ES2575629T3 - Polipéptido del Factor VIII - Google Patents

Description

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derivados de FVIII y, por ejemplo, la proteína dihidrofolato reductasa (DHFR), es apropiado seleccionar el hospedador de acuerdo con el tipo de proteína DHFR empleada. Si se emplea proteína DHFR de tipo silvestre, es preferible seleccionar una célula hospedadora que carezca de DHFR, permitiendo así el uso de la secuencia codificadora de DHFR como marcador de una transfección con éxito en medio selectivo que carece de hipoxantina, glicina y timidina.

Por otro lado, si se utiliza la proteína DHFR con baja afinidad de unión con metotrexato (MTX) como secuencia reguladora, no es necesario utilizar células resistentes a DHFR. La DHFR mutante es resistente al MTX, por lo tanto, los medios que contienen MTX se pueden utilizar como medios de selección con la condición de que las propias células hospedadoras sean sensibles a MTX. Alternativamente, un gen DHFR de tipo silvestre se puede emplear como marcador de la amplificación en una célula hospedadora que no carezca de DHFR, siempre que se emplee un segundo marcador seleccionable del fármaco, tal como la resistencia a la higromicina. Los ejemplos que se exponen describen el uso de células CHO (células CHO-DBX11) resistentes a MTX como células hospedadoras y vectores de expresión que emplean el promotor de CMV y SV40 como secuencias reguladoras para dirigir la expresión de los derivados de FVIII y de DHFR, respectivamente.

Polinucleótidos variantes y mutantes

Variantes de ácidos nucleicos de este tipo incluyen las producidas por sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar uno o más nucleótidos. Alteraciones en la secuencia de aminoácidos pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, conservadoras o no conservadoras. Especialmente preferidas entre éstas son las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran las propiedades y las actividades de los polipéptidos de la presente invención o de porciones de los mismos. También se prefieren a este respecto las sustituciones conservadoras.

La invención permite el uso de secuencias en vectores de expresión, así como para transfectar células hospedadoras y líneas celulares, siendo éstas células, procariotas o eucariotas. La invención también permite la purificación de los polipéptidos expresados a partir del vector de expresión. El vector de expresión puede contener diversos marcadores moleculares para facilitar la purificación. Posteriormente, la estructura artificial de expresión obtenida puede transformarse en cualquier célula hospedadora elegida. Los lisados celulares procedentes de la célula hospedadora se aíslan por métodos establecidos, bien conocidos en la técnica.

Polipéptidos variantes y mutantes

Para mejorar o alterar las características del polipéptido de FVIII de la presente invención, se pueden emplear aminoácidos modificados genéticamente. La tecnología de ADN recombinante conocida por los expertos en la técnica se puede utilizar para crear nuevos polipéptidos mutantes incluyendo sustituciones, deleciones, adiciones de aminoácidos únicas o múltiples, o proteínas de fusión. Tales polipéptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo, un aumento/disminución de la actividad o un aumento/disminución de la estabilidad. Además, se pueden purificar con mayor rendimiento y muestran una solubilidad mejor que el polipéptido natural correspondiente, al menos bajo ciertas condiciones de purificación y almacenamiento.

Anticuerpos

En una realización, la presente invención se dirige a la detección de la presencia de un polipéptido de FVIII usando una variedad de métodos de detección. Una forma de detectar un polipéptido del Factor VIII es marcar un ligando que se une específicamente al polipéptido de FVIII. Un ligando de este tipo puede ser un anticuerpo. El polipéptido de FVIII purificado se puede utilizar para producir un anticuerpo monoclonal o policlonal. Los fragmentos de polipéptido del Factor VIII también se pueden utilizar para producir un anticuerpo monoclonal o policlonal. Un anticuerpo monoclonal o policlonal obtenido posteriormente se puede utilizar para determinar la presencia de un polipéptido de FVIII en diversas muestras que incluyen células, tejidos y fluidos corporales tales como sangre, suero, plasma y orina, pero no limitados a los mismos. El polipéptido de FVIII se puede someter a ensayo usando una variedad de métodos biológicos moleculares, que incluyen hibridación in situ, inmunoprecipitación, tinción inmunofluorescente, análisis por transferencia Western y así sucesivamente, pero no se limitan a los mismos. Se puede llevar a cabo un ELISA utilizando un anticuerpo monoclonal contra un polipéptido de FVIII para determinar la cantidad de polipéptido de FVIII en la muestra biológica, incluyendo fluidos corporales de seres humanos que se cree que padecen un trastorno de la coagulación de la sangre, tal como la hemofilia.

