ES2574790T3 - Procedimiento para aumentar la especificidad de pruebas de diagnóstico para enfermedades autoinmunitarias - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para aumentar la especificidad de un ensayo de enfermedad autoinmunitaria basado en anticuerpos que comprende las etapas de: a. poner en contacto una muestra de suero o plasma con un antígeno derivado del moteado fino denso 70 (DFS70) para formar un complejo entre el antígeno derivado del DFS70 y los anticuerpos anti-DFS70 que pueden estar presentes en la muestra; b. hacer reaccionar la muestra con una diana de la enfermedad autoinmunitaria; y c. detectar los anticuerpos para la diana de la enfermedad autoinmunitaria.

Description

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Otros ejemplos incluyen crioglobulinemia mixta esencial, neuropatías desmielinizantes, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, enfermedad de Devic (neuromielitis óptica), lupus discoide, síndrome de Dressler, endometriosis, fascitis eosinofílica, eritema nudoso, síndrome de Evans, fibromialgia, alveolitis fibrosante, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), glomerulonefritis, granulomatosis con poliangitis (GP) véase enfermedad de Wegener, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, hipogammaglobulinemia, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), nefropatía por IgA, enfermedad esclerosante relacionada con IgG4, lipoproteínas inmunorreguladoras, miositis con cuerpos de inclusión, diabetes dependiente de insulina (tipo 1), cistitis intersticial, artritis juvenil, diabetes juvenil, síndrome de Kawasaki, síndrome de Lambert-Eaton, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, conjuntivitis leñosa , enfermedad IgA lineal (EAL), Lupus (LES), enfermedad de Lyme crónica, enfermedad de Meniere, poliangeítis microscópica, enfermedad mixta del tejido conjuntivo (EMTC), úlcera de Mooren, enfermedad de Mucha-Habermann, esclerosis múltiple, miastenia gravis, miositis, narcolepsia, neuromielitis óptica (de Devic), neutropenia, penfigoide cicatricial ocular y neuritis óptica.

Aún otros ejemplos incluyen reumatismo palindrómico, PANDAS (trastornos neuropsiquiátricos pediátricos autoinmunitarios asociados con Streptococcus), degeneración cerebelosa paraneoplásica, hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), síndrome de Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, Pars planitis (uveítis periférica), pénfigo, neuropatía periférica, encefalomielitis perivenosa, anemia perniciosa, síndrome de POEMS, poliarteritis nodosa, síndromes poliglandulares autoinmunitarios de tipo I, II y III, polimialgia reumática, polimiositis, síndrome postinfarto de miocardio, síndrome postpericardiotomía, dermatitis por progesterona, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fibrosis pulmonar idiopática, pioderma gangrenoso, aplasia pura de células rojas, fenómeno de Raynaud, distrofia simpática refleja, síndrome de Reiter, policondritis recidivante, síndrome de piernas inquietas, fibrosis retroperitoneal, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, escleritis, escleroderma, síndrome de Sjögren, autoinmunidad del esperma y testicular, síndrome de la persona rígida, endocarditis bacteriana subaguda (EBS), síndrome de Susac, oftalmía simpática, arteritis de Takayasu, arteritis temporal / arteritis de células gigantes, púrpura trombocitopénica (PT), síndrome de Tolosa-Hunt, mielitis transversa, colitis ulcerosa, enfermedad indiferenciada del tejido conectivo (EITC), uveítis, vasculitis, dermatosis vesiculoampollosas, vitíligo, granulomatosis de Wegener (ahora denominada granulomatosis con poliangitis (GP)).

Autoanticuerpos

El sistema inmunitario del ser humano protege al cuerpo contra la infección mediante la generación de anticuerpos contra sustancias extrañas o produciendo linfocitos T citotóxicos que tienen receptores que reconocen ciertos péptidos que invaden o infectan las células. Los anticuerpos, también conocidos como inmunoglobulinas, abreviado “Ig”, están en la superficie de los linfocitos B y en la sangre u otros líquidos corporales de los vertebrados. Normalmente están compuestos de unidades estructurales básicas cada una con dos cadenas pesadas grandes y dos cadenas ligeras pequeñas para formar, por ejemplo, monómeros con una unidad básica, dímeros con dos unidades o pentámeros con cinco unidades. Existen varios tipos diferentes de cadenas pesadas de anticuerpos, y varios tipos diferentes de anticuerpos, que se agrupan en diferentes isotipos en base a que cadena pesada poseen. Se conocen cinco isotipos diferentes de anticuerpos en los mamíferos, IgM, IgA, IgG, IgD e IgE, que desempeñan diferentes funciones, y ayudan a dirigir la respuesta inmunitaria apropiada para cada tipo diferente de molécula extraña que se encuentran.

