ES2579683T3 - Composiciones de péptidos cíclicos antimicrobianas para plantas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de prevención o control del crecimiento microbiano en plantas, material de plantas, partes de plantas o en medios usados para mantener las plantas o el material de plantas, comprendiendo el procedimiento la etapa de aplicar una composición antimicrobiana a las plantas, material de plantas, partes de plantas o medios, en el que la composición antimicrobiana comprende un decapéptido cíclico producido a partir de Bacillus aneurinolyticus como agente activo, siendo el decapéptido cíclico una tirocidina, triptocidina o fenicidina o un análogo de las mismas que comprende una secuencia de aminoácidos de ciclo(valina-X1-leucina-D10 fenilalanina-prolina-X2-X3-X4-X5-X6) (SEQ ID NO: 1), en la que: X1 es ornitina o lisina; X2 es valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano o tirosina; X3 es el isómero D de valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano o tirosina; X4 es asparagina o glutamina; X5 es glutamina o asparagina; y X6 es tirosina, fenilalanina o triptófano.

Description

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DESCRIPCIÓN

Composiciones de péptidos cíclicos antimicrobianas para plantas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones antimicrobianas para prevenir o controlar el crecimiento 5 microbiano en plantas, partes de plantas o material de plantas.

Antecedentes de la invención

La mayor amenaza para el mercado de productos frescos es la reducción en el rendimiento y la calidad debido a las infecciones microbianas, especialmente patógenos fúngicos. La infección anterior a la cosecha por patógenos microbianos da como resultado una pérdida de aproximadamente un 16 % de la producción mundial de alimentos

10 cada año, con una pérdida adicional de hasta un 50 % como consecuencia de infecciones posteriores a la cosecha, particularmente en los países en desarrollo. Esto tiene el potencial de amenazar la seguridad alimentaria mundial (Chakraborty y Newton, 2011, Plant Path. 60, 2-14, Montesinos y Bardaji, 2008, Chem. Biodivers. 5, 1225-1237).

Las infecciones posteriores a la cosecha, tales como las provocadas por Penicillium spp (moho azul), Monilinia spp (podredumbre parda) y, particularmente, Botrytis cinerea (moho gris) en uvas, fresas, cerezas y frutos de árboles

15 como las peras y manzanas, son la primera causa de las principales pérdidas en los frutos comerciales (Lennox et al. 2003. Plant Dis. 87, 639-644; Wilson et al., 1991 Crop Protection 10, 172-177; Romanazzi, 2010, Fresh produce 4, 111-115). Las medidas para limitar las pérdidas durante el almacenamiento incluyen almacenamiento a baja temperatura, control biológico y tratamientos con compuestos naturales, así como tratamientos químicos (Zheng et al. 2008. Food Control, 19, 470-474; Romanazzi, 2010, Fresh Produce 4, 111-115).

20 Otra preocupación importante en la industria agrícola son las pérdidas anteriores a la cosecha que están provocadas principalmente por un deterioro en la salud de la planta debido a la infección. Los Fusarium spp. transmitidos por el suelo están asociadas con el marchitamiento de la vid y la podredumbre de la raíz y afectan a muchas especies de plantas (Di Peitro et al, 2003, Mol. Plant Path 4, 315-325; Berrocal-Lobo y Molina, 2008, Trends Plant Sci. 13, 145150, Highet y Nair, 1995, Aus. J. Grape Wine Res, 1 48-50). Las esporas fúngicas pueden persistir en el suelo

25 durante años y los esquejes para la siembra o el desprendimiento de la hoja pueden fomentar la infección a través de heridas vasculares, aunque la infección en muchas plantas tiene lugar a través de las raíces (Berrocal-Lobo y Molina, 2008 Trends Plant Sci. 13, 145-150, Highet y Nair, 1995, Aus. J. Grape Wine Res, 1 48-50). Sin embargo, las dos enfermedades más destructivas asociadas con el deterioro de la vid son la enfermedad del pie negro, provocada por Cylindrocarpon spp., y el deterioro de la vid joven o enfermedad de Petri provocada por Phaeomoniella spp. y

30 Phaeoacremonium spp. (Fourie y Halleen. 2001, Winelands, 12, 19-23; 2002. Aus. Plant Path. 31:425-426.). La enfermedad del pie negro y la enfermedad de Petri infectan principalmente al material de propagación de la vid y a las vides recién plantadas y son responsables individual o colectivamente del deterioro de las vides jóvenes, de la reducción o pérdida de productividad y de la muerte de la vid joven. Las vides más viejas que se han infectado con estas enfermedades muestran un fenotipo alterado y poco o incluso ningún potencial de sujeción del fruto. Como

35 resultado, los viticultores se ven obligados a replantar viñas jóvenes infectadas con un coste y una pérdida de producción sustanciales. El problema, sin embargo, surge a menudo en los viveros que suministran el material de propagación. La investigación ha demostrado que la principal fuente de material infectado es el material de áreas de cultivo madre y los viveros, proporcionando menos de un 50 % del material de propagación plantas vendibles sanas (Fourie y Halleen, 2004, Aus. Plant Path. 33: 313-315; Halleen et al., 2003. Aus. Plant Path.32: 47-52). Halleen et al.

40 (2007, Plant Path. 56, 637-645) evaluaron 13 fungicidas, lo que representa 10 clases químicas diferentes para la inhibición miceliar in vitro de Cylindrocarpon y Campylocarpon spp, los agentes causales de la enfermedad del pie negro. Solo cloruro de manganeso-procloraz, imazalilo y benomilo pudieron reducir eficazmente el crecimiento miceliar en todas las cepas fúngicas sometidas a prueba, pero no pudieron proteger la propagación contra la enfermedad del pie negro en condiciones de campo. Este estudio mostró que la mayoría de los tratamientos

45 químicos eran ineficaces e inconsistentes en la protección de la vid contra la enfermedad del pie negro.

El cultivo de tejidos de plantas es una técnica importante en la industria de la vid y del fruto para el suministro de material de siembra sin virus ni patógenos para el establecimiento de nuevas viñas y huertos frutales. Una segunda técnica de cultivo de tejidos, a saber, el rescate de embriones, desempeña un papel importante en el cultivo de nuevas variedades cultivadas, especialmente variedades de uva sin semilla. Aunque se han establecido bien estas 50 técnicas en el suministro de material de siembra de buena calidad, todavía hay una serie de aspectos que influyen en la tasa de éxito del establecimiento del material de campo, en un entorno in vitro. Uno de los factores más importantes es la calidad del explante, que puede verse afectada en gran medida por la población microbiana (hongos, bacterias y levaduras) presente en el material de planta en el campo (Cassells, 2001, Proc. IV IS on In Vitro Cult. & Hort. Breeding, Eds. S. Sorvari et al., 353-350). El medio rico usado para establecer el material de explante in 55 vitro también es un medio perfecto para el crecimiento de estos microbios, lo que hace que la estrategia de esterilización que se emplea sea una etapa crucial en el establecimiento exitoso del material de explante del campo de nuevo al cultivo in vitro (Cassells, 2001, Proc. IV IS on In Vitro Cult. & Hort. Breeding, Eds. S. Sorvari et al., 353353-350). La esterilización de material de explante por lo general implica una combinación de tratamiento con agua caliente, tratamientos con alcohol y NaOCl2 (Cassells, 2000, Plant Cell Biology (Ed. Spier, RE), Wiley, Chichester,

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577-586), pero esto solo elimina parte de los microbios de la superficie, mientras que las bacterias y hongos endófitos sobreviven, lo que da lugar a la contaminación cuando el explante se dispone en el medio de cultivo. Los laboratorios de cultivo de tejidos se basan en antibióticos para controlar ambas infecciones fúngicas y bacterianas, pero es raro el caso en el que un solo microbio esté presente en el material de explante, lo que requiere

5 combinaciones de antibióticos, que pueden dar lugar a fitotoxicidad (Estopá, 2001, Plant Cell, Tissue & Organ Culture 65, 211-220). PPMTM, que contiene metilcloroisotiazolinona/metilisotiazolinona como ingredientes activos, es actualmente el único producto químico en el mercado que reivindica inhibir el crecimiento de ambos patógenos bacterianos y fúngicos, pero se ha informado de que interfiere con el desarrollo de la planta, especialmente en el cultivo de tejidos de la vid (Compton y Koch, 2001, In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 37, 259-261).