Los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-Id para anticuerpos de la invención), y fragmentos que se unen a epítopos de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo", tal y como se usa en esta memoria, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

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mosómica de los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo (Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:89328935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989).

La entrega de los ácidos nucleicos a un paciente puede ser directa, en cuyo caso el paciente es expuesto directamente al ácido nucleico o a vectores portadores del ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso, las células se transforman primero con los ácidos nucleicos in vitro y, a continuación, se trasplantan al paciente. Estas dos metodologías se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.

En una realización específica, las secuencias de ácido nucleico se administran directamente in vivo, en donde se expresan para producir el producto codificado. Esto se puede lograr por cualquiera entre numerosos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, construyéndolas como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolas de modo que se vuelven intracelulares, por ejemplo, mediante infección usando vectores retrovíricos defectuosos o atenuados u otros vectores víricos, o mediante una inyección directa de ADN desnudo, o recubriendo con lípidos o receptores la superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o administrándolas ligadas a un péptido que es conocido por entrar en el núcleo, administrándolas ligadas a un ligando sujeto a endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)) (que se pueden utilizar para dirigirse a tipos celulares que expresan específicamente los receptores), y así sucesivamente. En otra realización, se pueden formar complejos de ácido nucleico-ligando en donde el ligando comprende un péptido vírico fusogénico para destruir endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosómica. En aún otra realización, el ácido nucleico se puede dirigir in vivo para la captación y la expresión específica en células, dirigiéndolo a un receptor específico. Alternativamente, el ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro del ADN de la célula hospedadora para expresión, mediante recombinación homóloga (Koller y Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

En una realización específica, se usan vectores víricos que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido que se va a utilizar en la terapia génica, se clonan en uno o varios vectores, lo que facilita la entrega del gen a un paciente. Los vectores retrovíricos, vectores adenovíricos y virus adenoasociados son ejemplos de vectores víricos que se pueden utilizar. Los vectores retrovíricos contienen los componentes necesarios para un correcto empaquetamiento del genoma vírico y la integración en el ADN de la célula hospedadora.

Otra metodología para la terapia génica implica transferir un gen a células en cultivo tisular por métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección vírica. Por lo general, el método de transferencia incluye la transferencia a las células de un marcador seleccionable. Las células se seleccionan después para aislar aquellas células que han captado y están expresando el gen transferido. Esas células se entregan a continuación a un paciente.

En esta realización, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Tal introducción puede llevarse a cabo por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero no limitado a transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector vírico o bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia génica mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos y así sucesivamente. Se conocen numerosos métodos en la técnica para la introducción de genes ajenos en las células y se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención, siempre que no se afecte a las funciones necesarias de desarrollo y fisiológicas de las células receptoras. La técnica debe proporcionar una transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que la célula puede expresar el ácido nucleico y se puede heredar y expresar preferiblemente en su progenie celular.

Las células en las que se puede introducir un ácido nucleico a los efectos de la terapia génica, comprenden cualquier tipo celular deseado, disponible, e incluyen pero no se limitan a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre o progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, tal como se obtienen a partir de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, y así sucesivamente.

En una realización preferida, la célula empleada para la terapia génica es autóloga para el paciente.

En una realización en la que se usan células recombinantes en terapia génica, las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido se introducen en las células de tal manera que son expresables por las células o su progenie, y las células recombinantes se administran luego in vivo para el efecto terapéutico. En una realización específica, se utilizan células madre o progenitoras. Cualquier célula madre y/o progenitora que se puede aislar y mantener in vitro se puede utilizar potencialmente de acuerdo con esta realización de la presente invención.

En una realización específica, el ácido nucleico que se va a introducir para los fines de terapia génica comprende un promotor inducible ligado funcionalmente a la región codificadora, de tal manera que la expresión del ácido nucleico se puede vigilar, controlando la presencia o ausencia del inductor apropiado de la transcripción.

Composición terapéutica

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En una realización, la presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades de la coagulación de la sangre. De esta manera, el compuesto terapéutico de la invención se puede administrar a pacientes humanos que padecen

o son propensos a padecer la enfermedad, proporcionando compuestos que estimulan la coagulación de la sangre. En particular, la enfermedad puede ser la hemofilia, en particular, la hemofilia A.

