ES2576056T3 - Derivados de pirazolopirimidina tricíclica - Google Patents

Abstract

Un compuesto representado por la fórmula (1) o una sal del mismo:**Fórmula** en el que, en la fórmula (1), R1 representa un grupo metilo, R2 representa un átomo de cloro, R3 representa un grupo metoxi, R4 representa un grupo metilo, y X representa un grupo metileno.

Description

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DESCRIPCION

Derivados de pirazolopirimidina tric^clica Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un compuesto que tiene un esqueleto tridclico de pirazolopirimidina que inhibe el efecto la protema de choque termico 90 (HSP90).

Tecnica antecedente

La HSP90 es una protema chaperona intracelular principal. Las protemas chaperona son protemas que se unen a diversas protemas para ayudar en el plegado de protemas de enlace. Un grupo de protemas cuyo plegado requiere HSP90 se denomina generalmente protemas cliente de HSP90.

Se asume que HSP90 asf como multiples protemas, tales como cochaperonas, protemas acompanantes e inmunofilinas estan implicadas en el mecanismo de plegado de protemas cliente por HSP90 y que ellas ayudan colaborativamente en el plegado de protemas cliente de HSP90 (Documento no de patente 1); sin embargo, los detalles del mecanismo aun no estan suficientemente claros.

Se asume que protemas cliente de HSP90 forman un complejo con HSP90, cochaperonas y similares, y despues cambian conformacionalmente para dar protemas maduras y que las protemas se ubiquitinan y degradan por proteasomas cuando no estan plegadas normalmente por HSP90 y similares (Documentos no de patente 1 a 4).

En los ultimos anos, se han previsto inhibidores de HSP90 como candidatos para agentes terapeuticos para diversas enfermedades (por ejemplo, cancer, enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedades cardiovasculares, infecciones, enfermedades autoinmunes y enfermedades asociadas con lesion celular apoptotica) (Documento no de patente 2).

En particular, puesto que muchas protemas asociadas con el cancer que incluyen dianas moleculares para agentes anticancerosos son protemas cliente de HSP90, se han previsto inhinidores de HSP90 como candidatos para agentes anticancerosos. Por ejemplo, multiples protemas implicadas en la aparicion y desarrollo de cancer, tales como Her2, Raf, Akt y telomerasa con conocidas como protemas cliente de HSp90 (Documento no de patente 1). Se asume que estas protemas asociadas al cancer se cambian de protemas inmaduras a protemas maduras y actuan para provocar una transformacion maligna de celulas, respectivamente, mediante el uso de HSP90 como una protema chaperona. HSP90 es una protema que existe, no solo en celulas cancerosas, si no tambien celulas normales, y se ha informado de que la afinidad con una protema cliente y la actividad de ATPasa necesaria para su actividad de chaperona son mas altas en celulas cancerosas que en celulas normales (Documentos no de patente 1 a 3). Por lo tanto, se asume que inhibidores de HSP90 son capaces de inactivar multiples protemas asociadas con cancer simultaneamente de una manera espedfica de celulas y se han previsto como candidatos para agentes anticancerosos que son potentes y tienen un espectro antitumoral amplio.

Geldanamicina, herbimicina, 17-alilaminogeldanamicina (17-AAG) y similares son conocidas comunmente como inhibidores de HSP90 (Documentos no de patente 1 a 4). Estos compuestos se unen al bolsillo de union de ATP en el W-terminal de HSP90 e inhiben la union de HSP90 a ATP para inhibir la funcion de HSP90 como una protema de chaperona. Se ha informado de diversos compuestos que inhiben HSP90 ademas de los compuestos anteriores (Documento de patente 1, Documento de patente 2, Documento de patente 3, Documento no de patente 5 y Documento no de patente 6) y tambien estan indicados derivados de pirazolopirimidina tridclica (Documento de patente 4 y documento JP 2009 256323A).

Ademas, muchas publicaciones han informado sobre los usos pretendidos de derivados de pirazolopirimidina tridclica y compuestos que tienen una estructura de anillo condensado, que tambien tienen tres constituyentes heterodclicos, para propositos anticancerosos (Documentos de patente 5 a 9 y Documentos no de patente 7 y 8).

Lista de referencias

Documentos de patente

Documento de patente 1: WO 2005/28434 Documento de patente 2: WO 2008/049105 Documento de patente 3: WO 2008/093075 Documento de patente 4: WO 2008/035629 Documento de patente 5: WO 2004/047755 Documento de patente 6: WO 2006/015263 Documento de patente 7: WO 2005/021568 Documento de patente 8: WO 1998/043991 Documento de patente 9: WO 2008/100447

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Documentos no de patente:

Documento no de patente 1: Documento no de patente 2: Documento no de patente 3: Documento no de patente 4: Documento no de patente 5: Documento no de patente 6: Documento no de patente 7: Documento no de patente 8:

Medicinal Research Reviews (2006) Vol. 26, No. 3, 310-338 TRENDS in Molecular Medicine (2004) Vol. 10, No. 6, 283-290 British Journal of Pharmacology (2005) 146, 769-780 TRENDS in Biochemical Sciences (2006) Mar, 31 (3), 164-172 Journal of Medicinal Chemistry (2005) Vol. 48, No. 13, 4212-4215 Journal of Medicinal Chemistry (2006) Vol. 49, No. 1,381-390 Organic & Biomolecular Chemistry (2003) Vol. 1, No. 23, 4166-4172 Organic & Biomolecular Chemistry (2006) Vol. 4, No. 9, 1723-1729

Sumario de la invencion

Problema que debe resolverse por la invencion

Aunque se ha esperado que los inhibidores de HSP90 se usen como medicamentos, en particular como agentes anticancerosos, hasta la fecha no se ha usado realmente ninguno de los compuestos como medicamentos.

Medios para resolver el problema

Como resultado de extensos estudios para resolver los problemas anteriores, los inventores de la presente invencion han descubierto un nuevo compuesto que inhibe la actividad de ATPasa de HSP90 y tiene actividad antitumoral, que se representa por la formula (1) como se muestra mas adelante, completando de este modo la presente invencion. Ademas, los inventores han realizado ensayos de actividad antitumoral in vivo, ensayos de seguridad, ensayos de estabilidad metabolica, ensayos de inhibicion de enzima metabolica, etc., en el compuesto de la presente invencion. Como resultado, han descubierto que el compuesto de la presente invencion tiene diversas propiedades requeridas para medicamentos.

Mas espedficamente, la presente invencion proporciona:

[1] Un compuesto representado por la formula (1) o una sal del mismo:

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en el que, en la formula (1),

R1 representa un grupo metilo,

R2 representa un atomo de cloro,

R3 representa un grupo metoxi,

R4 5 6 7 8 9 representa un grupo metilo, y X representa un grupo metileno.

[2] Un compuesto de acuerdo con [1] en el que el compuesto es 2-{4-amino-2-[(3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2- ilo)metil]-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]azulen-8-il}-N-metilacetamida.

[3] Un bromhidrato de un compuesto de acuerdo con [2].

[4] Un clorhidrato de un compuesto de acuerdo con [2].

[5] Un metanosulfonato de un compuesto de acuerdo con [2].

[6] Un etano-1,2-disulfonato de un compuesto de acuerdo con [2].

[7] Un medicamento que comprende un compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6] como un principio activo.

[8] A composicion farmaceutica, que comprende un compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6] y un vehfculo farmacologicamente aceptable.

[9] Uso de un compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6] para la fabricacion de un medicamento.

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[10] Uso de un compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6] para la preparacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.

[11] Un compuesto de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6] para su uso en el tratamiento del cancer.

Ventajas de la invencion

De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un nuevo derivado de pirazolopirimidina que tiene actividad inhibidora de HSP90, que se representa mediante la formula (1) anterior. El compuesto de la presente invencion es util como un agente antitumoral.

Descripcion de las realizaciones

En la presente invencion, "protema de choque termico 90" o "HSP90" se refiere a cualquiera o todas de la familia de HSP90 a menos que se indique otra cosa. La familia de HSP90 incluye HSP90a, Hop90p, protema regulada por glucosa 94kDa (GRP94) y Hsp75/protema 1 asociada a receptor del factor de necrosis tumoral (TRAP1), por ejemplo.

En la presente invencion, "inhibidor de HSP90 " se refiere a un compuesto o composicion que inhibe parcial o completamente un efecto que HSP90. Los ejemplos del inhibidor de HSP90 incluyen un compuesto o composicion que inhibe parcial o completamente la expresion de HSP90 y un compuesto o composicion que inhibe parcial o completamente la funcion de HSP90 como una protema de chaperona.

En el presente documento, "funcion de HSP90 como una protema de chaperona" se refiere a una funcion de HSP90 que ayuda en el plegado de una protema cliente para a convertir la protema cliente en su forma funcional, o una funcion de HSP90 para estabilizar una protema cliente, por ejemplo.

Por consiguiente, los ejemplos espedficos del inhibidor de HSP90 incluyen un compuesto que inhibe la expresion de HSP90, un compuesto que inhiben la union de HSP90 a una protema cliente, un compuesto que inhibe la union de HSP90 a co-chaperonas o inmunofilinas, un compuesto que inhibe la union de HSP90 a ATP, un compuesto que inhibe la actividad de ATPasa de HSP90 y un compuesto que inhibe el cambio conformacional de HSP90. El inhibidor de HSP90 puede usarse como un agente terapeutico para una enfermedad provocada por un efecto de HSP90.

Los ejemplos de protema cliente de HSP90 incluyen: cinasas receptoras de factor de crecimiento, tales como Her2, EGFR, c-Kit, c-Met, KDR, Flt3, IGF-1R y PDGF; cinasas intracelulares, tales como PDK1, Akt, Raf, S6, Cdk4, Cdk6, Chk1, PLK1, Src, Aurora B, Bcr-Abl, GSK3p y ERK5; receptores esteroideos, tales como GR, ERa, PR y AR; y otras, tales como HIF-1, Survivina, terc, Bcl-6 y p53.

En la presente invencion, los ejemplos de la "enfermedad causada por un efecto de HSP90" incluyen cancer, enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedades cardiovasculares, infecciones, enfermedades autoinmunes y enfermedades asociadas con lesion celular apoptotica. En la presente invencion, los terminos "tumor" y "cancer" pueden usarse de manera intercambiable. Ademas, en la presente invencion, tumor, tumor maligno, cancer, neoplasma maligno, carcinoma, sarcoma y similares pueden denominarse genericamente como "tumor" o "cancer".

El compuesto representado por la formula (1) de acuerdo con la presente invencion puede estar presente en forma de un estereoisomero o un isomero optico derivado de un atomo de carbono asimetrico. El estereoisomero, el isomero optico y una mezcla de los mismos estan todos incluidos en la presente invencion.