10 Las alternativas a los microbicidas químicos, tales como agentes de control biológico, han dado a los productores un medio de protección respetuoso con el medio ambiente de sus productos, pero con un entorno en cambio constante, la eficacia del control biológico es impredecible y no se puede garantizar la protección contra patógenos microbianos.

Con los agentes antimicrobianos existentes (en su mayoría microbicidas químicos) que pierden potencia hacia

15 muchos de los patógenos debido a la resistencia, el incremento en la oposición global al uso de control químico y el movimiento hacia prácticas agrícolas más naturales y ecológicas, existe la necesidad de obtener agentes de control biológico naturales con un amplio espectro de actividad que puedan garantizar el establecimiento del material de siembra de alta calidad y también proteger al producto durante el almacenamiento posterior a la cosecha.

Se ha demostrado que los péptidos antibióticos bioactivos aislados a partir de Bacillus brevis y Bacillus polymyxa

20 son activos contra el moho gris Botrytis en fresas (Haggaga, 2008, Archives of Phytopathology and Plant Protection 41(7), 477-491).

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer modo de realización de la invención, se proporciona un procedimiento de prevención o control del crecimiento microbiano en plantas, material de plantas, partes de plantas o en medios usados para

25 mantener las plantas o el material de plantas, comprendiendo el procedimiento la etapa de aplicar una composición antimicrobiana a las plantas, material de plantas, partes de plantas o medios,

en el que la composición antimicrobiana comprende un decapéptido cíclico producido a partir de Bacillus aneurinolyticus como agente activo, siendo el decapéptido cíclico una tirocidina, triptocidina o fenicidina o un análogo de las mismas que comprende una secuencia de aminoácidos de ciclo(valina-X1-leucina-D-fenilalanina-prolina-X2-X3

30 X4-X5-X6) (SEQ ID NO: 1), en la que:

X1 es ornitina o lisina;

X2 es valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano o tirosina;

X3 es el isómero D de valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano o tirosina;

X4 es asparagina o glutamina;

35 X5 es glutamina o asparagina; y

X6 es tirosina, fenilalanina o triptófano.

El decapéptido cíclico puede tener un aminoácido seleccionado de una cualquiera de SEQ ID NOS: 6-21, SEQ ID NOS: 22-37 o SEQ ID NOS: 38-59, una cualquiera de SEQ ID NOS: 60-75, SEQ ID NOS: 76-91 o SEQ ID NOS: 92113, o una cualquiera de SEQ ID NOS: 114-129, SEQ ID NOS: 130-145, SEQ ID NOS: 146-161 o SEQ ID NOS:

40 162-167.

La composición puede contener dos o más de los decapéptidos cíclicos descritos anteriormente.

La composición también puede contener un organismo que produce de forma natural el/los decapéptido(s) cíclico(s).

La composición puede ser una composición antifúngica para controlar el crecimiento de uno o más de los siguientes hongos: Phaeoacremonium spp. (tal como Phaeoacremonium aleophilum), Phomopsis viticola, Fusarium spp. (tal

45 como Fusarium solani, F. oxysporum, F. verticilliodes), Cylindrocarpon spp. (tal como Cilidocarpon liriodendra), Botrytis cinerea, Talaromyces spp., Aspergillus spp. Penicillium spp., Monilinia spp., Trichoderma spp., o Phaeomoniella spp.

La composición puede ser una composición antibacteriana.

La composición puede tratar o prevenir el moho azul, podredumbre parda, moho verde, marchitamiento de la vid y 50 podredumbre de la raíz, enfermedad del pie negro, deterioro de la vid joven o enfermedad de Petri.

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Los decapéptidos cíclicos o mezcla de péptidos cíclicos o análogos/derivado(s) de los mismos se pueden modificar químicamente para mejorar la solubilidad, biodisponibilidad y/o bioactividad y/o para limitar la toxicidad. Los procedimientos de modificación pueden incluir oxidación, hidroxilación, acilación, amidación, acoplamiento de un resto orgánico, sustitución de un grupo hidroxilo, carbonilo, carboxilo, amino, metilo o azúcar/derivado de azúcar y

5 modificación biosintética.

La composición se puede formular adecuadamente para mejorar la actividad, estabilidad y/o biodisponibilidad y/o para limitar la toxicidad. Las formulaciones pueden contener sales biológicas, lípidos o derivados lipídicos, polisacáridos o derivados polisacáridos, azúcares o derivados de azúcares, aditivos GRAS autorizados o biológicamente respetuosos.

10 La composición también puede incluir uno o más de otros compuestos antimicrobianos o antifúngicos, incluyendo péptidos, lipopéptidos o antibióticos naturales de origen animal, microbiano o vegetal o biocidas o antibióticos producidos químicamente.

La composición puede incluir una combinación de una o más tirocidinas y gramicidina S o derivados de las mismas.

Las plantas pueden ser plantas embrionarias, jóvenes o maduras, y pueden ser plantas productoras de frutos,

15 plantas productoras de hortalizas, cultivos en hileras, cultivos de hortalizas, plantas ornamentales, hierbas o árboles. Por ejemplo, las plantas pueden ser vides, plantas de fresas, frutales de hueso (por ejemplo, ciruelas, cerezas, melocotones, nectarinas, albaricoques y almendras), manzanos, perales, cereales, tales como trigo, y similares.

El material de plantas o partes de plantas pueden ser esquejes de plantas, raíces, material de plantas para cultivo celular, explantes, flores, frutos, hortalizas, semillas o cereales. El material de plantas puede ser material de plantas

20 seco, tal como se encuentra en el pienso seco. Los frutos pueden ser frutos que sean susceptibles a B. cinerea y otros patógenos de descomposición, infección y descomposición, tales como uvas y fresas, diversas bayas o cerezas y frutos de árboles como higos, peras, manzanas, melocotones, albaricoques o ciruelas. Las hortalizas incluyen todas las variedades de crecimiento aéreo y subterráneo.

De acuerdo con un segundo modo de realización de la invención, se proporciona un procedimiento de mejora del

25 crecimiento de las plantas o del vigor de las plantas o de prolongación de la vida de las flores cortadas, comprendiendo el procedimiento la etapa de aplicar la composición descrita anteriormente a las plantas, al material de plantas, partes de plantas o medios de crecimiento, o al agua del jarrón para las flores cortadas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Desarrollo del crecimiento fúngico después de 5 días de incubación en ausencia (controles, paneles de la

30 izquierda) y presencia de gramicidina S (tratamiento, paneles de la derecha) con A Cylindrocarpon (20 mg/l de gramicidina S), B Phomopsis (10 mg/l de gramicidina S), C Phaeoacremonium (20 mg/l de gramicidina S).

Figura 2: El efecto de gramicidina S (GS) y una mezcla de tirocidina (Trc) a 15 mg/l sobre el desarrollo de una selección de plantas de cultivo de tejidos de la vid.

Figura 3: El efecto de gramicidina S (GS), una mezcla de tirocidina (Tyr) y una mezcla de tirocidina/gramicidina S a 35 30 mg/l usadas para la esterilización de brotes de uva sobre el desarrollo de plantas de vid.

Figura 4: Efecto del tratamiento de agua de jarrón sobre la absorción de agua de margaritas africanas pequeñas (Gerbera ssp.) (A) y la condición de la flor (B) durante 15 días. Los controles contenían únicamente agua corriente, los que contenían producto comercial recibieron la dosificación tal como se especifica por el proveedor y las flores de ensayo recibieron 35 mg/l de una mezcla de tirocidina, 35 mg/l de gramicidina S (GS) o una mezcla de gramicidina S

40 y tirocidina (que contenía 35 mg/l de cada una).

Figura 5: Efecto del tratamiento de agua de jarrón sobre la vida en el jarrón de flores Delphinium durante 5 días, considerándose una condición de flor de 4 o 5 como flores usables. Los controles contenían únicamente agua corriente, los que contenían producto comercial recibieron la dosificación tal como se especifica por el proveedor y el ensayo peptídico contenía 25 mg/l de una mezcla de tirocidina, 25 mg/l de gramicidina S (GS) o una mezcla de

45 gramicidina S y tirocidina (que contenía 25 mg/l de cada una).

Descripción detallada de la invención

Los procedimientos para controlar o prevenir el crecimiento de patógenos microbianos, y, en particular hongos patógenos, en plantas, partes de plantas y material de plantas se describen en el presente documento. Los agentes activos usados para el control de estos patógenos son tirocidinas, triptocidinas, fenicidinas o análogos de las

50 mismas.

