ES2577385T3 - Composición que comprende ácido alfa-lipoico y honokiol para tratar neuropatías - Google Patents

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Abstract

Composición que comprende ácido alfa-lipoico, o una sal o complejo del mismo, y honokiol, caracterizada porque la cantidad en peso de dicho honokiol es de entre el 1% y el 30% con respecto al peso total del honokiol y del ácido alfa-lipoico.

Description

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DESCRIPCION
Composicion que comprende acido alfa-lipoico y honokiol para tratar neuropatias
La presente invencion se refiere a una composicion para el tratamiento de neuropatias y, en particular, a una composicion para el tratamiento de sindromes sensoriales dolorosos de neuropatia periferica.
Se conocen numerosas composiciones utiles para la administracion a personas que sufren neuropatias.
En particular, se sabe que las composiciones que comprenden acido alfa-lipoico tienen un efecto beneficioso en el tratamiento de neuropatias, en especial de neuropatias perifericas adquiridas. De hecho, el acido alfa-lipoico mejora la barrera antioxidante y reduce el estres oxidativo aumentando los niveles de glutation, mejora la velocidad de la comunicacion nerviosa, de modo que optimiza su funcionalidad, y, finalmente, ejerce una accion de normalizacion contra la sensibilidad nerviosa, lo que reduce tanto el dolor como la turbidez sensorial.
Recientes estudios in vivo han confirmado los efectos neuroprotectores y cardioprotectores del acido alfa-lipoico.
Se conocen composiciones de liberacion rapida, o convencional, que comprenden acido alfa-lipoico de la dieta para una unica administracion diaria de 300 mg o 600 mg de acido alfa-lipoico.
Los estudios publicados "Oral Treatment With a-Lipoic Acid Improves Symptomatic Diabetic Polyneuropathy-The SYDNEY 2 trial" Dan Ziegler y otros, Diabetes Care, noviembre de 2006 vol. 29 n.° 11, pag. 2365-2370, y "Thioctic Acid and Acetyl-L-Carnitine in the Treatment of Sciatic Pain Caused by a Herniated Disc" Memeo Antonio y Mario Loiero, Clin. Drug Investigation 2008, Vol. 28, pag. 495-500, comunican que una dosis diaria de 600 mg de acido alfa-lipoico ofrece la mejor relacion riesgo/beneficio para el tratamiento de los sintomas de la polineuropatia diabetica y el dolor ciatico. Segun el primer estudio, en comparacion con una dosis diaria de 600 mg, las dosis mas altas de 1.200 mg y 1.800 mg no proporcionan una mejor respuesta en terminos de mejora de los sintomas de la polineuropatia diabetica. En el estudio tambien se muestra un aumento dependiente de la dosis de los efectos secundarios relacionados con el acido alfa-lipoico, tales como nauseas, vomitos y mareos.
Tambien se sabe que la corteza de Magnolia, un fitoderivado obtenido de Magnolia Officinalis, perteneciente a la familia de Magnoliacee, contiene dos compuestos fenolicos, honokiol y magnolol. Numerosas propiedades farmacologicas, tales como propiedades ansioliticas, antiinflamatorias, antimicrobianas, antioxidantes, antiagregantes plaquetarios y neurotroficas se atribuyen a la corteza de Magnolia.
Y. Fukuyama, Nakade K., Minoshima Y., Yokoyama, A., H. Zhai, Y. Mitsumoto "Neurotrophic activity of honokiol on the cultures of fetal rat cortical neurons," Bioorg. Med Chem. Lett 2002 Apr. 22; 12 (8):1163-6 da a conocer las actividades neurotroficas del honokiol a concentraciones entre 0,1 y 10 pM sobre neuronas corticales de rata cultivadas. En las neuronas corticales, el honokiol es capaz de estimular el crecimiento de neuritas. Ademas, el honokiol ha demostrado que es capaz de aumentar la supervivencia y el desarrollo de las neuronas de cultivos primarios.
En cuanto a la actividad neurotrofica del honokiol, Lee YJ. y otros, "Therapeutic applications of compounds in the magnolia family," Pharmacol. Ther. 2011, 130 (2): 157-76 dan a conocer dosis eficaces en ratas que varian de 0,01 g/kg a 0,25 g/kg. No se conoce ningun estudio que muestre una dosificacion eficaz para los seres humanos.
