ES2581314T3 - Métodos de cribado de anticuerpos - Google Patents

Abstract

Un metodo de preparacion de conjugados de anticuerpo para su uso en ensayos de cribado de anticuerpos que comprende las etapas de: proporcionar una pluralidad de muestras que contienen anticuerpo que varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y a la secuencia de anticuerpo a condicion de que, en una mayoria de la pluralidad de las muestras que contienen anticuerpo, sustancialmente todo el anticuerpo presente en una unica muestra sea de la misma secuencia; inmovilizar los anticuerpos sobre un soporte solido para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados; reducir completamente los enlaces disulfuro reducibles de los anticuerpos inmovilizados para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados reducidos, en donde la reduccion es selectiva para enlaces disulfuro reducibles; y o bien a) hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con un agente de terminacion, un farmaco o un conector de farmaco, y opcionalmente un agente de deteccion, para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden conjugados de anticuerpo inmovilizado, en donde el agente de terminacion, el farmaco o el conector de farmaco y el agente de deteccion opcional reaccionan selectivamente con tioles reactivos, el agente de terminacion, el farmaco o el conector de farmaco y el agente de deteccion opcional se proporcionan en exceso molar y la relacion de agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de farmaco; o bien b) hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con un agente de terminacion y un agente de deteccion para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden conjugados de anticuerpo inmovilizado, en donde el agente de terminacion y de deteccion reaccionan selectivamente con tioles reactivos, en donde el agente de terminacion y el agente de deteccion se proporcionan en exceso molar y la relacion de agente de terminacion y agente de deteccion esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de agente de terminacion y/o de agente de deteccion; y eluir los conjugados de anticuerpo para proporcionar una pluralidad de composiciones de conjugado de anticuerpo.

Description

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DESCRIPCION

Metodos de cribado de anticuerpos Antecedentes de la invencion

La actividad de conjugados de anticuerpo-farmaco (ADC, acronimo de antibody-drug conjugates) sobre celulas cancerosas puede estar afectada por una multitud de factores, tales como la afinidad de union, tasa de internalizacion, trafico subcelular, y eficaz liberacion de farmaco dentro de la poblacion de celulas diana. Por consiguiente, las propiedades de un anticuerpo ideal para la administracion de farmaco no son necesariamente las mismas que aquellas para un anticuerpo no conjugado terapeutico. Ademas, ensayos indirectos que implican el uso de anticuerpos secundarios para el cribado de ADC optimos pueden ser confusos, ya que la reticulacion sobre la superficie celular puede conducir a eventos aguas abajo alterados, y la afinidad del anticuerpo secundario limita el intervalo dinamico del ensayo. Cuando se buscan anticuerpos candidatos dirigidos contra un antigeno novedoso para terapia de ADC, lo mas deseable es, por tanto, cribar un gran panel de anticuerpos en forma de ADC y evaluar sus actividades citotoxicas, ya que estos resultados proporcionan una medicion directa de parametros que pueden afectar la actividad citotoxica. Sin embargo, cuando se trata con cantidades de microgramo de un gran numero de anticuerpos como es tipico de una campana de descubrimiento de anticuerpos, los rendimientos de las metodologias de conjugacion convencionales son limitantes. Existe la necesidad de metodos mejorados de cribado de anticuerpos para su uso como ADC. Esta presente invencion trata esta y otras necesidades.

Los documentos US2005/0276812 A1, US2010/0021474 A1, US2009/0280056 A1, US2009/0047296 A1, US2009/0136526 A1, US2007/0160617 A1, US2009/0226465 A1 y US2010/0034837 A1 se refieren a anticuerpos e inmunoconjugados y a su uso en el diagnostico y el tratamiento de enfermedades tales como el cancer.

Carter et al, “Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy", The Cancer Journal, 2008. 14(3), 154-169 se refiere al concepto general de conjugados de anticuerpo-farmaco (ADC) y revisiones de ADC en ensayos clinicos para terapia del cancer.

Tallian et al, “A Rapid Procedure for Preparing Fluorescein-labeled Specific Antibodies from Whole Antiserum: Its Use in Analyzing Cytoskeletal Architecture" se refiere a un metodo para la conjugacion directa de anticuerpos purificados con fluoresceina, que implica la inmovilizacion de anticuerpos como complejos de antigeno-anticuerpo sobre transferencias de nitrocelulosa.

Sumario de la invencion

La invencion proporciona metodos de preparacion de conjugados de anticuerpo para su uso en ensayos de cribado de anticuerpos y conjugados de anticuerpo producidos por los metodos reivindicados.

En algunas realizaciones, los metodos comprenden las etapas de proporcionar una primera y segunda muestra que contiene anticuerpo en el que la primera y segunda muestra que contiene anticuerpo varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo a condicion de que sustancialmente todo el anticuerpo presente en la primera muestra sea de la misma secuencia y sustancialmente todo el anticuerpo presente en la segunda muestra sea de la misma secuencia; inmovilizar los anticuerpos sobre un soporte solido para proporcionar una primera y segunda muestra que comprende anticuerpos inmovilizados; reducir completamente los enlaces disulfuro reducibles de los anticuerpos inmovilizados para proporcionar una primera muestra que comprende anticuerpos inmovilizados reducidos y segunda muestra que comprende anticuerpos inmovilizados reducidos, en el que la reduccion es selectiva para los enlaces disulfuro reducibles; hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco, y opcionalmente un agente de deteccion, para proporcionar conjugados de anticuerpo inmovilizado, en el que el agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional reaccionan selectivamente con tioles reactivos, el agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional se proporcionan en exceso molar, y la relacion de agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de farmaco; y eluir los conjugados de anticuerpo para proporcionar una primera muestra de conjugados de anticuerpo libre y segunda muestra de conjugados de anticuerpo libre.

En algunas realizaciones, los metodos comprenden las etapas de proporcionar una pluralidad de muestras de sobrenadante de hibridoma no purificado que comprende anticuerpo no cuantificado producido a partir de una pluralidad de clones de hibridoma, en el que la pluralidad de muestras varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo, a condicion de que, en una mayoria de la pluralidad de las muestras, sustancialmente todo el anticuerpo presente en cada muestra sea de un unico clon de hibridoma; inmovilizar los anticuerpos no cuantificados sobre un soporte solido para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados; reducir completamente los disulfuros intercatenarios de los anticuerpos inmovilizados para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados reducidos; hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y un agente de deteccion para proporcionar conjugados de anticuerpo inmovilizado, en el que el agente de terminacion,

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farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion reaccionan selectivamente con tioles reactivos, el agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional se proporcionan en exceso molar, y la relacion de agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de farmaco; y eluir los conjugados de anticuerpo de los soportes solidos para proporcionar una pluralidad de composiciones de conjugado de anticuerpo.

En algunas realizaciones, los metodos comprenden las etapas de proporcionar una pluralidad de muestras que contienen anticuerpo que varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo a condicion de que, en una mayoria de la pluralidad de las muestras que contienen anticuerpo, sustancialmente todo el anticuerpo presente en una unica muestra sea de la misma secuencia; inmovilizar los anticuerpos sobre un soporte solido para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados; reducir completamente los enlaces disulfuro reducibles de los anticuerpos inmovilizados para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados reducidos, en el que la reduccion es selectiva para enlaces disulfuro reducibles; hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco, y opcionalmente un agente de deteccion, para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden conjugados de anticuerpo inmovilizado, en el que el agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional reaccionan selectivamente con tioles reactivos, el agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional se proporcionan en exceso molar, y la relacion de agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de farmaco; y eluir los conjugados de anticuerpo para proporcionar una pluralidad de composiciones de conjugado de anticuerpo que comprenden conjugados de anticuerpo libre.

En algunas realizaciones, los metodos comprenden las etapas de proporcionar una pluralidad de muestras que contienen anticuerpo que varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo a condicion de que, en una mayoria de la pluralidad de las muestras que contienen anticuerpo, sustancialmente todo el anticuerpo presente en una unica muestra sea de la misma secuencia; inmovilizar los anticuerpos sobre un soporte solido para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados; reducir completamente los enlaces disulfuro reducibles de los anticuerpos inmovilizados para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados reducidos, en el que la reduccion es selectiva para enlaces disulfuro reducibles; hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con agente de terminacion y un agente de deteccion para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden conjugados de anticuerpo inmovilizado, en el que el agente de terminacion y de deteccion reaccionan selectivamente con tioles reactivos, el agente de terminacion y el agente de deteccion se proporcionan en exceso molar, y la relacion de agente de terminacion y agente de deteccion esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de agente de deteccion y/o de agente de terminacion; y eluir los conjugados de anticuerpo para proporcionar una pluralidad de composiciones de conjugado de anticuerpo que comprenden conjugados de anticuerpo libre.

En algunas realizaciones, los metodos comprenden las etapas de proporcionar una pluralidad de muestras que contienen anticuerpo que varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo, a condicion de que, en una mayoria de la pluralidad de las muestras que contienen anticuerpo, sustancialmente todo el anticuerpo presente en una unica muestra sea de la misma secuencia; inmovilizar los anticuerpos sobre un soporte solido para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados; reducir completamente los enlaces disulfuro reducibles de los anticuerpos inmovilizados para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados reducidos, en el que la reduccion es selectiva para enlaces disulfuro reducibles; hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco, y opcionalmente un agente de deteccion para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden conjugados de anticuerpo inmovilizado, en el que el agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional reaccionan selectivamente con tioles reactivos, el agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional se proporcionan en exceso molar, y la relacion de agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de farmaco; eluir los conjugados de anticuerpo para proporcionar una pluralidad de composiciones de conjugado de anticuerpo que comprenden conjugados de anticuerpo libre; ensayar para una actividad de los conjugados de anticuerpo; y seleccionar un anticuerpo de la base del resultado del ensayo.

En algunas realizaciones, los metodos comprenden las etapas de proporcionar una pluralidad de muestras que contienen anticuerpo que varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo, a condicion de que, en una mayoria de la pluralidad de las muestras que contienen anticuerpo, sustancialmente todo el anticuerpo presente en una unica muestra sea de la misma secuencia; inmovilizar los anticuerpos sobre un soporte solido para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados; reducir completamente los enlaces disulfuro reducibles de los anticuerpos inmovilizados para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados reducidos, en el que la reduccion es selectiva para enlaces disulfuro reducibles; hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con agente de terminacion y un agente de deteccion para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden conjugados de anticuerpo inmovilizado, en el que el agente de terminacion y de deteccion reaccionan selectivamente con tioles reactivos, el agente de terminacion y el agente de deteccion se proporcionan en exceso molar, y la relacion de agente de terminacion y agente de deteccion esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de agente de deteccion

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y/o de agente de terminacion; eluir los conjugados de anticuerpo para proporcionar una pluralidad de composiciones de conjugado de anticuerpo que comprenden conjugados de anticuerpo libre; ensayar para una actividad de los conjugados de anticuerpo; y seleccionar un anticuerpo de la base del resultado del ensayo.

Estos y otros aspectos de la presente invencion pueden entenderse mas completamente por referencia a la siguiente descripcion detallada, ejemplos no limitantes de realizaciones especificas y las figuras adjuntas.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Esta figura proporciona una transparencia de cromatogramas de interaccion hidrofoba de una IgG 1 murina en su forma no conjugada (discontinua), completamente reducida y conjugada con mcMMAF en solucion (linea continua gruesa) y completamente reducida y conjugada con mcMMAF mientras que esta inmovilizada sobre proteina G-Sepharose (linea continua fina).

Figura 2. Esta figura ilustra la fraccion molar de mcMMAF en una mezcla de reaccion a modo de ejemplo que comprende mcMMAF y N-etilmaleimida necesaria con el fin de lograr una carga de farmaco seleccionada sobre una IgG 1 murina inmovilizada sobre proteina G y completamente reducida con tris(2-carboxietil)fosfina en exceso.

Figura 3. La figura proporciona un cromatograma de PLRP de muestra de un conjugado de anticuerpo-farmaco que ilustra la distribucion de mcMMAF y NEM sobre las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo. La hidrofobia del farmaco produce tiempos de retencion mas tarde para especies con mas farmaco; se indica el numero de farmacos para cada especie.

Figura 4. Esta figura demuestra la salida de fluorescencia de conjugados de farmaco-Alexa Fluor® 647 en funcion de la carga de fluoroforo. El numero de fluoroforos por anticuerpo se representa en el eje x y la fluorescencia se representa en el eje y. La fluorescencia aumenta rapidamente a un valor maximo cuando la carga es aproximadamente 2,5 a 3 fluoroforos por anticuerpo, luego disminuye con carga adicional.

Figura 5. Esta figura proporciona la relacion de la absorbancia a 650 nm con respecto 280 nm, la relacion representada en funcion del nivel de carga de Alexa Fluor® 647 en conjugados mixtos de fluoroforo - anticuerpo mcMMAF.

Figura 6. Esta figura demuestra la consistencia de la carga de Alexa Fluor® 647 a traves de 65 muestras. La carga de fluoroforo se determino obteniendo la relacion de absorbancia 650 nm / 280 nm de cada muestra de conjugado de anticuerpo y refiriendose de nuevo a la Figura 5 para determinar la carga de fluoroforo asociada a la relacion de absorbancia.

Figura 7. Esta figura proporciona un cromatograma de PLRP de un conjugado mixto de mcMMAF - AF647 - NEM. El anticuerpo tiene 5 disulfuros reducibles. Esta figura proporciona una transparencia de dos longitudes de onda analiticas. La longitud de onda a 280 nm representada por una linea continua fina detecta todos los picos que contienen proteina y la longitud de onda de 620 nm representada por una linea continua gruesa detecta todos los picos que contienen al menos un Alexa Fluor® 647.

Figura 8. Esta figura ilustra la consistencia de carga de mcMMAF a traves de 34 muestras.

Figura 9. Esta figura proporciona un cromatograma de PLRP de un conjugado mixto de mcMMAF - AF647 - NEM. El anticuerpo tiene 6 enlaces disulfuro reducibles (por ejemplo, una IgG2b murina). La longitud de onda de 280 nm se representa por una linea continua fina y la longitud de onda de 620 nm se representa por una linea continua gruesa.

Figura 10. Esta figura proporciona un esquema a modo de ejemplo para la sintesis en fase solida basada en placa de ADC.