La formulación de compuestos terapéuticos se conoce generalmente en la técnica y se puede hacer referencia convenientemente a Remington's Pharmaceutical Sciences, 17ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., EE.UU. Por ejemplo, se puede administrar desde aproximadamente 0,05 μg a aproximadamente 20 mg por kilogramo de peso corporal al día. El régimen de dosificación se puede ajustar para proporcionar una respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar diariamente varias dosis divididas o la dosis se puede reducir proporcionalmente según esté indicado por las exigencias de la situación terapéutica. El compuesto activo se puede administrar de una manera conveniente tal como por vía oral, intravenosa (cuando son hidrosolubles), intramuscular, subcutánea, intranasal, intradérmica o supositorio o mediante un implante (por ejemplo, utilizando moléculas de liberación lenta por la vía intraperitoneal o empleando células, por ejemplo, monocitos o células dendríticas sensibilizadas in vitro y transferidas de forma pasiva al receptor). Dependiendo de la vía de administración, se puede requerir que el péptido esté recubierto con un material para protegerlo de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar dichos ingredientes.

Por ejemplo, la baja lipofilicidad de los péptidos les permitirá que sean destruidos en el tracto gastrointestinal por enzimas capaces de escindir enlaces peptídicos y en el estómago por hidrólisis ácida. Con el fin de administrar los péptidos por otra vía distinta a la administración parenteral, se pueden recubrir o administrar con un material que evite su inactivación. Por ejemplo, los péptidos se pueden administrar en un adyuvante, coadministrar con inhibidores enzimáticos o en liposomas. Los adyuvantes contemplados en esta memoria incluyen resorcinoles, tensioactivos no iónicos tales como éter oleílico de polioxietileno y éter n-hexadecílico de polietileno. Los inhibidores enzimáticos incluyen inhibidor de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DEP) y Trasylol. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua-en-aceite-en-agua, así como liposomas convencionales.

Los compuestos activos también se pueden administrar por vía parenteral o intraperitoneal. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol líquido, polietilenglicoles y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son hidrosolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que tenga una capacidad de ser inyectada cómoda. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe proteger contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, con el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido, en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede conseguir mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tiomersal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada por el uso en la composición de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado, con otros ingredientes diversos mencionados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos estériles en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos entre los mencionados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de una solución de la misma filtrada previamente de forma estéril.

Cuando los péptidos están adecuadamente protegidos tal y como se ha descrito anteriormente, el compuesto activo se puede administrar por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o puede estar incluido en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o se puede prensar en forma de comprimidos, o se puede incorporar directamente en el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas ingeribles y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos 1% en peso de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede variar, por supuesto, y puede estar convenientemente entre aproximadamente 5 a aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan de modo que una forma unitaria de dosificación oral contiene entre aproximadamente 0,1 μg y

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pleta. Los extremos cohesivos del vector digerido con EcoNI se volvieron romos mediante el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I para la ligación. Este vector ligado se denominó pCR2.1-deltaEcoNI_FVIII y se utilizó como un molde para una mutagénesis por deleción adicional, precisa.

Los cebadores oligonucleotídicos fueron diseñados para realizar una serie de deleciones precisas en marco. Cada cebador se empareja con las secuencias que flanquean ambos lados de los segmentos que se van a eliminar. Los cebadores delta-747, delta-754, delta-761, delta-768, delta-775 y delta-782 generan los sitios de fusión de Arg747-Gln1659, Lys754-Gln1659, Ile761-Gln1659, Lys768-Gln1659, His775-Gln1659 e Ile782-Gln1659, que son respectivamente:

(delta-747: 5'-CTTCTCCCAGAATTCAAGACAAGAGGAAATTGACTATG-3' (SEQ ID NO:8));

(delta-754: 5'-CCTAGCACTAGGCAAAAGCAAGAGGAAATTGACTATG-3' (SEQ ID NO:9));

(delta-761: 5'-CAATTTAATGCCACCACAATTCAAGAGGAAATTGACTATG-3' (SEQ ID NO:10));

(delta-768: 5'-CAGAAAATGACATAGAGAAGCAAGAGGAAATTGACTATG-3' (SEQ ID NO:11));

(delta-775: 5'-GACCCTTGGTTTGCACACCAAGAGGAAATTGACTATG-3' (SEQ ID NO:12));

(delta-782: 5'-GCACACAGAACACCTATGCCTAAAATACAAGAGGAAATTGACTATGATGATACC-3' (SEQ ID NO: 13)).