El documento US2006251608 da a conocer formulaciones para el tratamiento de la piel envejecida, que comprenden antioxidantes, coestimulantes de la antioxidacion, agentes antiinflamatorios, vitaminas, minerales y estimulantes de la sintesis del colageno. No se menciona ninguna eficacia de tales formulaciones para el tratamiento de neuropatias. El acido alfa-lipoico y el honokiol se mencionan ambos como posibles antioxidantes en tales formulaciones, pero no se da a conocer especificamente una combinacion de tales compuestos.
Se conocen suplementos nutricionales para deportistas, utiles para mejorar la masa muscular, la fuerza y la resistencia fisica, que incluyen, entre muchos otros componentes, tambien acido alfa-lipoico y corteza de magnolia que contiene el 2% de honokiol. No se comunica un efecto de estos suplementos para el tratamiento de neuropatias y la cantidad de honokiol en tales suplementos es extremadamente reducida. En particular, la relacion de honokiol y acido alfa-lipoico en tales suplementos conocidos resulta ser inferior al 0,3%.
Por consiguiente, el objetivo de la presente invencion es dar a conocer una composicion que comprende acido alfa- lipoico y que tiene una actividad mejorada en el tratamiento de los sintomas y el dolor neuropatico. Dicho objetivo se consigue con una composicion cuyas principales caracteristicas se especifican en la primera reivindicacion, y una formulacion farmaceutica y dietetica cuyas caracteristicas se especifican en la reivindicacion 9. Otras caracteristicas de la composicion y la formulacion segun la presente invencion se especifican en las reivindicaciones restantes.
La composicion segun la presente invencion comprende acido alfa-lipoico, o una sal o complejo del mismo, y honokiol, y se caracteriza por el hecho de que la cantidad en peso de honokiol esta entre el 1% y el 30% con
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respecto al peso total de los dos componentes honokiol y acido alfa-lipoico.
El acido alfa lipoico contenido en la composicion segun la presente invencion puede estar en forma racemica, es decir, puede ser una mezcla de las dos formas enantiomericas R y S, y/o sales o complejos de las mismas, o la composicion segun la presente invencion puede comprender solo la forma enantiomerica R biologicamente activa, o una sal o complejo de la misma.
De hecho, los presentes inventores han encontrado, sorprendentemente, que la eficacia del acido alfa-lipoico en el tratamiento de neuropatias y sindromes de dolor asociados con las mismas se potencia cuando dicho acido alfa- lipoico se asocia con honokiol en ciertas proporciones, a causa de un efecto de sinergia.
En particular, los estudios realizados por los presentes inventores han demostrado que en cultivos primarios de neuronas, la administracion de composiciones de acido alfa-lipoico y honokiol segun la presente invencion es eficaz en la promocion de la extension de las neuritas y la supervivencia de las celulas, mientras que una administracion similar de composiciones que comprenden alfa acido lipoico y honokiol en una cantidad de 0 a menos del 1% no es significativamente eficaz en la estimulacion de la extension de las neuritas.
Preferentemente, la cantidad en peso de honokiol en la composicion segun la presente invencion esta entre el 2% y el 15%, mas preferentemente entre el 3% y el 10% con respecto al peso total de honokiol y acido alfa-lipoico.
De hecho, se encontro que los intervalos mencionados anteriormente son las relaciones optimas entre las concentraciones de acido alfa-lipoico y honokiol, y en estas relaciones de los dos principios activos tienen un efecto sinergico claro, tal como lo demuestra la comparacion de la actividad significativa de la asociacion con la actividad del acido alfa-lipoico y de honokiol, cuando se utilizan de forma individual.
Tales como sales o complejos de acido alfa-lipoico, se pueden utilizar, por ejemplo, sales solubles en agua, tales como R-lipoato de sodio o de potasio, y otras sales solubles del enantiomero R o del racemato RS en la composicion segun la presente invencion.
La composicion segun la presente invencion comprende preferentemente ademas otros principios activos que forman, en combinacion con el acido alfa lipoico o una sal o complejo del mismo y honokiol, una composicion particularmente eficaz para el tratamiento de neuropatias no diabeticas y perifericas.
Preferentemente, por tanto, la composicion segun la presente invencion comprende acido gamma-linolenico o una sal o complejo, por ejemplo la sal de sodio del acido gamma-linolenico. Preferentemente, la cantidad en peso de dicho acido gamma-linolenico en la composicion segun la presente invencion esta entre el 2% y el 30% con respecto al peso total de honokiol y acido alfa-lipoico. Mas preferentemente, la cantidad en peso de dicho acido gamma- linolenico en la composicion segun la presente invencion esta entre el 15% y el 25% en comparacion con el peso total de honokiol y acido alfa-lipoico.