Aunque la estructura general de todos los anticuerpos es muy similar, una pequeña región en la punta de la proteína es extremadamente variable, lo que permite que existan millones de anticuerpos con estructuras en la punta ligeramente diferentes. Esta región se conoce como la región hipervarible que incluye la región determinante de complementariedad (RDC). Cada una de estas variantes puede unirse a una diana diferente, conocida como antígeno. Esta enorme diversidad de anticuerpos permite que el sistema inmunitario reconozca igualmente una amplia diversidad de antígenos. La única parte del antígeno reconocida por un anticuerpo se denomina epítopo. Estos epítopos se unen con su anticuerpo correspondiente en una interacción altamente específica, denominada de ajuste inducido, que permite a los anticuerpos identificar y unirse solo a su antígeno único entre los millones de moléculas diferentes que componen un organismo. El reconocimiento de un antígeno por un anticuerpo dirige el ataque de otras partes del sistema inmunitario. Los anticuerpos también pueden neutralizar dianas directamente mediante, por ejemplo, la unión a una parte de un patógeno que la necesita para causar una infección.

La gran y diversa población de anticuerpos se genera por combinaciones aleatorias de un conjunto de segmentos de genes que codifican diferentes sitios de unión a antígenos (o paratopos), seguido de mutaciones aleatorias en esta zona del gen del anticuerpo, que crean aún más diversidad. Una selección de anticuerpos con alta afinidad por el patógeno conduce a los resultados de la respuesta inmunitaria en un aumento de la producción de anticuerpos reactivos. Los genes de los anticuerpos también se reorganizan en un proceso denominado cambio de clase que cambia la base de la cadena pesada a otra, creando de un isotipo del anticuerpo diferente que retiene la región variable específica del antígeno. El cambio de clase permite que una única reactividad del anticuerpo se use por varias partes diferentes del sistema inmunitario. La producción de anticuerpos es la principal función del sistema inmunitario humoral.

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El antígeno también puede prepararse usando la técnica de síntesis en fase sólida inicialmente descrita por R. B. Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85:2149-2154). Pueden encontrarse otras técnicas de síntesis, por ejemplo, en Bodanszky, M. y col., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2ª Ed., (1976) así como en otros trabajos de referencia conocidos por los expertos en la materia. Puede encontrarse un resumen de las técnicas de síntesis en J. Stuart y J.

D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., 3ª Ed., Neurath, H. y col., Eds.,

p. 104-237, Academic Press, Nueva York, N.Y. (1976). Los grupos protectores adecuados para su uso en dichas síntesis se encontrarán en los textos anteriores, así como en J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, Nueva York, N.Y. (1973).

En general, los procedimientos sintéticos comprenden la adición secuencial de uno o más residuos de aminoácido o residuos de aminoácido protegidos a una cadena de polipéptido en crecimiento. En la síntesis en fase sólida, el aminoácido protegido o derivatizado se une a un soporte sólido inerte a través de su grupo carboxilo o amino no protegido. Después el grupo protector del grupo amino o carboxilo se retira selectivamente y se mezcla de manera similar el siguiente residuo de aminoácido protegido en la secuencia y se hace reaccionar en condiciones adecuadas para formar el enlace amida con el residuo unido al soporte sólido. Después el grupo protector del grupo amino y carboxilo se retira de este residuo recién añadido y después se añade el siguiente residuo en la secuencia, y así sucesivamente. Después de que todos los aminoácidos deseados se han unido en la secuencia apropiada, se retira secuencial o simultáneamente cualquiera de los grupos protectores restantes del grupo terminal y lateral. Después la secuencia de aminoácidos se separa del soporte sólido. Para controlar la formación de enlaces disulfuro de un péptido que tiene múltiples residuos de cisteína, pueden usarse diferentes grupos protectores que pueden retirarse independientemente permitiendo que solo las cisteínas que se desean sean reactivas para la formación del enlace disulfuro (Hargittai, B. y Barany, G., 1999, J. Peptide Res. 54:468-479).

La secuencia de aminoácidos del antígeno puede modificarse si se purifica de una fuente natural, se produce de manera recombinante o se prepara sintéticamente. El antígeno modificado se selecciona para que sea una variante funcional o inmunológicamente equivalente de las variaciones biológicas que suceden naturalmente (por ejemplo, las variantes alélicas, ortólogos, variantes de empalme o variantes post-translacionales).