Figura 11. Esta figura proporciona un esquema a modo de ejemplo para la aplicacion de tecnologia de conjugacion en fase solida al descubrimiento de ADC con propiedades deseables.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

El termino “anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a (a) polipeptidos de inmunoglobulina y porciones inmunologicamente activas de polipeptidos de inmunoglobulina, es decir, polipeptidos de la familia de la inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos o (b) derivados conservativamente sustituidos de tales polipeptidos de inmunoglobulina o fragmentos que se unen inmunoespecificamente a un antigeno diana. Los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos) para su uso en la presente invencion contienen (i) un sitio de union al

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antigeno que se une inmunoespedficamente a un antigeno diana, (ii) al menos un enlace disulfuro reducible (por ejemplo, enlace disulfuro intercatenario) y (iii) un dominio capaz de unirse reversiblemente a una fase solida. En algunas realizaciones, un anticuerpo comprendera una region Fc de longitud completa y la union a la fase solida sera mediante la region Fc. En algunas realizaciones, un anticuerpo comprendera uno o mas dominios Fc de un anticuerpo y la union a la fase solida sera mediante el uno o mas dominios Fc. En algunas realizaciones, el dominio capaz de unirse reversiblemente a una fase solida no sera una region Fc, pero sera un dominio manipulado en el anticuerpo, tal como, por ejemplo, una marca de afinidad. El termino anticuerpo incluye anticuerpos que estan no fucosilados o tienen fucosilacion del nucleo reducida. Los anticuerpos se describen generalmente en, por ejemplo, Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). La unidad basica de una estructura de anticuerpo intacto es un complejo de cuatro polipeptidos, dos cadenas de bajo peso molecular identicas (“ligeras”) y dos cadenas de alto peso molecular identicas (“pesadas”), asociadas juntas por tanto asociaciones no covalentes como por enlaces disulfuro. La clase y subclase de un anticuerpo es su isotipo. Los anticuerpos pueden estar, por ejemplo, en su forma tetramera natural (2 cadenas ligeras y 2 cadenas pesadas) y pueden ser de cualquiera de los isotipos conocidos IgG, IgA, IgM, IgD e IgE y sus subtipos, por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4 humanas e IgG 1, IgG2a, IgG2b e IgG3 de raton. Los anticuerpos son preferentemente monoclonales.

En el contexto de un anticuerpo, el termino “enlace disulfuro reducible” se refiere a un enlace disulfuro que es (i) reducible mientras que el anticuerpo esta reversiblemente unido a un soporte solido, y (ii) reducible bajo condiciones reductoras suaves. Condiciones reductoras suaves son aquellas condiciones que generalmente no producen ninguna desnaturalizacion sustancial del anticuerpo y generalmente no afectan la afinidad de union al antigeno del anticuerpo. Un ejemplo de condiciones reductoras suaves es reduccion bajo condiciones acuosas a pH casi neutro con un agente reductor debil. Un ejemplo de agentes reductores debiles son TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina) y DTT (ditiotreitol). Por consiguiente, un ejemplo de condiciones reductoras suaves es reduccion en un exceso de TCEP o DTT a una temperatura de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 37 °C y a pH de aproximadamente 5 a 8. Debido a que los codisolventes organicos pueden desnaturalizar sustancialmente las proteinas, si van a usarse codisolventes organicos en la desnaturalizacion y/o etapas de conjugacion posteriores, debe ser una cantidad minima de codisolventes (por ejemplo, inferior al 20 %, preferentemente inferior al 15 %, 10 %, o incluso del 5 %) de forma que no se produzca desnaturalizacion sustancial del anticuerpo. Normalmente, los enlaces disulfuro reducibles son aquellos que estan accesibles por el disolvente, es decir, no estan enterrados dentro de los dominios plegados del anticuerpo. (El experto entendera que cuando se reducen los enlaces disulfuro reducibles de una poblacion de anticuerpos dentro de una muestra segun los metodos descritos en el presente documento, puede haber una cantidad menor de anticuerpos que llegan a desnaturalizarse irreversiblemente (por ejemplo, generalmente menos del 10 %, incluso menos del 5 % o del 3 %)). Normalmente, en un anticuerpo, un enlace disulfuro esta presente como resultado de la oxidacion de los grupos laterales tiol (--SH) de dos residuos de cisteina. Estos residuos pueden encontrarse sobre diferentes cadenas de polipeptidos (intercatenarios), o sobre la misma cadena de polipeptidos (intracatenarios). Como resultado de la oxidacion, se forma un enlace disulfuro (--S--S--) entre los carbonos beta de los residuos de cisteina originales. El tratamiento del enlace disulfuro con un agente reductor produce la escision reductora de los enlaces disulfuro para generar dos grupos tiol libres, es decir, tioles reactivos. En algunas realizaciones, el enlace disulfuro reducible existe de forma natural. En algunos aspectos, el termino “enlace disulfuro reducible” se refiere a los enlaces disulfuro intercatenarios de origen natural de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un grupo(s) sulfhidrilo se introduce(n) quimicamente en el anticuerpo. Metodos adecuados para introducir grupos sulfhidrilo incluyen tecnologia de ADn recombinante. Los grupos sulfhidrilo pueden introducirse en un anticuerpo, por ejemplo, dentro del anticuerpo o en el extremo carboxi. Debido a que es preferible que los metodos descritos en el presente documento no interfieran con la actividad de union del antigeno de los conjugados de anticuerpo resultantes, es preferible que los grupos sulfhidrilo introducidos se introduzcan en un sitio distinto del sitio de union al antigeno del anticuerpo. Preferentemente, los grupos sulfhidrilo introducidos se introducen en un sitio distinto de las regiones variables de la cadena pesada o ligera, por ejemplo, preferentemente en la region constante de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un residuo de cisteina se manipula en un anticuerpo. El grupo sulfhidrilo de la cisteina normalmente formara un enlace disulfuro que puede entonces reducirse usando los metodos descritos en el presente documento.

En el contexto de una proteina de fusion, el termino “enlace disulfuro reducible” se refiere a un enlace disulfuro de una proteina de fusion que es (i) reducible mientras que la proteina de fusion esta reversiblemente unida a un soporte solido, y (ii) reducible bajo condiciones reductoras suaves. Para que una proteina de fusion sea de uso en los presentes metodos, debe permanecer generalmente intacta tras la reduccion del (de los) enlace(s) disulfuro reducible(s). Un ejemplo de condiciones reductoras suaves es la reduccion bajo condiciones acuosas a pH proximo a neutro con un agente reductor debil. En algunas realizaciones preferidas, el enlace disulfuro reducible estara en el dominio Ig de la proteina de fusion. En algunas realizaciones, el enlace disulfuro existe de forma natural y se refiere a los enlaces disulfuro intercatenarios de origen natural del dominio Ig de la proteina de fusion. En algunas realizaciones, un grupo(s) sulfhidrilo se introduce(n) quimicamente en el dominio Ig de la proteina de fusion.

El termino “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que se deriva de un unico clon celular, que incluye cualquier clon de celulas eucariotas o procariotas, o un clon de fago, y no el metodo por el que se produce. Asi, el termino “anticuerpo monoclonal” no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnologia de hibridomas.

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El termino “region Fc” se refiere a una region constante de un anticuerpo, por ejemplo, un dominio CHl-bisagra-CH2- Ch3, que opcionalmente tiene un dominio Ch4, o un derivado conservativamente sustituido de una region Fc tal.

El termino “dominio Fc” se refiere al dominio de la region constante de un anticuerpo, por ejemplo, un dominio Ch1, bisagra, Ch2, Ch3 o Ch4, o un derivado conservativamente sustituido de un dominio Fc tal.

Un “antigeno” es una molecula a la que un anticuerpo se une especificamente.

Un “agente citotoxico” se refiere a un agente que tiene un efecto citotoxico y/o citostatico sobre una celula. Un “efecto citotoxico” se refiere al agotamiento, eliminacion y/o a la destruccion de una celula(s) diana. Un “efecto citostatico” se refiere a la inhibicion de la proliferacion celular.

El termino “enlace disulfuro intercatenario”, en el contexto de un anticuerpo, se refiere a un enlace disulfuro entre dos cadenas pesadas, o una cadena pesada y una ligera de un anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, “conjugados de anticuerpo libre” se refiere a conjugados de anticuerpo que no estan inmovilizados sobre un soporte solido, por ejemplo, los anticuerpos se han liberado de un soporte solido.

La abreviatura “AFP” se refiere a dimetilvalina-valina-dolaisoleucina-dolaproinafenilalanina-p-fenilendiamina que tiene la formula general mostrada inmediatamente a continuacion:

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La abreviatura “MMAE” se refiere a monometil auristatina E que tiene la formula general mostrada inmediatamente a continuacion:

imagen2

La abreviatura “MMAF” se refiere a dovalina-valina-dolaisoleucina-dolaproinafenilalanina que tiene la formula general mostrada inmediatamente a continuacion:

imagen3

La abreviatura “AEB” se refiere a un ester producido haciendo reaccionar auristatina E con acido para- acetilbenzoico. La abreviatura “AEVB” se refiere a un ester producido haciendo reaccionar auristatina E con acido benzoilvalerico.

La expresion “sal farmaceuticamente aceptable”, como se usa en el presente documento, se refiere a sales organicas o inorganicas farmaceuticamente aceptables de una molecula o macromolecula. Pueden formarse sales de adicion de acido con grupos amino. Sales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, las sales sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, acido fosfato, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato acido, tartrato, oleato, tannato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Una sal farmaceuticamente aceptable puede implicar la inclusion de otra molecula tal como un ion acetato, un ion succinato u otro contraion. El contraion puede ser cualquier resto organico o inorganico que estabilice la carga sobre el

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compuesto parental. Ademas, una sal farmaceuticamente aceptable puede tener mas de un atomo cargado en su estructura. Casos en los que multiples atomos cargados son parte de la sal farmaceuticamente aceptable pueden tener multiples contraiones. Por tanto, una sal farmaceuticamente aceptable puede tener uno o mas atomos cargados y/o uno o mas contraiones.

General

Se ha inventado un metodo de cribar directamente anticuerpos basandose en su rendimiento como ADC o como anticuerpos no conjugados (es decir, anticuerpos desnudos). Se ha desarrollado una tecnica de marcado que es insensible a la concentration de anticuerpo presente en una muestra y aplicable a pequenas cantidades de anticuerpo que permiten una comparacion de las actividades de anticuerpos individuales de una poblacion heterogenea de anticuerpos.

El ensayo de cribado es util para identificar anticuerpos con caracteristicas deseadas. Los anticuerpos pueden generarse mediante cualquier tecnica conocida en la tecnica para generar anticuerpos, a condition de que los anticuerpos que van a cribarse comprendan (i) un sitio de union al antigeno que se une inmunoespecificamente a un antigeno especifico, (ii) al menos un enlace disulfuro reducible (por ejemplo, enlace disulfuro intercatenario) y (iii) un dominio capaz de unirse a una fase solida.

En un aspecto de la invention se proporciona una pluralidad de muestras que contienen anticuerpo. La expresion “una pluralidad de muestras" se refiere a dos o mas muestras. Debido a que los metodos proporcionados en el presente documento son idealmente aptos para el cribado de alto rendimiento, en un aspecto de la invencion, los metodos se realizan simultaneamente en al menos decenas o al menos cientos de muestras. Una de las fortalezas de los metodos proporcionados en el presente documento es que puede hacerse una comparacion entre anticuerpos aun cuando las muestras que contienen el anticuerpo puedan no contener la misma cantidad de anticuerpo. Por consiguiente, en un aspecto, las muestras varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y con respecto a la secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, en un aspecto, una primera muestra comprendera un primer anticuerpo en una primera cantidad y una segunda muestra comprendera un segundo anticuerpo en una segunda cantidad. La primera y segunda cantidades variaran y el primer y segundo anticuerpos variaran. En realizaciones en las que se desea comparar anticuerpos que se dirigen al mismo antigeno, los anticuerpos se uniran inmunoespecificamente al mismo antigeno. Con el fin de aclaracion, la expresion “en el que la pluralidad de muestras varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo" no requiere que todas las muestras dentro de una pluralidad de muestras varien con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo, solo que haya cierto nivel de heterogeneidad entre las muestras. Aunque hay una varianza en la secuencia de anticuerpo (por ejemplo, una primera muestra contendra un anticuerpo diferente que una segunda muestra), es preferible que una unica muestra contenga un anticuerpo, es decir, que el anticuerpo presente en una unica muestra sea de la misma secuencia. La expresion “sustancialmente todo el anticuerpo presente en una unica muestra sea de la misma secuencia" refleja la preferencia de que una unica muestra contenga un anticuerpo con el reconocimiento de que, en algunas muestras, pueda haber algo de contamination con otro anticuerpo. Preferentemente, en aquellas muestras que tienen alguna contamination con otro anticuerpo, hay menos del 30 %, preferentemente menos del 20 %, preferentemente menos del 15 %, mas preferentemente menos del 10 %, e incluso mas preferentemente menos del 5 %, menos del 4 %, o menos del 3 % de contaminacion con otro anticuerpo. En realizaciones preferidas, la mayoria de las muestras que contienen anticuerpo (mas del 50 % de las muestras e incluso mas preferentemente mas del 60 %, mas del 70 %, mas del 75 %, o incluso mas del 80 % de las muestras) en una pluralidad de muestras que contienen anticuerpo contienen un anticuerpo con ninguna cantidad o con cantidades menores de contaminacion con otro anticuerpo (por ejemplo, inferior al 15 %, preferentemente incluso inferior al 10 % o inferior al 5 % de contaminacion con otro anticuerpo). En algunas realizaciones preferidas, la mayoria de las muestras que contienen anticuerpo comprenderan anticuerpos que se unen inmunoespecificamente al mismo antigeno.

Los anticuerpos que van a cribarse usando los presentes metodos pueden dirigirse a cualquier antigeno. En realizaciones a modo de ejemplo, un anticuerpo que va a cribarse por los presentes metodos se unira inmunoespecificamente a un antigeno seleccionado de CD19, CD20, Cd21, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD70, CD74, CD83, CD133, CD138, CD200 o CD276. En otras realizaciones, el anticuerpo se unira inmunoespecificamente a BMPR1B, LAT1 (SLC7A5), STEAP1, MUC16, MUC1, factor potenciador de megacariocitos (MPF), Napi3b, Sema 5b, PSCA hlg, EtBR (receptor tipo B de endotelina), STEAP2, TrpM4, CRIPTO, CD21, CD79a, CD79b, FcRH2, HER2, HER3, HER4, NCA, MDP, IL20Ra, brevicano, Ephb2R, ASLG659, PSCA, PSMA, TMPRSS2, TMPRSS4, GEDA, BAFF-R, CXCR5, HLA-DOB, P2X5, CD72, LY64, FCRH1, VEGF, PLAC1, VEGFR1, VEGFR2 o IRTA2. En otras realizaciones, el anticuerpo se unira inmunoespecificamente a CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CD11a, CD14, CD16, CD18, CD19, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD40L, CD51, CD52, CD54, CD56, CD70, CD80, CD123, CD133, CD138, CD147, CD227 o CD276. En otras realizaciones, el anticuerpo se unira inmunoespecificamente a IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL- 18 o IL-23. En otras realizaciones, el anticuerpo se unira inmunoespecificamente a una proteina de la familia de transportadores de soluto de proteinas (por ejemplo, familia de transportadores de soluto 44, miembro 4 (proteina codificada por el gen SLC44A4) o familia de transportadores de soluto 34, miembro 2 (proteina codificada por el gen SLC34A2)); LIV-1 (proteina codificada por el gen SLC39A6); proteina de la familia SlAm de proteinas (por ejemplo, miembros de la familia SLAM 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9); proteina de la familia mucina de proteinas (por ejemplo,

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MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC6, MUC7, MUC8, MUC9, MUC10, MUC11, MUC12, MUC13, MUC14, MUC15 o MUC16); protema de la familia STEAP de proteinas (por ejemplo, STEAP1, STEAP2, STEAP3 o STEAP4); una protema de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (por ejemplo, TNF-RI, TNF-RII, DR1, DR2, DR3, DR4, DR5); protema MN; protema mesotelina; protema codificada por la familia Slitrk de proteinas (por ejemplo, SLITRK1, SLItRk2, SLITRK3, SLITRK4, SLITRK5 o SLITRK6), o una protema codificada por el gen GPNMB.

