ES2578081T5 - Composiciones bacterianas para profilaxis y tratamiento de enfermedades degenerativas - Google Patents

Composiciones bacterianas para profilaxis y tratamiento de enfermedades degenerativas Download PDF

Info

Publication number
ES2578081T5
ES2578081T5 ES10769192T ES10769192T ES2578081T5 ES 2578081 T5 ES2578081 T5 ES 2578081T5 ES 10769192 T ES10769192 T ES 10769192T ES 10769192 T ES10769192 T ES 10769192T ES 2578081 T5 ES2578081 T5 ES 2578081T5
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
alginate
lactobacillus reuteri
optionally
oral composition
bsh
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10769192T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2578081T3 (es
Inventor
Satya Prakash
Mitchell Jones
Christopher Martoni
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
UAS Laboratories LLC
Original Assignee
UAS Laboratories LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43031618&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2578081(T5) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by UAS Laboratories LLC filed Critical UAS Laboratories LLC
Publication of ES2578081T3 publication Critical patent/ES2578081T3/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2578081T5 publication Critical patent/ES2578081T5/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1664—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5036—Polysaccharides, e.g. gums, alginate; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C2220/00—Biochemical treatment
    • A23C2220/20—Treatment with microorganisms
    • A23C2220/204—Use of bacteria which are encapsulated, entrapped or immobilised; Fermentation with these bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/173—Reuteri
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones bacterianas para profilaxis y tratamiento de enfermedades degenerativas
CAMPO
La presente descripción se refiere a una composición oral mejorada de una bacteria con alta actividad bsh, a un elemento aislado o sobrenadante de la misma y a los procesos para preparar la composición mejorada. La presente descripción también se refiere a los métodos y usos de la composición oral mejorada para reducir el colesterol en suero, los lípidos en suero, la grasa corporal o el índice aterogénico para la profilaxis y el tratamiento de la aterosclerosis, enfermedades cardiovasculares o cerebrovasculares.
ANTECEDENTES
Hipercolesterolemia y Enfermedad Arterial Coronaria
La enfermedad arterial coronaria (EAC) es la principal causa de muerte, la forma más común de enfermedad cardiaca y la causa más común de muerte súbita en el mundo occidental. Las evidencias clínicas y epidemiológicas han establecido una conexión clara entre un nivel de colesterol en suero elevado y la EAC. En poblaciones aparentemente sanas, existe una relación exponencial entre el nivel de colesterol en suero y el riesgo coronario. En edades medianas, el riesgo de EAC aumenta de 2 a 3% por cada 1% de incremento del nivel de colesterol.
Se estima que 107 millones de estadounidenses adultos tienen niveles de colesterol en suero total de 5,18 mmol/L (200 mg/dL) y superiores. De éstos, aproximadamente 37 millones presentan niveles de 6,22 mmol/L (240 mg/dL) o por encima. En adultos, niveles de colesterol total de 6,22 mmol/L o superiores se consideran un riesgo elevado de eventos de tipo cardiovascular, mientras que niveles entre 5,18 y 6,22 mmol/L se consideran un riesgo alto en la frontera. Según las recomendaciones del “National Cholesterol Education Program” (NCEP) el principal objetivo de cualquier terapia es la reducción de los niveles de colesterol LDL (Third Report of the NCEP Expert Panel, 2002). En la actualidad nuevas guías consideran otros factores de riesgo tales como la edad, el historial familiar, el tabaquismo, la hipertensión, un HDL bajo y la diabetes mellitus, para estimar los niveles de colesterol umbral que requieren intervención. Los objetivos de LDL en la prevención primaria dependen por tanto de un riesgo absoluto del paciente de padecer eventos relacionados con EAC a corto plazo o a largo plazo. Actualmente, según las recomendaciones recientemente actualizadas de NECP, otros 36 millones adicionales de ciudadanos estadounidenses deberían ser tratados por colesterol elevado. Actualmente, menos de la mitad de los pacientes que se clasifican para tratamiento de modificación de lípidos están recibiéndolo, y solo un tercio de los pacientes tratados están alcanzando su objetivo de colesterol LDL.
Patogénesis de la Aterosclerosis
La participación de nivel elevado de colesterol LDL en aterosclerosis y EAC está bien documentada. La aterosclerosis se inicia por la retención de lipoproteínas que contienen apolipoproteína B (p.ej., el colesterol LDL) en la pared arterial. Con el tiempo, las lipoproteínas retenidas en la pared arterial se ven modificadas (es decir, agregadas y oxidadas) y producen una cascada de respuestas biológicas que evolucionan en una respuesta inflamatoria maladaptativa (Tabas et al. 2007). En particular, los monocitos entran en el subendotelio, se diferencian en macrófagos e ingieren las lipoproteínas modificadas retenidas para convertirse en células espumosas cargadas de colesterol. Eventualmente, células inflamatorias entran en las lesiones y ayudan a contribuir a la mencionada respuesta inflamatoria maladaptativa, un proceso acelerado por la retención amplificada de lipoproteínas en lesiones establecidas. Un proceso mediado por citocinas y factores de crecimiento hace que las células de músculo liso migren y formen un tapón fibroso colagenoso (placa aterosclerótica madura), lo más probablemente en la forma de una respuesta de tipo cicatriz para expulsar la lesión de la pared (Tabas et al. 2007). Sin embargo, según progresa la lesión, los macrófagos mueren, dando como resultado áreas de necrosis que contienen residuos extracelulares, cristales de colesterol, proteasas y material trombótico. En ese momento, se puede producir un adelgazamiento del tapón fibroso, una erupción o erosión de placa, produciendo potencialmente eventos vasculares trombóticos agudos tales como el infarto de miocardio y la apoplejía.
Las lipoproteínas de alta densidad desempeñan una función clave en el “transporte de colesterol inverso”, una ruta mediante la cual se elimina el exceso de colesterol de las células extrahepáticas y vuelve al hígado para su excreción del cuerpo. En los tejidos periféricos, se cree que el HDL elimina el colesterol celular a través de una variedad de mecanismos que incluyen la interacción de apolipoproteínas de HDL con sitios de unión de superficie celular o receptores (Tall, 1998). La acción de la lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT) convierte el colesterol absorbido en ésteres de colesterol y a su vez puede incrementar la capacidad de absorción de HDL. Tras retornar al hígado, el colesterol puede ser metabolizado en sales biliares y ser excretado del cuerpo. El colesterol LDL y HDL son los principales factores para mantener el equilibrio de colesterol en el cuerpo, y una relación elevada de HDL a LDL se correlaciona bien con una baja incidencia de AEC en humanos.
De forma similar, niveles elevados de triglicéridos en suero constituyen un factor de riesgo para aterosclerosis y AEC. Las razones específicas para esto incluyen el aumento de la producción de quilomicrón aterogénico y remanentes de VLDL, la relación inversa presente entre los niveles en suero de triglicéridos y HDL, el posible incremento resultante en el nivel de LDL atribuible a receptores de LDL hepáticos reducidos remanentes, así como a la formación de LDL más denso y, por tanto, más aterogénico, y a la interacción entre los triglicéridos en suero y el sistema fibrinolítico/coagulación. Debido a las múltiples conexiones entre los niveles elevados de triglicéridos y el riesgo de enfermedad cardiovascular aterosclerótica, es importante el escrutinio para hipertrigliceridemia cuando se determina el riesgo de un paciente para enfermedad cardiovascular aterosclerótica.
Respuestas Inmunes en Aterosclerosis
Se cree que la patogénesis de la aterosclerosis incluye dislipidemia, disfunción de endotelio vascular y un proceso inflamatorio crónico. Se ha demostrado que en la señalización intercelular de la aterosclerosis hay implicados varios mediadores, que incluyen moléculas pequeñas tales como óxido nítrico, mediadores de lípidos tales como eicosanoides y esteroles y citocinas. La inflamación está mediada por citocinas, glico-proteínas implicadas en la señalización célula a célula, que son producidas por macrófagos y células dendríticas en el epitelio en respuesta a un estímulo corporal antigénico o externo. La respuesta inmune está implicada en la formación de rasgos grasos, cuando el endotelio es activado y expresa quimiocinas y moléculas de adhesión que conducen al reclutamiento de monocitos/linfocitos y la infiltración en el subendotelio. También actúa como el punto de inicio de eventos vasculares clínicos adversos, cuando las células activadas dentro de la placa secretan proteasas de matriz que degradan proteínas de matriz extracelular y debilitan el tapón fibroso, conduciendo a la ruptura y la formación de trombos. Recientemente, se han relacionado los receptores de tipo-peaje (TLR, del inglés “toll-like receptors”) de la superficie del epitelio gastrointestinal con la inducción de una respuesta inflamatoria, ayudando a iniciar la señal de inicio para la producción de citocinas pro-inflamatorias (Tobias y Curtiss, 2007).
Se pone especial énfasis en la contribución de citocinas pro- y anti-inflamatorias para la inmunidad patogénica (innata y adaptativa) y reguladora en el contexto de la aterosclerosis. Las citocinas pueden diferenciarse entre las que tienen un modo de acción esencialmente pro-inflamatorio, que incluyen el factor de necrosis tumoral (TNF-alfa), la interleucina-12, la IL-18 y el interferón gamma, y las que tienen un modo de acción anti-inflamatorio, que incluyen IL-4, IL-10, IL-13 y el antagonista de receptor de IL-1 endógeno IL-1 ra. En respuesta al entorno local de las citocinas, las células CD4+ se diferencian en el linaje Th1 (pro-inflamatorio) o Th2 (anti-inflamatorio). Entre los principales inductores de las células Th1 y Th2 están la IL-12 y la IL-10, respectivamente. Las citocinas implicadas en el proceso Th1 incluyen la IL-2, el IFN-gamma y el TNF, mientras que las implicadas en el proceso Th2 incluyen IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. Se han identificado más de 30 miembros principales de la familia de las interleucinas, la mayoría de los cuales desempeñan una función en la aterogénesis. Específicamente, han sido atribuidas a propiedades principalmente anti-aterogénicas (IL-1 ra, IL-9, IL-10, IL-11) y pro-aterogénicas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-18). La modulación de estas interleucinas representa la estrategia más fácilmente aplicable a la inmunoterapia en la aterosclerosis. Se cree que las bacterias del intestino inician una respuesta inflamatoria cuando los TLRs del epitelio reconocen estructuras microbianas no comensales y dicha señal de citocina puede traducirse en un incremento del riesgo de aterosclerosis. El corolario para esta respuesta es que la microflora comensal es requerida para mantener la homeostasis intestinal a través del reconocimiento de sus estructuras no inflamatorias por TLRs. Una investigación reciente ha demostrado que las citocinas pro-inflamatorias producidas en el intestino pueden reducirse enormemente mediante la administración de bacterias comensales (Lactobacillus acidophilus) administradas libres en salino o en leche fermentada (Urbanska et al. 2009). Esta investigación demostró que el L. acidophilus disminuyó los niveles de IL-6, IL-12, TNF-alfa e IFN-gamma cuando se administra oralmente en salino y en leche fermentada (solo se publicaron los datos de IL-6) (Prakash y Urbanska, 2007).
Además de las citocinas pro- y anti-inflamatorias, se puede decir que la proteína C-reactiva de alta sensibilidad es el marcador inflamatorio en suero más importante para el riesgo coronario. Investigaciones recientes sugieren que los pacientes con niveles basales elevados de CRP tienen un riesgo incrementado de enfermedad cardiovascular, así como de diabetes e hipertensión. Un estudio clínico de 700 enfermeras demostró que aquellas en el cuartil más alto de consumo de grasas trans presentaban niveles en sangre de proteína C-reactiva que eran un 73% más elevados que los del cuartil más bajo (Lopez-Garcia, 2005). Otros han demostrado que la CRP (del inglés “C-reactive protein”) puede exacerbar la necrosis isquémica de un modo dependiente de complemento y que la inhibición de CRP puede ser una terapia segura y efectiva para los infartos de miocardio y cerebro (Pepys et al. 2006).
Síndrome metabólico
La dislipidemia, la aterosclerosis y la inflamación crónica están conectadas a otras enfermedades degenerativas a través del síndrome metabólico. El síndrome metabólico se caracteriza por un grupo de factores de riesgo metabólico en un individuo e incrementa el riesgo del individuo de desarrollar aterosclerosis. Esta agrupación de signos y síntomas afecta a una de cada cinco personas, y la prevalencia aumenta con la edad. Algunos estudios estiman que la prevalencia en los EE.UU. es de hasta el 25% de la población (Ford et al., 2002). Los síntomas y características incluyen: hiperglucemia en ayunas - diabetes mellitus de tipo 2 o glucosa en ayunas alterada, tolerancia a la glucosa alterada, o resistencia a la insulina; tensión sanguínea elevada; obesidad central (también conocida como adiposidad visceral, de patrón masculino o en forma de manzana), sobrepeso con depósitos grasos principalmente alrededor de la cintura.
Enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD)
La enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD, del inglés “non-alcoholic fatty liver disease”) es considerada una manifestación hepática del síndrome metabólico. La NAFLD se define como una inflamación grasa del hígado cuando ésta no es debida a un consumo excesivo de alcohol. La NAFLD está fuertemente relacionada con la obesidad, la dislipidemia, la resistencia a insulina (IR) y la diabetes mellitus de tipo II (no dependiente de insulina). La NAFLD cubre el espectro completo de los trastornos de hígado graso metabólicos, particularmente cuando la histología no está definida. La NAFLD puede manifestarse como esteatosis simple (hígado graso), en el extremo clínicamente más indolente, o puede progresar a una esteatosis con inflamación o fibrosis, en cuyo caso se denomina NASH. Sin embargo, incluso las formas estables de la NAFLD pude suponer una morbidez aún no identificada, ya que el hígado graso típicamente funciona de forma menos eficiente que el hígado no graso. La NASH probablemente representa un estadio intermedio que se caracteriza por esteatosis con inflamación lobular. Se sabe que la NAFLD afecta al 10-39% de la población global general con una incidencia media del 20% (Angulo 2002).
Existen varios factores de riesgo asociados a la NAFLD. Estos factores incluyen afecciones y enfermedades de la vida común tales como la obesidad, la hiperglucemia, la diabetes mellitus de tipo 2 y la hipertrigliceridemia. Adicionalmente, la NAFLD está fuertemente asociada a la obesidad central y a la adiposidad visceral. También se asocian factores genéticos y raciales a NAFLD/NASH. Este trastorno contribuirá de forma sustancial, por tanto, a la carga de enfermedades hepáticas crónicas en las próximas décadas.
Tratamiento y prevención de hipercolesterolemia y dislipidemia
Los métodos para reducir los niveles de colesterol en humanos implican el control de la dieta, la modificación de hábitos, y terapia de ejercicio y fármacos. El control de la dieta por sí solo es insuficiente para la mayoría de los individuos. Los estudios demuestran que una eliminación completa del colesterol en la dieta y una limitación del contenido en grasas hasta menos del diez por ciento de la ingesta calórica diaria da como resultado tan solo un cuatro por ciento de regresión de las placas ateroscleróticas tras cinco años cuando se combina con un control del estrés y ejercicio aeróbico (Ornish et al. 1990).
Se han propuesto otras opciones dietarias para reducir el nivel de colesterol LDL, que incluyen fibras solubles, esteroles y estanoles vegetales y proteína de soja. Informes recientes indican que las formas solubles de la fibra dietaria con una ingesta de 5-10 g al día pueden reducir el nivel de colesterol LDL en aproximadamente un 5% (Third Report of the NCEP Expert Panel 2002). Se han publicado pocos, o ninguno, efectos inconsistentes en relación al nivel de colesterol HDL; sin embargo, parece ser que la modulación de las rutas metabólicas del colesterol y biliar puede ser un requisito, ya que existe muchas evidencias en estudios que intentan reducir la ingesta dietaria o incrementar el catabolismo de colesterol, que dan como resultado una reducción del nivel de HDL, a menos que se usen en combinación con una medicación de reducción del nivel de colesterol que afecte a enzimas hepáticas. Además, no se ha demostrado que la fibra insoluble afecte significativamente a los niveles de colesterol en circulación. Los estudios en animales y humanos demuestran que los estanoles y esteroles vegetales reducen el nivel de colesterol total en plasma y bajan los niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL). Los datos han demostrado que los ésteres de esterol y estanol derivados de plantas en dosis de 2-3 g/día reducen los niveles de colesterol LDL en un 6-15% sin ningún cambio significativo en los niveles de triglicéridos o de colestero1HDL (Hallikainen y Uusitupa, 1999). Nuevamente, a menudo estudios que no muestran un descenso en el nivel de HDL o un descenso no estadísticamente significativo en el nivel de HDL han incluido pacientes con medicación de reducción del nivel de colesterol que alteran las rutas enzimáticas hepáticas, tales como las estatinas. Se ha demostrado que la proteína de soja incluida en una dieta baja en ácidos grasos saturados y colesterol reduce el nivel de colesterol LDL en aproximadamente un 5%, sin embargo, los requerimientos de dosis no son bien conocidos (Jenkis et al. 2000).
Las estatinas pueden reducir significativamente la síntesis de colesterol endógeno, a través de la inhibición de la HMG-CoA reductasa, y regular al alza los receptores de lipoproteína de baja densidad en el hígado, conduciendo a reducciones del nivel de colesterol LDL del 20-30%. La eficacia de las estatinas ha sido evaluada intensivamente en una multitud de ensayos clínicos (Pedersen et al. 1994). Sin embargo, se ha demostrado que las estatinas exhiben efectos secundarios poco habituales pero potencialmente graves. Los más predominantes entre ellos son la miopatía, que puede evolucionar en una rhabdomiolisis que amenace la vida, y la polineuropatía (Gaist et al. 2001; Gaist et al. 2002; Omar y Wilson 2002; Staffa et al. 2002).
También se ha demostrado que la terapia de fibratos ofrece beneficios a largo plazo en pacientes de alto riesgo con bajo nivel de colesterol HDL y alto nivel de dislipidemia de triglicéridos (Goldenberg et al. 2008). Sin embargo, los fibratos también se asocian a una variedad de efectos adversos que incluyen un aumento del riesgo de cálculos biliares, miopatía y malestar de estómago (Sgro y Escousse, 1991).
La niacina ha sido usada ya desde hace algún tiempo, en dosis de 1-2 gramos al día, para reducir los niveles de triglicéridos y colesterol LDL. Cabe destacar que se ha demostrado que la vitamina B3 aumenta el colestero1HDL a estos niveles y se ha prescrito a pacientes con un bajo nivel de colestero1HDL que están en riesgo de padecer un evento cardiaco. Desafortunadamente, con el uso regular aparecen efectos secundarios incómodos y graves que incluyen sofocos faciales y de cuerpo completo.
Los secuestrantes de ácido biliar (BAS) han sido usados clínicamente desde los años 1960 para reducir el nivel de colesterol LDL. Los secuestrantes de ácido biliar tienen una baja tasa de aceptación debido, en parte, a los efectos secundarios gastrointestinales (Probstfiled y Rifkind, 1991).