Las modificaciones post-translacionales que suceden durante la vida de una proteína se consideran “sustituciones permisibles” de los residuos de aminoácido y pueden mejorar la unión de la secuencia antigénica al autoanticuerpo. Si bien no se conocen todas las modificaciones post-translacionales de las proteínas, se anticipa que un experto en la materia haría sustituciones permisibles dentro de las secuencias de aminoácidos para determinar si puede lograrse la unión mejorada una vez se identifican tales modificaciones post-translacionales para esa proteína en particular. Los ensayos ELISA pueden determinar fácilmente las secuencias modificadas que tienen una reactividad y/o selectividad aumentada para un anticuerpo.

Otras modificaciones dentro del alcance de la presente invención proporcionan algunas ventajas en el uso del antígeno, específicamente en su capacidad para imitar el sitio antigénico de la proteína, así como la afinidad por el autoanticuerpo de interés. Estas modificaciones, referidas como “variantes”, incluyen cualquier secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos se han añadido o insertado, eliminado o sustituido con otro residuo. El término “sustituido” incluye las modificaciones de un residuo de aminoácido existente mediante mutagénesis de sitio dirigido, mutagénesis aleatoria o mediante tratamiento químico, tal como mediante modificación enzimática.

Las variantes de adición incluyen fusiones N-o C-terminal e inserciones intrasecuencia de aminoácidos individuales

o múltiples. En un tipo de variante de adición, los residuos de cisteína pueden añadirse en los extremos de las secuencias de aminoácidos o insertarse entre las secuencias de aminoácidos. Estos residuos de cisteína pueden utilizarse para formar enlaces disulfuro en el péptido o entre dos o más péptidos. Se conoce bien en la técnica que los péptidos cíclicos, así como los complejos que contienen múltiples copias de péptidos antigénicos, proporcionan uniones mejoradas a sus dianas en comparación con sus homólogos lineales. El número de conformaciones que pueden formarse por el péptido dependerá de la cantidad de residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos. El control de la formación del enlace disulfuro intramolecular puede alcanzarse usando grupos protectores que pueden retirarse selectivamente (Hargittai, B. y Barany, G., 1999, J. Peptide Res. 54:468-479). También se ha encontrado que los enlaces disulfuro preferenciales pueden formarse mediante la inserción de residuos de aminoácido cargados adyacentes a los residuos de cisteína. Específicamente, cuando se prefiere un puente disulfuro entre dos residuos de cisteína inespecíficos, los residuos de aminoácido cargados opuestamente pueden colocarse adyacentes a estas cisteínas para promover la unión a través de interacciones de carga. En la misma medida, donde algunos residuos de cisteína están flanqueados por aminoácidos cargados idénticamente, se prevé que no se favorecerá la formación de disulfuro. Adicionalmente, la formación de puentes sulfhidrilo intramoleculares e intermoleculares también puede controlarse por el pH y la concentración de antígeno.

Las variantes de deleción pueden prepararse mediante truncamientos del N-o C-terminal o por la eliminación intrasecuencia de los residuos de aminoácido. Los truncamientos pueden prepararse por digestión de las secuencias antigénicas purificadas obtenidas de la proteína. Alternativamente, la secuencia antigénica puede prepararse sintéticamente, o de manera recombinante al tener deleciones intrasecuencia o truncamientos terminales.

Las sustituciones de aminoácidos dentro de la secuencia antigénica pueden usarse para alterar la función o características químicas del antígeno. Específicamente, los residuos de aminoácido pueden sustituirse para afectar

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a la estructura, carga, hidrofobicidad o hidrofilicidad de la secuencia antigénica. Por ejemplo, el aminoácido prolina actúa para restringir la conformación de las secuencias antigénicas, lo que puede resultar en una actividad de unión mejorada para el anticuerpo. El ensayo ELISA puede determinar fácilmente una actividad mejorada de estas secuencias antigénicas modificadas.

Las variantes pueden tener desde 1 a 3, 5, 10,15, 20, 25 o 50 sustituciones, inserciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones pueden ser conservadoras, no conservadoras, o una combinación de ambas. Las secuencias antigénicas de la presente invención pueden comprender al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 50 residuos de aminoácido consecutivos de una proteína natural. Además, pueden ser al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % idénticas a la proteína natural. Adicionalmente, pueden tener una actividad inmunológica de más del 1 %, 10 %, 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % de una proteína natural.

