ES2581277T3 - Composición mejorada para inhibir la proliferación de células tumorales - Google Patents
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Abstract
Una célula dendrítica (CD) proinflamatoria, que ha sido estimulada para la maduración ex vivo mediante el tratamiento con las sustancias sal sódica del ácido poliinosínico-policitidílico (poli-I:C), resiquimod (R848) e interferón γ (IFN-γ), pero no con la prostaglandina E2 (PGE2), para ser usada para el tratamiento contra el cáncer en un individuo diferente de la fuente de las CD maduras proinflamatorias, en donde el uso es por inyección en el interior del tumor.
Description
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DESCRIPCION
Composicion mejorada para inhibir la proliferacion de celulas tumorales Campo de la invencion
Esta invencion pertenece en general al campo del tratamiento del cancer. Mas en particular, la invencion se refiere a la inmunoterapia contra el cancer, y mas en particular a una inmunoterapia celular para la inhibicion de la proliferacion de las celulas tumorales.
Antecedentes
Las vacunas se han utilizado desde hace tiempo para prevenir las enfermedades infecciosas, tales como las infecciones vmcas o microbianas. La respuesta celular del sistema inmunitario tiene entre sus principales cometidos proporcionar al hospedador la capacidad para defenderse, recuperarse de las infecciones e impedir otras infecciones por el mismo antfgeno. Los mecanismos inmunitarios celulares tambien se cree que son utiles contra el cancer.
Las celulas dendnticas (CD), las celulas presentadoras de antfgeno (CPA) mas potentes, desempenan una funcion central en el inicio y regulacion de las respuestas inmunitarias. Tienen la capacidad unica de sensibilizar los linfocitos T indiferenciados y desencadenar e inducir las respuestas eficaces de linfocitos T citotoxicos (LTC). Las precursoras de las CD estan presentes en la sangre circulante y se pueden atraer con rapidez a los sitios de infeccion o de inflamacion. Cuando las precursoras de las CD se diferencian en CD inmaduras, se vuelven muy eficaces a la hora de captar y procesar los antigenos de las protemas exogenas. En respuesta a diferentes estfmulos de la maduracion, tales como componentes bacterianos y vmcos que expresan ligandos del receptor de tipo Toll (TLR), citocinas inflamatorias y/o interacciones espedficas de linfocitos T (interacciones entre el ligando de CD40 y CD40), inician un proceso de diferenciacion que conduce a la disminucion de la captacion del antigeno y de la capacidad de procesamiento, y a un incremento de la expresion de moleculas coestimuladoras y del CMH. Es importante senalar que la intensidad de la senal y la persistencia de las senales que induce el reconocimiento directo de los patogenos (p. ej., los TLR) o la ligacion a CD40 se ha demostrado que son determinantes cnticos de las funciones espedficas de las CD. Por lo tanto, las CD se ven inducidas a termino por factores de activacion en los sitios perifericos, para cumplir 1 de las 2 funciones mutuamente excluyentes, esto es, o migrar a los ganglios linfaticos (como CD migratorias maduras) para la interaccion eficaz con los linfocitos T, o bien acondicionar el microentorno mediante la produccion de grandes cantidades de mediadores inflamatorios, entre ellos quimiocinas y citocinas (como CD proinflamatorias maduras).
Las estrategias inmunoterapicas contra el cancer que ya existen y que se centran en las CD se basan todas en la premisa de que la calidad de la respuesta de los linfocitos T depende principalmente de la capacidad que tienen las CD migratorias para procesar y presentar antfgenos tumorales a los linfocitos T en los organos linfaticos secundarios, y asf pues crear una respuesta de LTC espedfica contra el tumor, lo que conduce a un ataque inmunitario contra las celulas cancerosas. Los datos de diferentes modelos tumorales de raton han demostrado que se puede desencadenar tal respuesta de acuerdo con una de las tres estrategias principales, bien conocidas por el experto en la tecnica. Estas estrategias inmunoterapicas contra el cancer se estan comprobando activamente en la actualidad en los humanos, pero todas con escaso exito.
La primera estrategia es activar y madurar las CD migratorias cargadas de antfgeno desde el paciente portador del tumor ex vivo y posteriormente reintrodudrselas al mismo paciente. La carga de antfgeno se realiza tfpicamente mediante la adicion de antfgenos asociados al tumor (celulas tumorales lisadas, protema, peptidos o acidos nucleicos que codifican tales antfgenos) a las CD inmaduras procedentes de monocitos y la posterior activacion/maduracion de las CD cargadas de antfgeno con diferentes combinaciones de factores inflamatorios. Las CD reintroducidas se supone que migran a los ganglios linfaticos de drenaje, donde sensibilizan a los linfocitos T espedficos del tumor. Los linfocitos T sensibilizados por las CD, en particular los LTC, viajan a continuacion al sitio del tumor, donde posteriormente inducen la apoptosis de las celulas tumorales.
En «Maturation of monocyte-derived dendritic cells with Toll-like receptor 3 and 7/8 ligands combined with prostaglandin E2 results in high interleukin-12 production and cell migration», CANCER IMMUNOLOGY IMMUNOTHERAPY, vol. 57 (11), 2008, pags 1589-1597, Boullart et al. describen que las CD maduradas con poli(I:C) (ligando del TLR3) y/o R848 (ligando de los TLR7/8) son capaces de producir cantidades inmensas de IL-12p70, pero muestran menos capacidad migratoria, lo que dificulta la migracion a los ganglios linfaticos. La adicion de la prostaglandina E2 (PGE2) mejoro la capacidad migratoria de las CD maduradas por el ligando del TLR, al mismo tiempo que mantiene su produccion de IL-12p70 tras el encuentro con los linfocitos T. Sin embargo, en el ambito clmico, la manipulacion ex vivo de las CD propias, a saber, autologas, de los pacientes lleva mucho tiempo y expone al paciente a un mayor riesgo de infecciones. Tambien resulta tedioso el proceso de manipulacion en el cual las CD reciben una breve sensibilizacion con antfgenos tumorales y se activan en CD migratorias que presentan con eficacia los antfgenos tumorales.
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La segunda estrategia principal, que elude la necesidad de la propagacion ex vivo de las CD migratorias procedentes de paciente, comprende la administracion de anftgenos tumorales, entre ellos las celulas tumorales alogenas irradiadas, o plasmidos que codifican anftgenos tumorales, en tejidos normales intactos, entre ellos las inyecciones subcutaneas o intramusculares. Los anftgenos tumorales se complementan con los denominados adyuvantes, que tienen el objetivo de desencadenar una respuesta inmunitaria mediada por las CD in vivo. Los adyuvantes que se utilizan con mas frecuencia son quimiocinas, citocinas o plasmidos que codifican estos factores, y/o factores de maduracion de las CD, tales como el factor a de la necrosis tumoral (TNF-a) y/o agonistas de los TLR.
Sin embargo, la administracion del antfgeno tumoral exogeno es un proceso tedioso.
La tercera estrategia principal, que tambien elude la necesidad de la propagacion ex vivo de las CD migratorias procedentes del paciente, incluida en la primera estrategia principal y que, ademas, elude la necesidad del antfgeno tumoral exogeno, incluida en la segunda estrategia principal, tiene en cuenta un adyuvante que se inyecta directamente en los tumores. Asf pues, se desea que el adyuvante actue selectivamente sobre las CD in vivo y el tumor del paciente actua como una fuente de anftgenos asociados al tumor. Los adyuvantes que se han analizado son parecidos a los descritos en la segunda estrategia principal: quimiocinas, citocinas o plasmidos que codifican estos factores y/o factores de maduracion de las CD, tales como el TNF-a y los agonistas de los TLR. Sin embargo, un tumor viable puede ser una mala fuente del anftgenos asociados al tumor para las CD inmaduras atrafdas debido a que no haya una cantidad suficiente de celulas tumorales muertas, preferiblemente inducidas por apoptosis, y que puedan ser engullidas por estas CD.
Las tres estrategias mencionadas mas arriba se han comprobado en los pacientes humanos con cancer, pero con escaso exito. Por lo tanto, hay una necesidad obvia de mas vacunas terapeuticas eficaces y de metodos mejorados para el tratamiento del cancer.
Compendio
Por consiguiente, la presente invencion busca preferiblemente solventar las deficiencias identificadas mas arriba en la tecnica, por sf solas o en cualquier combinacion, y soluciona al menos los problemas mencionados mas arriba al proporcionar una celula dendntica madura proinflamatoria que produce una gran cantidad de quimiocinas deseables e interleucina 12 (IL-12), una composicion que comprende tal celula dendntica proinflamatoria, un metodo para producir tal celula dendntica proinflamatoria, un uso de dicha celula dendntica proinflamatoria o dicha composicion como un medicamento, y un uso de dicha celula dendntica o dicha composicion para el tratamiento del cancer.
