ES2574614T3

ES2574614T3 - Procedimiento de determinación de una concentración de una especie de polisorbato en una mezcla

Info

Publication number: ES2574614T3
Application number: ES13745180.3T
Authority: ES
Inventors: Benedicte GBAGUIDI; Olivier C. Germay; Sonia LARDAU
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2013-05-21
Publication date: 2016-06-21
Anticipated expiration: 2033-05-21
Also published as: US9134228B2; BR112014029107A2; JP6129302B2; IN2014KN02807A; CN104487823B; BR112014029107A8; CA2874077A1; CN104487823A; BR112014029107B1; JP2015523556A; CA2874077C; US20150129766A1; EP2852828B1; WO2013175312A1; EP2852828A1

Abstract

Un procedimiento de determinación de la concentración de una especie de polisorbato en una mezcla conocida por contener una única especie de polisorbato, que comprende: a) obtener una muestra de ensayo de dicha mezcla; b) añadir un patrón interno a dicha muestra de ensayo; c) obtener, con un espectrómetro, un espectro de reflectancia total atenuada (ATR) del infrarrojo medio de la muestra de ensayo; d) identificar, del espectro de reflectancia, un número de onda que corresponde al pico C>=O de dicha especie de polisorbato; e) identificar, del espectro de reflectancia, un número de onda que corresponde al pico del patrón interno; f) calcular el área bajo la curva para dicho número de onda del C>=O, normalizada mediante el área del pico del patrón interno; y g) comparar dicha área normalizada con una curva de calibrado para determinar la concentración de dicha especie de polisorbato en dicha muestra de ensayo.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de determinacion de una concentracion de una especie de polisorbato en una mezcla Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un procedimiento de medicion de polisorbatos, tales como polisorbato 80, usando espectroscop^a Infrarroja por Transformada de Fourier con Reflectancia Total Atenuada (ATR-FTIR).

Antecedentes

Las tecnicas que existen en la tecnica para cuantificar polisorbatos, incluyen procedimientos basados en colorimetna, separacion por HPLC, cromatograffa de gases (GC) y GC con deteccion por espectroscopfa de masas (MS). Sin embargo, puede darse una interferencia con tales procedimientos de ensayo debido a los constituyentes o condiciones presentes en las muestras de ensayo (interferencia de la matriz). Esto puede requerir una preparacion espedfica de la muestra de ensayo, a veces compleja y que consume mucho tiempo.

Sumario de la invencion

Un aspecto de la presente invencion es un procedimiento para determinar la concentracion de una especie de polisorbato en una mezcla que se sabe que contiene una unica especie de polisorbato, obteniendo una muestra de ensayo de la mezcla, anadiendo un patron interno a la muestra de ensayo, obteniendo un espectro de Reflectancia Total Atenuada (ATR) del infrarrojo medio de la muestra de ensayo, identificando a partir del espectro de reflectancia un numero de onda correspondiente al pico C=O de dicha especie de polisorbato y un numero de onda correspondiente al pico del patron interno, calculando el area bajo la curva para el numero de onda C=O (normalizada mediante el area del pico del patron interno), y comparando dicha area normalizada con una curva de calibrado para determinar la concentracion de dicha especie de polisorbato en la muestra de ensayo.

En una realizacion la muestra de ensayo comprende un antfgeno, tal como un antigeno proteico o un antigeno polisacarido.

En una realizacion, la muestra de ensayo no se pretrata qmmicamente antes de obtener los espectros de reflectancia total atenuada del infrarrojo medio de la muestra de ensayo.

En una realizacion, el patron interno es azida.

En una realizacion, la muestra de ensayo es de un componente de una vacuna a granel.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es un ejemplo de un cromatograma de GC-MS en modo de monitorizacion del ion seleccionado (SIM) (el pico etiquetado como TIC: 25.D\data.ms 10,686 es polisorbato 80).

La Figura 2 representa los modos vibracionales de los enlaces qmmicos. La localizacion de los modos vibracionales se da en terminos de longitud de onda y frecuencia.

La Figura 3 muestra los espectros de ATR-FTIR obtenidos de concentraciones conocidas de polisorbato 80 en solucion (agua), normalizadas usando el patron interno (region II), donde el eje X es el numero de onda (cm-1) y el eje Y es la absorbancia (absorbancia normalizada en unidades arbitrarias). La region del espectro (I) 3000 - 2800 cm-1 = cadena alifatica del polisorbato 80; la region (II) 2200 - 1980 cm-1 = patron interno anadido a la muestra; el pico de la region (III) a 1735 cm-1 = polisorbato 80 (C=O); el pico de la region (IV) a 1100 cm-1 = polisorbato 80 (C-O). Las areas de los pico (I), (III) y (IV) aumentan en funcion de la concentracion de polisorbato 80. Cada lmea del grafico representa un resultado promedio para una muestra, a partir de 32 escaneos.

La Figura 4 muestra las curvas de calibrado obtenidas de las regiones (I), (III) y (IV) de la Figura 3, normalizadas usando la region II del patron de azida. El area (eje Y) se expresa como unidades arbitrarias; el eje X es la concentracion de polisorbato 80 (|ig/ml).

Figura 5: Ejemplo de espectros de ATR-FTIR de una muestra de un CC-Gripe a granel, normalizada usando el patron interno (region II). Debido a la complejidad de la matriz, solo el pico (III) de la Figura 3 puede usarse para identificar y cuantificar el polisorbato 80 en las muestras de CC-Gripe.

Figura 6: graficos del area frente a concentracion de polisorbato 80 de la region (I) y (III) de la Figura 5.

Figura 7A: representa los espectros del polisorbato 80 usando ATR-FTIR.

Figura 7B: representa la cuantificacion del polisorbato 80 usando ATR-FTIR, donde las correlaciones de la respuesta de los picos no estan normalizadas.

Figura 8A: representa los espectros del polisorbato 80 usando ATR-FTIR.

Figura 8B: representa la cuantificacion del polisorbato 80 usando ATR-FTIR, donde los picos se normalizan usando azida como patron interno.

La Figura 9 representa los espectros del polisorbato 80 de dos muestras obtenidas durante la purificacion del CC-Gripe, donde la lmea superior es una muestra tomada antes de la adicion del polisorbato, y la lmea inferior es una muestra tomada tras la adicion del polisorbato durante el procesamiento.

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Descripcion detallada

Los excipientes se anaden a menudo a formulaciones de productos farmaceuticos, incluyendo formulaciones de vacunas. Los tensioactivos, incluyendo polisorbatos, son excipientes comunmente usados en las preparaciones de productos farmaceuticos y vacunas. Los tensioactivos (tales como polisorbatos) pueden, por ejemplo, ayudar a retener la actividad biologica de las protemas mediante el mantenimiento de una estructura proteica espedfica durante el almacenamiento, transporte y entrega. Los tensioactivos tambien pueden ayudar a disminuir la adsorcion de protemas a las superficies (por ejemplo, viales y jeringas), a reducir la tension superficial interfasial y a disminuir la tasa de desnaturalizacion de las protemas (que puede conducir a la agregacion de protemas). Vease, por ejemplo, Khossravi y col., Pharma Research, 19(5):634 (20O2); Lougheed y col., Diabetes, Vol. 32 (1983) 424-432.

El polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60 y el polisorbato 80 son excipientes comunes de polisorbato usados en la formulacion de productos biofarmaceuticos, incluyendo vacunas. Puede requerirse la cuantificacion de los tensioactivos, asf como otros ingredientes, en los productos medicos, biofarmaceuticos y biologicos por las agencias reguladoras.

Se divulga en el presente documento un procedimiento de Espectroscopfa Infrarroja por Transformada de Fourier con Reflectancia Total Atenuada (ATR-FTlR) que cuantifica el polisorbato en formulaciones ftquidas, incluyendo formulaciones de productos farmaceuticos que comprenden excipientes ademas de polisorbato.

Procedimientos de cuantificacion de polisorbatos

Se han descrito diversos procedimientos analfticos para la cuantificacion de polisorbatos. Dichos procedimientos pueden incluir la preparacion de la muestra en multiples etapas, un potencial interferente en una matriz compleja y una falta de sensibilidad y especificidad.

El polisorbato 20 y/u 80 pueden cuantificarse en base a la coloracion azul de la especie de polisorbato que forma complejos con el reactivo de cobalto-tiocianato en un disolvente organico; la concentracion de polisorbato 20 y/u 80 se determina mediante la absorcion optica. Zsolt y Gabor, J. Pharmaceut. Biomed. Anal., 18 (1998) 715-720; Hu y col., J. Chromatogr. A, 984 (2003) 233-236; Adamo y col., J. Chromatogr. B, 878 (2010) 1865-1870; Tani y col., J. Chromatogr. A, 786 (1997) 99-106.