Las muestras que contienen anticuerpo pueden generarse de muchas formas diferentes. Hay muchas tecnicas conocidas en la tecnica para generar anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos que son utiles en los presentes metodos pueden producirse por tecnicas de expresion recombinante, tecnica de presentacion en fagos, a partir de hibridomas, a partir de mielomas, a partir de otras celulas de mamifero que expresan anticuerpo, y a partir de combinaciones de los mismos. Los anticuerpos que van a usarse en la presente invencion puede ser de cualquier especie (por ejemplo, humana, murina, rata) y pueden ser de especies mixtas, por ejemplo, quimericas. Los anticuerpos que van a usarse en la presente invencion pueden comprender regiones variables de longitud completa o fragmentos de las mismas.

Puede utilizarse varias celulas de mamifero y lineas celulares para expresar un anticuerpo. Por ejemplo, pueden usarse celulas de mamifero tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO) (por ejemplo, DG44, Dxb11, CHO- K, CHO-K1 y CHO-S). En algunas realizaciones se usan lineas celulares humanas. Lineas de celulas de mieloma adecuadas incluyen SP2/0 e IR983F y lineas de celulas de mieloma humanas tal como Namalwa. Otras celulas adecuadas incluyen celulas de rinon embrionario humano (por ejemplo, HEK293), celulas de rinon de mono (por ejemplo, COS), celulas epiteliales humanas (por ejemplo, HeLa), PeRc6, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, BHK y K6H6. Otras celulas huesped adecuadas incluyen celulas YB2/0.

Puede usarse cualquier tecnica de generation de anticuerpos para generar las muestras que contienen anticuerpo descritas en el presente documento a condition de que los anticuerpos generados puedan inmovilizarse sobre un soporte solido y contener al menos un enlace disulfuro reducible. En algunas realizaciones, el anticuerpo se generara por un metodo conocido en la tecnica y se modificara con el fin de ponerlo en condicion para su uso en los presentes metodos. Por ejemplo, los anticuerpos generados por presentacion en fagos u otros metodos pueden modificarse para contener una marca de afinidad y/o pueden formatearse para expresar una region Fc. Para una vision general de la tecnologia de presentacion en fagos para producir anticuerpos vease Schmitz et al., 2000, Placenta 21, Suplemento A, S106-112. Vease tambien Lightwood et al., 2006, Journal of Immunological Methods 316, 133-143.

En algunos aspectos, los anticuerpos que van a ensayarse se generan usando tecnicas de hibridomas muy conocidas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las celulas huesped son de un hibridoma. Las tecnicas de hibridomas se tratan generalmente en, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1988); y Hammerling, et al., en Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Los anticuerpos tambien pueden generarse usando lineas celulares inmortales o condicionalmente inmortales distintas de lineas celulares de hibridoma, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos generados a partir de lineas celulares condicionalmente inmortales de ratones H-2Kb-tsA58 (Pasqualinie y Arap, PNAS, 2004, 101(1), 257-259). Estas tecnologias pueden usarse para generar anticuerpos completamente de roedor, quimericos de roedor-humano, o humanos. Por ejemplo, para una vision general de una tecnologia para producir anticuerpos humanos a partir de ratones transgenicos inmunizados usando tecnologia de hibridomas vease Lonberg y Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93.

Ademas, pueden involucrarse empresas tales como Amgen, Inc. (Thousand Oaks, CA) y BEM (Princeton, NJ) para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antigeno seleccionado usando tecnologia similar a la citada anteriormente. Pueden producirse anticuerpos completamente humanos usando ratones transgenicos que son incapaces de expresar genes de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina endogena, pero que pueden expresar genes de las cadenas pesadas y ligeras humanos. Los ratones transgenicos se inmunizan en el modo normal con un antigeno seleccionado, por ejemplo, todo o una portion de un polipeptido diana. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antigeno pueden obtenerse usando tecnologia de hibridomas convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana alojados por los ratones transgenicos se reorganizan durante la diferenciacion de linfocitos B, y posteriormente experimentan conmutacion de clase y mutation somatica. Asi, usando una tecnica tal, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente utiles. Para una vision general de esta tecnologia para producir anticuerpos humanos vease Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93).

Los presentes metodos no requieren una etapa de purification antes de la inmovilizacion del anticuerpo sobre un soporte solido. En algunos aspectos, el anticuerpo proporcionado en la muestra que contiene anticuerpo no esta purificado. En algunas realizaciones, el sobrenadante de cultivo celular no purificado o los medios acondicionados no purificados se proporcionan como la muestra que contiene anticuerpo. Por ejemplo, en algunas realizaciones en las que la tecnologia de hibridomas se usa para generar anticuerpos, las muestras que contienen anticuerpo son muestras de sobrenadante de hibridoma no purificado. En algunos aspectos, las muestras de sobrenadante varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo. Es preferible que una unica muestra de

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sobrenadante de hibridoma contenga anticuerpo de un unico clon de hibridoma, aunque las muestras que contienen anticuerpo pueden contener contaminacion con otros anticuerpos. Metodos de recogida de poblaciones clonales de hibridomas se conocen en la tecnica, ya que son metodos de generation de sobrenadante de hibridoma. Por ejemplo, en un aspecto, hibridomas recien fusionados se siembran en medio semi-solido, por ejemplo, metilcelulosa) con un medio selectivo (por ejemplo, un medio que promueve la supervivencia y proliferation de celulas de hibridoma y la elimination de linfocitos B no fusionados y celulas de mieloma. Ejemplos de un medio tal incluyen uno que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Las colonias productoras de IgG clonales se seleccionan y se ponen en pocillos individuales que contienen medio para soportar la expansion de la linea celular y la production de anticuerpos. El sobrenadante de hibridoma resultante puede ensayarse por los presentes metodos. En otro aspecto, las celulas de hibridoma se clonan usando un enfoque de dilucion limitada. En algunas realizaciones, antes de la inmovilizacion y la conjugation, los sobrenadantes de cultivo de hibridoma no purificados se criban para la presencia de anticuerpos con especificidad por antigenos deseada. En algunas realizaciones, se proporciona de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 5 ml de sobrenadante de hibridoma.

En algunas realizaciones, el sobrenadante de cultivo celular no purificado es distinto del sobrenadante de hibridoma, por ejemplo, sobrenadante de cultivo de celulas CHO (por ejemplo, lineas celulares DG44, Dxb11, CHO-K1 y CHOS), u otro sobrenadante de cultivo celular.

En algunas realizaciones, el anticuerpo en las muestras que contienen anticuerpo se produce en medios de cultivo que carecen de IgG endogena, y, en particular, medios de cultivo que carecen de IgG bovina. En algunas realizaciones, el medio de cultivo se agota en IgG endogena antes de uso (vease, por ejemplo, el Ejemplo 8). Medios de cultivo adecuados incluyen aquellos que contienen, por ejemplo, sales, fuente de carbono (por ejemplo, azucares), fuente de nitrogeno, aminoacidos, oligoelementos, antibioticos, agentes de selection, y similares, segun se requiera para el crecimiento. Pueden usarse medios comercialmente disponibles, ademas de medios de donation comercialmente disponibles, que incluyen medios de donation con empobrecimiento de IgG. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, seran evidentes para el experto en la materia.

Los presentes metodos usan un soporte solido para la conjugacion de los anticuerpos con una entidad quimica deseada. Debido a que los presentes metodos se realizan en fase solida y no en solution, los presentes metodos pueden realizarse con muestras que contienen cantidades muy pequenas (por ejemplo, 1 a 500 |jg) de anticuerpo. En algunas realizaciones, habra de 1 jg a 100 jg, de 1 jg a 50 jg, de 1 jg a 20 jg, de 3 jg a 100 jg, de 3 jg a 50 jg, de 3 jg a 20 jg, de 5 jg a 100 jg, de 5 jg a 50 jg, o de 5 jg a 20 jg de anticuerpo presente en una unica muestra. En un aspecto, al menos una de las muestras en una pluralidad de muestras tendra de 1 jg a 100 jg, de 1 jg a 50 jg, de 1 jg a 20 jg, de 3 jg a 100 jg, de 3 jg a 50 jg, de 3 jg a 20, de 5 jg a 100 jg, de 5 jg a 50 jg, o de 5 jg a 20 jg de anticuerpo presente.

Un soporte solido se refiere a un material funcionalizado insoluble al que los anticuerpos pueden unirse reversiblemente, tanto directamente como indirectamente, permitiendoles separarse de materiales no deseados, por ejemplo, exceso de reactivos, contaminantes y disolventes. Ejemplos de soportes solidos incluyen, por ejemplo, materiales polimericos funcionalizados, por ejemplo, agarosa, o su forma de perla Sepharose®, dextrano, poliestireno y polipropileno, o mezclas de los mismos; discos compactos que comprenden estructuras de canal microfluidico; chips de matriz de proteina; puntas de pipeta; membranas, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa o PVDF; y microparticulas, por ejemplo, perlas paramagneticas o no paramagneticas. En algunas realizaciones, un medio de afinidad se unira al soporte solido y el anticuerpo se unira indirectamente al soporte solido mediante el medio de afinidad. En un aspecto, el soporte solido comprende un medio de afinidad de proteina A o medio de afinidad de proteina G. Un “medio de afinidad de proteina A" y un “medio de afinidad de proteina G” se refieren cada uno a una fase solida sobre la que esta unida una proteina natural o sintetica que comprende un dominio de union a Fc de proteina A o proteina G, respectivamente, o una variante mutada o fragmento de un dominio de union a Fc de proteina A o proteina G, respectivamente, variante o fragmento que retiene la afinidad por una portion Fc de un anticuerpo.

Los presentes metodos comprenden una etapa de inmovilizar anticuerpo sobre un soporte solido para proporcionar anticuerpos inmovilizados. En algunas realizaciones, el soporte solido tendra la capacidad de unir mas anticuerpo que la cantidad presente en la muestra que contiene anticuerpo o, en otras palabras, la cantidad de anticuerpo unido al soporte solido tras la etapa de inmovilizacion sera inferior a la capacidad del soporte solido. Debido a que las muestras generalmente varian con respecto a la cantidad de anticuerpo, habra variabilidad correspondiente en la cantidad de anticuerpo inmovilizado de una muestra en comparacion con otra.

En algunas otras realizaciones, podria desearse limitar la cantidad de anticuerpo unido y el soporte solido solo tendra la capacidad de unir hasta una cierta cantidad de anticuerpo (por ejemplo, hasta 5 jg, hasta 10 jg, o hasta 15 jg de proteina). En estas realizaciones, aunque habra un limite en cuanto a la cantidad maxima de anticuerpo que puede unirse al soporte solido, todavia puede haber variabilidad en la cantidad de anticuerpo inmovilizado en una muestra en comparacion con otra. Esto es debido a que una o mas de las muestras podrian contener una pequena cantidad de anticuerpo, inferior a la capacidad de carga maxima del soporte solido. Un enfoque para preparar un soporte solido que tiene capacidad limitada para unir anticuerpo es preparar una resina de capacidad muy baja de forma que un mayor volumen de suspension de resina (20 ul por ejemplo) contenga solo capacidad suficiente para

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unir 5 ug de anticuerpo. Un enfoque alternativo es reducir la capacidad eficaz de una resina diluyendo la resina con un volumen apropiado de resina no funcionalizada. Por ejemplo, una resina de protema G-Sepharose con una capacidad de union de 20 ug/ul podria convertirse en una resina mixta con una capacidad de union eficaz de 0,5 ug/ul mezclando 1 parte de proteina G-Sepharose con 40 partes de Sepharose no funcionalizada. En la realizacion de una solucion de resina tal, en algunas realizaciones, el diluyente sera una resina que se construye a partir del mismo material que la resina de afinidad, tiene tamanos de poro lo suficientemente pequenos para excluir anticuerpos, y carece de cualquier funcionalidad superficial que pueda interaccionar con anticuerpos o los reactivos quimicos usados para preparar los conjugados de anticuerpo.

En algunos aspectos de la invencion, los anticuerpos se inmovilizan sobre un soporte solido por la etapa de aplicar una muestra que contiene anticuerpo a un soporte solido. Si se desea, puede realizarse una etapa de lavado tras la inmovilizacion para separar los anticuerpos inmovilizados del sobrenadante de cultivo celular u otros componentes de las muestras que contienen anticuerpo.

Una vez los anticuerpos se inmovilizan sobre el soporte solido, se realiza una etapa de reduccion con el fin de reducir completamente los enlaces disulfuro reducibles de los anticuerpos inmovilizados y de generar tioles reactivos. Los anticuerpos se reducen en condiciones que son favorables para una reduccion completa de los enlaces disulfuro reducibles. Normalmente, los anticuerpos se reducen con un exceso de agente reductor con el fin de garantizar una reduccion sustancialmente completa de los enlaces disulfuro reducibles. Por la expresion “reducir completamente los enlaces disulfuro reducibles del anticuerpo" se indica que sustancialmente todos (por ejemplo, superior al 70 %, preferentemente superior al 80 %, incluso mas preferentemente superior al 85 %, 90 %, o 95 %) los anticuerpos en una muestra estan completamente reducidos en cuanto a sus enlaces disulfuro reducibles. En otras palabras, para una cantidad sustancial de los anticuerpos en una muestra, todos los enlaces disulfuro reducibles de los anticuerpos se escindiran durante la etapa de reduccion. Por ejemplo, si los anticuerpos en una muestra tienen 4 enlaces disulfuro reducibles, despues de la etapa de reduccion, los 4 enlaces disulfuro reducibles de una cantidad sustancial de los anticuerpos se escindiran para generar 8 tioles reactivos. La reduccion es una que es selectiva para los enlaces disulfuro reducibles. Por la expresion “selectiva para los enlaces disulfuro reducibles" indica que los enlaces disulfuro reducibles son sustancialmente los unicos enlaces que se reducen. En algunas realizaciones de la invencion, los enlaces disulfuro reducibles son los disulfuros intercatenarios de origen natural del anticuerpo, los anticuerpos se reducen en condiciones que son favorables para una reduccion completa de los disulfuros intercatenarios de origen natural, y la reduccion es una que es selectiva para los disulfuros intercatenarios de origen natural. Por la expresion “selectivo para disulfuros intercatenarios" se indica que los disulfuros intercatenarios estan selectivamente reducidos. En otras palabras, los disulfuros intercatenarios son sustancialmente los unicos enlaces que estan reducidos. Debido a que los anticuerpos se ponen en contacto con un exceso de agente reductor y el agente reductor es selectivo para los enlaces disulfuro reducibles, la generacion de tioles reactivos por anticuerpo generalmente sera independiente de la cantidad de anticuerpo en la muestra.