La composicion segun la presente invencion preferentemente comprende tambien una fuente fisiologicamente aceptable de selenio. Por fuente fisiologicamente aceptable de selenio, en la presente descripcion y en las reivindicaciones, se entiende cualquier fuente de selenio asimilable, utilizable en las composiciones dieteticas o farmaceuticas, por ejemplo una sal de selenio o un complejo de selenio con un aminoacido. Preferentemente, se utiliza un compuesto seleccionado del grupo que consiste en selenometionina, selenito de sodio, selenato de sodio y levadura de selenio como fuente fisiologicamente aceptable de selenio.
Preferentemente, la cantidad en peso de dicha fuente fisiologicamente aceptable de selenio en la composicion segun la presente invencion es adecuada para proporcionar una cantidad de selenio entre el 0,0001% y el 2% con respecto al peso total de honokiol y acido alfa-lipoico. Mas preferentemente, la cantidad en peso de dicha fuente fisiologicamente aceptable de selenio en la composicion segun la presente invencion es adecuada para proporcionar una cantidad de selenio entre el 0,0001% y el 0,1% con respecto al peso total de honokiol y acido alfa-lipoico.
La composicion segun la presente invencion comprende tambien, preferentemente, al menos un componente seleccionado del grupo formado por vitamina C, vitamina E y vitaminas del grupo B, por ejemplo vitaminas B1, B2, B5, B6 y B12.
La composicion segun la presente invencion puede formularse en cualquier forma adecuada para la administracion oral. En particular, en un aspecto, la presente invencion se refiere a una formulacion dietetica o farmaceutica para la administracion oral, que comprende una composicion tal como se ha definido anteriormente, en forma de una pildora, comprimido, capsula, comprimido masticable, goma de mascar, pastillas, polvo para suspension oral, polvo granulado para su reconstitucion o polvo o bucal, suspension oral, jarabe.
La composicion segun la presente invencion puede comprender tambien excipientes, fragancias y otras sustancias aptas para su uso alimentario segun el tipo de formulacion farmaceutica deseada. Los excipientes adecuados para la produccion de comprimidos o capsulas son, por ejemplo, patata, trigo o almidon de maiz, almidon parcialmente
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pregelatinizado, celulosa microcristalina, fosfato de calcio dibasico, carbonato de calcio, polioles tales como manitol y sorbitol, maltodextrina, lactosa, sflice coloidal, dioxido de silicio altamente disperso, behenato de glicerilo, propilenglicol, polivinilpirrolidona, polivinilpirrolidona reticulada, esteres y eteres de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa), croscarmelosa de sodio, alginatos, carragenanos, estearato de magnesio, estearilfumarato de sodio, dioxido de titanio, gelatina, aceites vegetales tales como aceite de soja o de girasol, oleato de poliglicerol, glicerol, trigliceridos de acidos grasos, lecitina.
Preferentemente, la formulacion segun la presente invencion esta en forma de comprimidos o capsulas adecuadas para la administracion diaria de una cantidad de acido alfa-lipoico desde 200 mg a 1.300 mg, y de una cantidad de honokiol desde 2,5 mg a 150 mg.
Mas preferentemente, la formulacion segun la presente invencion esta en forma de comprimidos o capsulas adecuados para la administracion diaria de una cantidad de 580 mg a 620 mg de acido alfa-lipoico y una cantidad de 45 mg a 60 mg de honokiol, o adecuados para la administracion diaria de una cantidad de 280 mg a 320 mg de acido alfa-lipoico y de 20 mg a 30 mg de honokiol.
Incluso mas preferentemente, la formulacion segun la presente invencion esta en forma de comprimidos o capsulas adecuados para la administracion diaria de una cantidad de 600 mg de acido alfa-lipoico y de una cantidad de 54 mg de honokiol, o adecuados para la administracion diaria de una cantidad de 300 mg de acido alfa-lipoico y de 27 mg de honokiol.