Asf pues, en un primer aspecto, se da a conocer una celula dendntica (CD) proinflamatoria, que se ha estimulado para que madure ex vivo mediante el tratamiento con las sustancias sal sodica del acido poliinosmico-policitidflico (poli-I:C), resiquimod (R848) e interferon y (IFN-y), pero no con la prostaglandina E2 (PGE2), para ser usada para el tratamiento contra el cancer en un individuo diferente al de la fuente de las CD maduras proinflamatorias, en donde el uso es la inyeccion intratumoral.
En un segundo aspecto, se da a conocer una composicion farmaceutica que comprende CD proinflamatorias de acuerdo con el primer aspecto, uno o varios excipientes farmaceuticamente aceptables y, opcionalmente, celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP), para ser usada para el tratamiento contra el cancer en un individuo diferente al de la fuente de las CD maduras proinflamatorias, en donde el uso es la inyeccion intratumoral.
Se definen otras realizaciones de la invencion en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invencion difiere de la tecnica anterior en que produce una gran cantidad de citocinas deseables, tales como la quimiocina ligando 9 (motivo C-X-C) (CXCL9), tambien conocido como MIG, quimiocina 3 de motivo C-C (CCL3), tambien conocida como protema 1a inflamatoria de macrofagos (MIP-1a), factor a de la necrosis tumoral (TNF-a), IL-1p e IL-12 despues de la retirada de los esftmulos de activacion, y asf pues son idoneos para ser usados, tal como por inyeccion, sin la presencia de factores exogenos estimulantes de la maduracion.
Cuando se inyectan dentro del tumor en un paciente en una preparacion alogena, a saber, el paciente es diferente al donante de quien proceden las CD proinflamatorias, o las CMSP, utilizadas para crear la CD proinflamatoria, tal DC proinflamatoria activara las propias CD de los pacientes, de tal modo que se diferenciaran en las CD migratorias cargadas con el tumor. Este efecto se debe a la capacidad que tienen las CD proinflamatorias inyectadas para producir grandes cantidades de una combinacion de citocinas deseables e IL-12, entre ellas la quimiocina MIP- 1a/CCL3 que atrae CD, linfocitos citolfticos naturales y linfocitos T de la memoria, la quimiocina MIG/CXCL9 que atrae linfocitos citolfticos naturales y linfocitos T de la memoria, asf como la citocina IL-12 que activa los linfocitos citolfticos naturales. Ademas, una ventaja de las CD maduras, tales como las CD maduras proinflamatorias, frente a las CD inmaduras es que potencian la activacion de los linfocitos citolfticos naturales mediante el contacto de una celula con otra. El hecho de que las CD proinflamatorias esten libres de factores exogenos fuertes de activacion, tal como maduracion, es una ventaja, ya que la presencia de factores exogenos fuertes de activacion dentro del tumor puede, si no, desencadenar una diferenciacion de las CD propias del paciente atrafdas al interior del tumor en CD proinflamatorias especfticas del paciente, o sea, propias, y no en las CD migratorias deseables espedficas del paciente. Asf pues, se necesitaran al menos 18 horas de estimulacion para conseguir probablemente una expresion
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alta de moleculas como CD86 en una CD en maduracion para darle la capacidad optima para activar un linfocito citolttico natural. De acuerdo con la tecnica anterior, las CD activadas/maduras son incapaces de producir cantidades significativas de IL-12 al cabo de 18 horas. Si se aborta la activacion despues de tan solo 8 horas, quedana pendiente una produccion. Sin embargo, estas CD no han tenido tiempo de inducir moleculas relevantes que activen los linfocitos citolfticos naturales.
Se sabe que el trasplante con organos, tejidos o CD maduras alogenos induce una fuerte inmunizacion que conduce a la expansion de los linfocitos T CD4+ alorreactivos que son espedficos de los peptidos alogenos derivados del CMH que se presentan con las propias moleculas del CMH de clase II (llamada la via indirecta de alorreconocimiento). Mediante el uso de CD proinflamatorias alogenas para la inyeccion intratumoral, las CD posteriormente seran destruidas (rechazadas) por el sistema inmunitario del hospedador y, gracias a ello, se convertiran en una fuente de epftopos muy inmunogenos para los linfocitos T cooperadores CD4+ (peptidos alogenos derivados del CMH) que seran capturados por las CD atrafdas propias y lo mas probable es que contribuyan a romper la tolerancia CD8 a los antfgenos tumorales en los pacientes portadores de tumores. Asf pues, las CD proinflamatorias actuanan como adyuvante y no como CD migratorias, lo que es a la vez ventajoso y diferente en comparacion con la tecnica anterior. Por ejemplo, si la prostaglandina E2 (PGE2) esta incluida en diferentes cocteles de maduracion de CD, la CD madura se convertira en una CD migratoria que abandonara rapidamente el sitio de la inyeccion (tumor), lo que es una desventaja dentro del contexto de esta invencion.
Mediante el uso de las CD alogenas, a saber, en un individuo diferente del que se aislaron, o donante, de las CD maduras proinflamatorias o las CMSP, tal posible adyuvante no se ha preparado individualmente para cada paciente concreto y permite la produccion a gran escala con la consiguiente disminucion de los costes de fabricacion. Ademas, la vacuna se puede congelar y transportar a grandes distancias, que mejora ademas su viabilidad comercial.
Breve descripcion de los dibujos
Estos y otros aspectos, caractensticas y ventajas de los que es capaz la invencion resultaran obvios y se deduciran de la siguiente descripcion de las realizaciones de la presente invencion, en la que se hace referencia a los dibujos acompanantes, en los que
la figura 1 es una ilustracion esquematica de un metodo de acuerdo con el tercer aspecto; la figura 2 es una ilustracion esquematica de un metodo de acuerdo con el cuarto aspecto;
la figura 3 son graficos que muestran la produccion de CCL3/MIP-1a (figura 3C), CCL5/RANTES (figura 3A) y CXCL9/MIG (figura 3B) desde las CD maduras proinflamatorias de acuerdo con el primer aspecto;
la figura 4 es un grafico que muestra la produccion de IL-12 desde las CD maduras proinflamatorias de acuerdo con el primer aspecto;
la figura 5 son graficos que muestran la produccion de la IL-1p y del TNF-a por una composicion de acuerdo con el segundo aspecto;
la figura 6 son graficos que muestran la produccion de la IL-1p y del TNF-a por una composicion de acuerdo con el segundo aspecto;
la figura 7 es un grafico que muestra la produccion del IFN-y por una composicion de acuerdo con el segundo aspecto;
la figura 8 son graficos de FACS que muestran la influencia de diferentes sustancias sobre la maduracion de las CDi;
la figura 9 son graficos de FACS que muestran la influencia de las CD maduras proinflamatorias de acuerdo con el primer aspecto, o una composicion de acuerdo con el segundo aspecto, sobre la maduracion de las CDi.
la figura 10 es un grafico que muestra el volumen tumoral de un estudio que contempla una realizacion;
la figura 11 muestra fotos de los resultados histopatologicos (tumor primario) de un estudio que contempla una realizacion;
la figura 12 muestra fotos de los resultados histopatologicos de control (tumor primario) de un estudio que contempla una realizacion.
la figura 13 muestra fotos de los resultados histopatologicos (tumor secundario) de un estudio que contempla una realizacion; y
la figura 14 muestra fotos de los resultados histopatologicos de control (tumor secundario) de un estudio que contempla una realizacion.
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Descripcion de las realizaciones
Varias realizaciones de la presente invencion se describiran con mas detalle a continuacion con referencia a las figuras acompanantes para que los expertos en la tecnica sean capaces de llevar a cabo la invencion. Sin embargo, la invencion puede realizarse de muchas formas diferentes y no se debe interpretar que esta limitada por las realizaciones presentadas en la presente memoria. Es mas, estas realizaciones se dan a conocer para que esta descripcion sea detallada y completa, y transmita por completo el alcance de la invencion a los expertos en la tecnica. Las realizaciones no limitan la invencion, sino que la invencion esta solo limitada por las reivindicaciones adjuntas a la patente. Ademas, la terminologfa utilizada en la descripcion detallada de las realizaciones concretas ilustradas en las figuras acompanantes no pretende limitar de ningun modo la invencion.
Los adyuvantes inyectados en el interior del tumor que tienen el proposito de inducir una respuesta inmunitaria antitumoral eficaz con toda probabilidad tendran que inducir 3 fenomenos en el interior del tumor que recibio la inyeccion, todos igual de importantes para conseguir una erradicacion del tumor mediada por los LTC.
Primero, la CD inmadura (CDi) necesita ser atrafda al tumor para quedar expuesta al anftgeno tumoral. Esta perfectamente establecido en la tecnica que la quimiocina MIP-1a/CCL3 tiene una fuerte capacidad para estimular la atraccion de las CDi, que incluye la atraccion de las CDi in vivo al interior del tumor.