El antígeno de bloqueo de la presente invención funciona principalmente para unirse a los autoanticuerpos anti-DFS70 en una muestra del paciente de manera que cualquiera de los autoanticuerpos anti-DFS70 que pueden estar presentes se unan y por lo tanto no puedan participar en una reacción posterior con una diana de la enfermedad autoinmunitaria. Esto puede conseguirse incluyendo una etapa de pre-incubación antes de realizar una prueba de inmunodiagnóstico de una muestra objeto con una diana de la enfermedad autoinmunitaria.

Para los fines de la presente invención, el antígeno derivado del DFS70 usado como antígeno de bloqueo puede ser una proteína DFS70 de origen natural que se ha extraído usando técnicas de extracción de proteínas bien conocidas por los expertos en la materia. Alternativamente, en diversas realizaciones, la proteína o antígeno del DFS70 puede ser un péptido sintético. En otras realizaciones, la proteína DFS70 puede ser un péptido recombinante producido a través de técnicas de ingeniería molecular.

En realizaciones más específicas, el antígeno de bloqueo del DFS70 de la presente invención puede ser un antígeno derivado del DFS70, en el que el antígeno de bloqueo está compuesto de al menos un fragmento de la proteína DFS70. Se ha informado por Ogawa y col. (Ogawa et al. 2004 J Autoimmun 23: 221-231) de una evidencia de la variación de la reactividad de los epítopos en antígenos derivados del DFS70 en el que los constructos de DFS70 que comprenden diferentes partes recombinantes de la proteína DFS70 se probaron para la autoantigenicidad. En diversas realizaciones, el antígeno de bloqueo del DFS70 puede ser una proteína completa o un péptido inmunogénico derivado del DFS70. Los antígenos peptídicos adecuados para la unión a autoanticuerpos anti-DFS70 en una muestra del paciente pueden diseñarse, construirse y emplearse de acuerdo con técnicas bien conocidas. Véase, por ejemplo, Harlow & Lane Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Czernik, Methods in Enzymology,

201: 264-283 (1991); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 21-49 (1962)). De acuerdo con esto, se contempla en la presente invención que la proteína DFS70, y los fragmentos de la misma, pueden ser adecuados para hacerlos reaccionar como un antígeno de bloqueo en los procedimientos descritos en el presente documento.

Se contempla que las modificaciones y cambios pueden hacerse en la preparación de un antígeno de bloqueo del DFS70 y aún obtener una molécula funcional que codifica una proteína con características deseables. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, regiones de unión al antígeno de anticuerpos o sitios de unión en moléculas de sustrato. Dado que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína es lo que define esa actividad funcional biológica de la proteína, algunas sustituciones de aminoácidos pueden hacerse en una secuencia de la proteína y sin embargo obtener una proteína con propiedades similares. Por tanto, se contempla que pueden hacerse diversos cambios en la secuencia de aminoácidos de diversos antígenos derivados del DFS70 sin pérdida apreciable en su utilidad o actividad biológica.

Pre-incubación

Preparación de una muestra objeto: En algunas realizaciones de la presente invención, una muestra objeto que consta de suero, plasma u otro fluido corporal como se ha descrito previamente se obtiene del sujeto para la preincubación con el antígeno de bloqueo. Además, la muestra objeto puede estar en diversas formas incluyendo, pero sin limitación, líquida, congelada, refrigerada, liofilizada y otras formas conocidas en la técnica. La muestra también puede someterse a unas etapas adicionales de purificación o tratamiento antes de y/o seguido de la etapa de preincubación en el presente documento.

En diversas realizaciones que se describen a continuación, el uso de la expresión “solución de DFS” se entiende que incluye el antígeno del DFS70 y el antígeno derivado del DFS70 como se ha descrito anteriormente. En una realización ejemplar, la solución de DFS70 puede prepararse diluyendo el antígeno del DFS70 o el antígeno derivado del DFS70 en un tampón para formar una solución de DFS70. En otras realizaciones de la presente invención, el antígeno derivado del DFS70 puede prepararse en diversas formas incluyendo, pero sin limitación, líquida, congelada, refrigerada, liofilizada, inmovilizada en una fase sólida mediante absorción o unida covalentemente y otras formas conocidas en la técnica.

Puesta en contacto de la muestra objeto con el antígeno derivado del DFS70: Una realización ejemplar de una etapa de pre-incubación consiste en preparar una solución de DFS70 para usarse como diluyente, en la que una muestra objeto se pone en contacto con la solución de DFS70 para absorber los anticuerpos anti-DFS70. En realizaciones

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