ES2580804T3 - Métodos, dispositivos y sistemas para ingeniería de tejido óseo utilizando un biorreactor - Google Patents

Abstract

Un método de hacer injertos óseos, que comprende: moldear el andamio de acuerdo con una forma diana del hueso que va a ser reemplazado; formar un soporte con una cavidad que se ajuste apretadamente al andamio resultante del moldeado, y bombear el líquido de perfusión a la cavidad mientras recibe simultáneamente el líquido de perfusión a través de puertos sellados en múltiples puntos hacia y alrededor del andamio, estando los puntos separados y organizados de manera que el líquido de perfusión entre al andamio sobre una superficie de mismo y salga del andamio en estos puntos.

Description

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DESCRIPCION

Metodos, dispositivos y sistemas para ingeniena de tejido oseo utilizando un biorreactor Campo

La presente divulgacion se relaciona en general a ingeniena de tejidos y, especialmente a metodos, dispositivos y sistemas para ingeniena de tejido oseo.

Antecedentes

La reconstruccion de tejido oseo involucra con frecuencia el injerto de tejido autologo. Procedimiento en el cual, el hueso de una parte del paciente se usa para reemplazar hueso perdido o danado en otra parte del paciente. Dado que el injerto de hueso se toma del propio cuerpo del paciente, hay un riesgo reducido de que el cuerpo del paciente rechace el injerto: sin embargo, el tejido autologo puede estar limitado a dificultades en la recoleccion, morbilidad del sitio del donante, y/o capacidad del medico para contornear formas tridimensionales delicadas.

El documento US 2008/0113426 A1 divulga un reactor de perfusion para la ingeniena de tejidos apto para preparar implantes oseos. Un andamio dentro de un tubo de membrana y se expone a la perfusion a traves de puertos conectados al tubo.

El documento US 6,632,651 B1 divulga el sistema de perfusion para el mantenimiento de tejido viable que consta de una camara que contiene un andamio de una forma deseada la cual es impregnada con celulas y una bomba que modela y regula el flujo del fluido.

El documento EP 1359214 A1 divulga un reactor de perfusion para ingeniena de tejidos con andamios para mantener y cultivar celulas. El lfquido de perfusion se extrae de puntos de salida conectados a cada andamio.

Sumario

La disponibilidad de injertos oseos personalizados disenados a partir de las propias celulas madre de un paciente puede revolucionar la forma en la que los defectos oseos son tratados actualmente. Un enfoque “biomimetico” usa celulas madre, factores reguladores y andamios apropiados para guiar la diferenciacion celular y agruparlas en el fenotipo de tejido deseado: asf, un injerto de hueso humano anatomicamente conformado, puede cultivarse ex vivo usando un biorreactor capaz de perfundir grandes andamios porosos complejos. Los andamios se derivan de modelos basados en imagenes de un molde que se siembra y cultiva con celulas madre mesenquimales humanas. El biorreactor rodea el andamio y controla el flujo para la perfusion de las celulas. Un crecimiento celular denso y uniforme se obtiene a traves del constructo como resultado de la perfusion del medio. El biorreactor puede tener un molde en el cual el medio de perfusion es empujado bajo presion, y puertos en multiples sitios a traves de los cuales el medio puede entrar y/o salir del molde.

De acuerdo con la reivindicacion 1, el metodo de hacer un injerto oseo incluye moldear un andamio de acuerdo con la forma del molde oseo que se va a reemplazar, formando un soporte con una cavidad que se ajusta estrechamente al andamio dando como resultado la forma, y bombeando el lfquido de perfusion dentro de la cavidad mientras simultaneamente recibe el lfquido a traves de los puertos sellados en multiples puntos hacia y alrededor del andamio. Los multiples puntos pueden ser separados y dispuestos de tal manera que el lfquido de perfusion entra en el andamio sobre una superficie sustancial de la misma y sale del andamio a los multiples puntos.

Un injerto oseo puede incluir un andamio con celulas. Las celulas pueden organizarse de tal manera que tienen un patron de densidad que es sensible a un patron de flujo de lfquido de perfusion a traves del andamio. El patron de flujo puede incluir un gradiente de disminucion de la densidad de celulas derivadas de focos en la superficie del andamio.

Un metodo de fabricacion de una estructura de tejido puede incluir la formacion de una imagen de una estructura del tejido diana, formando un andamio tridimensional en respuesta a la imagen y sembrando el andamio con celulas. El metodo puede incluir tambien la entrega de nutrientes a las celulas dentro y en la superficie del andamio a traves de un fluido de nutrientes dentro de un recipiente hermeticamente formado que sostiene el andamio, mediante una primera porcion de la superficie del andamio, y hacia fuera a traves de al menos una segunda porcion de la superficie.

Un sistema de ingeniena de tejidos puede incluir un dispositivo mecanizado, un biorreactor y un mecanismo de fluido. El dispositivo mecanizado puede configurarse en un recipiente tridimensional con una superficie interna que adopta la forma de una anatoirna especifica del paciente. El biorreactor tiene un receso para recibir dichos recipientes y puertos de salida configurados para aceptar al menos un lumen y permitir la comunicacion de flujo

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entre al menos un lumen y el volumen interno definido por la superficie interna de dicho recipiente. El mecanismo de fluido se configura para remover el lfquido de perfusion desde al menos un lumen y regresarlo hacia el interior del recipiente.