Las tirocidinas, triptocidinas, fenicidinas y gramicidina S son una familia de decapéptidos cíclicos de lámina β naturales que adoptan conformaciones estructurales/topologías moleculares similares, están altamente conservados y tienen una identidad de secuencia alta. Se producen por Bacillus y Brevibacillus spp.

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Las tirocidinas y gramicidina S contienen la secuencia pentapeptídica Val-Orn-Leu-D-Phe-Pro (SEQ ID NO: 4). Este resto pentapeptídico puede variar en su residuo catiónico, siendo reemplazable el residuo ornitina por lisina para ambas tirocidinas y gramicidina S, y siendo reemplazables también los residuos valina o leucina por leucina, isoleucina o valina por las tirocidinas.

5 La gramicidina S tiene una secuencia altamente conservada que es una repetición de la unidad pentapeptídica descrita anteriormente, es decir, ciclo(Val-Orn/Lys-Leu-D-Phe-Pro)2 (SEQ ID NO: 3). En lugar de repetirse la unidad pentapeptídica, las tirocidinas comprenden un resto pentapeptídico variable de Phe-D-Phe-Asn-Gln-Tyr (SEQ ID NO: 5), o un derivado de la misma en donde los tres residuos aromáticos son independientemente reemplazables por triptófano, fenilalanina o tirosina.

10 Las estructuras químicas primarias de gramicidina S y una de las tirocidinas (tirocidina A) se muestran a continuación:

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Gramicidina S Tirocidina A

Los estudios sobre tirocidinas han demostrado que son activas contra Neurospora crassa (Mach y Slayman 1966,

15 BBA 124, 351-36; Trevillyan y Pall, 1979, J. Bact. 397-403) y que el complejo tirocidina-gramicidina (las gramicidinas son péptidos 15-meros neutros lineales no relacionados con gramicidina S), tirotricina, es activo contra Candica albicans (Kretschmar et al., 1996, Mycoses. 39, 45-50). La tirotricina fue el primer antibiótico que se usó en la práctica clínica, pero después cayó en el descrédito debido a su toxicidad hemolítica (Dubos y Cattaneo, 1939, J. Exp. Med. 70, 249; Hotchkiss y Dubos, 1941, J. Biol. Chem. 141, 155; Bradshaw, 2003 BioDrugs 17, 233-240). Sin

20 embargo, el solicitante no tiene conocimiento de ningún estudio que se haya realizado sobre productores de tirotricina (por ejemplo, Bacillus aneurinolyticus, comúnmente denominada la cepa Dubos de Bacillus brevis) o tirocidinas en el control biológico de patógenos de plantas. Esto se debe posiblemente a la alta toxicidad percibida de estos péptidos, aunque parece que esta percepción es infundada (Rautenbach et al. 2007, BBA Biomembr. 1768, 1488-1497). El complejo tirotricina también se ha usado en pastillas para la garganta (1 mg de tirotricina por pastilla)

25 bajo el nombre comercial Tyrozets, indicando su relativa seguridad para el consumo humano, pero este ya se ha interrumpido debido a una eficacia cuestionable.

Los decapéptidos cíclicos de la presente invención son tirocidinas, triptocidinas, fenicidinas o análogos de las mismas conocidos, que tienen una secuencia de aminoácidos altamente conservada que comprende Val-X1-Leu-DPhe-Pro-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQ ID NO: 2), o un derivado o análogo de la misma, en la que X1 es ornitina o lisina.

Los análogos adecuados de las tirocidinas, triptocidinas o fenicidinas pueden ser los que incluyen una o más de las siguientes sustituciones:

el residuo valina sustituido con un residuo leucina o isoleucina o aminoácido hidrófobo o análogo/derivado;

el residuo leucina sustituido con un residuo isoleucina o valina o aminoácido hidrófobo o análogo/derivado;

35 reemplazándose el residuo prolina por residuo hidroxiprolina o análogo/derivado del mismo;

el residuo fenilalanina sustituido con un residuo triptófano o tirosina o análogo aromático/derivado del mismo;

el residuo ornitina sustituido con una lisina o un aminoácido catiónico o un análogo/derivado de la misma;

siendo X2 valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano o tirosina o un aminoácido hidrófobo o análogo/derivado; siendo X4 asparagina, glutamina o leucina o un análogo o derivado de la misma;

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siendo X5 glutamina o un aminoácido polar o análogo/derivado del mismo; o siendo alternativamente el isómero D de valina, leucina, isoleucina, o un aminoácido hidrófobo o análogo/derivado del mismo; y siendo X6 un residuo tirosina, fenilalanina o triptófano o prolina. Más preferentemente, los derivados de decapéptidos cíclicos pueden ser uno o más de los péptidos seleccionados

del grupo que consiste en: Análogos de tirocidina: Ciclo-(VKLfPWwNQY) (tirocidina C1) (SEQ ID NO: 6) Ciclo-(VOLfPWwNQY) (tirocidina C) (SEQ ID NO: 7) Ciclo-(VKLfPWfNQY) (tirocidina B1) (SEQ ID NO: 8) Ciclo-(VOLfPWfNQY) (tirocidina B) (SEQ ID NO: 9) Ciclo-(VKLfPFwNQY) (tirocidina B1’) (SEQ ID NO: 10) Ciclo-(VOLfPFwNQY) (tirocidina B’) (SEQ ID NO: 11) Ciclo-(VKLfPFfNQY) (tirocidina A1) (SEQ ID NO: 12) Ciclo-(VOLfPFfNQY) (tirocidina A) (SEQ ID NO: 12) Ciclo-(VKLfPYwNQY) (SEQ ID NO: 14) Ciclo-(VOLfPYwNQY) (SEQ ID NO: 15) Ciclo-(VKLfPYfNQY) (SEQ ID NO: 16) Ciclo-(VOLfPYfNQY) (SEQ ID NO: 17) Ciclo-(VKLfPFyNQY) (SEQ ID NO: 18) Ciclo-(VOLfPFyNQY) (SEQ ID NO: 19) Ciclo-(VKLfPWyNQY) (SEQ ID NO: 20) Ciclo-(VOLfPWyNQY) (SEQ ID NO: 21) Ciclo-(LKLfPWwNQY) (SEQ ID NO: 22) Ciclo-(LOLfPWwNQY) (SEQ ID NO: 23) Ciclo-(LKLfPWfNQY) (SEQ ID NO: 24) Ciclo-(LOLfPWfNQY) (SEQ ID NO: 25) Ciclo-(LKLfPFwNQY) (SEQ ID NO: 26) Ciclo-(LOLfPFwNQY) (SEQ ID NO: 27) Ciclo-(LKLfPFfNQY) (SEQ ID NO: 28) Ciclo-(LOLfPFfNQY) (SEQ ID NO: 29) Ciclo-(LKLfPYwNQY) (SEQ ID NO: 30) Ciclo-(LOLfPYwNQY) (SEQ ID NO: 31) Ciclo-(LKLfPYfNQY) (SEQ ID NO: 32) Ciclo-(LOLfPYfNQY) (SEQ ID NO: 33)

imagen7

Ciclo-(LKLfPFyNQY) (SEQ ID NO: 34) Ciclo-(LOLfPFyNQY) (SEQ ID NO: 35) Ciclo-(LKLfPWyNQY) (SEQ ID NO: 36) Ciclo-(LOLfPWyNQY) (SEQ ID NO: 37)

5 Ciclo-(IKLfPWwNQY) (SEQ ID NO: 38) Ciclo-(lOLfPWwNQY) (SEQ ID NO: 39) Ciclo-(IKLfPWfNQY) (SEQ ID NO: 40) Ciclo-(IOLfPWfNQY) (SEQ ID NO: 41) Ciclo-(IKLfPFwNQY) (SEQ ID NO: 42)

10 Ciclo-(IOLfPFwNQY) (SEQ ID NO: 43) Ciclo-(IKLfPFfNQY) (SEQ ID NO: 44) Ciclo-(IOLfPFfNQY) (SEQ ID NO: 45) Ciclo-(IKLfPYwNQY) (SEQ ID NO: 46) Ciclo-(lOLfPYwNQY) (SEQ ID NO: 47)

15 Ciclo-(IKLfPYfNQY) (SEQ ID NO: 48) Ciclo-(IOLfPYfNQY) (SEQ ID NO: 49) Ciclo-(IKLfPFyNQY) (SEQ ID NO: 50) Ciclo-(lOLfPFyNQY) (SEQ ID NO: 51) Ciclo-(IKLfPWyNQY) (SEQ ID NO: 52)