Con la expresion "adecuado/a para la administracion diaria de", en la presente descripcion y en las reivindicaciones se entiende que cada capsula o comprimido contiene las cantidades totales de los ingredientes activos especfficos o fracciones de las mismas cantidades de modo que se permite la administracion de la cantidad global mediante mas capsulas o comprimidos. Por ejemplo, las capsulas o comprimidos que contienen aproximadamente 300 mg de acido alfa-lipoico y 15 mg de honokiol se consideran adecuados para la administracion diaria de aproximadamente 600 mg de acido alfa-lipoico y 30 mg de honokiol.
El acido gamma linolenico o una sal o complejo del mismo estan contenidos en la formulacion segun la presente invencion en cantidades que oscilan entre 10 mg y 300 mg.
Una formulacion preferente segun la presente invencion es adecuada para la administracion diaria de una cantidad de 580 mg a 620 mg de acido alfa-lipoico, una cantidad de 45 mg a 60 mg de honokiol y una cantidad de 125 mg a 140 mg de acido gamma-linolenico, y esta en la forma de capsulas blandas de gelatina. Otra formulacion preferente segun la presente invencion, en forma de capsulas blandas de gelatina, es adecuada para la administracion diaria de una cantidad de 280 mg a 320 mg de acido alfa-lipoico, de una cantidad de 20 mg a 30 mg de honokiol y una cantidad de 60 mg a 70 mg de acido gamma-linolenico.
La fuente fisiologicamente aceptable de selenio ya descrita esta contenida en la formulacion segun la presente invencion en una cantidad tal como para proporcionar una cantidad de selenio entre 1 pg y 90 pg.
La vitamina C esta preferentemente incluida en la formulacion segun la presente invencion en una cantidad comprendida entre 20 mg y 1000 mg.
La vitamina E esta preferentemente incluida en la formulacion segun la presente invencion en una cantidad entre 1 mg y 100 mg.
La vitamina B1 esta preferentemente incluida en la formulacion segun la presente invencion en una cantidad entre 1 mg y 5 mg.
La vitamina B2 esta preferentemente incluida en la formulacion segun la presente invencion en una cantidad entre 1 mg y 5 mg.
La vitamina B5 esta preferentemente incluida en la formulacion segun la presente invencion en una cantidad entre 1 mg y 20 mg.
La vitamina B6 esta preferentemente incluida en la formulacion segun la presente invencion en una cantidad entre 1 mg y 8 mg.
La vitamina B12 esta preferentemente incluida en la formulacion segun la presente invencion en una cantidad que varfa entre 0,001 mg y 0,020 mg.
Una formulacion preferente segun la presente invencion comprende aproximadamente 600 mg de acido alfa-lipoico, aproximadamente 54 mg de honokiol, aproximadamente 140 mg de acido gamma-linolenico y aproximadamente 0,110 mg de selenito de sodio.
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Otra formulacion preferente segun la presente invencion comprende aproximadamente 300 mg de acido alfa-lipoico, aproximadamente 27 mg de honokiol, y aproximadamente 66 mg de acido gamma-linolenico y aproximadamente 0,055 mg de selenito de sodio.
La tecnica de la preparacion de la composicion segun la presente invencion se selecciona dependiendo del tipo de administracion y otras consideraciones practicas.
Para la preparacion de las formulaciones segun la presente invencion se puede utilizar cualquier tecnica conocida por los expertos en la tecnica para la produccion de comprimidos con un ingrediente activo de bajo punto de fusion, por ejemplo compresion directa despues de la mezcla de polvos, compresion en humedo o en seco despues de la granulacion (por ejemplo, en lecho fluido), la compresion de granulos o pelets. La produccion de capsulas puede llevarse a cabo, por ejemplo, llenando armazones preformados (cuerpo) con polvos, granulos, pequenos comprimidos o pelets y su posterior cierre mediante la aplicacion de una cabeza; mediante la formacion, posiblemente, de laminas coloreadas de gelatina, en las que se incorpora un plastificante adecuado y su carga simultanea con liquidos (por ejemplo, metodo de Sherer) o solidos (por ejemplo, de metodo Accogel); mediante la adicion a la gelatina de gotas de plastificante y, posiblemente, los principios activos, en soluciones oleosas frias (por ejemplo, metodo de goteo).