Un metodo para fabricar una estructura de tejido oseo incluye la siembra de un andamio poroso con celulas madre mesenquimales, y la perfusion de un medio de cultivo a traves del volumen intersticial del andamio poroso por un periodo de tiempo tal que las celulas madre mesenquimales desarrollan laminillas de tejido oseo el cual llena los espacios porosos del andamio.

Breve descripcion de los dibujos

Las Figuras 1A-1B son imagenes de una mandfbula humana mostrando la localizacion del condilo de la articulacion temporomandibular con respecto a la misma.

La Figura 1C es una imagen de un andamio descelularizado conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

La Figura 1D es una imagen de un biorreactor ensamblado conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

La Figura 1E es un diagrama esquematico que muestra el biorreactor con el andamio en su interior conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

La Figura 1F es una vision lateral del modelo tridimensional de un biorreactor con un andamio en su interior, conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

Las Figuras 1G a 1J muestran diversas etapas en el ensamble de un biorreactor, conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

Figura 1K es un diagrama esquematico de un aparato para el soporte de perfusion de un birreactor, conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

La Figura 2 es una tabla que muestra el conteo de cultivo celular bajo diferentes condiciones, conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

Las Figuras 3A a 3H son imagenes de ejemplares oseos formados bajo diferentes condiciones, conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

Las Figuras 4A a 4C son imagenes de un andamio oseo ilustrando cambios en el andamio debido a la perfusion sobre el tiempo, conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

La Figura 5A-5B muestra modelos del fluido del lfquido de perfusion en el andamio del biorreactor, conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

Las Figuras 5C a 5F son imagenes que muestran caractensticas de injertos cultivados, conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

La Figura 6A es una imagen que muestra una tincion de von Kossa de cortes histologicos de sedimentos cultivados bajo condiciones osteogenicas, conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

La Figura 6B es una tabla que muestra el contenido de calcio estandarizado a los valores de ADN de sedimentos de celulas cultivadas durante cuatro semanas en medio osteogenico (ost), condrogenico (ch) o medio control (ctr).

La Figura 6C es una imagen que muestra una tincion con azul alcian e de sedimentos celulares cultivados bajo condiciones condrogenicas.

La Figura 6D es una imagen que muestra una tincion de rojo aceite 0 de gotitas de lfpidos en sedimentos cultivados bajo condiciones adipogenicas.

La Figura 7A es una imagen de un aparato para rotacion de matraces que se usa para sembrar las celulas en el andamio, conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

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La Figura 7B es una imagen que muestra la tincion de hematoxilina-eosina de andamios un d^a despues de la siembra

Las Figuras 8A a 8D son imagenes que muestran los efectos de la velocidad del flujo de perfusion en la densidad celular, conforme a una o mas realizaciones de la materia en cuestion.

Descripcion detallada

La disponibilidad de injertos oseos personalizados disenados a partir de las propias celulas madre del paciente tiene el potencial de alterar la forma en la que los defectos oseos son tratados actualmente. Los injertos oseos con un alto grado de fidelidad a la forma pueden ser producidos, lo cual tiene un bajo riesgo de rechazo por el cuerpo del paciente. La funcionalidad de la ingeniena de injertos oseos se puede evaluar por las propiedades mecanicas y la capacidad de las celulas para hacer la protema especifica de tejido. Los injertos oseos craneofaciales tambien tienen la caractenstica de que su funcionalidad esta ligada a su geometna global.

Los injertos oseos de gran utilidad para cirugfa reconstructiva pueden basarse en “andamios de diseno” formados en geometnas gruesas espedficas para el paciente y el defecto a ser tratado. Los injertos de hueso humano viables, anatomicamente conformadas pueden ser disenados usando celulas madre humanas mesenquimales (hMSCs) y un sistema biorreactor “biomimetico” de andamios. Las tecnicas descritas se pueden utilizar para disenar estructuras de tejido tales como injertos oseos, incluyendo pero no limitado a autoinjertos. Las celulas madre humanas mesenquimales son adecuadas para el uso en aplicaciones craneales y maxilofaciales debido a su facil accesibilidad, capacidad para proliferacion in vitro, y el potencial de formar cartflago, hueso, tejido adiposo y tejido vascular.

El potencial de las celulas madre mesenquimales para su potencial diferenciacion hacia linajes mesenquimales se caracteriza por cada grupo de celulas por sedimentos de cultivo celular bajo condiciones osteogenicas, condrogenicas y adipogenicas para un cultivo por periodo de tiempo, por ejemplo, durante cuatro semanas. La figura 6A muestra una tincion de von Kossa de un corte histopatologico de celulas madre humanas mesenquimales cultivadas bajo condiciones osteogenicas. La figura 6B es un grafico ilustrando el contenido de calcio de las celulas madre humanas mesenquimales cultivadas durante cuatro semanas en medio osteogenico (ost), condrogenico (ch) o medio control (ctr). Los datos en la figura 6B se han estandarizado con respecto a los valores de ADN. La figura 6C representa una tincion con azul alcian de celulas madre humanas mesenquimales cultivadas bajo condiciones condrogenicas, mientras que la figura 6D es una imagen de una tincion con rojo aceite 0 de gotitas de lfquido de celulas madre humanas mesenquimales cultivadas bajo condiciones adipogenicas. De esta forma, las celulas madre humanas mesenquimales se han pre diferenciado segun linajes condrogenicos y osteogenicos. Por otra parte, las celulas madre humanas mesenquimales pueden formar distintas regiones oseas y cartilaginosas. Sin embargo, otros tipos de celulas madre tambien se pueden usar de acuerdo con una o mas realizaciones contempladas.