Segundo, es importante inducir la apoptosis de las celulas tumorales para hacer que los anftgenos tumorales queden disponibles para las CDi atrafdas. Existen dentro de la tecnica varios metodos diferentes para conseguir esto, entre ellos metodos que desencadenan la atraccion al interior de los tumores y la activacion de los linfocitos citolfticos naturales. En diferentes modelos de raton, la destruccion primaria de las celulas tumorales susceptibles mediada por los linfocitos citolfticos naturales, principalmente debido a la induccion de la apoptosis, ha demostrado repetidamente que suscita con eficacia un desarrollo posterior, mediado por las CD, de las respuestas de los linfocitos T citotoxicos espedficos del tumor contra las celulas tumorales originales resistentes a los linfocitos citolfticos naturales. Se sabe que los linfocitos citolfticos naturales expresan el receptor de quimiocinas CXCR3 y la atraccion dependiente de CXCR3 de los linfocitos citolfticos naturales se ha demostrado en varios modelos animales. Un ligando de CXCR3 bien conocido es MIG/CXCL9 y hay pruebas de que los linfocitos citolfticos naturales se acumulan despues de la inyeccion intratumoral de MIG/CxcL9.
Para que los linfocitos citolfticos naturales atrafdos destruyan de manera eficaz las celulas tumorales, lo mas probable es que tambien sea necesaria la presencia de factores activadores de los linfocitos citolfticos naturales, tales como la IL-12, un potente activador in vitro e in vivo de la actividad destructora de los linfocitos citolfticos naturales.
Tercero, se debe inducir la maduracion de las CDi atrafdas para que pasen a ser CD migratorias maduras.
Las primeras etapas de las infecciones vfticas (que conducen normalmente a las respuestas inmunitarias desviadas de Th1) estan normalmente asociadas a la atraccion local y a la activacion tanto de las CD como de los linfocitos citolfticos naturales. En un estudio reciente, a los linfocitos citolfticos naturales de la sangre periferica humana que se habfan expuesto a IL-12 o IL-4 en una incubacion breve (durante una noche) se les investigo su capacidad para inducir la maduracion de las CD. En especial, solo los linfocitos citolfticos naturales que se habfan estimulado con la IL-12 fueron capaces de inducir la maduracion sustancial de las CD. Asf pues, se concluyo que los linfocitos citolfticos naturales expuestos a la IL-12 durante un intervalo de tiempo compatible con las respuestas in vivo podnan favorecer la seleccion de las CD maduras apropiadas para la posterior sensibilizacion de las celulas Th1 en los organos linfaticos secundarios (5). Estos datos in vitro con humanos estan en lmea con los datos in vivo con modelos de ratones que muestran que la respuesta de Th1 se incrementa significativamente cuando la inyeccion de las CD cargadas de antfgeno en los ratones va seguida de la atraccion acumulativa de linfocitos citolfticos naturales, en comparacion con las situaciones en las que no se observo ningun reclutamiento de linfocitos citolfticos naturales.
Tambien se ha demostrado que la maduracion de las CD polarizantes de Th1 esta inducida por factores solubles producidos por los linfocitos T activados policlonalmente. El tratamiento de las CD inmaduras con un medio acondicionado de linfocitos T (MALT) preparado a partir de sobrenadantes libres de celulas de linfocitos T activados con anti-CD3, o linfocitos T activados por la estimulacion dual con anti-CD3 y anti-CD28, se ha demostrado que contiene varios factores solubles, entre ellos el ligando de CD40, el TNF-a y el IFN-y. A diferencia de la induccion moderada de moleculas coestimuladoras mediante la adicion de citocinas independientes o medio acondicionado con monocitos, el tratamiento de las CD inmaduras con MALT se ha demostrado que induce un incremento notable de la expresion de las moleculas coestimuladoras de una manera dependiente de la dosis. La capacidad del MALT para inducir tales cambios fenoftpicos se anula adicionalmente mediante la neutralizacion de anticuerpos espedficos contra CD40L, TNF-a e IFN-y, lo que indica que estos factores presentes en el MALT estan principalmente implicados en la maduracion de las CD. Es importante senalar que las CD tratadas con MALT producen una gran cantidad de IL-12 desviante de Th1.
Finalmente, se sabe que los linfocitos T CD4+ desempenan funciones cruciales en la sensibilizacion, expansion y memoria y en la supervivencia de los LTC CD8+ al «ayudar» a las CD migratorias durante su interaccion analoga con los linfocitos T CD8+ espedficos de anftgeno en los ganglios linfaticos de drenaje. Una serie de estudios dentro
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del area de la inmunoterapia contra el cancer se han basado en la estrategia de que los linfocitos T CD4+ que reconocen los peptidos del CMH de clase II con el anftgeno tumoral de tipo silvestre proporcionanan la ayuda necesaria para la induccion de los LTC. Sin embargo, la ayuda proporcionada por los peptidos de los anftgenos tumorales a menudo sera debil o ausente debido a la induccion de la tolerancia de los linfocitos T CD4+ hacia estas autoprotemas que evolucionan durante la progresion tumoral, lo que podna dificultar el efecto terapeutico de una vacuna. Los resultados recientes demuestran que la adicion de epftopos auxiliares que no son del propio T CD4+ a las autoprotemas asociadas al tumor en el sitio de la vacuna es suficiente para romper la tolerancia de CD8 establecida contra los anftgenos asociados al tumor en los modelos de ratones.
Tornados en su conjunto, todos estos datos indican que un adyuvante inyectado en el interior del tumor que tiene el objetivo de inducir una respuesta inmunitaria antitumoral adaptativa (mediada por linfocitos T) eficiente se debe caracterizar por una elevada y continua produccion de MIP-1a/MIP-1a/CCL3 (atraccion de CD, linfocitos citolfticos naturales y linfocitos T de memoria), MIG/CXCL9 (atraccion de linfocitos T de memoria y linfocitos citolfticos naturales), IL-12p70 (liberacion de anftgenos tumorales mediada por los linfocitos citolfticos naturales, y maduracion de las CD migratorias mediada por los linfocitos citolfticos naturales) y, finalmente, la presencia de protemas inmunogenas que no sean propias y que podnan actuar como epftopos auxiliares de linfocitos T CD4+ durante la sensibilizacion, mediada por las CD, de los linfocitos T CD8+ espedficos del tumor en el ganglio linfatico de drenaje.
Las CD procedentes de monocitos humanos tienen la capacidad de producir gran cantidad de MIP-1a/CCL3, IL- 12p70 y MIG/CXCL9 durante la estimulacion persistente con determinados ligandos de TLR que tambien conducen a su maduracion. Para inyectar dentro del tumor tales CD maduras proinflamatorias activadas persistentemente, tienen que lavarse antes de instilarlas al interior del tumor. Si no, la administracion concurrente de los estimulantes (con el objetivo de inducir ex vivo las CD proinflamatorias) lo mas probable es que conduzca a una activacion fuerte y persistente de CD inmaduras atrafdas tambien al interior del tumor, lo que conduce a su diferenciacion en CD maduras proinflamatorias en vez de la diferenciacion deseada en CD maduras migratorias. Por desgracia, el cese de los esftmulos de maduracion como los ligandos de TLR4 o el CD40L en los momentos en los que las CD se han diferenciado en CD maduras (normalmente al cabo de mas de 12 horas de la estimulacion) se sabe que induce una rapida disminucion de la produccion de citocinas inflamatorias, que incluye la produccion de la IL-12. Por lo tanto, se deben utilizar metodos de activacion que activan las CD en CD maduras proinflamatorias con una produccion continua de los factores deseables despues del cese de factores inductores de la activacion.
Los presentes inventores encontraron un metodo para producir una CD madura proinflamatoria, que tras la retirada de la estimulacion persistente con factores de activacion fuertes, hace, asf pues, que las CD libres de los factores de estimulacion, que producen una cantidad sorprendentemente alta de quimiocinas deseables e IL-12. Las CD maduras proinflamatorias se pueden administrar a un paciente de una forma alogena, a saber, a un paciente que no es de quien se obtienen las CD.
Las CD maduras proinflamatorias pueden estar mezcladas con celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP), con lo que forman una composicion. Las CD maduras proinflamatorias pueden estar revestidas con un superanftgeno, tal como la enterotoxina B de Staphylococcus aureus, que provocara una activacion policlonal de los linfocitos T dentro de la poblacion de las CMSP.
Cuando se administran a un paciente, las CD maduras proinflamatorias o las composiciones induciran una respuesta inmunitaria que conducira a una respuesta inmunitaria celular contra el tumor que destruye el tumor.
El efecto es extrafuerte si el paciente no es el donante de las CMSP, bien como tales o bien como la fuente de las CD maduras proinflamatorias, a saber, son alogenas para el paciente. A continuacion, las CD maduras proinflamatorias o la composicion actuaran como epftopos auxiliares de los T CD4+ que no son propios.