El compuesto representado por la formula (1) de acuerdo con la presente invencion es particular y preferentemente:

2-{4-amino-2-[(3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metil]-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]azulen-8-il}-N-

metilacetamida.

El compuesto representado por la formula (1) de acuerdo con la presente invencion puede convertirse en una sal farmacologicamente aceptable, segun se desee. Los ejemplos de dichas sales incluyen: sales hidracidas halogenadas tales como sales clorhidrato o yodhidrato; sales de acidos inorganicos, tales como nitratos, percloratos, sulfatos y fosfatos; alcanosulfonatos inferiores, tales como metanosulfonatos, trifluorometanosulfonatos o etanosulfonatos; arilsulfonatos, tales como bencenosulfonatos o p-toluenosulfonatos; sales de acido organico, tales como formiatos, acetatos, malatos, fumaratos, succinatos, citratos, tartratos, oxalatos o maleatos; y sales de aminoacido, tales como ornitinatos, glutamatos o aspartatos. De estas, se prefieren sales hidracidas halogenadas y sales de acido organico, y son mas preferidas bromato, clorhidrato, metanosulfonato o etano-1,2- disulfonato.

El compuesto representado por la formula (1) de acuerdo con la presente invencion o una sal del mismo puede estar presente como una forma libre, o en forma de un hidrato o un solvato. Este puede estar presente en la forma libre, o en forma de en forma de una sal hidrato o similar, como resultado de la absorcion de humedad del aire. El tipo de solvato no esta particularmente limitado, siempre y cuando sea farmacologicamente aceptable. Espedficamente, se prefiere un hidrato, un etanolato o similar. Ademas, cuando un atomo de nitrogeno esta presente en el compuesto representado por la formula (1) de acuerdo con la presente invencion, este puede ser una forma de N-oxido. Tales formas de solvato, hidrato, sal de hidrato y N-oxido tambien estan incluidas en el alcance de la descripcion.

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Dependiendo de los tipos de sustituyentes o la combinacion de los mismos, el compuesto representado por la formula (1) de acuerdo con la presente invencion puede estar presente como diversos tipos de isomeros, incluyendo isomeros geometricos, tales como un isomero cis o un isomero trans, tautomeros, o isomeros opticos, tales como una forma d o una forma l. El compuesto de la presente invencion incluye todos estos isomeros, estereoisomeros y mezclas de tales isomeros y estereoisomeros que se mezclas en cualquiera de las proporciones dadas, a menos que se indique otra cosa.

El compuesto representado por la formula (1) de acuerdo con la presente invencion tambien puede comprender uno o mas isotopos atomicos de uno o mas atomos constituyentes de los mismos en una proporcion no natural. Los ejemplos de tal isotopo atomico incluyen deuterio (2H), tritio (3h), yodo-125 (125I) y carbono-14 (14C). Estos compuestos son utiles como agentes terapeuticos o preventivos, o reactivos usados para estudios, tales como reactivos de ensayo y agentes de diagnostico, tales como agentes de diagnostico in vivo. Independientemente de si son o no compuestos radioactivos, todas las variantes isotopicas del compuesto representado por la formula (1) estan incluidas en el alcance de la presente invencion.

Ademas, la presente descripcion tambien desvela un compuesto que se convierte en un compuesto (1) como un principio activo de una composicion farmaceutica de la presente invencion como resultado de una reaccion con una enzima, acido gastrico o similar, en condiciones fisiologicas in vivo; a saber, un compuesto que se convierte en el compuesto (1) como resultado de una oxidacion enzimatica, reduccion, hidrolisis o similar, o un "compuesto profarmaco farmacologicamente aceptable" que se convierte en el compuesto (1) como resultado de hidrolisis similar debido a acido gastrico, etc.

Los ejemplos del profarmaco mencionado anteriormente incluyen compuestos obtenidos mediante acilacion, alquilacion o fosforilacion del grupo amino del compuesto (1) (por ejemplo, compuestos obtenidos convirtiendo el grupo amino mencionado anteriormente en eicosanoflo, alanilo, pentilaminocarbonilo, (5-metil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-ilo)metoxicarbonilo, tetrahidrofuranilo, pirrolidilmetilo, pivaloiloximetilo o terc-butilo y otros compuestos).

Un compuesto del profarmaco de la presente invencion puede producir a partir del compuesto (1) de acuerdo con un procedimiento conocido. Ademas, un profarmaco del compuesto de la presente invencion incluye un profarmaco que se convierte en el compuesto (1) en condiciones fisiologicas, como se describe en las paginas 163-198 de "lyakuhin no Kaihatsu (Desarrollo de medicamentos)" Vol. 7, Bunshi Sekkei (Diseno Molecular), Hirokawa Shoten Co., 1990.

A continuacion se describira un procedimiento tfpico para producir el compuesto representado por la formula (1). Debe indicarse que puede usarse un grupo protector adecuado en cada reaccion, segun sea necesario, o que puede realizarse una conversion deseada en una reaccion de qmmica organica comun. El tipo de grupo protector y el tipo de conversion de sustituyentes respectivos no estan particularmente limitados.

[Etapa principal 1]

Se describira un procedimiento para producir un compuesto representado por la formula (1), en la que X es un grupo metileno.

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Esquema 1

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en el que R1, R2, R3 y R4 son como se ha definido anteriormente, respectivamente, R5 representa un grupo metileno que puede estar sustituido con 1 o 2 grupos alquilo que tienen de 1 a 6 atomos de carbono, R6 representa un grupo arilo que puede tener uno o mas sustituyentes o un grupo heterodclico que puede tener uno o mas sustituyentes, R7 representa un grupo amino que tiene un grupo protector, y cada uno de LG1 y LG2 representa un grupo saliente. Los grupos salientes, Lg1 y LG2, incluyen un atomo de halogeno, un grupo toluenosulfoniloxi, un grupo metanosulfoniloxi, un grupo trifluorometanosulfoniloxi y similares. Los grupos protectores para el grupo amino incluyen un grupo benciloxicarbonilo, un grupo ferc-butoxicarbonilo, un grupo bencilo y similares.

Un derivado de aldehfdo (1) (obtenible como un producto disponible en el mercado) se trata con bromuro de alilo y polvos de indio en un disolvente para obtener un compuesto (2). El derivado de alqueno (2) tambien puede obtenerse usando el derivado de aldehfdo (1) y un reactivo de Grignard, tal como bromuro de alil magnesio. Como disolvente, se prefiere W,W-dimetilformamida, W-metilpirrolidona, tetrahidrofurano, dimetilsulfoxido o similar. La temperatura de reaccion esta preferentemente entre -70 °C y 100 °C, y mas preferentemente entre -20 °C y 50 °C. El tiempo de reaccion es preferentemente entre 1 hora y 48 horas.

El derivado de alqueno (2) se somete una 1,2-dihidroxilacion, de manera que se obtiene un derivado de triol (3). Los ejemplos de tal dihidroxilacion de un alqueno incluyen una reaccion que usa permanganato potasico, una reaccion de adicion de agua en presencia de sal de mercurio (procedimiento de Kucherov-Deniges), una reaccion de oxidacion de osmio usando una cantidad catalftica de tetraoxido de osmio y un oxido de amina como cooxidante, y una reaccion de dihidroxilacion usando yodo (procedimiento Prevoat o procedimiento Woodward). Los ejemplos de disolventes usados en estas reacciones incluyen W,W-dimetilformamida, W-metilpirrolidona, tetrahidrofurano, dimetilsulfoxido, cloruro de metileno, acetona, t-butanol, agua y mezclas de los mismos. La temperatura de reaccion es adecuadamente entre 0 °C y 100 °C, y preferentemente entre 10 °C y 50 °C. El tiempo de reaccion es preferentemente entre 1 hora y 72 horas.

El derivado de triol (3) puede convertirse en un derivado de acetal (4) por tratamiento con 2,2-dimetoxipropano y una cantidad catalftica de un acido en un disolvente tal como W,W-dimetilformamida, W-metilpirrolidona, tetrahidrofurano o dimetilsulfoxido, o por tratamiento con tal catalizador acido en acetona. Los ejemplos de tal catalizador acido incluyen

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acidos de Lewis, incluyendo acido p-toluenosulfonico, acido clortndrico, acido sulfurico y cloruro de cinc como ejemplos tttpicos. La temperature de reaccion esta preferentemente entre 0 °C y 100 °C, y mas preferentemente entre 10 °C y 50 °C. El tiempo de reaccion es preferentemente entre 1 hora y 48 horas.

El compuesto (4) puede convertirse en un derivado de cetona (5) por tratamiento en condiciones de reaccion de oxidacion adecuadas. Los ejemplos de una reaccion de oxidacion en este caso incluyen oxidacion de Mukaiyama para activar dimetilsulfoxido o similares; oxidacion de Swern o una reaccion de oxidacion usando como su modificacion diciclohexilcarbodiimida, antudrido trifluoroacetico, acetico antudrido o un complejo de trioxido de azufre-piridina en lugar de cloruro de oxalilo; y una reaccion de oxidacion usando dioxido de manganeso. Los ejemplos de un disolvente usado en el presente documento incluyen dioxano, tetrahidrofurano y cloruro de metileno. La temperatura de reaccion esta preferentemente entre -70 °C y 50 °C. El tiempo de reaccion es preferentemente entre 1 hora y 48 horas.

El derivado de cetona (5) puede convertirse en un compuesto (6) por tratamiento con un derivado de hidrazina (R6-R5-NHNH2) (compuesto (A)) en un disolvente. El compuesto (A) puede producirse por el procedimiento descrito en J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 4228-4239, etc. Los ejemplos del disolvente usado en esta reaccion incluyen alcohol, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, dioxano y mezclas de los mismos. La temperatura de reaccion esta preferentemente entre -20 °C y 50 °C, y mas preferentemente entre 0°C y 30 °C. Cuando el compuesto (A) se reemplaza por su sal, puede usarse adecuadamente un equivalente o exceso de una base en relacion a la sal. Un ejemplo de la base trietilamina. El tiempo de reaccion es preferentemente entre 1 hora y 48 horas.

Un derivado de diol (8) puede obtenerse protegiendo el grupo amino en la posicion 6 del compuesto (6) con un grupo protector adecuado tal como un grupo benciloxicarbonilo o un grupo ferc-butoxicarbonilo para convertirlo en un compuesto (7), y despues tratando el derivado de acetal (7) con un acido, tal como acido sulfurico, acido clortndrico o acido acetico. Los ejemplos del disolvente usado en esta reaccion incluyen alcohol, agua, dioxano y mezclas de los mismos. La temperatura de reaccion esta preferentemente entre -10 °C y 70 °C, y mas preferentemente entre 0 °C y 40 °C. El tiempo de reaccion es preferentemente entre 1 hora y 48 horas.