El control in vitro de la viabilidad celular y desarrollo del tejido en la construccion de tejido oseo clmicamente de tamano y forma determina su utilidad para la medicina regenerativa. La mejora del transporte colectivo y la generacion de cizallamiento hidrodinamico, es importante para el desarrollo y funcionamiento oseo, lo que puede requerir flujo intersticial. De esta forma, se describe en este documento los dispositivos de ingeniena de tejidos, sistemas y metodos para la creacion in vitro de un condilo oseo completo que contiene celulas viables de una densidad fisiologica y una matriz osea bien desarrolladas. En las realizaciones, las celulas madre humanas mesenquimales pueden inducir la formacion de hueso en un andamio descelularizado que tiene la geometna exacta de la estructura osea deseada. Por ejemplo, la estructura osea deseada puede ser el condilo de la articulacion temporomandibular (TMJ), como se senala en las figuras 1A-1B.

Las celulas madre humanas mesenquimales pueden inducir la formacion osea en el andamio usando un biorreactor “anatomico” con control del flujo intersticial. Los patrones de flujo asociados con la geometna compleja del tejido oseo proporcionan una oportunidad unica de correlacionar la arquitectura del hueso formado con las caractensticas del flujo intersticial, bajo condiciones in vitro controlables. Este enfoque puede ayudar a proporcionar una variedad de injertos oseos formados anatomicamente disenados para reunir las necesidades de un paciente determinado y una reconstruccion ortopedica o craneofacial especifica. Otras aplicaciones seran tambien evidentes a partir de la presente descripcion.

Los andamios anatomicamente formados pueden generarse por hueso CNC mecanizado completamente descelularizado (por ejemplo, trabecular) basado en imagenes digitalizadas de la estructura osea deseada. Por ejemplo, el hueso trabecular puede derivarse de la region subcondral de la articulacion de la rodilla de un ternero y posteriormente tratado para remover cualquier material celular. El hueso puede ser lavado con agua a alta velocidad para remover la medula y despues sometido a lavado durante una hora en solucion salina amortiguada por fosfatos (PBS) con 0,1% de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) (p/v) a temperatura ambiente. El hueso puede ser sujeto entonces a lavados secuenciales en solucion isotonica (Tris10mM, EDTA al 0.1% (p/v)) durante la noche a 4°C, detergente (Tris10mM, Dodecilsulfato sodico (SDS) al 0.5% (p/v)) por 24 horas a temperatura ambiente, y solucion enzimatica (50 U/ml de ADNsa, 1U/ml de ARNsa, Tris 10 mM) por 3 a 6 horas a 37°C para eliminar cualquier

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material celular restante. Alternativamente se pueden usar, otros tipos de materiales de andamios. Por ejemplo, el andamio puede estar formado de otro material de origen natural tal como coral, material sintetico como ceramica o poffmero, y/u otras estructuras porosas naturales o sinteticas.

El hueso trabecular descelularizado puede sembrarse con celulas madre humanas mesenquimales y cultivarse con flujo intersticial de un medio de cultivo. Un biorreactor con una camara interna en la forma exacta del hueso humano deseado (por ejemplo, una articulacion temporomandibular humana) controla la perfusion a lo largo de la ingeniena del andamio. Despues del periodo de cultivacion (por ejemplo, 5 semanas), en el tejido de crecimiento puede evidenciarse, por la formacion de las capas confluentes del hueso laminar (por microscopfa de barrido electronico), un marcado aumento del volumen de la matriz mineralizada (por tomograffa cuantitativa microcomputarizada), y la formacion de osteoides (histologicamente). Los experimentos han demostrado que las celulas en una construccion de este tipo son completamente viables a una densidad fisiologica, lo cual es una propiedad deseable en injertos. Ademas, la densidad y arquitectura de la matriz osea se correlaciona con la intensidad y el patron del flujo intersticial, como se determino en estudios con modelos experimentales.

La forma anatomica de una estructura osea, por ejemplo la articulacion temporomandibular de un paciente se puede definir a partir de imagenes medicas digitalizadas, asf como las porciones senaladas en las figuras 1A-1B. La articulacion temporomandibular tiene una importancia clmica y una forma compleja, lo cual puede ser conveniente para evaluar y demostrar las tecnicas de ingeniena y dispositivos descritos en el presente documento. Sin embargo, las tecnicas y dispositivos descritos en el presente documento son igualmente aplicables a otros tipos de huesos y formas. La forma de la estructura osea puede reproducirse fielmente por la construccion de un andamio oseo trabecular descelularizado. Por ejemplo, el andamio se puede preparar moliendo el hueso descelularizado con base en imagenes del paciente de tomograffa computarizada clmica (CT) representando la geometna exacta del condilo humano de la articulacion temporomandibular. Un ejemplo de dicho andamio molido para un condilo de la articulacion temporomandibular se muestra en la figura 1C. Los datos de tomograffas computarizadas pueden alimentar un dispositivo computarizado con el fin de crear un andamio apropiadamente formado de hueso trabecular totalmente descelularizado. Aunque la forma de un condilo de la articulacion temporomandibular se ha mostrado y discutido para el andamio, por supuesto, hay otras formas posibles, dependiente del injerto oseo deseado.