Probióticos
Se ha publicado que los probióticos están asociados a una variedad de beneficios para la salud clínicamente relevantes. Se han estudiado particularmente bien varias cepas de bacterias de ácido láctico en humanos y animales. Ensayos clínicos controlados con placebo han demostrado que L. reuteri, L. rhamnosus GG, L. casie y S. boulardii son eficaces para reducir la duración de la diarrea aguda (Huang et al. 2002). L. rhamnosus GG administrado a niños redujo el riesgo de diarrea nosocomial y de gastroenteritis de rotavirus (Szajewska et al. 2001). Los estudios de Aso et al. revelaron que el L. casei Shirota aumenta el porcentaje de células T colaboradoras y de células NK en pacientes adultos de cáncer colorrectal, y que tiene un efecto protector sobre la recurrencia de cáncer de vejiga superficial (Aso et al., 1995). Adicionalmente, se ha demostrado que cepas seleccionadas de lactobacilos suprimen de forma significativa los tumores intestinales por mutágenos químicos (McIntosh et al. 1999). Las bacterias de ácido láctico han sido administradas para prevenir la sepsis en pacientes con pancreatitis aguda severa. Un estudio aleatorizado de Rayes et al. que implicaba pacientes de trasplante hepático reveló que las infecciones post-operatorias se veían reducidas significativamente cuando se administraban células de L. plantarum vivas en comparación con el tratamiento antibiótico estándar (Rayes et al. 2002). Como medio para prevenir la alergia, un estudio controlado aleatorizado realizado por Lodinova-Zadnikova et al. investigó el efecto de la colonización en el nacimiento con Escherichia coli no patogénica Nissle 1917 (Lodinova-Zadnikova y Sonnenborn 1997). Los sujetos inoculados con la cepa de E. coli mostraron una colonización significativamente reducida de patógenos bacterianos, así como una incidencia significativamente menor de alergias después de 10 y 20 años, con respecto a los sujetos de control. También se han usado probióticos como opciones de tratamiento para el manejo de enfermedades inflamatorias del intestino (IBD, del inglés “Inflammatory Bowel Diseases”) tales como la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa y la pouchitis.
El L. reuteri está bien establecido como uno de los miembros más extendidos de las bacterias intestinales naturales. Se ha documentado que cepas de L. reuteri específicas de hospedante confieren protección de amplio espectro frente a una selección de enfermedades asociadas a microbios y productos químicos en humanos y animales (Dobrogosz, 2005). Sin embargo, la terapia tradicional con probióticos implica la administración de bacterias con la esperanza de que algunas bacterias sobrevivan a las severas condiciones gástricas y colonicen el colon, donde las bacterias se reproducirán y vivirán indefinidamente. Muchas menos bacterias sobreviven en el duodeno, el jejuno o el íleo debido a factores tales como la acide, la respuesta inmune y la concentración de bilis. Las bacterias deben estar presentes en un duodeno o el jejuno del intestino delgado para reducir el nivel de colesterol y en particular el ácido biliar.
SUMARIO
Los inventores de la presente han determinado que las bacterias altamente activas en hidrolasa de sal biliar (bsh) proporcionan un agente mejorado para reducir el nivel de colesterol en suero, el nivel de lípidos en suero, la grasa corporal y el índice aterogénico para profilaxis y tratamiento de aterosclerosis, y enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripción proporciona una composición oral que comprende una bacteria con alta actividad bsh, un aislado o un sobrenadante de la misma; en donde la bacteria con alta actividad bsh degrada > 50 pmol de ácido glicodesoxicólico (GDCA)/gramo/hora y > 2 pmol de ácido taurodesoxicólico (TDCA)/gramo/hora cuando se mide a lo largo de 1 hora y 5 horas, respectivamente; o degrada >65 pmol GDCA/g/h y >7 pmol TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos. En una realización, la bacteria con alta actividad bsh degrada >300 pmol de GDCA/g/h y >40 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos. La bacteria con elevada actividad bsh degrada >2000 pmol de GDCA/g/h y >500 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos, en donde la elevada actividad de BSH resulta de las condiciones de fermentación que favorecen el desarrollo de la elevada actividad BSH. En otra realización adicional, la bacteria con elevada actividad bsh degrada >15000 pmol de GDCA/g/h y >2000 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos.
En una realización, la bacteria es Lactobacillus, Bifidobacteria, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus o Leuconostoc. En otra realización, la Lactobacillus es Lactobacillus reuteri, opcionalmente, Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359), Lactobacillus reuteri (NCIMB 701089), Lactobacillus reuteri (ATCC 55148), Lactobacillus reuteri (ATCC 23272), Lactobacillus reuteri (NCIMB 702655), Lactobacillus reuteri (LMG 18238), Lactobacillus reuteri (CCUG 32271), Lactobacillus reuteri (CCUG 32305), Lactobacillus reuteri (CCUG 37470), Lactobacillus reuteri (CCUG 44001) o Lactobacillus reuteri (CCUG 44144). En otra realización, la composición comprende además un vehículo.
En otra realización adicional, la concentración de bacterias es de 106 - 1012 unidades formadoras de colonia (CFU)/gramo.
Las bacterias de la presente descripción están contenidas opcionalmente en un polímero o en una microcápsula o nanocápsula.
En otra realización, la composición oral descrita en la presente memoria se cultiva en condiciones de fermentación que comprenden una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, un pH de 4-7, opcionalmente 5, y un tiempo de recolección de 12-24 horas, opcionalmente 12-16 horas. En una realización, la fuente de carbono comprende maltosa, sacarosa, dextrina, una combinación de sorbitol y glucosa o una combinación de inulina y glucosa. En otra realización adicional, la fuente de nitrógeno comprende (i) extracto de levadura y extracto de malta, extracto de levadura y extracto de vacuno, o hidrolisato de caseína y extracto de malta; y (ii) peptona o triptona.
En otra realización adicional, la composición oral descrita en la presente memoria está liofilizada con lioprotectores. En una realización, los lioprotectores comprenden una concentración final de 0,2% a 10% de maltodextrina y de 0,05% a 0,33% de extracto de levadura ó 0,05-2,5% de inulina y de 0,05 a 0,1% de extracto de levadura. En una realización, los lioprotectores comprenden una concentración final de 2-4% de maltodextrina y 0,1% de extracto de levadura, 0,3% de inulina y 0,1% de extracto de levadura, ó 0,3% de inulina.
En una realización adicional, la composición oral descrita en la presente memoria se almacena en líquido, en donde las condiciones de almacenamiento líquido comprenden una disolución conservante final que comprende 2,5-10% de medio de crecimiento, 50-99,99% de yogur u otro lácteo fermentado, 50-99,99% de sobrenadante de cultivo o 5% de MRS.
En otra realización adicional, la composición oral descrita en la presente memoria se congela súbitamente en una disolución crioprotectora final, tal como 0,2-10% de maltodextrina, opcionalmente 1-3% de maltodextrina y de 0,05 a 0,33% de extracto de levadura, opcionalmente 0,1-0,2% de extracto de levadura, de 0,05 a 2,5% de inulina, opcionalmente al menos 0,2% de inulina, trehalosa 0,5M, fructosa 0,5M, lactosa 0,5M, maltosa 0,5M ó 50-99,99%, opcionalmente 50%, de medio agotado.
En otro aspecto, la composición oral de la presente descripción comprende además un agente reductor del nivel de triglicéridos, un agente para aumentar el nivel de HDL o para limitar el descenso del nivel de HDL, un agente reductor del nivel de colesterol, un agente para preservar la actividad de bsh, un agente para modular adipocinas u hormonas de la obesidad, un agente hipoglucémico, o un agente terapéutico para reducir las citocinas pro­ inflamatorias IL-1 a/p, IL-2, IL-15, IL-3, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, IFN-gamma, TNF-alfa o para aumentar el nivel de las citocinas anti-inflamatorias IL-1 ra, IL-9, IL-10, IL-11.
En otro aspecto de la presente descripción, los inventores de la presente proporcionan métodos y usos de las composiciones orales para reducir el nivel de colesterol en suero, el nivel de lípidos en suero, la grasa corporal o el índice aterogénico, y para profilaxis y tratamiento de la aterosclerosis, y enfermedades cardiovasculares o cerebrovasculares en un animal, opcionalmente un mamífero, tal como un humano.
También se proporcionan en la presente memoria procesos para producir bacterias con elevada actividad de bsh que comprenden el cultivo de las bacterias en condiciones de fermentación; la liofilización de las bacterias con lioprotectores, el almacenamiento de las bacterias en condiciones de almacenamiento líquidas y la congelación espontánea de las bacterias con crioprotectores.
Otras características y ventajas de la presente descripción serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Cabe destacar, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican las realizaciones preferidas de la descripción, se proporcionan únicamente a modo de ilustración, ya que diversos cambios y modificaciones que caen dentro del espíritu y el alcance de la descripción serán evidentes para los especialistas en la técnica a partir de la descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Las realizaciones de la descripción se describirán ahora en relación a las figuras, en las que:
Figura 1: muestra la desconjugación de TDCA por acción de cepas libres de Lactobacillus reuteri (ATCC 53608, ATCC 53609, ATCC 55148, ATCC 55739 y nCiMB 701359) con el tiempo. El experimento se llevó a cabo por triplicado y las barras de error representan una desviación estándar respecto a la media.
Figura 2: muestra la desconjugación de GDCA por acción de cepas libres de Lactobacillus reuteri (ATCC 53608, ATCC 53609, ATCC 55148, ATCC 55739 y NCIMB 701359) con el tiempo. El experimento se llevó a cabo por triplicado y las barras de error representan una desviación estándar respecto a la media.
Figura 3: muestra la desconjugación de TDCA por acción de cepas libres de Lactobacillus reuteri y Lactobacillus fermentum con el tiempo. El experimento se llevó a cabo por triplicado y las barras de error representan una desviación estándar respecto a la media.
Figura 4: muestra la desconjugación de GDCA por acción de cepas libres de Lactobacillus reuterí (LabMet, NCIMB 701359) y Lactobacillus fermentum (ATCC 11976) con el tiempo. El experimento se llevó a cabo por triplicado y las barras de error representan una desviación estándar respecto a la media.
Figura 5: muestra la desconjugación de TDCA por acción de cepas libres de Lactobacillus reuteri (LMG 9213, NCIMB 11951, ATCC 23272, NCIMB 702656, NCIMB 701359 y NCIMB 701089) con el tiempo. El experimento se llevó a cabo por triplicado y las barras de error representan una desviación estándar respecto a la media.
Figura 6: muestra la desconjugación de GDCA por acción de cepas libres de Lactobacillus reuteri (LMG 9213, NCIMB 11951, ATCC 23272, NCIMB 702656, NCIMB 701359 y NCIMB 701089) con el tiempo. El experimento se llevó a cabo por triplicado y las barras de error representan una desviación estándar respecto a la media.
Figura 7: muestra el tamaño de la zona de precipitación de 3 Lactobacillus reuteri con actividad bsh: Lr010: Lactobacillus reuteri (LabMet), Lr052: Lactobacillus reuteri (NCIMB 701089) y Lr050: Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359).
Figura 8: muestra la desconjugación de TDCA por acción de cepas libres de Lactobacillus reuteri (ATCC 55148, ATCC 55739, NCIMB 701359, NCIMB 701089, NCIMB 702655, LMG 18238, LMG 22877, LMG 22878, LMG 22879, CCUG 32305, CCUG 37470, CCUG 44001, CCUG 44144, CCUG 47824) con el tiempo. El experimento se llevó a cabo por triplicado y las barras de error representan una desviación estándar respecto a la media.
Figura 9: muestra la desconjugación de GDCA por acción de cepas libres de Lactobacillus reuteri (ATCC 55148, ATCC 55739, NCIMB 701359, NCIMB 701089, NCIMB 702655, LMG 18238, LMG 22877, LMG 22878, LMG 22879, CCUG 32305, CCUG 37470, CCUG 44001, CCUG 44144, CCUG 47824) con el tiempo. El experimento se llevó a cabo por triplicado y las barras de error representan una desviación estándar respecto a la media.
Figura 10: muestra un conjunto representativo de microfotografías de morfología de microcápsula con diferentes condiciones lioprotectoras a una relación 7:3 de microcápsula a lioprotector para salino, trehalosa 1M, y un 10% de leche desnatada usado para la liofilización y rehidratación de Lactobacillus microencapsulados.
DESCRIPCION DETALLADA
Los inventores de la presente han demostrado que las bacterias con elevada actividad de bsh proporcionan una composición oral mejorada para reducir el nivel de colesterol en suero, el nivel de lípidos en suero, la grasa corporal y el índice aterogénico, y para la profilaxis y el tratamiento de aterosclerosis, y enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares.
Composiciones
Por consiguiente, se proporciona una composición oral para reducir el nivel de colesterol en suero, el nivel de lípidos en suero, la grasa corporal o el índice aterogénico, o para la profilaxis o el tratamiento de aterosclerosis, enfermedades cardiovasculares o cerebrovasculares, comprendiendo la composición una bacteria con actividad elevada de bsh, un elemento aislado o sobrenadante de la misma; en donde la bacteria con elevada actividad de bsh degrada >50 pmol de ácido glicodesoxicólico (GDCA)/gramo/hora y >2 pmol de ácido taurodesoxicólico (TDCA)/gramo/hora cuando se mide a lo largo de 1 hora y 5 horas, respectivamente; o degrada >65 pmol de GDCA/g/h y >7 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos. En una realización, la bacteria con elevada actividad de bsh degrada >300 pmol de GDCA/g/h y >40 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos. En otra realización, la bacteria con elevada actividad de bsh degrada >2000 pmol de GDCA/g/h y >500 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos. En otra realización adicional, la bacteria de elevada actividad de bsh degrada >15000 pmol de GDCA/g/h y >2000 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos.
En una realización, la composición comprende además un vehículo.
Bacterias con elevada actividad de bsh, tal como se usa en la presente memoria se refiere a bacterias que degradan >50 pmol de GDCA/gramo/hora y >2 pmol de TDCA/gramo/hora cuando se mide a lo largo de 1 hora y 5 horas, respectivamente; o que degradan >65 pmol de GDCA/g/h y >7 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos, opcionalmente >300 pmol de GDCA/g/h y >40 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos, o >2000 pmol de GDCA/g/h y >500 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos, o >2000 pmol de GDCA/g/h y >500 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos o >15000 pmol de GDCA/g/h y >2000 pmol de TDCA/g/h cuando se mide a lo largo de 30 minutos y se identifican fácilmente por parte de un especialista en la técnica en base a los métodos descritos en los Ejemplos. En una realización, la degradación de GDCA y TDCA se mide con HPLC. La determinación de sales biliares mediante HPLC se describe en Scalia 1988 y Jones et al.
2003.
El término “elemento aislado” tal como se usa en la presente memoria se refiere a una porción separada, aislada o fraccionada del cultivo celular o producto de fermentación que puede ser más puro o más activo que la muestra sin purificar. El término “sobrenadante”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere al líquido que queda por encima del material depositado por decantación, precipitación o centrifugación.
En una realización, las bacterias con elevada actividad de bsh son bacterias vivas. El término “bacterias vivas” tal como se usa en la presente memoria se refiere a una biomasa de bacterias metabolizadoras de nutrientes y excretoras de residuos. En una realización, las bacterias vivas son bacterias probióticas. El término “bacterias probióticas” tal como se usa en la presente memoria se refiere a microorganismos vivos que cuando son administrados en cantidades adecuadas confieren un beneficio a la salud del hospedante.
La bacteria con elevada actividad de bsh es opcionalmente Lactobacillus, Bifidobacteria, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus o Leuconostoc. En una realización, la Lactobacillus es Lactobacillus reuteri, opcionalmente, Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359), Lactobacillus reuteri (NCIMB 701089), Lactobacillus reuteri (ATCC 55148), Lactobacillus reuteri (ATCC 23272), Lactobacillus reuteri (NCIMB 702655), Lactobacillus reuteri (LMG 18238), Lactobacillus reuteri (CCUG 32271), Lactobacillus reuteri (CCUG 32305), Lactobacillus reuteri (CCUG 37470), Lactobacillus reuteri (CCUG 44001) o Lactobacillus reuteri (CCUG 44144).
En otra realización, el Lactobacillus reuteri se adhiere a las células epiteliales gastrointestinales, compite por la adhesión, o inhibe la unión de otras bacterias debido a proteínas de superficie celular.
En una re 6al 1iza 2ción, la concentración de las bacterias en las composiciones orales desc 8rita 1s 2 en la presente moria es de 10 - 10 unidades formadoras de colonia (CFU)/gramo, opcionalmente de 10 - 10 CFU/gramo. m
E e
n otra realización, la composición proporcionada en la presente memoria comprende 106-1014 CFU opcionalmente 108-1013 CFU.
El término “bsh” o “hidrolasa de sal biliar” tal como se usa en la presente memoria se refiere a una enzima capaz de hidrolizar sales biliares producidas por la bacteria.
Las bacterias con elevada actividad bsh pueden cultivarse en condiciones de fermentación que mejoren la producción de biomasa y la actividad de bsh. En una realización, las condiciones de fermentación comprenden la inoculación en un medio que comprenda fuentes de carbono y nitrógeno y que tenga un pH de 4 a 7 y un tiempo de recolección de 12 a 24 horas. En una realización particular, el pH de las condiciones de fermentación es 5. En otra realización adicional, el tiempo de recolección es de 12 a 16 horas.
En una realización, la fuente de carbono comprende maltosa, sacarosa, dextrina, una combinación de sorbitol y glucosa o una combinación de inulina y glucosa. En una realización particular, la fuente de carbono es maltosa. En una realización, las fuentes de carbono se añaden en una concentración final de 2%, por ejemplo, si se usan inulina y glucosa, de 1% de cada uno si se añaden a una concentración final de 2%.
En otra realización, la fuente de nitrógeno comprende (i) extracto de levadura y extracto de malta, extracto de levadura y extracto de vacuno, o hidrolisato de caseína y extracto de malta; y (ii) peptona o triptona. En una realización, la fuente de nitrógeno comprende además cisteína. La peptona puede ser cualquier peptona, que incluye aunque sin limitación, la peptona n° 3, peptona de pez, peptona de soja, peptona de proteosa y peptona de caseína. En una realización, la fuente de nitrógeno se añade a un total de 2,5%, por ejemplo, si se usa una fuente de peptona, levadura y extracto de malta, se añade un 1% de peptona, un 0,5% de extracto de levadura y un 1% de extracto de malta hasta una concentración final de 2,5%. En otra realización, el extracto de vacuno sustituye al extracto de malta y los sustitutos de caseína bien a la peptona o bien al extracto de levadura. En otra realización se añade de 0,01 a 0,05% de cisteína, opcionalmente 0,01%.
En una realización, las bacterias con elevada actividad bsh son bacterias libres. El término “bacterias libres” tal como se usa en la presente memoria se refiere a bacterias que no están inmovilizadas sobre un polímero o encapsuladas por microencapsulación celular artificial.
En otra realización, las bacterias con elevada actividad de bsh están contenidas o inmovilizadas en un polímero, opcionalmente un polímero natural. Los polímeros naturales incluyen, sin limitación, alginato, chitosán, agarosa, pectina, agaropectina, genipina y celulosa. En una realización, las bacterias con elevada actividad de bsh están inmovilizadas sobre una película.
En otra realización adicional, las bacterias con elevada actividad de bsh están encapsuladas. Encapsulación es un término usado para incluir los métodos de macroencapsulación, microencapsulación y nanoencapsulación. Los términos microencapsulación y nanoencapsulación se refieren a una subclase de encapsulación, donde se producen cápsulas pequeñas, micro- o nano-encapsuladas. Las técnicas de encapsulación y microencapsulación son conocidas en la técnica. Las microcápsulas son pequeños recipientes esféricos o tejidos recubiertos en el rango de 1-999 pm y nanocápsulas en el rango de 1-999 nm, mientras que las macrocápsulas son recipientes membranosos de lámina plana o fibra hueca de mayor tamaño. Las macro-, micro- y nano-cápsulas deben contener un entorno celular que sea capaz de soportar el metabolismo y la proliferación celular, ya que las células que acomodan proporcionan a la cápsula funcionalidad.