El compuesto (9) puede obtenerse convirtiendo el grupo hidroxilo del compuesto (8) en un grupo saliente LG1 tal como un atomo de halogeno, un grupo toluenosulfoniloxi, un grupo metanosulfoniloxi o un grupo trifluorometanosulfoniloxi por tratamiento con cloruro de tionilo, bromuro de tionilo, cloruro de toluenosulfonilo, cloruro de metanosulfonilo o cloruro de trifluorometanosulfonilo en presencia de una base, por ejemplo, basado en un conocimiento comun en qrnmica organica. La temperatura de reaccion esta preferentemente entre -78 °C y 30 °C, y mas preferentemente entre -20 °C y 10 °C. El tiempo de reaccion es preferentemente entre 1 hora y 48 horas.

El compuesto (10) puede obtenerse haciendo reaccionar el compuesto (9) con bisulfuro de sodio en un disolvente, tal como W,W-dimetilformamida y despues tratando con una base. Como alternativa, el compuesto (10) tambien puede obtenerse haciendo reaccionar compuesto (9) con tioacetato potasico en un disolvente, tal como W,W-dimetilformamida. Los ejemplos de la base incluyen carbonato potasico y bicarbonato potasico. La base es preferentemente carbonato potasico. La temperatura de reaccion es adecuadamente entre -30 °C y 100 °C, y preferentemente entre -10 °C y 70 °C.

Los ejemplos del procedimiento de conversion del grupo hidroxilo en un grupo oxo (conversion del compuesto (10) en el compuesto (11)) incluyen oxidacion de Mukaiyama y oxidacion de Swern o una reaccion de oxidacion usando como su modificacion DCC, anhndrido trifluoroacetico, acetico anhndrido o un complejo de trioxido sulfur-piridina en lugar de cloruro de oxalilo. Estos procedimientos se describen en The Chemical Society of Japan (ed.), "Jikken Kagaku Koza (cursos en qrnmica experimental), 4a edicion, Vol. 23, Yuki Gosei (Smtesis Organica) V" (Maruzen Co., Ltd., 1992) o similares.

Un derivado de ester de acido acetico (12) puede producirse mediante una homologacion, incluyendo como un ejemplo tfpico, reaccion de Wittig de cada reactivo disponible en el mercado seleccionado para obtener un grupo R1 deseado con el derivado de cetona (11). La homologacion es preferentemente una reaccion conocida, y puede ser una descrita en Jikken Kagaku Koza (Cursos en Qrnmica Experimental) (4a edicion, Vol. 22, editado por The Chemical Society of Japan, Maruzen Co., Ltd.) "Yuki Gosei (Smtesis Organica) I: Tankasuiso, Harogen Kagobutsu (Hidrocarburos, Compuestos de Halogeno)", pp. 57-69.

Un derivado de amida del acido acetico (13) puede producirse permitiendo que monoalquilamina actue directamente sobre el derivado de ester del acido acetico (12) en alcohol, o hidrolizando el derivado de ester del acido acetico (12) para obtener un derivado de acido acetico y despues sometiendolo a una reaccion de condensacion con diversos tipos de aminas (obtenibles como productos disponibles en el mercado). La reaccion de hidrolisis de ester hidrolisis es preferentemente una hidrolisis alcalina conocida. Una referencia es Jikken Kagaku Koza (Cursos en qrnmica experimental) (4a edicion, Vol. 22, editado por The Chemical Society of Japan, Maruzen Co., Ltd.) "Yuki Gosei (Smtesis Organica) IV: San, Aminosan, Peputido (Acidos, Aminoacidos, Peptidos)", pp. 6-11. Un procedimiento usado como un procedimiento de smtesis de peptidos puede usarse adecuadamente en la reaccion de condensacion con aminas. Los ejemplos del procedimiento de smtesis de peptidos incluyen un procedimiento de azida, un procedimiento de cloruro de acido, un procedimiento de DCC (diciclohexilcarbodiimida), un procedimiento de ester activo, un procedimiento de carbonildiimidazol, un procedimiento que usa una carbodimida soluble en agua y un procedimiento que usa cianofosfato de dietilo. Estos procedimientos se describen en M. Bondansky, Y. S. Klausner y M. A. Ondetti, "Peptide

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Synthesis"(A Wiley-interscience publication, Nueva York, 1976), G. R. Pettit, "Synthetic Peptides" (Elsevier Scientific Publication Company, Nueva York, 1976), The Chemical Society of Japan (ed.), "Jikken Kagaku Koza (Cursos en Qmmica Experimental), 4a edicion, Vol. 22, Yuki Gosei (Smtesis Organica) IV" (Maruzen Co., Ltd., 1992) o similares. Los ejemplos del disolvente usado en la reaccion de condensacion con diversos tipos de aminas incluyen W,W-dimetilformamida, W-metilpirrolidona, piridina, cloroformo, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, dioxano, acetonitrilo y mezclas de los mismos. La temperatura de reaccion es adecuadamente entre -20 °C y 50 °C, y preferentemente entre -10 °C y 30 °C.

El compuesto (13) puede convertirse en un compuesto (13a) mediante tratamiento de acidos, tratamiento de oxidacion o hidrolisis, y el tratamiento posterior realizado en condiciones de reaccion de desproteccion adecuadas para el grupo protector el grupo amino que tiene un grupo protector (R4), cuando su grupo R6-R5- es un grupo protector tal como un grupo 4-metoxibencilo. Un ejemplo tfpico de las condiciones de reaccion de desproteccion adecuadas para el grupo protector se describira posteriormente. Por ejemplo, cuando el grupo amino sustituido con un grupo protector es un grupo alcanoilamino o un grupo aroilamino, el grupo puede convertirse en un grupo amino por hidrolisis usando una solucion acuosa de hidroxido sodico, hidroxido potasico, amoniaco o similares. Cuando el grupo amino sustituido con un grupo protector es un grupo ferc-butoxicarbonilamino o un grupo di-ferc-butoxicarbonilamino, el grupo puede convertirse en un grupo amino por tratamiento con un acido, tal como acido clortudrico o acido trifluoroacetico.

El compuesto (13a) puede convertirse en un compuesto (14) por tratamiento con un derivado de piridina (compuesto (B)) preparado por el procedimiento descrito en J. Med. Chem. 1992, 35, 438-450, etc., en un disolvente, en presencia de una base. Los ejemplos del disolvente incluyen W,W-dimetilformamida, W-metilpirrolidona, tetrahidrofurano y dimetilsulfoxido. Los ejemplos de la base incluyen hidruro sodico, etoxido sodico, ferc-butoxido potasico, hidroxido potasico, carbonato potasico y carbonato de cesio. La temperatura de reaccion es adecuadamente entre 0 °C y 100 °C. El tiempo de reaccion es adecuadamente entre 1 y 48 horas.

Por otro lado, cuando el grupo R6-R5- del compuesto (13) no es ningun grupo protector pero es un sustituyente de interes, el compuesto (14) puede obtenerse tratando el grupo amino que tiene un grupo protector (R7) en las condiciones de reaccion de desproteccion mencionadas anteriormente.

Puesto que el compuesto de la presente invencion o una sal del mismo inhibe HSP90, este puede usarse como un inhibidor de HSP90, un agente para inhibir la actividad de ATPasa de HSP90, o un agente para inhibir la union de HSP90 a ATP. Por tanto, este puede usarse como un medicamento que comprende el compuesto de la presente invencion o una sal del mismo, y particular y preferentemente como un agente anticanceroso.

La actividad de ATPasa de HSP90 puede examinarse mediante un ensayo de ATPasa usado comunmente por una persona experta en la materia. Por ejemplo, la actividad de ATPasa de HSP90 puede detectarse usando una protema de HSP90 recombinante y ATP en presencia o ausencia del compuesto de ensayo, como se describe en Ejemplo de Ensayo 1 posteriormente. Como alternativa, en un ensayo de ATPasa, el procedimiento descrito en Analytical Biochemistry 327, 176-183 (2004) o Nature 425, 407-410 (2003) puede llevarse a cabo adecuadamente, por ejemplo.

La inhibicion de la expresion de HSP90 puede examinarse mediante transferencia de Northern, transferencia de Western, ELISA o similares, usados comunmente por una persona experta en la materia. Por ejemplo, se recupera ARNm de celulas cultivadas en presencia o ausencia del compuesto de ensayo para realizar la transferencia de Northern. Cuando la cantidad de ARNm de HSP90 en ARNm recuperado de celulas cultivadas en presencia del compuesto de ensayo se reduce con respecto a la de ARNm recuperado de las celulas cultivadas en ausencia del compuesto de ensayo, el compuesto de ensayo se identifica como un compuesto que inhibe la expresion de HSP90. Como alternativa, la cantidad de protema de HSP90 puede examinarse adecuadamente realizando transferencia de Western, usando el procedimiento descrito en Cancer. Res. 65, 6401-6408 (2005), por ejemplo.

La inhibicion de la union de HSP90 a una protema cliente puede examinarse mediante inmunoprecipitacion y transferencia de Western usados comunmente por una persona experta en la materia, por ejemplo. En immunoprecipitation y transferencia de Western, el procedimiento descrito en J. Biol. Chem. 277, 10346-10353 (2002) puede llevarse a cabo adecuadamente, por ejemplo.

El compuesto que inhibe la union de HSP90 a co-chaperonas o inmunofilinas puede examinarse mediante inmunoprecipitacion y transferencia de Western, usados comunmente por una persona experta en la materia, por ejemplo. La union de HSP90 a cochaperonas o inmunofilinas puede examinarse adecuadamente en presencia o ausencia del compuesto de ensayo realizando el procedimiento descrito en Nature 425, 407-410 (2003), por ejemplo.

La inhibicion de la union de HSP90 a ATP puede examinarse mediante un ensayo para union de ATP marcado a HSP90, por ejemplo. La union de HSP90 a aTp marcado puede examinarse adecuadamente en presencia o ausencia del compuesto de ensayo realizando el procedimiento descrito en J. Biol. Chem. 272, 18608-18613 (1997), por ejemplo.

La inhibicion del cambio conformacional de HSP90 puede examinarse mediante un ensayo conformacional usando bis-ANS (1,1'-bis(acido 4-anilino-5-naftalenosulfonico)), por ejemplo. En el ensayo conformacional, el procedimiento descrito en J. Med. Chem. 47, 3865-3873 (2004) puede llevarse a cabo adecuadamente, por ejemplo.

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La actividad inhibidora del crecimiento celular puede examinarse usando un procedimiento de ensayo de inhibicion del crecimiento que se usa comunmente por una persona experta en la materia. La actividad de inhibicion de crecimiento celular puede determinarse mediante, por ejemplo, comparando los niveles de crecimiento celular (por ejemplo, celulas tumorales) en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo como se describe en el siguiente Ejemplo de Ensayo 2. El nivel de crecimiento puede examinarse usando un sistema de ensayo para el ensayo de celulas vivas. Los ejemplos del procedimiento para el ensayo de celulas vivas incluyen un ensayo de captacion de [3H]-timidina, un procedimiento de BrdU y un ensayo de MTT.