Fekete y col. describen un procedimiento de LC-CAD para la determinacion cuantitativa de polisorbato 80, en base a su interaccion con 5(p-dimetilaminobenciliden) rodanina (PDR) en medio alcalino (Fekete y col., J. Pharmaceut. Biomed. Anal., 52 (2010) 672-679). El procedimiento usa la separacion por cromatograffa ftquida de alta eficacia (HPLC) y deteccion por aerosol cargado (CAD). Fekete y col. exponen que el procedimiento de LC-CAD es adecuado para la cuantificacion del polisorbato 80 en el intervalo de 10-60 |ig/ml en soluciones de protemas.

La cromatograffa ftquida de alta eficacia de exclusion por tamano (SEC-HPLC) con deteccion por absorbancia ultravioleta (UV) emplea una fase movil que contiene el tensioactivo que se determina a una concentracion por encima de su concentracion micelar cfftica (CMC).

La cromatograffa ftquida de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) con deteccion por absorbancia UV tras la preparacion de la muestra puede basarse en la hidrolisis acida del ester de laurato de sorbitan seguido de una separacion por RP-HPLC con deteccion por absorbancia UV del acido laurico libre (relacion molar 1:1). Zsolt y col., J. Pharmaceut. Biomed. Anal., 18 (1998) 715-720. De modo alternativo puede usarse la hidrolisis basica del ester de laurato de sorbitan seguido de la separacion por RP-HPLC con deteccion por absorbancia UV del acido oleico libre. Hu y col., J. Chromatogr. A, 984 (2003) 233-236; Adamo y col., J. Chromatogr. B, 878 (2010) 1865-1870; Tracy y col., AAPS J., 10 (S1) (2008) 647.

La cromatograffa ftquida de alta eficacia en fase inversa (RP-HPLC) con deteccion evaporativa de dispersion de luz (ELSD) puede lograr la elucion del polisorbato 80 como un unico pico (coelucion de todos los componentes de polisorbato). Nair y col., J. Chromatogr. A, 1012 (2003) 81-86; Hewitt y col., J. Chromatogr. A, 1215 (2008) 156-160; Adamo y col., J. Chromatogr. B, 878 (2010) 1865-1870; Hewitt y col., J. Chromatogr. A, 15:2138-45 (2011).

La cromatograffa de gases (GC) con deteccion por espectrometffa de masas (MS) usa la hidrolisis acida del ester de oleato de sorbitan seguido de la separacion del metil ester de oleato por GC con deteccion por espectrometffa de masas (MS). La preparacion de la muestra implica un procedimiento de hidrolisis y a continuacion una etapa de extraccion. El polisorbato 80 se cuantifica frente al acido pentadecanoico como patron interno (Oliveira y col., Talanta Vol. 69 (2006) 1278-1284).

Otros procedimientos analfticos para la cuantificacion de polisorbatos pueden incluir cromatograffa en capa fina (TLC), cromatograffa de fluidos supercffticos (SFC), analisis por fluorescencia con fraccionamiento de colorantes fluorescentes de N-fenil-1-naftilamina en el nucleo hidrofobo de micelas formadas por polisorbato, cuantificacion de los componentes acidos del polisorbato por RP-HPLC tras la reaccion de derivatiacion con 2-nitrofenilhidrazona, caracterizacion de polisorbatos usando espectrometffa de masas de desorcion/ionizacion por laser asistida por matriz y tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS) y cromatograffa ftquida con deteccion por espectrometffa de masas (MS).

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La patente EP 1 382964 A describe un procedimiento para determinar la concentracion de una especie de polisorbato en una mezcla, comprendiendo el procedimiento obtener una muestra de ensayo de la mezcla, anadir un reactivo de tiocianato de amonio/nitrato de cobalto a la muestra de ensayo y cuantificar el complejo cobalto tiocianato resultante mediante mediciones de la absorbancia con un espectrofotometro.

Wenger y col., Analytical Biochemistry, 337 (2005), 48-54 describen un procedimiento para determinar la concentracion de una especie de polisorbato en una mezcla, comprendiendo el procedimiento: obtener una muestra de ensayo de la mezcla; anadir 5-dodecanoilaminofluoresceina (DAF) a la muestra de ensayo; y cuantificar las concentraciones de polisorbato por encima de una concentracion micelar cntica mediante la deteccion de un aumento de la polarizacion de la fluorescencia debido a la insercion de DAF en las micelas de polisorbato.

La patente de Estados Unidos US 2005/0287675 A describe un procedimiento para determinar una relacion de aglutinante agente de curado de un producto fibroso, comprendiendo el procedimiento: obtener, con un espectrometro de ATR-FTIR, un espectro del infrarrojo medio del producto, identificar, a partir del espectro, un numero de onda correspondiente al pico C=O del grupo acido carboxflico en el aglutinante y un numero de onda correspondiente al pico C=O del grupo ester en el aglutinante y calcular una relacion de los valores de absorbancia a dichos numeros de onda.

Espectroscopia IR

La espectroscopia vibracional infrarroja (IR) identifica las moleculas analizando sus enlaces qmmicos, que vibran a una frecuencia caractenstica. La radiacion de luz de 4000-400 cm-1, el infrarrojo medio, comunmente se usa como la region infrarroja del espectro que abarca las frecuencias fundamentales de la mayona de las vibraciones moleculares. En una molecula, los movimientos de estiramiento y plegado de un componente (por ejemplo CH2) dan como resultado multiples modos de oscilacion. Las oscilaciones que provocan un cambio en el dipolo en la molecula dan como resultado la absorcion de un foton con la misma frecuencia. Un espectro de las frecuencias de absorcion en una muestra puede registrarse y usarse para detectar y cuantificar los grupos qmmicos presentes en la muestra.

Reflectancia total atenuada (ATR)

La Reflectancia Total Atenuada (ATR) es una tecnica de muestreo usada con espectroscopia infrarroja. Una muestra de ensayo se pone en contacto con un cristal de ATR (de modo alternativo denominado como Elemento de Reflexion Interna (ERI)). Cuando se ensayan las muestras lfquidas, se extiende una capa superficial (delgada) sobre el cristal de ATR. Un haz de radiacion incidente (luz infrarroja) se dirige en el cristal de ATR a un angulo predeterminado. El haz pasa a traves del cristal de ATR de manera que se refleja internamente de manera total en el ifmite entre el ERI y la muestra de ensayo. La reflectancia interna crea una onda evanescente que se extiende solo unos pocos micrometres mas alla de la superficie del cristal de ATR en la muestra, y algo de la energfa de la radiacion incidente se absorbe por la muestra de ensayo. La onda evanescente por consiguiente se atenua o altera en las regiones del espectro infrarrojo donde la muestra absorbe energfa. La intensidad de la radiacion reflectada internamente se disminuye para las longitudes de onda donde la muestra absorbe energfa, y la cantidad de absorcion en puntos espedficos puede usarse para cuantificar la cantidad de moleculas espedficas en la muestra de ensayo. La radiacion reflectada, por lo tanto, incluye informacion a partir de la que puede adquirirse un espectro de absorcion para la muestra de ensayo. La energfa atenuada sale del cristal de ATR, a un detector en el espectrometro de IR. El sistema genera un espectro infrarrojo (espectros de reflexion interna o espectros de reflexion total atenuada (ATR)).

Debido a la profundidad limitada de penetracion de la onda evanescente en la muestra, las muestras de ensayo se colocan en contacto estrecho con el cristal de ATR; esto puede lograrse usando muestras lfquidas. El tipo de cristal de ATR usado define su mdice de refraccion, el intervalo de transmision infrarrojo y las propiedades qmmicas de la ERI. La profundidad de la penetracion puede controlarse alterando el angulo de incidencia del haz IR entrante con respecto al ERI o cambiando el mdice de refraccion del cristal de ATR.

Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)

La espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) se basa en la absorcion de la luz infrarroja por las moleculas. Las moleculas solo absorben la luz infrarroja a frecuencias que afectan el momento dipolar de la molecula; esto provoca la excitacion a estados vibracionales mas altos. Las moleculas monoatomicas (He, Ne, etc.) y diatomicas homopolares (H2, O2, etc.) no absorben luz infrarroja.

La espectroscopia FTIR obtiene un espectro infrarrojo de absorcion mediante una muestra solida, lfquida o gaseosa. Un algoritmo matematico (trasformada de Fourier) se usa para convertir los datos brutos en un espectro. En la espectroscopia FTIR, un haz que comprende frecuencias diferentes de luz se dirige a la muestra, y se toman las mediciones de absorcion a diferentes longitudes de onda. Todas las frecuencias opticas se observan simultaneamente, durante un periodo de tiempo conocido como tiempo de escaneo. El haz se cambia (por ejemplo, usando un interferometro de Michelson, como se conoce en la tecnica) para contener una combinacion diferente de frecuencias y las mediciones se toman de nuevo. Esto se repite para proporcionar muchos puntos de datos (datos brutos) que se usan para calcular la absorcion a longitudes de onda particulares.