Las ventajas de las composiciones y formulaciones segun la presente invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de los siguientes ejemplos, con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
- La figura 1a muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata tras 7 dias en EtOH al 0,5%;
- La figura 1b muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata tras 7 dias en EtOH al 0,5% al que se han anadido 40 ng ml-1 de bFGF;
- La figura 1c muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata despues de 7 dias en EtOH al 0,5% al que se ha anadido una solucion 10 pM de acido alfa-lipoico al 99,7% y honokiol al 0,3%;
- La figura 1d muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata despues de 7 dias en EtOH al 0,5% al que se ha anadido una solucion 10 pM de acido alfa-lipoico al 95,5% y honokiol al 4,5%;
- La figura 1e muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata despues de 7 dias en EtOH al 0,5% al que se ha anadido una solucion 10 pM de acido alfa-lipoico al 91% y honokiol al 9%;
- La figura 1f muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata despues de 7 dias en EtOH al 0,5% al que se ha anadido una solucion 10 pM de acido alfa-lipoico al 46% y honokiol al 54%;
- La figura 1d muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata despues de 7 dias en EtOH al 0,5% al que se ha anadido una solucion 10 pM de acido alfa-lipoico solo;
- La figura 1 h muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata despues de 7 dias en EtOH al 0,5% al que se ha anadido una solucion 10 pM de honokiol solo;
- La figura 2a muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata tras 4 dias en EtOH al 0,5%;
- La figura 2b muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata despues de 4 dias en EtOH al 0,5% al que se ha anadido una solucion 10 pM de acido alfa-lipoico al 99,7% y honokiol al 0,3%;
- La figura 2c muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata despues de 4 dias en EtOH al 0,5% al que se ha anadido una solucion 10 pM de acido alfa-lipoico al 91% y honokiol al 9%;
- La figura 2d muestra una fotografia de un cultivo de celulas primarias de neuronas corticales de rata despues de 4 dias en EtOH al 0,5% al que se ha anadido una solucion 10 pM de acido alfa-lipoico al 46% y honokiol al 54%.
Materiales y metodos
La pureza de los compuestos utilizados se verifico mediante cromatografia liquida de alto rendimiento (HPLC, pico simple), mediante resonancia magnetica nuclear (1H) y (13C) y por espectrometria de masas de alta resolucion.
El medio de cultivo fue medio de cultivo modificado de Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS) y suplemento B27 y se obtuvieron de la firma Gibco BRL (NY, EE.UU.). Los reactivos PD98059 [2-(2-amino-3-metoxifenil)-4H-1- benzopiran-4-ona], LY294002 [2-(4-morfolinil)-8-fenil-1 (4H) benzopiran-4-ona] y KN93 [sal de fosfato de N-[2-[N-(4- clorocinnamil)-N-metilaminometil]fenil]-N-(2-hidroxietil)-4-metoxibencenosulfonamida] se adquirieron de la firma Sigma (MO, EE.UU.). Los factores de crecimiento de fibroblastos humanos recombinantes (bFGF) fueron suministrados por Upstate Biotechnology Inc. (Nueva York, EE.UU.). Todos los demas reactivos utilizados son los reactivos de mayor pureza disponibles en el mercado.
EJEMPLO 1 - Caracteristicas morfoloaicas
Se prepararon ocho cultivos de celulas primarias tal como se da a conocer en Abe K y otros, "Effects of recombinant
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human basic fibroblast growth factor and its modified protein CS23 on survival of primary cultured neurons from various regions of fetal rat brain", Jpn J Pharmacol 1990, 53 (2): 221-7. Todas las operaciones se llevaron a cabo en condiciones esteriles.
Las celulas neuronales se separaron de los hemisferios cerebrales de fetos de rata de 18 dias (Japan SLC, Inc.) y se suspendieron en FBS al 10%/MEM, despues se sembraron a razon de 9.000 celulas cm-2 en placas con poli-L- lisina.
Despues de 24 horas, el medio de cultivo se reemplazo con un medio sin suero, especifico para el crecimiento de las neuronas (medio neurobasal) suplementado con B27.
A continuacion, se utilizo un primer cultivo (A) como cultivo de control.
A un segundo cultivo (B) se anadieron 40 ng ml-1 de bFGF.
A un tercer cultivo (C) se anadio 99,7% en peso de acido alfa-lipoico y 0,3% en peso de honokiol a la concentracion global de 10 pM.
A un cuarto cultivo (D) se anadio 95,5% en peso de acido alfa-lipoico y 4,5% en peso de honokiol a la concentracion global de 10 pM.
A un quinto cultivo (E) se anadio 91% en peso de acido alfa-lipoico y 9% en peso de honokiol a la concentracion global de 10 pM.