Además de los cebadores mutagénicos descritos anteriormente, un cebador de selección (5'-CGTGATCCATGTCGACGCCTGCTTGCC-3' (SEQ ID NO: 14)) que cambia el único sitio original NcoI por SalI, se utilizó para la mutagénesis dirigida al sitio con el plásmido pCR2.1-deltaEcoNI_FVIII como molde. La digestión por restricción se llevó a cabo para seleccionar los clones positivos, que fueron verificados adicionalmente mediante secuenciación. Los clones finalmente verificados se denominaron dB747, dB754, dB761, dB768, dB775 y dB782, respectivamente.

Ejemplo 2B -Generación de plásmidos que contienen una nueva secuencia de N-glicano en los sitios de fusión

Para evitar la exposición de un nuevo epítopo con una secuencia de aminoácido no natural, en la región de unión de la cadena pesada y la cadena ligera, creamos una secuencia de reconocimiento de N-glicosilación (Asn-X-Ser/Thr en la que X puede ser cualquier aminoácido) en los sitios de fusión, uniendo Asn en las posiciones 745, 757 y 764 del dominio B, a aminoácidos en las posiciones 1650, 1653 y 1656 situados cerca de aminoácidos Ser o Thr en las posiciones 1651, 1654 y 1657, que generan un sitio de glicosilación ligado a N en los sitios de fusión. Los cebadores de oligonucleótidos se diseñaron para realizar una serie de deleciones precisas en marco. pCR2.1-deltaEcoNI_FVIII se utilizó como molde para una mutagénesis precisa por deleción adicional. Cada cebador se empareja con las secuencias que flanquean ambos lados de los segmentos que se van a eliminar. Los cebadores N-745-1650, N-7451653, N-745-1656, N-757-1650, N-757-1653, N-757-1656, N-764-1650, N-764-1653 y N-764-1656 generan los sitios de fusión Asn745-Ile1650, Asn745-Thr1653, Asn745-Gln1656, Asn757-Ile1650, Asn757-Thr1653, Asn757-Gln1656, Asn764-Ile1650, Asn764-Thr1653 y Asn764-Gln1656. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores de oligonucleótidos son las siguientes:

(N-745-1650: 5'-CAAGAAGCTTCTCCCAGAAAATAACTCGTACTACTCTTC-3' (SEQ ID NO:15));

(N-745-1653: 5'-CAAGAAGCTTCTCCCAGAAAACTACTCTTCAGTCAGTC-3' (SEQ ID NO:16));

(N-745-1656: 5'-CAAGAAGCTTCTCCCAGAAACAGTCAGATCAAGAGGAAATTG-3' (SEQ ID NO:17));

(N-757-1650: 5'-CTAGGCAAAAGCAATTTAATATAACTCGTACTACTCTTC-3' (SEQ ID NO:18));

(N-757-1563: 5'-CTAGGCAAAAGCAATTTAATACTACTCTTCAGTCAGTC-3' (SEQ ID NO:19));

(N-757-1656: 5'-CTAGGCAAAAGCAATTTAATCAGTCAGATCAAGAGGAAATTG-3' (SEQ ID NO:20));

(N-764-1650: 5'-CACCACAATTCCAGAAAATATAACTCGTACTACTCTTC-3' (SEQ ID NO:21));

(N-764-1653: 5'-CACCACAATTCCAGAAAATACTACTCTTCAGTCAGTC-3' (SEQ ID NO:22));

(N-764-1656: 5'-CACCACAATTCCAGAAAATCAGTCAGATCAAGAGGAAATTG-3' (SEQ ID NO:23)).

Además de los cebadores mutagénicos descritos anteriormente, un cebador de selección (5'-CGTGATCCATGTCGACGCCTGCTTGCC-3' (SEQ ID NO: 24)), que cambia el único sitio original de NcoI por SalI, se utilizó para la mutagénesis dirigida al sitio usando el plásmido pCR2.1-deltaEcoNI_FVIII como molde. La digestión por restricción se llevó a cabo para seleccionar los clones positivos, que fueron verificados adicionalmente mediante una secuenciación. Los clones verificados finalmente se denominaron dBN(45-50), dBN(45-53), dBN(45-56), dBN(57-50), dBN(57-53), dBN(57-56), dBN(64-50), dBN(64-53) y dBN(64-56), respectivamente.