20 Ciclo-(IOLfPWyNQY) (SEQ ID NO: 53) Ciclo-(VKLfPLwNQY) (SEQ ID NO: 54) Ciclo-(VOLfPLwNQY) (SEQ ID NO: 55) Ciclo-(VKLfPLfNQY) (SEQ ID NO: 56) Ciclo-(VOLfPLfNQY) (SEQ ID NO: 57)

25 Ciclo-(VKLfPLyNQY) (SEQ ID NO: 58) Ciclo-(VOLfPLyNQY) (SEQ ID NO: 59) Análogos de triptocidina: Ciclo-(VKLfPWwNQW) (SEQ ID NO: 60) Ciclo-(VOLfPWwNQW) (triptocidina C) (SEQ ID NO: 61)

30 Ciclo-(VKLfPWfNQW) (SEQ ID NO: 62) Ciclo-(VOLfPWfNQW) (triptocidina B) (SEQ ID NO: 63) Ciclo-(VKLfPFwNQW) (SEQ ID NO: 64) Ciclo-(VOLfPFwNQW) (SEQ ID NO: 65) Ciclo-(VKLfPFfNQW) (SEQ ID NO: 66)

35 Ciclo-(VOLfPFfNQW) (triptocidina A) (SEQ ID NO: 67) Ciclo-(VKLfPYwNQW) (SEQ ID NO: 68) Ciclo-(VOLfPYwNQW) (SEQ ID NO: 69) Ciclo-(VKLfPYfNQW) (SEQ ID NO: 70) Ciclo-(VOLfPYfNQW) (SEQ ID NO: 71) Ciclo-(VKLfPFyNQW) (SEQ ID NO: 72) Ciclo-(VOLfPFyNQW) (SEQ ID NO: 73)

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5 Ciclo-(VKLfPWyNQW) (SEQ ID NO: 74) Ciclo-(VOLfPWyNQW) (SEQ ID NO: 75) Ciclo-(LKLfPWwNQW) (SEQ ID NO: 76) Ciclo-(LOLfPWwNQW) (SEQ ID NO: 77) Ciclo-(LKLfPWfNQW) (SEQ ID NO: 78)

10 Ciclo-(LOLfPWfNQW) (SEQ ID NO: 79) Ciclo-(LKLfPFwNQW) (SEQ ID NO: 80) Ciclo-(LOLfPFwNQW) (SEQ ID NO: 81) Ciclo-(LKLfPFfNQW) (SEQ ID NO: 82) Ciclo-(LOLfPFfNQW) (SEQ ID NO: 83)

15 Ciclo-(LKLfPYwNQW) (SEQ ID NO: 84) Ciclo-(LOLfPYwNQW) (SEQ ID NO: 85) Ciclo-(LKLfPYfNQW) (SEQ ID NO: 86) Ciclo-(LOLfPYfNQW) (SEQ ID NO: 87) Ciclo-(LKLfPFyNQW) (SEQ ID NO: 88)

20 Ciclo-(LOLfPFyNQW) (SEQ ID NO: 89) Ciclo-(LKLfPWyNQW) (SEQ ID NO: 90) Ciclo-(LOLfPWyNQW) (SEQ ID NO: 91) Ciclo-(IKLfPWwNQW) (SEQ ID NO: 92) Ciclo-(IOLfPWwNQW) (SEQ ID NO: 93)

25 Ciclo-(IKLfP(Wf)NQW) (SEQ ID NO: 94) Ciclo-(IOLfP(Wf)NQW) (SEQ ID NO: 95) Ciclo-(IKLfP(Fw)NQW) (SEQ ID NO: 96) Ciclo-(IOLfP(Fw)NQW) (SEQ ID NO: 97) Ciclo-(IKLfPFfNQW) (SEQ ID NO: 98)

30 Ciclo-(IOLfPFfNQW) (SEQ ID NO: 99) Ciclo-(IKLfPYwNQW) (SEQ ID NO: 100) Ciclo-(IOLfPYwNQW) (SEQ ID NO: 101) Ciclo-(IKLfPYfNQW) (SEQ ID NO: 102) Ciclo-(IOLfPYfNQW) (SEQ ID NO: 103)

35 Ciclo-(IKLfPFyNQW) (SEQ ID NO: 104) Ciclo-(IOLfPFyNQW) (SEQ ID NO: 105) Ciclo-(IKLfPWyNQW) (SEQ ID NO: 106)

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Ciclo-(IOLfPWyNQW) (SEQ ID NO: 107) Ciclo-(VKLfPLwNQW) (SEQ ID NO: 108) Ciclo-(VOLfPLwNQW) (SEQ ID NO: 109) Ciclo-(VKLfPLfNQW) (SEQ ID NO: 110)

5 Ciclo-(VOLfPLfNQW) (SEQ ID NO: 111) Ciclo-(VKLfPLyNQW) (SEQ ID NO: 112) Ciclo-(VOLfPLyNQW) (SEQ ID NO: 113) Análogos de fenicidina: Ciclo-(VKLfPWwNQF) (SEQ ID NO: 114)

10 Ciclo-(VOLfPWwNQF) (fenicidina C) (SEQ ID NO: 115) Ciclo-(VKLfPWfNQF) (SEQ ID NO: 116) Ciclo-(VOLfPWfNQF) (fenicidina B) (SEQ ID NO: 117) Ciclo-(VKLfPFwNQF) (SEQ ID NO: 118) Ciclo-(VOLfPFwNQF) (SEQ ID NO: 119)

15 Ciclo-(VKLfPFfNQF) (SEQ ID NO: 120) Ciclo-(VOLfPFfNQF) (fenicidina A o tirocidina E) (SEQ ID NO: 121) Ciclo-(VKLfPYwNQF) (SEQ ID NO: 122) Ciclo-(VOLfPYwNQF) (SEQ ID NO: 123) Ciclo-(VKLfPYfNQF) (SEQ ID NO: 124)

20 Ciclo-(VOLfPYfNQF) (SEQ ID NO: 125) Ciclo-(VKLfPFyNQF) (SEQ ID NO: 126) Ciclo-(VOLfPFyNQF) (SEQ ID NO: 127) Ciclo-(VKLfPWyNQF) (SEQ ID NO: 128) Ciclo-(VOLfPWyNQF) (SEQ ID NO: 129)

25 Ciclo-(LKLfPWwNQF) (SEQ ID NO: 130) Ciclo-(LOLfPWwNQF) (SEQ ID NO: 131) Ciclo-(LKLfPWfNQF) (SEQ ID NO: 132) Ciclo-(LOLfPWfNQF) (SEQ ID NO: 133) Ciclo-(LKLfPFwNQF) (SEQ ID NO: 134)

30 Ciclo-(LOLfPFwNQF) (SEQ ID NO: 135) Ciclo-(LKLfPYwNQF) (SEQ ID NO: 136) Ciclo-(LOLfPYwNQF) (SEQ ID NO: 137) Ciclo-(LKLfPYfNQF) (SEQ ID NO: 138) Ciclo-(LOLfPYfNQF) (SEQ ID NO: 139)

35 Ciclo-(LKLfPFyNQF) (SEQ ID NO: 140) Ciclo-(LOLfPFyNQF) (SEQ ID NO: 141) Ciclo-(LKLfPWyNQF) (SEQ ID NO: 142)

imagen10

Ciclo-(LOLfPWyNQF) (SEQ ID NO: 143) Ciclo-(LKLfPFfNQF) (SEQ ID NO: 144) Ciclo-(LOLfPFfNQF) (SEQ ID NO: 145) Ciclo-(IKLfPWwNQF) (SEQ ID NO: 146)

5 Ciclo-(IOLfPWwNQF) (SEQ ID NO: 147) Ciclo-(IKLfPWfNQF) (SEQ ID NO: 148) Ciclo-(IOLfPWfNQF) (SEQ ID NO: 149) Ciclo-(IKLfPFwNQF) (SEQ ID NO: 150) Ciclo-(IOLfPFwNQF) (SEQ ID NO: 151)

10 Ciclo-(IKLfPYwNQF) (SEQ ID NO: 152) Ciclo-(IOLfPYwNQF) (SEQ ID NO: 153) Ciclo-(IKLfPYfNQF) (SEQ ID NO: 154) Ciclo-(IOLfPYfNQF) (SEQ ID NO: 155) Ciclo-(IKLfPFyNQF) (SEQ ID NO: 156)