La microencapsulación o nanoencapsulación celular artificial es una técnica usada para encapsular materiales biológicamente activos en membranas poliméricas semi-permeables ultra finas especializadas (véase, p.ej., Chang and Prakash, 1997; Chang, 1964). Los métodos para preparar células artificiales han sido bien documentadas en la técnica pertinente. Las membranas celulares artificiales se seleccionan o diseñan opcionalmente para cada dispositivo terapéutico específico por parte del especialista en la técnica, porque se pueden diseñar varias membranas diferentes para una aplicación deseada. El uso de membranas diferentes permite la variación en permeabilidad, transferencia de materia, estabilidad mecánica, capacidad de tamponamiento, biocompatibilidad y otras características. Se debe mantener un equilibrio entre las propiedades físicas de las membranas de la cápsula de tal modo que soporten la supervivencia de las células atrapadas.
Se pueden preparar microcápsulas para las bacterias de la invención usando técnicas como las de la Publicación de EE.UU. n° 2007-0116671 a nombre de Prakash y Jones, que se incorporan a la presente memoria a modo de referencia.
Las propiedades de transporte de materia de una membrana son críticas ya que el caudal de entrada de moléculas, esencial para la supervivencia celular, y el caudal de salida de residuos metabólicos determina en definitiva la viabilidad de las células atrapadas. Potencialmente se puede aplicar cualquier barrera para aplicaciones enzimáticas. Ordinariamente, la permeabilidad de cápsula deseada se determina por el umbral de peso molecular (MWCO, del inglés “molecular weight cut-off”), y depende de la aplicación. El MWCO es el peso molecular máximo de una molécula que se permite pasar a través de los poros de la membrana de la cápsula (Uludag et al. (2000) Adv. Drug. Deliv. Rev. 42: 29-64). Para trasplantes, el MWCO debe ser suficientemente alto para permitir el paso de nutrientes, pero suficientemente bajo para rechazar anticuerpos y otras moléculas del sistema inmune. El rango de MWCO opcionalmente es de 3000 D a 950.000 D (Chang y Prakash, 1998). El MWCO de microcápsulas administradas oralmente debe permitir el paso de metabolitos no deseados desde el plasma hacia el interior de la microcápsula, y a continuación debe facilitar la posterior eliminación de la molécula alterada o proporcionar su almacenamiento (Uludag et al., 2000). Para las células de la presente descripción que deben administrarse oralmente, opcionalmente se usa un contenedor que permita el paso de nutrientes, pero que bloquee los anticuerpos y otras moléculas inmunes, por ejemplo una membrana semi-permeable que tenga un MWCO de 3000 D a 950.000 D (Chang y Prakash, 1998). Alternativamente, el extremo inferior del rango puede ser de aproximadamente: 2000 D, 4000 D, 5000 D ó 10.000 D, y el extremo superior del rango puede ser de aproximadamente: 900.000 D, 750.000 D ó 500.000 D.
El tipo más común de membrana usada para terapia celular es la membrana de polímero basada en alginato; sin embargo, se puede usar otras varias sustancias tales como proteínas, polihemoglobina y lípidos (Uludag et al., 2000; Prakash y Jones, 2002). Otra estrategia adicional para la composición de membrana es usar un polímero sintético biodegradable tal como polilactida, ácido poliglicólico y polianhídrido. Las membranas usadas comúnmente incluyen membranas de fibra hueca, membrana de alginato-polilisina-alginato (APA), nitrato de celulosa, poliamida, polímero acomplejado con lípidos y vesículas de lípidos. Los polímeros establecidos y prometedores para la encapsulación de células vivas y la encapsulación de enzimas incluyen alginato-polilisina-alginato (APA), alginato-polimetileno-coguanidina-alginato (A-PMCG-A), hidroximetilacrilato-metil metacrilato (HEMA-MMA), h EmA-MMA-MAA multilaminado, poliacrilonitrilo cloruro de vinilo (PAN-PVC), acrilonitrilo/metalilsulfonato sódico (AN-69), polietilen glicol/poli pentametilciclopentasiloxano/polidimetilsiloxano (PEG/PD5/PDMS), poli W,W-dimetil acrilamida (PDMAAm), encapsulados silíceos y sulfato de celulosa/alginato sódico/polimetileno-co-guanidina (CS/A/PMCG). Otros materiales que son útiles incluyen, sin limitación, acetato ftalato de celulosa, alginato de calcio y partículas de gel de k-carragenato-goma garrofín, partículas de gelano-xantano, poli(lactida-co-glicólidos), carragenano, polianhídridos de almidón, polimetacrilatos de almidón, poliaminoácidos, polímeros de recubrimiento entérico.
El diseño de una membrana, destinada a uso en terapias de células vivas orales, debe considerar varios factores primarios de tal modo que se minimice la muerte microbiana y se maximice la eficacia terapéutica. Para asegurar su eficacia, se pueden diseñar células encapsuladas artificialmente destinadas a administración oral para proteger su carga viva contra el entorno ácido del estómago y la inmunoglobulina liberada por respuesta inmune intestinal.
Una composición útil es la encapsulación de partículas de alginato cálcico con poli-L-lisina (PLL) que forman microcápsulas de alginato-poli-L-lisina-alginato (APA). En la microcápsula de membrana APA, el alginato forma el núcleo y la matriz para la célula y la PLL se une al núcleo de alginato. La unión de PLL al alginato es el resultado de los numerosos grupos alquilamino de cadena larga presentes en la PLL que se extienden desde la cadena principal de poliamida en una serie de direcciones y que interaccionan con varias moléculas de alginato, a través de interacciones electrostáticas. La reticulación resultante produce una membrana compleja estable que reduce la porosidad de la membrana de alginato y forma una barrera inmunoprotectora.
Alternativamente, para encapsulación se usan membranas de alginato/poli-L-lisina/pectina/poli-L-lisina/alginato (APPPA), alginato/poli-L-lisina/pectina/poli-L-lisina/pectina (APPPP) y alginato/poli-L-lisina/chitosán/poli-L-lisina/alginato (APCPA). Estas composiciones de membrana multicapa se comportan bien en los ensayos de estabilidad GI, proporcionando un incremento de la resistencia a disolución completa en agua, ácidos diluidos y bases, así como en presencia de agentes quelantes de iones, a la vez que permiten un control más preciso de la permeabilidad de la membrana.
Existen varios métodos disponibles para preparar células artificiales que contienen células vivas para terapia. Por ejemplo, para la preparación de la membrana clásica de alginato-polilisina-alginato (APA), las células vivas, tal como células bacterianas, son suspendidas en una matriz del polímero natural de alginato (1,5%). La suspensión viscosa de polímero-bacterias se hace pasar a través de una aguja de medida 23 usando una bomba de jeringa. A continuación se usa aire comprimido, pasado a través de una aguja coaxial de medida 16, para romper las gotitas que se forman en la punta de la aguja de medida 23. Se deja que las gotitas gelifiquen durante 15 minutos en una disolución enfriada en hielo con agitación suave de agentes químicos solidificantes, tal como CaCl2 (1,4 %). Después de la gelificación en CaCl2, las partículas son lavadas con HEPES (0,05 % en HEPES, pH 7,20), recubierto con polilisina (0,1% durante 10 minuto) y se volvió a lavar en HEPES (0,05 % en HEPES, pH 7,20). Las cápsulas resultantes son recubiertas a continuación con los productos químicos apropiados para disolver su contenido de núcleo interior. Para esta etapa, a menudo se usa un baño de citrato al 3,00 % (3,00 % en HEPES:tampón salino 1:1, pH 7,20). Las microcápsulas formadas pueden almacenarse entonces a 4°C en una disolución mínima (10% de nutriente celular hasta 90% de agua).
Por consiguiente, en una realización, las bacterias con elevada actividad de bsh son encapsuladas en microcápsulas semipermeables poliméricas (1-999 pm) o en nanocápsulas semipermeables poliméricas (1-999 nm). En una realización, las microcápsulas o nanocápsulas poliméricas semipermeables comprenden membranas de alginato/poli-L-lisina/alginato (APA), alginato/chitosán/alginato (ACA) o alginato/genipina/alginato (AGA). En otra realización, la microcápsula o nanocápsula comprende membranas de alginato/poli-L-lisina/pectina/poli-llisina/alginato (APPPA), alginato/poli-L-lisina/pectina/poli-L-lisina/pectina (APPPP), alginato/poli-L-lisina/chitosán/poli-L-lisina/alginato (APCPA), alginato-polimetileno-co-guanidina-alginato (A-PMCG-A), hidrometilacrilato-metil metacrilato (HEMA-MMA), HEMA-MMA-MAA multicapa, poliacrilonitrilo cloruro de vinilo (PAN-PVC), acrilonitrilo/metalilsulfonato sódico (AN-69), polietilen glicol/poli pentametilciclopentasiloxano/polidimetilsiloxano (PEG/PD5/PDMS) o poli N,N-dimetil acrilamida (PDMAAm). En otra realización adicional, la microcápsula o nanocápsula comprende fibra hueca, nitrato de celulosa, poliamida, polímero acomplejado con lípidos, una vesícula de lípidos, un encapsulado silíceo, sulfato de celulosa/alginato sódico/polimetileno-co-guanidino (CS/A/PMCG), acetato ftalato de celulosa, alginato de calcio, partículas de gel de k-carragenano-goma garrofín, partículas de gelano-xantano, poli(lactida-co-glicólidos), carragenano, polianhídridos de almidón, polimetacrilatos de almidón, poliaminoácidos o polímeros de recubrimiento entérico.
En una realización adicional, las microcápsulas o nanocápsulas poliméricas son resistentes a las condiciones gastro­ intestinales, tales como pH 1-8 y/o bilis [1-30 mmol]).
Las composiciones orales descritas en la presente memoria opcionalmente están liofilizadas, secadas mediante calor, secadas mediante pulverización o secadas por congelación. Alternativamente, las composiciones orales se preparan de forma opcional húmedas.
En una realización, las composiciones orales descritas en la presente memoria están liofilizadas con lioprotectores para asegurar la viabilidad y una mejor actividad de bsh con el tiempo. Los lioprotectores típicos incluyen, sin limitación, una concentración final de 0,2% a 10% de maltodextrina y de 0,05% a 0,33% de extracto de levadura ó 0,05-2,5% de inulina y de 0,05 a 0,1% de extracto de levadura. En una realización, los lioprotectores comprenden una concentración final de 2-4% de maltodextrina y 0,1% de extracto de levadura, 0,3% de inulina y 0,1% de extracto de levadura, ó 0,3% de inulina.
En otra realización, las composiciones orales descritas en la presente memoria se almacenan en líquido para asegurar la viabilidad y una actividad mejorada de bsh. Las condiciones de almacenamiento líquido típicas incluyen, aunque sin limitación, una concentración final de disolución conservante que comprende 2,5-10% de medio de crecimiento (tal como se describe en la presente memoria), 50-90,99% de yogur u otro lácteo fermentado, 50-99,99% de sobrenadante de cultivo o 5% de MRS.
En otra realización adicional, las composiciones orales descritas en la presente memoria son congeladas espontáneamente para asegurar la viabilidad y la mejor actividad de bsh. Las condiciones típicas de congelación espontánea incluyen, sin limitación, una concentración final de disolución crioprotectora que comprende 0,2-10% de maltodextrina, opcionalmente 1-3%, maltodextrina y de 0,05 a 0,33% de extracto de levadura, opcionalmente 0,1-0,2% de extracto de levadura, de 0,05 a 2,5% de inulina, opcionalmente al menos 0,2% de inulina, trehalosa 0,5M, fructosa 0,5M, lactosa 0,5M, maltosa 0,5M o 50-99,99%, opcionalmente 50% de medio agotado.
El término “vehículo” tal como se usa en la presente memoria se refiere a un vehículo aceptable que facilite la administración al sujeto. Por ejemplo, un vehículo aceptable que facilita la administración oral incluye, sin limitación, un suplemento, un producto alimentario, una bebida, un alimento funcional o un nutracéutico, o un excipiente. “Nutracéutico” significa un producto aislado o purificado a partir de alimentos (o fuentes usadas para preparar alimentos, tales como plantas, animales u otros organismos) que se cree que tienen beneficios para la salud, tales como un efecto medicinal, fisiológico o profiláctico. “Producto alimenticio funcional” significa que es un alimento, que se consume como parte de una dieta y que tiene beneficios para la salud, tales como beneficios medicinales, fisiológicos o profilácticos, más allá de la función nutricional básica de suministro de nutrientes.
En otra realización, el vehículo comprende una cápsula, píldora, cápsula de gel, líquido o película disoluble.
Las composiciones orales descritas en la presente memoria para reducir el nivel de colesterol en suero, el de lípidos en suero, la grasa corporal o el índice aterogénico, o para la profilaxis y el tratamiento de aterosclerosis, y de enfermedades cardiovasculares o cerebrovasculares, comprenden además opcionalmente otros agentes o sustancias terapéuticas para dichas indicaciones. Por consiguiente, en una realización, la composición oral comprende además un agente reductor de triglicéridos, opcionalmente, inhibidores de escualeno sintasa, inhibidores de proteína de transferencia de triglicéridos microsomales, estatinas, secuestrantes de ácido biliar, inhibidores de la absorción de colesterol, fibratos y otros agonistas alfa de PPAR, agonistas de PPAR duales, inhibidores de lipasa, inhibidores de proteína tirosina fosfatasa 1B, péptido pancreático YY3-36, antagonistas de receptor recombinantes y otros receptores canabinoides o agonistas de 5-HT2c, tales como lorcaserina. En otra realización, la composición comprende además un agente para aumentar el nivel de HDL o para limitar la reducción del nivel de HDL, opcionalmente, estatinas, secuestrantes de ácido biliar, inhibidores de absorción de colesterol, fibratos y otros agonistas de PPAR alfa, agonistas de PPAR duales, inhibidores de lipasa, inhibidores de proteína tirosina fosfatasa 1B, péptido pancreático YY3-36, antagonistas de receptor recombinantes y otros receptores canabinoides o agonistas de 5-HT2c, tales como lorcaserina. En otra realización adicional, la composición oral comprende además un agente reductor del nivel de colesterol, opcionalmente un secuestrante de ácido biliar (BAS), una estatina, ezetimibe, ácido alfa-linoleitico, ácido omega-3,6,9-eicosapentaenoico (EPA), ácido docosahexaenoico (DHA), fibratos, fibra soluble, polifenol, metabolito de gama-orizanol hesperetina, fitoquímico, otro probiótico, psyllium, fitosterol, fitostanol, vitamina, antioxidante o antibiótico. La estatina se puede seleccionar del grupo que consiste en Lovastatina, Pravastatina, Zocor, Fluvastatina, Mevastatina, Pitavastatina, Cerivastatina, Simvastatina, Rosuvastatina y Atorvastatina. El BAS puede ser colestiramina, colestipol o colesevelam. El fibrato puede ser clofibrato, bezafibrato, gemfibrozil o fenofibrato. En una realización adicional, la composición oral comprende además un agente para preservar la actividad de bsh, opcionalmente, inulina, trehalosa, maltodextrano, extracto de levadura, polietilen glicol, glicerol, lípido, grasa emulsificada, un producto lácteo, glucosa, fructosa, sacarosa, un polisacárido, anhidrobiosis, un policosanol, polietilen glicol (PEG), un esterol vegetal, un estanol vegetal o un ácido graso omega. El policosanol puede ser octacosanol, triacontanol, alcohol de behenilo, alcohol de lignocerilo, alcohol de cerilo, 1-heptacosanol, 1-nonacosanol, 1-dotriacontanol o alcohol de geddilo. En otra realización adicional, la composición oral comprende además un agente para modular adipocinas u hormonas de la obesidad, opcionalmente, leptina, ghrelina, resistina, adiponectina, quemerina, II-6, visfatina, proteína de unión a retinol 4 o inhibidor-1 de activador de plasminógeno. En otra realización adicional, la composición oral comprende además un agente hipoglucémico, opcionalmente, metformina, rosiglitazona, pioglitazona, gliburide, glicalzide, glimepiride, nateglinide, repaglinide, mitiglinide, alogliptina, saxagliptina, vildagliptina y dapaglifozina. Incluso en otra realización adicional, la composición oral comprende además un agente terapéutico para reducir las citocinas pro-inflamatorias IL-1 a/p, IL-2, IL-15, IL-3, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, IFN-gamma, TNF-alfa, o para aumentar el nivel de las citocinas anti-inflamatorias IL-1 ra, IL-9, IL-10, IL-11.
En otra realización adicional, la composición oral comprende además vitamina B12. En una realización adicional, la composición oral comprende además ácido linoleico conjugado (CLA). En otra realización adicional, la composición oral comprende además reuterina y/o reutericiclina.
Métodos y usos
La descripción incluye métodos y usos de las composiciones orales descritas en la presente memoria. En una realización, se proporciona un método de terapia que comprende la administración de una composición oral descrita en la presente memoria a un animal que lo necesite. También se proporciona un uso de una composición oral descrita en la presente memoria para la terapia de un animal. Además se proporciona un uso de una composición oral descrita en la presente memoria en la preparación de un medicamento para terapia. También se proporciona la composición oral descrita en la presente memoria para uso en terapia.
Las composiciones descritas en la presente memoria son útiles para reducir el nivel de colesterol en suero de un animal que lo necesite. Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripción proporciona un método para reducir el nivel de colesterol en suero en un animal que lo necesite, que comprende la administración de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral descrita en la presente memoria. También se proporciona un uso de una composición oral descrita en la presente memoria para reducir el nivel de colesterol en suero en un animal que lo necesite. También se proporciona un uso de una composición oral descrita en la presente memoria en la preparación de un medicamento para reducir el nivel de colesterol en suero en un animal que lo necesite. Se proporciona además una composición oral descrita en la presente memoria para uso en la reducción del nivel de colesterol en suero en un animal que lo necesite.
En una realización, el animal que lo necesite tiene una enfermedad o trastorno que se caracteriza por un aumento de la acumulación de colesterol en suero y/o tejidos que produce una patología o tiene un nivel de colesterol excesivo como factor de riesgo. Los trastornos de colesterol incluyen hipercolesterolemia familiar o el trastorno de colesterol heredado (ICD, del inglés “inherited colesterol disorder”), defectos en los productos genéticos del metabolismo de colesterol, p.ej., 7-alfa-hidroxilasa y varias formas de xantomas. Los niveles incrementados de colesterol en suero pueden indicar aterosclerosis, cirrosis biliar, hiperlipidemias familiares, dieta elevada en colesterol, hipotiroidismo, infarto de miocardio, síndrome nefrítico y diabetes no controlada. “Colesterol excesivo” significa fuera del rango de colesterol típico (normal). El nivel típico de colesterol es menos de 200 mg/dL. El límite alto es de 200-239 mg/dL y cualquier valor por encima de 240 mg/dL es elevado. El informe del “National Cholesterol Education Program NCEP III” sobre e( colesterol incluye un “Full Report” (“Informe completo”) y una sección de “Drug Therapy” (“Terapia de fármacos”). Éstos proporcionan una revisión de ejemplos de tratamiento del colesterol mediante estatinas, secuestrantes de ácido biliar, dieta, etc. y se refieren a niveles de colesterol y factores de riesgo (p.ej., véanse las Tablas IV. 1-1; VI. 1-1; VI. 1-2; VI. 1-3). Las composiciones descritas en la presente memoria son similares a los secuestrantes de ácido biliar en que reducen los niveles de bilis. El informe de NCEP proporciona una guía sobre el uso de terapias farmacéuticas en relación a la presencia de otros factores de riesgo. Existen dos tipos de colesterol, colesterol HDL (a veces denominado colesterol bueno) y colesterol LDL (a veces denominado colesterol malo). El “colesterol excesivo” también se puede determinar respecto al LDL. Por ejemplo, la terapia de fármacos se considera opcionalmente para individuos con múltiples factores de riesgo (2 ó más) cuando el nivel de colesterol LDL es: >100 mg/dL (p.ej., con una meta para reducir el nivel de colesterol LDL hasta <100 mg/dL), al menos 130 mg/dL (p.ej., con una meta para reducir el nivel de colesterol LDL a menos de 130 mg/dL), al menos 160 mg/dL (p.ej., con una meta para reducir el nivel de colesterol LDL a menos de 130 mg/dL). Adicionalmente, la terapia de fármacos también se considera opcionalmente para individuos con 0-1 factores de riesgo cuando el nivel de colesterol LDL es de al menos 190 mg/dL (p.ej., con una meta para reducir el nivel de colesterol LDL hasta menos de 160 mg/dL). Los valores normales tienden a aumentar con la edad, y las mujeres pre-menopáusicas presentan niveles algo menores que los hombres de la misma edad.