A un sexto cultivo (F) se anadio 46% en peso de acido alfa-lipoico y 54% en peso de honokiol a la concentracion global de 10 pM.
A un septimo cultivo (G) se anadio solo acido alfa-lipoico a la concentracion global de 10 pM.
A un octavo de cultivo (H) se anadio solo honokiol a la concentracion global de 10 pM.
Despues de 6 dias de incubacion, las celulas de los ocho cultivos se fijaron con formaldehido al 4%.
A continuacion, se evaluaron los ocho cultivos en cuanto a la longitud de las neuritas a nivel microscopico. Las neuronas fueron sometidas a tincion inmunohistoquimica para detectar la proteina 2 asociada a los microtubulos (MAP2) segun el metodo histoquimico para la longitud de las neuritas, tal como se da a conocer en Fukuyama Y y otros, "Neurotrophic activity of honokiol on the cultures of fetal rat cortical neurons" Bioorg. Med Chem. Lett 12, 1163-66 (2002). La longitud de la neurita mas extensa de todo el cuerpo celular se midio y se calculo utilizando los programas de software Lumina Vision y Mac-SCOPE, segun el metodo mencionado anteriormente descrito en Y. Fukuyama y otros, (2002). Los analisis morfometricos se realizaron mediante la medicion de la longitud de la neurita mas larga de cada neurona utilizando el software Lumina Vision y Mac-Scope (Yoshiyasu Fukuyama y otros, 2002).
Los resultados se muestran en la tabla 1, en la que p indica la significacion estadistica y ns significa "no significativo”.
Tabla 1
Cultivo
Relacion ALA/honokiol Incremento de la longitud promedio de las neuritas (pm) Incremento respecto al control (cultivo A)
A
- 280 1
B
- 295 (p=ns) 1,05
C
ALA (99,7%) honokiol (0,3%) 450 (p= ns) 1,61
D
ALA (95,5%) honokiol (4,5%) 585,4 (p < 0,001) 2,09
E
ALA (91%) honokiol (9%) 630,7 (p < 0,001) 2,25
F
ALA (46%) honokiol (54%) 289 (p= ns) 1,03
G
ALA (100%) 285 (p=ns) 1,01
H
honokiol (100%) 287 (p=ns) 1,02
La longitud de las neuritas en los cultivos tratados con las composiciones analizadas segun la presente invencion, con una concentracion de honokiol entre el 4,5% y el 9%, relleno estas significativamente aumentada (p <0,001), mientras que los cultivos tratados con una composicion que contenia acido alfa-lipoico al 99,7% y honokiol al 0,3%
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no mostraron un aumento estadisticamente significativo de la longitud de las neuritas. Se descubrio que la composicion que comprende 95,5% en peso de acido alfa-lipoico peso y 4,5% en peso de honokiol, y la que comprendia 91% en peso de acido alfa-lipoico y 9% en peso de honokiol era eficaz en la estimulacion significativa de la extension considerable de las neuritas en comparacion con el control (cultivo A) y con el cultivo suplementado con factores de crecimiento (cultivo B) y especialmente tambien con respecto al cultivo al que anadio una composicion que comprendia 99,7% en peso de acido alfa-lipoico peso y 0,3% en peso de honokiol (cultivo C). Cabe senalar que se descubrio que el efecto de la composicion segun la presente invencion, tanto en las proporciones de 95,5% de acido alfa-lipoico como de 4,5% honokiol, y de 91% de acido alfa-lipoico y 9% de honokiol, era mas significativo que el obtenido con el factor de crecimiento bFGF. La composicion que comprendia 46% en peso de acido alfa-lipoico y 54% en peso de honokiol inhibio el crecimiento de las neuritas en el cultivo de F.
Las composiciones que comprendian acido alfa-lipoico solo u honokiol solo estimularon el crecimiento de las neuritas en una manera insignificante. El resultado es un valor no significativamente diferente del de la composicion de control.
La figura 1 tambien muestra que, despues de 7 dias de cultivo celular, en los cultivos de C, D y E (figuras 1c, 1d y 1e), las neuronas mostraron neuritas extendidas que contenian somas neuronales mas prominentes y oscuros en comparacion con el cultivo A de control (figura 1a), y eran mejores, sobre todo en cuanto a los cultivos de D y E (figura 1d y 1e), con respecto a las culturas B (figura 1b) que contenia, respectivamente, 40 ng ml-1 de bFGF y cultivos de acido alfa-lipoico individual (figura 1d) u honokiol (figura 1h).