15 Ciclo-(IOLfPFyNQF) (SEQ ID NO: 157) Ciclo-(IKLfPWyNQF) (SEQ ID NO: 158) Ciclo-(IOLfPWyNQF) (SEQ ID NO: 159) Ciclo-(IKLfPFfNQF) (SEQ ID NO: 160) Ciclo-(IOLfPFfNQF) (SEQ ID NO: 161)

20 Ciclo-(VKLfPLwNQF) (SEQ ID NO: 162) Ciclo-(VOLfPLwNQF) (SEQ ID NO: 163) Ciclo-(VKLfPLfNQF) (SEQ ID NO: 164) Ciclo-(VOLfPLfNQF) (SEQ ID NO: 165) Ciclo-(VKLfPLyNQF) (SEQ ID NO: 166)

25 Ciclo-(VOLfPLyNQF) (SEQ ID NO: 167) donde las abreviaturas en mayúsculas estándar denotan los L-aminoácidos, con la excepción de O para ornitina, las

abreviaturas en minúsculas denotan un D-residuo, y Ciclo indica una ciclación amino a carboxi-terminal por medio de un enlace amida. Las referencias en lo sucesivo a "decapéptidos cíclicos" se refieren a las secuencias establecidas anteriormente y

30 análogos o derivados de los mismos. El solicitante ha descubierto que las tirocidinas y derivados de las mismas, y las composiciones que las contienen o sus productores, se pueden usar como agentes de control biológico para controlar o prevenir el crecimiento de patógenos antimicrobianos en plantas o material de plantas o medios de cultivo y entornos. Por ejemplo, se pueden usar:

35 (1) para prevenir el arrastre de patógenos fúngicos latentes a plantas propagadas en vivero y promover el crecimiento y la supervivencia;

(2) para controlar y prevenir las infecciones fúngicas en plantas embrionarias y jóvenes y promover el crecimiento y la supervivencia;

(3) para controlar y prevenir las infecciones fúngicas y microbianas en el material de plantas y medios para su uso en 40 cultivos de células vegetales;

5

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35

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55

(4)

para proporcionar protección contra patógenos fúngicos posteriores a la cosecha que infectan los frutos cosechados;

(5)

para mejorar la conservación de flores cortadas mejorando la absorción de agua y previniendo/limitando las infecciones en el tallo de la flor.

Las plantas pueden ser plantas productoras de fruto, plantas productoras de hortalizas, cultivos en hileras, cultivos de hortalizas, plantas ornamentales, hierbas o árboles. Por ejemplo, las plantas pueden ser plantas de bayas tales como vides, plantas de fresas, manzanos, perales, frutales de hueso, cereales, tales como trigo, y similares.

El material de plantas incluye esquejes de plantas, raíces, explantes, material de plantas para cultivo celular, flores, frutos (tales como fresas, uvas, cerezas, manzanas, peras, melocotones y similares), semillas o cereales.

Los decapéptidos cíclicos se pueden producir por sus productores bacterianos naturales, modificando genéticamente un microorganismo adecuado o usando un sistema orgánico/semisintético. Los residuos de aminoácidos en los derivados o análogos se pueden reemplazar por separado o en combinación en la secuencia del decapéptido cíclico núcleo (ciclo(valina-ornitina-leucina-D-fenilalanina-prolina-X2-X3-X4-X5-X6) (SEQ ID NO: 1) por producción bacteriana/microbiana o usando sistemas orgánicos/semisintéticos.

Los decapéptidos cíclicos se pueden modificar químicamente para mejorar la solubilidad, biodisponibilidad y/o bioactividad y/o para limitar la toxicidad. Los procedimientos de modificación incluyen oxidación, hidroxilación, acilación, amidación, acoplamiento de un resto orgánico, sustitución de un grupo hidroxilo, carbonilo, carboxilo, amino, metilo o azúcar/derivado de azúcar y modificación biosintética.

Los decapéptidos cíclicos, mezclas de los mismos o modificaciones de los mismos se pueden formular en una composición adecuada para su uso en plantas, partes de plantas o material de plantas, conservación de flores, en medios de cultivo, en instalaciones de cultivo o entornos de vivero, o en equipo de propagación de plantas. La composición se puede formular adecuadamente para mejorar la actividad, estabilidad y/o biodisponibilidad y/o para limitar la toxicidad. Las formulaciones pueden contener sales biológicas, lípidos o derivados lipídicos, polisacáridos o derivados polisacáridos, azúcares o derivados de azúcares, aditivos GRAS autorizados o biológicamente respetuosos.

La composición se puede formular en diversos tipos de formulaciones, tales como soluciones, polvos humectables, polvos solubles, comprimidos y gránulos solubles en agua o dispersables. La composición también se puede formular como una reserva concentrada (que se diluye en una solución acuosa antes de la aplicación por pulverización convencional) o como un producto listo para usar.

Un agente tensioactivo se puede usar como agente humectante, solubilizante y de penetración. Los tensioactivos adecuados incluyen tensioactivos derivados de péptidos (es decir, surfactina e iturina), tensioactivos no iónicos, tensioactivos aniónicos y tensioactivos anfóteros, tales como ácidos cólicos, sales de sulfatos de alquilo, sales de ácidos alquilsulfónicos, sales de ácidos alquilarilsulfónicos, éteres alquilarílicos y sus derivados de polioxietileno, éteres de polietilenglicol, ésteres de polioles y derivados de alcoholes de azúcares.

Otros componentes de la formulación pueden incluir tensioactivos adicionales, disolventes, codisolventes, colorantes, protectores UV (ultravioleta), antioxidantes, antiespumantes, adhesivos, propagadores, agentes antiespumación, conservantes, humectantes, tampones, vehículos, emulsionantes, agentes humectantes, dispersantes, agentes de fijación, disgregantes, solubilizantes ácidos u otros componentes que faciliten la manipulación y el manejo del producto. Estos vehículos, diluyentes, agentes auxiliares, etc., se seleccionan preferentemente para optimizar la acción antifúngica en plantas o material de plantas.

Los vehículos sólidos pueden incluir, por ejemplo, los siguientes materiales en forma de polvo fino o granulada: medios de cultivo celular o medios de cultivo celular seco que contienen agarosa/agar; fertilizantes de tipo orgánico; arcillas (por ejemplo, caolinita, tierra de diatomeas, óxido de silicio hidratado sintético, arcilla de Fubasami, bentonita, arcilla ácida); talco y otros minerales inorgánicos (por ejemplo, sericita, cuarzo en polvo, azufre en polvo, carbón activado, carbonato de calcio); y fertilizantes químicos (por ejemplo, sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio, urea). Los vehículos líquidos pueden incluir, por ejemplo, medios de cultivo celular, agua; alcoholes (por ejemplo, metanol, etanol, isopropanol); cetonas (por ejemplo acetona, metiletilcetona, ciclohexanona); ésteres (por ejemplo, acetato de etilo, acetato de butilo); nitrilos (por ejemplo, acetonitrilo, isobutironitrilo); y amidas de ácido (por ejemplo, dimetilformamida, dimetilacetamida), así como bases diluidas (por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y aminas).

Otros agentes auxiliares pueden incluir, por ejemplo, agentes adhesivos y agentes dispersantes, tales como caseína, gelatina, polisacáridos (por ejemplo, almidón en polvo, goma arábiga, derivados de celulosa, ácido algínico, quitina), derivados de lignina y polímeros solubles en agua sintéticos (por ejemplo de poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli(ácido acrílico)); sales (por ejemplo, sales de citrato, cloruro, sulfato, acetato, amonio, bicarbonato, fosfato, y similares) y estabilizantes tales como PAP (fosfato ácido de isopropilo), BHT (2,6-di-terc-butil-4-metilfenol), BHA (2(2-/3-terc-butil-4-metioxifenol), aceites vegetales, aceites minerales, fosfolípidos, ceras, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos.

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15

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30

35

Los reguladores del crecimiento de plantas convencionales, herbicidas, fungicidas, bactericidas, insecticidas, nematicidas, acaricidas, pesticidas bioquímicos, pesticidas producidos por plantas (productos botánicos), componentes de medios de cultivo celular o nutrientes de plantas, etc., también se pueden incorporar en la composición de la presente invención.

La composición también puede incluir uno o más de otros compuestos antimicrobianos o antifúngicos, incluyendo péptidos, lipopéptidos o antibióticos naturales de origen animal, microbiano o vegetal o fungicidas o antibióticos producidos químicamente. Por ejemplo, la composición puede incluir un complejo tirocidina-gramicidina (denominado tirotricina).