En un aspecto, el agente reductor usado en la etapa de reduccion es TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina) y la TCEP se anade en exceso durante 30 minutos a temperatura ambiente. Por ejemplo, 250 ul de una solucion 10 mM de TCEP a pH 7,4 reduciran facilmente los disulfuros intercatenarios de 1 a 100 ug de anticuerpo en 30 minutos a temperatura ambiente. Sin embargo, pueden usarse otros agentes reductores y condiciones. Ejemplos de otros agentes reductores incluyen DTT (ditiotreitol), mercaptoetanol y mercaptoetilamina. Ejemplos de condiciones de reaccion incluyen temperaturas de 5 °C a 37 °C durante un intervalo de pH de 5 a 8. La conjugacion de los tioles de anticuerpos resultantes y el analisis por cromatografia de interaccion hidrofoba o de fase inversa (por ejemplos, veanse las Figuras 1 y 3, respectivamente) proporciona un indicador del grado de reduccion de disulfuros lograda bajo diversas condiciones reductoras. Tras la reduccion, puede realizarse una etapa de lavado con el fin de eliminar agente reductor y cualquier otro componente que pueda haberse unido no especificamente al soporte solido durante la etapa de captura del anticuerpo, por ejemplo, componentes del medio de cultivo.

En algunos aspectos de la presente invencion, aunque las muestras variaran con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo, la mayoria de los anticuerpos no variara sustancialmente con respecto al numero de enlaces disulfuro reducibles. Por ejemplo, en algunas realizaciones, sustancialmente todo el anticuerpo contenido en la primera y segunda muestra tendran la misma cantidad de enlaces disulfuro reducibles. En algunas de tales realizaciones, los enlaces disulfuro reducibles seran disulfuros intercatenarios. Si los anticuerpos en la primera y segunda muestra tienen 4 enlaces disulfuro intercatenarios (por ejemplo, IgG1 humana), despues de la reduccion, los anticuerpos inmovilizados reducidos en ambas muestras tendran cada uno 8 tioles reactivos. Este nivel de reduccion a 8 tioles reactivos por anticuerpo es independiente de la cantidad de anticuerpo en las muestras debido al exceso de agente reductor, la selectividad de la etapa de reduccion y el numero uniforme de enlaces reducibles en cada anticuerpo. Similarmente, si el anticuerpo en la primera y segunda muestras tienen 5 enlaces disulfuro intercatenarios, despues de la reduccion, los anticuerpos inmovilizados reducidos en ambas muestras tendran cada uno 10 tioles reactivos. Este nivel de reduccion a 10 tioles reactivos por anticuerpo tambien es independiente de la cantidad de anticuerpo debido al exceso de agente reductor, la selectividad de la etapa de reduccion y el numero uniforme de disulfuros reducibles en cada anticuerpo. En algunas realizaciones en las que esta siendo cribado un panel de anticuerpos murinos, por ejemplo, un panel de anticuerpos murinos de hibridomas, la mayoria de los anticuerpos sera una cualquiera de las isoformas murinas principales IgG 1 e IgG2a. Las isoformas IgG1 y IgG2a murinas contienen ambas 5 enlaces disulfuro intercatenarios y, despues de la reduccion, cada

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anticuerpo tendra 10 tioles reactivos. Por consiguiente, la mayoria de los anticuerpos tendra la misma cantidad de enlaces disulfuro reducibles. Aunque la mayoria de las isoformas en estas realizaciones pueden ser IgG1 e IgG2a, tambien pueden estar presentes otras isoformas. Por ejemplo, tambien pueden estar presentes isoformas IgG2b murinas, IgG2c murinas e IgG3 murinas. En los casos en los que estan presentes las isoformas IgG2b murinas, la reduccion de estos anticuerpos generara 12 tioles reactivos, ya que las isoformas IgG2b tienen 6 enlaces disulfuro intercatenarios. En algunas realizaciones se usaran ratones transgenicos para la production de anticuerpos y los ratones pueden estar geneticamente manipulados para producir anticuerpos que tienen un cierto isotipo, ademas de anticuerpos que tienen isotipos IgG humana. En algunas de tales realizaciones, los ratones pueden manipularse para solo expresar isotipos especificos. En algunas realizaciones, los ratones pueden manipularse para solo expresar solo un isotipo o dos isotipos principales.

Tras la etapa de reduccion, los anticuerpos se cargan con la entidad quimica deseada (en otras palabras, se conjugan con la entidad quimica deseada). La selection de las entidades quimicas que van a usarse depende en parte del fin del ensayo. En algunas realizaciones, los anticuerpos se cribaran con el fin de seleccionar un anticuerpo para su uso como ADC. En estas realizaciones se desea que los anticuerpos se conjuguen con un farmaco. Los anticuerpos pueden conjugarse directamente con el farmaco o indirectamente mediante un conector. El farmaco y el conector de farmaco pueden ser cualquier farmaco o conector de farmaco que sea eficaz para su uso como ADC y que sea reactivo con tiol. Por la expresion “reactivo con tiol” se indica que la entidad quimica reaccionara con un tiol reactivo generado mediante la reduccion de un enlace disulfuro reducible y formara un enlace covalente con el mismo. Los farmacos y conectores de farmaco reactivos con tiol incluyen aquellos farmacos o conectores de farmaco que no son naturalmente reactivos con tiol, pero que se han derivatizado con un agente reactivo con tiol para hacerlos reactivos con tiol. Las condiciones usadas para la conjugation son tales que el farmaco reaccionara selectivamente con un tiol reactivo (tanto directamente como mediante su conector). Ejemplos de grupos reactivos con tiol que son altamente selectivos para tioles reactivos incluyen, por ejemplo, maleimidas, tales como N- etilmaleimida. Se considera que las maleimidas tales como N-etilmaleimida son bastante especificas para grupos sulfhidrilo, especialmente a valores de pH inferiores a 7, en los que otros grupos estan protonados. A pH 7, por ejemplo, la reaction con tioles simples es aproximadamente 1.000 veces mas rapida que con las aminas correspondientes. Las reacciones de tioles con maleimidas son muy rapidas a temperatura ambiente a pH 7,4, y 30 minutos son adecuados para garantizar la reaccion completa sin arriesgar la conjugacion de los grupos maleimida con amina. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el farmaco se ligara al anticuerpo mediante un grupo maleimida. Otros grupos reactivos que son altamente selectivos para tioles reactivos incluyen, por ejemplo, yodoacetamidas, vinilsulfonas y aziridinas.

En algunas realizaciones se deseara cargar completamente un anticuerpo con farmaco. En tales realizaciones, el nivel de carga de farmaco deseable sera igual al numero de tioles reactivos por anticuerpo. Por ejemplo, en algunas de tales realizaciones, la carga de farmaco deseada sera 10 farmacos por anticuerpo y el numero de tioles reactivos por anticuerpo sera 10. En algunas realizaciones en las que se desea un nivel de carga de farmaco que es igual al numero de tioles reactivos, el farmaco reactivo con tiol o conector de farmaco se proporcionara en exceso suficiente a los anticuerpos inmovilizados con el fin de reaccionar con todos los tioles reactivos disponibles. Debido a que la reaccion se establece de forma que los farmacos y conectores de farmaco que van a usarse en esta etapa sean reactivos con tiol y las condiciones usadas sean selectivas para la conjugacion con tioles reactivos, el farmaco o conector de farmaco reacciona selectivamente con los tioles reactivos (es decir, el farmaco y los conectores de farmaco no reaccionan sustancialmente con otros sitios sobre el anticuerpo, que incluyen, por ejemplo, otros aminoacidos (por ejemplo, residuos de lisina)). Debido a esta selectividad, es posible controlar la carga de farmaco y disenar el experimento de forma que haya una carga de farmaco uniforme sustancial entre las muestras. Por la expresion “carga de farmaco uniforme sustancial entre las muestras" se indica que la carga de farmaco promedio entre las muestras es sustancialmente la misma o, en otras palabras, el numero promedio de moleculas de farmaco por anticuerpo en la muestra uno sera sustancialmente el mismo que el numero promedio de moleculas de farmaco por anticuerpo en la muestra dos. Puede esperarse alguna varianza en la carga de farmaco, pero generalmente estara dentro de una varianza de aproximadamente el 25 %, preferentemente dentro de una varianza del 20 % o incluso del 10 %. Por consiguiente, en algunas realizaciones en las que la mayoria de las muestras contienen anticuerpos de los subtipos IgG 1 e IgG2a murinas, si un farmaco o conector de farmaco reactivo con tiol se anade a las muestras en exceso suficiente para reaccionar con todos los tioles reactivos disponibles, habra un promedio de 10 moleculas de farmaco por anticuerpo en la mayoria de las muestras. Debido a que estas muestras tienen una carga de farmaco uniforme sustancial, una vez eluida, la concentration de los ADC purificados puede determinarse por metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, metodos espectrofotometricos, y sus actividades pueden compararse para determinar que anticuerpos son mas o menos activos en un ensayo. Esta comparacion puede realizarse aunque los anticuerpos a comparar se proporcionen a concentraciones variables y en algunas realizaciones a concentraciones variables desconocidas. Una comparacion entre anticuerpos proporcionados a concentracion variable desconocida se ayuda por la capacidad de cargarlos sustancialmente uniformemente con farmaco o conector de farmaco.

En algunas realizaciones no se desea cargar completamente un anticuerpo con farmaco o conector de farmaco. En algunas de tales realizaciones, si se desea un menor nivel de carga de farmaco, los anticuerpos inmovilizados pueden hacerse reaccionar con tanto un farmaco o conector de farmaco como un agente de termination de tiol. El termino “agente de terminacion de tiol" se usa en el presente documento para referirse a un agente que bloquea

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selectivamente un tiol reactivo. El farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion de tiol se proporcionaran en una relacion de farmaco o conector de farmaco con respecto a agente de terminacion de tiol que produzca la carga de farmaco deseada. Al igual que el farmaco o conector de farmaco, el agente de terminacion sera altamente selectivo por tioles reactivos. Los agente de terminacion reactivos con tiol incluyen aquellos agentes de terminacion que no son naturalmente reactivos con tiol, pero que se han derivatizado con un agente reactivo con tiol para hacerlos reactivos con tiol. Ejemplos de agentes de terminacion de tiol que pueden usarse incluyen agentes de terminacion de maleimida tales como, por ejemplo, N-etilmaleimida. Otros agentes de terminacion incluyen, por ejemplo, yodoacetamida y acido yodoacetico. En algunas realizaciones, tanto el farmaco o el conector de farmaco como el agente de terminacion de tiol tienen el mismo tipo de agente reactivo con tiol. Por ejemplo, en algunas realizaciones preferidas, si el farmaco va a ligarse al anticuerpo mediante un grupo maleimida, el agente de terminacion tambien se ligara al anticuerpo mediante el mismo tipo de grupo maleimida. Esto ayuda a garantizan que las tasas de reaccion relativas del conector de farmaco y el agente de terminacion sean similares. Preferentemente, no habra mas de aproximadamente 100 veces de diferencia en las tasas de reaccion relativas, mas preferentemente no mas de 10 veces, e incluso mas preferentemente no mas de 5 veces de diferencia en las tasas de reaccion relativas.

En un aspecto, la relacion de agente de terminacion y farmaco o conector de farmaco elegida dependera del nivel de carga de farmaco deseado. En algunas realizaciones, la relacion de conector de farmaco o farmaco con respecto al agente de terminacion proporcionado a los anticuerpos inmovilizados se reflejara en la relacion a la que estos reactivos estan conjugados con los anticuerpos. En realizaciones cuando el farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion se proporcionan en exceso molar, la relacion de conector de farmaco o farmaco con respecto al agente de terminacion proporcionado se reflejara en la relacion a la que estos reactivos estan conjugados con los anticuerpos si las tasas de reaccion de tiol intrinsecas de estos dos componentes son las mismas. Por ejemplo, si una mezcla de reaccion que va a usarse para la conjugation tiene una mezcla 1:1 de conector de farmaco o farmaco con respecto a agente de terminacion, en realizaciones en las que las tasas de reactivo de tiol intrinseco del farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion son las mismas y la mayoria de las muestras comprenden anticuerpos que tienen 5 enlaces disulfuro reducibles (por ejemplo, anticuerpos de los subtipos IgG1 y IgG2a murinas), tras la reaccion, habra un promedio de 5 moleculas de farmaco por anticuerpo y 5 agentes de terminacion por anticuerpo en la mayoria de las muestras. Se ha observado, sin embargo, por los presentes inventores que las tasas de reaccion de tiol intrinsecas del farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion no son generalmente las mismas, y por consiguiente, si el farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion se proporcionan en exceso, la relacion a la que el farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion se proporcionan a las muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados no sera la misma relacion a la que estan conjugadas con los anticuerpos. En tales realizaciones, la relacion apropiada de farmaco o conector de farmaco con respecto al agente de terminacion puede determinarse experimentalmente con el fin de lograr el nivel de carga de farmaco deseado. En particular, en tanto que el farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion se proporcionen en exceso (generalmente, un exceso de al menos aproximadamente 3 veces) y los anticuerpos presentes en las muestras tengan sustancialmente el mismo numero de enlaces disulfuro reducibles, la relacion producira niveles de carga de farmaco consistentes (es decir, sustancialmente uniformes) a traves de las muestras independientemente de la cantidad de anticuerpo presente en el soporte solido.

En algunas realizaciones preferidas, la reaccion de conjugacion del anticuerpo con el farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion sera bajo control cinetico, no control termodinamico. Por ejemplo, en las condiciones en las que los moles totales de farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion proporcionados a una muestra que contiene los anticuerpos inmovilizados es igual o inferior al numero de moles de tiol reactivo en la muestra, entonces la relacion de farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion proporcionado a la muestra que comprende los anticuerpos reducidos inmovilizados se reflejara en la relacion de conjugacion real de los anticuerpos con respecto al farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion. Puede decirse que una reaccion de conjugacion tal esta bajo control termodinamico. Por ejemplo, si 100 pmoles de un anticuerpo IgG1 murina (aproximadamente 15 ug) se redujeron con exceso de agente reductor para producir 10 tioles por anticuerpo, entonces 1 nmol de tiol reactivo estaria presente. Si se preparo una mezcla 1:1 de farmaco o conector de farmaco con respecto al agente de terminacion tal que la concentration de cada uno fuera 0,5 mM y la concentration total fuera 1 mM, la adicion de 1 ul de esta solution al anticuerpo reducido presentaria un total de 1 nmol de farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion. Suponiendo que la reaccion de farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion y tiol es una altamente favorable (por ejemplo, tanto el farmaco o conector de farmaco como los agentes de terminacion son derivados de maleimido), el conjugado preparado por este procedimiento tendria una mezcla 1:1 de los dos compuestos (la reaccion de tiol-maleimida es altamente favorable y termodinamicamente llevaria esta reaccion eficazmente a completitud). Esto seria cierto incluso si uno de los compuestos reaccionara a una tasa sustancialmente mas rapida que el otro. En realizaciones en las que se desea cargar uniformemente una pluralidad de muestras, este enfoque requeriria generalmente que la cantidad de anticuerpo presente en cada una de las muestras fuera conocida. Ademas, en realizaciones en las que hay variabilidad en la cantidad de anticuerpo entre las muestras (tal como un panel de anticuerpos de hibridomas), requeriria un gran esfuerzo adaptar la cantidad de farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion que van a anadirse a cada muestra con el fin de llegar a muestras que estan cargadas sustancialmente uniformemente. En realizaciones en las que la cantidad de anticuerpo en las muestras es desconocida y/o hay variabilidad entre muestras, es generalmente preferible manipular la reaccion de manera que este bajo el control cinetico y, por consiguiente, proporcione las muestras que

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contienen anticuerpo con un exceso de farmaco total o conector de farmaco y el agente de terminacion.