En otra realización, los métodos y usos para reducir el nivel de colesterol en suero aumentan o limitan la reducción del nivel de lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) en suero del animal. En una realización adicional, los métodos y usos para reducir el nivel de colesterol en suero también disminuyen el nivel de triglicéridos en suero de un animal. En otra realización adicional, los métodos y usos para reducir el nivel de colesterol en suero también reducen los factores de riesgo aterosclerótico del animal. Los factores de riesgo aterosclerótico incluyen, sin limitación, homocistina en suero, fibrinógeno, proteína C-reactiva, lipoproteína (a), ácido úrico, matriz metalopeptidasa 9 (MMP-9), inhibidor-1 de activador de plasminógeno (PAI-1) o su antígeno, activador de plasminógeno de tejido (tPA), TNF alfa, IL-6, P-selectina, proteína-1 quimotáctica de monocito (MCP-1), ligando de CD40 soluble (sCD40L), molécula 1 de adhesión inter-celular (ICAM-1), mieloperoxidasa (MPO), adiponectina, leptina, fosfolipasa A asociada a lipoproteína e insulina.
En otra realización adicional, los métodos y usos para reducir el nivel de colesterol en suero también producen y administran vitamina B12 al animal. En una realización adicional, los métodos y uso para reducir el nivel de colesterol en suero también producen y administran ácido linoleico conjugado (CLA) al animal. En otra realización adicional, los métodos y usos para reducir el nivel de colesterol en suero también producen y administran reuterina y reutericiclina al animal.
Las composiciones orales descritas en la presente memoria también son útiles para reducir el nivel de triglicéridos en suero en un animal que lo necesite. Por consiguiente, en un aspecto, la presente descripción proporciona un método para reducir el nivel de triglicéridos en suero en un animal que lo necesite que comprende la administración de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición descrita en la presente memoria. También se proporciona un uso de una composición oral descrita en la presente invención para reducir el nivel de triglicéridos en suero en un animal que lo necesite. También se proporciona un uso de una composición oral descrita en la presente memoria para la preparación de un medicamento para reducir el nivel de triglicéridos en suero en un animal que lo necesite. También se proporciona una composición oral descrita en la presente memoria para uso en la reducción del nivel de triglicéridos en suero en un animal que lo necesite.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para reducir el índice aterogénico de un animal, que comprende la administración al animal de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción. También se proporciona un uso de una cantidad reductora de ácido de una composición de la descripción para reducir el índice aterogénico de un animal. También se proporciona un uso de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción en la preparación de un medicamento para reducir el índice aterogénico de un animal. Además se proporciona una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción para uso en la reducción del índice aterogénico de un animal. El índice aterogénico se calcula usando al menos una de las ecuaciones mostradas en la Tabla 1.
En otro aspecto adicional, la descripción proporciona un método para la profilaxis o el tratamiento de la aterosclerosis o de un trastorno degenerativo provocado por aterosclerosis en un animal que comprende la administración al animal de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción. También se proporciona un uso de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción para la profilaxis o el tratamiento de la aterosclerosis o de un trastorno degenerativo producido por la aterosclerosis. También se proporciona un uso de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción en la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de la aterosclerosis o un trastorno degenerativo producido por la aterosclerosis. Además se proporciona una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción para uso en la profilaxis o el tratamiento de la aterosclerosis o de un trastorno degenerativo producido por la aterosclerosis. Los trastornos degenerativos incluyen, aunque sin limitación, enfermedad cerebrovascular, apoplejía, enfermedad vascular, enfermedad arterial coronaria, infarto de miocardio, trombosis, angina, angina inestable, claudicación intermitente, ataque isquémico transitorio o fallo renal.
El término “profilaxis o tratamiento” se refiere a la reducción de la probabilidad de una afección o al alivio de una afección.
En un aspecto adicional, la descripción proporciona un método para reducir la grasa corporal total o para tratar la obesidad o la pre-obesidad en un animal, que comprende la administración al animal de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción. También se proporciona un uso de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción para reducir la grasa corporal total o para tratar la obesidad o la pre-obesidad en un animal. También se proporciona un uso de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción en la preparación de un medicamento para reducir la grasa corporal total o para tratar la obesidad o la pre-obesidad en un animal. Además se proporciona una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción para uso en la reducción de la grasa corporal total o para tratar la obesidad o la pre-obesidad en un animal. El término “obesidad” tal como se usa en la presente memoria se refiere a una enfermedad, afección o trastorno médico, y se define como un índice de masa corporal (IMC) >30. Un IMC de 25-30 es pre-obeso.
En otro aspecto adicional, la descripción proporciona un método para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o trastorno metabólico en un animal que comprende la administración al animal de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción. También se describe un uso de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o trastorno metabólico en un animal. También se proporciona un uso de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción en la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o trastorno metabólico en un animal. Además se proporciona una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción para uso en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o trastorno metabólico en un animal. Las enfermedades y trastornos metabólicos incluyen, sin limitación, hiperlipidemia, hiperglucemia, hiperlipoproteinemia, tolerancia a la glucosa alterada (IGT, del inglés “impaired glucose tolerance”), resistencia a la insulina, pre-diabetes, diabetes de tipo I, diabetes de tipo II y síndrome metabólico.
En otro aspecto, la descripción proporciona un método para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o trastorno hepático asociado a concentraciones elevadas de lípidos y triglicéridos en suero o en el hígado, a inflamación hepática, enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), enfermedad de hígado graso alcohólico (AFLD) esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis hepática, esteatosis hepática, fibrosis hepática, niveles anormalmente elevados de ALT, AST, GGT o Alk-P en suero, virus de Epstein-Barr, hepatitis, hepatitis autoinmune, enfermedad granulomatosa hepática, colangitis, cáncer hepatocelular, colangiocarcinoma, enfermedad hepática metabólica en un animal, que comprende la administración al animal de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción. También se proporciona un uso de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o trastorno hepático asociado a concentraciones elevadas de lípidos y triglicéridos en suero o en el hígado, inflamación hepática, enfermedad de hígado graso no alcohólica (NAFLD), enfermedad de hígado graso alcohólica (AFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis hepática, esteatosis hepática, fibrosis hepática, niveles anormalmente elevados de ALT, AST, GGT o Alk-P en suero, virus de Epstein-Barr, hepatitis, hepatitis autoinmune, enfermedad granulomatosa hepática, colangitis, cáncer hepatocelular, colangiocarcinoma, enfermedad hepática metabólica en un animal. También se proporciona un uso de una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción en la preparación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o trastorno hepático asociado a concentraciones elevadas de lípidos y triglicéridos en suero o en el hígado, inflamación hepática, enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), enfermedad de hígado graso alcohólica (AFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis hepática, esteatosis hepática, fibrosis hepática, niveles anormalmente elevados de ALT, AST, GGT o Alk-P en suero, virus de Epstein-Barr, hepatitis, hepatitis autoinmune, enfermedad granulomatosa hepática, colangitis, cáncer hepatocelular, colangiocarcinoma, enfermedad hepática metabólica en una animal. Además se proporciona una cantidad reductora de ácido biliar de una composición oral de la descripción para uso en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o trastorno hepático asociado a concentraciones elevadas de lípidos y triglicéridos en suero o en el hígado, inflamación hepática, enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), enfermedad de hígado graso alcohólico (AFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), cirrosis hepática, esteatosis hepática, fibrosis hepática, niveles anormalmente elevados de ALT, AST, GGT o Akl-P en suero, virus de Epstein-Barr, hepatitis, hepatitis autoinmune, enfermedad granulomatosa hepática, colangitis, cáncer hepatocelular, colangiocarcinoma, enfermedad hepática metabólica en un animal.
Se pueden coadministrar o usar otros agentes o sustancias terapéuticas en combinación con las composiciones orales descritas en la presente memoria. Por consiguiente, en una realización, los métodos y usos descritos en la presente memoria comprenden además la administración de un agente reductor del nivel de triglicéridos, opcionalmente, inhibidores de escualeno sintasa, inhibidores de proteína de transferencia de triglicéridos microsomales, estatinas, secuestrantes de ácido biliar, inhibidores de la absorción de colesterol, fibratos y otros agonistas de PPAR alfa, agonistas de PPAR duales, inhibidores de lipasa, inhibidores de proteína tirosina fosfatasa 1B, péptido pancreático YY3-36, antagonistas de receptor recombinantes y otros antagonistas cannabinoides o agonistas de 5-HT2c, tal como lorcaserina. En otra realización, los métodos y usos descritos en la presente memoria comprenden además la administración de un agente para aumentar el nivel de HDL o para limitar la reducción del nivel de HDL, opcionalmente, estatinas, secuestrantes de ácido biliar, inhibidores de la absorción de colesterol, fibratos y otros agonistas de PPAR alfa, agonistas de PPAR duales, inhibidores de lipasa, inhibidores de proteína tirosina fosfatasa 1B, péptido pancreático YY3-36, antagonistas de receptor recombinante y otros antagonistas cannabinoides, o agonistas de 5-HT2c, tal como lorcaserina. En otra realización adicional, los métodos y usos descritos en la presente memoria comprenden además la administración de un agente reductor del nivel de colesterol, opcionalmente un secuestrante de ácido biliar (BAS), una estatina, ezetimibe, ácido alfa-linoléitico, ácido omega-3,6,9 eicosapentaenoico (EPA), ácido docosahexaenoico (DHA), fibratos, fibra soluble, polifenol, metabolito de gama-orizanol hesperetina, fitoquímicos, otro probiótico, psyllium, fitosterol, fitostanol, vitamina, antioxidante o antibiótico. Las estatinas incluyen, sin limitación, lovastatina, pravastatina, zocor, fluvastatina, mevastatina, pitavastatina, cerivastatina, simvastatina, rosuvastatina y atorvastatina. El BAS incluye, sin limitación, colestiramina, colestipol y colesevelam. Los fibratos incluyen, sin limitación, clofibrato, bezafibrato, gemfibrozil y fenofibrato. En otra realización adicional, los métodos y usos descritos en la presente memoria comprenden además la administración de un agente para preservar la actividad de bsh, opcionalmente, inulina, trealosa, maltodextrano, extracto de levadura, polietilen glicol, glicerol, lípidos, grasa emulsificada, un producto lácteo, glucosa, fructosa, sacarosa, un polisacárido, anhidrobiosis, un policosanol, polietilen glicol (PEG), un esterol vegetal, un estanol vegetal, o un ácido graso omega. El policosanol incluye, sin limitación, octacosanol, triacontanol, alcohol de behenilo, alcohol de lignocerilo, alcohol de cerilo, 1-heptacosanol, 1-nonacosanol, 1-dotriacontanol y alcohol de geddilo. En una realización adicional, los métodos y usos descritos en la presente memoria comprenden además la administración de un agente para modular adipocinas u hormonas de obesidad, opcionalmente, leptina, ghrelina, resistina, adiponectina, quemerina, II-6, visfatina, proteína 4 de unión a retinol o inhibidor-1 de activador de plasminógeno. En otra realización adicional, los métodos y usos descritos en la presente memoria comprenden además la administración de un agente hipoglucémico, opcionalmente, metformina, rosiglitazona, pioglitazona, gliburide, gliclazide, glimepiride, glipizidebile, glibenclamide, acarbosa, miglitol, voglibosa, sitagliptina, nateglinide, repaglinide, mitiglinide, alogliptina, saxagliptina, vildagliptina y dapagliflozina. En otra realización, los métodos y usos descritos en la presente memoria comprenden además la administración de un agente terapéutico para reducir las citocinas pro­ inflamatorias IL-1 a/p, IL-2, IL-15, IL-3, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, IFN-gamma, TNF-alfa, o para aumentar el nivel de las citocinas anti-inflamatorias IL-1 ra, IL-9, IL-10, IL-11.
El término “animal” tal como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier miembro del reino animal, opcionalmente, un mamífero, tal como un humano.
La administración de una “cantidad efectiva” o “cantidad reductora de ácido biliar” de los agentes descritos en la presente memoria se define como una cantidad efectiva a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios para alcanzar el resultado deseado. La cantidad efectiva de la composición bacteriana con elevada actividad de bsh se ajusta opcionalmente de acuerdo a factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del animal. Los regímenes de dosificación se ajustan fácilmente para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o la dosis se puede reducir proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. En una realización, las composiciones pueden administrarse o usarse de 1 a 4 veces al día.
Las composiciones se pueden preparar mediante métodos conocidos para la preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que pueden administrarse a pacientes, y de tal modo que se combina una cantidad efectiva de la célula en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados se describen, por ejemplo, en “Remington’s Pharmaceutical Sciences” (Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., EE.UU. 2003 - 20a Edición) y en “The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF19)”, publicado en 1999).
Procesos para cultivar y preparar las bacterias
En la presente memoria también se describen procesos para preparar una bacteria con una elevada actividad de bsh que comprenden cultivar bacterias productoras de bsh en condiciones de fermentación que favorezcan el desarrollo de una elevada actividad de bsh. Las condiciones de fermentación adecuadas han sido descritas en la sección anterior de composiciones. Por ejemplo, las condiciones de fermentación comprenden opcionalmente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, un pH de 4 a 7 y un tiempo de recolección de 12 a 24 horas. En una realización, la fuente de carbono es un azúcar que opcionalmente comprende maltosa, sacarosa, dextrina, una combinación de sorbitol y glucosa o una combinación de inulina y glucosa. En una realización particular, la fuente de carbono es maltosa. En otra realización, la fuente de nitrógeno comprende (i) extracto de levadura y extracto de malta, extracto de levadura y extracto de vacuno, o hidrolisato de caseína y extracto de malta; y (ii) peptona o triptona. En otra realización, la fuente de nitrógeno comprende además cisteína. En una realización particular, la peptona es la peptona n° 3. Las concentraciones típicas de las fuentes de carbono y nitrógeno son como se describe en la sección anterior de composiciones.
En una realización adicional, el proceso comprende además liofilizar las composiciones bacterianas libres o microencapsuladas con lioprotectores como los descritos en la presente memoria. En una realización, los lioprotectores comprenden una concentración final de 0,2% a 10% de maltodextrina y de 0,05% a 0,33% de extracto de levadura o de 0,05-2,5% de inulina y de 0,05 a 0,1% de extracto de levadura. En una realización, los lioprotectores comprenden una concentración final de 2-4% de maltodextrina y de 0,1% de extracto de levadura, de 0,3% de inulina y 0,1% de extracto de levadura, o de 0,3% de inulina.
En una realización alternativa, el proceso comprende además almacenar la composición de bacterias de elevada actividad de bsh libres o microencapsuladas en condiciones de almacenamiento líquido. En una realización, las condiciones de almacenamiento comprenden una disolución conservante final que comprende un 2,5-10% de medio de crecimiento, un 50-99,99% de yogur u otro lácteo fermentado, un 50-99,99% de sobrenadante de cultivo o un 5% de MRS.
En otra realización adicional, el proceso comprende además la congelación espontánea de la composición libre o microencapsulada en una disolución crioprotectora tal como se describe en la presente memoria. En una realización, la disolución crioprotectora comprende una concentración final de 0,2-10% de maltodextrina, opcionalmente 1-3%, maltodextrina y de 0,05 a 0,33% de extracto de levadura, opcionalmente 0,1-0,2% de extracto de levadura, de 0,05 a 2,5% de inulina, opcionalmente al menos 0,2% de inulina, Trehalosa 0,5M, fructosa 0,5M, lactosa 0,5M, maltosa 0,5M o 50-99,99%, opcionalmente 50%, de medio agotado. La congelación espontánea tal como se usa en la presente memoria se refiere a someter a la composición a temperaturas por debajo de -80 grados Celsius, por ejemplo, sometiendo a la composición libre o microencapsulada a nitrógeno líquido tal como a una temperatura de -196 grados Celsius, o congelando la composición a temperaturas ultra bajas, tal como -130 grados Celsius, o usando hielo seco.
La descripción anterior describe generalmente la presente descripción. Se puede obtener una compresión más completa en referencia a los siguientes ejemplos específicos. Dichos ejemplos se describen únicamente con fines ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la descripción. Se contemplan cambios en forma y sustitución por equivalentes, si las circunstancias lo sugieren o lo hacen necesario.
Los siguientes ejemplos no limitativos son ilustrativos de la presente descripción:
Ejemplos
Desconjugación de TDCA y GDCA mediante cepas libres de Lactobacillus reuteri(Figuras 1 y 2)
Resultados
Las Figuras 1 y 2 demuestran la desconjugación de ácido taurodesoxicólico y ácido glicodesoxicólico, medido mediante HPLC, en un ensayo in vitro usando 0,4 gramos de Lactobacillus reuteri (ATCC 53608, ATCC 53609, ATCC 55148, ATCC 55739 y NCIMB 701359) con el tiempo. Las cepas de Lactobacillus reuteri NCIMB 70159 y ATCC 55739 tienen la mayor actividad de bsh, determinado mediante HPLC. Se deberían considerar las limitaciones de la “resolución” del ensayo (usando 0,4 gramos y tomando muestra durante más de 2,5 horas); sin embargo, aun así estas cepas demostraron una actividad de bsh considerablemente mayor que otras evaluadas en este experimento y, puesto que el nivel de GDCA no es medible a las 2,5 horas, existe una diferencia incluso mayor en la actividad de bsh, ya que el sustrato se vuelve limitante.
Materiales y métodos
Bacterias y condiciones de cultivo
Se cultivaron cuatro cepas de Lactobacillus reuteri obtenidas de ATCC (53609, 53608, 55148 y 55739) y NCIMB 701359 en caldo de cultivo esterilizado de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) a 37°C durante 20 horas. Los cultivos fueron aislados mediante centrifugación y las células bacterianas recolectadas se usaron en el siguiente ensayo BSH.
Medida de actividad BSH
Para medir la actividad BSH, se añadieron las bacterias recolectadas a 100% de MRS suplementado con una combinación de glicodesoxicolato sódico y taurodesoxicolato sódico, ambos a 5 mM (0,4 g de células bacterianas/20 mL de MRS suplementado con GDCA y TDCA). A continuación las bacterias se incubaron en el caldo de reacción anaeróbicamente a 37°C con agitación mínima (100 rpm), y se tomaron muestras del sobrenadante a intervalos de 2,5 horas y se procesaron para determinar las concentraciones de sales biliares conjugadas. Resumidamente, se acidificaron muestras de 500 pL con 5 pL de HCl 6N tras retirar las células bacterianas por centrifugación a 10000g durante 3 minutos. Los sobrenadantes fueron suplementados entonces con 500 pL de metanol que contienen GCA (ácido glicocólico) 4 mM como patrón interno. Las muestras fueron sometidas a vórtice durante 10 minutos y se centrifugaron a 1000g durante 15 minutos. Las muestras se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm antes de ser analizadas mediante HPLC. Los análisis de HPLC de sales biliares siguieron el procedimiento descrito por Jones et al. 2003.