Las CD maduras proinflamatorias o la composicion contribuiran a que las CD, los linfocitos citolfticos naturales y los linfocitos T propios del paciente se vean atrafdos al sitio de la inyeccion, mediante la capacidad que tienen las CD maduras proinflamatorias para producir quimiocinas relevantes, tales como MIP-1a/CCL3, en gran cantidad y para activar los linfocitos citolfticos naturales atrafdos mediante interacciones que dependen del contacto entre las celulas y la capacidad que tienen las CD maduras proinflamatorias para producir una gran cantidad de la citocina IL-12, que conducira a la carga del antfgeno en las CD atrafdas propias del paciente con el material tumoral inmunogeno de las celulas tumorales destruidas por los linfocitos citolfticos naturales.
Preferiblemente, la composicion 100 se inyecta directamente en el tumor. La capacidad para atraer las CD al interior del tumor y por todos los tumores es importante, ya que en la mayona de los pacientes estudiados con cancer, las CD se han encontrado principalmente en la periferia de los tumores, lo que podna limitar su interaccion con las celulas tumorales. Es importante senalar que la capacidad que tienen las quimiocinas para atraer las CD en circulacion de los propios pacientes al sitio tumoral expone las celulas tumorales a CD recien atrafdas o generadas (a diferencia de las CD locales), lo que puede estar menos afectado por un medio tumoral inmunodepresor.
En una realizacion de acuerdo con la figura 1, se da a conocer un metodo 10, en donde se proporcionan 11 celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) 101. Los monocitos 102 se afslan 12 de dichas CMSP 101. Las CD inmaduras (CDi) 103 se generan 13 a partir de dichos monocitos 102 y la maduracion de las CDi 103 se induce 14
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por la adicion de los inductores de activacion poli-I:C, R848 e IFN-y a las CDi 103, seguido del lavado para retirar todos los factores de activacion, lo que da lugar a las CD maduras proinflamatorias 104 libres del factor de estimulacion.
En una realizacion, la induccion 14 de la maduracion de las CDi 103 comprende ademas la adicion de al menos una de las sustancias elegidas del grupo que consiste en: IFN-a, IL-1p y TNF-a.
En una realizacion, la generacion 13 de las CDi se induce mediante el cultivo de monocitos en un medio acuoso que comprende IL-4 y GM-CSF durante 2 a 7 dfas, tales como de 3 a 5 dfas, o 3 o 5 dfas.
En una realizacion de acuerdo con la figura 2A, se da a conocer un metodo 20 para producir una composicion 100, tal como el cocultivo de las CD maduras proinflamatorias 104 y las CMSP 101. El metodo comprende proporcionar 21 celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) 101, obtener 22 CD maduras proinflamatorias 104, y mezclar 23 dichas CMSP 101 y dichas CD maduras proinflamatorias 104.
En una realizacion de acuerdo con la figura 2B, el metodo 20 para producir una composicion 100 comprende ademas la etapa, antes de mezclar, de tratar 22b la CD madura proinflamatoria 104 con un superantigeno 200.
Las realizaciones anteriores se describiran con mas detalle a continuacion.
Experimental
La siguiente realizacion experimental no pretende limitarse a la forma espedfica presentada en la presente memoria. Es mas, la invencion esta limitada solo por las reivindicaciones acompanantes y resultan igualmente posibles dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas otras realizaciones ademas de las realizaciones espedficas arriba mencionadas.
Aislamiento de CMSP y monocitos
Las celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) 101 se separan de la sangre periferica obtenida de donantes sanos (Sahlgrenska sjukhuset, Goteborg, Suecia) mediante centrifugacion en gradiente de densidad en un Lymphoprep (Nycomed, Pharma, Oslo, Noruega), bien conocido por los expertos en la tecnica. Las CMSP 101 se resuspenden en el medio Cellgro (Cell Genix, Friburgo, Alemania) a una concentracion final de 2,5 * 106/ml seguido de la incubacion en una placa de 24 pocillos con fondo plano (1 ml/pocillo) a 37 °C y CO2 al 6%. Al cabo de 2 h, se retiran las celulas sin adherir, mientras que las celulas adheridas restantes se lavan dos veces con PBS, lo que da lugar a monocitos 102 aislados (que consisten principalmente en celulas CD14+).
Generacion de las CD
Para diferenciar los monocitos 102 en CD inmaduras 103, los monocitos 102 de la etapa de aislamiento se cultivaron en medio acuoso recien preparado, tal como medio Cellgro, complementado con inductores, a saber, 1000 U/ml de IL-4 humana recombinante y 1000 U/ml de GM-CSF humano recombinante (todos de CellGenix, Friburgo, Alemania) en 3 o 5 dfas.
La generacion de CD inmaduras (CDi) 103 procedentes de monocitos en IL-4 y GM-CSF es un modelo in vitro bien aceptado, y las celulas se pueden considerar analogas a las CD del tejido periferico.
Maduracion de las CD
Despues de 3 a 5 dfas de cultivo en medio Cellgro complementado con IL-4 y GM-CSF, la maduracion de las CD inmaduras 103 se indujo con la adicion de poli-I:C a 20 pg/ml (Sigma, Steinheim, Alemania), un inmunoestimulante espedfico del receptor TLR-3, tambien conocido como acido poliinosmico:policitidflico o sal sodica del acido poliinosmico-policitidflico, y R848 a 2,5 pg/ml (Sigma, Steinheim, Alemania), ligando 7/8 del receptor de tipo Toll, tambien conocido como resiquimod, al medio de cultivo, o la combinacion poli-I:C y R848 complementado con el interferon y a 1000 U/ml (IFN-y, R&D Systems, Minneapolis, EE. UU). Al cabo de 18 h de incubacion, las celulas se lavaron tres veces y se incubaron adicionalmente en medio recien preparado (sin anadir factores de activacion exogenos) durante 24 h para obtener las CD maduras proinflamatorias 104 de acuerdo con un aspecto.
Los sobrenadantes de cultivo se recogieron de los cultivos de acuerdo con los protocolos bien conocidos por el experto en la tecnica.
Se realizo un analisis por ELISA sobre los sobrenadantes, tal y como se describe a continuacion, para analizar la concentracion de las quimiocinas CCL3/MIP-1a, CCL5/RANtEs, CXCL9/MIG, CCL2/protema 1 quimiotactica de monocitos (MCP-1) y la citocina interleucina 12 (IL-12).
Cocultivo de CD y CMSP
Las CMSP 101 se obtuvieron de acuerdo con lo anterior y tambien se obtuvieron las CD maduras proinflamatorias
104 de acuerdo con lo anterior.
Para conseguir una maduracion rapida y la activacion policlonal de los linfocitos T de las CMSP 101, se anadio EEB (enterotoxina estafilococica B) a 0,01 pg/ml (R&D Systems, Minneapolis, EE. UU.) al cultivo de CD en la etapa de maduracion, 30 min antes del lavado. Despues de lavarlas tres veces en PBS, las DC maduras proinflamatorias 104 5 (2,5 x 105 celulas/ml) se cocultivaron con 1 * 106 celulas/ml de CMSP alogenas (aisladas de la sangre periferica de
donantes sanos, tal y como se describe mas arriba) en un volumen total de 1 ml durante 24 h.
Se recogieron los sobrenadantes de cultivo del cocultivo de las CD maduras proinflamatorias 104 y las CMSP alogenas, tambien denominados sobrenadantes MLR, y posteriormente se conservaron a -80 °C. Los sobrenadantes se analizaron luego para detectar por ELISA, tal y como se describe a continuacion, la presencia de 10 los factores de activacion/maduracion de las CD bien conocidos IFN-y, TNF-a e IL-1p. Los sobrenadantes tambien se estudiaron para detectar si eran capaces de inducir la maduracion fenotipica de las CDi, y tambien se describe a continuacion.
ELISA
La cantidad de CCL3/MIP-1a, CCL5/RANTES, CXCL9/MIG, CCL2/MCP-1, IL-12, TNF-a, IL-1p e IFN-y se midio 15 mediante el ensayo absorbente inmunoenzimatico (ELISA) con el Duo Set ELISA Development System de R&D System, Minneapolis, EE. UU., de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Evaluacion de la maduracion fenotfpica
Las celulas dendnticas derivadas de monocitos 103 (CDi) se generaron tal y como se describe mas arriba. Al cabo de 5 dfas de incubacion en medio Cellgro complementado con IL-4 y GM-CSF, las CD inmaduras 103 se incubaron 20 a 37 °C durante 24 h en 300 pl de los sobrenadantes MLR mencionados mas arriba y 100 pl de medio Cellgro recien preparado. Las CD cultivadas sin la adicion de los sobrenadantes se utilizaron como control. Para determinar si los sobrenadantes MLR inducen la maduracion, las muestras se tineron con PE anti-CD86 de humano en combinacion con FITC de anti-CD83 de humano. Las IgG1 y IgG2 de raton tenidas con FITC y PE se utilizaron como controles de isotipo (todos de BD Biosciences, California, EE. UU.). Las muestras se analizaron por citometna de flujo (FACS) 25 con el programa informatico Cell Quest (BD Biosciences, California, EE. UU.).