La composición se puede diluir en agua, mezcla orgánica con agua o con vehículo líquido, y pulverizar o aplicar en entornos controlados sobre la planta o material de plantas a tratar, o usar para lavar materiales de plantas o el entorno/sistemas/equipo o mezclar con medios de cultivo celular o medios de propagación de plantas. De forma alternativa, la composición se puede aplicar directamente en el suelo (en el que crecerá o está creciendo la planta) con o sin fertilizantes granulares o fertilizantes de tipo orgánico para la propagación de plantas cultivadas o la mejora en el crecimiento de plantas.

A continuación se demuestra que las tirocidinas, triptocidinas y fenicidinas y derivados/análogos de las mismas son microbicidas de amplio espectro que son activos contra la contaminación tanto bacteriana como fúngica. Los decapéptidos cíclicos análogos a las tirocidinas también muestran una baja fitotoxicidad. Todos los decapéptidos cíclicos son termoestables, funcionan en un amplio intervalo de pH y son relativamente insensibles a las sales minerales. Por otra parte, debido a que son péptidos cíclicos, son menos propensos a degradarse rápidamente como los péptidos lineales y, por lo tanto, son adecuados para ofrecer posibilidades de protección a largo plazo.

La invención se describirá ahora en más detalle por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Actividad antimicrobiana

Se analizaron las actividades antimicrobianas de una mezcla de tirocidina (mezcla Trc), así como tirocidinas purificadas, triptocidina C, fenicidina A y gramicidina S (GS). Típicamente, la mezcla Trc contenía TrcA/A1 (30-35 %), TrcB/B1 (30-35 %), TrcC/C1 (20-25 %), TpcA/B/C (5-10 %) y PhcA y análogos secundarios (<5 %). La GS usada en ensayos in vivo contenía típicamente gramicidina S (> 90 %) y análogos de gramicidina S (<10 %).

Se usaron ensayos con caldo de microdilución y agar para evaluar la actividad antifúngica de los decapéptidos cíclicos en medio líquido y en medio sólido (gel), respectivamente. En medio de caldo y agar, la mezcla Trc mostró una actividad significativa contra patógenos fúngicos seleccionados, por ejemplo, Phaeoacremonium aleophilum, Phomopsis viticola, Fusarium solani, F. oxysporum, F. verticilliodes, Cilidocarpon liriodendri y Botrytis cinerea (tabla 1). GS también mostró una actividad significativa contra estos patógenos fúngicos. La mezcla Trc y GS mostraron una actividad antibacteriana micromolar baja de amplio espectro, en particular contra el patógenos alimentario L. monocytogenes.

Tabla 1: Actividad antifúngica de la mezcla de tirocidina natural y gramicidina S contra organismos diana fúngicos y bacterianos seleccionados.

Diana microbiana

Mezcla Trc GS

MIC + EEM

MIC + EEM

Especie fúngica

Caldo Agar Caldo Agar

Fusarium solani

9,3 ± 1,2 > 100 2,5 ± 0,1 5,5 ± 1,3

Fusarium oxysporum

10 ± 1,1 nd 2,6 ± 0,2 nd

Fusarium verticilliodes

12 ± 2,9 nd 3,5 ± 0,3 nd

Botrytis cinerea

4,8 ± 0,7 7,6 ± 1,7 2,8 ± 0,3 2,5 ± 0,3

Cylindrocarpon liriodendri

2,9 ± 0,1 <10 2,3 ± 0,1 <10

Aspergillus fumigatus ATCC 204305

8,6 ± 0,5 nd 8,6 ± 0,7 nd

Talaromyces ramulosus (aislado de melocotón)

3,7 ± 0,4 nd 3,0 ± 0,1 3,6 ± 0,3

Talaromyces mineoluteus (aislado de melocotón)

3,3 ± 0,2 nd 4,2 ± 0,2 nd

Penicillium expansum (aislado de melocotón)

5,2 ± 0,3 nd 3,7 ± 0,3 nd

Penicillium digitatum (aislado de cítrico)

3,7 ± 0,2 >20 3-4 <20

Penicillium glabrum (aislado de madera)

9,8 ± 0,2 nd 4,0 ± 0,5 nd

Trichoderma atroviride (aislado de madera)

11 ± 0,4 nd 4,8 ± 0,3 nd

Phomopsis viticola

nd <10 nd <10

Phaeoacremonium aleophilum

nd <10 nd <10

Especie bacteriana

Bacillus subtilis 168

12-20 nd 8-14 nd

Bacillus subtilis OKB105

25-30 nd 8-14 nd

Bacillus subtilis OKB120

12-20 nd 8-14 nd

Bacillus subtilis ATCC21332

25-30 nd 8-14 nd

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Bacillus spizizenii ATCC 6633

21 ± 3,9 nd 2,6 ± 0,2 nd

Micrococcus luteus NCTC 8340

5,7 ± 0,11 <10 28 ± 0,4 6

Listeria monocytogenes B73

23 ± 0,63 nd 9,9 ± 0,2 nd

Listeria monocytogenes B73-MR1

14 ± 0,30 nd 5,6 ± 0,1 nd

Escherichia coli HB101

>100 >100 44 40

En resumen, los ensayos muestran que 3-12 mg/l (3-12 ppm o partes por millón) de decapéptido cíclico elimina hasta 20 millones de esporas fúngicas por litro de medio de crecimiento. Del mismo modo, 15-25 mg/l (15-25 ppm) de decapéptido cíclico elimina 2x1011/l de unidades formadoras de colonias del patógeno alimentario bacteriano L. monocytogenes. A partir de los resultados es evidente que la mezcla Trc y GS presentan actividad antimicrobiana y, en particular antifúngica, significativa contra un amplio espectro de patógenos.

Las actividades antifúngicas de los decapéptidos cíclicos purificados, GS, TrcA1, TrcA, TrcB1, TrcB, TrcC1, TrcC, PhcA y TpcC se determinaron contra F. solani y B. cinerea tanto en caldo de triptona de soja modificada con extracto de levadura (medio con alto contenido en sal, YTSB, resultados no mostrados) como en caldo de dextrosa de patata (PDB de bajo contenido en sal) (tabla 2). Se descubrió una actividad en µM baja en el medio de alto contenido en sal (YSTB) en comparación con el medio de bajo contenido en sal (PDB) para todos los péptidos, excepto para TpcC y PhcA. TpcC y PhcA estaban especialmente influenciados por su entorno, presentando TPCC una disminución en la actividad de aproximadamente dos veces contra B. cinerea y F. solani de YTSB a PDB y perdiendo PhcA una actividad de ± 2 veces y ± 5 veces respectivamente contra B. cinerea y F. solani de PDB a YTSB.

Tabla 2: Resumen de los decapéptidos cíclicos y su actividad antifúngica contra hongos que crecen en PDB. Se usan abreviaturas de una/tres letras estándar con la excepción de O para ornitina, letras minúsculas para Daminoácidos, (+) para residuo de aminoácido catiónico, Ar para residuo de aminoácido aromático.

Identidad

Abr. Secuencia MIC contra B. cinerea en PDB (n) MIC contra F. solani en PDB (n)

Ciclo (Val-(+)-Leu-D-Phe-Pro-

Mezcla de tirocidina

Mezcla Trc Ar-D-Ar-Asn-Gln-Ar) (SEQ ID NO: 178) 4,8±0,7 (6) 9,3±1,2 (3)

Tirocidina C1

TrcC1 Ciclo-(VKLfPWwNQY) (SEQ ID NO: 179) 8,9±1,5 (3) 32±2,8 (3)

Tirocidina C

TrcC Ciclo-(VOLfPWwNQY) (SEQ ID NO:180) 3,5±0,2 (6) 4,3±0,4 (3)

Tirocidina B1/ B1'

TrcB1/B1' Ciclo-(VKLfP(W,f)NQY) (SEQ ID NO:) (SEQ ID NO: 181) 3,6±0,1 (6) 5,9±0,6 (3)

Tirocidina B/B'

TrcB/B' Ciclo-(VOLfP(W,f)NQY) (SEQ ID NO:182) 5,1±1,0 (6) 11±4,0 (3)

Tirocidina A1

TrcA1 Ciclo-(VKLfPFfNQY) (SEQ ID NO: 183) 4,1±0,7 (6) 7,9±0,7 (3)