Análisis de sales biliares por HPLC
El análisis de HPLC de sales biliares siguió el procedimiento descrito por Jones et al. 2003. El análisis se llevó a cabo en una columna C-18 de fase inversa: LiChrosorb RP-18, 5 pm, 250 x 4,6 mm. El sistema de HPLC consistió en dos módulos de suministro de disolvente ProStar 210, un detector UV-VIS ProStar 320, un autoinyector ProStar 410 y un sistema de datos cromatográficos Galaxie (versión 1.9.3.2). Se aplicó una mezcla de metanol y tampón de acetato sódico 50 mM ajustada a pH 4,3 con ácido o-fosfórico (70:30, v/v) como fase móvil con un caudal de 1,0 mL/min. El detector se fijó a 210 nm y todas las medidas se llevaron a cabo a temperatura ambiente.
Desconjugación de TDCA y GDCA por Lactobacillus reuteri libre y Lactobacillus fermentum (Figuras 3 y 4) Resultados
Las Figuras 3 y 4 muestran la desconjugación de ácido taurodesoxicólico y ácido glicodesoxicólico, medida mediante HPLC, en un ensayo in vitro de Lactobacillus reuteri (Lab Met, NCIMB 701359) o Lactobacillus fermentum (ATCC 11976) e incluso una fracción (1/8) de la cantidad de células de Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359) superan a las Lactobacillus reuteri (LabMet) in vitro.
Materiales y métodos
Bacterias y condiciones de cultivo
Las cepas bacterianas usadas en este estudio son L. reuteri (LabMet, NCIMB 701359) y L. fermentum (ATCC 11976). Las bacterias se cultivaron en caldo de cultivo esterilizado de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) a 37°C durante 20 horas. Los cultivos fueron aislados mediante centrifugación y las células bacterianas recolectadas fueron usadas en el siguiente ensayo BSH.
Medida de actividad BSH
Para medir la actividad BSH, se añadieron las bacterias recolectadas a 100% de MRS suplementado con una combinación de glicocolato sódico y taurocolato sódico 5 mM (0,4 g ó 0,05 g de bacterias /20 mL de MRS suplementado con GDCA y TDCA). A continuación las bacterias se incubaron anaeróbicamente a 37°C, y se tomaron muestras del sobrenadante a intervalos de 3 horas y se procesaron para determinar las concentraciones de sales biliares conjugadas en los tubos de reacción. Resumidamente, se acidificaron muestras de 500 pL con 5 pL de HCl 6N tras retirar las células bacterianas por centrifugación a 10000g durante 3 minutos. Los sobrenadantes fueron suplementados entonces con 500 pL de metanol que contiene GCA (ácido glicocólico) 4 mM como patrón interno. Las muestras fueron sometidas a vórtice durante 10 minutos y se centrifugaron a 1000g durante 15 minutos. Las muestras se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm antes de ser analizadas mediante HPLC. Los análisis de HPLC de sales biliares siguieron el procedimiento descrito por Jones et al.
Análisis de sales biliares por HPLC
El análisis de HPLC de sales biliares siguió el procedimiento descrito por Jones et al. 2003. El análisis se llevó a cabo en una columna C-18 de fase inversa: LiChrosorb RP-18, 5 pm, 250 x 4,6 mm. El sistema de HPLC consistió en dos módulos de suministro de disolvente ProStar 210, un detector UV-VIS ProStar 320, un autoinyector ProStar 410 y un sistema de datos cromatográficos Galaxie (versión 1.9.3.2). Se aplicó una mezcla de metanol y tampón de acetato sódico 50 mM ajustada a pH 4,3 con ácido o-fosfórico (70:30, v/v) como fase móvil con un caudal de 1,0 mL/min. El detector se fijó a 210 nm y todas las medidas se llevaron a cabo a temperatura ambiente.
Desconjugación de TDCA y GDCA por las cepas libres de Lactobacillus reuteri (Figuras 5 y 6) Resultados
Las Figuras 5 y 6 muestran la desconjugación de ácido taurodesoxicólico y ácido glicodesoxicólico, medida mediante HPLC en un ensayo in vitro, usando 0,2 gramos de Lactobacillus reuteri libre (NCIMB 701359, NCIMB 701089, NCIMB 702656, NCIMB 11951, ATCC 23272 y LMG 9213) con el tiempo. Las cepas NCIMB 701359, NCIMB 701089 y ATCC 23272 tienen el mayor grado de actividad de bsh, determinada mediante HPLC, nuevamente limitado por la resolución del estudio.
Materiales y métodos
Bacterias y condiciones de cultivo
Las cepas bacterianas usadas en este estudio son L. reuri NCIMB 701359, L. reuteri NCIMB 701089, L. reuteri NCIMB 702656, L. reuteri NCIMB 11951, L. reuteri ATCC 23272 y L. reuteri LMG 9213. Las bacterias fueron inoculadas a partir de una única colonia y se sometieron a pasaje dos veces con inóculos al 1%. Las bacterias fueron cultivadas en caldo de cultivo esterilizados de Man, Rogosa, Sharpe (MRS, Difco) a 37°C durante 20 horas cada vez. Los cultivos se aislaron por centrifugación y las células bacterianas recolectadas se usaron en el ensayo en el siguiente ensayo BSH.
Medida de actividad BSH
Para medir la actividad BSH, se añadieron 0,2 g de bacterias recolectadas a 100% de MRS suplementado con una combinación de glicocolato sódico y taurocolato sódico 5 mM (0,2 g de bacterias /20 mL de MRS suplementado con GDCA 5 mM y TDCA 5 mM). A continuación las bacterias se incubaron anaeróbicamente a 37°C, y se tomaron muestras del sobrenadante a las 1, 3, 5 y 7 horas para determinar las concentraciones de sales biliares conjugadas en los tubos de reacción. Resumidamente, se acidificaron muestras de 500 |j L con 5 |j L de HCl 6N tras retirar las células bacterianas por centrifugación a 10000g durante 3 minutos. Los sobrenadantes fueron suplementados entonces con 500 jiL de metanol que contiene GCA (ácido glicocólico) 4 mM como patrón interno. Las muestras fueron sometidas a vórtice durante 10 minutos y se centrifugaron a 1000g durante 15 minutos. Las muestras se filtraron a través de un filtro de 0,45 jm antes de ser analizadas mediante HPLC. Los análisis de HPLC de sales biliares siguieron el procedimiento descrito por Jones et al.
L. reutericon elevada actividad de bsh y reducción del nivel de colesterol
Materiales y métodos
La actividad de bsh de las cepas de Lactobacilli se calculó mediante el ensayo estándar de HPLC para TDCA y GDCA descrito en las secciones de materiales y métodos anteriores. Las tasas de eliminación de xDCA se calcularon tomando la concentración de GDCA o TDCA eliminada de contenidos intestinales simulados en el punto final y restando el valor de línea base. La cantidad de DCA producido, o de xDCA eliminado, se dividió entre la masa de microcápsulas usadas y se multiplicó por el volumen de contenido intestinal simulado y se dividió por el tiempo transcurrido, en horas, desde la línea base hasta el punto final. Esto se realizó mediante la ecuación: xDCA reducido = |umol de DCA producido ó xDCA reducido/g microcápsula/h.
Resultados
La Tabla 2 muestra la actividad de bsh de las cepas de Lactobacillus reuteri evaluadas preclínicamente o clínicamente y expresada como una velocidad (pmol DCA/g/h) medida para 5 horas y para 30 minutos. Aunque se demostró que la Lactobacillus reuteri (LabMet) reduce el nivel de colesterol preclínicamente, se requerían dosis elevadas de L. reuteri y una elevada frecuencia de dosificación. Se confirmó que la Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359) con mayor actividad de bsh, que redujo el nivel de colesterol en estudios preclínicos, reduce significativamente el nivel de colesterol en ensayos clínicos humanos. Se cree que la mayor tasa de actividad de bsh es la responsable de la actividad y existen evidencias considerables que apoyan la reivindicación de que se requiere un nivel umbral de actividad de bsh para células libres administradas en dosis diarias elevadas. Parece ser que los organismos que degradan >50 pmol de GDCA/gramo/hora y >2 pmol de TDCA/gramo/hora medido a 1 hora y a 5 horas, respectivamente, y que son administrados en la cantidad de 106-1012 organismos son suficientes para reducir el nivel de colesterol. Por esta razón, se predice que la Lactobacillus reuteri (NCIMB 701089), con una actividad de bsh incluso más elevada, reduce el nivel de colesterol y proporciona buenos resultados en estudios preclínicos y clínicos. Adicionalmente, la actividad de bsh se midió con el mismo ensayo de HPLC para TDCA y GDCA; sin embargo, la velocidad media se calculó para un periodo de 30 minutos. Esto proporciona una determinación precisa de la velocidad enzimática real, ya que la curva de desconjugación de xDCA es más lineal entre 0 y 30 minutos, y la reacción no está limitada por la baja disponibilidad de sustrato observada a tiempos más altos.
Los materiales y métodos son los mismos que en la sección de ensayo de HPLC descrita anteriormente.
Eficacia y seguridad de Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359) microencapsulada de elevada actividad de bsh en hámster sirio dorado F1B (Tabla 3)
Resultados
La Tabla 3 muestra el cambio porcentual final de lípidos respecto a los valores de control para hámsters F1B inducidos para ser hipercolesterolémicos y a los que se administró después por sonda nasogástrica Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359) microencapsuladas o libres. Aunque se producen reducciones similares del nivel de colesterol total entre grupos, hay una reducción incrementada del nivel de LDL-C, una menor reducción del de HDL-C, y una mejor eliminación de triglicéridos con el organismo libre en este modelo. Esto da como resultado una diferencia drástica en el índice aterogénico (IA) global y demuestra que aunque hay ventajas en la microencapsulación en términos de una mejor administración y supervivencia, también tiene ventajas la administración del organismo libre con elevada actividad de bsh, ya que se puede obtener un mejor perfil de lípidos.
Materiales y métodos
Se adquirió un total de 38 hámsters sirios dorados Bio F1B de 7-8 semanas de edad a Biobreeders, EE.UU. Tras la recepción, se dejó a los animales una semana de aclimatación. Los animales fueron alojados en jaulas individuales en una habitación con control de temperatura y humedad, y con un ciclo de luz-oscuridad invertido de doce horas, con alimento y agua disponibles ad libidum. Tras la aclimatación, los animales fueron pesados y se les extrajeron muestras de sangre para determinar el nivel de lípidos de línea base como se describe a continuación.
Se indujo hipercolesterolemia mediante cinco semanas de alimentación con la dieta de ensayo, que contenía un 0,05% de colesterol. Semanalmente se monitorizó el consumo de alimento y la ganancia de peso. Se tomaron muestras de sangre a las cuatro y cinco semanas de la inducción y se analizó el nivel de lípidos. Adicionalmente, se determinaron marcadores de seguridad antes de iniciar el tratamiento (cinco semanas de inducción). Se recogieron muestras fecales el último día del periodo de inducción y se determinó el contenido de ácido biliar.
Todos los animales que no presentaron hipercolesterolemia tras cinco semanas de alimentación con la dieta de inducción de hipercolesterolemia fueron excluidos (5 animales). Los animales estantes fueron asignados entonces a uno de los tres grupos de tratamiento mediante aleatorización en bloque basada en los niveles de LDL en suero, y se ajustaron para igualar el promedio de peso de cada grupo (n=11 para cada grupo). Tras la aleatorización, se administró a los animales el tratamiento mediante sonda nasogástrica durante seis semanas.
Durante el periodo de tratamiento se mantuvo la alimentación con la dieta de ensayo hipercolesterolémico. La ingesta de alimento y el peso fueron monitorizados semanalmente y se midieron los niveles de lípidos en sangre cada dos semanas. Tras seis semanas de tratamiento, se recogieron muestras fecales de punto final y los animales fueron sacrificados usando dióxido de carbono. Se extrajo sangre mediante punción cardiaca para análisis del nivel de lípidos de punto final, para los marcadores de seguridad y para hematología. Durante la necropsia, se tomaron los hígados de animales representativos de cada grupo para análisis histológico.
Eficacia y seguridad de yogur que contiene Lactobacillus reuteri (LabMet) microencapsulada de menor actividad de bsh para reducir el nivel de lípidos (Tabla 4)
Resultados
La Tabla 4 muestra el cambio porcentual en el nivel de lípidos en ayunas de sujetos medianamente hipercolesterolémicos en respuesta al consumo de Lactobacillus reuteri (LabMet) microencapsulada a lo largo de un periodo de tratamiento de 6 semanas. El resultado muestra algún cambio en el nivel de colesterol en suero respecto al control, con niveles reducidos de triglicéridos en suero.
Materiales y métodos
Este estudio examinó la eficacia de composiciones de yogur probiótico que contiene la Lactobacillus reuteri (LabMet) microencapsulada de menor actividad de bsh sobre los parámetros de salud relativos a enfermedad degenerativa en humanos.
Se anticipó que el consumo del producto probiótico induciría cambios favorables en los marcadores de riesgo para varias enfermedades debilitantes de edad creciente y que el consumo de probiótico alteraría favorablemente el nivel de lípidos frente a tratamientos convencionales en individuos hiperlipidémicos.
El diseño del estudio fue un ensayo multi fase/lavado, aleatorizado, doblemente ciego, controlado, en el que los sujetos recibieron yogures de control o yogures de ensayo a lo largo de un periodo de 6 semanas seguido de un periodo de lavado de 6 semanas antes de las siguientes fases.
Se aleatorizaron un total de 30 hombres y mujeres sanos, de 18-60 años de edad, con nivel de LDL-C en plasma de 130-260 mg/dL, niveles de TG inferiores a 400 mg/dL y un índice de masa corporal (IMC) de 22-32 kg/m2.
Se proporcionaron dietas metabólicas de composición conocida con precisión a los sujetos, bajo una estricta supervisión en una instalación de investigación clínica. Las dietas fueron nutricionalmente adecuadas y proporcionaron el 100% de los requerimientos energéticos. Adicionalmente, los sujetos recibieron un yogur de ensayo al día durante el periodo de tratamiento.
Se tomaron muestras de sangre en ayuno de 12 horas al principio y al final de las fases del ensayo. Las muestras de sangre obtenidas en el día 1 y 2 fueron usadas para medir los valores de línea base para las diferentes mediciones del estudio, mientras que las muestras de sangre obtenidas en los últimos días se usaron para medir los valores finales para los niveles de lípidos en suero.
Eficacia y seguridad de yogur que contiene Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359) microencapsulada de elevada actividad de bsh para reducir el nivel de lípidos (Tablas 5 y 6)
Resultados
Las Tablas 5 y 6 muestran el cambio porcentual en el nivel de lípidos en ayunas en sujetos hipercolesterolémicos en respuesta al consumo de Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359) de mayor actividad de bsh a lo largo de un periodo de tratamiento de 6 semanas. El resultado muestra reducciones significativas en el nivel de colesterol total y LDL, así como en ApoB, como se predeciría a partir de los valores de actividad de bsh (26,4 gmol de GDCA/gramo/hora y 182,6 gmol de TDCA/gramo/hora). Este brazo de estudio paralelo, aleatorizado, doblemente ciego, fue bien establecido y estuvo bien controlado; por tanto, cualquier reducción del nivel de colesterol fue debida al ingrediente probiótico.
Materiales y métodos
Este estudio examinó la eficacia de formulaciones de yogur probiótico que contiene Lactobacillus reuterí (NCIMB 701359) microencapsulada de elevada actividad de bsh sobre parámetros de salud relativos a enfermedades degenerativas en humanos.
El objetivo fue evaluar los efectos del consumo de una formulación de yogur que contiene Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359) de elevada actividad de hidrolasa de sal biliar (bsh) microencapsulada en alginato poli-L-lisina alginato (APA) sobre los niveles de lípidos en adultos hipercolesterolémicos y acceder a los cambios relativos de concentración de colesterol LDL en plasma en adultos hipercolesterolémicos tras 6 semanas de consumo del producto frente al producto de control.
El experimento implicó un ensayo controlado con placebo de brazo paralelo aleatorizado doblemente ciego multicéntrico (5 centros). Los sujetos recibieron instrucciones de seguir las recomendaciones dietarias de “Health Canada”, que tienen el objetivo de ayudar a reducir riesgos de obesidad y enfermedad cardiaca. La duración del estudio fue de 10 semanas, incluyendo un lavado de 2 semanas, periodos de preparación de 2 semanas y un periodo de tratamiento de 6 semanas. Durante el periodo de lavado, los sujetos siguieron solo instrucciones dietarias. Durante el periodo de preparación, se tomó placebo. El producto de tratamiento o de placebo se tomó durante el periodo de tratamiento completo.
Se aleatorizaron un total de 120 hombres y mujeres sanos con edades entre 18 y 74 años, con un nivel de colesterol LDL >3,4 mmol/L, y los niveles de TG <4,0 mmol/L, y un rango de IMC de 22-32 kg/m2 y se evaluaron 109 sujetos como pre-protocolo.
Se tomaron muestras de sangre en ayuno de doce horas al principio y al final del periodo de tratamiento. Las muestras de sangre obtenidas en el día 1 y 2 fueron usadas para medir los valores de línea base para las diferentes mediciones del estudio, mientras que las muestras de sangre obtenidas en los últimos días se usaron para medir los valores finales para los niveles de lípidos en suero.
Identificación de bacterias con elevada actividad de bsh (Figura 7 y Tabla 7)
Resultados
El ensayo de escrutinio de zona de precipitación de MRS-TDCA-placa muestra que, como método para determinar la actividad de bsh de TDCA, la placa está sin purificar y puede no ser suficiente para identificar probióticos candidatos para reducir el nivel de colesterol con una elevada actividad de bsh. Como puede observarse, los cultivos con mayor actividad de bsh tienen mayores zonas de precipitación; sin embargo, en los casos en los que el precipitado de DCA se concentra más densamente, el escrutinio con placas de TDCA solo no identifica los organismos con mayor actividad de bsh como candidatos potenciales. Por esta razón puede requerirse un ensayo con una mayor resolución, tal como un ensayo de HPLC, que cuantifique la actividad de bsh para glico- y tauroconjugados.
La Figura 7 muestra tres Lactobacillus reuteri con actividad de bsh cultivadas anaeróbicamente en un placa MRS-TDCA durante 24 horas. El tamaño de la zona de precipitación y la densidad de precipitación son claramente diferentes para cada organismo.
La Tabla 7 muestra el diámetro de precipitación (mm) de ácido desoxicólico (DCA) medido sobre placas MRS-TDCA después de 24 horas de crecimiento anaeróbico mediante discos de filtración impregnados con cultivo. Los valores son promedios de mediciones por triplicado en 3 placas MRS-TDCA de agar. La comparación de los resultados de la Tabla 7 con los de la Tabla 2 demuestra que el ensayo de zona de precipitación no siempre diferencia bacterias con elevada actividad de bsh como es evidente a partir del hecho de que la LR050 tiene una mayor zona de precipitación que la LR052, mientras que el HPLC demuestra que en realidad la LR052 tiene mayor actividad de bsh.
Materiales y métodos
Se cultivaron Lactobacillus durante una noche en medio MRS a 37°C. Se centrifugaron 500 pL de cada cultivo en un Eppendorf pesado previamente. Se retiró el sobrenadante y se pesaron las partículas. Las partículas fueron resuspendidas con MRS para conseguir la misma proporción 1:10 de p/v se añadieron 10 pL de cada cultivo a discos de filtración por duplicado sobre diferentes placas de agar MRS-TDCA. Las placas fueron incubadas anaeróbicamente a 37°C y se realizaron medidas.