En algunas realizaciones de la presente invencion, las entidades qmmicas que van a conjugarse con los tioles reactivos de los anticuerpos reducidos se proporcionaran en exceso molar (exceso molar en cuanto a los tioles reactivos). En estas realizaciones, si el farmaco o conector de farmaco reacciona mas rapidamente con un tiol reactivo que el agente de terminacion, el farmaco o conector de farmaco se representara desproporcionadamente en el conjugado final. Esto es debido a que el farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion estan eficazmente compitiendo entre si para reaccionar con un numero limitante de tioles reactivos disponibles. Si el farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion estan presentes a concentraciones iguales en la solucion de reaccion, solo se conjugaran a concentraciones iguales si sus tasas de reaccion son las mismas. Alterando la composition de una mezcla de reaccion de forma que las concentraciones del farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion no sean iguales, la relation a la que reaccionan con los tioles disponibles puede controlarse. Por ejemplo, un farmaco o conector de farmaco de reaccion lenta esta desproporcionalmente infrarrepresentado en un conjugado preparado con una mezcla 1:1 con un agente de terminacion que reacciona mas rapido. Cambiando la relacion a 2:1 en favor del farmaco o conector de farmaco que reacciona mas lento, su representation sobre el conjugado aumentara. Asi, por la modulation de la relacion del farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion proporcionado a las muestras que comprenden los anticuerpos reducidos inmovilizados, puede lograrse una relacion deseada de farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion en el conjugado final. En condiciones en las que el farmaco total o conector de farmaco y el agente de terminacion estan presentes en exceso con respecto a los tioles reactivos disponibles, su distribution al producto final sera independiente de la cantidad de tiol de partida. De este modo, una pluralidad de muestras puede cargarse sustancialmente uniformemente incluso cuando la cantidad de anticuerpo en las muestras sea desconocida y/o haya variabilidad entre las muestras. En algunas realizaciones, un volumen apropiado de farmaco o conector de farmaco y agente de terminacion se proporciona a las muestras tal que este presente un exceso molar de aproximadamente 2 veces (e incluso mas preferentemente, un exceso molar de 3 veces o mas) de reactantes totales con respecto a tioles totales. Si la cantidad de anticuerpo en las muestras es desconocida, cada muestra puede tratarse como si tuviera la maxima cantidad de anticuerpo. Para muchas de las muestras estara presente significativamente menos de la cantidad maxima y el exceso sera superior a 2 veces. Esta provision de exceso de reactantes que tienen una relacion establecida permite cantidades variables de anticuerpos a traves de un panel que va a tratarse con un cantidad fija grande de farmaco total o conector de farmaco y agente de terminacion para producir un panel de conjugados con carga comparable de cada farmaco o conector de farmaco y el agente de terminacion presente. El hecho de que el tratamiento igual de muestras produzca niveles comparables de carga, independientemente de la cantidad de anticuerpo inicialmente presente en la muestra, hace que este metodo sea conveniente para aplicaciones de alto rendimiento en las que estan conjugados grandes numeros de anticuerpos.

Como se trata en el presente documento, aunque es preferible que la mayoria de las muestras que van a ensayarse no varien con respecto al numero de enlaces disulfuro reducibles presentes en los anticuerpos contenidos en ellas, en algunas realizaciones, habra alguna variation. En algunas realizaciones, a pesar de la variation, las muestras se trataran con la misma relacion de entidades quimicas. Cuando se interpretan los datos, el experto reconocera que un cierto subconjunto de las muestras difirieron en la cantidad de enlaces disulfuro reducibles. Si se desea, el experto puede determinar el isotipo del anticuerpo antes de o tras la conjugation para ayudar en la interpretation de los datos.

En algunas realizaciones, antes de la etapa de conjugacion, pueden usarse metodos convencionales para determinar el isotipo del anticuerpo en cada una de las muestras y, por tanto, el numero de enlaces disulfuro reducibles por anticuerpo en cada una de las muestras. En algunas de tales realizaciones, las muestras que contienen anticuerpos que tienen el mismo numero de enlaces disulfuro reducibles se pondran en contacto con una mezcla de reaccion que tiene una relacion de farmaco o conector de farmaco con respecto al agente de terminacion para llegar a una carga de farmaco deseada y muestras que contienen anticuerpos que tienen un numero diferente de enlaces disulfuro reducibles se pondran en contacto con una mezcla de reaccion que tiene una relacion diferente de farmaco o conector de farmaco con respecto al agente de terminacion para llegar a esa misma carga de farmaco deseada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, si la carga de farmaco promedio deseada es 4, las muestras que contienen anticuerpos de IgG 1 y IgG2a murinas (10 tioles reactivos por anticuerpo cuando estan completamente reducidas) se pondran todas en contacto con una mezcla de reaccion que tiene una relacion de farmaco o conector de farmaco con respecto al agente de terminacion para llegar a una carga de farmaco promedio de 4 y carga de agente de terminacion promedio de 6. Las muestras que contienen anticuerpos de IgG2b murina (12 tioles reactivos por anticuerpo cuando estan completamente reducidas) se pondran en contacto con una mezcla de reaccion que tiene una relacion de farmaco o conector de farmaco diferente al agente de terminacion (por ejemplo, una mayor fraction de agente de terminacion) para llegar a la misma carga de farmaco promedio de 4. En otras realizaciones, aunque puede haber variacion entre isotipos y numero de disulfuros intercatenarios, se aceptara que haya alguna variacion en la carga y todas las muestras recibiran la misma relacion de farmaco o conector de farmaco con respecto al agente de terminacion.

En algunas realizaciones, antes de la etapa de conjugacion y tras la etapa de reduction, habra una etapa de reoxidacion parcial. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los enlaces disulfuro reducibles consistiran en enlaces disulfuro intercatenarios de origen natural, ademas de enlaces disulfuro formados de grupos sulfhidrilo introducidos.

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En algunas de estas realizaciones se deseara conjugar las entidades qmmicas seleccionadas con los sulfhidrilos introducidos, pero no con los grupos sulfhidrilo de los enlaces disulfuro intercatenarios de origen natural. En estas realizaciones, tras la reduccion completa de los enlaces disulfuro reducibles, puede haber una etapa de reoxidacion parcial para reoxidar los enlaces disulfuro intercatenarios de origen natural, quedando los sulfhidrilos introducidos disponibles para unirse a las entidades quimicas deseadas. La reoxidacion de los disulfuros nativos puede lograrse, por ejemplo, por tratamiento de los anticuerpos reducidos con un gran exceso molar de acido deshidroascorbico a pH 6,5, dejando que la reaccion avance durante 1 hora a temperatura ambiente.

En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, en lugar de, o ademas del agente de terminacion, se proporciona un agente de deteccion para la conjugacion. Los agentes de deteccion pueden ser, por ejemplo, marcas primarias o marcas secundarias. En algunas realizaciones, el agente de deteccion sera uno que se detecta directamente. En otras realizaciones, el agente de deteccion sera uno que se detecta indirectamente. En algunas realizaciones, el agente de deteccion sera, por ejemplo, cualquier marca reactiva de tiol que puede usarse para la cuantificacion de anticuerpos y/o como indicador para un ensayo de union o cualquier otro ensayo deseable. Las marcas reactivas de tiol incluyen aquellas marcas que no son naturalmente reactivas con tiol, pero que se han derivatizado con un agente reactivo con tiol para hacerlas reactivas con tiol. En algunas realizaciones, el mismo tipo de agente reactivo con tiol se usara para enlazar las diversas entidades quimicas (agente de deteccion y/o farmaco o conector de farmaco y/o agente de terminacion) al anticuerpo. En algunas realizaciones, el agente de deteccion sera un compuesto radioactivo, un agente quimioluminiscente, un agente fluorescente, o un cromogeno. En algunas realizaciones, el agente de deteccion sera una molecula fluorescente tal como un fluoroforo. En algunas realizaciones, el agente de deteccion sera biotina. En un aspecto, el agente de deteccion sera un fluoroforo y el fluoroforo se derivatizara con un grupo maleimida con el fin de hacerlo reactivo con tiol. Las ensenanzas descritas en el presente documento pueden usarse para evaluar el nivel de carga preferido de un agente de deteccion seleccionado. En algunas realizaciones, se usa un fluoroforo como agente de deteccion y el fluoroforo se carga a una carga promedio de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3 fluoroforos por anticuerpo. Los Ejemplos 3 y 4 proporcionan descripciones a modo de ejemplo de como adaptar la relacion de entidades quimicas con el fin de lograr un nivel deseado de farmaco y/o carga de fluoroforo.

La presente invencion engloba realizaciones en las que los anticuerpos se criban no con el fin de seleccionar un anticuerpo para su uso como un ADC, sino con el fin de seleccionar un anticuerpo para su uso como un anticuerpo no conjugado. En estas realizaciones, los anticuerpos inmovilizados se pondran en contacto con un agente de deteccion y el agente de terminacion a una relacion seleccionada y no habra uso de farmaco o conector de farmaco. Usando las ensenanzas descritas en el presente documento, que incluyen las ensenanzas de los Ejemplos 3 y 4, puede determinarse la relacion apropiada de agente de deteccion con respecto al agente de terminacion.

Despues de poner en contacto los anticuerpos reducidos con la cantidad apropiada y el tipo de entidades quimicas (la seleccion de las entidades quimicas sera dependiente, por ejemplo, de si se desea cribar anticuerpos como anticuerpos no conjugados o ADC; si se desea tener una carga de farmaco completa o carga de farmaco parcial; y si se desea incluir un agente de deteccion en la mezcla) y dejar tiempo suficiente para la completitud de la reaccion (por ejemplo, 30 minutos para las entidades quimicas que contienen maleimida), se desea realizar una etapa de lavado con el fin de eliminar cualquier material sin reaccionar. Posteriormente, los conjugados de anticuerpo inmovilizado pueden eluirse del soporte solido para proporcionar composiciones de conjugado de anticuerpo. Se conocen en la tecnica metodos de elucion de proteinas de soportes solidos y el profesional habitual sera capaz de seleccionar un tampon apropiado para la elucion. Por ejemplo, en realizaciones en las que el soporte solido comprende resina de proteina A o proteina G, los conjugados de anticuerpo pueden eluirse con tampones de pH bajo patron para la elucion de columnas de proteina A o de proteina G.

En algunas realizaciones de la invencion, los metodos descritos en el presente documento para la preparacion de conjugados de anticuerpo produciran una pluralidad de composiciones de conjugado de anticuerpo-farmaco que tienen carga de farmaco sustancialmente uniforme (el experto entendera que puede haber algun valor atipico dependiendo de la uniformidad del numero de enlaces disulfuro reducibles a traves de muestras). En estas realizaciones, debido a la carga de farmaco sustancialmente uniforme entre las muestras, pueden compararse las caracteristicas relativas de anticuerpos en una primera y segunda muestra. Esta comparacion puede realizarse aun cuando los anticuerpos que van a compararse se proporcionen a concentraciones variables y, en algunas realizaciones, a concentraciones variables desconocidas. Una comparacion entre los anticuerpos de concentration desconocida y variable se facilita con la capacidad para cargarlos sustancialmente uniformemente con farmaco o conector de farmaco.

Se conocen en la tecnica metodos de determination de carga de farmaco. Un metodo que se usa en el presente documento es la cromatografia de liquidos de alta resolution sobre un copolimero de poliestireno-divinilbenceno, por ejemplo, una columna de PLRP™ de fase inversa. Esta tecnica desnaturalizante puede separar limpiamente la especie de cadena ligera y cadena pesada carga de diversas maneras. Tambien puede usarse cromatografia de interaction hidrofoba (HIC) como metodo analitico usado para determinar mezclas isomericas de conjugados resultantes. El nivel de carga de farmaco puede determinarse basandose en una relacion de absorbancias, por ejemplo, a 250 nm y 280 nm. Vease, por ejemplo, la publication de EE.UU. N.° 20090010945.

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En algunas realizaciones, tras la elucion de los conjugados de anticuerpo, se realizaran ensayos de actividad y/u otros ensayos con el fin de caracterizar los conjugados de anticuerpo. En algunas realizaciones se realizaran ensayos de union a celulas, de afinidad y/o de citotoxicidad. Muchos metodos de determinacion de si un ADC se une o no a una diana de interes o ejerce un efecto citotoxico sobre una celula son conocidos para aquellos expertos en la materia, y pueden usarse en los presentes metodos. Por ejemplo, pueden usarse ensayos de viabilidad celular para determinar el efecto citotoxico de un ADC sobre una celula. Veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 7.659.241 y 7.498.298, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento en su totalidad y para todos los fines, para ensayos de union a celula y de citotoxicidad a modo de ejemplo.

En algunas realizaciones, tras la elucion de los conjugados de anticuerpo, se deseara determinar la cantidad de anticuerpo o conjugado de anticuerpo en las composiciones de conjugado de anticuerpo. En algunas realizaciones se deseara determinar la cantidad real de anticuerpo o conjugado de anticuerpo en una muestra. En otras realizaciones sera suficiente determinar la cantidad relativa de anticuerpo o conjugado de anticuerpo en una pluralidad de muestras. Por ejemplo, puede ser suficiente saber que la muestra 1 tiene mas anticuerpo que la muestra 2 que tiene mas anticuerpo que la muestra 3, etc. Se conocen en la tecnica muchos metodos para determinar la cantidad de proteina y pueden usarse en el presente documento. En algunas realizaciones se usara un ensayo de absorbancia para determinar la concentracion de anticuerpo. En realizaciones en las que un fluoroforo es parte del conjugado de anticuerpo, la concentracion de anticuerpo puede determinarse usando un ensayo de fluorescencia. En realizaciones en las que la fluorescencia se usa para la cuantificacion de proteina, puede ser necesario un patron para convertir los valores de fluorescencia sin procesar en una concentracion. Se conocen en la tecnica metodos de uso de fluorescencia y de generacion de curvas patron para determinar la concentracion de proteina. En un ejemplo, aproximadamente 200 |jg de un anticuerpo patron se conjugaran durante la etapa de conjugacion despues de recogerse en medios de blanco. Despues de la elucion, la concentracion de este patron se determinara por metodos convencionales, por ejemplo, un ensayo de absorbancia a A280 convencional, y se ensayara una curva patron preparada por una serie de dilucion para fluorescencia junto con las muestras de conjugado. Alternativamente, puede usarse un robot de manipulation de liquidos para normalizar placas, eliminando asi la necesidad de diluciones sucesivas.