Ademas, la actividad antitumoral in vivo puede examinarse usando un procedimiento para ensayar actividad antitumoral usado comunmente por una persona experta en la materia. Por ejemplo, se transplantan en un raton, una rata o similar, diversos tipos de celulas tumorales, y despues de la confirmacion de la supervivencia celulas transplantadas, el compuesto de la presente invencion se administra al animal mediante administracion oral, administracion intravenosa, etc. Despues de esto, de varios dfas a varias semanas despues, se compara el crecimiento del tumor en un grupo sin administracion del agente con aquel en un grupo de administracion del compuesto, a fin de confirmar la actividad antitumoral in vivo del compuesto de la presente invencion.

El compuesto de la presente invencion puede usarse para el tratamiento de tumores o canceres, tales como cancer de pulmon, cancer gastrointestinal, cancer de ovario, cancer uterino, cancer de pecho, cancer de tugado, cancer de cabeza y cuello, cancer de sangre, cancer renal, neoplasma testicular, cancer de prostata, mieloma multiple, cancer de piel, tal como melanoma maligno, sarcoma, por ejemplo.

Puesto que el compuesto de la presente invencion tiene accion inhibidora de HSP90, este puede usarse para el tratamiento del cancer en el que la dependencia de HSP90 esta aumentada. Tales canceres en los que dependencia de HSP90 esta aumentada incluyen cancer que depende de una o mas protemas cliente de HSP90, cancer en que una o mas protemas cliente de HSp90 estan expresadas en exceso, cancer en el que una o mas protemas clientes de HSP90 estan mutadas, y similares. Los ejemplos mas espedficos incluyen cancer en el que Her2, c-Met, Flt3 o similares estan expresados en exceso, y cancer en el que c-kit, PDGFR, Raf o similares estan mutados. Sin embargo, los ejemplos no se limitan a los mismos.

Adicionalmente, muchos grupos de factores asociados con cancer (RAS-MAPK, PI3K, telomerasa, etc.) estan presentes en una ruta de senalizacion intracelular a la que pertenece la protema cliente de HSP90. Si se inhibe HSP90, tambien se inhibe la senalizacion a tales factores. Como resultado, tambien se inhibe la activacion de la ruta de senalizacion intracelular mencionada. Por tanto, tambien dese este punto de vista, el compuesto de la presente invencion que es un inhibidor de HSP90 puede usarse preferentemente para el tratamiento de diversos tipos de canceres.

La composicion farmaceutica de la presente invencion comprende un compuesto de la presente invencion y un vehmulo farmacologicamente aceptable. Este puede usarse en forma de diversos tipos de inyecciones tales como una inyeccion intravenosa, una inyeccion intramuscular o una inyeccion subcutanea, o puede administrarse por diversos procedimientos, tales como administracion oral o una administracion percutanea. El vehmulo farmacologicamente aceptable se refiere a un material farmacologicamente aceptable (por ejemplo, un excipiente, un diluyente, un aditivo, un disolvente, etc.), que esta asociado con el transporte del compuesto de la presente invencion o una composicion que comprende el compuesto de la presente invencion desde un determinado aparato u organo a otro aparato u organo.

Como un procedimiento para preparar una formulacion, se selecciona una formulacion adecuada (por ejemplo, una formulacion oral o una inyeccion), y puede aplicarse un procedimiento usado comunmente para preparar diversos tipos de formulaciones dependiendo del procedimiento de administracion. Los ejemplos de formulaciones orales incluyen comprimidos, polvos, granulos, capsulas, pfldoras, trociscos, soluciones, siropes, jarabes, emulsiones y suspensiones oleosas o acuosas. En el caso de administracion oral, el agente puede estar tanto en forma libre como en una forma de sal. La formulacion acuosa puede producirse formando un aducto de acido con un acido farmacologicamente aceptable o formando una sal de un metal alcalino, tal como sodio. Cuando la formulacion es una inyeccion, tambien puede usarse un estabilizador, un conservante, un solubilizador o similar en la formulacion. La inyeccion puede proporcionarse en forma de una formulacion que debe prepararse antes de su uso almacenando una solucion que puede contener tal adyuvante o similar en un contenedor y despues convirtiendo esta en una formulacion solida mediante liofilizacion o similar. Una dosis puede almacenarse en un contenedor, o pueden almacenarse multiples dosis en un contenedor.

Los ejemplos de formulaciones solidas incluyen comprimidos, polvos, granulos, capsulas, pfldoras y trociscos. Estas formulaciones solidas pueden contener un aditivo farmaceuticamente aceptable junto con el compuesto de la presente invencion. Los ejemplos de los aditivos incluyen cargas, agentes formadores de volumen, aglutinantes, desintegrantes, solubilizadores, agentes humectantes y lubricantes. Estos pueden mezclarse selectivamente segun sea necesario para proporcionar una formulacion.

Los ejemplos de formulaciones lfquidas incluyen soluciones, siropes, elixires, emulsiones y suspensiones. Estas formulaciones lfquidas pueden contener un aditivo farmaceuticamente aceptable junto con el compuesto de la presente invencion. Los ejemplos de los aditivos incluyen agentes de suspension y emulsionantes. Estos pueden

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mezclarse selectivamente segun sea necesario para proporcionar una formulacion.

El compuesto de la presente invencion puede usarse para el tratamiento del cancer de mairnferos, en particular seres humanos. La dosis y el intervalo de dosificacion pueden seleccionarse adecuadamente en base al criterio del especialista de acuerdo con el sitio de la enfermedad y la altura del cuerpo, peso corporal, sexo o historial medico del paciente. Cuando el compuesto de la presente invencion se administra a un ser humano, el intervalo de administracion es aproximadamente de 0,01 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, y preferentemente aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal al dfa. Cuando el compuesto se administra a un ser humano, el compuesto se administra preferentemente en una dosis o dos a cuatro dosis separadas al dfa, y la administracion se preferentemente se repite a intervalos adecuados. La dosis diaria puede exceder la dosis mencionada anteriormente si es necesario, en base al criterio del especialista.

El compuesto de la presente invencion puede usarse junto con otros agente antitumorales. Los ejemplos de tales otros agentes antitumorales incluyen un antibiotico antitumoral, un ingrediente de plantas antitumoral, MRB (modificador de la respuesta biologica), hormona, vitamina, un anticuerpo antitumoral, un agente dirigido molecularmente y otros agentes antitumorales.

Mas espedficamente, los ejemplos de un agente de alquilacion incluyen: agentes alquilantes, tales como mostaza nitrogenada, N-oxido de mostaza nitrogenada o clorambucilo; agentes de alquilacion de aziridina, tales como carbocuona o tiotepa; agentes de alquilacion de epoxido, tales como dibromomanitol o dibromodulcitol; agentes de alquilacion de nitrosourea, tales como carmustina, lomustina, semustina, clorhidrato de nimustina, estreptozocina, clorozotocina o ranimustina; busulfan; tosilato de improsulfan; y Dacarbazina.

Los ejemplos de diversos tipos de antimetabolitos incluyen: antimetabolitos de purina, tales como 6-mercaptopurina, 6-tioguanina o tioinosina; antimetabolitos de pirimidina, tales como fluorouracilo, tegafur, tegafururacilo, carmofur, doxifluridina, broxuridina, citarabina o enocitabina; y antifolicos, tales como metotrexato o trimetotrexato.

Los ejemplos de un antibiotico antitumoral incluyen: agentes antitumorales antibioticos de antraciclina, tales como mitomicina C, bleomicina, peplomicina, daunorubicina, aclarubicin, doxorubicin, pirarubicin, THP-adriamicina, 4'-epidoxorubicin o epirubicina; cromomicina A3; y actinomicina D.

Los ejemplos de un ingrediente de plantas antitumoral incluyen: alcaloides de la vinca, tales como vindesina, vincristina o vinblastina; taxanos, tales como paclitaxel o docetaxel; y epipodofilotoxinas, tales como etoposide o teniposide.

Los ejemplos de un MRB incluyen un factor de necrosis tumoral e indometacina.

Los ejemplos de una hormona incluyen hidrocortisona, dexametasona, metilprednisolona, prednisolona, prasterona, betametasona, triamcinolona, oximatolona, nandrolona, metenolona, fosfestrol, etinil estradiol, clormadinona y medroxiprogesterona.

Los ejemplos de una vitamina incluyen vitamina C y vitamina A.

Los ejemplos de un anticuerpo antitumoral y del agente dirigido molecularmente incluyen trastuzumab, rituximab, cetuximab, nimotuzumab, denosumab, bevacizumab, infliximab, mesilato de imatinib, gefitinib, erlotinib, sunitinib, lapatinib y sorafenib.

Los ejemplos de otros agente antitumorales incluyen cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, tamoxifen, camptotecina, ifosfamidas, ciclofosfamida, melfalan, L-asparaginasa, aseclatona, esquizofilan, picibanilo, procarbazina, pipobroman, neocarzinostatin, hidroxiurea, ubenimexy crestina.

Ademas, la presente invencion tambien incluye el uso de un compuesto de la presente invencion, una sal del mismo o un solvato del mismo para la produccion del medicamento mencionado anteriormente.

La presente invencion se describira espedficamente con referencia a los Ejemplos que se muestran mas adelante; sin embargo, la presente invencion no se limita a los mismos y no deben interpretarse como limitativos en ningun sentido. Los reactivos, disolventes y materiales de partida no descritos espedficamente en el presente documento estan facilmente disponibles de fuentes comerciales.

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Ejemplos (Ejemplo 1)

(1) 1-(2-Amino-4,6-dicloropirimidin-5-il)-3-buten-1-ol

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Se anadieron polvo de indio (0,23 g) y polvo de cinc (1,31 g) a una mezcla compuesta de 2-amino-4,6-dicloropirimidin-5-carboaldel'ndo disponible en el mercado (1,92 g) y N,N-dimetilformamida (20 ml). Despues de esto, se anadieron yoduro sodico (0,15 g) y bromuro de alilo (1,73 ml) a la mezcla, a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agito durante 3 horas. Despues de esto, la mezcla de reaccion se filtro a traves de celite y despues se anadio acetato de etilo al filtrado. La mezcla resultante se lavo sucesivamente con acido clorhndrico 1 N y una solucion salina saturada en este orden. La fase organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y despues se concentro. Despues de esto, se anadio hexano al residuo y despues se recogio un precipitado por filtracion, para obtener el compuesto del tttulo anterior (1,75 g) en forma de un solido. RMN ^H (DMSO-D6) 6: 2,55-2,69 (2H, m), 4,95-5,09 (3H, m), 5,37 (1H, d, J = 4,1 Hz), 5,67-5,77 (1H, m), 7,42 (2H, s).