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Determinación del nivel de antígeno de FVIII (FVIII:Ag) y de la actividad procoagulante de FVIII (FVIII:C) en el material sobrenadante de cultivos de BHK21 transfectados con el vector de expresión derivado de FVIII, 24 h después de la transfección (resultados expresados en mU/ml o %/ml)

Derivado

FVIII:Ag (mU/ml) FVIII:C (%/ml)

dBN(45-56)

88,6 ± 6,37 7,2 ± 0,75

dBN(57-50)

87,9 ± 11,1 8,1 ± 0,37

dBN(57-53)

82,4 ± 3,24 7,3 ± 0,54

dBN(57-56)

86:5 ± 8,15 7,6 ± 0,69

dBN(64-50)

87,4 ± 7,38 8,2 ± 0,53

dBN(64-53)

80,7 ± 5,56 7,5 ± 0,64

dBN(64-56)

84,9 ± 3,42 7,9 ± 0,41

FVIII de longitud completa

5,5 ± 0,53 0,3 ± 0,06

Los resultados muestran que los derivados de FVIII que se han sometido a deleción son biológicamente activos en un ensayo de coagulación sanguínea, y que los niveles más altos de proteína se obtuvieron con las estructuras artificiales de derivados de FVIII, más que con el FVIII de longitud completa. Además, la relación FVIII:C y FVIII:Ag

5 para los derivados de esta invención es mayor que la de FVIII de longitud completa, lo que indica que los derivados de FVIII pueden ser más estables después de la secreción en medios de cultivo. Tal y como se muestra en la Tabla 3, los incrementos en la actividad de FVIII (FVIII:C) de los derivados de FVIII recombinante a lo largo del tiempo, después de la incubación, eran más elevados que en comparación con los de FVIII de longitud completa recombinante.

10 Ejemplo 4 -Sustitución de Pro por Phe en la posición 739

Pro739 en las variantes de FVIII con el dominio B delecionado descritas anteriormente, se modificó utilizando el método de mutagénesis dirigida al sitio. Un cebador oligonucleotídico (5'-AACAATGCCATTGAATTCAGAAGCTTCTCCCAG-3' (SEQ ID NO: 25)) fue diseñado para introducir la sustitución de Pro por Phe en la posición 739. Los procedimientos de mutagénesis en su totalidad fueron idénticos al Ejemplo 2 15 descrito anteriormente. Los vectores que poseían una sustitución Pro739Phe en cada derivado de FVIII con el dominio B delecionado, se denominaron dB747-739F, dB754-739F, dB761-739F, dB768-739F, dB775-739F, dB782739F, dBN(45-50)-739F, dBN(45-53)-739F, dBN(45-56)-739F, dBN(57-50)-739F, dBN(57-53)-739F, dBN(57-56)739F, dBN(64-50)-739F, dBN(64-53)-739F y dBN(64-56)-739F, respectivamente. Los ADNs resultantes se clonaron en el vector de expresión de mamífero, se prepararon, se transfectaron y las muestras resultantes se sometieron a

20 ensayo tal como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la Tabla 4, se observó que dB761-739F y dB782-739F generaban más actividad que dB761 y dB782, respectivamente, aumentaban la actividad después de la mutación de la prolina a una fenilalanina en la posición 739.

Tabla 3

Determinación de la actividad procoagulante de FVIII (FVIII:C) en el material sobrenadante de cultivos de BHK21 transfectados con el vector de expresión derivado de FVIII, 24 h y 48 h después de la transfección (resultados expresados en %/ml)

Derivado

24 h 48 h

dB-747

7,8 ± 0,09 15,9 ± 0,85

dB-754

9,0 ± 0,28 17,9 ± 0,43

dB-761

8,0 ± 0,22 16,0 ± 0,69

dB-768

7,7 ± 0,31 18,0 ± 0,19

dB-775

7,3 ± 0,44 14,9 ± 0,34

dB-782

6,2 ± 0,12 14,2 ± 0,91

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FVIII de longitud completa

0,3 ± 0,09 0,2 ± 0,06

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Ejemplo 7 -Activación de FVIII recombinante de longitud completa y de derivados de FVIII con trombina

FVIII recombinante de longitud completa y los derivados de FVIII se compararon en un estudio de la cinética de la activación con trombina. La activación se midió en una prueba de coagulación clásica (APTT) después de la incubación en presencia de una cantidad catalítica de trombina.