Los resultados del ensayo muestran que las composiciones segun la presente invencion tienen un efecto indudable e impredecible sobre la diferenciacion de las neuronas corticales.
EJEMPLO 2- Evaluacion de la supervivencia neuronal
Se prepararon cuatro cultivos de celulas primarias tal como se da a conocer en Abe K y otros, "Effects of recombinant human basic fibroblast growth factor and its modified protein CS23 on survival of primary cultured neurons from various regions of fetal rat brain", Jpn J Pharmacol 1990, 53 (2): 221-7. Todas las operaciones se llevaron a cabo en condiciones esteriles. Las celulas neuronales se separaron de los hemisferios cerebrales de fetos de rata de 18 dias (Japan SLC, Inc.) y se suspendieron en FBS al 10%/MEM, a continuacion se sembraron a razon de 20.000 celulas cm-2 en placas con poli-L-lisina.
Despues de 24 horas, el medio de cultivo se reemplazo con un medio sin suero, especifico para el crecimiento de las neuronas (medio neurobasal) suplementado con B27.
El procedimiento de los cultivos celulares fue esencialmente el mismo que el implementado en el ejemplo con NBM/B27 excepto que, como medio de cultivo sin suero, se utilizo DMEM suplementado con N2 (Cestelli A y otros, "Formulation of a novel synthetic medium for selectively culturing rat CNS neurons". Dev Brain Res 1985, 22,219); y tambien que las placas tenian una densidad celular igual a 2 x 105 cm-2.
A continuacion, se utilizo un cultivo (I) como cultivo de control.
A un cultivo (L) se anadio 99,7% en peso de acido alfa-lipoico y 0,3% en peso de honokiol a la concentracion de 10 pM.
A un cultivo (M) se anadio 91% en peso de acido alfa-lipoico y 9% en peso de honokiol a la concentracion de 10 pM.
A un cultivo (N) se anadio 46% en peso de acido alfa-lipoico y 54% en peso de honokiol a la concentracion de 10 pM.
Despues de 3 dias de incubacion, las celulas de los cuatro cultivos se fijaron con formaldehido al 4%.
La supervivencia neuronal se evaluo mediante el metodo de WST-8 H Tominaga y otros, "A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay", Anal Commun 1999, 36,47. Este metodo utiliza una sal de 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4—disolfofenil)—2H tetrazolio como indicador cromogeno para evaluar la viabilidad de las celulas WST-8 y produce resultados sobre la viabilidad celular que estan en linea con los obtenidos respectivamente con el metodo MTT utilizando bromuro de 3—(4,5—dimetil—2—tiazolil)—2,5—difenil—2H tetrazolio, y con el metodo de captacion de timidina tritiada.
Los resultados se muestran tanto en la tabla 2, en la que los valores se expresan como el promedio, como en la figura 2. En la tabla 2, p indica significacion estadistica y ns significa "no significativo”.
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Tabla 2
Cultivo
% de absorbancia a 450 nm con respecto al control (cultivo I)
I
100,0
L
106,0 (p= ns)
M
143,1 (p < 0,001)
N
29,7 (p < 0,001)
El cultivo M tiene valores que son significativamente mas altos que el control I.
El cultivo I de referenda, en ausencia de principios activos, determino la supervivencia de un pequeno numero de neuronas. Por el contrario, en el cultivo M, la presencia de las composiciones segun la presente invencion a la concentracion de 10 pM, mostro una alta capacidad del crecimiento y supervivencia de las neuronas.
EJEMPLO 3
Se prepararon cuatro cultivos de celulas primarias tal como se da a conocer en el ejemplo 2 (como en Abe K y otros, "Effects of recombinant human basic fibroblast growth factor and its modified protein CS23 on survival of primary cultured neurons from various regions of fetal rat brain.", Jpn. J. Pharmacol. 1990; 53 (2): 221-7).
A continuacion, se utilizo un cultivo (O) como cultivo de control.
A un cultivo (P) se anadio 91% en peso de acido alfa-lipoico y 9% en peso de honokiol a la concentracion global de 10 pM.
A un cultivo (Q) se anadio 91% en peso de acido alfa-lipoico y 9% en peso de honokiol a la concentracion de 10 pM y 0,003 pM de selenio.