(2) 1-(2-Amino-4,6-dicloropirimidin-5-il)-2-(2,2-dimetil-[1.3]dioxolan-4-ilo)etan-1-ol

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Una mezcla compuesta de 1-(2-amino-4,6-dicloropirimidin-5-il)-3-buten-1-ol (57,24 g), N-oxido de N-metilmorfolina (147,6 g), tetrahidrofurano (500 ml), acetona (500 ml), agua (500 ml) y tetraoxido de osmio (62 mg) se agito a temperatura ambiente durante 2 dfas. Despues de haberse confirmado la desaparicion de los materiales, se anadio una solucion acuosa saturada de tiosulfato sodico (1 l) a la solucion de reaccion y la mezclas de reaccion se concentro despues a aproximadamente 1,5 l a presion reducida. El residuo se saturo con cloruro sodico, seguido de la extraccion con tetrahidrofurano. La fase organica se seco sobre sulfato sodico anhidro. Despues de la filtracion, el filtrado se concentro a presion reducida y despues el disolvente se retiro por destilacion. Se anadieron W,W-dimetilformamida (500 ml), 2,2-dimetoxipropano (210 ml) y monohidrato del acido p-toluenosulfonico (18,61 g) al residuo resultante. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 14 horas. Se anadieron una solucion saturada de bicarbonato sodico (1 l) y agua (1 l) a la mezcla de reaccion, seguido de la extraccion con acetato de etilo. La fase organica se lavo sucesivamente con agua y una solucion salina saturada en este orden, y despues se seco sobre sulfato sodico anhidro. Despues de la filtracion, el filtrado se concentro a aproximadamente 100 ml a presion reducida. Se anadio hexano al residuo y despues el precipitado se recogio por filtracion, para obtener el compuesto del tttulo (53,88 g) en forma de un solido.

RMN 1H (DMSO-D6) 6: 1,22-1,32 (6H, m), 1,72-2,23 (2H, m), 2,50 (1H, s), 3,50 (1H, td, J = 14,2, 6,9 Hz), 4,22-3,92 (2H, m), 5,06-5,36 (2H, m), 7,43 (2H, d, J = 12,8 Hz). IEN-EM m/z: 308 (M+H)+.

(3) 1-(2-Amino-4,6-dicloropirimidin-5-il)-2-(2,2-dimetil-[1.3]dioxolan-4-ilo)etan-1-ona

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Se anadio gota a gota anhfdrido acetico (149 ml) a una mezcla compuesta del 1-(2-amino-4,6-dicloro- pirimidin-5-il)-2-(2,2-dimetil-[1.3]dioxolan-4-ilo)etan-1-ol anterior (74,70 g) y dimetilsulfoxido (600 ml) a temperatura ambiente durante 15 minutos en refrigeracion en un bano de hielo. Despues, la mezcla de reaccion se agito a la misma temperatura de antes durante 18 horas. Despues de haberse confirmado la desaparicion de los materiales, la solucion de reaccion se vertio en agua enfriada con hielo. El solido precipitado se recogio por filtracion, para obtener el

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compuesto del tftulo (68,26 g).

RMN 1H (CDCla) 6: 1,37 (3H, s), 1,42 (3H, s), 2,98-3,06 (1H, m), 3,32-3,40 (1H, m), 3,67-3,72 (1H, m), 4,25-4,30 (1H, m), 4,57-4,64 (1H, m), 5,72 (2H, s). IEN-EM m/z: 306 (M+H)+.

(4) 4-Cloro-3-[(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-ilo)metil]-1-(4-metoxibencil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-amina

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Se anadio trietilamina (83,68 ml) a una mezcla compuesta de la 1-(2-amino-4,6-dicloropirimidin-5- il)-2-(2,2-dimetil-[1.3]dioxolan-4-ilo)etan-1-ona anterior (61,23 g), clorhidrato de (4-metoxibencil)-hidrazina (41,50 g) producido por el procedimiento descrito en la Patente de Estados Unidos N.° US2003/18197 y diclorometano (600 ml) durante 30 minutos en refrigeracion en un bano de hielo. Despues de esto, mientras la temperatura de la solucion de reaccion se elevaba gradualmente, se agito durante 17 horas. Despues de esto, se anadio una solucion acuosa al 10 % de acido dtrico a la mezcla de reaccion, seguido de la extraccion con diclorometano. La fase organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y despues se concentro a presion reducida. Se anadio una solucion acuosa al 5 % al residuo resultante y despues el precipitado se recogio por filtracion. El material resultante se lavo con agua, para obtener el compuesto del tftulo (73,84 g) en forma de un solido.

RMN 1H (CDCla) 6: 1,36 (3H, s), 1,43 (3H, s), 3,11 (1H, dd, J = 14,7, 8,1 Hz), 3,43 (1H, dd, J = 14,7, 5,2 Hz), 3,73-3,78 (4H, m), 4,08 (1H, dd, J = 8,1,6,0 Hz), 4,54-4,61 (1H, m), 4,77 (2H, s a), 5,22 (2H, s), 6,83 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,24 (2H, d, J = 8,5 Hz).

IEN-EM m/z: 404 (M+H)+.

(5) Dicarbonato de di-terc-butil{4-cloro-3-[(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-ilo)metil]-1-(4-metoxibencil)-1H-pirazolo- [3,4-d]pirimidin-6-il}imida

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Se anadieron 4-dimetilaminopiridina (2,20 g) y dicarbonato de di-terc-butilo (86,59 g) a una mezcla compuesta de la 4-cloro-3-[(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-ilo)metil]-1-(4-metoxibencil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-amina anterior

(72,83 g) y tetrahidrofurano (700 ml) y despues la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 12 horas. Despues de esto, la mezcla de reaccion se filtro y despues el filtrado se concentro a presion reducida. El residuo resultante se purifico por cromatograffa en columna sobre gel de sflice (acetato de etilo-hexano), para obtener el compuesto del tftulo (70,00 g) en forma de una sustancia amorfa.

RMN 1H (CDCls) 6: 1,37 (3H, s), 1,40 (3H, s), 1,44-1,46 (18H, m), 3,21-3,29 (1H, m), 3,48-3,55 (1H, m), 3,74-3,81 (4H, m), 4,09-4,15 (1H, m), 4,58-4,66 (1H, m), 5,48 (2H, dd, J = 17,3, 15,1 Hz), 6,81 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,27-7,30 (2H, m). IEN-EM m/z: 604 (M+H)+.

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(6) Dicarbonato de di-ferc-butil[4-cloro-3-(2,3-dihidroxipropil)-1-(4-metoxibencil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-il]imida

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El dicarbonato de di-ferc-butil{4-cloro-3-[(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-ilo)metil]-1-(4-metoxibencil)-1H-pirazo-

lo[3,4-d]pirimidin-6-il}imida anterior (53,85 g) se disolvio en acetonitrilo (500 ml) y despues se anadio cloruro de cobre (II) dihidrato (30,39 g) a la solucion. La mezcla resultante se agito a temperature ambiente durante 2 horas. Despues de esto, se anadio una solucion acuosa saturada de cloruro de amonio a la solucion de reaccion, seguido de la extraccion con acetato de etilo. La fase organica se lavo con una solucion salina saturada y despues se seco sobre sulfato sodico anhidro, seguido de concentracion a presion reducida. El residuo resultante se purifico por cromatograffa en columna sobre gel de sflice (acetato de etilo-hexano), para obtener el compuesto del tftulo (37,70 g) en forma de una sustancia amorfa.

RMN 1H (CDCla) 6: 1,46 (18H, s), 3,15 (1H, d, J = 3,7 Hz), 3,23-3,33 (2H, m), 3,62-3,82 (5H, m), 4,26-4,34 (1H, m), 5,49 (2H, t, J = 15,9 Hz), 6,82 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,25-7,30 (2H, m).

IEN-EM m/z: 564 (M+H)+.

(7) Dicarbonato de Di-ferc-butil[8-hidroxi-2-(4-metoxibencil)-2,7,8,9-tetrahidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]azulen- 4-il]-imida

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Se anadio gota a gota cloruro de metanosulfonilo (4,23 ml) a una mezcla compuesta del dicarbonato de di-ferc-butil[4-cloro-3-(2,3-dihidroxipropil)-1-(4-metoxibencil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-il]imida anterior (28,00 g), 2,4,6-collidina (16,53 ml) y diclorometano anhidro (400 ml) en refrigeracion en un bano de hielo. Despues, la mezcla resultante se agito a 4 °C durante 15 horas. Despues de esto, se anadio una solucion acuosa al 10 % de acido cftrico a la mezcla de reaccion, seguido de la extraccion con diclorometano. La fase organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y despues se concentro a presion reducida. El residuo resultante se disolvio en W,W-dimetilformamida (300 ml) y despues se anadio monohidrato de hidrogeosulfuro de sodio (5,52 g) a la solucion en refrigeracion en un bano de hielo. Despues de esto, la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Despues de esto, se anadio carbonato potasico (10,29 mg) a la mezcla de reaccion y despues la mezcla resultante se calento a 50 °C, seguido de una operacion de agitacion adicional durante 5 horas.

Posteriormente, se anadio acetato de etilo a la mezcla de reaccion y despues el material resultante se lavo sucesivamente con una solucion acuosa al 10% de acido cftrico y despues con una solucion salina saturada. El material resultante se seco sobre sulfato sodico anhidro y despues se concentro a presion reducida. El residuo resultante se purifico por cromatograffa en columna sobre gel de sflice (acetato de etilo-hexano), para obtener el compuesto del tftulo (20,59 g) en forma de un solido.

RMN 1H (CDCla) 6: 1,45 (18H, s), 2,39 (1H, s a), 3,29-3,51 (4H, m), 4,58 (1H, s a), 3,76 (3H, s), 5,42-5,49 (2H, m), 6,82 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,30 (2H, d, J = 8,6 Hz).

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IEN-EM m/z: 544 (M+H)+.

(8) Acetato de 4-[bis(terc-butoxicarbonilo)amino]-2-(4-metoxibencil)-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]azulen- 8-ilo

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En una atmosfera de nitrogeno, se anadio gota a gota acetico anhndrido (14 ml) a una mezcla compuesta del dicarbonato de di-terc-butil[8-hidroxi-2-(4-metoxibencil)-2,7,8,9-tetrahidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]azulen-

4-il]imida anterior (8,17 g), dimetilsulfoxido (74 ml) y piridina (12 ml) en refrigeracion sobre hielo y despues la mezcla resultante se agito durante 30 minutos. Despues de esto, la solucion de reaccion se agito adicionalmente a temperatura ambiente durante 15 horas. Despues de haberse confirmado la desaparicion de los materiales, la mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo y despues se lavo con una solucion salina saturada. La fase organica se seco sobre sulfato sodico anhidro, seguido de concentracion a presion reducida. El residuo resultante se purifico por cromatograffa en columna sobre gel de sflice (acetato de etilo- hexano), para obtener el compuesto del tftulo (6,15 g) en forma de una sustancia amorfa.