En algunas realizaciones, los resultados de un ensayo de citotoxicidad y el conocimiento de la concentracion relativa o real de anticuerpo en las composiciones de conjugado de anticuerpo se usaran para identificar anticuerpos con caracteristicas deseadas. Los metodos descritos en el presente documento de preparation de conjugados de anticuerpo permiten hacer comparaciones entre una pluralidad de anticuerpos de concentracion variable y, en algunas realizaciones, cantidad desconocida. Los metodos descritos en el presente documento de preparacion de conjugados de anticuerpo permiten una selection de anticuerpos con caracteristicas deseables cuando se empieza con, por ejemplo, un panel de anticuerpos resultantes de una fusion de hibridomas. En algunas realizaciones preferidas, es la carga de farmaco uniforme sustancial entre muestras lo que permite hacer comparaciones relevantes entre muestras. El fallo en garantizar niveles de carga sustancialmente uniformes podria, por ejemplo, conducir a resultados erroneos de un cribado de un panel de anticuerpos para su uso como ADC. Esto es debido a que no se sabria si una muestra de ADC presentaria mayor citotoxicidad debido a las caracteristicas del anticuerpo como ADC o debido a que la muestra contiene mas farmaco por anticuerpo. Por ejemplo, cabria normalmente esperar que una composition de conjugado de anticuerpo que comprende el anticuerpo “A" y que tiene una carga de farmaco promedio de 4 presentara mas citotoxicidad que una composicion de conjugado de anticuerpo que comprende anticuerpo “B” y que tiene una carga de farmaco promedio de 1. Esta mayor citotoxicidad no seria un indicador de las caracteristicas relativas de los anticuerpos A y B como ADC, sino simplemente un indicador de la mayor carga de farmaco en el anticuerpo A. Si ambas composiciones de conjugado de anticuerpo tuvieran una carga de farmaco promedio de aproximadamente 4, si una mostrara mayor citotoxicidad, podria atribuirse al anticuerpo y no simplemente a la carga de farmaco. Similarmente, la capacidad para determinar la cantidad real o relativa de anticuerpo o conjugado de anticuerpo en las muestras tambien permite hacer comparaciones relevantes entre muestras. Sin conocimiento de la cantidad real o relativa de anticuerpo o conjugado de anticuerpo en la muestra, no se sabria si un ADC presenta mayor citotoxicidad debido al anticuerpo particular o simplemente debido a que hay mas anticuerpo o ADC en la muestra.

Ademas de proporcionar metodos de preparacion de conjugados de anticuerpo para su uso en ensayos de cribado de anticuerpos y conjugados de anticuerpo producidos por los metodos reivindicados, la presente invention proporciona anticuerpos y/o conjugados de anticuerpo (por ejemplo, conjugados de anticuerpo-farmaco) para uso terapeutico en el que el anticuerpo se selecciono usando los metodos descritos en el presente documento.

Como se ha tratado previamente, el farmaco o conector de farmaco usado en los presentes metodos puede ser cualquier farmaco o conector de farmaco que sea eficaz para su uso como un ADC y que sea reactivo con tiol. El farmaco puede ser cualquier farmaco citotoxico, citostatico o inmunosupresor. Se conocen en la tecnica metodos de seleccion de farmaco y conector de farmaco para su uso como ADC. Veanse, por ejemplo, los documentos WO 2004010957, WO 2007/038658, la patente de EE.UU. N.° 6.214.345, la patente de EE.UU. N.° 7.498.298 y la publication de EE.UU. N.° 2006/0024317.

Clases utiles de agentes citotoxicos o inmunosupresores incluyen, por ejemplo, agentes anti-tubulina (por ejemplo, auristatinas, maitansinoides, alcaloides de la vinca), inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, camptotecinas),

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ligandos de union al surco menor de ADN (por ejemplo, caliqueamicinas, duocarmicinas, enedimas, lexitropsinas, clorometilbenzoindolinas), inhibidores de la replicacion del ADN (por ejemplo, antraciclinas), agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino tales como cis-platino, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino tri-nuclear y carboplatino), inhibidores de proteinas cinasas, enzimas citotoxicas y toxinas de protema.

En algunas realizaciones, agentes citotoxicos adecuados incluyen, por ejemplo, antibioticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores a quimioterapia, etoposidos, pirimidinas fluoradas, ionoforos, nitrosoureas, platinoles, compuestos formadores de poros, antimetabolitos de purina, sensibilizadores a la radiacion, esteroides, puromicinas, doxorubicinas y criptofisinas.

Agentes citotoxicos o inmunosupresores individuales incluyen, por ejemplo, un androgeno, antramicina (AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfan, butionina sulfoximina, gamma caliqueamicina, N- acetil-gamma-dimetilhidrazida caliqueamicina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU), CC-1065, cemadotina, clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinosido, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (antiguamente actinomicina), daunorubicina, decarbazina, discodermolida, docetaxel, doxorubicina, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, equinomicina, eleuterobina, epotilona A y B, etoposido, estramustina, un estrogeno, 5-fluorodesoxiuridina, 5-fluorouracilo, gemcitabina, gramicidina D, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, irinotecan, lomustina (CCNU), maitansina, mecloretamina, melfalan, 6- mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, netropsina, nitroimidazol, paclitaxel, palitoxina, plicamicina, procarbazina, rizoxina, estreptozotocina, tenoposido, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecan, vinblastina, vincristina, vinorelbina, VP-16 y VM-26.

En algunas realizaciones, el farmaco es un agente anti-tubulina. Ejemplos de agentes anti-tubulina incluyen, pero no se limitan a, taxanos (por ejemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)) y alcaloides de la vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina). Otros agentes anti-tubulina incluyen, por ejemplo, derivados de la bacatina, analogos de taxano (por ejemplo, epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimida, estramustina, criptofisinas, cemadotina, combretastatinas, discodermolida y eleuterobina.

En ciertas realizaciones, el agente citotoxico es un maitansinoide, otro grupo de agentes anti-tubulina. Por ejemplo, en realizaciones especificas, el maitansinoide es maitansina o DM-1 o DM-4 (ImmunoGen, Inc.; vease tambien Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131).

En algunas realizaciones, el farmaco es una auristatina, otro grupo de agentes anti-tubulina. Las auristatinas incluyen, pero no se limitan a, auristatina E y derivados de la misma. AFP, AEB, AEVB, MMAF y MMAE son ejemplos de auristatinas que pueden usarse en el presente documento. La sintesis y estructura de las auristatinas se describe en las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. N.° 2003-0083263, 2005-0238649 y 20050009751; publication de patente internacional N.° WO 04/010957, publication de patente internacional N.° WO 02/088172, y las patentes de EE.UU. N.° 7.498.298; 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; y 4.486.414.

La parte de conector de un conector de farmaco es un compuesto que puede usarse para enlazar el anticuerpo con el farmaco. El conector puede comprender mas de un resto quimico. En algunas realizaciones, el conector es escindible bajo condiciones intracelulares, de forma que la escision del conector libera la unidad de farmaco del anticuerpo en el entorno intracelular. En algunas realizaciones, el conector es un conector de peptidilo (por ejemplo, un conector que comprende dos o mas aminoacidos) que se escinden por una peptidasa intracelular o enzima proteasa, que incluye, pero no se limita a, una proteasa lisosomica o endosomica. Los agentes de escision pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todas las cuales son conocidas por hidrolizar derivados de farmaco de dipeptido produciendo la liberation de farmaco activo dentro de celulas diana (vease, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). En algunas realizaciones, el conector de peptidilo escindible por una proteasa intracelular comprende un dipeptido Val-Cit o un dipeptido Phe-Lys (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. 7.659.241). En todavia otras realizaciones, el conector no es escindible y el farmaco se libera por degradation del anticuerpo.

En algunas realizaciones, el conector escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrolisis a ciertos valores de pH y/o escindible bajo condiciones reductoras (por ejemplo, un conector de disulfuro). Se conocen en la tecnica varios conectores de disulfuro, que incluyen, por ejemplo, aquellos que pueden formarse usando SATA (N- succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2- piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno), SPDB y SMPT (vease, por ejemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., en Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Vease tambien la patente de EE.UU. N.° 4.880.935).

Conectores a modo de ejemplo que pueden usarse con los presentes metodos se describen en los documentos WO 2004010957, WO 2007/038658, las patentes de EE.UU. N.° 6.214.345, 7.659.241, 7.498.298 y la publicacion de EE.UU. N.° 2006/0024317, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia en su

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totalidad y para todos los fines.

En algunas realizaciones a modo de ejemplo de la presente invencion, el conector de farmaco es de formula I o formula II en la que Val-Cit se refiere al dipeptido valina-citrulina.

imagen4

Formula II (“mc-MMAF”)

Proteinas

Los metodos descritos en el presente documento de preparacion de conjugados de anticuerpo tambien pueden usarse para preparar proteinas de fusion para su uso en ensayos de cribado de proteinas de fusion. El termino “proteina de fusion" se usa en el presente documento para referirse a fusiones de dominio de union-Ig, en las que el dominio de union puede ser, por ejemplo, un ligando, un dominio extracelular de un receptor, un peptido, un peptido que no existen de forma natural, o similares, con la condicion de que el dominio de union no incluya un dominio variable de un anticuerpo. Al igual que los anticuerpos descritos en el presente documento, la porcion Ig de la proteina de fusion debe comprender al menos un enlace disulfuro reducible, y un dominio capaz de unirse a una fase solida. En un aspecto, el dominio de Ig sera la region Fc de un anticuerpo. Ejemplos de proteinas de fusion de dominio-Ig incluyen etanercept que es una proteina de fusion de sTNFRII con la region Fc (patente de EE.UU. N.° 5.605.690), alefacept que es una proteina de fusion de LFA- 3 expresada en celulas presentadoras de antigenos con la region Fc (patente de EE.UU. N.° 5.914.111), una proteina de fusion de antigeno-4 asociado a linfocitos T citotoxicos (CTLA-4) con la region Fc (J. Exp. Med. 181:1869 (1995)), una proteina de fusion de interleucina 15 con la region Fc (J. Immunol. 160:5742 (1998)), una proteina de fusion del factor VII con la region Fc (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:12180 (2001)), una proteina de fusion de la interleucina 10 con la region Fc (J. Immunol. 154:5590 (1995)), una proteina de fusion de interleucina 2 con la region Fc (J. Immunol. 146:915 (1991)), una proteina de fusion de CD40 con la region Fc (Surgery 132:149 (2002)), una proteina de fusion de Flt-3 (tirosina cinasa similar a fms) con la region Fc del anticuerpo (Acta. Haemato. 95:218 (1996)), una proteina de fusion de OX40 con la region Fc del anticuerpo (J. Leu. Biol. 72:522 (2002)), y proteinas de fusion con otras moleculas de CD (por ejemplo, CD2, CD30 (TNFRSF8), CD95 (Fas), CD106 (VcAm-I), CD137), moleculas de adhesion (por ejemplo, ALcAm (molecula de adhesion a celulas de leucocitos activadas), cadherinas, ICAM (molecula de adhesion intercelular)-1, ICAM-2, ICAM-3), receptores de citocinas (por ejemplo, interleucina-4R, interleucina-5R, interleucina-6R, interleucina-9R, interleucina-10R, interleucina-12R, interleucina-13Ralfa1, interleucina-13Ralfa2, interleucina-15R, interleucina- 21Ralfa), quimiocinas, moleculas de senalizacion inductoras de muerte celular (por ejemplo, B7-H1, DR6 (receptor 6 de muerte), PD-1 (muerte 1 programada), TRAIL R1), moleculas coestimulantes (por ejemplo, B7-1, B7-2, B7-H2, ICOS (coestimulante inducible)), factores de crecimiento (por ejemplo, ErbB2, ErbB3, ErbB4, HGFR), factores inductores de la diferenciacion (por ejemplo, B7-H3), factores activantes (por ejemplo, NKG2D) y moleculas de transferencia de senales (por ejemplo, gpl30), BCMA y TACI.

Todas las etapas descritas en el presente documento pueden adaptarse facilmente a realizaciones en las que el material de partida no es anticuerpo, sino proteina de fusion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporcionarian muestras que contienen proteina de fusion en vez de muestras que contienen anticuerpo. Las muestras de proteina de fusion variarian con respecto a la cantidad y secuencia. En realizaciones preferidas, sustancialmente toda la proteina de fusion presente en una unica muestra seria de la misma secuencia. “Sustancialmente toda la proteina de fusion presente en una unica muestra es de la misma secuencia" refleja la preferencia de que una unica muestra contenga una proteina de fusion con el reconocimiento de que puede haber una cantidad menor (por ejemplo, hasta el 20 %, preferentemente inferior al 15 %, inferior al 10 %, inferior al 5 %, inferior al 4 %, o inferior al 3 %) de contamination con otra proteina de fusion.

Al igual que con los anticuerpos, los metodos no requeririan una etapa de purification antes de la inmovilizacion de las proteinas de fusion. En algunos aspectos, la proteina de fusion proporcionada en la muestra que contiene proteinas de fusion no esta purificada. Al igual que con los anticuerpos, en algunas realizaciones, se proporciona sobrenadante de cultivo celular no purificado como muestra que contiene proteinas de fusion. Se conocen en la tecnica metodos de generation de proteinas de fusion en cultivo celular y no se tratan en el presente documento. En

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algunas realizaciones, la protema de fusion en las muestras que contienen protemas de fusion se cultivo en medio de cultivo con empobrecimiento de IgG, y, en particular, medio de cultivo con empobrecimiento de IgG bovina. Al igual que con los anticuerpos, los presentes metodos pueden realizarse con muestras que contienen cantidades muy pequenas (por ejemplo, 1 a 500 |jg) de proteina de fusion. En algunas realizaciones, habra de 1 |jg a 100 jg, de 1 ^g a 50 jg, de 1 jg a 20 jg, de 5 jg a 100 jg, de 5 jg a 50 jg, o de 5 jg a 20 jg de protema de fusion presente en una unica muestra.

Los presentes metodos comprenden una etapa de inmovilizar la proteina de fusion sobre un soporte solido para proporcionar proteinas de fusion inmovilizadas. En algunas realizaciones, el soporte solido tiene la capacidad de unir mas proteina de fusion que la cantidad presente en la muestra que contiene proteinas de fusion o la cantidad de proteina de fusion unida es inferior a la capacidad del soporte solido. En otras realizaciones, el soporte solido tendra capacidad de union reducida.

Una vez las proteinas de fusion se inmovilizan sobre el soporte solido, se realiza una etapa de reduccion con el fin de reducir completamente los enlaces disulfuro reducibles de la proteina de fusion inmovilizada y de generar tioles reactivos. Tras la etapa de reduccion, las proteinas de fusion se cargan con la entidad quimica deseada (en otras palabras, se conjugan con la entidad quimica deseada). De nuevo, la seleccion de las entidades quimicas que van a usarse depende en parte del fin del ensayo. En algunas realizaciones de la presente invencion, las proteinas de fusion se cribaran con el fin de seleccionar proteina de fusion para su uso como conjugados de proteina de fusion- farmaco. En estas realizaciones, se desea que las proteinas de fusion se conjuguen con un farmaco. Las proteinas de fusion pueden conjugarse directamente con el farmaco o indirectamente mediante un conector. El farmaco y el conector de farmaco pueden ser cualquier farmaco o conector de farmaco descrito en el presente documento. Al igual que con los anticuerpos, las proteinas de fusion pueden ponerse en contacto con una mezcla de reaccion que comprende farmaco, agente de terminacion y opcionalmente un agente de detection. Al igual que con los anticuerpos, la presente invencion engloba realizaciones en las que las proteinas de fusion no se criban con el fin de seleccionar una proteina de fusion para su uso como conjugado de proteina de fusion-farmaco, sino con el fin de seleccionar una proteina de fusion para su uso como una proteina de fusion no conjugada. En estas realizaciones, la mezcla de reaccion de conjugation no incluira un farmaco o conector de farmaco, sino en su lugar una mezcla de agente de deteccion y agente de terminacion. Al igual que con los conjugados de anticuerpo, en algunas realizaciones, los metodos descritos en el presente documento de preparation de conjugados de proteina de fusion produciran una pluralidad de composiciones de conjugado de proteina de fusion con carga uniforme sustancial entre muestras. Tras la elucion de las proteinas de fusion, pueden realizarse ensayos de actividad y/u otros ensayos con el fin de caracterizar las proteinas de fusion. Los resultados de los ensayos y el conocimiento de la concentration relativa o real de proteina en las composiciones de conjugado de proteina de fusion pueden usarse para identificar proteinas de fusion que tienen propiedades deseadas bien como proteinas de fusion no conjugadas o bien como conjugados de proteina de fusion-farmaco.