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Por consiguiente, en la ATR-FTIR, se determinan los cambios que ocurren en un haz infrarrojo en el Kmite del ERI y la muestra de ensayo. Cuando se trata de espectros del infrarrojo medio, el numero de onda (centimetro'1) se usa comunmente en lugar de la longitud de onda, debido a que el numero de onda es proporcional a la energfa y la frecuencia de la radiacion.

La profundidad de la penetracion de la energfa infrarroja en la muestra es dependiente de la longitud de onda. A medida que la longitud de onda de la radiacion infrarroja aumenta, la profundidad de la penetracion aumenta. Dicho de forma alternativa, la profundidad de la penetracion aumenta a medida que el numero de onda disminuye. Esto provoca que las intensidades relativas de las bandas en el espectro de ATR aumenten con la disminucion del numero de onda cuando se comparan con un espectro de transmision de la misma muestra. Este fenomeno puede corregirse matematicamente mediante un programa, incluyendo paquetes de programas de FTIR disponibles en el mercado.

En la ATR-FTIR la marca de la intensidad del espectro de incidencia retornante, junto con la ley de Beer, se usan para identificar y cuantificar compuestos. La ley de Beer subyace del analisis de datos de FTIR. Se establece que para una longitud de trayectoria constante, la intensidad de la energfa de la luz incidente (directa) que atraviesa un medio absorbente disminuye exponencialmente con la concentracion. Las operaciones matematicas y estadfsticas del presente procedimiento pueden realizarse usando cualquier equipo computacional adecuado. El espectrometro puede tener la capacidad de almacenar los espectros IR recogidos (datos) y llevar a cabo la manipulacion matematica de los datos. Un ordenador personal disponible en el mercado puede usarse para iniciar el programa para la adquisicion de los datos, el calculo de las diferencias en los espectros, y los analisis espectrales y otros analisis. Los ordenadores conectados con un instrumento de FTIR pueden emplearse para adquirir los datos en un analisis, mientras los analisis se llevan a cabo en otro. La adquisicion adecuada de los datos y los paquetes de los programas de operacion pueden escribirse de novo o pueden adquirirse. Los paquetes de programas disponibles en el mercado adecuados para su uso en la presente invencion incluyen el programa OPUS (Bruker Optics, Alemania); y Matlab (Mathworks Inc., Estados Unidos) pueden personalizarse para su uso en este procedimiento. Existen muchas tecnicas de clasificacion multivariantes adecuadas para su uso con los datos espectrales IR incluyendo, pero sin limitacion, metodologfas de cuantificacion tales como mmimos cuadrados parciales, analisis de componentes principales (PCA) o regresion de componentes principales (PCR). Un espectro IR procesado puede formarse de diversos espectros IR brutos (por ejemplo, por multiples escaneos en un intervalo de longitudes de onda y usando tecnicas de promedio conocidas en la tecnica).

Oliveira y col. describen la evaluacion del contenido de esteres en biodiesel usando FTIR en base a la vibracion de estiramiento del C=O de los grupos ester (Oliveira y col., Talanta Vol. 69 (2006) 1278-1284). La Patente de Estados Unidos n.° 7.255.835 describe un procedimiento en un unico paso de ATR-FTIR para su uso en la determinacion de la estructura secundaria de protemas.

Adquisicion del espectro IR

Los detalles espedficos para la recogida y el analisis de un espectro IR usando la ATR-FTIR vanan con el equipo espedfico usado, pero generalmente comprenden la irradiacion de un ERI, que esta en contacto con una muestra de ensayo lfquida, con la radiacion IR y la monitorizacion de la radiacion reflejada desde el ERI. Los datos de reflexion pueden almacenarse en un medio adecuado y/o exponerse en la pantalla de un ordenador o en papel milimetrado.

Un espectro adquirido usando los aparatos y procedimientos de la presente invencion puede comprender una senal del disolvente de la muestra; puede llevarse a cabo una resta del fondo (resta matematica) donde se conoce el disolvente. Los componentes biologicos, tales como protemas, glicoprotemas, o polisacaridos, pueden estar en los disolventes que comprenden agua o un tampon acuoso. Un tampon acuoso puede comprender compuestos ademas de agua. El tampon fosfato salino (PBS), tris(hidroximetil) aminometano, HEPES (4-(2-hidroxietil)-1- piperazinetanosulfonico) y otros compuestos se usan comunmente para tamponar soluciones que comprenden moleculas biologicas, tales como antfgenos polipeptfdicos. La resta del componente tampon puede lograrse restando matematicamente el espectro del tampon (obtenido en ausencia de una muestra) del espectro de la muestra en presencia del tampon.

Las operaciones de resta del fondo pueden llevarse a cabo a medida que se necesite retirar otras senales del fondo, tales como las del cristal de ATR limpio.

Las operaciones matematicas de resta espectrales pueden llevarse a cabo en un sistema de ordenador; la operacion de resta puede comprender un algoritmo que identifica (o permite a un usuario identificar) las regiones de un espectro compuesto para la resta. Tras identificar las regiones a restarse, la resta se lleva a cabo para generar una diferencia en el espectro resultante. La diferencia en el espectro puede estar presente graficamente o tabulada en funcion de la absorbancia a una longitud de onda dada y presente en forma de tabla.

Presente procedimiento

El presente procedimiento de cuantificacion de polisorbato mediante ATR-FTIR se basa en la deteccion y cuantificacion del enlace carbonilo (C=O) del polisorbato. Este enlace esta presente en cada polisorbato 80,

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polisorbato 60, polisorbato 40 y polisorbato 20. Por consiguiente el presente procedimiento es util en la cuantificacion de cualquier polisorbato 80, polisorbato 60, polisorbato 40 y polisorbato 20. De acuerdo con la presente invencion, la muestra contiene solo una unica especie de polisorbato (por ejemplo, contiene solo polisorbato 80).

Incluso cuando se coloca la misma cantidad de muestra en la ATR, la cantidad precisa de la muestra retenida en el elemento de la ATR puede variar, por consiguiente el presente procedimiento usa una curva de calibrado creada con un patron interno, para normalizar la cantidad de muestra retenida en la ATR.

El presente procedimiento permite la determinacion de la concentracion de polisorbato en una muestra de ensayo lfquida mediante la tecnica espectroscopica ATR-FTIR sin el pretratamiento qmmico de la muestra. Los presentes inventores han utilizado un ERI de diamante para obtener los espectros de FTIR del polisorbato 80. Para crear una curva de calibrado, e identificar los picos espedficos de interes, los presentes inventores han usado un conjunto de calibrado que consiste en polisorbato 80 en H2O, en concentraciones de 20 |ig/ml, 50 |ig/ml, 100 |ig/ml, 250 |ig/ml y 500 |ig/ml. Se ha encontrado que el area del pico (C=O) de cada espectro a 1735 cm-1, cuando se normaliza usando un patron interno (azida) se correlaciona linealmente con los contenidos de polisorbato 80 (R2>0,99). Los resultados obtenidos del procedimiento de ATR-FTIR se han confirmado mediante el procedimiento de deteccion por cromatograffa de gases con espectrometna de masa (GC-MS).

Los ejemplos proporcionados en el presente documento demuestran un procedimiento de ATR-FTIR para la determinacion de una concentracion de polisorbato en muestras de ensayo de mezclas complejas que contienen componentes de polipeptidos (los ejemplos proporcionados en el presente documento han utilizado muestras de virus de la gripe a granel purificado producido en un cultivo celular (CC-Gripe)). Sera evidente para los expertos en la materia que la muestra usada para la cuantificacion debe ser representativa de la que se obtiene a granel.

El presente procedimiento para la cuantificacion de polisorbato en una formulacion, incluyendo formulaciones que comprenden componentes de antigenos, utiliza procedimientos que seran evidentes para los expertos en la materia de espectroscopfa tras la consideracion de la presente divulgacion. El equipo util en el presente procedimiento incluye, pero sin limitacion, un ATR ERI y un espectrometro de FTIR, y un equipo y programa de procesamiento de datos apropiado. Los detalles espedficos del procedimiento se rigen por los parametros del equipo y la naturaleza del experimento, pero se describe una metodologfa general en el presente documento. Adicionalmente, la metodologfa divulgada puede adaptarse a las diversas propiedades de la muestra en estudio y a otras consideraciones experimentales pertinentes.

Una realizacion de la presente invencion proporciona un procedimiento de ATR-FTIR para cuantificar polisorbato en una muestra. En una realizacion la muestra comprende un polipeptido y/o una protema en un lfquido (una muestra lfquida), tal como polipeptidos y/o protemas en agua (una muestra acuosa). En una realizacion el polipeptido es un antfgeno polipeptfdico.