RMN 1H (CDCla) 6: 1,44 (18H, s), 2,26 (3H, s), 3,77 (3H, s), 3,88 (2H, s), 5,50 (2H, s), 6,68 (1H, s), 6,83 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,31 (2H, d, J = 8,8 Hz).

IEN-EM m/z: 584 (M+H)+.

(9) Dicarbonato de di-terc-butil[2-(4-metoxibencil)-8-oxo-2,7,8,9-tetrahidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]azulen- 4-il]imida

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Una mezcla compuesta del acetato de 4-[bis(terc-butoxicarbonilo)amino]-2-(4-metoxibencil)-2,7-dihidro-6-tia- 1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]azulen-8-ilo anterior (6,15 g), metanol (200 ml) y carbonato potasico (0,73 g) se agito durante 1,5 horas en refrigeracion en un bano de hielo. Despues de haberse confirmado la desaparicion de los materiales, se anadio una solucion acuosa saturada de cloruro de amonio a la mezcla de reaccion, seguido de la extraccion con acetato de etilo. La fase organica se lavo con una solucion salina saturada y despues se seco sobre sulfato sodico anhidro, seguido de concentracion a presion reducida, para obtener el compuesto del tftulo (5,70 g) en forma de una sustancia amorfa. RMN 1H (CDCla) 6: 1,46 (18H, s), 3,84 (2H, s), 3,77 (3H, s), 4,23 (2H, s), 5,48 (2H, s), 6,83 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,32 (2H, d, J = 8,6 Hz).

IEN-EM m/z: 542 (M+H)+.

(10) {4-[Bis(ferc-butoxicarbonilo)amino]-2-(4-metoxibencil)-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]azulen- 8-il}acetato de etilo

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Una mezcla compuesta del dicarbonato de di-ferc-butil[2-(4-metoxibencil)-8-oxo-2,7,8,9-tetrahidro-6-tia-1,2,3,5- 5 tetraazabenzo[cd]azulen-4-il]imida anterior (5,19 g), (trifenilfosfanilideno)acetato de etilo (3,51 g) y tolueno (300 ml) se agito a 65 °C durante 13 horas. Despues de esto, la mezcla de reaccion se concentro a presion reducida y despues el residuo se purifico por cromatograffa en columna sobre gel de sflice (acetato de etilo-hexano), para obtener el compuesto del tftulo (3,78 g) en forma de una sustancia amorfa.

RMN 1H (CDCla) 6: 1,29 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,69-1,77 (1H, m), 2,37-2,40 (1H, m), 2,46-2,52 (1H, m), 2,68-2,71 (2H, m), 10 4,20 (2H, c, J = 7,1 Hz), 5,10-5,13 (1H, m), 5,20 (2H, s a).

IEN-EM m/z: 612 (M+H)+

(11) Trifluoroacetato de 2-(4-amino-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]azulen-8-il)-N-metilacetamida

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El {4-[bis(ferc-butoxicarbonilo)amino]-2-(4-metoxibencil)-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraaza-

15 benzo[cd]azulen-8-il}acetato de etilo anterior (2,2 g) se disolvio en una solucion al 40 % de metilamina/metanol (40 ml), y la solucion mezclada se agito a temperatura ambiente durante 2 horas. La finalizacion de la reaccion se confirmo por CL-EM y despues el disolvente se retiro por destilacion a presion reducida. Despues de esto, se anadieron anisol (2 ml) y acido trifluoroacetico (40 ml) al residuo resultante y despues la mezcla resultante se agito a 65 °C durante 15 horas. Despues de esto, la solucion de reaccion se concentro a presion reducida y despues se anadio una solucion 20 mixta de isopropil eter-eter al residuo. El precipitado se recogio por filtracion, para obtener el compuesto del tftulo (1,53 g) en forma de un solido.

IEN-EM m/z: 277 (M+H)+.

(12) Acido 5-cloro-4-hidroxi-6-metilnicotmico

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25 Se suspendio acido 4-hidroxi-6-metil-nicotmico disponible en el mercado (300 mg) en 3 ml de acetonitrilo y despues se anadio W-clorosuccinimida (380 mg) a la suspension. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos. Despues de esto, la solucion de reaccion se calento a reflujo durante 45 minutos. Despues de haberse confirmado la desaparicion de los materiales, la solucion de reaccion se enfrio sobre hielo y despues el precipitado se recogio por filtracion, para obtener el compuesto del tftulo (324 mg) en forma de un solido. RMN 1H (CD3OD) 6: 2,56 30 (3H, s), 8,50 (1H, s). IEN-EM m/z: 188 (M+H)+.

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(13) 4,5-Dicloro-6-metilnicotinato de metilo

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Se anadio oxicloruro de fosforo (1,13 ml) al acido 5-cloro-4-hidroxi-6-metilnicotmico anterior (320 mg) y despues la mezcla resultante se calento a reflujo durante 2 horas. Despues de esto, la solucion de reaccion se concentro a presion reducida y despues se anadio gota a gota metanol (3 ml) al residuo en refrigeracion sobre hielo. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido de concentracion a presion reducida. Una solucion saturada de bicarbonato sodico se anadio al residuo en refrigeracion sobre hielo, seguido de la extraccion con acetato de etilo. La fase organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y despues el disolvente se retiro por destilacion, para obtener un producto en bruto del compuesto del fftulo (436 0mg) en forma de un solido. IEN-EM m/z: 220 (M+H)+.

(14) 5-Cloro-4-metoxi-6-metilnicotinato de metilo

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Se disolvio 4,5-dicloro-6-metilnicotinato de metilo en bruto (380 mg) en 3 ml de metanol y, en una corriente de nitrogeno, se anadio despues metoxido sodico (120 mg) a la solucion en refrigeracion sobre hielo. La temperatura de la solucion de reaccion se elevo gradualmente a temperatura ambiente y se agito durante 18 horas. Despues de haberse confirmado la desaparicion de los materiales, se anadio una solucion acuosa saturada de cloruro de amonio a la solucion de reaccion en refrigeracion sobre hielo, seguido de la extraccion con cloroformo. La fase organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y despues el disolvente se retiro por destilacion. El residuo se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice (acetato de etilo-hexano), para obtener el compuesto del fftulo (210 mg) en forma de un solido. RMN 1H (CDCla) 6: 2,67 (3H, s), 3,95 (4H, s), 4,00 (3H, s), 8,76 (1H, s).

IEN-EM m/z: 216 (M+H)+

(15) (5-Cloro-4-metoxi-6-metilpiridin-3-ilo)metanol

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El 5-cloro-4-metoxi-6-metilnicotinato de metilo anterior (1,0 g) se disolvio en 30 ml de metanol y despues se anadio borohidruro sodico (1,75 g) a la solucion. La mezcla resultante se calento a reflujo durante 1 hora. Despues de esto, una solucion acuosa saturada de cloruro de amonio se anadio a la solucion de reaccion en refrigeracion sobre hielo, seguido de la extraccion tres veces con cloroformo. La fase organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y despues el disolvente se retiro por destilacion, para obtener el compuesto del fftulo (0,92 g) en forma de una sustancia oleosa. RMN 1H (CDCla) 6: 2,63 (3H, s), 4,00 (3H, s), 4,71 (2H, s a), 8,33 (1H, s)

IEN-EM m/z: 188 (M+H)+

(16) 3-Cloro-5-(clorometil)-4-metoxi-2-metilpiridina

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El (5-cloro-4-metoxi-6-metilpiridin-3-ilo)metanol anterior (520 mg) se disolvio en 20 ml de cloroformo y despues se anadio cloruro de tionilo (0,38 ml) a la solucion en refrigeracion sobre hielo. La mezcla resultante se agito a la misma temperatura de antes durante 3 horas. Despues de esto, la solucion de reaccion se concentro y despues se anadio acetato de etilo al concentrado. La mezcla resultante se lavo con una solucion saturada de bicarbonato sodico, agua y una solucion salina saturada en este orden. La fase organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y despues el disolvente se retiro por destilacion. El residuo se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice (acetato de etilo-hexano), para obtener el compuesto del fftulo (550 mg) en forma de una sustancia oleosa.

RMN 1H (CDCls) 6: 2,64 (3H, s), 4,05 (3H, s), 4,61 (2H, s), 8,35 (1H, s).

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IEN-EM m/z: 206 (M+H)+.

(17) 3-Cloro-4-metoxi-2,5-dimetilpiridina

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La 3-cloro-5-(dorometil)-4-metoxi-2-metilpiridina anterior (550 mg) se disolvio en 10 ml de metanol y despues se anadio Pd al 10 % sobre carbono (50 mg) a la solucion. Se realizo hidrogenacion por contacto a presion normal sobre la mezcla en refrigeracion sobre hielo durante 3 horas. Despues de esto, el catalizador se retiro por filtracion y despues el metanol se retiro por destilacion a presion reducida. El residuo se extrajo con cloroformo. La fase organica se lavo con una solucion saturada de bicarbonato sodico y despues se seco sobre sulfato sodico anhidro. El disolvente se retiro por destilacion y el residuo se purifico por cromatograffa sobre gel de sflice (acetato de etilo-hexano), para obtener el compuesto del tftulo (365 mg) en forma de una sustancia oleosa.

RMN 1H (CDCla) 6: 2,25 (3H, s), 2,59 (3H, s), 3,89 (3H, s), 8,16 (1H, s).

IEN-EM m/z: 172 (M+H)+.

(18) 1-Oxido de 3-cloro-4-metoxi-2,5-dimetilpiridina

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La 3-cloro-4-metoxi-2,5-dimetilpiridina anterior (181 mg) se disolvio en 5 ml de diclorometano y despues se anadieron peroxido de urea (169 mg) y anhfdrido ftalico (219 mg) a la solucion. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 2,5 horas. Despues de esto, una solucion acuosa saturada de tiosulfato sodico se anadio a la solucion de reaccion en refrigeracion sobre hielo y la mezcla resultante despues se diluyo con cloroformo. La fase acuosa se extrajo dos veces con cloroformo. La fase organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y despues el disolvente se retiro por destilacion, para obtener el compuesto del tftulo (181 mg) en forma de un solido.

RMN 1H (CDCla) 6: 2,24 (3H, s), 2,62 (3H, s), 3,87 (3H, s), 8,07 (1H, s).

IEN-EM m/z: 188 (M+H)+.