Resultados
A continuacion se comentan los resultados de la parte experimental Produccion continua de las quimiocinas inflamatorias deseables
Tal y como se muestra en la figura 3, la produccion de CCL3/MIP-1a (figura 3C), CCL5/RANTES (figura 3A) y 30 CXCL9/MIG (figura 3B) desde las CD maduras proinflamatorias 104 de 3 donantes de sangre estudiados era mas alta si las CDi se habfan inducido mediante el cultivo durante 5 dfas en GM-CSF e IL-4 antes de la estimulacion combinada del TLR, a saber, induccion 14 de la maduracion, en comparacion con el cultivo durante 3 dfas en GM- CSF e IL-4. Ademas, la estimulacion combinada del TLR con la adicion de IFN-y dio la cantidad mas alta de CCL3/MIP-1a y CXCL9/MIG, mientras que la produccion de CCL5/RANTES no se vio afectada por la adicion del 35 IFN-y.
Asf pues, una celula dendntica proinflamatoria (CD), que se ha estimulado para la maduracion ex vivo mediante el tratamiento con las sustancias sal sodica del acido poliinosmico-policitidflico (poli-I:C), resiquimod (R848) e interferon Y (IFN-y).
En una realizacion, la celula dendntica (CD) proinflamatoria, ademas, se ha estimulado con al menos una de las 40 sustancias elegidas del grupo que consiste en interferon a (IFN-a), interleucina 1p (IL-1p) y factor a de la necrosis tumoral (TNF-a).
En especial, la elevada concentracion que se detecto de las quimiocinas relevantes se produjo despues de la retirada de los estfmulos de maduracion. El hecho de que las CD maduras proinflamatorias 104 esten libres de factores de activacion exogenos fuertes, tales como los de maduracion, es una ventaja, ya que la presencia de 45 factores de activacion exogenos fuertes dentro del tumor podna de otro modo estimular una diferenciacion de las CD propias del paciente que se ven atrafdas al interior del tumor en CD proinflamatorias espedficas del paciente, a saber, propias, y no en las deseables CD migratorias espedficas del paciente.
La CD madura proinflamatoria produce al menos 25.000 pg IL-12/ml/106 celulas, tal como 120.000 pg/ml/106 celulas al menos 100.000 pg CXCL9/ml/106 celulas, tal como 400.000 pg/ml/106 celulas, y al menos 40.000 pg CCL3/ml/106 50 celulas, tal como 180.00 pg/ml/106 celulas, durante 24 horas despues de retirar los estfmulos.
Las CD maduras proinflamatorias tambien pueden producir CCL5/RANTES, tal como 17.500 pg/ml/106 celulas, durante 24 h despues de retirar los estfmulos.
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No se hallo una cantidad detectable (nivel de deteccion: 312 pg/ml) de CCL2/MCP-1 (datos sin mostrar). La figura 3 muestra la concentracion de CCL3/MIP-1a (figura 3C), CCL5/RANTES (figura 3A) y CXCL9/MIG (figura 3B), segun se obtuvieron con analisis por ELISA. Los resultados mostrados son valores medios ± DE de tres individuos. El eje Y correspondiente muestra la cantidad de la sustancia correspondiente producida en pg/ml/2,5 * 105 celulas, durante 24 h despues de retirar los estimulos. El eje X muestra las diferentes combinaciones medidas.
Produccion continua de IL-12p70
Ya que la estimulacion combinada de TLR, a saber, la induccion 14 de la maduracion, con o sin la estimulacion concurrente con IFN-y, se hallo que inducfa una produccion continua y fuerte de las quimiocinas que atraen a los linfocitos citolfticos naturales (CcL3/MIP-1a, CCL5/RANTES y CXCL9/MlG) en las CD proinflamatorias maduras 104, fue interesante estudiar si tales CD podfan liberar concurrentemente la IL-12, tal como IL-12p70, un factor activador de los linfocitos citolfticos naturales bien conocido. Tal y como se muestra en la figura 4, la estimulacion doble de los TLR (tal como con R848 y poli-I:C) mostro que inducfa una produccion fuerte y continua de IL-12p70 despues de retirar los estfmulos de maduracion, tal como los inductores de la activacion. Ademas, la adicion del IFN-y durante la activacion mejoro mas la produccion de IL-12p70. A igual que la produccion de las quimiocinas, la produccion de IL- 12p70 era optima (en 3 de los 4 experimentos) cuando se cultivaron los monocitos en GM-CSF e IL-4 durante 5 dfas, en comparacion con 3 dfas, antes de la activacion. La figura 4 muestra la produccion de IL-12p70 despues de la induccion de la maduracion de las CD. Los datos presentados son en forma de media ± DE de tres experimentos con diferentes donantes. El eje Y muestra la cantidad de la sustancia producida en pg/ml/2,5 * 105 celulas, durante 24 h despues de retirar los estfmulos. El eje X muestra las diferentes combinaciones medidas.
El cocultivo de CD maduras, o CD maduras revestidas con EEB, con CMSP alogenas induce la produccion de factores de maduracion de CD.
Se sabe que los factores solubles proinflamatorios producidos por linfocitos citolfticos naturales activados y los linfocitos T favorecen la maduracion de las CD inmaduras presenciales. Asf pues, fue interesante examinar si las CD maduras proinflamatorias 104, cuando se cocultivan con las CMSP alogenas (que imitan las celulas inmunitarias reclutadas) en una composicion 100, eran capaces de inducir la produccion de citocinas que se sabe que son importantes para la maduracion de las CD. Para optimizar la activacion de los linfocitos T inducidos por las CD, las CD se revistieron con el superantfgeno endotoxina estafilococica B (EEB) mediante la adicion de la eEb al cultivo de CD al final (30 minutos antes del lavado) del periodo de estimulacion con agonistas dobles de TLR e IFN-y. Los superantfgenos, entre ellos la EEB, se sabe que forman complejos con el CMH de clase II en las CPA y que estimulan los linfocitos T a traves del receptor de los linfocitos T. Se produce una activacion policlonal rapida y tanto los linfocitos T CD4+ como los CD8+ aparecen en respuesta a la EEB, lo que lleva al incremento de la produccion de mediadores proinflamatorios, entre ellos TNF-a, IL-1 e IFN-y. La EEB consigue estimular hasta el 20% del repertorio de linfocitos T y la «hiperactivacion» de los linfocitos T se produce habitualmente en menos de 48 h desde la exposicion a la EEB.
Despues de varios lavados, las CD maduras proinflamatorias 104, con o sin un «revestimiento» concurrente con la EEB, se cocultivaron con CMSP alogenas durante 24 h, y se midio por ELISA la cantidad de TNF-a, IL-1p e IFN-y liberados en el sobrenadante. Tambien se pueden usar otros tipos de superantfgenos, tales como las enterotoxinas estafilococicas A, C, D, E, F, G, H y J, y la toxina 1 del smdrome de choque toxico estafilococico (TSST-1, por su nombre en ingles). Tal y como se muestra en la figura 5A, el cocultivo de CD maduras proinflamatorias 104 revestidas con EEB (estimuladas con los ligandos del TLR combinados), pero no las CD inmaduras, inducm una produccion significativa de IL-1p despues del cocultivo con las CMSP alogenas. El cocultivo de las CD inmaduras revestidas con EEB con las CMSP alogenas indujo una produccion sustancial del TNF-a que mejoro marginalmente con el uso de las CD maduras. La produccion de la IL-1p o del TNF-a no estaba sustancialmente afectada por la adicion de IFN-y para la estimulacion doble de los tLr durante la maduracion de las CD. En particular, el revestimiento con EEB contribuyo notablemente a la liberacion de la IL-1p y del TNF-a en el modelo de cocultivo presente (figura 6), lo que indica que los linfocitos T activados policlonalmente son los principales productores de estas citocinas.
Asf pues, las CD maduras proinflamatorias pueden producir al menos 2.000 pg TNF-a/ml/106 celulas, tal como 32.000 pg/ml/106 celulas y al menos 500 pg IL-1p/ml/106 celulas, tal como 2.500 pg/ml/106 celulas, durante 24 h despues de retirar los estfmulos.
Se demostro que, al igual que la produccion de la IL-1p y del TNF-a, la produccion mas abundante del IFN-y era cuando se utilizan las CD maduras que se habfan revestido con EEB en los cocultivos (figura 7), lo mas probablemente debido a la activacion policlonal de los linfocitos T. La adicion de las CMSP a las CD estimuladas por los TLR y el IFN-y indujo ligeramente la produccion del IFN-y, posiblemente secretado por los linfocitos citolfticos naturales activados por la IL-12 producida por las CD maduras proinflamatorias 104.
La figura 5 muestra la cantidad de las citocinas IL-1p (figura 5A) y TNF-a (figura 5B) segun se mide por ELISA. La figura 6 muestra la cantidad de citocinas IL-1p (figura 6A) y TNF-a (figura 6B) segun se mide por ELISA, pero con la adicion de medio, CMSP o CMSP/EEB. Los datos mostrados en la figura 5 son valores medios ± DE de cuatro
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individuos, y la figura 6 muestra los resultados de un experimento.