Las Figuras 7A y 7B muestran una comparación de la cinética de activación con trombina, de FVIII recombinante humano (rH FVIII) y de derivados de FVIII. Algunos derivados de FVIII se activan más fuertemente con incrementos de 7 veces después de 5 minutos de incubación con trombina. Dos derivados de FVIII, dBN(64-53) y dBN(64-56), se activan de la misma manera que rh FVIII. Aunque algunos derivados de FVIII tienen mayores aumentos de la activación, no se activan más rápidamente que los otros derivados o que el FVIII de longitud completa, mostrando de ese modo que los derivados de FVIII no están preactivados. Esto es importante para los fines de su uso terapéutico.

Los mayores aumentos de la activación con trombina de algunos derivados se pueden explicar por su menor umbral de activación. Menores cantidades de trombina generadas en un sitio de lesión vascular pueden causar una activación incrementada de los derivados de FVIII, lo que permite que estos derivados actúen como moléculas procoagulantes con un aumento de la eficacia, en comparación con otros derivados con actividad de FVIII. En otras palabras, los derivados de FVIII, excepto dBN(64-53) y dBN(64-56), se pueden activar en un evento muy anterior a los eventos de la coagulación sanguínea. En consecuencia, los derivados de FVIII con un aumento mayor de la activación se pueden administrar a pacientes con hemofilia A, a una dosis mucho más baja y una frecuencia más reducida que otras moléculas con actividad de FVIII. Esto reduce significativamente el riesgo de una producción de anticuerpos inhibidores en los pacientes. Además, esto también reduce aún más los costes de producción y de medicación.

Todas las referencias citadas en esta memoria se incorporan como referencia en su totalidad.

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando únicamente una experimentación de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención, descritas específicamente en este documento. Se pretende que tales equivalentes estén incluidos en el alcance de las reivindicaciones.

Las realizaciones preferidas de la presente invención son:

Punto 1: Un polipéptido del Factor VIII que comprende una deleción interna de uno o varios aminoácidos entre 1649 y 1688 fusionada con cualquier secuencia de aminoácidos en el dominio B desde aproximadamente 741 a 782, en relación con una secuencia de aminoácidos del Factor VIII humano de longitud completa (SEQ ID NO: 1).

Punto 2: El polipéptido del Factor VIII según el punto 1, en el que la deleción interna es de los aminoácidos 746 a 1649, 746 a 1652, 746 a 1655, 758 a 1649, 758 a 1652, 758 a 1655, 765 a 1649, 765 a 1652, 765 a 1655, 748 a 1658, 755 a 1658, 762 a 1658, 769 a 1658, 776 a 1658 o 783 a 1658.

Punto 3: El polipéptido del Factor VIII según el punto 1, que es una cadena sencilla.

Punto 4: El polipéptido del Factor VIII según el punto 1, en el que la prolina en la posición 739 se sustituye por otro aminoácido.

Punto 5: El polipéptido del Factor VIII según el punto 1, que comprende la secuencia de tripéptido (Asn-X-Thr

o Asn-X-Ser) que abarca los sitios de fusión entre el aminoácido Asn en las posiciones 745, 757 o 764, y el aminoácido Thr o Ser en las posiciones 1651,1654 o 1657, en relación con una secuencia de aminoácidos del Factor VIII humano de longitud completa (SEQ ID NO: 1).

Punto 6: El polipéptido del Factor VIII según el punto 1, representado por la siguiente fórmula con los siguientes dominios dominios enlazados:

H-S-L

en donde

(i)

el dominio H representa una secuencia polipeptídica que comprende sustancialmente Ala-1 hasta Arg740 del Factor VIII humano de acuerdo con SEQ ID NO: 1;

(ii)

el dominio S representa un enlazador de tipo espaciador polipeptídico que comprende hasta aproximadamente 60 aminoácidos, en donde el extremo N-terminal del dominio S es aproximadamente el residuo 740, y el extremo C-terminal del dominio S termina aproximadamente en el residuo 1688 del Factor VIII humano de acuerdo con SEQ ID NO: 1; y

(iii) el dominio L representa una secuencia polipeptídica que comprende sustancialmente Arg-1689 hasta Tyr-2332 del Factor VIII humano de acuerdo con SEQ ID NO: 1.

Punto 7: El polipéptido del Factor VIII según el punto 6, en el que el dominio S comprende una secuencia de

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Claims (1)

1. imagen1