Las celulas madre humanas mesenquimales se pueden cultivar hasta la tercera replicacion y luego ser usadas para la siembra de andamios. Despues de sembrados, los andamios pueden cultivarse con un medio osteogenico, asf como el medio esencial mmimo de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina, dexametasona100 nM, beta-glicerofosfato 10 mM y acido ascorbico-2-fosfato 50 mM. El andamio mecanizado puede ser sembrado en una suspension agitada de celulas madre humanas mesenquimales, por ejemplo, a una densidad de 106 celulas/ml. El andamio puede entonces ser precultivado estaticamente por un periodo adicional de tiempo, por ejemplo, 1 semana, para permitir la union celular. Los andamios de celulas sembradas pueden ser transferidos a las camaras de los biorreactores anatomicos y se aplica el cizallamiento hidrodinamico iniciando la perfusion del medio. La perfusion usando el biorreactor puede realizarse en un periodo adicional de tiempo, por ejemplo, por 4 semanas.

Las figuras 1D a 1F muestran el sistema biorreactor de perfusion de acuerdo con los modelos del presente documento. El sistema biorreactor de perfusion es disenado para controlar la via de perfusion a traves de un andamio 100 geometricamente complejo. Un molde 102 anatomicamente formado sostiene el andamio 100. Debido su diseno modular, las camaras del biorreactor pueden adoptar diferentes geometnas simplemente insertando un molde 102 diferente de forma apropiada, creado, por ejemplo, mediante el uso de imagenes medicas digitalizadas. Adicionalmente, el biorreactor puede hacerse de materiales que permiten la visualizacion no invasiva y el seguimiento de la distribucion del medio dentro de los andamios de tejido a lo largo del periodo de cultivacion.

El interior del biorreactor es disenado para ajustarse a la superficie del andamio. Por ejemplo, el interior del biorreactor puede formarse usando un molde de polidimetilsiloxano (PDMS). El molde de polidimetilsiloxano puede ser creado al trasvasar PDMS alrededor de una pieza molida de CNC de delrin (copoffmero de acetal) generado a partir de las imagenes digitales a fin de duplicar la forma del andamio oseo 100. Una vez el molde de PDMS se haya endurecido, el delrin es eliminado. El andamio 100 se puede colocar en el molde PDMS 102 e insertarse en el biorreactor. El molde PDMS 102 forma una cavidad interior entre la camara 108 interior para sujetar el andamio 100 dentro de esta. Aunque se ha descrito el molde de PDMS, hay otros materiales y tecnicas que pueden ser utilizadas para producir la cavidad interior que alberga el andamio dentro del biorreactor.

Un sistema que provee un software para la generacion de instrucciones de maquina para la fabricacion del andamio y/o el dispositivo de soporte (en los ejemplos, corresponde al molde 102) puede tambien ser proporcionado. El software puede tomar imagenes de la anatomfa diana y producir instrucciones para la elaboracion del dispositivo de soporte o recipiente de manera que tenga paredes como las descritas con respecto al molde 102 en cuestion. El sistema tambien puede estar provisto de un dispositivo de fresado para fabricar una estructura positiva para crear el molde o una estructura negativa para el molde como tal. Otros tipos de “elaboracion” son tambien posibles, tal como pero no limitado a impresion 3D o los sistemas rapidos de prototipado/fabricacion (por ejemplo, dispositivo de foto polimerizacion guiado por computador).

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Las figuras 1G a 1J muestran los pasos para el montaje del biorreactor ejemplar. Un andamio oseo 100 es ensamblado con el molde 102 y ubicado dentro de la carcasa de camara 108 interior del biorreactor. La carcasa de camara 108 interior puede estar hecha, de por ejemplo, polipropileno o polistireno. Una varilla de metal 106 se coloca a traves de los agujeros preformados en el molde 102 y la carcasa de camara 108 interior, a fin de alinear el conjunto con una ranura 110 en la camara 112 exterior. La camara 112 exterior puede ser hecha, por ejemplo de acnlico transparente. Por ejemplo, la camara exterior del biorreactor puede tener un diametro externo de 7.5 cm y una altura de 5 cm. Sin embargo, otros materiales y tamanos adecuados tambien se pueden usar para el biorreactor de acuerdo con uno o mas realizaciones contempladas. En virtud de la alineacion proporcionada por la varilla 106, el ensamble y el andamio dentro de este pueden mantenerse en la orientacion correcta, como se muestra en la figura 1H. El ensamble del andamio 100, molde 102 y carcasa de camara 108 interior insertada en la camara 112 exterior, que son entonces tapadas hermeticamente con una tapa 114. La tapa 114 puede estar hecha, por ejemplo, de polieterimida (PEI). La tapa 114 tambien puede tener una ranura en la misma para acomodar la varilla 106 cuando se sellen la camara 108 interior y camara 112 exterior.