Una realizacion de la presente invencion proporciona un procedimiento de ATR-FTIR para cuantificar polisorbato en una muestra, en donde la muestra comprende un polisacarido, tal como un antfgeno polisacarido. En una realizacion la muestra comprende un polisacarido en un lfquido (una muestra lfquida), tal como polisacaridos en agua (una muestra acuosa). En una realizacion el polisacarido es un antfgeno polisacarido.

En una realizacion la muestra de ensayo es de una vacuna (incluyendo vacunas monovalentes a granel, asf como formulaciones finales de vacunas, incluyendo formulaciones de vacunas polivalentes); en una realizacion adicional la muestra de ensayo es de una vacuna que comprende un antfgeno de un organismo seleccionado del virus de la gripe, virus del sarampion, virus de las paperas, virus de la varicela (chickenpox), virus de la rubeola, virus herpes, virus de la polio, virus de la viruela, poxvirus, virus del papiloma humano (VPH), virus de la encefalitis japonesa, virus de la hepatitis tales como la HepA o HepB, rotavirus, virus del dengue, virus sincitial respiratorio (VSR), citomegalovirus (CMV), Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium difteria, Clostridium tetani, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, una especie de Streptococcus, una especie de Corynebacterium, una especie de Clostridium, una especie de Salmonella y una especie de Bordetella.

En una realizacion, se sabe que la muestra comprende una unica especie de polisorbato seleccionado de polisorbato 80, polisorbato 60, polisorbato 40 y polisorbato 20. Cuando una unica especie de polisorbato esta presente en la muestra, los resultados proporcionan una medicion de la concentracion de esta especie de polisorbato. La cantidad de muestra debe ser suficiente para proporcionar una capa delgada de la muestra en el ERI.

En una realizacion de la presente invencion, el procedimiento emplea una tecnica de muestreo para la ATR y la espectroscopfa FTIR en un unico paso.

En una realizacion, el procedimiento comprende: (a) proporcionar una muestra que comprende una unica especie de polisorbato y un patron interno; (b) proporcionar un elemento de reflexion interna (ERI); (c) poner en contacto la muestra con el eRi para formar una interfase de muestra-ERI; (d) usar un dispositivo de FTIR, o un dispositivo que contiene opticas de enfoque para permitir la utilizacion de la radiacion FTIR, para dirigir un haz de radiacion infrarroja (IR) a traves del ERI en condiciones tales que la radiacion IR interactua con la interfase de muestra-ERI; (e) registrar

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el perfil de reflectancia en el intervalo de frecuencias de 4000 - 600 cm-1; (f) recopilar el perfil de absorbancia de la muestra en una base de datos informatica, (g) generar un espectro IR de la muestra en el intervalo de frecuencias de 4000 - 600 cm-1 y (h) calcular el area (area bajo la curva) del pico a 1735 cm-1; determinando la concentracion de polisorbato en dicha muestra en referencia a una curva de calibrado.

En una realizacion, se establece una curva de calibrado para cada conjunto de experimented o muestra ensayada. En una realizacion se establece una unica curva de calibrado y se usa para multiples muestras, donde las muestras son de mezclas preparadas mediante el mismo procedimiento. En una realizacion se establece y se usa una curva de calibrado para multiples muestras, donde las muestras son de mezclas preparadas mediante el mismo procedimiento, por un periodo de tiempo establecido.

Cuando solo se detecta la presencia de una especie de polisorbato (y no la cantidad), no se requiere una curva de calibrado.

La especificidad del procedimiento para una matriz particular (por ejemplo, un componente de la vacuna particular) puede demostrarse usando muestras de la matriz anadida a concentraciones conocidas de polisorbato.

En una realizacion, el patron interno es azida, y se genera un espectro IR de la muestra en el intervalo de frecuencias de 2200 - 1980 cm-1.

En una realizacion adicional, el patron interno es azida, y se genera un espectro IR de la muestra que comprende la frecuencia de 1735 cm-1.

En una realizacion, la muestra de ensayo no se pretrata en una manera que altere la estructura qmmica del polisorbato (“Pretratamiento qmmico” o “pretratado qmmicamente”), por ejemplo, el polisorbato no forma complejos con el cobalto-tiocionato, derivatizado, transesterificado, transbencilado, tratado para producir un derivado ester y/o hidrolizado. Tal como se usa en el presente documento, la adicion de un patron interno que no altere la estructura qmmica del polisorbato no se considera “pretratamiento qmmico”.

En una realizacion, se anade un patron interno a la muestra de ensayo. En una realizacion, el patron interno es azida (anion lineal que es isoelectrico con CO2).

En una realizacion, el presente procedimiento de espectroscopfa ATR-FTIR para la cuantificacion de polisorbato puede usarse para formulaciones lfquidas que contienen (a) moleculas de protema, y/o (b) excipientes ademas de un polisorbato (excipientes no polisorbato). En una realizacion, el presente procedimiento de espectroscopfa ATR- FTIR para la cuantificacion de polisorbato puede usarse para formulaciones lfquidas que contienen (a) moleculas de polisacarido, y/o (b) excipientes ademas de un polisorbato (excipientes no polisorbato). Tales excipientes no polisorbato incluyen detergentes a parte de polisorbato, por ejemplo, TRITON™ X-100 (4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicol, f-Octilfenoxipolietoxietanol, eter ferc-octilfemlico de polietilenglicol; disponibles de Sigma Aldrich, St. Louis, MS) y succinato de vitamina E (SVE).

En una realizacion de la presente invencion, el procedimiento de adquisicion de un espectro de una muestra se automatiza usando paquetes adecuados de programas disponibles en el mercado para la adquisicion automatizada del espectro.

En otra realizacion, la presente invencion se automatiza completamente y puede comprender un inyector automatico para inyectar y retirar muestras y un paquete de programas de adquisicion del espectro para poner en marcha un espectrometro de FTIR.

Terminos

A menos que se explique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comunmente por un experto en la materia a la que pertenece esta descripcion. Las definiciones de los terminos comunes en biologfa molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew y col. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Los polisorbatos se derivan del sorbitan pegilado (un derivado del sorbitol) esterificado con acidos grasos. Las especies de polisorbato incluyen polisorbato 20 (monolaurato de sorbitan polioxietilenado (20)), polisorbato 40 (monopalmitato de sorbitan polioxietilenado (20)), polisorbato 60 (monoestearato de sorbitan polioxietilenado (20)) y polisorbato 80 (monooleato de sorbitan polioxietilenado (20)). La designacion numerica que sigue al “polisorbato” se refiere al grupo lipofilo (monolaurato (20), monopalmitato (40), monoestearato (60) y monooleato (80)). El numero veinte (20) que sigue a “polioxietilenado” se refiere al numero total de grupos oxietileno en la molecula. Los polisorbatos se clasifican como tensioactivos no ionicos. Los nombres comerciales para los polisorbatos incluyen ALKEST™ y TWEEN™.

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El polisorbato 80 es un tensioactivo y emulsionante no ionico; los nombres comerciales incluyen Alkest TW 80, Canarcel y TWEEN™ 80. El polisorbato 20 es un tensioactivo y emulsionante no ionico; los nombres comerciales incluyen Alkest TW 20 y TWEEN™ 20. El polisorbato 40 es un tensioactivo y emulsionante no ionico; los nombres comerciales incluyen TWEEN™ 40. El polisorbato 60 es un tensioactivo y emulsionante no ionico; los nombres comerciales incluyen TWEEN™ 60. Las estructuras del polisorbato 80 y del polisorbato 20 se muestran a continuacion.

Polisorbato 80 (la suma de w, x, y y z es 20):

COCHjCHrKiOH

&

Suma dew + x + y + z = 20

Polisorbato 20 (la suma de w, x, y y z es 20):

imagen1

Las especies de polisorbatos, incluyendo polisorbato 80, polisorbato 60, polisorbato 40, polisorbato 20 y las combinaciones de los mismos, se usan como excipientes en formulaciones medicas, incluyendo vacunas, incluyendo vacunas para proporcionar proteccion contra la gripe, la infeccion por el virus del papiloma humano (HPV), encefalitis japonesa, enfermedad por neumococo, hepatitis (HepB) y enfermedad por rotavirus; tambien combinaciones de vacunas tales como DTaP (difteria, tetanos y tos ferina), DTaP/Hib (DTaP mas Haemophilus influenzae B). DTaP/IPV (DTaP mas virus de la polio atenuado), y DTaP-HepB-IPV.