(19) (3-Cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metanol

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El 1-oxido de 3-cloro-4-metoxi-2,5-dimetilpiridina anterior (530 mg) se suspendio en 15 ml de diclorometano y despues se anadio anhfdrido trifluoroacetico (0,39 ml) a la suspension en refrigeracion sobre hielo. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. La solucion de reaccion se diluyo con cloroformo y despues se lavo con una solucion saturada de bicarbonato sodico. La fase de agua se extrajo con cloroformo. La fase organica se seco sobre sulfato sodico anhidro y despues el disolvente se retiro por destilacion para obtener el compuesto del tftulo (521 mg) en forma de una sustancia oleosa.

RMN 1H (CDCh) 6: 2,29 (3H, s), 3,93 (3H, s), 4,29 (1H, s a), 4,72-4,74 (2H, m), 8,26 (1H, s).

IEN-EM m/z: 188 (M+H)+.

(20) Clorhidrato de 3-cloro-2-(clorometil)-4-metoxi-5-metilpiridina

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El (3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metanol anterior (530 mg) se disolvio en 20 ml de cloroformo y despues se anadio gota a gota cloruro de tionilo (1,03 ml) a la solucion en refrigeracion sobre hielo. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. Despues de esto, la solucion de reaccion se concentro y despues se lavo con un disolvente mixto de eter-hexano, para obtener el compuesto del tftulo (410 mg) en forma de un solido.

RMN 1H (CDCla) 6: 2,47 (3H, s), 4,32 (3H, s), 5,09 (2H, s), 8,54 (1H, s).

IEN-EM m/z: 206 (M+H)+.

(21) 2-{4-Amino-2-[(3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metil]-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]- azulen-8-il}-N-metilacetamida

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Se anadio dimetilformamida (1 ml) a trifluoroacetato de 2-(4-amino-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5- tetraazabenzo[cd]azulen-8-il)-N-metilacetamida (28 mg), clorhidrato de 3-cloro-2-(clorometil)-4-metoxi-5-metilpiridina (36 mg) y carbonato potasico (69 mg). La mezcla resultante se agito a 60 °C durante 2,5 horas. Despues de esto, el material insoluble se retiro por filtracion y despues el disolvente se retiro por destilacion en una corriente de nitrogeno. El residuo resultante se disolvio en dimetilsulfoxido (1 ml) y despues se purifico por HPLC preparativa de fase inversa. El disolvente se retiro por destilacion a presion reducida, para obtener el compuesto del tftulo (27,0 mg) en forma de un solido.

RMN 1H (CDCla) 6: 2,24 (4H, s), 2,82 (3H, d, J = 4,9 Hz), 3,27 (2H, s), 3,80 (2H, s), 3,91 (3H, s), 5,21 (2H, s), 5,65 (2H, s), 5,87 (1H, s), 6,70 (1H, s), 8,16 (1H, s).

IEN-EM m/z: 446 (M+H)+.

(Ejemplo 2)

Monobromhidrato de 2-{4-amino-2-[(3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metil]-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5- tetraazabenzo[cd]azulen-8- il}-N-metilacetamida

Una solucion al 20 % de acido bromhftdrico-etanol (204 pl, 0,505 mmol) se anadio a una solucion en acetonitrilo (350 ml) de 2-{4-amino-2-[(3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metil]-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-

tetraazabenzo[cd]azulen- 8-il}-N-metilacetamida (250 mg, 0,561 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agito durante 3 horas y despues el solido precipitado se recogio por filtracion. Se anadio etanol (3 ml) al solido resultante y despues la mezcla resultante se agito durante 1 dfa. Despues de esto, el solido se recogio por filtracion. Despues el solido se seco a presion reducida a temperatura ambiente durante 2 dfas, para obtener el compuesto del tftulo (128 mg, 0,243 mmol).

Anal. calc. para C19H2-iN7O2SClBr0,4H2O: C, 42,91; H, 4,01; O, 7,13; N, 18,57; Cl, 6,68; Br, 15,03; S, 6,08. Encontrado: C, 42,73; H, 4,11; O, 7,19; N, 18,36; Cl, 6,64; Br, 14,96; S, 6,00.

(Ejemplo 3)

Monoclorhidrato de 2-{4-amino-2-[(3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metil]-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo- [cd]azulen-8- il}-N-metilacetamida

Se anadio acido clorhndrico 3 N (0,786 ml, 2,358 mmol) a una suspension en etanol (30 ml) de la 2-{4- amino-2-[(3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metil]-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]azulen-8-il} -N-metilacetamida anterior (527,52 mg, 1,183 mmol), mientras se agitaba a 25 °C. La mezcla resultante se agito durante 1 hora. El solido precipitado se filtro, se lavo con etanol (6 ml) y despues se seco a presion reducida a 40 °C durante 30 minutos, para obtener el compuesto del tftulo (531,09 mg, 1,101 mmol).

Anal. calc. para C-i9H21Cl2N7O2S: C, 47,31; H, 4,39; N, 20,33; O, 6,63; Cl, 14,70; S, 6,65.

Encontrado: C, 47,29; H, 4,40; N, 20,02; O, 6,87; Cl, 14,99; S, 6,83.

(Ejemplo 4)

Monometanosulfonato de 2-{4-amino-2-[(3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metil]-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5- tetraazabenzo[cd]azulen-8- il}-N-metilacetamida

Una solucion en eter dietflico (50 ml) de acido metanosulfonico (32 mg, 0,302 mmol) se anadio a 5 °C a una solucion en acetonitrilo (150 ml) de 2-{4-amino-2-[(3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metil]-2,7-

dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraaza-benzo[cd]azulen-8-il}-N-metilacetamida (151 mg, 0,339 mmol). La mezcla resultante se agito a 5 °C durante 25 minutos. Despues de esto, el disolvente se retiro por destilacion a presion reducida, despues se

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anadio una cantidad adecuada de eter dietflico al residuo y despues un solido se recogio por filtracion. Despues de esto, se anadio etanol (1 ml) al solido resultante y despues la mezcla resultante se agito a temperature ambiente durante aproximadamente 1 dfa. Despues de esto, un solido se recogio por filtracion y despues se seco a presion reducida a temperatura ambiente durante 1 dfa, para obtener el compuesto del tttulo (145 mg, 0,268 mmol).

Anal. calc. para C20H24N7O5S2Cl0,3H2O: C, 44,71; H, 4,69; O, 15,45; N, 17,81; Cl, 6,54; S, 11,56.

Encontrado: C, 43,88; H, 4,53; O, 15,49; N, 17,91; Cl, 6,48; S, 11,71.

(Ejemplo 5)

Monoetano-1,2-disulfonato de 2-{4-amino-2-[(3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metil]-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5- tetraazabenzo[cd]azulen-8- il}-N-metilacetamida

Una solucion en acetona (50 ml) de etano-1,2-disulfonato (70 mg, 0,368 mmol) se anadio a 5 °C a una solucion en acetona (50 ml) de 2-{4-amino-2-[(3-cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metil]-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraaza- benzo[cd]azulen-8-il}-N-metilacetamida (164 mg, 0,368 mmol). La mezcla resultante se agito a 5 °C durante 20 minutos. Despues de esto, la solucion de reaccion se dejo en reposo a 5 °C durante 18 horas y despues se agito a temperatura ambiente durante 7 horas. Despues de esto, el solido precipitado se recogio por filtracion y despues se seco a presion reducida a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 dfa, para obtener el compuesto del tftulo (119 mg, 0,187 mmol).

Anal. calc. para C21H26N7O8S3CM.4H2O: C, 38,06; H, 4,68; O, 22,29; N, 14,92; Cl, 5,25; S, 13,83.

Encontrado: C, 38,14; H, 4,39; O, 22,74; N, 14,83; Cl, 5,36; S, 14,55.

(Ejemplo de ensayo 1: Ensayo de ATPasa de Hsp90)

Un ensayo de ATPasa de Hsp90 se realizo usando a protema recombinante Hsp90 de levadura (en lo sucesivo llamada rHsp90). Se clono ADN de Hsp90 de levadura a partir de una genoteca de ADN genomico de levadura de acuerdo con un procedimiento convencional. El ADN de Hsp90 de levadura clonado se incorporo en un plasmido para expresion en Escherichia coli, y el plasmido se expreso en Escherichia coli para obtener rHsp90.

El compuesto de ensayo se disolvio en DMSO a 10 mM. La solucion disuelta se diluyo con DMSO a dos concentraciones, 1 mM y 0,2 mM. Cada solucion diluida se diluyo 10 veces mas con un tampon de ensayo (Tris 100 mM, pH 7,4, KCl 20 mM, MgCh 6 mM) (concentracion de cada solucion de compuesto de ensayo: 100 pM y 20 pM; concentracion de DMSO: 10 %).

Se disolvio rHsp90 en un tampon TE (Tris 20 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM) a una concentracion de 2,531 mg/ml. La solucion se diluyo con un tampon de ensayo a 125 pg/ml y se repartio en una placa de ensayo de 96 pocillos a 40 pl por pocillo (concentracion final: 100 pg/ml).

La solucion de compuesto de ensayo se repartio a 5 pl por pocillo y despues las soluciones en los pocillos respectivos se mezclaron usando un mezclador de placas. Se diluyo aTp 100 mM (Sigma, Catalog N.° A-7699) con un tampon de ensayo a 1 mM y se repartio a 5 pl por pocillo (concentracion final: 100 pM). Las soluciones en los pocillos respectivos se mezclaron usando un mezclador de placas y despues la placa de ensayo se dejo en reposo en a 37 °C durante dos horas.

Se repartio Reactivo BIOMOL GREEN (BIOMOL, N.° de catalogo AK-111) at 100 pl por pocillo, y la reaccion se finalizo. Las soluciones en los pocillos respectivos se mezclaron usando un mezclador de placas y despues se repartio citrato sodico al 34 % a 10 pl por pocillo. Las soluciones en los pocillos respectivos se mezclaron usando un mezclador de placas y despues la placa de ensayo se dejo en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. La absorbancia a 650 nm de cada pocillo se midio usando SpectramaxPLUS (Molecular Devices).

La relacion de la absorbancia del grupo anadido al compuesto de ensayo con respecto a la absorbancia del grupo sin el compuesto de ensayo (valor T/C) se determino mediante la siguiente formula de calculo, basada en la suposicion de que la absorbancia del pocillo en el que se anadieron el compuesto de ensayo y rHsp90 era A, la absorbancia del pocillo en el que unicamente se anadio rHsp90 era By la absorbancia del pocillo en el que no se anadieron ni el compuesto de ensayo ni rHsp90 era C. El calculo se realizo usando Softmax Pro 4,6 (Molecular Devices). Adicionalmente, se calculo una tasa de inhibicion (%) usando la siguiente formula de calculo:

T/C = (A-C)/(B-C)

El compuesto del Ejemplo 1 mostro una actividad inhibidora de ATPasa del 50 % o superior a una concentracion de 2 pM.