Usando los metodos descritos en el presente documento, los anticuerpos que funcionan bien como anticuerpos no conjugados y las proteinas de fusion que funcionan bien como proteinas de fusion no conjugadas pueden identificarse y pueden seleccionarse para desarrollo adicional. En algunas realizaciones, los anticuerpos o las proteinas de fusion identificados por los presentes metodos se formularan para aplicaciones terapeuticas y/o no terapeuticas. Similarmente, los anticuerpos o las proteinas de fusion identificados como aquellos con actividades deseadas como conjugados de farmaco tambien pueden seleccionarse para desarrollo adicional. En algunas realizaciones, tales anticuerpos o proteinas de fusion se conjugaran con el farmaco o conector de farmaco deseado usando metodos conocidos y se formularan para aplicaciones terapeuticas y/o no terapeuticas. En algunas realizaciones, los anticuerpos, los conjugados de anticuerpo-farmaco, las proteinas de fusion y los conjugados de proteina de fusion se formularan como composiciones farmaceuticas y comprenderan una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz del anticuerpo, conjugado de anticuerpo-farmaco, proteina de fusion o conjugado de proteina de fusion y uno o mas componentes farmaceuticamente compatibles (aceptables). Por ejemplo, una composition farmaceutica o no farmaceutica normalmente incluye uno o mas vehiculos (por ejemplo, liquidos esteriles, tales como agua y aceites). El agua es un vehiculo mas tipico cuando la composicion farmaceutica se administra intravenosamente. Tambien pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehiculos liquidos, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, aminoacidos, almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de silice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sodico, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composicion, si se desea, tambien puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsion, comprimidos, pildoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberation sostenida y similar. Ejemplos de vehiculos farmaceuticos adecuados se describen en “Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Tales composiciones normalmente contendran una cantidad terapeuticamente eficaz de la proteina, normalmente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehiculo de manera que se proporcione la forma para la administration apropiada al paciente. Las formulaciones se corresponden con el modo de administracion.

Normalmente, las composiciones para administracion intravenosa son soluciones en tampon acuoso isotonico esteril. Cuando sea necesario, el farmaco tambien puede incluir un agente solubilizante y un anestesico local tal

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como lignocama para aliviar el dolor en el sitio de la inyeccion. Generalmente, los componentes se suministran tanto por separado como mezclados juntos en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un envase hermeticamente sellado tal como una ampolla o sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando el farmaco va a administrarse por infusion, puede dispensarse con una botella de infusion que contiene agua de calidad farmaceutica esteril o solucion salina. Cuando el farmaco se administra mediante inyeccion, puede proporcionarse una ampolla de agua esteril para inyeccion o solucion salina de manera que los componentes puedan mezclarse antes de la administracion.

La invencion se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de la misma.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Reduccion de anticuerpos en solucion y por fase solida

Es muy reconocido que en condiciones en las que los anticuerpos retienen su estructura plegada nativa, TCEP reduce facilmente los disulfuros intercatenarios sin reducir los disulfuros intracatenarios de los dominios de inmunoglobulina, que estan inaccesibles a reactivos solubles en agua. Cuando un anticuerpo esta unido a medios de afinidad por proteina G, esta selectividad por los disulfuros intercatenarios sigue sin cambiar. Esto se ilustra en la Figura 1. Esta figura muestra cromatogramas hechos reduciendo un anticuerpo murino inmovilizado en proteina G con TCEP 10 mM, seguido de conjugacion con un exceso de mc-MMAF. Estos cromatogramas estan superpuestos con cromatogramas del mismo anticuerpo reducido con TCEP por quimica en solucion convencional y que ha reaccionado con mc-MMAF. Los resultados comparables entre el metodo en solucion convencional y el metodo en fase solida indican que la reactividad del anticuerpo no cambia significativamente tras la union a medios de afinidad por la proteina G. Esta caracteristica permite que se reduzca un gran panel de anticuerpos, todos ellos al mismo numero de tioles reactivos sin considerar la cantidad de cada anticuerpo presente, usando una cantidad de TCEP que esta en exceso con respecto al numero de disulfuros reducibles en el anticuerpo mas abundante. En ausencia de cualquier conocimiento de cuanto anticuerpo puede estar presente, el anticuerpo mas abundante teoricamente puede definirse como la capacidad de la resina de afinidad (ug de anticuerpo por ul de resina) por el volumen del lecho de resina (ul).

Ejemplo 2 - Adaptacion de la relacion de farmaco con respecto al agente de terminacion en la mezcla de reaccion de conjugacion de farmaco para una carga de farmaco deseable

La Figura 2 ilustra el grado de carga del farmaco de maleimido mcMMAF cuando se anade como una mezcla con N- etilmaleimida (NEM) a una IgG 1 murina inmovilizada sobre proteina G y completamente reducida con exceso de TCEP. La figura ilustra la reactividad ligeramente menor de mcMMAF con respecto a NEM, de forma que, en este ejemplo, si se desea un conjugado con una fraccion molar de mcMMAF promedio de 0,4 (una carga de farmaco de 4), la fraccion molar de mcMMAF en la mezcla de maleimida debe ser 0,53. La carga de mcMMAF en cada conjugado se determino por cromatografia de fase inversa con una columna de PLRP-S, que separa eficazmente las cadenas pesadas y ligeras basandose en su carga de farmaco; la hidrofobia de mcMMAF produce despues tiempos de retention para las especies con grado creciente de conjugacion de mcMMAF (Figura 3). Se preparo una mezcla de mcMMAF y NEM a esta relacion y se aplico a un pequeno panel de anticuerpos murinos para evaluar la generalidad de esta relacion a traves de los diferentes isotipos IgG. Como se muestra en la tabla a continuation, las IgG1 y IgG2a murinas, ambas de las cuales poseen 5 disulfuros intercatenarios, dieron niveles de carga de farmaco mcMMAF entre 3,9 y 4,2 como se ha determinado por cromatografia de PLRP-S. Una IgG2b murina, que posee 6 disulfuros intercatenarios, dio una carga de mcMMAF promedio correspondientemente mayor como resultado del mayor numero de tioles reactivos por anticuerpo que resultan de la reduccion completa. Este resultado ilustra la importancia de adaptar la mezcla de maleimida segun el numero de disulfuros reducibles de anticuerpo si se desea un nivel de carga especifico.

Isotipo

mIgG1 mIgG2a mIgG2b

Farmacos / Ab

3,9 4,0 3,9 4,2 4,2 4,1 3,9 5,3

Ejemplo 3 - Metodo de determinacion del nivel de carga de fluoroforo a modo de ejemplo y de preparacion de un patron para determinar la carga de fluoroforo en conjugados de anticuerpo

Pueden prepararse conjugados mixtos con tanto farmaco como un fluoroforo presente en el conjugado de una manera controlable. La presencia de un fluoroforo puede permitir cuantificacion mas sensible de los conjugados resultantes de un gran panel de anticuerpos o como grupo indicador para ensayos de union u otros ensayos realizados en el panel. Puede incluirse la maleimida Alexa Fluor® 647 en una mezcla de maleimidas, junto con mcMMAF y NEM, para crear un panel de conjugados de anticuerpo con una carga promedio deseada para Alexa Fluor® 647 y mcMMAF. Para evaluar un nivel de carga dirigido de AlexaFluor 647, se preparo una serie de conjugados de IgG 1 murina usando una mezcla binaria de maleimida AlexaFluor 647 y mcMMAF. La carga promedio de mcMMAF sobre estos conjugados se determino por cromatografia de PLRP-S, y la carga de Alexa

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Fluor® 647 se calculo como (10 - carga de mcMMAF), ya que los sitios de conjugacion totales en IgG 1 murina completamente reducida es 10. La salida de fluorescencia de estos conjugados se determino entonces usando un lector de placas de fluorescencia, y se represento en funcion de la carga de Alexa Fluor® 647 (Figura 4). La Figura 4 ilustra que la fluorescencia aumenta rapidamente al aumentar el nivel de carga hasta un valor maximo correspondiente a aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3 fluoroforos por anticuerpo, luego disminuye constantemente con carga adicional de fluoroforo. Esta disminucion en la salida de fluorescencia con carga de fluoroforo creciente es supuestamente debida a la auto-extincion que surge de la estrecha proximidad espacial de los fluoroforos cuando se conjugan con los disulfuros reducidos de un anticuerpo. Basandose en este resultado, se selecciono una carga de fluoroforo de aproximadamente 3 por anticuerpo. A este nivel de carga no solo la salida de fluorescencia seria maxima (produciendo la mayor sensibilidad en ensayos fluorescentes), sino que la variacion en la fluorescencia en funcion de la carga de fluoroforo tambien sera minima. Esto garantizara que pequenas variaciones en la carga de fluoroforo a traves de un panel de anticuerpos no produciran grandes diferencias en la salida fluorescente, un punto importante si la fluorescencia va a usarse para cuantificar las concentraciones de conjugado.

Tambien se determino la relacion de la absorbancia a 650 nm con respecto a 280 nm para cada uno de los conjugados de fluoroforo-farmaco descritos anteriormente. Estas relaciones se muestran en la Figura 5, representada contra los datos de fluoroforos por anticuerpo. En la region de 2,5 a 3 fluoroforos por anticuerpo, el cambio en la relacion de absorbancia de 650 nm / 280 nm es lineal con el cambio en el nivel de carga, y la ecuacion de esta linea puede usarse para determinar la carga de fluoroforo en conjugados de anticuerpo AF647 - mcMMAF mixtos a partir de los valores de absorbancia medidos.

Ejemplo 4 - Metodo a modo de ejemplo de adaptacion de la relacion de entidades quimicas con el fin de lograr un nivel de carga de farmaco deseado

Como se describe en el Ejemplo 3, un numero a modo de ejemplo de fluoroforos por anticuerpo es aproximadamente 3. Suponiendo que las muestras que contienen anticuerpo son de isotipos IgG1 e IgG2a murinas y el nivel de carga deseado para fluoroforos es 3, podria lograrse un nivel de carga de farmaco de 7 preparando la mezcla apropiada de maleimida AF647 y mcMMAF. Sin embargo, puede lograrse un nivel mas bajo de carga de farmaco incluyendo un reactivo de terminacion tal como N-etilmaleimida (NEM). Asi, podria prepararse una mezcla ternaria de AF647, mcMMAF y NEM en una relacion apropiada para lograr cualquier nivel deseado de carga de AF647 y de mcMMAF (a condicion de que la suma de los dos no sea superior a 10 para una IgG1 o IgG2a murinas). Para determinar la correcta mezcla de estos tres reactivos necesarios para lograr un nivel de carga deseado, se determinaron sus reactividades relativas. Esto se hizo preparando mezclas 1:1 de mcMMAF : NEM y AF647 : NEM y haciendo reaccionar estas mezclas con una IgG1 murina completamente reducida inmovilizada sobre proteina G. El nivel de carga de fluoroforo en el conjugado de AF647 resultante se determino a partir de su relacion de absorbancia de 650 nm / 280 nm por referencia a la Figura 5, mientras que la carga de mcMMAF en el conjugado de farmaco resultante se determino por cromatografia de PLRP. Estos datos se muestran en la tabla a continuacion; la fraccion molar en el anticuerpo es la carga de cada reactivo (AF647 o mcMMAF) dividida entre 10, el numero total de maleimidas que se conjugan con la IgG 1 murina reducida; la fraccion molar de NEM es 1 menos la fraccion molar de reactivo; y la reactividad relativa es la relacion de la fraccion molar de reactivo con respecto a la fraccion molar de NEM. En este analisis, a NEM se le asigna un valor de reactividad relativo de 1.

Mezcla 1:1

Carga Fraccion molar en el anticuerpo Fraccion molar de NEM en el anticuerpo Reactividad relativa

AF647 : NEM

2,88 0,288 0,712 0,404

mcMMAF:NEM

3,75 0,375 0,625 0,6

Para convertir estos valores de reactividad relativa en una relacion apropiada de maleimidas para usar en la mezcla ternaria, es primero necesario definir los niveles de carga deseados de cada reactivo en el anticuerpo conjugado final. Para este ejemplo se usara una carga objetivo de 4,5 mcMMAF, 3 AF647 y 2,5 NEM, suponiendo de nuevo que el conjugado de anticuerpo tendra 10 tioles disponibles cuando se reduzca. Esto se corresponde con una fraccion molar de conjugado de 0,45, 0,3 y 0,25, respectivamente. Los calculos necesarios se resumen entonces en la tabla a continuacion.

Reactivo

Fraccion molar conjugada objetivo Reactividad relativa (vease la tabla anterior) Fraccion molar Reactividad relativa Fraccion molar requerida en la mezcla de maleimida

mcMMAF

0,45 0,6 0,75 0,43

AF647

0,3 0,404 0,74 0,43

NEM

0,25 1 0,25 0,14

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Brevemente, el valor objetivo para la fraccion molar de conjugado de cada reactivo se divide entre su factor de reactividad relativa que se determino anteriormente usando mezclas 1:1 de los diferentes reactivos. Este valor se convierte entonces en una fraccion molar requerida en la mezcla de maleimida dividiendo el valor entre la suma de los valores para todos los reactivos. Por ejemplo, para mcMMAF, 0,45/0,6 = 0,75; 0,75 / (0,75 + 0,74 + 0,25) = 0,43. De este modo, se predeciria una mezcla de mcMMAF, AF647 y NEM en una relacion de 0,43 : 0,43 : 0,14 para dar conjugados de anticuerpo con una carga promedio 4,5, 3 y 2,5 para los tres reactivos, respectivamente. De un modo similar, podrian calcularse diferentes relaciones de los reactivos para lograr diferentes niveles de carga en el conjugado, o podrian calcularse relaciones para otros reactivos una vez sus reactividades relativas se hubieran determinado.