Desconjugación de TDCA y GDCA por cepas libres de Lactobacillus reuteri (Figuras 8 y 9)
Resultados
Las Figuras 8 y 9 muestran la desconjugación de ácido taurodesoxicólico y ácido glicodesoxicólico, determinada mediante HPLC, en un ensayo in vitro usando 0,2 gramos de Lactobacillus reuteri libre (ATCC 55148, ATCC 55739, NCIMB 701359, NCIMB 701089, NCIMB 702655, LMG 18238, LMG 22877, LMG 22878, LMG 22879, CCUG 32271, CCUG 32305, CCUG 37470, CCUG 44001, CCUG 44144, CCUG 47824) con el tiempo. Los resultados muestran que las cepas ATCC 55148, NCIMB 701359, NCIMB 701089, NCIMB 702655, LMG 18238, CCUG 32271, CCUG 32305, CCUG 37470, CCUG 44001 y CCUG 44144 presentan particularmente una elevada actividad de bsh, determinada mediante HPLC.
Materiales y métodos
Bacterias y condiciones de cultivo
Las cepas de Lactobacillus reuteri fueron cultivadas en caldo esterilizado de Man, Rogosa, Sharpe (MRS) a 37°C durante 20 horas. Los cultivos fueron aislados por centrifugación y las bacterias recolectadas fueron usadas en el siguiente ensayo BSH.
Medición de la actividad BSH
Para medir la actividad BSH, las bacterias recolectadas se añadieron a un 100% de MRS suplementado con una combinación de glicodesoxicolato sódico y tauro desoxicolato sódico, ambos a 5 mM (0,2 g de células bacterianas/20 mL de MRS suplementado con GDCA y TDCA). A continuación las bacterias fueron incubadas en el caldo de reacción anaeróbicamente a 37°C con mínima agitación (100 rpm), y se tomaron muestras del sobrenadante a intervalos de 2,5 horas y se procesaron para determinar las concentraciones de sales biliares conjugadas. Resumidamente, se acidificaron muestras de 500 pL con 5 pL de HCl 6N tras eliminar las células bacterianas mediante centrifugación a 10000g durante 3 minutos. Los sobrenadantes fueron suplementados entonces con 500 pL de metanol que contenía GCA (ácido glicocólico) 4 mM como patrón interno. Las muestras fueron sometidas a vórtice durante 10 minutos y se centrifugaron a 1000g durante 15 minutos. Las muestras fueron filtradas a través de un filtro de 0,22 pm antes de ser analizadas mediante HPLC. El análisis de HPLC de las sales biliares siguió el procedimiento descrito por Jones et al. 2003.
Análisis de HPLC de sales biliares
El análisis de HPLC de sales biliares siguió el procedimiento descrito por Jones et al. 2003. El análisis se llevó a cabo en una columna C-18 de fase inversa: LiChrosorb RP-18, 5 pm, 250 x 4,6 mm. El sistema de HPLC consistió en dos módulos de suministro de disolvente ProStar 210, un detector UV-VIS ProStar 320, un autoinyector ProStar 410 y un sistema de datos cromatográficos Galaxie (versión 1.9.3.2). Se aplicó una mezcla de metanol y tampón de acetato sódico 50 mM ajustada a pH 4,3 con ácido o-fosfórico (70:30, v/v) como fase móvil con un caudal de 1,0 mL/min. El detector se fijó a 210 nm y todas las medidas se llevaron a cabo a temperatura ambiente.
Ejemplo 2 - Elevada actividad BSH
Materiales y métodos generales
Siembra y crecimiento bacterianos: las superficies de reservas bacterianas en glicerol congeladas fueron rascadas con un palo de madera esterilizado para rayar placas de agar MRS. Tras una incubación de una noche a 37°C en condiciones anaeróbicas, se seleccionó una única colonia de L. reuteri NCIMB 701359 con un lazo metálico en condiciones esterilizadas y se transfirió a un tubo que contenía 10 mL de MRS. Los cultivos fueron incubados durante una noche a 37°C para uso experimental.
Microencapsulación de L. reuteri NCIMB 701359: se prepararon microcápsulas con un 8% de carga celular y un 1,75% de concentración de alginato usando una boquilla de 200 pm. El proceso de recubrimiento fue el siguiente: en primer lugar, las partículas de alginato fueron drenadas de CaCb; en segundo lugar, las partículas de alginato fueron lavadas en NaCl al 0,85% (p/v) durante 10 minutos; en tercer lugar, las partículas de alginato fueron recubiertas en s-PLL al 0,1% (p/v) durante 20 minutos; en cuarto lugar, las microcápsulas alginato-PLL fueron lavadas con NaCl al 0,85% (p/v) durante 10 minutos; en quinto lugar, las microcápsulas de alginato-PLL fueron recubiertas con alginato al 0,1% (p/v) durante 20 minutos; y finalmente las microcápsulas de alginato-PLL-alginato fueron lavadas con NaCl al 0,85% (p/v) durante 10 minutos.
Ensayo BSH para células libres congeladas y liofilizadas: células libres congeladas fueron descongeladas, centrifugadas y lavadas, y se añadieron (0,05 g) a 20 mL de MRS que contenía TDCA 5 mM y GDCA 5 mM. Las células libres liofilizadas se añadieron (0,15 g) a 20 mL de MRS que contenía TDCA 5 mM y GDCA 5 mM. Las muestras fueron sacadas después de 30 minutos y se analizaron con HPLC. Los controles fueron medio solo y microcápsulas recién preparadas cultivadas en MRS.
Ensayo BSH para microcápsulas: microcápsulas descongeladas y lavadas (muestra entre 0,3 g y 2,5 g, dependiendo de la actividad relativa) fueron añadidas a 20 mL de MRS que contenía TDCA 5 mM y GDCA 5 mM. Se sacaron muestras después de 30 minutos y se analizaron con HPLC. Los controles fueron medio solo y microcápsulas recién preparadas cultivadas en MRS. 0,3 g de microcápsulas contenían 0,03 g de partícula de células libres.
Ensayo de HPLC para actividad BSH: los análisis se llevaron a cabo en una columna C-18 de fase inversa (LiChrosorb RP-18250 mm x 4,6 mm, 5 pm) con un caudal de 1,0 mL/min. La fase móvil era una mezcla de metanol y tampón de acetato sódico 50 mM (pH 4,3 ajustado con ácido o-fosfórico) en una proporción de 70:30 y la detección se midió a 210 nm. La actividad de bsh se evaluó a través de la cantidad de GDCA y TDCA desconjugados en las muestras por hora y gramo de microcápulas.
A. Actividad de bsh mejorada mediante fermentación (Tablas 8-10)
Materiales y métodos
Aumento de la actividad de bsh en base a las fuentes de carbono y nitrógeno: se cultivaron células de Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 mediante el método general descrito anteriormente. Se inoculó un 1% de L. reuteri NCIMB 701359 en medio MRS modificado con diferentes fuentes de carbono y nitrógeno. Los cultivos inoculados fueron incubados a 37°C durante 24 h. Tras el periodo de incubación, se añadió 0,05 g ó 0,1 g de partícula de células a 20 mL de MRS que contenía TDCA 5 mM y GDCA 5 mM. Se retiraron muestras después de 0,5 h y 1,5 h, y se analizaron mediante HPLC. Se usó MRS como medio de crecimiento de control. Los análisis se llevaron a cabo mediante HPLC como se ha descrito en los métodos generales anteriormente.
Aumento de la actividad de bsh en base al pH y al tiempo de recolección: se cultivaron células de Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 mediante el método general descrito anteriormente. Se inoculó un 1% de L. reuteri NCIMB 701359 en medio MRS modificado con diferentes fuentes de carbono y nitrógeno, y se ajustó el pH a pH 5, 6 y 6,8 mediante la adición de NaOH o HCl. Los cultivos inoculados a diferentes condiciones de pH fueron incubados a 37°C para tiempos de recolección de 12h a 48h. Tras el periodo de incubación, se añadió 0,05 g ó 0,1 g de partícula de célula a 20 mL de MRS que contenía TDCA 5 mM y GDCA 5 mM. Las muestras se retiraron tras 0,5 h y 1,5 h, y se analizaron con HPLC como se ha descrito en los métodos generales anteriormente. Los controles se cultivaron en medio MRS no modificado.
Resultados
Los resultados más favorables a partir de una fuente de carbono para Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 fermentada en MRS modificado, que incrementan la actividad de bsh y el rendimiento, fueron con maltosa. El GDCA y TDCA se desconjugaron a velocidades de 2.253 (gmol/g/h) y 173 (gmol/g/h) respectivamente y se mantuvo un rendimiento de 0,015 g/mL (Tabla 8). Los resultados más favorables a partir de una fuente de nitrógeno para Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 fermentada con esta fuente de carbono (maltosa) y buscando incrementar la desconjugación de GDCA (gmol/g/h), la desconjugación de TDCA (gmol/g/h) (HPLC), y el rendimiento (g/mL) fueron con una combinación de peptona n° 3, extracto de levadura, extracto de malta y cisteína. El GDCA y TDCA se desconjugaron a velocidades de 21.185 (gmol/g/h) y 2.323 (gmol/g/h) respectivamente y se mantuvo un rendimiento de 0,013 g/mL (Tabla 9). Los resultados más favorables para el tiempo de recolección y el pH inicial para Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 fermentada en el medio comentado anteriormente (maltosa peptona n° 3 extracto de levadura extracto de malta cisteína) o MRS, buscando incrementar la desconjugación de GDCA (gmol/g/h), la desconjugación de TDCA (gmol/g/h) (HPLC), y el rendimiento (g/mL) fueron para un pH de 5 y un tiempo de recolección de 12-20 horas (Tabla 10).
Estos resultados muestran que las condiciones que incluyen fuentes de carbono y nitrógeno, pH y tiempo de recolección alcanzan una elevada actividad de bsh y un elevado rendimiento celular con Lactobacillus reuteri NCIMB 701359; estas condiciones producen un producto de elevada actividad, que mantiene niveles elevados de bsh durante el almacenamiento en formato de alimento funcional o suplemento alimenticio, y que es económicamente viable para producción comercial. Estos datos demuestran que las células probióticas con maquinaria productora de bsh son fermentadas fácilmente con un medio y unas condiciones definidas para alcanzar niveles terapéuticos de actividad enzimática y niveles de biomasa comercialmente viables. Este proceso es útil para preparar probióticos con actividad de bsh viables comercialmente para reducir el nivel de lípidos y para otras aplicaciones.
B. Actividad de bsh mejorada por liofilización (Tabla 11 y Figura 10)
Materiales y métodos
Condiciones de almacenamiento de liofilización para elevada actividad BSH: se prepararon microcápsulas que contenían Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 mediante el método general descrito anteriormente. Las microcápsulas fueron almacenadas con una proporción de 7:3 de microcápsulas a disolución lioprotectora como se indica a continuación: trehalosa 1M, 10% de maltodextrina, 1% de inulina, 10% de maltodextrina y 0,33% de extracto de levadura, trehalosa 1M y 0,33% de extracto de levadura, 1% de inulina y 0,33% de extracto de levadura, 10% de maltodextrina y 1% de hidrolisato de caseína, y 10% de leche desnatada. Se liofilizaron suspensiones que contenían las microcápsulas y disolución lioprotectora y se almacenaron a 4°C durante 0, 1,2, 3, 4, 5 y 6 semanas en alícuotas individuales. Para cada tiempo, muestras duplicadas de microcápsulas liofilizadas que contenían todas lioprotector fueron rehidratadas con salino. Se usó el ensayo de bsh para microcápsulas descrito anteriormente para preparar las muestras para análisis mediante HPLC empleando el método general anterior.
Se preparó Lactobacilluls reuteri NCIMB 701359 libre mediante el método general descrito anteriormente. Se añadieron lioprotectores a la suspensión de células libres a una concentración final de: 10% de maltodextrina y 0,33% de extracto de levadura. Las suspensiones fueron liofilizadas y almacenadas a 4°C ó a temperatura ambiente durante 0, 1, 2 y 3 meses en alícuotas individuales. Para cada tiempo, muestras duplicadas de células liofilizadas que contenían todas lioprotector fueron rehidratadas con salino. Se usó el ensayo de bsh para material liofilizado descrito anteriormente para preparar las muestras para análisis mediante HPLC empleando el método general anterior.
Resultados
Los resultados más favorables a partir de un lioprotector para Lactobacillus reuteri NCIMB 701359, que aumenta la actividad de bsh, fueron con un 10% de maltodextrina y un 0,33% de extracto de levadura, un 1% de inulina y un 0,33% de extracto de levadura, y con un 1% de inulina (Tabla 11).
Estos resultados demuestran que los lioprotectores mantienen una elevada actividad de bsh para Lactobacillus reuteri NCIMB 701359; el lioprotector mantiene la morfología de las microcápsulas tras rehidratación (Figura 10), mantiene niveles elevados de bsh durante el almacenamiento en formato de alimento funcional o suplemento alimenticio, y es económicamente viable para producción comercial. Estos datos demuestran que las células probióticas libres o microencapsuladas con maquinaria productora de bsh son liofilizadas fácilmente con lioprotectores para mantener niveles terapéuticos de actividad enzimática. Este proceso es útil para preparar probióticos liofilizados con actividad bsh comercialmente viables para reducir el nivel de lípidos y para otras aplicaciones.
C Actividad de bsh mejorada por almacenamiento líquido (Tabla 12)
Materiales y métodos
Condiciones de almacenamiento en líquido para actividad BSH: se prepararon microcápsulas que contenían Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 mediante el método general descrito anteriormente. Las microcápsulas fueron almacenadas en una proporción de 1:1 de microcápsulas a disoluciones conservadoras como se indica a continuación: 5% de medio de crecimiento, 10% de medio de crecimiento, 20% de medio de crecimiento, 10% de medio MRS, yogur, sobrenadante de cultivo, 1% de maltosa, 0,85% de salino, 1% de extracto de malta, 1% de inulina, 10% de sorbitol, 0,33% de extracto de levadura, 1% de inulina y 0,33% de extracto de levadura y fructosa 1M. Las microcápsulas resultantes fueron almacenadas en disoluciones conservantes a 4 grados para almacenamiento a un plazo corto de 4 días en alícuotas individuales. Se extrajeron del medio de almacenamiento muestras duplicadas de microcápsulas que contenían la disolución conservante y se lavaron con salino. Se usó el ensayo de bsh para microcápsulas descrito anteriormente para preparar las muestras para análisis de HPLC mediante el método general anterior.
Resultados
Los resultados más favorables a partir de una condición de almacenamiento líquido para Lactobacillus reuteri NCIMB 701359, considerando la actividad de bsh tras 4 días de almacenamiento líquido, fueron con yogur (1:1), 5% de medio de crecimiento (1:1), 10% de medio de crecimiento, 20% de medio de crecimiento (1:1), sobrenadante de cultivo (1:1) y 10% de MRS (1:1) (Tabla 12).
Estos resultados demuestran que las condiciones de almacenamiento líquido mantienen la elevada actividad de bsh de la Lactobacillus reuteri NCIMB 701359; que estas condiciones dan como resultado la producción de un producto altamente activo, que mantiene niveles de bsh elevados durante el almacenamiento líquido temporal, y que es económicamente viable para usarse en un proceso comercial. Estos datos demuestran que determinadas condiciones de almacenamiento específicas son beneficiosas para el almacenamiento en medio líquido a fin de alcanzar niveles terapéuticos de actividad enzimática. Este proceso es útil para mantener la actividad de bsh durante el almacenamiento a corto plazo, y hace que el proceso de producción sea viable comercialmente para producir probióticos con actividad de bsh para reducir el nivel de lípidos y para otras aplicaciones terapéuticas en enfermedades metabólicas.
D Actividad de bsh mejorada por congelación espontánea (Tabla 13)
Materiales y métodos
Condiciones de almacenamiento por congelación espontánea para actividad de bsh: se prepararon microcápsulas que contenían Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 mediante el método general anterior. Las microcápsulas fueron almacenadas en una proporción de 1:1 de microcápsulas a disolución crioprotectora como se indica a continuación: trehalosa 1M, fructosa 1M, 1% de inulina, maltosa 1M, sacarosa 1M, 10% de PEG 8000, 0,85% de salino, 10% de leche desnatada, 10% de almidón o 10% de fructooligosacáridos. Las suspensiones que contenían las microcápsulas y la disolución crioprotectora se hicieron pasar lentamente a través de una jeringa esterilizada para formar gotitas esféricas que fueron suspendidas en nitrógeno líquido. Las partículas congeladas espontáneamente resultantes fueron aisladas del nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C en alícuotas individuales. Inmediatamente y después de 3 semanas de almacenamiento, se tomaron muestras duplicadas de microcápsulas en partículas que contenían disolución crioprotectora del medio de almacenamiento y se lavaron con salino. Se usó el ensayo de bsh para microcápsulas descrito anteriormente para preparar las muestras para el análisis de HPLC descrito anteriormente en los métodos generales.
Se prepararon Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 libres mediante el método general anterior. La partícula de células libres se re-suspendió en medio agotado con una proporción 1:1 de células a medio agotado. La suspensión celular resultante se hizo pasar lentamente a través de una jeringa esterilizada para formar gotitas esféricas que fueron suspendidas en nitrógeno líquido. Las partículas congeladas espontáneamente resultantes fueron aisladas del nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Del medio de almacenamiento se retiraron muestras duplicadas de células en partículas que contenían disolución crioprotectora de medio agotado. Se usó el ensayo de bsh para células libres descrito anteriormente para preparar las muestras para el análisis de HPLC descrito anteriormente en los métodos generales.
Resultados
Los resultados más favorables a partir de medio crioconservante para Lactobacillus reuteri NCIMB 701359, congeladas espontáneamente en nitrógeno líquido, cuando se considera la morfología de la cápsula y/o el % de actividad de bsh remanente inmediatamente post-congelación espontánea y a las 3 semanas, incluyeron 1:1 de bacterias libres o microencapsuladas a disolución crioconservante con maltodextrina y extracto de levadura, inulina, trehalosa, fructosa, sacarosa, lactosa, maltosa y medio agotado a las concentraciones indicadas (Tabla 13).
Estos resultados demuestran que las condiciones de crioconservación en congelación espontánea en nitrógeno líquido para almacenamiento en congelación alcanzan una elevada actividad de bsh y una buena morfología de microcápsula con Lactobacillus reuteri NCIMB 701359; lo que permite la producción de un producto con niveles elevados de bsh a lo largo de un almacenamiento extendido en formato de alimento funcional o suplemento alimenticio, y que es económicamente viable para la producción comercial. Estos datos demuestran que las células probióticas libres o microencapsuladas con elevada actividad de bsh se preparan fácilmente en diversas condiciones crioconservadoras y que la congelación espontánea en nitrógeno líquido alcanza niveles terapéuticos de actividad enzimática, así como una excelente morfología de microcápsula. Este proceso es útil para preparar probióticos con actividad de bsh comercialmente viables para reducir el nivel de lípidos y para otras aplicaciones.
Aunque la presente descripción ha sido descrita en referencia a lo que actualmente se considera que son los ejemplos preferidos, debe entenderse que la descripción no está limitada por los ejemplos incluidos. Al contrario, la descripción pretende cubrir las diversas modificaciones y disposiciones equivalentes incluidas dentro del espíritu y el alcance de las reivindicaciones acompañantes.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente se incorporan plenamente a la presente memoria a modo de referencia, en la misma extensión que si cada publicación, patente o solicitud de patente individual estuviera específica e individualmente indicada para ser incorporada plenamente a modo de referencia.