La camara 112 exterior y tapa 114 sirven tambien para comprimir el molde 102 alrededor del andamio 100, forzando de este modo que el medio de cultivo fluya a traves de todo el andamio, en lugar de la canalizacion de la periferia alrededor de la misma. La camara 112 exterior puede tener una pluralidad de puertos cilmdricos radiales, por ejemplo, los orificios 104. Por ejemplo, la camara 112 exterior puede tener seis puertos dispuestos equidistantemente alrededor de la circunferencia de la camara exterior (por ejemplo, a intervalos de 60°). Cada uno de los puertos cilmdricos pueden servir como grna para el control de la posicion exacta y profundidad para la insercion de una aguja 116 dentro del andamio 100, cuyo proposito es discutido en mayor detalle a continuacion. Por ejemplo, la aguja 116 puede ser una aguja de calibre 23. Ajustando anillos de delrin que pueden ser colocados en cada orificio 104. El centro de los anillos de delrin puede ser aprovechado para acomodar tornillos de nylon que han sido nucleados para adaptarse a las agujas de calibre 23 dentro del mismo. Las agujas son ubicadas dentro de los tornillos de nylon de tal manera que los extremos de las agujas sobresalen de los tornillos. Cuando se atornillan dentro de los anillos delrin, el conjunto de tornillos de nylon permite que la aguja penetre el andamio en la camara interior para servir como un puerto de entrada/salida para el flujo del medio.

Uno o mas puertos de salida pueden ser proporcionados en y alrededor del andamio para distribuir uniformemente el fluido a traves del mismo y permitir la perfusion completa de las areas intersticiales del andamio. Tales puertos de salida son mas pequenos que los puertos de entrada.

La ubicacion de cada orificio 104 esta determinada, por ejemplo, por el uso del diseno asistido por un computador basado en una reconstruccion tridimensional de la estructura osea deseada. En los modelos, tres de los seis puertos 104 pueden ser usados como salidas. Un puerto adicional, alineado con el eje central de la camara interna 108, puede ser conectado al tubo 122 mediante un conector 118 (por ejemplo, un conector de luer). Este puerto central sirve como una unica entrada para el medio a introducir en el andamio 100. De esta forma, el flujo entra por el tubo 122 a la camara interna 108, perfunde a traves del andamio 100, y sale a traves de tres (o mas) agujas de salida 116. El tubo 120 conectado a las agujas de salida 116 pueden transportar el lfquido perfundido desde este.

La velocidad de flujo del medio saliendo a traves de los puertos de salida 104 por el tubo 120 puede ser regulada de tal manera que la velocidad de flujo para cada salida es igual. Tal regulacion puede lograrse, por ejemplo al ajustar las abrazaderas en el tubo 120. Alternativamente, los reguladores de flujo en lmea o valvulas pueden ser usadas para controlar la velocidad de flujo de cada salida. Ademas, la velocidad de flujo para cada salida no tiene que ser igual. mas bien la velocidad de flujo puede ser controlado para lograr un perfil de flujo deseado propicio para el crecimiento celular determinado a partir del modelado y/o experimentacion de flujo asistido por computador.

Como se muestra en la figura 1K, el medio de cultivo perfundido traves del biorreactor 1004 puede ser regresado por la bomba 1010 al deposito 1002 para su reutilizacion. El deposito 1002 puede tambien servir como una trampa de burbujas con una salida de aire 1008. La bomba 1010, puede ser por ejemplo, una bomba peristaltica digital multicanal de bajo flujo, que puede recircular el medio de cultivo desde el deposito 1002 al biorreactor. El medio en el reservorio 1002 puede ser cambiado periodicamente a traves del puerto 1006 del deposito. Por ejemplo, una jeringa puede conectarse al puerto 1006 para eliminar esterilmente el medio de cultivo y agregar medio de cultivo al deposito sin perturbar la operacion del biorreactor 1004. El deposito puede contener un volumen inicial de, por ejemplo, 40 ml de medio de cultivo. La mitad del medio de cultivo en el deposito puede ser reemplazada, por ejemplo, cada tres dfas.

La ingeniena de tejidos de la construccion de grandes huesos requiere flujo a traves del intersticio y/o poros del andamio para un transporte eficiente de nutrientes y de material de desecho entre las celulas y el medio de cultivo. Adicionalmente, el flujo intersticial permite una exposicion directa de celulas al cizallamiento hidrodinamico lo cual puede ser importante para la osteogenesis. La velocidad de flujo volumetrica (por ejemplo 1,8 ml/min) y la correspondiente velocidad superficial (por ejemplo un promedio de 0,06 cm/s) pueden ser seleccionadas para sostener el crecimiento de tejido denso a lo largo del andamio. Por ejemplo, las tasas de flujo pueden ser seleccionadas con el fin de estar dentro de la gama de indices de flujo y velocidades superficiales que estimulan la diferenciacion osteogenica de las de las celulas madre humanas mesenquimales.

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Las celulas pueden ser cultivadas en un andamio que tiene las propiedades estructurales, bioqmmicas y mecanicas del hueso original y la geometna real del injerto final. Por ejemplo, el andamio puede estar formado de hueso completamente descelularizado, el cual ha sido elaborado, por ejemplo por la fabricacion guiada por imagen, para lograr la geometna deseada del injerto final. El volumen de vado de dicho hueso descelularizado fue determinado por un analisis de micro-CT, el cual es mayor del 80%. Los analisis de microscopfa electronica de barrido (SEM) e histologicos del hueso descelularizado tambien revelan tamanos de los poros de aproximadamente 1 mm. Dichas caractensticas estructurales permiten la siembra dinamica eficiente y espacialmente uniforme de las celulas madre humanas mesenquimales en los andamios. la evaluacion histologica de los andamios recien sembrados demostro que las hMSCs alinean las paredes porosas internas, mientras dejan espacios porosos despejados. En referencia a la figura 7A, un matraz de spinner (la tapa muestra elaboraciones de la articulacion temporomandibular) puede ser usada para sembrar celulas en los andamios de una articulacion temporomandibular. La figura 7B muestra una tincion de hematoxicilina-eosina (H&E) de un andamio un dfa despues de sembrado. Como es evidente en la figura 7B los espacios porosos en el andamio permanecen abiertos, y las celulas pueden encontrarse solo a lo largo de las paredes de los poros (vease las flechas en la figura 7B). La figura 7C muestra una tincion via/muerta de un andamio un dfa despues de sembrado. Como es evidente en la figura 7C, un alto porcentaje de celulas viables se puede mantener durante todo el proceso de siembra.