(Ejemplo de ensayo 2: ensayo de inhibicion del crecimiento celular)

Se realizo un ensayo de inhibicion del crecimiento celular usando dos tipos de celulas (SK-BR.3 de lmea celular de cancer de mama humano y NCl-H460 de lmea celular de cancer de pulmon humano).

Se suspendieron celulas de cada tipo en un medio y se sembraron en una placa multi pocillo de 96 pocillos a 2000 celulas/150 pl/pocillo en el caso de SK-BR-3 y a 500 celulas/150 pl/pocillo en el caso de NCI-H460. El compuesto de

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ensayo se disolvio en DMSO y este se diluyo con un medio para preparar una solucion de muestra (concentracion de DMSO: 0,5 % o inferior). El dfa de la siembra, se anadieron adicionalmente a las celulas 50 |jl de medio que contema DMSO al que no se habfa anadido el compuesto de ensayo (en lo sucesivo llamada solucion diluida de DMSO; concentracion de DMSO: 0,5 % o inferior) o 50 jl de la solucion de muestra. Se realizo un ensayo de MTT inmediatamente despues y 72 horas despues de anadir la solucion de muestra o la solucion diluida de DMSO a las celulas. El ensayo de MTT se realizo como se indica a continuacion.

Se anadieron 5 mg/ml de una solucion de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) a 20 jl por pocillo. Despues de esto, la placa se incubo a 37 °C en CO2 al 5 % durante cuatro horas. La placa se centrifugo a 1200 rpm durante cinco minutos y despues el sobrenadante de cultivo se retiro mediante succion usando a dosificador. Se anadio DMSO a 150 jl por pocillo y el formazan generado se disolvio. La placa se agito usando un mezclador de placas para tenir uniformemente los pocillos respectivos. La absorbancia de cada pocillo se midio usando un lector de placas a una OD de 540 nm con una referencia de 660 nm.

Se determino el valor T/C (%) para cada concentracion mediante la siguiente formula de calculo y se represento una curva de dosis-respuesta para calcular la concentracion inhibidora del crecimiento del 50 % (valor GI50), basada en la suposicion de que el valor de OD medido inmediatamente despues de anadir la solucion de muestra era S, el valor de OD medido 72 horas despues de anadir la solucion de muestra era T y el valor de OD medido 72 horas despues de anadir la solucion diluida de DMSO era C.

T/C (%) = (T-S)/(C-S) x 100

Los resultados se muestran a continuacion.

GI50 de GI50 (nM)

SK-BR-3

NCI-H460

Compuesto 1

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(Ejemplo de ensayo 3: ensayo de actividad antitumoral in vivo)

Se realizo un ensayo de actividad antitumoral usando NCI-H1975 (lmea celular de cancer de pulmon de celulas humanas no pequenas).

En el dfa 0, las celulas mencionadas anteriormente se trasplantaron subcutaneamente en la region del costado izquierdo de cada raton macho desnudo (4 x 106 celulas por raton).

En el dfa 10, se midieron el peso corporal y el diametro del tumor. Despues, los ratones se dividieron en grupos aleatoriamente, de manera que los grupos no tuvieron diferencias estadfsticamente significativas en terminos de peso corporal y el volumen de tumor estimado (el volumen de tumor estimado = el diametro largo del tumor x el diametro corto del tumor x el diametro corto del tumor/2).

En el dfa 11, el diametro del tumor se midio y despues se inicio la administracion del compuesto de ensayo.

El compuesto de ensayo se preparo a una concentracion de 1,5 mg/ml y se administro por via oral a los ratones a una dosis de 15 mg/10 ml/kg.

Tal administracion se realizo una vez al dfa durante el periodo del dfa 11 al dfa 14 y se midio el diametro del tumor durante el periodo del dfa 11 al dfa 14 y en el dfa 17.

El dfa 17, el tumor se extirpo y despues se midio el peso humero del tumor.

El peso inicial del tumor se calculo a partir del volumen del tumor medido el dfa 11, definiendo la gravedad como 1.

El peso aumentado del tumor se calculo restando el peso inicial del tumor del peso humedo del tumor medido el dfa 17.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

La tasa de inhibicion del crecimiento tumoral (GI% = 100 -T/C (%)) de cada compuesto de ensayo se calculo a partir de la relacion (T/C (%)) del peso de tumor aumentado (T) del grupo de administracion de compuesto de ensayo con respecto al peso de tumor aumentado (C) del grupo de control (grupo de administracion de disolvente).

El ensayo de significancia entre el grupo de control y el grupo de administracion de compuesto de ensayo se realizo de acuerdo con el ensayo de comparacion multiple de Dunnett usando EXSAS ver. 7.5.2.2 (Arm Corp).

El compuesto del Ejemplo 1 mostro una actividad inhibidora del crecimiento tumoral significativa del 50 % o superior.

(Ejemplo de ensayo 4: Ensayo de inhibicion de CYP3A4 usando microsoma hepatico humano)

Se usaron Midazolam (un sustrato; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1'-Hidroximidazolam (una diana para su medicion; Becton, Dickinson and Company, Japon), Ketoconazol (un control positivo; Sigma Chemical Co.), NADPH Regeneration System (Solucion A y Solucion B (Becton, Dickinson and Company, Japon)). Se pesaron cantidades adecuadas de dicho compuesto de ensayo, sustrato, diana para su medicion y control positivo. Estas se disolvieron en DMSO y despues se diluyeron con acetonitrilo, segun fue adecuado.

180 |jl de una solucion de reaccion preparada mezclando los siguientes materiales (1) a (5) se habfan calentado previamente a 37 °C durante 10 minutos:

(1) Tampon fosfato potasico (pH 7,4; concentracion final: 50 mM)

(2) Agua purificada

(3) Midazolam (concentracion final: 2,5 jM)

(4) Compuesto de ensayo (concentracion final: 10 jM; control negativo: ningun compuesto; control positivo: Ketoconazol, concentracion final: 0,1 jM)

(5) Microsoma hepatico humano (concentracion final: 0,05 mg-P/ml).

Se anadieron 20 jl del NADPH Regeneration System (solucion A/solucion B/agua purificada = 5/1/4) a esta solucion de reaccion y la reaccion se inicio. La mezcla se incubo durante 10 minutos. Despues de esto, se muestrearon 50 jl de la solucion de reaccion y despues esta se anadio a 200 jl de acetonitrilo, seguido de la terminacion de la reaccion. Ademas, se anadieron 50 jl de una solucion de acetonitrilo que contema una sustancia de patron interno a la solucion de reaccion.

Para retirar protemas de esta muestra, la solucion de reaccion se transfirio a una placa de recoleccion de 96 pocillos (Waters) usando Captiva (marca registrada) (GL Sciences). Esta solucion de muestras se definio como una muestra usada para el ensayo de CL-EM/EM.

Se prepararon muestras de 1'-Hidroximidazolam que teman concentraciones conocidas (concentraciones finales: de 0 a 5 jM; 5 puntos en total), por separado. Se preparo una curva de calibracion usada para el ensayo y se ensayo la concentracion de 1'-Hidroximidazolam en la muestra. Esta reaccion se realizo por duplicado.

La cantidad de 1'-Hidroximidazolam generada en el control negativo se definio como 100 % y despues se calculo la proporcion de la cantidad de este compuesto generada mediante la adicion de cada compuesto. Por tanto, se obtuvo el valor de inhibicion de CYP3A4.

Como resultado, la tasa de inhibicion del compuesto 1 fue 15 %. El control positivo, Ketoconazol, mostro una tasa de inhibicion del 82 %.

(Ejemplo de ensayo 5: ensayo de actividad antitumoral in vivo)

Un ensayo de actividad antitumoral se realizo usando NCI-H1650 (lmea celular de cancer de pulmon de celulas humanas no pequenas).

Las celulas mencionadas anteriormente se trasplantaron por via subcutanea en la region del costado derecho de cada raton desnudo macho (1 x 107 celulas por raton).

Treinta y nueve dfas despues, el tumor se extirpo y se preparo una pequena seccion que tema cada lado de 2 a 3 mm. La seccion pequenas se trasplanto subcutaneamente en la region del costado derecho de cada raton desnudo macho (Dfa 0).

El dfa 14, se midieron el peso corporal y el diametro del tumor. Despues, los ratones se dividieron en grupos aleatoriamente, de manera que los grupos no tuvieran diferencias estadfsticamente significativas en terminos de peso corporal y volumen de tumor estimado (el volumen de tumor estimado = el diametro mas largo del tumor x el diametro mas corto del tumor x el diametro corto del tumor /2).

El dfa 14, se inicio entonces la administracion del compuesto de ensayo.

Los compuestos de ensayo se prepararon a concentraciones de 0,65, 0,9 y 1,3 mg/ml, y se administraron por via oral a los ratones de una dosis de 10 ml/kg.

Tal administracion se realizo una vez al dfa durante el periodo del d^a 14 al dfa 31 y se midio el dinametro del tumor el dfa 14, d^a 17, dfa 21, d^a 24, dfa 28 y d^a 31.

El dfa 31, el tumor se extirpo y despues se midio el peso humedo del tumor.

El peso inicial del tumor se calculo a partir del volumen de tumor medido el dfa 14, definiendo la gravedad como 1.

5 El peso aumentado del tumor se calculo restando el peso inicial del tumor del peso humedo del tumor medido el dfa 31.

La tasa de inhibicion del crecimiento tumoral (GI% = 100 -T/C (%)) de cada compuesto de ensayo se calculo a partir de la proporcion (T/C (%)) del peso de tumor aumentado (T) del grupo de administracion del compuesto de ensayo con respecto al peso tumoral aumentado (C) del grupo de control (grupo de administracion de disolvente).

El ensayo de significancia entre el grupo de control y el grupo de administracion de compuesto de ensayo se realizo de 10 acuerdo con el ensayo de comparacion multiple de Dunnett usando EXSAS ver. 7.5.2.2 (Arm Corp).

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto representado por la formula (1) o una sal del mismo:

   imagen1

   en el que, en la formula (1),

   R1 representa un grupo metilo,

   R2 representa un atomo de cloro,

   R3 representa un grupo metoxi,

   R4 representa un grupo metilo, y X representa un grupo metileno.
2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el compuesto es 2-{4-amino-2-[(3- cloro-4-metoxi-5-metilpiridin-2-ilo)metil]-2,7-dihidro-6-tia-1,2,3,5-tetraazabenzo[cd]azulen-8-il}-N-metilacetamida.
3. 3. Un bromhidrato de un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 2.
4. 4. Un clorhidrato de un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 2.
5. 5. Un metanosulfonato de un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 2.
6. 6. Un etano-1,2-disulfonato de un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 2.
7. 7. Un medicamento que comprende un compuesto de acuerdo con uno cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 como un principio activo.
8. 8. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehfculo farmacologicamente aceptable.
9. 9. Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricacion de un medicamento.
10. 10. Uso de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
11. 11. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en el tratamiento del cancer.