Tabla 1: Dos ecuaciones usadas habitualmente para determinar el índice aterogénico (IA), que representa el riesgo aterogénico, y que se usan como indicadores prognósticos en pacientes en riesgo de desarrollar aterosclerosis.
Figure imgf000023_0002
Tabla 2: La actividad BSH de Lactobacillus reuteri libre determinada mediante HPLC se muestra en gmol de DCA por gramo y hora (gmol de DCA/g/h). Ácido taurodesoxicólico = TDCA, Ácido glicodesoxicólico = GDCA, Ácido desoxicólico = DCA.
Figure imgf000023_0001
Tabla 3: Se muestran los valores finales de nivel de lípidos (% de cambio respecto al control) correspondientes a hámsters F1B inducidos para ser hipercolesterolémicos (0,5% de colesterol en dieta) (5 semanas) y tratados después (6 semanas) mediante sonda nasogástrica con Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359) microencapsulada o libre (n=33).
Figure imgf000024_0001
Tabla 4: Cambio porcentual en los niveles de lípidos en ayunas (sobre el control) en sujetos humanos moderadamente hipercolesterolémicos en respuesta al consumo de Lactobacillus reuteri (LabMet) microencapsulada en APA de baja actividad de bsh en un periodo de tratamiento de 6 semanas (n=30, siguiendo el protocolo).
Figure imgf000024_0003
Tabla 5: Se proporcionan los niveles de lípidos en ayunas, como diferencia porcentual respecto al placebo, en sujetos humanos moderadamente hipercolesterolémicos en respuesta al consumo de Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359) microencapsulada de elevada actividad de bsh en un periodo de tratamiento de 6 semanas (n=109, siguiendo el protocolo).
Figure imgf000024_0002
Tabla 6: Se proporcionan los niveles de lípidos en ayunas, como diferencia porcentual respecto al placebo, en sujetos humanos hipercolesterolémicos, con un riesgo elevado y un riesgo muy elevado, en respuesta al consumo de Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359) microencapsulada en APA de elevada actividad de bsh en un periodo de tratamiento de 6 semanas (n=65).
Figure imgf000024_0004
Figure imgf000025_0002
Tabla 7: Diámetro de precipitación (mm) de ácido desoxicólico (DCA) medido sobre placas de MRS-TDCA tras 24 horas de crecimiento anaeróbico mediante discos de filtración impregnados con cultivo. Los valores son promedios de medidas por triplicado en 3 placas de agar de MRS-TDCA.
Figure imgf000025_0003
Tabla 8: Resultados experimentales para determinar la fuente de carbono para incrementar la desconjugación de GDCA (pmol/g/h), la desconjugación de TDCA (pmol/g/h) (HPLC), y el rendimiento (g/mL) para Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 fermentada en MRS modificado (extracto de levadura extracto de vacuno peptona n° 3) con diferentes fuentes de carbono.
Figure imgf000025_0001
Tabla 9: Resultados experimentales para determinar la fuente de nitrógeno para incrementar la desconjugación de GDCA (pmol/g/h), la desconjugación de TDCA (pmol/g/h) (HPLC), y el rendimiento (g/mL) para Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 fermentada en la fuente de carbono (maltosa) con diferentes fuentes de nitrógeno.
Figure imgf000026_0001
Tabla 10: Resultados experimentales para determinar el tiempo de recolección y el pH inicial para incrementar la desconjugación de GDCA (pmol/g/h), la desconjugación de TDCA (pmol/g/h) (HPLC), y el rendimiento (g/mL) para Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 fermentada con medio de crecimiento (maltosa peptona n° 3 extracto de levadura cisteína) o medio MRS a diferentes valores de pH inicial y a diferentes tiempos de recolección.
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000027_0001
Tabla 11: Resultados experimentales para lioprotectores, en una proporción 7:3 de microcápsulas a disolución lioprotectora, y % de la actividad original de bsh para Lactobacillus reuteri NCIMB 701359 a valores promedio para 2 y 3, así como para 5 y 6 semanas.
Figure imgf000027_0002
Tabla 12: Resultados experimentales para condiciones de almacenamiento líquido en base a la actividad de bsh (% del original) a 4 días.5
Figure imgf000028_0001
Tabla 13: Resultados experimentales para disolución crioconservadora, cuando se congela espontáneamente y se almacena a -802C, para microcápsulas de Lactobacillus reuteri NCIMB 701359, determinados mediante microscopía para morfología de microcápsula (% de calidad original) y HPLC para actividad de bsh (% de actividad original), datos inmediatamente después de congelación espontánea en nitrógeno líquido y después de 3 semanas de almacenamiento a -80°C.
Figure imgf000029_0001
LISTA DE REFERENCIAS
Angulo, P. "Nonalcoholic fatty liver disease", N. Engl. J. Med. 346, 1221 (2002).
Aso, Y. et al., "Preventive Effect of A Lactobacillus-Casei Preparation on the Recurrence of Superficial Bladder-Cancer in A Double-Blind Trial", European Urology 27(2), 104 (1995).
Chang, T.M.S. Semipermeable microcapsules. Science 146, 524-525 (1964).
Chang, T.M. & Prakash, S. Artificial cells for bioencapsulation of cells and genetically engineered E. coli. For cell therapy, gene therapy, and removal of urea and ammonia. Methods Mol. Biol. 63, 343-358 (1997).
Chang, T.M. & Prakash, S. Therapeutic uses of microencapsulated genetically engineered cells. Mol. Med. Today 4, 221-227 (1998).
Dobrogosz, W.J. "Enhancement of human health with Lactobacillus reuteri: A probiotic, immunobiotic and immunoprobiotic", NUTRAfoods 4, 15 (2005).
Ford, E.S. et al. Pevalence of metabolic syndrome among US adults: findings from the third Nationa1Health and Nutrition Examination Survey. JAMA 287(3):356 (2002).
Gaist, D. et al., "Lipid-lowering drugs and risk of myopathy: A population based follow-up study", 12(5), 565 (2001). Gaist, D. et al., "Statins and risk of polyneuropathy - A case-control study", 58(9), 1333 (2002).
Goldenberg, I., M. Benderly, y U. Goldbourt, "Update on the use of fibrates: focus on bezafibrate", 4(1), 131 (2008). Hallikainen, M. A. y M. I. J. Uusitupa, "Effects of 2 low-fat stanol ester-containing margarines on serum cholesterol concentrations as part of a low-fat diet in hypercholesterolemic subjects”, 69(3), 403 (1999).
Huang, J.S. et al., "Efficacy of probiotic use in acute diarrhea in children: a meta-analysis", Dig. Dis. Sci. 47(11), 2625 (2002).
Jenkins, D. J. A. et al., "The effect on serum lipids and oxidized low-density lipoprotein of supplementing self-selected low-fat diets with soluble-fiber, soy, and vegetable protein foods", 49(1), 67 (2000).
Jones et al. "Method for Bile Acid Determination by High Performance Liquid Chromatography". J Med Sci 2003; 23(5): 277-280.
Lodinova-Zadnikova, R. y U. Sonnenborn, "Effect of preventive administration of a nonpathogenic Escherichia coli strain on the colonization of the intestine with microbial pathogens in newborn infants", Biol. Neonate 71(4), 224 (1997).
Lopez-Garcia, E. "Consumption of Trans Fatty Acids Is Related to Plasma Biomarkers of Inflammation and Endothelial Dysfunction". The Journal of Nutrition 135 (3): 562 (2005).
McIntosh, G. H., P. J. Royle, y M. J. Playne, "A probiotic strain of L. acidophilus reduces DMH-induced large intestinal tumors in male Sprague-Dawley rats", Nutr. Cancer 35(2), 153 (1999).
Omar, M. A. y J. P. Wilson, "FDA adverse event reports on statin-associated rhabdomyolysis", 36(2), 288 (2002). Ornish, D. et al., "Can Life-Style Changes Reverse Coronary Heart-Disease", 336(8708), 129 (1990).
Pedersen, T. R. et al., "Randomized Trial of Cholesterol-Lowering in 4444 Patients with Coronary-Heart-Disease - the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S)", 344(8934), 1383 (1994).
Pepys, M.B. et al.,"Targeting C-reactive protein for the treatment of cardiovascular disease". Nature 440: 1217 (2006).
Prakash, S. y Jones M.L. Engineering Artificial Cells for Therapy. 7-22-2002. Sarawak, Malaysia, 2nd World Engineering Congress. Ref Type: Conference Proceeding
Prakash, S. y Urbanska A.M. (2007). Fermented milk product and uses thereof. WO 2007/140613.
Probstfield, J. L. y B. M. Rifkind, "The Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial: design, results, and implications", 40 Suppl 1, S69-S75 (1991).
Rayes, N. et al., "Early enteral supply of lactobacillus and fiber versus selective bowel decontamination: a controlled trial in liver transplant recipients", Transplantation 74(1), 123 (2002).
Scalia. "Simultaneous determination of free and conjugated bile acids in human gastric juice by HPLC". J of Chrom, 431 (1988) 259-269.
Sgro, C. y A. Escousse, "Side-Effects of Hypolipidemic Drugs", 46(5), 351 (1991).
Staffa, J. A., J. Chang, y L. Green, "Cerivastatin and reports of fatal rhabdomyolysis", 346(7), 539 (2002).
Szajewska, H. et al., "Efficacy of Lactobacillus GG in prevention of nosocomial diarrhea in infants", J. Pediatr. 138(3), 361 (2001).
Tabas, K. J. Williams, y J. Boren, "Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis -Update and therapeutic implications", 116 (16), 1832 (2007).
Tall, A. R. "An overview of reverse cholesterol transport", 19 Suppl A, A31-A35 (1998).
"Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) final report," 106(25), 3143 (2002).
Tobias, P.S., L.K. Curtiss, "Toll-like receptors in atherosclerosis", Biochem Soc Trans. 35(6) 1453 (2007).
Uludag, H., De Vos, P., & Tresco, P.A. Technology of mammalian cell encapsulation. Adv. Drug Deliv. Rev. 42, 29-64 (2000).
Urbanska A.M., Bhathena J., Martoni C., Prakash S. "Estimation of the Potential Antitumor Activity of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus Yogurt Formulation in the Attenuation of Tumorigenesis in Apc(Min/+) Mice". Dig. Dis. Sci. (2009) 54: 264-273.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición oral que comprende una bacteria con elevada actividad BSH, en donde la bacteria de elevada actividad BSH degrada >2000 pmol de GDCA/g/h y >500 pmol de TDCA/g/h cuando se determina a los 30 minutos, u opcionalmente >15000 pmol de GDCA/g/h y >2000 pmol de TDCA/g/h cuando se determina a los 30 minutos, en donde la elevada actividad de BSH resulta de las condiciones de fermentación que favorecen el desarrollo de la elevada actividad BSH.
2. La composición oral de la reivindicación 1, en donde la bacteria es Lactobacillus, Bifidobacteria, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus o Leuconostoc, en donde la Lactobacillus es opcionalmente Lactobacillus reuteri, opcionalmente Lactobacillus reuteri (NCIMB 701359), Lactobacillus reuteri (NCIMB 701089), Lactobacillus reuteri (ATCC 55148), Lactobacillus reuteri (ATCC 23272), Lactobacillus reuteri (NCIMB 702655), Lactobacillus reuteri (LMG 18238), Lactobacillus reuteri (CCUG 32271), Lactobacillus reuteri (CCUG 32305), Lactobacillus reuteri (CCUG 37470), Lactobacillus reuteri (CCUG 44001) o Lactobacillus reuteri (CCUG 44144).
3. La composición oral de la reivindicación 1 ó 2, en donde las bacterias de elevada actividad BSH son cultivadas en condiciones de fermentación que comprenden una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, un pH de 4-7 y un tiempo de recolección de 12 a 24 horas, opcionalmente 12-16 horas, y en donde la concentración de bacterias es opcionalmente 106 - 1012 CFU/gramo; en donde la fuente de carbono comprende opcionalmente maltosa, sacarosa, dextrina, una combinación de sorbitol y glucosa, o una combinación de inulina y glucosa; y en donde la fuente de nitrógeno comprende opcionalmente (i) extracto de levadura y extracto de malta, extracto de levadura y extracto bovino o hidrolisato de caseína y extracto de malta; y (ii) peptona, opcionalmente peptona n° 3, o triptona.
4. La composición oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la bacteria está inmovilizada en un polímero, que comprende opcionalmente alginato, chitosán, agarosa, pectina, agaropectina, genipina o celulosa; o están encapsuladas en microcápsulas o nanocápsulas poliméricas semi-permeables, en donde la microcápsula o nanocápsula comprende opcionalmente membranas de Alginato/Poli-L-lisina/Alginato (APA), Alginato/Chitosán/Alginato (ACA), Alginato/Genipina/Alginato (AGA), Alginato/Poli-L-lisina/Pectina/Poli-L-lisina/Alginato (APPPA), Alginato/Poli-L-lisina/Pectina/Poli-L-lisina/Pectina (APPPP), Alginato/Poli-L-lisina/Chitosán/Poli-L-lisina/Alginato (APCPA), alginato-polimetileno-co-guanidina-alginato (A-PMCG-A), hidroximetilacrilato-metil metacrilato (HEMA-MMA), HEMA-MMA-MAA multicapa, poliacrilonitrilovinilcloruro (PAN-PVC), acrilonitrilo/metalilsulfonato sódico (AN-69), polietilen glicol/poli pentametilciclopentasiloxano/polidimetilsiloxano (PEG/PD5/PDMS) o poli N,N-dimetil acrilamida (PDMAAm).
5. La composición oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composición está liofilizada, secada por calor, secada por pulverización, preparada húmeda o congelada espontáneamente en una disolución crioprotectora.
6. La composición oral de la reivindicación 5, en donde la composición está liofilizada con lioprotectores que comprende (a) 0,2 a 10% de maltodextrina y 0,05 a 0,33% de extracto de levadura, (b) de 0,05 a 2,5% de inulina y de 0,05 a 0,1% de extracto de levadura, o (c) 0,3% de inulina.
7. La composición oral de la reivindicación 5, en donde la composición se almacena en líquido, en donde las condiciones de almacenamiento líquido comprenden una disolución conservante final que comprende 2,5-10% de medio de crecimiento, 50-99,99% de yogur u otro lácteo fermentado, 50-99,99% de sobrenadante de cultivo o 5% de disolución de MRS.
8. La composición oral de la reivindicación 5, en donde la disolución crioprotectora comprende una concentración final de (a) 0,2-10% de maltodextrina y 0,05 a 0,33% de extracto de levadura, (b) de 0,05 a 2,5% de inulina, (c) Trehalosa 0,5M, (d) fructosa 0,5M, (e) lactosa 0,5M, (f) maltosa 0,5M o (g) 50-99.99% de medio agotado.
9. La composición oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, que comprende además un vehículo, en donde el vehículo comprende opcionalmente un suplemento, producto alimenticio, bebida, alimento funcional, sustancia nutracéutica, cápsula, píldora, cápsula de gel, líquido o película disoluble.
10. La composición oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para uso en la reducción del nivel de colesterol en suero de un animal.
11. La composición oral de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para uso en la profilaxis o el tratamiento de la aterosclerosis o de un trastorno degenerativo provocado por la aterosclerosis en un animal.
12. Un proceso para preparar una bacteria con elevada actividad BSH como se ha definido en la reivindicación 1, que comprende cultivar la bacteria productora de BSH en un medio que comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, y un pH de 4 a 7, y recolectar las bacterias después de 12 a 24 horas, opcionalmente 12-16 horas, en donde el medio comprende además cisteína; en donde la fuente de carbono comprende maltosa, sacarosa, dextrina, una combinación de sorbitol y glucosa o una combinación de inulina y glucosa; y en donde la fuente de nitrógeno comprende (i) extracto de levadura y extracto de malta, extracto de levadura y extracto vacuno, o hidrolisato de caseína y extracto de malta; y (ii) peptona, opcionalmente peptona n° 3, o triptona.
13. El proceso de la reivindicación 12, que además comprende liofilizar la bacteria libre o microencapsulada con lioprotectores, en donde los lioprotectores comprenden (a) de 0,2 a 10% de maltodextrina y de 0,05 a 0,33% de extracto de levadura, (b) de 0,05 a 2,5% de inulina y de 0,05 a 0,1% de extracto de levadura, o (c) 0,3% de inulina.
14. El proceso de la reivindicación 12, que además comprende almacenar la bacteria de elevada actividad BSH libre o microencapsulada en condiciones de almacenamiento líquido, en donde las condiciones de almacenamiento líquido comprenden una disolución conservante final que comprende 2,5-10% de medio de crecimiento, 50-99,99% de yogur u otro lácteo fermentado, 50-99,99% de sobrenadante de cultivo o 5% de disolución MRS.
15. El proceso de la reivindicación 12, que además comprende congelar espontáneamente la composición y la disolución crioprotectora a al menos -80 grados Celsius, en donde la disolución crioprotectora comprende una concentración final de (a) 0,2-10% de maltodextrina y de 0,05 a 0,33% de extracto de levadura, (b) de 0,05 a 2,5% de inulina, (c) Trehalosa 0,5M, (d) fructosa 0,5M, (d) lactosa 0,5M, (f) maltosa 0,5M o (g) 50-99,99% de medio agotado.