Las vacunas de la gripe se preparan en diversos sustratos. Muchas vacunas en el mercado se preparan usando huevos de gallina. Mas recientemente, las vacunas de la gripe se han desarrollado usando lmeas celulares tales como la lmea celular de rinon canino Madin-Darby (MDCK), lmea celular MRC-5 (pulmon fetal humano), lmea celular Vero (celulas epiteliales de rinon de mono verde africano), lmea celular de ovario de hamster chino (CHO), lmea celular EB66® y lmea celular PER.C6® (ser humano, Crucell (Pafses Bajos)). La lmea celular EB66® es una lmea celular de pato disponible en el mercado derivada de celulas madre embrionarias (Vivalis, Nantes, Francia) y usada para el crecimiento y produccion de componentes de vacunas, incluyendo la produccion de virus usados en la fabricacion de vacunas virales, incluyendo virus de la gripe. Las celulas EB66® son susceptibles a la infeccion por muchos virus, incluyendo virus de la gripe aviar. Los procedimientos alternativos de la produccion de componentes de vacunas incluyen crecimiento en huevos embrionados de pollo y fibroblastos del embrion de pollo (CEF) primarios.

Como se usa en el presente documento, una formulacion (o solucion) que contiene (o comprende) un componente proteico (o un polipeptido) puede ser una composicion medica, tal como una composicion biofarmaceutica, tal como una vacuna terapeutica o una vacuna profilactica, o una composicion que comprende un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, o una parte de union al antfgeno del mismo.

Como se usa en el presente documento, una formulacion (o solucion) que contiene (o comprende) un componente polisacarido puede ser una composicion medica, tal como una composicion biofarmaceutica, tal como una vacuna terapeutica o una vacuna profilactica.

Como se usa en el presente documento una vacuna puede ser una disenada y destinada a la administracion a un mairnfero humano o no humano. La vacuna puede ser profilactica, para proporcionar proteccion contra una enfermedad (reducir la posibilidad de contraer la enfermedad), o terapeutica (para tratar una enfermedad al disminuir los smtomas, severidad, duracion, o riesgo de recurrencia de la enfermedad). La vacuna puede ser una vacuna contra el cancer. La vacuna puede ser monovalente o polivalente.

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Como se usa en el presente documento una vacuna puede comprender antfgenos obtenidos de un virus, incluyendo pero sin limitacion: virus de la gripe, virus del sarampion, virus herpes, virus de la polio, virus de la viruela, poxvirus, virus del papiloma humano (VPH), virus de la encefalitis japonesa, virus de la hepatitis tal como HepB y rotavirus.

Como se usa en el presente documento una vacuna puede comprender antigenos obtenidos de una especie bacteriana, incluyendo pero sin limitacion: Streptococcus pneumoniae, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetella pertussis y Haemophilus influenzae.

Como se usa en el presente documento, BPFa significa buenas practicas de fabricacion actuales.

Como se usa en el presente documento, “componentes de una vacuna a granel” o “a granel” se refiere a un principio activo de la vacuna contenido, o almacenado en, un volumen mayor que el volumen de la vacuna acabada. La concentracion del principio activo de la vacuna a granel es normalmente mayor que la concentracion del principio activo en la vacuna acabada. Un producto a granel es un producto intermedio en la fabricacion comercial de las vacunas. Un producto a granel puede ser univalente (monovalente), es decir, que contiene un antigeno purificado, bivalente, o multivalente. Un producto a granel puede contener el antfgeno purificado en diferentes concentraciones a las que estaran presentes en una formulacion final de la vacuna (para el uso clmico o venta comercial). En una realizacion, el producto a granel contiene al menos un antfgeno de la protema del virus de la gripe, por ejemplo, un antfgeno de neuraminidasa (NA) o de hemaglutinina (HA). El producto a granel puede contener antfgenos derivados de una cadena de un patogeno, o de multiples cadenas de un patogeno. Las formulaciones de la vacuna final puede comprender multiples antfgenos (vacunas polivalentes), es decir, pueden ser una mezcla a granel de monovalentes multiples, y pueden comprender antfgenos de multiples patogenos o multiples cadenas de un patogeno. Los productos a granel pueden almacenarse hasta que se necesiten para la preparacion final de las dosis de vacuna. Las vacunas pueden estar en la forma de un lfquido, un lfquido con adyuvante, o liofilizadas.

Como se usa en el presente documento, una muestra es una parte representativa de un volumen mayor. La muestra puede ser de una mezcla, tal como un lfquido que comprende elementos no lfquidos. La muestra puede ser una muestra acuosa.

Como se usa en el presente documento, una mezcla comprende al menos dos elementos diferentes, por ejemplo, una mezcla comprende moleculas de una especie de polipeptido y moleculas de una especie de polisorbato. La mezcla puede estar en forma solida o en forma lfquida.

Como se usa en el presente documento, los terminos “peptido”, “polipeptido” y “protema” se intercambian y significan un polfmero de aminoacidos, independientemente de su tamano. Aunque “protema” se usa a menudo en referencia a polipeptidos relativamente grandes, y “peptido” se usa a menudo en referencia a polipeptidos pequenos, el uso de estos terminos en la tecnica se solapa y vana. El termino “polipeptido” tal como se usa en el presente documento se refiere a peptidos, polipeptidos y protemas, a menos que se indique lo contrario. Como se usa en el presente documento, los terminos “protema”, “polipeptido” y “peptido” se refieren tanto a los productos genicos expresados como a entidades sintetizadas qmmicamente, y abarcan glicoprotemas y toxinas de protemas inactivadas (toxoides).

Como se usa en el presente documento un antfgeno se refiere a una sustancia, incluyendo peptidos y protemas (incluyendo glicoprotemas), que inducen una respuesta inmune en un mairnfero, incluyendo un ser humano.

Como se usa en el presente documento, la cuantificacion incluye la determinacion de una concentracion de una sustancia particular en una muestra, por ejemplo, en |ig/ml, o la determinacion de la cantidad total de una sustancia en un volumen particular.

Como se usa en el presente documento, el termino “acuoso” significa que comprende un componente de agua. Por consiguiente, una “solucion acuosa” es una solucion que comprende un componente de agua. La expresiones “acuoso” y “solucion acuosa” abarcan espedficamente la inclusion de agua, oxido de deuterio o ambos como componentes de agua.

Como se usa en el presente documento, el termino elemento de reflexion interna (ERI) se usa de manera intercambiable con el termino cristal de ATR o elemento de ATR, y significa un cristal, prisma u otra estructura que admite la radiacion entrante y refleja la radiacion al menos una vez desde una superficie (superficie reflectante) en el interior del elemento. En la ATR-FTIR, la reflectancia sigue a la interaccion de la radiacion con una muestra en contacto con la superficie reflectante del ERI. Despues de dicha reflectancia, la radiacion puede re-reflejarse o emitirse desde el ERI. Pueden usarse muchas marcas de espectrometros con la ATR, anadiendo un dispositivo de ATR al espectrometro. El espectrometro de FTIR preferentemente tiene la capacidad de suministrar energfa IR a una muestra en un angulo de incidencia predeterminado entre aproximadamente 30 a aproximadamente 60 grados, y recoger la luz reflejada desde la muestra a traves de un amplio intervalo de angulos, incluyendo el angulo de incidencia.

Los ERI tienen un alto mdice de refraccion (al menos mayor que el de la muestra que se ensaya, y normalmente entre 2,38 y 4,01 a 2000 cm-1), y puede ser un cristal opticamente denso, tal como un cristal de germanio, un cristal de seleniuro de cinc, un cristal de diamante, u otro material de alto mdice de refraccion capaz de transmitir la luz IR. La forma de un cristal de ATR depende del tipo de espectrometro y la muestra con la que se usa, tal y como se

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conoce en la tecnica.

El angulo de incidencia, como se usa en el presente documento, es el angulo en el que la luz de incidencia impacta en un ERI. En la presente invencion, puede usarse un elemento de ATR de diamante y un angulo adecuado de incidencia es 45 grados desde la superficie normal.

Como se usa en el presente documento, la expresion “ATR de paso multiple” significa una tecnica de reflectancia total atenuada en la que la radiacion incidente en un ERI tiene al menos dos caras de reflexion, interacciona al menos dos veces con una cara de reflexion antes de salir del ERI. Puede referirse a dichas interacciones como “rebotes” o “pasos”. El ATR de paso multiple genera un espectro de ATR de paso multiple. Como se usa en el presente documento, la expresion “ATR de paso simple” significa una tecnica de reflectancia total atenuada en la que la radiacion incidente en un ERI tiene al menos una cara de reflexion en el ERI que interactua solo una vez con una cara de reflexion antes de salir del ERI (un “rebote” o “paso”). La ATR de paso simple genera un espectro de ATR de paso simple.