Despues de una hora, se encontro que la eficiencia de la siembra fue de 34,0 ± 7,1% dando como resultado aproximadamente 3,4 x 106 celulas por construccion, fijadas de una manera espacialmente uniforme. Los andamios se cultivaron estaticamente por una semana antes de su colocacion en los biorreactores, permitiendo la union celular firme y deposicion de la matriz extracelular antes de la exposicion a fuerzas hidrodinamicas de cizalladura. Por supuesto, otros metodos y dispositivos para la siembra de andamios son contemplados.

Despues de sembrado, el andamio puede ser ensamblado en condiciones esteriles en el biorreactor, como se discute al respecto en las figuras 1G a 1J. El rapido montaje puede mantener la viabilidad celular en el andamio durante el proceso. Usando el biorreactor, el medio de cultivo puede ser perfundido a lo largo de todo el andamio. Para una determinada velocidad de flujo, la velocidad de flujo de salida se mantiene igual en cada una de las tres salidas, aunque las tasas de flujo diferenciales son tambien posibles. La velocidad optima de flujo de entrada puede ser determinada basandose en el analisis de flujo de fluido, el modelado asistido por computador para los datos experimentales. Por ejemplo, la velocidad de flujo de entrada puede estar entre 0,4 ml/min y 1,8 ml/min. La evaluacion experimental de la densidad y distribucion celular despues de 5 semanas de cultivado sugiere que 1.8 ml/min pueden producir la mejor distribucion celular y el mas rapido desarrollo de tejido para el biorreactor descrito. Basado en analisis de micro-CT el promedio del area del corte transversal a traves de los andamios en la direccion de flujo se determino que era 0,5 cm2. Para esta area del corte transversal, la velocidad de flujo de entrada de 1,8 ml/min corresponde a un promedio de la velocidad de flujo superficial de 0,06 cm/s. Sin embargo, otras tasas de flujo y/o velocidades de flujo superficiales pueden elegirse dependiendo de, por ejemplo, la geometna del biorreactor, el tipo de celula madre, el tamano del andamio, el tipo de andamio, y/o tamano de los poros.

Debido a la compleja distribucion del flujo dentro de los andamios de tejido, las tasas de flujo tan altas como 0,15 cm/s son posibles en ciertas regiones del andamio, y tan bajas como 0,0001 cm/s en otras regiones del andamio. En todo el intervalo de estas velocidades de flujo, las hMSCs pueden mantener completamente la viabilidad y exhibir las caractensticas de diferenciacion osteogenica. Tampoco hay ningun umbral aparente en la velocidad de flujo del fluido en el que la perfusion se vuelve perjudicial por las hMSCs. Por lo tanto, es posible que el crecimiento del tejido pueda ser mejorado mediante el aumento de las tasas de flujo en el biorreactor por encima de la velocidad de flujo de entrada de 1,8 ml/min descrita anteriormente.

Las densidades celulares finales fueron aproximadamente 105 - 210 x 106 celulas/ml. Tales altas densidades de celulas pueden ser importantes para la formacion funcional de tejido oseo para la interaccion celula-celula. Para los modelos estaticamente cultivados, el pobre empaquetamiento de las celulas (indicado por SEM) y solo minima formacion osteoide (indicado por histologfa) proporcionaron evidencia de diferenciacion funcional limitada de las hMSCs en las regiones interiores de estas realizaciones. Para los modelos de biorreactores cultivados, diversas modalidades de imagen, discutidas a continuacion, confirmaron que las celulas forman tejidos densos a traves de los volumenes de constructo, llevando a un mayor incremento en el volumen del hueso.

Con referencia a las figuras 8A a 8D, muestran los efectos del flujo de perfusion en la densidad celular en el andamio. Las figuras 8A a 8D son tinciones de H&E de las regiones centrales del andamio cultivado durante 5 semanas bajo diferentes condiciones de flujo. En la figura 8A fue cultivada fue cultivado bajo condicion estatica (por ejemplo, no flujo). En la figura 8B fue cultivado bajo una velocidad de flujo de entrada de 0,4 ml/min. En la figura 8C fue cultivado bajo una velocidad de flujo de entrada de 0,8 ml/min. En la figura 8D fue cultivado bajo una velocidad de flujo de entrada de 1,8 ml/min. Como se evidencia en las figuras 8A a 8D, el aumento en la velocidad de flujo lleva al deposito cada vez mas denso de la matriz en los espacios porosos.