ES10769192T 2009-05-01 2010-04-30 Composiciones bacterianas para profilaxis y tratamiento de enfermedades degenerativas Active ES2578081T5 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17474009P 2009-05-01 2009-05-01
US174740P 2009-05-01
PCT/CA2010/000660 WO2010124387A1 (en) 2009-05-01 2010-04-30 Bacterial compositions for prophylaxis and treatment of degenerative disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2578081T3 ES2578081T3 (es) 2016-07-20
ES2578081T5 true ES2578081T5 (es) 2019-10-16

Family

ID=43031618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10769192T Active ES2578081T5 (es) 2009-05-01 2010-04-30 Composiciones bacterianas para profilaxis y tratamiento de enfermedades degenerativas

Country Status (14)

Country Link
US (1) US10660857B2 (es)
EP (2) EP3067056A1 (es)
JP (2) JP6100526B2 (es)
KR (1) KR20120015335A (es)
CN (1) CN102481322A (es)
AU (1) AU2010242498A1 (es)
BR (1) BRPI1009920A2 (es)
CA (1) CA2796929C (es)
DK (1) DK2419114T4 (es)
ES (1) ES2578081T5 (es)
HR (1) HRP20160598T4 (es)
PL (1) PL2419114T5 (es)
RU (1) RU2571211C2 (es)
WO (1) WO2010124387A1 (es)

Families Citing this family (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2578081T5 (es) 2009-05-01 2019-10-16 Uas Laboratories Llc Composiciones bacterianas para profilaxis y tratamiento de enfermedades degenerativas
WO2011146981A1 (en) * 2010-05-24 2011-12-01 Ozstar Therapeutics Pty Ltd Anti-diabetic compositions and methods
KR101873193B1 (ko) 2010-06-08 2018-07-02 아사히 그룹 홀딩스 가부시키가이샤 지질 대사 개선제
TWI355939B (en) * 2011-01-14 2012-01-11 Genmont Biotech Inc Composition and use of probiotic strain gm-263 (ad
US10548761B2 (en) 2011-02-04 2020-02-04 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of colorectal cancer in a human being
US12533312B2 (en) 2011-02-04 2026-01-27 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US10086018B2 (en) 2011-02-04 2018-10-02 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of colorectal cancer in a human being
US10512661B2 (en) 2011-02-04 2019-12-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US10245288B2 (en) 2011-02-04 2019-04-02 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing NASH in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US11419903B2 (en) 2015-11-30 2022-08-23 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US11523934B2 (en) 2011-02-04 2022-12-13 Seed Health, Inc. Method and system to facilitate the growth of desired bacteria in a human's mouth
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US12279989B2 (en) 2011-02-04 2025-04-22 Seed Health, Inc. Method and system for increasing beneficial bacteria and decreasing pathogenic bacteria in the oral cavity
US10842834B2 (en) 2016-01-06 2020-11-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US10687975B2 (en) 2011-02-04 2020-06-23 Joseph E. Kovarik Method and system to facilitate the growth of desired bacteria in a human's mouth
US9987224B2 (en) 2011-02-04 2018-06-05 Joseph E. Kovarik Method and system for preventing migraine headaches, cluster headaches and dizziness
US11273187B2 (en) 2015-11-30 2022-03-15 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US12257272B2 (en) 2015-12-24 2025-03-25 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
WO2013027087A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-28 Compagnie Gervais Danone A non-reuterin-producing lactobacillus reuteri strain for treating helicobacter pylori infection
CN104024430A (zh) * 2011-08-26 2014-09-03 微生物诊断有限责任公司 用于诊断和治疗心脏缺陷的方法
US8268305B1 (en) 2011-09-23 2012-09-18 Bio-Cat, Inc. Method and compositions to reduce serum levels of triacylglycerides in human beings using a fungal lipase
EP2782586A4 (en) * 2011-11-23 2015-07-01 Ozstar Therapeutics Pty Ltd ENHANCED SYNERGIC ANTIDIABETIC COMPOSITIONS
WO2013081462A1 (en) * 2011-12-02 2013-06-06 Universiteit Maastricht Phytostanols for the prevention or treatment of hepatic inflammation
JP5571650B2 (ja) * 2011-12-27 2014-08-13 農業生産法人株式会社 熱帯資源植物研究所 非アルコール性脂肪性肝疾患および／または非アルコール性脂肪肝炎の治療薬
JP5525511B2 (ja) * 2011-12-27 2014-06-18 農業生産法人株式会社 熱帯資源植物研究所 非アルコール性脂肪性肝疾患および／または非アルコール性脂肪肝炎の治療薬
UA114615C2 (uk) 2012-01-06 2017-07-10 Омтера Фармасьютікалз, Інк. Збагачена дпк композиція омега-3 поліненасичених жирних кислот у формі вільної кислоти
CN102690856A (zh) * 2012-05-30 2012-09-26 绵阳劲柏生物科技有限责任公司 微生物溶液制作游离型胆汁酸的工艺
EP3401396A1 (en) * 2012-10-03 2018-11-14 Metabogen AB Treating or preventing atherosclerosis or associated diseases by beta-carotene
CA3212215A1 (en) 2012-11-23 2014-05-30 Seres Therapeutics, Inc. Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
US8906668B2 (en) 2012-11-23 2014-12-09 Seres Health, Inc. Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
HK1218560A1 (zh) 2013-02-04 2017-02-24 Seres Therapeutics, Inc. 组成与方法
CA2899925A1 (en) 2013-02-04 2014-08-07 Seres Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inhibition of pathogenic bacterial growth
EP2967077A4 (en) 2013-03-15 2016-09-14 Seres Therapeutics Inc NETWORK-BASED MICROBIAL COMPOSITIONS AND METHOD
KR102143856B1 (ko) 2013-06-11 2020-08-12 하우스 웰니스 푸드 코퍼레이션 대식세포에 물질을 송달하는 담체
WO2014200349A1 (en) * 2013-06-13 2014-12-18 Fast Forward Pharmaceutical B.V. Cd40 signalling inhibitor and a further compound, wherein the further compound is a bile acid, a bile acid derivative, an tgr5-receptor agonist, an fxr agonist or a combination thereof, for the treatment of chronic inflammation, and the prevention of gastrointestinal cancer or fibrosis.
KR102250588B1 (ko) * 2013-07-02 2021-05-12 오스트리아노바 싱가포르 피티이 리미티드 캡슐화 세포의 동결-건조 방법, 동결 건조된 캡슐화 세포, 동결 건조된 캡슐화 세포를 함유하는 조성물, 및 상기 세포 및 조성물의 용도
GB201319531D0 (en) 2013-11-05 2013-12-18 Optibiotix Health Ltd Composition & methods of screening
GB201319538D0 (en) * 2013-11-05 2013-12-18 Optibiotix Health Ltd Composition
AU2015341571A1 (en) 2013-11-05 2017-05-18 Optibiotix Limited Prebiotic composition and its method of production
GB201319540D0 (en) 2013-11-05 2013-12-18 Optibiotix Health Ltd Composition
GB201319539D0 (en) 2013-11-05 2013-12-18 Optibiotix Health Ltd Composition & methods of screening
EP3074027B1 (en) 2013-11-25 2024-12-18 Seres Therapeutics, Inc. Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof
US9956282B2 (en) 2013-12-16 2018-05-01 Seres Therapeutics, Inc. Bacterial compositions and methods of use thereof for treatment of immune system disorders
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US12329783B2 (en) 2013-12-20 2025-06-17 Seed Health, Inc. Method and system to improve the health of a person's skin microbiome
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US12246043B2 (en) 2013-12-20 2025-03-11 Seed Health, Inc. Topical application to treat acne vulgaris
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US10624934B2 (en) * 2014-03-06 2020-04-21 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Prebiotic formulations
GB2524474B (en) * 2014-03-07 2018-01-31 Genmont Biotech Inc Composition and use of lactobacillus reuteri GMNL-89 in treating type 2 diabetes
JP2017528499A (ja) * 2014-09-25 2017-09-28 アストラゼネカ・アクチエボラーグＡｓｔｒａｚｅｎｅｃａ Ａｋｔｉｅｂｏｌａｇ 肝臓の疾患を治療するためのオメガ３脂肪酸とｓｇｌｔ−２阻害薬との併用剤
MA41611A (fr) 2015-02-23 2018-01-02 Omthera Pharmaceuticals Inc Préparations en milli-capsules comprenant des acides gras polyinsaturés libres
CN105132327B (zh) 2015-09-09 2018-12-11 华南理工大学 一种多环芳烃污染修复微囊材料及其制备方法和应用
US12239706B2 (en) 2015-11-30 2025-03-04 Seed Health, Inc. Method and system for protecting monarch butterflies from pesticides
EP3391757A4 (en) * 2015-12-17 2019-08-21 Cj Cheiljedang Corporation METHOD FOR COATING LACTIC ACID BACTERIA WITH INCREASED INTESTINAL SURVIVAL RATE
FR3045383B1 (fr) * 2015-12-18 2019-06-14 Maat Pharma Procede de lyophilisation d'un echantillon de microbiote fecal
CN106361739A (zh) * 2016-08-29 2017-02-01 大连槿藏商贸有限公司 共轭亚油酸或其衍生物在制备乙醛脱氢酶促进剂方面的应用
US11447738B2 (en) 2016-10-28 2022-09-20 Vedanta Biosciences, Inc. Methods and compositions for preserving bacteria
KR20180049731A (ko) 2016-11-03 2018-05-11 주식회사 쎌바이오텍 비만 및 지질 관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR101938865B1 (ko) * 2016-11-03 2019-01-16 주식회사 쎌바이오텍 골 질환, 비만 및 지질 관련 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
US10590496B2 (en) * 2016-11-29 2020-03-17 Wedea Inc. Composition for preventing and treating degenerative brain disease using novel lactic acid bacteria
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
JPWO2018151186A1 (ja) * 2017-02-16 2019-12-12 味の素株式会社 ポリマービーズ
KR101999693B1 (ko) * 2017-06-13 2019-07-15 부산대학교 산학협력단 산성 환경에서 프로바이오틱스를 보호하는 프로바이오틱스 전달용 하이드로겔 제제 및 이를 포함하는 프로바이오틱스 전달용 조성물
CN107365705B (zh) * 2017-07-14 2021-01-12 江苏微康生物科技有限公司 一种油溶性益生菌冻干菌粉的冻干保护剂及其应用
EP3668527A1 (en) 2017-08-14 2020-06-24 Seres Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating cholestatic disease
MX2020003198A (es) * 2017-09-29 2020-10-12 Univ Industry Cooperation Group Kyung Hee Univ Bacterias acidolácticas novedosas y uso de las mismas.
JP2021501185A (ja) 2017-10-30 2021-01-14 セレス セラピューティクス インコーポレイテッド 抗生物質耐性を処置するための組成物及び方法
WO2019092608A1 (en) * 2017-11-08 2019-05-16 Materias S.R.L. In situ gelifying powder
CN108102985B (zh) * 2018-02-12 2020-08-04 江南大学 一种复配天然酵母发酵制备面包的方法
US11541105B2 (en) 2018-06-01 2023-01-03 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance
EP3823724A1 (en) * 2018-07-16 2021-05-26 The Medical College of Wisconsin, Inc. Reutericyclin or lactobacillus reuterii for reducing weight gain
CN108841898A (zh) * 2018-07-16 2018-11-20 安徽民祯生物工程有限公司 一种透性化酵母细胞生产海藻糖的方法
US12150967B2 (en) 2018-08-18 2024-11-26 Seed Health, Inc. Methods and compositions for honey bee health
WO2020068936A1 (en) * 2018-09-25 2020-04-02 Duke University Methods and compositions to treat and prevent infection
CN109266766B (zh) * 2018-10-10 2021-10-19 中国人民解放军第三0二医院 肠道微生物作为胆管细胞癌诊断标志物的用途
US12569524B2 (en) 2018-10-22 2026-03-10 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Compositions and methods for preventing and treating antibiotic induced pathologies using probiotics in the biofilm state
KR102447791B1 (ko) * 2018-10-30 2022-10-04 씨제이웰케어 주식회사 유산균의 동결 보호를 위한 시스테인 또는 이의 염의 용도
MX2021006708A (es) * 2018-12-07 2021-09-21 Pivot Bio Inc Composiciones polimericas con mayor estabilidad para productos microbianos fijadores de nitrogeno.
CN110108815B (zh) * 2019-05-24 2022-01-04 江西省科学院生物资源研究所 一种用于二十八烷醇预防肝损伤效果的体外评价方法
CN112007051B (zh) * 2019-05-28 2022-05-10 景岳生物科技股份有限公司 一种预防中风及改善中风严重度的组合物及其用途
WO2020247536A1 (en) 2019-06-03 2020-12-10 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Prebiotic formulations for prevention of sepsis and necroenterocolitis induced neurodevelopmental deficiencies
WO2021048172A2 (en) 2019-09-09 2021-03-18 River Stone Biotech Aps Delivery vehicle for in situ delivering of pharmaceutical agents
TWI719691B (zh) * 2019-10-28 2021-02-21 葡萄王生技股份有限公司 羅伊氏乳桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）菌株ＧＫＲ１用於製備降低尿酸之組成物的用途
KR102274678B1 (ko) * 2020-07-16 2021-07-12 (주)코엔바이오 신규한 락토바실러스 플란타룸 아종 플란타룸 Ｃｅｂ－ｋｃ－００７ 균주 및 이를 포함하는 항비만 효능을 가지는 조성물
CN112168847A (zh) * 2020-09-30 2021-01-05 浙江大学 罗伊氏乳杆菌在制备治疗急性肝衰竭药物中的用途
CN112618665B (zh) * 2020-12-19 2022-06-14 杭州益品新五丰药业有限公司 一种提高免疫反应的糠甾醇-谷维素联合用药制剂
CN112603912A (zh) * 2020-12-23 2021-04-06 广东省农业科学院动物科学研究所 罗伊氏菌素在畜禽养殖方面的应用
KR102215599B1 (ko) * 2020-12-28 2021-02-15 주식회사 에이치이엠 신규한 비피도박테리움 애니멀리스 락티스 hem20-01 균주, 및 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 우울증 치료용 조성물
CN113604402B (zh) * 2021-08-30 2023-07-21 江苏恒顺醋业股份有限公司 一种特异性的乳酸菌培养基及其培养方法和应用
EP4166002A1 (en) * 2021-10-12 2023-04-19 Evonik Operations GmbH Microbial preparations containing specific cryoprotectants
CN114107066A (zh) * 2021-11-19 2022-03-01 广东容大生物股份有限公司 高活性高稳定性益生菌规模化制备技术开发与示范
CN114010665A (zh) * 2021-11-30 2022-02-08 西南医科大学附属医院 罗伊氏乳杆菌在制备预防和/或治疗酒精性肝病的药物中的应用
CN115607576A (zh) * 2022-09-29 2023-01-17 青岛东海药业有限公司 一种用于防治糖尿病及白色念珠菌感染并发症的组合物及其应用
CN115494244B (zh) * 2022-11-21 2023-03-24 保定佳瑞源生物芯片有限公司 一种癌抗原ca724的吖啶酯抗体标记稀释液及其应用
CN116870155A (zh) * 2023-05-22 2023-10-13 遵义医科大学附属医院 一种离子通道阻滞剂在治疗和/或预防肝纤维化中的应用
CN117187145B (zh) * 2023-10-20 2024-07-16 深圳保时健生物工程有限公司 一株具有降脂、降血糖和减重功能的嗜酸乳杆菌goldgut-la100及其应用
CN118497081B (zh) * 2024-07-09 2024-10-11 云南大学 一种发酵粘液乳杆菌iobra9848及其分离方法和应用

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4362711A (en) * 1980-07-11 1982-12-07 Evreka Inc. Blood cholesterol level reducing agent and method
NL9101537A (nl) † 1991-09-11 1993-04-01 Tno Lactobacilli met genetisch gemodificeerde galzouthydrolytische activiteit, produktie en toepassing daarvan.
US5716615A (en) * 1992-02-10 1998-02-10 Renata Maria Anna Cavaliere Vesely Dietary and pharmaceutical compositions containing lyophilized lactic bacteria, their preparation and use
US5686276A (en) * 1995-05-12 1997-11-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Bioconversion of a fermentable carbon source to 1,3-propanediol by a single microorganism
US5534253A (en) * 1995-06-07 1996-07-09 Biogaia Ab Method of treating enteropathogenic bacterial infections in poultry
GB9601333D0 (en) * 1996-01-23 1996-03-27 Univ Mcgill Microencapsulated genetically engineered microorganisms for clinical application
KR100387245B1 (ko) * 1997-10-17 2003-08-19 일양약품주식회사 유산균의안정화를위한미세장용성코팅과립
US6811786B1 (en) * 1999-04-01 2004-11-02 Ganeden Biotech, Inc. Methods for reducing cholesterol using Bacillus coagulans spores, systems and compositions
DE19956400B4 (de) 1999-11-24 2005-09-08 Sagredos, Angelos, Prof. Dr. Therapeutisch wirksame Zusammensetzung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
US6653062B1 (en) 2000-07-26 2003-11-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Preservation and storage medium for biological materials
EP1264893A1 (en) 2001-06-08 2002-12-11 Teagasc Dairy Products Research Centre CLA biosynthesis by bifidobacteria
US7135180B2 (en) * 2002-04-11 2006-11-14 Medimmune Vaccines, Inc. Preservation of bioactive materials by freeze dried foam
WO2004076657A2 (en) * 2003-02-28 2004-09-10 Mcgill University Cell and enzyme compositions for modulating bile acids, cholesterol and triglycerides
EP1807506B1 (en) * 2004-10-08 2013-04-17 Georgia Tech Research Corporation Microencapsulation of cells in hydrogels using electrostatic potentials
WO2007140613A1 (en) 2006-06-06 2007-12-13 Mcgill University Fermented milk product and use thereof
EP2061483A1 (en) * 2006-09-07 2009-05-27 McGill University Oral polymeric membrane feruloyl esterase producing bacteria formulation
NL1032840C2 (nl) 2006-11-09 2008-05-13 Friesland Brands Bv Probiotische hydrolysaatvoeding voor kinderen.
US20080254011A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-16 Peter Rothschild Use of selected lactic acid bacteria for reducing atherosclerosis
CN101273757B (zh) * 2008-03-31 2011-02-09 北京市农林科学院 罗伊氏乳酸杆菌冻干制剂及其制备方法
ES2578081T5 (es) 2009-05-01 2019-10-16 Uas Laboratories Llc Composiciones bacterianas para profilaxis y tratamiento de enfermedades degenerativas

Also Published As

Publication number Publication date
EP3067056A1 (en) 2016-09-14
JP2015127338A (ja) 2015-07-09
AU2010242498A1 (en) 2011-12-22
DK2419114T3 (en) 2016-07-25
RU2571211C2 (ru) 2015-12-20
PL2419114T3 (pl) 2016-09-30
DK2419114T4 (da) 2019-05-27
EP2419114A4 (en) 2013-07-31
ES2578081T3 (es) 2016-07-20
HRP20160598T4 (hr) 2019-06-28
EP2419114A1 (en) 2012-02-22
EP2419114B2 (en) 2019-02-27
JP2012525338A (ja) 2012-10-22
PL2419114T5 (pl) 2019-09-30
US20110217368A1 (en) 2011-09-08
US10660857B2 (en) 2020-05-26
JP6100526B2 (ja) 2017-03-22
HRP20160598T1 (hr) 2016-07-29
RU2011148944A (ru) 2013-06-10
EP2419114B1 (en) 2016-04-20
CN102481322A (zh) 2012-05-30
BRPI1009920A2 (pt) 2016-03-15
CA2796929A1 (en) 2010-11-04
CA2796929C (en) 2020-03-10
WO2010124387A1 (en) 2010-11-04
KR20120015335A (ko) 2012-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2578081T5 (es) Composiciones bacterianas para profilaxis y tratamiento de enfermedades degenerativas
Li et al. Intestinal delivery of probiotics: materials, strategies, and applications
Li et al. Preserving viability of Lactobacillus rhamnosus GG in vitro and in vivo by a new encapsulation system
JP5392672B2 (ja) 新規の乳酸桿菌株及びその使用
JP6442401B2 (ja) プロバイオティクスを封入するための微粒子、この微粒子を得ることおよびその使用
ES2436251B1 (es) Bacteroides cect 7771 y su uso en la prevención y tratamiento de sobrepeso, obesidad y alteraciones metabólicas e inmunológicas.
CN103619343A (zh) 双歧杆菌cect7765及其在预防和/或治疗超重、肥胖和相关病理中的用途
Wang et al. Effects of a novel encapsulating technique on the temperature tolerance and anti-colitis activity of the probiotic bacterium Lactobacillus kefiranofaciens M1
WO2024184260A2 (en) Composition comprising bifidobacterium longum subsp. infantis, bifidobacterium breve and 2&#39;-fucosyllactose
Hébrard et al. Use of whey protein beads as a new carrier system for recombinant yeasts in human digestive tract
CN117838737A (zh) 一种短双歧杆菌207-1及其在调节脂代谢方向的应用
Im et al. Bacillus polyfermenticus ameliorates colonic inflammation by promoting cytoprotective effects in colitic mice
Arellano Improving the viability of freeze-dried probiotics using a lysine-based rehydration mixture
US12594311B2 (en) Lactobacillus plantarum PDG8 and use in treating cardiovascular diseases
RU2780868C1 (ru) Иммунобиологическое средство на основе бутирата и способ его использования для терапии воспалительных заболеваний кишечника
TW201336989A (zh) 雙歧桿菌ｃｅｃｔ７７６５及彼於預防及／或治療過重、肥胖症及相關病徵之用途
Singh et al. Milk Based Extrusion Method For Microencapsulation of Probiotics
Zhao An immobilised cell system for the delivery of functional Lactobacillus reuteri DPC16 cells to their target site in a simulated gastrointestinal tract
Brachkova Evaluation of the viability of Lactobacillus spp. in different dosage forms