Como se usa en el presente documento, una curva de calibrado usada en una realizacion de la presente invencion, significa un patron de referencia creado usando las mismas etapas que se han indicado en el procedimiento, pero usando muestras (muestras de calibrado) que contienen cantidades conocidas de una especie de polisorbato. La especie de polisorbato en la muestra de calibrado es la misma que en las muestras de ensayo, y las cantidades de la especie de polisorbato en la muestra de calibrado abarcan una intervalo que incluye el intervalo que razonablemente se espera, por un experto en la materia, que este presente en las muestras de ensayo. Por ejemplo, cuando se espera que vane la concentracion de polisorbato en las muestras de ensayo entre cero y 500 |ig/ml, las muestras de calibrado que contienen 0 |ig/ml, 25 |ig/ml, 50 |ig/ml, 100 |ig/ml, 250 |ig/ml y 500 |ig/ml pueden usarse para preparar una curva de calibrado. Cualquier unidad de area adecuada puede usarse para la curva de calibrado.

Los terminos en singular “un”, “una” y “el” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, se pretende que la palabra “o” incluya “y” a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El termino “pluralidad” se refiere a dos o mas. Ademas, las limitaciones numericas dadas con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia y que se declara que son “aproximadamente” un cierto nivel, se pretende que sean aproximadas. Por consiguiente, cuando se indica que una concentracion es “aproximadamente 250 |ig/ml” (por ejemplo), se pretende que la concentracion se entienda que es al menos aproximadamente (o “aproximadamente” o “~”) 250 |ig/ml.

Aunque los procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la practica o el ensayo de la presente divulgacion, se describen procedimientos y materiales adecuados a continuacion. El termino “comprende” significa “incluye”. Por lo tanto, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra “comprende”, y las variaciones tales como “comprendido” y “comprendiendo” se entendera que implican la inclusion de un compuesto o composicion (por ejemplo, acido nucleico, polipeptido, antfgeno) o etapa, o grupo de compuestos o etapas establecidas, pero no la exclusion de otros compuestos, composiciones, etapas, o grupos cualesquiera de los mismos. La abreviatura, “p. ej.” se usa en el presente documento para indicar un ejemplo no limitativo y es sinonimo del termino “por ejemplo”.

Para facilitar la revision de las diversas realizaciones de la presente divulgacion, se proporcionan las siguientes explicaciones de los terminos. Los terminos y explicaciones adicionales pueden proporcionarse en el contexto de la presente divulgacion.

Se ha desarrollado un procedimiento rapido y sensible para la cuantificacion de polisorbato en formulaciones lfquidas, incluyendo formulaciones que comprenden protemas (incluyendo glicoprotemas) y/o polisacaridos. El procedimiento tambien es adecuado para la cuantificacion de polisorbato en formulaciones lfquidas que contienen otros excipientes (no polisorbato), y en formulaciones lfquidas que contienen tanto protemas como otros excipientes (no-polisorbato).

Ejemplos

Ejemplo 1: Procedimiento de cuantificacion de polisorbato 80 por GC-MS

La cromatograffa de gases-espectrometna de masas (GC-MS) es un procedimiento comunmente usado y validado para medir el contenido de polisorbato 80 en muestras lfquidas.

Las muestras y los patrones se trataron usando un procedimiento de dos etapas:

(1) Derivatizacion: metanol + transesterificacion de Fischer con HCl.

(2) Extraccion del producto de derivatizacion: fraccionamiento en hexano/medio acuoso. La transmetilacion del polisorbato 80 (usando MeOH + HCl) proporciona el metil ester del acido 9-octadecenoico.

Se uso un patron interno (acido pentadecanoico) para representar la variabilidad de la etapa de derivatizacion. La separacion cromatografica se obtuvo usando una columna capilar de sflice fundida (columna WCOT (tubular abierta con pared recubierta) Ulti-metal de 25 m x 0,25 mm de Varian recubierta con TAP-CB con un DF=010 (Agilent

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Technologies, Santa Clara, Estados Unidos). El intervalo de calibrado era de 50 a 2000 pg/ml. La deteccion por espectrometna de masas del polisorbato 80 y el patron interno (PI) era a una m/z espedfica (relacion masa respecto a carga).

Las muestras y los patrones se prepararon mezclando:

■ 200 pl de muestra o patron

■ 200 pl de acido pentadecanoico (patron interno, PI)

■ 400 |il de MeOH/HCl 4 N

Despues las muestras (o patrones) se calentaron durante una hora a 80 °C y se anadieron 400 |il de hexano para extraer el derivado metil ester. Despues las muestras (o patrones) se centrifugaron durante cinco minutos a 11.000 rpm. La fase de hexano se recogio y se analizo por GC-MS.

La Tabla 1 muestra la relacion masa respecto a carga (m/z) usada para la deteccion por GC-MS del patron interno y el polisorbato 80 y el tiempo de retencion de estos componentes.

Tabla 1

Analito: m/z Tiempo de retencion

Acido pentadecanoico (PI): 256-143 9,29 min

Polisorbato 80: 264-296 10,69 min

La Figura 1 es un ejemplo de un cromatograma de GC-MS en modo SIM que muestra el pico de polisorbato 80. El primer pico corresponde al patron interno (cantidad conocida), y el segundo pico (etiquetado como TIC:25.D\data.ms 10,686 (TIC=Cromatograma de lones Totales)) corresponde al polisorbato derivatizado. El numero de conteos indica la abundancia.

Ejemplo 2: Procedimiento de ATR-FTIR

Se desarrollo un procedimiento de cuantificacion de polisorbato usando ATR-FTIR usando muestras obtenidas durante la produccion de componentes inactivados de vacuna de la gripe a granel.

El virus de la gripe se produjo en celulas EB66®. El cultivo viral se separo de las celulas y se purifico para producir un concentrado a granel usando las siguientes etapas sucesivas: centrifugacion, microfiltracion, ultrafiltracion, ultracentrifugacion por gradiente de sacarosa, inactivacion con p-propiolactona, inactivacion con luz ultravioleta (UV), ultrafiltracion, ruptura (alteracion e inactivacion del virus completo), ultracentrifugacion, cromatograffa, ultrafiltracion y filtracion en 0,22 pm.

Los productos finales purificados a granel comprendfan antfgenos proteicos de la gripe y excipientes.

Los espectros de ATR-FTIR se registraron a temperatura ambiente en un espectrofotometro de FT-IR de haz simple TENSOR™ 27 (Bruker Optics, Ettlingen, Alemania) equipado con un detector de mercurio/cadmio/teluro refrigerado con nitrogeno lfquido a una resolucion nominal de 4 cm-1 y codificado cada cm-1. El espectrofotometro se purgo continuamente con aire seco. Se llevo a cabo un espectro de absorbancia del fondo antes de cada muestra (ERI sin muestra). Este “blanco” se resto del espectro medido de la muestra mediante el programa usado.

Aproximadamente 1 pl de muestra se extendio en el elemento de reflexion interna (ERI) y el disolvente se evaporo lentamente con un flujo suave de nitrogeno. El ERI era un cristal de diamante (Golden Gate Reflectance ATR, Reflex Analytical Corporation, Ridgewood, NJ, Estados Unidos; reflexion simple) transparente a la radiacion infrarroja (IR) de interes. Se uso un alojamiento convencional sellado y purgable de las opticas; se uso un interferometro de Michelson.

Para cada muestra, los espectros se registraron de 4000 a 600 cm-1 y para cada muestra se promediaron multiples escaneos.

Se asigno la region del espectro 3000 - 2800 cm-1 a la cadena alifatica del polisorbato 80; 2200 - 1980 cm-1 al pico correspondiente al patron interno (azida); el pico a 1735 cm-1 es del polisorbato 80 (estiramiento C=O); el pico a 1100 cm-1 se asigna al enlace C-O del polisorbato 80. (Vease Coates, The Interpretation of Infrared Spectra: Published Reference Sources, Applied Spectroscopy Review, Vol. 31 (1-2), 179-192 (1996); Smith, Infrared Spectral Interpretation, a Systematic Approach, CRC Press, Boca Raton, FL, 1999). Las areas de los picos (I), (III) y (IV) se normalizaron usando el area del pico de azida (II) (patron interno).

Tal y como se describe en los Ejemplos 3 y 4, las curvas de calibrado se crearon usando muestras de calibrado que conteman cantidades conocidas de polisorbato, y se identificaron los picos de interes espedficos, usando patrones de referencia con concentraciones conocidas de polisorbato 80. Los patrones de referencia eran (1) soluciones de

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polisorbato 80 en H2O (20, 50, 100, 250 y 500 |jg/ml), y (2) muestras de CC-Gripe a granel purificado con concentraciones conocidas anadidas de polisorbato 80. Los patrones de referencia tambien conteman azida como patron interno (azida al 0,2 % p/v; diluida diez veces para proporcionar una azida final al 0,02 %). El analisis de los datos se llevo a cabo usando los programas OPUS (Bruker Optics, Alemania) y Matlab (Mathworks Inc., Estados Unidos).