A un cultivo (R) se anadio 91% en peso de acido alfa-lipoico y 9% en peso de honokiol a la concentracion de 10 pM y 0,24 pM de acido gamma linolenico.
Despues de 3 dias de incubacion, las celulas de los cuatro cultivos se fijaron con formaldehido al 4%.
La supervivencia de las neuronas se evaluo mediante el ensayo de reduccion de WST-8 (Tominaga y otros, 1999). Los resultados se muestran en la tabla 3 en la que los valores se expresan como promedios. Adicionalmente, p denota significacion estadistica.
Tabla 3
Cultivo
% de absorbancia a 450 nm con respecto al control (cultivo O)
O
100,0
P
143,1 (p < 0,001)
Q
178,9 (p < 0,001)
R
176,5 (p < 0,001)
Los resultados presentados en la tabla 3 muestran que, sorprendentemente, las composiciones segun realizaciones preferentes de la presente invencion, que comprenden selenio y/o acido gamma-linolenico son particularmente eficaces en la mejora de la supervivencia de los cultivos neuronales. En particular, las composiciones utilizadas en los cultivos de Q y R son significativamente mas eficaces que los utilizados para el cultivo de referencia O y que los utilizados en el cultivo de P.

Claims (13)

  1. 5
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    REIVINDICACIONES
    1. Composicion que comprende acido alfa-lipoico, o una sal o complejo del mismo, y honokiol, caracterizada porque la cantidad en peso de dicho honokiol es de entre el 1% y el 30% con respecto al peso total del honokiol y del acido alfa-lipoico.
  2. 2. Composicion, segun la reivindicacion anterior, caracterizada porque la cantidad en peso de dicho honokiol se encuentra entre el 2% y el 15% con respecto al peso total del honokiol y el acido alfa-lipoico.
  3. 3. Composicion, segun la reivindicacion anterior, caracterizada porque la cantidad en peso de dicho honokiol se encuentra entre el 3% y el 10% con respecto al peso total del honokiol y el acido alfa-lipoico.
  4. 4. Composicion, segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende acido gamma- linolenico o una sal o complejo del mismo.
  5. 5. Composicion, segun la reivindicacion anterior, caracterizada porque la cantidad de dicho acido gamma-linolenico es de entre el 2% y el 30% con respecto al peso total del honokiol y el acido alfa-lipoico.
  6. 6. Composicion, segun la reivindicacion 3, caracterizada porque comprende una fuente fisiologicamente aceptable de selenio.
  7. 7. Composicion, segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende, como minimo, un componente seleccionado del grupo que consiste en vitamina C, vitamina E, vitaminas B.
  8. 8. Composicion, segun una de las reivindicaciones anteriores, para su utilizacion en el tratamiento de neuropatias perifericas.
  9. 9. Formulacion dietetica o farmaceutica para administracion oral, que comprende una composicion segun una de las reivindicaciones anteriores.
  10. 10. Formulacion, segun la reivindicacion 9, en forma de comprimidos o capsulas adecuados para la administracion diaria de una cantidad de 200 a 1.300 mg de acido alfa-lipoico y de 2,5 a 150 mg de honokiol.
  11. 11. Formulacion, segun la reivindicacion 10, en forma de comprimidos o capsulas adecuados para la administracion diaria de una cantidad de 580 a 620 mg de acido alfa-lipoico y de 45 a 60 mg de honokiol, o adecuados para la administracion diaria de una cantidad de 280 a 320 mg de acido alfa-lipoico y de 20 a 30 mg de honokiol.
  12. 12. Formulacion, segun la reivindicacion 10, en forma de capsulas de gelatina blanda, adecuada para la administracion diaria de una cantidad de 200 a 1.300 mg de acido alfa-lipoico, de 2,5 a 150 mg de honokiol y de 10 a 300 mg de acido gamma-linolenico o una sal o complejo del mismo.
  13. 13. Formulacion, segun la reivindicacion 11, en forma de capsulas de gelatina blandas, adecuada para la administracion diaria de una cantidad de 580 a 620 mg de acido alfa-lipoico, de una cantidad de 45 a 60 mg de honokiol y de 125 a 140 mg de acido gamma-linolenico o para la administracion diaria de una cantidad de 280 a 320 mg de acido alfa-lipoico, de una cantidad de 20 a 30 mg de honokiol y de 60 a 70 mg de acido gamma-linolenico.
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