A traves de la perfusion del andamio de la manera descrita mediante el biorreactor, las celulas son capaces de proliferar en el andamio, con el fin de formar un injerto oseo viable. En los experimentos, las celulas proliferan extensivamente durante la primera semana de cultivo, como se evidencio en aproximadamente un aumento de 7,5

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veces en el contenido de ADN. El contenido de ADN continuo aumentando en todo el periodo de cultivo bajo ambas condiciones de cultivo, tanto en la estatica (4,5 veces mas) como en la perfundida (10 veces mas), lo que resulta en general 37 y 35 veces mas, respectivamente, en el numero de las celulas en relacion con sus valores de siembra iniciales. Con referencia ahora a la figura 2, el numero de celulas aumento con el tiempo de cultivo y perfusion del medio. Desde el dfa 1 al dia7, el numero de celulas aumento 7,5 veces, de 3,4 x 106 a 25 x 106 celulas/andamio. Sobre las siguientes cuatro semanas, el numero de celulas en cultivo estatico aumento 4,5 veces, aproximadamente 110 x 106 celulas/andamio. Mientras que el aumento en el cultivo del biorreactor perfundido fue 10 veces mas, aproximadamente 250 x 106 celulas/andamio.

Con referencia a las figuras 3A a 3H, la formacion de hueso fue marcadamente reforzada por la perfusion en una manera que respondiera al patron de flujo de fluido. Las figuras 3A A 3D muestran andamios cultivados bajo condiciones estaticas mientras que las figuras 3E a 3H muestran andamios cultivados con medio de perfusion en el biorreactor en cuestion. Las figuras 3A y 3E muestran una tincion con tricromico de la totalidad de los cortes transversales de los andamios, que muestran las diferencias en la distribucion de la nueva matriz comparado con el andamio original para los grupos de cultivo estatico (figura 3A) y perfundido (figura 3E). Ademas, las diferencias significativas se pueden observar en la formacion osteoide (flechas) en la region central de los andamios cultivados estaticamente (figura 3B) y de perfusion (figura 3F).

Las figuras 3C, 3D, 3G y 3H son imagenes de microscopfa electronica de barrido (SEM) de las regiones centrales del andamio. En especial, las figuras 3C y 3D muestran que los andamios cultivados estaticamente exhiben espacios porosos vacfos y celulas pobremente empaquetadas. Por el contrario, las figuras 3G y 3H muestran que los andamios cultivados en perfusion demuestran la formacion de laminas densas y confluentes de tejido oseo que llenan todo el espacio poroso. Los incrementos medidos en el numero de celulas con el tiempo y regimen de cultivo han sido corroborados con los datos de imagenes. Los andamios cultivados bajo condiciones estaticas forman nueva matriz primaria en la periferia (figura 3A), mientras que los andamios que crecen en el biorreactor muestran un nuevo crecimiento a lo largo de sus volumenes (figura 3E). Los cortes histologicos demostraron marcado contraste en el crecimiento celular y formacion de patron osteoide en las regiones centrales de los dos grupos de cultivo (figura 3B y 3F). La nueva area osteoide estandarizada a hueso trabecular existente en las regiones centrales del andamio estatico fue de 0,031 ± 0,013 mm2/mm2, comparado con 0,210 ± 0,022 mm2/mm2 para los andamios perfundido (por ejemplo un incremento de 7 veces debido a la perfusion). Las imagenes de microscopfa electronica de barrido (SEM) de las regiones internas de los andamios de tejido corroboran estos hallazgos, sin embargo estos fueron singularmente instructivos. Las regiones internas de los andamios estaticos mostraron espacios porosos que estaban vacfos o unicamente empaquetados pobremente con las celulas y matriz (figuras 3C y 3d), a diferencia de los andamios perfundidos, los cuales mostraron espacios porosos densamente empaquetados a lo largo de todos sus volumenes (figuras 3G y 3H).

Las figuras 4A fue tomada en el momento del inicio del proceso de perfusion, la figura 4B en medio del proceso de perfusion, y la figura 4C al finalizar el proceso de perfusion. En particular estas figuras ilustran el desarrollo de la arquitectura de la matriz osea mineralizada del andamio con el tiempo y de una manera dependiente de las condiciones de cultivo. Asf, las imagenes muestran los cambios en la estructura de los poros (en relacion con el estado inicial) que fueron evidentes al finalizar el periodo de cultivo de cinco semanas. Los andamios biorreactor muestran una mas rapida deposicion de la nueva matriz mineral en comparacion con los andamios estaticos. La deposicion mineral en los espacios porosos se evidencia tambien en las figuras 4A-4C. Se observo un incremento estadfsticamente significativo en el volumen oseo en relacion con el tiempo de cultivo en ambos tipos, el andamio estatico (8.7%) y el perfundido (111%), con el consiguiente incremento en el numero de trabecular (Tb.N*) y el espesor (Tb.Th), y la disminucion de la separacion trabecular (Tb.Sp*). Los numeros del mdice de modelo estructural (SMI) para los andamios estaticos y perfundidos fueron mas bajos despues de la cultivacion, lo que indica una tendencia hacia la formacion de las trabeculas en forma de placa.

El modelado asistido por computador se puede realizar para evaluar el efecto de los parametros de flujo de perfusion. Un ejemplo de tal modelo de computador para un andamio de la articulacion temporomandibular en el biorreactor descrito se muestra en las figuras 5A-5B. En particular, la modelizacion teorica del flujo en el andamio indica una amplia distribucion en la magnitud (0 a 0,15 cm/s) y las direcciones de las velocidades de flujo dentro de los modelos. Las velocidades de flujo fueron mas altas en las regiones de entrada y salida, adyacentes a los puertos de agujas. Debido a la compleja geometna del andamio, su base plana no esta en el centro de la camara, lo que resulta en gradientes espaciales de la distribucion de flujo a traves de la base. Las velocidades de flujo mas bajas se encontraron en las proyecciones externas derechas e izquierdas de los andamios con el vector de velocidad calculado indicando alrededor de cero en los extremos (figura 5A), ya que la aguja de salida no fue colocada en la punta de la proyeccion. Los estudios mostraron que el medio hace de hecho que se perfundan estas regiones extremas. El analisis histologico de andamios de cinco semanas demostro claramente la supervivencia celular y la produccion de la matriz en estas regiones.