Los modos vibracionales generales se representan en la Figura 2. Se usa el infrarrojo medio, aproximadamente 4000 - 400 cm-1 (1,4 - 3,0 jm), para estudiar las vibraciones fundamentals y la estructura asociada. Por ejemplo, los modos vibracionales para un grupo CH2 incluyen el estiramiento simetrico (vs CH2 aproximadamente 2853 cm-1), estiramiento asimetrico (vas CH2 aproximadamente 2926 cm-1), plegado o movimiento en tijera en el plano (8s CH2 aproximadamente 1465 cm-1), plegado u oscilacion en el plano (p CH2 aproximadamente 720 cm-1), plegado o movimiento de arriba a abajo fuera del plano (w CH2 1350 - 1150 cm-1), plegado o torsion fuera del plano (tCH 1350 -1150 cm-1).

Ejemplo 3: Deteccion por ATR-FTIR del polisorbato en agua

Usando el procedimiento tal y como se ha descrito en el Ejemplo 2, se investigo la concentracion de polisorbato usando 20 |ig/ml, 50 |ig/ml, 100 |ig/ml, 250 |ig/ml y 500 |ig/ml de polisorbato 80 en agua (una unica muestra inicial diluida para crear las diferentes concentraciones). Cada muestra contema azida (0,02 % p/v) como patron interno.

La Figura 3 muestra un ejemplo de los espectros obtenidos de las diluciones de polisorbato 80/agua. Cada lmea representa una de las muestras (20 |ig/ml, 50 |ig/ml, 100 |ig/ml, 250 |ig/ml y 500 |ig/ml de polisorbato 80 en agua), y es un valor promedio de 32 escaneos. (Tambien se prepararon los resultados promedio de 256 escaneos por muestra (no mostrados), y se dio la misma correlacion que con los resultados promediados de 32 escaneos). La region 3000 - 2800 cm-1 del espectro se asigna a la cadena alifatica del polisorbato 80; el pico a 2200 - 1980 cm-1 corresponde al patron interno (azida); el pico a 1735 cm-1 es del polisorbato 80 (estiramiento C=O); el pico a 1100 cm-1 se asigna al enlace C-O del polisorbato 80. (Vease Coates, The Interpretation of Infrared Spectra: Published Reference Sources, Applied Spectroscopy Review, Vol. 31 (1-2), 179-192 (1996); Smith, Infrared Spectral Interpretation, a Systematic Approach, cRc Press, Boca Raton, FL, 1999).

Las cinco lmeas en la Figura 3 representan las cinco muestras de la dilucion polisorbato/agua. Las areas de los picos (I), (III) y (IV) son polisorbato normalizado usando la azida (patron interno, mostrado en el area del pico (II)).

Region (I) 3000 - 2800 cm-1 = cadena alifatica del polisorbato;

Region (II) 2200 - 1980 cm-1 = patron interno, azida;

Region (III) pico a 1735 cm-1 = polisorbato (C=O);

Region (IV) pico a 1100 cm-1 = polisorbato (C-O).

Las areas de los picos (I), (III) y (IV) se identificaron debido a que aumentaron en funcion de la concentracion de polisorbato 80.

De estos cinco espectros se trazo la regresion lineal de la Figura 4. La Figura 4 traza las proporciones de las areas de los picos (I, III y IV; normalizadas usando el patron interno). El area esta expresada como unidades arbitrarias. La dosis-respuesta del polisorbato 80 mostro ser lineal en este intervalo con coeficientes de determinacion R2 por encima de 0,99 para el pico (III) y (IV).

Ejemplo 4: Deteccion por ATR-FTIR del polisorbato en muestras de CC-Gripe a granel

Para demostrar que la matriz no afecto a la medicion de polisorbato, se anadio polisorbato 80 (en las cantidades de 20 |ig/ml, 50 |ig/ml, 100 |ig/ml, 250 |ig/ml y 500 |ig/ml) a muestras de CC-Gripe a granel. Las muestras conteman azida como patron interno, y se investigaron usando ATR-FTIR tal y como se ha descrito en los Ejemplos 2 y 3.

La Figura 5 muestra un ejemplo de los espectros obtenidos de las muestras de polisorbato 80/CC-Gripe. Las cinco lmeas en la Figura 5 representan las cinco muestras de polisorbato/gripe diferentes, promediadas de 32 escaneos, y normalizadas usando el patron interno azida. (Las areas de los picos (I), (II) y (III) son como las que se informaron en la Figura 3).

El pico a 1735 cm-1 (III) se identifico debido a que aumento de forma precisa con cantidades anadidas de polisorbato 80. Debido a la complejidad de la matriz, solo el pico (III) puede usarse para identificar y cuantificar el polisorbato 80 en muestras de CC-Gripe. Vease los coeficientes de linealidad a continuacion.

La Figura 6 muestra la regresion lineal trazada para (I) y (III), usando los cinco espectros de la Figura 5. El area esta expresada como unidades arbitrarias. La dosis-respuesta del polisorbato 80 mostro ser lineal en este intervalo con un coeficiente de determinacion r2 superior a 0,99 para el pico (III). Esto indica que la matriz no afecto significativamente a la medicion del polisorbato, y por lo tanto el polisorbato en agua puede usarse como curva de calibrado.

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Ejemplo 5: Deteccion por ATR-FTIR del polisorbato en los patrones de referencia y las muestras de gripe

Los datos obtenidos en los Ejemplos 3 y 4 se usaron para calcular los valores de recuperacion, como se muestran en la Tabla 2. (Valor de recuperacion = % de cantidad conocida de polisorbato que se midio).

Tabla 2

Muestra: 20 |ig/ml 50 |ig/ml 100 |ig/ml 250 |ig/ml 500 |ig/ml Promedio

Polisorbato 80 en H2O: 86 % 110 % 104 % 96 % 101 % 99 %

CC-Gripe a granel con polisorbato 80 anadido: 80 % 89 % 88 % 90 % 98 % 89 %

Ejemplo 6: Uso del patron interno

Las Figuras 7 y 8 representan el efecto del uso del patron interno en la medicion del polisorbato en CC-Gripe a granel. La Figura 7A es una vista aumentada de un ejemplo de pico III obtenido usando el procedimiento de ATR- FTIR como se ha descrito en el Ejemplo 2, para tres muestras (los resultados son el promedio de 256 escaneos) sin normalizacion. La Figura 8A es una vista aumentada de un ejemplo de pico III obtenido usando el procedimiento de ATR-FTIR como se ha descrito en el Ejemplo 2, para tres muestras (los resultados son el promedio de 256 escaneos) donde los picos se han normalizado usando el patron interno (area del pico dividida por el area del pico del patron interno).

Las Figuras 7B y 8B representan graficamente las areas de los picos frente a la concentracion de polisorbato (eje X, |ig/ml) para las Figuras 7 y 8, respectivamente. La normalizacion mejora la linealidad de la respuesta (R2= 0,9933).

Ejemplo 7: Cuantificacion del polisorbato en muestras de CC-Gripe a granel

Tabla 3: Cuantificaciones de polisorbato en muestras de CC-Gripe a granel usando GC-MS (procedimiento tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1) y ATR-FTIR (procedimiento tal y como se ha descrito en el Ejemplo 2). Todas las muestras son a granel purificadas o a granel finales. La presencia de polisorbato era debida al procedimiento de purificacion utilizado.

Tabla 3 - todos los antfgenos producidos en el cultivo celular

Muestras de CC-Gripe (numeros de los lotes): GC-MS: concentracion de polisorbato 80 |ig/ml ATR-FTIR: concentracion de polisorbato 80 |ig/ml Relacion de las mediciones de GC-MS/ATR-FTIR

DFCPB002 -final: 216 249 0,87

DFCPB003 -final: 124 175 0,71

DFCPB004-final: 201 233 0,86

DFCPBDA001: 368 372 0,99

DFCPBDA003: 1124 1088 1,03

DFCPBDA004: 411 387 1,06

DFCPBDA005: 281 321 0,88

DFCPBDA006: 304 306 0,99

EB66-61 a granel A: 382 392 0,97

EB66-61 a granel B: 356 316 1,13

EB66-69 a granel A: 255 204 1,25

EB66-69 a granel B: 326 309 1,06

EFCPAHA016-A: 268 294 0,91

EFCPAHA026: 122 128 0,95

EFCPAHA028: 129 191 0,68

EFCPAHA037: 338 351 0,96

EFCPAHA038: 737 789 0,93

La comparabilidad de los resultados indica que el procedimiento de ATR-FTIR es un procedimiento alternativo fiable para la cuantificacion de polisorbato. El uso del presente procedimiento de ATR-FTIR para la cuantificacion de polisorbato no requiere un pretratamiento qmmico de la muestra, y no muestra interferencias de la matriz purificada de CC-Gripe a granel.

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La Tabla 4 muestra la cuantificacion de polisorbato 80 en muestras obtenidas en diferentes puntos durante el procesamiento del lote EB66-69 (cultivo celular). Se observo una buena correlacion de los datos entre los dos procedimientos de medicion.