La figura 7 muestra la cantidad de la citocina IFN-a en los sobrenadantes segun se mide por ELISA. Los datos mostrados en la figura 7 proceden de un unico experimento.
El correspondiente eje X en las figuras 5, 6 y 7 muestra la cantidad de la correspondiente sustancia producida en pg/ml/2,5 * 105 celulas, durante 24 h despues de retirar los estfmulos. El correspondiente eje Y muestra las diferentes combinaciones medidas.
Maduracion fenotipica de las CD inmaduras presenciales
A los sobrenadantes de los cocultivos de las CD maduras proinflamatorias 104 revestidas con EEB o sin revestir y de las CMSP alogenas 101 se les estudio posteriormente su capacidad para inducir una maduracion fenotfpica de las CD inmaduras presenciales. Asf pues, se da a conocer una composicion 100 que comprende CD maduras proinflamatorias 104 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores y celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) 101. Los sobrenadantes de estos cocultivos celulares se utilizaron para estimular las CD inmaduras presenciales obtenidas de los monocitos adheridos cultivados durante 5 dfas en gM-CSF e IL-4. Al cabo de 24 h de estimulacion, se recogieron las celulas para el analisis por FACS. Se utilizaron anti-CD86 y anti-CD83 humanos para examinar la expresion de moleculas coestimuladoras (CD86) y marcadores de maduracion (CD83), respectivamente. Los sobrenadantes de los cocultivos de las CD maduras proinflamatorias 104 que se habfan madurado con la estimulacion combinada de los TLR, a saber, mediante la adicion de poli-I:C, R848 a las CDi 103, seguido del revestimiento con EEB, indujo una expresion prominente de CD86 y CD83 desde las CD presenciales, tal y como se muestra en la figura 8. Asf pues, la composicion 100 puede comprender un superantfgeno. La adicion del IFN-y durante la maduracion de las CD de vacuna mediada por los TLR no contribuyo a ninguna maduracion fenotfpica adicional inducida por los sobrenadantes de las CD inmaduras presenciales, tal y como se observa en la figura 8C.
La figura 8 muestra la influencia de la EEB y los ligandos del TLR, a saber, inductores de maduracion, sobre las CD inmaduras 103. Los monocitos adheridos se incubaron en GM-CSF e IL-4 durante 5 dfas para obtener las CDi 103. Los sobrenadantes de un MLR con CD maduras proinflamatorias 104 estimuladas con EEB/TLR y las CMSP 101 se anadieron el dfa 5, a lo que siguio otra incubacion durante 24 h. Para estudiar las moleculas coestimuladoras y los marcadores de maduracion, se recogieron las celulas y se tineron con anti-CD86 y anti-CD83 humanos. Los marcadores de la superficie coestimuladores y de maduracion se indujeron con fuerza con los ligandos de TLR y la EEB. Los resultados mostrados son de uno de los dos experimentos representativos.
Los sobrenadantes de cultivos celulares que solo contienen CD maduras proinflamatorias 104 que se habfan madurado con la estimulacion combinada del TLR mas el IFN-y indujeron una expresion sustancial de CD83 en las CD presenciales, tal y como se ve en la figura 9B. Tal y como se aprecia en la figura 9C, la expresion de CD83 mejoro mas con los sobrenadantes de cocultivos con las CMSP alogenas y las CD maduras proinflamatorias 104. Finalmente, los sobrenadantes de los cocultivos con las CD maduras proinflamatorias 104 revestidas con la EEB y las CMSP alogenas 101 indujeron la expresion mas fuerte de CD83, tal y como se ve en la figura 9D, lo que indica que para inducir la maduracion maxima inducida por sobrenadante de las CD inmaduras presenciales es importante la inclusion de la EEB en los cocultivos 100 de CD maduras proinflamatorias 104 con CMSP 101 alogenas.
En vista de los resultados arriba mencionados, de acuerdo con un aspecto, se da a conocer una CD madura proinflamatoria 104, o una composicion 100, para el uso como medicamento.
De acuerdo con un aspecto, se da a conocer una CD madura proinflamatoria 104, o una composicion 100, para ser usada en el tratamiento del cancer.
De acuerdo con un aspecto, se da a conocer el uso de CD maduras proinflamatorias 104, o una composicion 100, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento contra el cancer.
La CD madura proinflamatoria104, o una composicion 100, se podna inyectar en el interior del tumor.
En una realizacion, se elige el cancer del grupo que consiste en: cancer de mama, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer intestinal, gliomas malignos, osteosarcoma, melanoma maligno, cancer de pancreas, linfomas malignos y cancer de esofago.
De acuerdo con un aspecto, se da a conocer una CD madura proinflamatoria 104, o una composicion 100, para ser usada como medicamento en un individuo diferente del que se obtienen, tal como un donante, las CD maduras proinflamatorias 104 o las CMSP 101.
De acuerdo con un aspecto, se da a conocer una CD madura proinflamatoria 104, o una composicion 100, para ser usada para el tratamiento contra el cancer en un individuo diferente del que se obtuvieron, tal como un donante, las CD maduras proinflamatorias 104 o las CMSP 101.
Inyeccion intratumoral
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Tal y como se menciona mas arriba, la CD madura proinflamatoria 104, o una composicion 100, se puede inyectar dentro del tumor para producir un efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral.
Para demostrarlo, Visionar Preclinical AB realizo un estudio con ratas en Uppsala (Suecia) de acuerdo con la descripcion siguiente.
Se utilizaron 15 ratas hembra Fischer en este estudio. Despues de la aclimatacion (como mmimo una semana), una suspension celular de 100 pl que comprendfa 106 celulas MAT B III (aisladas originalmente del adenocarcinoma de la glandula mamaria de la rata) en medio RPMI se inyecto por via subcutanea en el gluteo izquierdo de los animales (dfa -4). Cuatro dfas despues se indujo un segundo tumor en el gluteo derecho (dfa 0). La CD madura proinflamatoria 104 (producida tal y como se describe mas arriba) o el vetculo solo (tampon PBS con suero de ternera fetal (STF) al 10% (volumen)) se inyecto en el primer tumor (gluteo izquierdo) cuatro dfas despues de la instilacion del segundo tumor (gluteo derecho) (dfa 4). La dosis de la CD madura proinflamatoria 104 fue de 20 pl por animal, lo que comprende 105 celulas CD maduras proinflamatorias 104. El crecimiento del primer y segundo tumor se registro a lo largo de todo el estudio. La parte experimental con animales del estudio fue autorizada por el comite de etica regional para la experimentacion con animales en Uppsala, Suecia (C320/9).
Una vision general del diseno experimental se observa en la tabla 1 que viene a continuacion.
- Grupo
- N ID Tumor 1 Tumor 2 Tratamiento
- Control
- 6 658, 659, 662, 667, 668, 671 1 * 106 celulas lado izquierdo (dfa -4) 1 * 106 celulas lado derecho (dfa 0) Vetculo en el interior del tumor IZQUIERDO (dfa 4)
- CD madura proinflamatoria 104
- 9 657, 660, 661, 663, 664, 665, 666, 669, 670 1 * 106 celulas lado izquierdo (dfa -4) 1 * 106 celulas lado derecho (dfa 0) 0,1 * 106 celulas CD 104 en el interior del tumor IZQUIERDO (dfa 4)
Tabla 1. Diseno experimental. La primera columna es el grupo, seguido del numero de ratas participates (N), ID unico de la ratas participates, especificacion de la induccion del tumor 1 y 2, y, finalmente, especificacion del tratamiento, respectivamente.
El dfa de la vacunacion intratumoral en el primer tumor, en el gluteo izquierdo (dfa 4), los animales se distribuyeron al azar en dos grupos diferentes en funcion del volumen del tumor izquierdo. Tanto en el grupo de CD maduras proinflamatorias 104 como en las de control, las inyecciones intratumorales se hicieron con un vetculo de tampon PBS con suero de ternera fetal al 10% (volumen).
En dfas alternantes se comprobaba el crecimiento del tumor en los animales. Cuando eran palpables, el tamano del tumor se midio con el uso de un calibrador. Se anoto la longitud y la anchura del tumor. El volumen del tumor se calculo mediante la formula: longitud (cm) * anchura (cm) * profundidad (cm) * 0,44.
El plan original era sacrificar tres animales del grupo de CD maduras proinflamatorias 104 el dfa 7 y a todos los demas animales el dfa 15 (once dfas despues de la inyeccion del segundo tumor). Sin embargo, el dfa 7, los tumores del lado izquierdo de un animal de control y de siete animales del grupo de CD maduras proinflamatorias 104 (a los que se dio vetculo o vetculo + celulas de vacuna, respectivamente) eran de mas de 2 cm3 y, por lo tanto, se sacrificaron estos ocho animales. Dos dfas despues (dfa 9), el tumor izquierdo (primer tumor) de los siete animales restantes tambien hata superado el lfmite etico y, asf pues, tambien fueron sacrificados estos animales.