Tirocidina A

TrcA Ciclo-(VOLfPFfNQY) (SEQ ID NO: 184) 5,2±0,6 (6) 4,0±0,4 (3)

Triptocidina C

TpcC Ciclo-(VOLfPWwNQW) (SEQ ID NO: 185) 3,6±0,2 (6) 4,6±0,9 (3)

Fenicidina A

PhcA Ciclo-(VOLfPFfNQF) (SEQ ID NO: 186) 6,9±1,4 (5) 7,2±1,0 (3)

Gramicidina S

GS Ciclo-(VOLfPVOIfP) (SEQ ID NO: 187) 1,8 ± 0,3 2,2 ± 0,1

En general, GS, TrcA y TrcC presentaron la mayor actividad con la mayor consistencia tanto contra B. cinerea como contra F. solani en YTSB y PDB. En general, las actividades antifúngicas potentes contra ambas especies en ambos medios son buenas indicaciones de actividad antifúngica tolerante a la sal que es necesaria para la protección del pienso. Además, la actividad del decapéptido cíclico en medio líquido es un prerrequisito para el control de patógenos fúngicos, por ejemplo, en depósitos de hidratación e hidropónicos que se usan en la propagación de plantas. También se descubrió una buena actividad tanto para la mezcla Trc como GS en agar para varios patógenos diana, lo que es una buena indicación de su potencial en la esterilización de la superficie. Esto se exploró adicionalmente y se analiza a continuación.

Actividad antifúngica en superficies

Las especies de hongos pueden ser patógenos de superficie. Por ejemplo, B. cinerea se puede encontrar en la superficie de las uvas (Ferreira, 1990 S. Afr. J. Enol. Vitic 11, 38-41) y fresas (Hang et al, 2005, Plant Pathol. J. 21, 59-63). De forma alternativa, los hongos patógenos, tales como F. solani, se pueden encontrar en el suelo (Booth, C. (Ed), 1971, The Genus Fusarium, Commonwealth Mycological institute, Surrey) o en el xilema de plantas (Alaniz et al., 2007, Plant Dis. 91, 1187-1193). Por lo tanto, para proteger los frutos, semillas, cereales y preparados alimenticios secos, el agente antifúngico también debe ser activo en entornos de superficie.

imagen11

Solo se proporcionó protección de superficie parcial por la mezcla Trc contra F. solani, que no es un importante patógeno de descomposición, mientras que GS permaneció altamente activa contra este patógeno que creció en

5 medio de agar (tabla 3). Tanto la mezcla Trc como GS fueron altamente activas contra B. cinerea, tanto en los ensayos de gel de PDA (agar y dextrosa de patata) como de YTSA (agar y triptona de soja modificada con extracto de levadura), similares a los de los medios líquidos, mostrando actividad de superficie (tabla 3). Esto indica que la mezcla Trc y GS se podría usar como agentes protectores para frutos contra B. cinerea, un importante hongo patógeno en la descomposición del fruto.

10 Tabla 3: Resumen de la actividad contra F. solani y B. cinerea en PDA e YTSA de la mezcla Trc y GS.

PDA (µg/ml) YTSA (µg/ml)

CI50 ± EEM MIC ± EEM CI50 ± EEM MIC ± EEM

F. solani 8,3 ± 3,7 > 100 16,7 ± 0,8 >100

Mezcla Trc

B. cinerea 5,0 ± 0,9 7,6 ± 1,7 7,44 ± 0,2 14,4 ± 1,5

F. solani 4,9 ± 1,2 6,3 ± 1,5 9,6 ± 0,5 19,9 ± 1,2

GS

B. cinerea 2,0 ± 0,3 2,8 ± 0,3 4,5 ± 1,1 8,2 ± 1,8

También se han observado resultados prometedores en ensayos preliminares en naranjas, con un 50 % y un 80 % menos de infecciones en heridas por P. digitatum usando 50 mg/l (50 ppm) de mezcla Trc y GS, respectivamente.

La mezcla Trc y GS mostraron una actividad antifúngica fuerte contra los tres patógenos fúngicos sometidos a

15 prueba en presencia y ausencia de cortes en madera (tabla 4, figura 1). La mezcla Trc era altamente activa contra Phomopsis en presencia de material de tallo de vid. Sin embargo, la mezcla Trc mostró una actividad reducida contra Cylindrocarpon y menos aún contra esporas Phaeoacremonium, cuando se sometió a prueba a 10 mg/l contra estos patógenos (tabla 4). Esto sugeriría que la se une al material de madera, reduciendo así la concentración eficaz requerida para destruir ciertas esporas fúngicas en solución, pero protegiendo potencialmente la superficie de

20 madera. Esta pérdida de actividad en solución se superó, sin embargo, incrementando la concentración de la mezcla Trx a 20 mg/l. También se debe destacar que la actividad de la mezcla Trc se sometió a prueba a 10 veces (107 esporas/l) la concentración de esporas usada para las pruebas de fungicidas comerciales y a 100 veces la concentración de esporas observada normalmente en el material de vid contaminada (comunicación personal con el Department of Plant pathology, Stellenbosch University).

25 Tabla 4: La actividad antifúngica de la mezcla Trc y GS en presencia y ausencia de material de tallo de vid (gvs) en condiciones de depósito de hidratación simuladas. Se indica el porcentaje de esporas viables, determinado con un ensayo de viabilidad, en comparación con controles de crecimiento/supervivencia.

Cylindrocarpon Phomopsis Phaeoacremonium [Mezcla -gvs + gvs -gvs + gvs -gvs + gvsTrc]

10 µg/ml0 400 0 0 8 20 µg/ml 0 0 NDND 0 0

[Gram S] -gvs + gvs -gvs + gvs -gvs + gvs

10 µg/ml0 000 0 0 20 µg/ml 0 0 NDND 0 0

Actividad antifúngica in vivo

30 La mezcla Trc y GS también se sometieron a prueba para determinar su uso en la esterilización de material de vid recogido en el campo para su uso en cultivos de plantas. Se descubrió que 20 mg/l de mezcla Trc o GS eran suficientes para eliminar los hongos patógenos en la etapa de lavado o en medio de crecimiento sin un importante efecto perjudicial para el material de plantas (resultados no mostrados). Sin embargo, en casos seleccionados, se descubrió que la eficacia antibacteriana de la mezcla Trc era inadecuada, y para mejorar la eficacia global tuvo que

35 combinarse con GS, lo que mostró una buena actividad antibacteriana. Se descubrió además que 15 mg/l de mezcla Trc o GS eran suficientes para eliminar los hongos patógenos en el medio de crecimiento sin un importante efecto perjudicial para el material de plantas (figura 1). La mezcla Trc no solo potenció la supervivencia en el cultivo de plantas, sino que potenció significativamente el follaje, las raíces y el crecimiento global por encima de la de las plantas de control. GS también potenció la supervivencia en el cultivo de plantas y el crecimiento de follaje, pero el crecimiento de las raíces se vio visiblemente afectado. Por lo tanto, la mezcla Trc muestra un gran potencial para la esterilización, protección y estimulación del crecimiento global de los explantes en el medio de crecimiento.

imagen12

Los ensayos de campo en los que se trataron brotes de vid después del injerto con 30 mg/l de mezcla Trc, GS o una

5 mezcla de GS y mezcla Trc mostraron que el tratamiento dio lugar a una supervivencia de un >15 % mayor de brotes de 2 meses en la viña (figura 3). Los brotes tratados también mostraron visiblemente más follaje, en correlación con los resultados de cultivos de plantas de uva. Esto demuestra que los decapéptidos cíclicos solos o en combinación también tienen eficacia en condiciones de vivero y también bajo condiciones agrícolas.

Los ensayos de flores cortadas en híbridos de la margarita africana (Gerbera hybrid) mostraron que tan solo 35 mg/l

10 de mezcla Trc, GS o GS + mezcla Trc en agua corriente incrementan sustancialmente la absorción de agua (mejora de un >45 %) por encima de la de las flores en agua sola, lo que indica que se suprimen las infecciones oportunistas que bloquean el tallo de la flor. La absorción de agua fue inicialmente mejor que la observada para un producto comercial para la conservación de flores cortadas (figura 4A). Se descubrió que la supervivencia de la mayoría de las flores era de ± 2 días más cuando se trataron con la mezcla Trc que las flores en el control de agua no tratada,

15 GS o GS + mezcla Trc, aunque ligeramente menos flores que las del producto comercial optimizado todavía estaban en condición prístina (figura 4B). Sin embargo, GS a 35 mg/l sola o en GS + mezcla Trc no contribuyó a la supervivencia de la flor y puede haber dado lugar a cierta fitotoxicidad en la Gerbera.