Tabla 4: Cuantificacion de polisorbato (GC-MS y ATR-FTIR)

Etapas del procedimiento: Tampon de la muestra Muestra Polisorbato 80

EB66-69: Conc. medida (GC-MS |ig/ml) Conc. medida (ATR-FTIR |ig/ml) Medida (|ig/ml)

Ultrafiltracion: PBS UF1 <51 <LDC 0

Ultracentrifugacion: PBS-Tx100 SN 802 75 0

Ultracentrifugacion: PBS-Tx100 SN 858 <LDC 0

Retirada del detergente: PBS-Tw80-Tx100-SVE FT <51 18* 50-200

Ultrafiltracion: PBS-Tw80-Tx100-SVE UF2 520 539 100-500

Filtracion esterilizante: PBS-Tw80-Tx100-SVE a granel 255 219 100-500

*Ruido LDC = lfmite de cuantificacion

Como se muestra en la Tabla 4, la tecnica GC-MS indico la presencia de polisorbato antes de la adicion del polisorbato 80.

La Figura 9 compara la medicion por ATR-FTIR en el area del pico III, usando muestras de dos puntos diferentes en el procedimiento. La muestra “ruptura SN” se tomo antes de anadirse cualquier polisorbato durante el procedimiento de purificacion. La Figura 9 no muestra interferencias en el area del pico III. En comparacion a la muestra “PBS a granel”, tomada en un punto en la purificacion tras anadirse el polisorbato. Esta muestra contiene polisorbato (etiquetada como TWEEN80 en el grafico).

La Figura 9 demuestra la especificidad de la presente tecnica de ATR-FTIR para medir polisorbato en una muestra que contiene protemas.

Referencias adicionales

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Blanco y col., Analytical control of pharmaceutical production steps by near infrared reflectance spectroscopy, Analytica Chimica Acta, 392(2-3):237 (1999)

Chang y col., Study of Interaction of Tributyl Phosphate, Non-ionic Surfactant and Water by FT-Infrared Spectrum. ISEC 2002, Cape Town, South Africa, 131-136, 2002

Hillgren y col., Protection mechanism of Tween 80 during freeze-thawing of a model protein, LDH, International Journal of Pharmaceutics 2002 237:1-2 (57-69)

Kato y col., Determination of polysorbates in foods by colorimetry with confirmation by infrared spectrophotometry, thin-layer chromatography, and gas chromatography, J Assoc Off Anal Chem. 1989 Ene- Feb;72(1):27-9.

Kerwin y col., Effects of tween 80 and sucrose on acute short-term stability and long- term storage at -20 °C of a recombinant hemoglobin, Journal of Pharmaceutical Sciences 1998 87:9 (1062-1068)

Kishore y col., The degradation of polysorbates 20 and 80 and its potential impact on the stability of biotherapeutics. Pharm Res. 2011 May; 28(5):1194-210. Epub 2011 Mar 3.

Li y col., Effect of poly(ethylene glycol) stearate on the phase behavior of monocaprate/Tween80/water system and characterization of poly(ethylene glycol) stearate-modified solid lipid nanoparticles, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 2008 317:1-3 (352-359)

Schwegman y col., Evidence of partial unfolding of proteins at the ice/freeze-concentrate interface by infrared microscopy, Journal of Pharmaceutical Sciences 2009 98:9 (3239-3246)

Tian y col., Enhanced brain targeting of temozolomide in polysorbate-80 coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles, Int J Nanomedicine. 2011;6:445-52. Epub 2011 Feb 23.

Xie y col., Improvement of antifouling characteristics in a bioreactor of polypropylene microporous membrane by the adsorption of Tween 20, Journal of Environmental Sciences Volumen 19, Issue 12, 2007, Paginas 1461-1465 Xie y col., Surface modification of polyethylene membrane by adsorption of Tween 20 to improve antifouling characteristics in a bioreactor, Environmental Science and Technology, 2009

Xie y col., Surface modification of polypropylene microporous membranes by the adsorption of non-ionic surfactants, Chinese Journal of Polymer Science (Edicion inglesa) 24(4), Julio 2006, Paginas 421-429

Yan y Chen, Investigation of microstructure of colloidal liquid aphrons (CLA), Journal of Xi'an Jiaotong University, 41(11):1351-54 (2007)

Yan y Chen, Zheng y col., FTIR study of Tween 80/1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate/toluene microemulsions, Colloid Polymer Sci 287:871-876 (2009).

5 Yelenskii, y col., Phase state determination of tween-80-water binary mixtures by IR spectroscopy, Moscow

University Chemistry Bulletin, 47 (6), pp. 386-392 (2006)

Zheng y col., FTIR study of Tween80/1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate/ toluene microemulsions, Colloid and Polymer Science 2009 287:7 (871-876)

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Claims

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25

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35

40

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50

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de determinacion de la concentracion de una especie de polisorbato en una mezcla conocida por contener una unica especie de polisorbato, que comprende:

a) obtener una muestra de ensayo de dicha mezcla;

b) anadir un patron interno a dicha muestra de ensayo;

c) obtener, con un espectrometro, un espectro de reflectancia total atenuada (ATR) del infrarrojo medio de la muestra de ensayo;

d) identificar, del espectro de reflectancia, un numero de onda que corresponde al pico C=O de dicha especie de polisorbato;

e) identificar, del espectro de reflectancia, un numero de onda que corresponde al pico del patron interno;

f) calcular el area bajo la curva para dicho numero de onda del C=O, normalizada mediante el area del pico del patron interno; y

g) comparar dicha area normalizada con una curva de calibrado para determinar la concentracion de dicha especie de polisorbato en dicha muestra de ensayo.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que dicha mezcla comprende un antigeno proteico, opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en protemas del virus de la gripe; protemas hemaglutininas (HA) de la gripe; protemas neuraminidasas (NA) de la gripe; protemas del virus del sarampion, protemas del virus de las paperas, protemas del virus de la varicela (chickenpox), protemas del virus de la rubeola, protemas del virus del dengue, protemas del virus respiratorio sincitial (VRS), protemas de citomegalovirus (CMV), protemas del virus del papiloma humano (VPH); protemas del virus de la hepatitis A; protemas del virus de la hepatitis B; protemas del rotavirus; protemas del virus de la poliomielitis; protemas del virus del sarampion; protemas del virus herpes; protemas del virus de la viruela; protemas de poxvirus; protemas de S. pneumococcus.; protemas de Haemophilus influenzae B; protemas de Corynebacterium diphtheria; protemas de especies de Corynebacterium; protemas de Clostridium tetani; protemas de especies de Clostridium; protemas de Bordetella pertussis; y protemas de especies de Bordetella.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1 en el que dicha mezcla comprende un antfgeno polisacarido opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en polisacaridos de especies de Streptococcus; polisacaridos de Streptococcus pneumonia; polisacaridos de Neisseria meningitides; polisacaridos de Haemophilus influenzae; polisacaridos de especies de Salmonella; y polisacaridos de Salmonella typhi.
4. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que dicha muestra de ensayo no se pretrata qmmicamente antes de obtener los espectros de reflectancia total atenuada del infrarrojo medio de la muestra de ensayo.
5. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que la unica especie de polisorbato es polisorbato 80 y el numero de onda correspondiente al pico C=O es aproximadamente 1735 cm-1.
6. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que dicho patron interno es azida.
7. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que dicha muestra de ensayo es una muestra lfquida, opcionalmente dicha muestra de ensayo es una muestra acuosa.
8. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior en el que dicha mezcla comprende excipientes no polisorbato.
9. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior en el que dicha mezcla comprende un excipiente no polisorbato seleccionado de (4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietilenglicol, t-Octilfenoxipolietoxietanol, eter terc- octilfemlico de polietilenglicol y succinato de vitamina E (SVE).
10. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior en el que dicha mezcla es un componente de una vacuna a granel.
11. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que dicha muestra de ensayo se pone en contacto con un elemento de reflexion interna (ERI) simple antes de obtener los espectros de ATR.
12. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que dicha muestra de ensayo se pone en contacto con un elemento de reflexion interna (ERI) multiple antes de obtener los espectros de ATR.
13. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior en el que la muestra se seca en nitrogeno antes de obtener los espectros.
14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que dicha mezcla es una solucion acuosa que comprende dicha unica especie de polisorbato, en el que dicha especie de polisorbato es polisorbato 80, y en el que dicho procedimiento comprende anadir azida a dicha muestra de ensayo como patron interno; medir el area del pico

a 1735 cm-1 y a 2200 - 1980 cm-1 usando ATR-FTIR; normalizar dicha area del pico a 1735 cm-1 con dicha area del pico a 2200 - 1980 cm-1 y determinar el area normalizada del pico a 1735 cm-1.