Los tumores se diseccionaron, se pesaron, se congelaron en hielo seco y se conservaron a -70 °C para el posterior estudio histopatologico.
Los tumores congelados (derecho e izquierdo) enviados a MicroMorph para el analisis histopatologico se presentan en la tabla 2 que viene a continuacion. Se prepararon criosecciones de 8 pm y se tineron con hematoxilina/eosina, y para las CD/macrofagos (anticuerpo de raton anti-CD68 de rata), linfocitos citolfticos naturales (anticuerpo de raton anti-CD161a de rata) y celulas positivas para CD8 (linfocitos T CD8+ y tambien CD/macrofagos CD8+), de acuerdo con los metodos bien conocidos por un experto en la tecnica.
El numero de celulas inmunogenas en los diferentes tumores se puntuaron a ciegas como sigue: pocas celulas positivas (1+), un numero moderado de celulas positivas (2+) o una gran cantidad de celulas positivas (3+).
- ID
- Grupo Dia experimental
- 659
- Control 7
- 661
- CD madura proinflamatoria 104 7
- 662
- Control 9
- ID
- Grupo Dia experimental
- 664
- CD madura proinflamatoria 104 9
- 665
- CD madura proinflamatoria 104 7
- 667
- Control 9
- 670
- CD madura proinflamatoria 104 9
Tabla 2. Tumores congelados enviados para el analisis histopatologico. Las columnas muestran el ID de la rata, el grupo y el dfa experimental del sacrificio, respectivamente.
El analisis de los resultados de diferentes grupos con respecto a los volumenes tumorales se realizaron con la 5 prueba de t y mediciones repetidas de ANOVA (PASW v 18 en un ordenador HP Compac dc 7700p). La estadfstica descriptiva del volumen tumoral se presenta en las tablas 3 y 4 que vienen a continuacion.
- Control de vehuculo
- CD maduras proinflamatorias 104
- Tumor Tumor
- Primer tumor Segundo tumor Primer tumor Segundo tumor
- Media EEM N valido Media EEM N valido Media EEM N valido Media EEM N valido
- VT d2
- 0,03 0,02 6 0 0,04 0,02 9 0
- VT d4
- 0,20 0,05 6 0 0,20 0,06 9 0
- VT d6
- 1,17 0,16 6 0,04 0,02 6 1,40 0,22 9 0,01 0,01 9
- VT d7
- 2,02 0,61 6 0,09 0,04 6 3,35 0,55 9 0,05 0,02 9
- VT d9
- 4,43 0,25 5 0,68 0,08 5 4,32 1,04 2 0,36 0,04 2
Tabla 3. Volumen del tumor (VT) a diferentes dfas (d*). La tabla muestra el volumen medio del tumor (ml), el error estandar de la media (EEM) y el numero de animales (N) a la largo de todo el estudio.
10 Una medicion repetida ANOVA se utilizo para analizar el volumen tumoral del dfa 6 al dfa 9. El primer y segundo tumores se analizaron por separado. Debido a la manipulacion de los valores ausentes en el analisis de las mediciones repetidas, se traslado el ultimo valor medido.
- Control del vehuculo
- CD maduras proinflamatorias 104
- Tumor Tumor
- Primer tumor Segundo tumor Primer tumor Segundo tumor #
- Media EEM N valido Media EEM N valido Media EEM N valido Media EEM N valido
- VT d6
- 1,17 0,16 6 0,04 0,02 6 1,40 0,22 9 0,01 0,01 9
- VT d7
- 2,02 0,61 6 0,09 0,04 6 3,35* 0,55 9 0,05 0,02 9
- VT d9
- 4,53* 0,22 6 0,57* 0,13 6 3,96* 0,48 9 0,12t 0,05 9
Tabla 4. El volumen medio del tumor (ml), el error estandar de la media (EEM) y el numero de animales (N) con 15 traslado del ultimo valor medido. * P < 0,05 comparado con el dfa 6 dentro del grupo. # P < 0,05 comparacion completa con el tumor correspondiente en el grupo de control, } P < 0,05 en comparacion con el tumor correspondiente en el grupo control.
La estadfstica descriptiva de la masa tumoral se presenta en la tabla 5 que viene a continuacion.
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- Control del vehuculo
- COMBIG-DC
- Tumor
- Tumor
- Primer tumor Segundo tumor
- Primer tumor Segundo tumor
- Media EEM N valido
- Media EEM N valido
- Media EEM N valido
- Media EEM N valido
- MT d7 3,3491 1 MT d9 4,0094 0,3604 5
- 0,1992 1 0,6090 0,0690 5 3,1209 0,3819 7 4,0201 0,3530 2 0,1423 0,0292 7 0,2740* 0,0104 2
Tabla 5. Masa tumoral media (MT, g), error estandar de la media (EEM) y numero de animales (N) en los diferentes dfas de sacrificio. * P < 0,05 en comparacion con el correspondiente tumor en el grupo de control (prueba de t).
La figura 10 es un grafico que muestra el volumen tumoral (ml) de los diferentes tumores en los diferentes grupos (COMBIG-DC significa CD madura proinflamatoria 104). Cuando los animales se retiraron del estudio, se traslado el ultimo valor medido. Los valores son media ± EEM. Se puede observar con claridad que las ratas tratadas con las CD maduras proinflamatorias 104 teman un volumen tumoral mas pequeno con respecto al primer y al segundo tumor.
El primer tumor crecio muy rapido y a todos los animales tuvieron que ser sacrificados antes de lo planificado debido al gran volumen tumoral. A siete de nueve animales del grupo de CD maduras proinflamatorias 104 y a uno de seis animales del grupo de control tuvieron que ser sacrificados el dfa 7, y el resto de animales el dfa 9. Para poder realizar el analisis estadfstico sobre el material, el ultimo volumen tumoral medido a dfa 7 se traslado al dfa 9. Esto podna posiblemente dar un volumen falsamente mas bajo del primer tumor (inyectado con vacuna) el dfa 9, y el hecho de que se retirasen mas animales del grupo de CD maduras proinflamatorias 104 se debena tener en cuenta al analizar los resultados sobre el volumen y el peso del primer tumor (izquierdo). A continuacion, se utilizo una medicion repetida ANOVA para analizar los volumenes tumorales desde el dfa 6 al dfa 9. El primer y el segundo tumor se analizaron por separado.
El mayor volumen tumoral del primer tumor en el grupo de CD maduras proinflamatorias 104 el dfa 7 se podna explicar por una respuesta inflamatoria en marcha contra las celulas dendnticas inyectadas, ya que la inmunohistoqmmica revelo un incremento del numero de celulas inflamatorias infiltrantes en estos primeros tumores en el grupo de CD maduras proinflamatorias 104 en comparacion con el grupo de control (vease a continuacion).
El segundo tumor del grupo de CD maduras proinflamatorias 104 tema una reduccion estadfsticamente significativa del volumen tumoral en comparacion con el grupo de control. Ademas, se encontro un peso mas bajo estadfsticamente significativo de los dos segundos tumores que se retiraron el dfa 9 en el grupo de CD maduras proinflamatorias 104 en comparacion con el grupo de control.
Se congelaron los tumores y se prepararon criocortes, y se tineron con hematoxilina/eosina y para las CD/macrofagos (anticuerpos de raton anti-CD68 de rata), linfocitos citolfticos naturales (anticuerpos de raton anti- CD161a de rata) y celulas CD8 positivas (linfocitos T CD8+ y tambien CD/macrofagos CD8+). Los tumores se compoman de celulas tumorales malignas rodeadas por una capsula conjuntiva laxa de un grosor variable. Se encontraron hebras de fibras conjuntivas entremezcladas con las celulas tumorales. Se observaron areas de celulas tumorales necroticas en todas las muestras. Se observaron conjuntos de material cristalizado en algunos de los primeros tumores (inyectados). Ya que esto se encontro solo en los primeros tumores, lo mas probable es que sea una reminiscencia del material inyectado.
Un resumen de esto se presenta en la tabla 6 que viene a continuacion.