Con referencia a las figuras 5A-5F, la morfologfa de la matriz osea se ha correlacionado con los patrones del medio de perfusion del flujo. La figura 5A muestra vectores de velocidad codificados por colores indicando la magnitud y direccion del flujo a traves del andamio basado en parametros medidos experimentalmente. La figura 5B esta

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seccionada digitalmente, y los contornos codificados por colores se usan para indicar la magnitud del flujo en las regiones interiores. Las imagenes de microscopfa electronica de barrido (SEM) mostraron variaciones morfologicas en la morfologfa del tejido con la variacion en el patron del flujo del fluido. Por ejemplo, en las regiones del medio donde el flujo del fluido es unidireccional, el tejido parece suave y alineado, y las estructuras cristalinas pueden verse facilmente en la superficie (figuras 5C-5D). En la base de la proyeccion cerca al puerto de salida, el modelo indica grandes cambios locales en el vector de velocidad, resultando efectivamente en patrones de flujo remolino. La gran ampliacion de las imagenes de microscopfa electronica de barrido de esta zona demostro un remolino correspondiente a la estructura de matriz mineralizada (figura 5E-F).

Por lo tanto, el enfoque descrito en este documento demuestra que es posible crear los injertos de hueso usando un

biorreactor que (i) guarda los andamios de tejido formados anatomicamente con geometnas complejas, (ii) proporciona flujo intersticial controlado del medio de cultivo a traves de los espacios porosos de los andamios, y (iii) permite el establecimiento de protocolos de cultivo para la ingeniena de injertos de huesos humanos grandes.

Varias operaciones de ingeniena de tejidos se pueden emplear incluyendo, pero no limitandose a (i) fabricacion de andamios anatomicos guiados por imagen, (ii) uso de hueso descelularizado como un andamio osteoinductivo, (iii) uso de poblacion de celulas madre mesenquimales pluripotenciales, aplicables a formas autologas o alogenicas, (iv) la perfusion basada en el control del ambiente y la estimulacion bioffsica de los modelos oseos cultivados, y (v) la optimizacion del modelado computacional del diseno del biorreactor.

Un metodo para la ingeniena de tejido oseo puede incluir por separado o en combinacion: (i) la formacion de imagenes al menos una parte de un paciente para un injerto oseo deseado, (ii) la realizacion de un andamio poroso a la forma del injerto oseo deseado, (iii) sembrar el andamio poroso con hMSCs, y (iv) la perfusion del medio de cultivo a lo largo del volumen intersticial del andamio poroso por un periodo de tiempo para que las hMSCs desarrollen laminas de tejido oseo que llenan los espacios porosos del andamio.

Los metodos, sistemas y dispositivos para la ingeniena de tejidos descritos en este documento permiten asf la formacion de modelos oseos geometricamente complejos de alta fidelidad biologica y estructural. El modelo computacional del flujo de fluido tambien puede proporcionar pistas importantes sobre la respuesta del tejido a los estfmulos bioffsicos. Aunque se han discutido configuraciones particulares en el presente documento, pueden emplearse otras configuraciones. Ademas, la anterior descripcion se aplica, en algunos casos, a los ejemplos generados en un laboratorio, pero estos ejemplos pueden extenderse a tecnicas de produccion. Por ejemplo, cuando las cantidades y tecnicas se aplican a ejemplos de laboratorio, estas no deben entenderse como limitantes. Adicionalmente, aunque la produccion de injertos de tejido oseo se ha descrito en este documento, las tecnicas descritas son aplicables tambien a otros tejidos.

Claims (8)

1. Reivindicaciones

   1. Un metodo de hacer injertos oseos, que comprende:

   moldear el andamio de acuerdo con una forma diana del hueso que va a ser reemplazado;

   formar un soporte con una cavidad que se ajuste apretadamente al andamio resultante del moldeado, y

   5 bombear el Kquido de perfusion a la cavidad mientras recibe simultaneamente el Kquido de perfusion a traves de puertos sellados en multiples puntos hacia y alrededor del andamio, estando los puntos separados y organizados de manera que el lfquido de perfusion entre al andamio sobre una superficie de mismo y salga del andamio en estos puntos.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el receptor incluye recibir el lfquido de perfusion a traves de las agujas, 10 cada una insertada en el andamio en uno correspondiente de los puntos multiples.
3. 3. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el lfquido de perfusion incluye un nutriente.
4. 4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el andamio es sembrado con celulas.
5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el bombeo se continua por un periodo de dfas.

   15 6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el soporte es de un material transparente.
6. 7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el soporte esta alojado en una camara transparente.
7. 8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el moldeado incluye generar imagenes de la

   forma diana y la elaboracion de una palanquilla de andamio en respuesta a los datos que definen una imagen

   20 resultante de dicha generacion de imagenes.
8. 9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas: el modelado del flujo del lfquido de perfusion a traves del andamio, y

   la seleccion de los puntos multiples en respuesta al resultado de la modelizacion.