Se realizaron ensayos con flores Delphinium y 25 mg/l y 50 mg de GS o mezcla Trc y GS + mezcla Trc (50 mg/l de concentración combinada). La mezcla Trc a 25 y 50 mg/ml no mostró fitotoxicidad y preservó las flores mejor que los 20 controles en agua corriente. GS en 25 mg/l no mostró fitotoxicidad evidente, pero a 50 mg/l de nuevo se demostró que era fitotóxica. Sin embargo, GS + mezcla Trc, que contenía 25 mg/l de GS en comparación con 35 mg/ml en el ensayo de Gerbera, superó al producto comercial en la conservación de flores Delphinium (figura 5). Estos resultados indican que la mezcla Trc o una combinación óptima de GS + mezcla Trc tienen un buen potencial en formulaciones de productos para prolongar la vida en jarrón de flores cortadas tan diversas como Gerbera spp. y

25 Delphinium spp. en arreglos florales.

Materiales y procedimientos

Ensayos de actividad antifúngica y antibacteriana

La actividad antibacteriana de las tirocidinas y gramicidina S contra todas las bacterias se sometidas a prueba se determinó por los procedimientos descritos por Du Toit EA y Rautenbach M (2000) J. Microbiol. Methods, 42, 159

30 165. La actividad antifúngica de las tirocidinas contra todas las bacterias sometidas a prueba se determinó por los procedimientos descritos por Troskie AM, Vlok NM y Rautenbach M (2012) J. Microbiol. Methods, 91, 551-558.

Ensayos de depósito de hidratación

Las actividades de GS y mezcla Trc también se evaluaron en presencia y ausencia de material de tallo de vid en un entorno de depósito de hidratación simulado. Cada ensayo de 5,0 ml contenía esporas fúngicas a 10000 esporas/ml, 35 péptido a 10 y 20 mg/ml y material de tallo de vid. El material de tallo de vid se lavó con etanol al 70 % y se aclaró con agua estéril antes de disponerlo en depósitos de hidratación inoculados, después de esto se añadió la mezcla Trc. Los controles contenían el péptido o bien material de tallo de vid. Los ensayos se incubaron a temperatura ambiente durante 16 horas, después de esto se sembraron tres alícuotas de 100 ml de cada ensayo en agar PDA y se dejaron crecer durante tres días a 25 ºC. Algunas placas se tiñeron con tinción Brilliant Blue de Coomassie

40 (Coomassie al 0,025 , isopropanol al 12,5 % y ácido acético al 10 %) para una mejor visualización de las colonias fúngicas. Se registró el número de colonias que se desarrollaron después de tres días y se expresó como porcentaje de esporas viables después de su comparación con las muestras de control que no contenían péptido.

Ensayos de cultivo de planta

Se transfirieron plantas de cultivo de tejido de vid a medio MS que contenía GS o mezcla Trc a una concentración de

45 15 μg/ml y se incubaron a 25 ºC con un ciclo día noche 16 h/8 h. Se realizó un seguimiento del crecimiento y desarrollo de las plántulas de vid y se comparó con el conjunto de plantas de control que se mantuvieron en medio MS sin GS o mezcla Trc.

Ensayos de campo de brotes de uva

Se trataron brotes de uva después del injerto por inmersión de 2 x 500 brotes/cubo en 50 l de agua que contenía

50 30 mg/l de mezcla Trc o 30 mg/l de GS. La inmersión secuencial en 30 mg/l de mezcla Trc y 30 mg/l de GS también se realizó en 500 brotes. Se siguieron prácticas de vivero estandarizadas y se incubaron los brotes durante tres meses antes de plantarlos en una viña de vivero. Se contaron los brotes muertos y los brotes viables con follaje después de aproximadamente un mes de crecimiento y se compararon con los brotes de control que se sometieron a la práctica normal.

55 Ensayos de flores cortadas

Se realizaron ensayos de flores cortadas en híbridos pequeños de la margarita africana (Gerbera hybrid) y espuela de caballero azul (Gerbera hybrid) en flores de 3 días. Las flores se prepararon cortando 3-5 cm de cada tallo y se dispuso cada una por separado en un matraz aforado con 100 ml que, o bien no contenía aditivo o bien contenía mezcla Trc (35 mg/l para Gerbera y 25 mg/l para Delphinium), GS (35 mg/l para Gerbera y 25 mg/l para Delphinium),

5 mezcla Trc + GS (70 mg/l combinados para Gerbera y 50 mg/l combinados para Delphinium) o aditivo comercial para la conservación de flores. Las flores (6-12 por ensayo) se mantuvieron en una habitación tanto con luz natural como fluorescente (16 horas de luz/día) a 22 ± 1 ºC. Se realizó un seguimiento del volumen de agua cada 24 horas y se anotó para cada flor.

Se puntuó la condición de la flor de 0 a 5, siendo 0 = muerta, 1 = pétalos de flor deshidratados, cerrados y en caída,

10 2 = flor todavía parcialmente abierta pero deshidratada y en caída, 3 = comienza la caída de la flor, pétalos suaves, 4 = algunos pétalos se vuelven blandos, flor todavía en buenas condiciones y 5 = flor en condiciones prístinas con pétalos y tallo/hojas fuertes.

Claims (8)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de prevención o control del crecimiento microbiano en plantas, material de plantas, partes de plantas o en medios usados para mantener las plantas o el material de plantas, comprendiendo el procedimiento la etapa de aplicar una composición antimicrobiana a las plantas, material de plantas, partes de plantas o medios,

   en el que la composición antimicrobiana comprende un decapéptido cíclico producido a partir de Bacillus aneurinolyticus como agente activo, siendo el decapéptido cíclico una tirocidina, triptocidina o fenicidina o un análogo de las mismas que comprende una secuencia de aminoácidos de ciclo(valina-X1-leucina-Dfenilalanina-prolina-X2-X3-X4-X5-X6) (SEQ ID NO: 1), en la que:

   X1 es ornitina o lisina; X2 es valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano o tirosina; X3 es el isómero D de valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano o tirosina; X4 es asparagina o glutamina; X5 es glutamina o asparagina; y X6 es tirosina, fenilalanina o triptófano.
2. 2. Un procedimiento de mejora del crecimiento de las plantas o vigor de las plantas o de prolongación de la vida de las flores cortadas, comprendiendo el procedimiento la etapa de aplicar una composición antimicrobiana a las plantas, al material de plantas, partes de plantas o medios de crecimiento, o al agua del jarrón para las flores cortadas.

   en el que la composición antimicrobiana comprende un decapéptido cíclico producido a partir de Bacillus aneurinolyticus como agente activo, siendo el decapéptido cíclico una tirocidina, triptocidina o fenicidina o un análogo de las mismas que comprende una secuencia de aminoácidos de ciclo(valina-X1-leucina-Dfenilalanina-prolina-X2-X3-X4-X5-X6) (SEQ ID NO: 1), en la que:

   X1 es ornitina o lisina; X2 es valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano o tirosina; X3 es el isómero D de valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano o tirosina; X4 es asparagina o glutamina; X5 es glutamina o asparagina; y X6 es tirosina, fenilalanina o triptófano.
3. 3. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el decapéptido cíclico esta seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos mostradas en:

   (a)

   una cualquiera de las SEQ ID NOS: 6-59;

   (b)

   una cualquiera de las SEQ ID NOS: 60-113; o

   (c)

   una cualquiera de las SEQ ID NOS: 114-167.

4. 4.

   Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición antimicrobiana contiene más de un tipo de decapéptido cíclico de SEQ ID NO: 1.

5. 5.

   Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la composición antimicrobiana contiene un organismo que produce el decapéptido cíclico.

6. 6.

   Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el crecimiento microbiano que se controla es el crecimiento fúngico.

7. 7.

   Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, que previene o controla el crecimiento de uno o más hongos seleccionados del grupo que consiste en Phaeoacremonium spp., Phomopsis viticola, Fusarium spp., Cylindrocarpon spp., Botrytis cinerea, Talaromyces spp., Aspergillus spp. Penicillium spp., Monilinia spp., Trichoderma spp. y Phaeomoniella spp.

8. 8.

   Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el crecimiento

   61 microbiano que se controla es el crecimiento bacteriano.

   imagen2

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