- ID
- Grupo Dia exp. Tumor CD68 CD161a CD8a H/E
- 659
- Control 7 Primero 1-2+ 1-2+ 1-2+ Aprox. la mitad del tumor necrotico
- Segundo 3+ 2+ 2-3+ Aprox. la mitad del tumor necrotico
- 661
- CD madura 7 Primero 3+ 2+ 3+ Aprox. la mitad del tumor necrotico
- proinflamatoria 104 Segundo 3+ 2+ 3+ Aprox. la mitad del tumor necrotico
- 662
- Control 9 Primero 2+ 1 + 2+ Aprox. la mitad del tumor necrotico
- Segundo 2+ 1+ 2+ La mayona de las celulas
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20
25
30
- ID
- Grupo Dia exp. Tumor CD68 CD161a CD8a H/E
- tumorales son viables
- 664
- CD madura proinflamatoria 104 9 Primero 1-2+ 1 + 2+ La mayona de las celulas tumorales son viables
- Segundo 2+ 1+ 2+ La mayona de las celulas tumorales son viables
- 665
- CD madura proinflamatoria 104 7 Primero 3+ 2+ 3+ La mayona de las celulas tumorales son necroticas
- Segundo 3+ 1-2+ 2-3+ La mayona de las celulas tumorales son viables
- 667
- Control 9 Primero 2+ 1 + 2+ Aprox. la mitad del tumor necrotico
- Segundo 2+ 1+ 2+ La mayona de las celulas tumorales son viables
- 670
- CD madura proinflamatoria 104 9 Primero 2-3+ 1 + 2-3+ La mayona de las celulas tumorales son necroticas
- Segundo 3+ 1-2+ 2-3+ La mayona de las celulas tumorales son viables
Tabla 6. Resultados del analisis histopatologico el dfa del sacrificio ^a exp.). Los valores son puntuaciones del numero de CD/macrofagos (CD68), linfocitos citolfticos (CD161a), CD/macrofagos (CD8a) y linfocitos T citotoxicos (CD8a). La evaluacion morfologica de los tumores se realizo sobre cortes con tincion de H/E.
Se hallaron celulas positivas para CD8a, CD68 y CD161a infiltradas en el tumor en todas las muestras analizadas. Las celulas positivas se observaron en la capsula que rodea el tumor, asf como en las areas de las celulas tumorales. Aunque el resultado no era concluyente, pareda haber una tendencia a que los animales tratados con las CD maduras proinflamatorias 104 tuvieran una mayor presencia de las celulas estudiadas.
Asf pues, habfa una tendencia a que el tratamiento con la inyeccion intratumoral de las CD maduras proinflamatorias 104 indujera un incremento de la atraccion de CD/macrofagos, linfocitos citolfticos naturales y linfocitos T citotoxicos hacia los tumores con una posterior reduccion del volumen y del peso del segundo tumor.
La figura 11 muestra fotos de los resultados histopatologicos para los macrofagos, linfocitos citolfticos naturales, linfocitos T citotoxicos (CD/CD8+) 3 dfas despues de la inyeccion intratumoral de las CD maduras proinflamatorias 104 en el tumor primario.
La figura 12 muestra fotos de los resultados histopatologicos del correspondiente control, con la inyeccion intratumoral solo con el vehfculo.
Asf pues, se puede observar que CD/macrofagos, linfocitos citolfticos naturales y linfocitos T citotoxicos se vieron atrafdos hacia el tumor despues de la inyeccion con las CD maduras proinflamatorias 104, pero no despues de la inyeccion con el vehfculo unicamente.
La figura 13 muestra fotos de los resultados histopatologicos para CD/macrofagos, linfocitos citolfticos naturales y linfocitos T citotoxicos de los tumores secundarios 5 dfas despues de la inyeccion intratumoral de las CD maduras proinflamatorias 104 en el tumor primario.
La figura 14 muestra fotos de los resultados histopatologicos del correspondiente control, con la inyeccion intratumoral del vehfculo unicamente.
Asf pues, se puede observar que CD/macrofagos, linfocitos citolfticos naturales y linfocitos T citotoxicos se ven atndos incluso hacia el tumor secundario (metastasis) despues de la inyeccion con las CD maduras proinflamatorias 104 en el tumor primario, pero a un grado mas bajo despues de la inyeccion unicamente del vehfculo.
En conjunto, este estudio de vacuna en un modelo tumoral indica que la inyeccion de las CD maduras proinflamatorias 104 en el interior del tumor induce una atraccion prominente de las celulas inflamatorias, entre ellas CD, linfocitos citolfticos naturales y linfocitos T, hacia el sitio de la inyeccion (primer tumor). Tal atraccion intensa de celulas inflamatorias probablemente explica el incremento del volumen tumoral que se observa los primeros 2 o 3 dfas despues de la inyeccion. La inyeccion intratumoral de las CD maduras proinflamatorias 104 induce ademas una reduccion de un tumor distante (tumor derecho), lo que indica un efecto antitumoral sistemico.
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En una realizacion, el cancer se elige del grupo que consiste en: cancer de mama, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer intestinal, gliomas malignos, osteosarcoma, melanoma maligno, cancer de pancreas, linfomas malignos y cancer de esofago.
En una realizacion, las CD maduras proinflamatorias 104, o una composicion 100 de acuerdo con lo anterior, comprende ademas excipientes farmaceuticamente aceptables, tales como vehfculos, conservantes, adyuvantes, etc.
En una realizacion, el excipiente es seroalbumina humana al 2%, que se proporciona en una solucion fisiologica de NaCl.
En una realizacion, las CD 104 maduras y las celulas mononucleares de la sangre periferica (CMSP) 101 son alogenas con respecto al sujeto, a saber, se originan en un donante cuyo CMH es incompatible con el sujeto, tal como un CMH completamente incompatible.
Esto tiene la ventaja de que la composicion terapeutica se puede producir por adelantado y conservar, tal como en un estado congelado, antes de ser usada. La naturaleza alogena de la composicion con respecto al paciente tambien ocasionara que la composicion sea mas eficaz, como se explica mas arriba.
En un aspecto, se da a conocer un metodo para el tratamiento de un paciente mairnfero que tiene un tumor. El metodo comprende la administracon al paciente, una vez o varias veces, de una cantidad terapeuticamente eficaz de una CD madura proinflamatoria 104, o una composicion 100, en donde un donante, del cual se toman las CD maduras proinflamatorias 104 y/o las CMSP 101, no es el paciente.
La administracion puede ser por inyeccion en el interior del tumor.
En las reivindicaciones, el termino «comprende/que comprende» no excluye la presencia de otros elementos o etapas. Ademas, aunque se enumeran por separado, se pueden aplicar una multitud de elementos o etapas de metodos en, p. ej., una unica etapa. Adicionalmente, aunque las caractensticas individuales pueden estar incluidas en diferentes reivindicaciones, estas se pueden combinar posiblemente de manera ventajosa y la inclusion en diferentes reivindicaciones no implica que una combinacion de caractensticas no sea factible y/o ventajosa. Ademas, las referencias singulares no excluyen las multiples. Los terminos «un», «una», «primero», «segundo», etc., no excluyen una multitud. Los signos de referencia en las reivindicaciones se proporcionan simplemente como un ejemplo aclaratorio y no se deben interpretar como que limitan el alcance de las reivindicaciones de ningun modo.
Claims (8)
- 51015202530REIVINDICACIONES1. Una celula dendntica (CD) proinflamatoria, que ha sido estimulada para la maduracion ex vivo mediante el tratamiento con las sustancias sal sodica del acido poliinosmico-policitid^lico (poli-I:C), resiquimod (R848) e interferon Y (IFN-y), pero no con la prostaglandina E2 (PGE2), para ser usada para el tratamiento contra el cancer en un individuo diferente de la fuente de las CD maduras proinflamatorias, en donde el uso es por inyeccion en el interior del tumor.
- 2. La CD madura proinflamatoria para ser usada de acuerdo con la reivindicacion 1, que ademas ha sido estimulada con al menos una de las sustancias elegidas del grupo que consiste en interferon a (IFN-a), interleucina 1p (IL-1p) y factor a de la necrosis tumoral (TNF-a).
- 3. La CD madura proinflamatoria para ser usada de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que produce al menos 25.000 pg IL-l2/ml/106 celulas, al menos 100.000 pg CXCL9/ml/106 celulas y al menos 40.000 pg CCL3/ml/106 celulas durante 24 h despues de la retirada de los estfmulos.
- 4. La CD madura proinflamatoria para ser usada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que ademas produce al menos 2.000 pg TNF-a/ml/106 celulas y al menos 500 pg IL-1p/ml/106 celulas durante 24 h despues de la retirada de los estimulos.
- 5. La CD madura proinflamatoria para ser usada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el cancer se elige del grupo que consiste en: cancer de mama, cancer de prostata, cancer de rinon, cancer intestinal, gliomas malignos, osteosarcoma, melanoma maligno, cancer de pancreas, linfomas malignos y cancer de esofago.
- 6. Composicion farmaceutica que comprende las celulas dendnticas proinflamatorias maduras de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y uno o varios excipientes farmaceuticamente aceptables, para ser usada para el tratamiento contra el cancer en un individuo diferente de la fuente de las CD maduras proinflamatorias, en donde el uso es por inyeccion en el interior del tumor.
- 7. La composicion farmaceutica para ser usada de acuerdo con la reivindicacion 6, que ademas comprende celulas mononucleares de la sangre periferica.
- 8. La composicion farmaceutica para ser usada de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde las celulas mononucleares de la sangre periferica se han obtenido de una persona que no es el paciente.
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