Ejemplo 5 - Demostracion de la consistencia de la carga de farmaco a traves de muestras

Se preparo una solucion de mcMMAF, maleimida AF647 y NEM en una relacion de 0,43 : 0,43 : 0,14 y se uso para conjugar un panel de anticuerpos por los presentes metodos. Estos anticuerpos se habian generado a partir de 1,5 ml de medio de cultivo de hibridomas con empobrecimiento de IgG bovina, usando hibridomas recien fusionados resultantes de una campana de inmunizacion murina. Una placa de 96 pocillos de muestras se sometio a analisis para determinar la consistencia de la carga de farmaco y de fluoroforo de los conjugados mezclados resultantes. La carga de fluoroforo se determino por la relacion de absorbancia de 650 nm / 280 nm de cada muestra, medida en un lector de placas de absorbancia, por referencia a la relacion lineal mostrada en la Figura 5. Los datos resultantes se muestran en la Figura 6, representados contra la cantidad de conjugado que dio cada muestra; los datos se muestran solo para aquellas muestras que dieron al menos 2,5 |jg de conjugado, ya que cantidades mas bajas de esta no produjeron valores de absorbancia a 280 nm significativamente por encima del nivel inicial. Hubo 65 muestras sobre la placa que cumplieron este umbral de 2,5 jg y se representan en la Figura 6. Como puede apreciarse en la figura, la carga esta dispersada entre 2 y 4 fluoroforos por anticuerpo, con un media calculada de 3,26 y un coeficiente de variacion del 10,2 %. La carga media de 3,26 se diferencia en menos del 10 % de la carga objetivo de 3. Y, lo que es mas importante, el intervalo de los niveles de carga de fluoroforo observados entro dentro de la region de la curva de fluorescencia frente a la carga (Figura 4) en la que la fluorescencia no cambia enormemente, debido al fenomeno auto-extintor. En otras palabras, se espera que la diferencia en la fluorescencia observada entre los anticuerpos con 2, 3 o 4 fluoroforos por anticuerpo sea inferior al 20 %. La carga de mcMMAF se determino por cromatografia de PLRP; un cromatograma de PLRP de muestra de un conjugado de anticuerpo de mcMMAF - AF647 - NEM se muestra en la Figura 7. Esta figura es una transparencia de dos longitudes de onda analiticas, 280 nm para detectar todos los picos que contienen proteina, y 620 nm para detectar aquellos picos que contienen al menos un Alexa Fluor® 647. Como puede apreciarse en esta figura, la cadena ligera con NEM (2,2 minutos) se resuelve ligeramente a partir de la cadena ligera con Alexa Fluor® 647 (2,5 minutos), pero ambas se resuelven bien a partir de la cadena ligera con mcMMAF (3,8 minutos), que ilustra que la columna de PLRP separa bien especies basandose en la carga de mcMMAF, pero no la carga de AF647. Como la cadena ligera contiene solo una cisteina que se reduce por el tratamiento con TCEP, estas son las unicas especies de cadena ligera presentes, y los picos de NEM y de mcMMAF no tienen absorbancia a 620 nm ya que no contienen AF647. La agrupacion de pico de la cadena pesada es mas complicada debido al hecho de que con 4 tioles disponibles, cada pico no es una unica especie. Por ejemplo, el pico correspondiente a la cadena pesada con 2 copias de mcMMAF (7,7 minutos) es un conjunto de especies de la cadena pesada que tambien contienen 2 AF647, 2 NEM, o 1 AF647 y 1 NEM; estas diversas especies no se separan por la columna de PLRP. Esta caracteristica de la separacion permite usar estos datos para evaluar estrictamente la carga de mcMMAF sin afectarse por la presencia de AF647 o NEM. Usando este metodo, los niveles de carga de mcMMAF se determinaron para 34 muestras a partir de la placa de sobrenadante de hibridomas, y se representan en la Figura 8 contra la cantidad de conjugado que dio cada muestra. Como puede apreciarse en la figura, la carga se dispersa entre 4 y 6 copias de mcMMAF por anticuerpo, con una media calculada de 4,51 y un coeficiente de variacion del 7,75 %. La carga media de 4,51 esta exactamente en el nivel objetivo de 4,5. Como puede apreciarse en la figura, hay 3 valores atipicos con niveles de carga superiores a 5; los cromatogramas de PLRP de estas muestras contienen una especie de la cadena pesada con 5 copias de mcMMAF, que indica la presencia de un disulfuro reducible adicional en la cadena pesada de estos anticuerpos (vease la Figura 9 como ejemplo), sugiriendo que estos anticuerpos son del isotipo IgG2b murina. Asi, la mayor carga observada en estas muestras no es debida a carga desproporcionada de mcMMAF en comparacion con los otros anticuerpos, sino a que estos anticuerpos tienen el 20 % mas de tioles disponibles (12 en vez de 10) y, por tanto, se esperaria que se cargaran, con cada reactivo, a niveles del 20 % superiores. Si estos tres se excluyen del analisis y solo se consideran aquellos anticuerpos con 10 tioles disponibles, la carga de mcMMAF media para los 31 anticuerpos es de 4,42 y el coeficiente de variacion disminuye al 3,45 %. Estos resultados ilustran la consistencia de la carga de reactivo (mcMMAF y AF647) lograda por el presente metodo a traves de un panel de anticuerpos de isotipo variable y en cantidades variables de un panel de hibridomas recien fusionados.

Ejemplo 6 - Metodo a modo de ejemplo de preparacion de conjugados de anticuerpo cargados con conector de farmaco y agente de terminacion

Se prepararon sobrenadantes de hibridoma como soluciones de 4,5 ml en tubos de fondo de redondo de 5 ml. Se anadieron 150 ul de suspension de resina de proteina G (Millipore ProSep-G) a cada uno. Los tubos se taparon y se giraron durante la noche a 5 °C. Tambien se prepararon dos tubos de control, uno con medio de crecimiento con empobrecimiento de IgG bovina (para servir de blanco) y uno con este mismo medio enriquecido con 100 ug de un

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anticuerpo de control.

A la manana siguiente se transfirio resina de los tubos a una placa filtrante de 96 pocillos de 2 ml con una frita de polipropileno de 2,5 um (Seahorse Bioscience) usando un pipeteador de matrices de 1250 ul. El sobrenadante en la placa filtrante se paso a traves por breve aplicacion de vado. Despues de haberse secado todos los pocillos (< 30 segundos), la placa se centrifugo a 500 x g durante 3 minutos para garantizar la completa bajada de todos los fluidos y resina. Despues de la centrifugacion, la placa filtrante se volvio a colocar en el colector y cada pocillo recibio 500 ul de PBS. La placa se agito entonces a 1200 RPM en la Thermomixer durante 30 segundos para suspender la resina. Entonces, el PBS se paso a traves por vado. Este proceso se repitio dos veces, durante un total de 3 lavados con PBS. Este proceso se repitio entonces con 3x PBS, y luego seguido de otro lavado con PBS. Tras este lavado final, la placa se centrifugo como antes.

Despues, los anticuerpos unidos se redujeron anadiendo 500 ul de TCEP 20 mM en KPO4 250 mM, NaCl 150 mM, pH 7, EDTA 1 mM y agitando durante 2 horas a 37 °C en la Thermomixer. Tras la reduction, la solution de TCEP se hizo pasar a traves por vado y a continuation se centrifugo como antes, luego se lavo con PBS + EDTA 1 mM como se ha descrito anteriormente. Esto se repitio 4x, durante un total de 5 lavados.

Despues, los anticuerpos unidos se conjugaron con una mezcla de NEM y mc-MMAF en una relation molar de 4:6. Se preparo una solucion madre de NEM + mc-MMAF a una concentration de maleimida total de 12 mM por adelantado. Se anadieron 1,1 ml de esta solucion a 55 ml de 10 % de DMSO, se transfirieron a un deposito multicanal, y se anadieron 500 ul a cada pocillo de la placa filtrante, que luego se agito durante 30 minutos a 22 °C. Tras la conjugation, la solucion de maleimida se hizo pasar a traves por vado y luego se centrifugo como antes. La velocidad de la centrifuga aumento a 1500x g para completar el secado. Los pocillos se lavaron entonces dos veces con 500 ul de 10 % de DMSO en PBS, luego tres veces con PBS.

Los ADC unidos se eluyeron entonces anadiendo 200 ul de glicina 100 mM, pH 2,0, a cada pocillo y agitando durante 3 minutos a 1200 RPM, 22 °C, en la Thermomixer. Mientras que se agitaba, se anadieron 20 ul de tampon de neutralization (fosfato dibasico 1 M + 0,1 % de Tween-20) a cada pocillo de una placa de recogida de 350 ul. Cuando habian transcurrido 3 minutos, los ADC se eluyeron en la placa de recogida centrifugando a 1500 x g durante 6 minutos.

Se transfirieron 200 ul de cada solucion de ADC a una placa de ensayo Costar UV. Se preparo una segunda placa con tampon de elucion neutralizado para servir de blanco. Se llevaron a cabo mediciones a A280 con un lector de placas SpectraMax de Molecular Devices para determinar las concentraciones de proteina.

Finalmente, los ADC se esterilizaron por filtration. En BSC, se fijo una placa filtrante de 0,2 um esteril (Millipore) a una placa de recogida de 1 ml esteril (Matrix) usando cinta de laboratorio. Entonces se anadieron las soluciones de ADC a la placa filtrante y se centrifugaron a 500 x g durante 3 minutos. El ensamblaje se transfirio entonces a BSC y se desensamblo, a continuacion se tapo la placa de recogida con una estera de tapa esteril (Matrix).

Ejemplo 7 - Metodo a modo de ejemplo de preparation de conjugados de anticuerpo cargados con conector de farmaco, agente de termination y fluoroforo

Se sembraron hibridomas recien fusionados en medio de metilcelulosa (Genetix) que contenia HAT y anti-IgG de raton fluorescentemente marcada (Genetix). Se seleccionaron colonias productoras de IgG clonales y se depositaron en una placa de 96W que contenia HSFM (InVitrogen) mas factor de donation con empobrecimiento de IgG (Roche). Se incubaron diluciones cuadruples de sobrenadantes de cultivo de hibridoma no purificado con celulas tumorales diana en un ensayo homogeneo que contenia 100 ng/ml de anticuerpo secundario anti-raton marcado con Cy5 (Jackson Labs). La union de hibridomas a las celulas tumorales se detecto usando un FMAT8200 (Applied Biosystems) y se expandieron pocillos positivos en placas de 48W que contenian 2 ml de HSFM (InVitrogen) mas factor de clonacion con empobrecimiento de IgG. Se usaron los anticuerpos de sobrenadantes extinguidos en 48W para la purification y conjugacion en fase solida.

Se transfirieron sobrenadantes de hibridoma (1,5 ml) a placas de pocillos profundas de 96 pocillos con una frita de polipropileno de 0,45 um (Seahorse Bioscience). Para permitir la cuantificacion de la concentracion de conjugado por fluorescencia, se incluyo un anticuerpo murino patron en la conjugacion. Se dispusieron 50 ug del anticuerpo patron en 4 pocillos de la placa con medio de blanco (200 ug totales). Adicionalmente, 3 pocillos contuvieron solo medio de blanco para la determination de la fluorescencia de fondo.

Se dispusieron 100 ul de PBS en cada pocillo de una placa filtrante de pocillos profundos de 96 pocillos ajustada a un filtro de polipropileno de 2,5 um (Seahorse Bioscience). Se anadieron 20 ul de suspension de resina de proteina G (GE Life Sciences GammaBind Plus) a cada pocillo.

Se dispuso la placa filtrante que contenia la resina de proteina G como placa receptora en un colector de vado, y se ensamblo el colector. La placa filtrante de 0,45 um que contenia las muestras de anticuerpo y patrones se dispuso encima del colector, y los sobrenadantes se transfirieron a el. Aplicando vado, los sobrenadantes se filtraron

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entonces a traves de los filtros de 0,45 um en la placa que contema la resina de protema G. La placa de resina se agito entonces durante 2 horas a temperatura ambiente a 1200 RPM usando una Thermomixer de Eppendorf para efectuar la union a la proteina G. El sobrenadante residual se filtro entonces en una placa receptora de pocillos profundos de 2 ml por centrifugacion a 500 x g durante 5 minutos.

Se anadio a la placa una solucion de tricarboxietilfosfina 10 mM (TCEP) en fosfato de potasio 100 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM (150 ul por pocillo). La placa se agito entonces como antes durante 30 minutos, luego se saco del agitador y se centrifugo durante 2 minutos a 500 x g. La resina se lavo cuatro veces con 500 ul de PBS que contema EDTA 1 mM, con filtracion a vacio tras cada lavado. Tras el lavado final, se anadieron otros 500 ul de PBS / EDTA y se eliminaron por centrifugacion durante 3 minutos a 500 x g.

Se prepararon soluciones madre individuales de conector de farmaco (mcMMAF), Alexa Fluor® 647 y NEM a 10 mM en DMSO. Estas soluciones madre se combinaron entonces en una unica solucion a la siguiente relacion para la conjugacion:

3:3:1 de mcMMAF: Alexa Fluor® 647 : NEM

Se disolvieron 140 ul de esta solucion en 15 ml de PBS / EDTA, y se anadieron 150 ul a cada pocillo de la placa lavada. La placa se agito entonces como antes durante 15 minutos, luego se saco del agitador y se centrifugo durante 2 minutos a 500 x g. La resina se lavo cuatro veces con 500 ul de PBS, con filtracion a vacio tras cada lavado. Tras el lavado final, se anadieron otros 500 ul de PBS y se eliminaron por centrifugacion durante 3 minutos a 500 x g.

Se anadieron 10 ul de fosfato de potasio 1 M a pH 7,4 a cada pocillo de una placa de ensayo de fondo claro de 96 pocillos de 350 ul. La placa de resina se dispuso encima de la placa de ensayo y se anadieron 100 ul de tampon de elucion (glicina 50 mM a pH 2,5 + 0,08 % de Tween-20) a cada pocillo. La placa se agito suavemente por balanceo manual durante 2 minutos, luego se centrifugo durante 2 minutos a 500 x g para recoger los conjugados de anticuerpo eluidos en la placa de ensayo. La placa de ensayo se dispuso inmediatamente en un lector de placas de fluorescencia (Molecular Devices) y se agito durante 10 segundos usando el agitador del lector de placas para garantizar la mezcla completa del tampon de neutralizacion en el tampon de elucion. Entonces se midio la fluorescencia de cada pocillo a 675 nm usando una excitacion de 635 nm con un filtro de corte de 665 nm. Se extrajeron las soluciones en los pocillos que contenian los patrones y se reunieron en una unica solucion patron, y la concentracion de este patron se determino por un metodo de absorbancia a A280 convencional en una cubeta de 1 cm. Entonces se preparo una serie de dilucion de este patron (usando tampon de elucion neutralizado como diluyente) hasta una concentracion de 1 ug/ml. Entonces se transfirieron 110 ul de cada patron a una placa de ensayo de fondo claro de 350 ul limpia y la fluorescencia se midio de nuevo en el lector de placas. Se ajusto una curva polinomica de segundo orden a los valores de fluorescencia de los patrones, y las concentraciones de las muestras se asignaron por interpolacion a esta curva patron.

Finalmente, los ADC se esterilizaron por filtracion. En BSC, se fijo una placa filtrante de 0,2 um esteril (Millipore) a una placa de recogida de 1 ml esteril (Matrix) usando cinta de laboratorio. Entonces se anadieron las soluciones de ADC a la placa filtrante y se centrifugaron a 500 x g durante 3 minutos. El ensamblaje se transfirio entonces a BSC y se desensamblo, a continuacion se tapo la placa de recogida con una estera de tapa esteril (Matrix).

Se probaron conjugados mixtos de anticuerpo que contienen fluoroforo y farmaco en ensayos de union a celula y de citotoxicidad. Para los ensayos de union basados en celulas, el panel de anticuerpos se diluyo a 1:200 y 1:1000 en PBS + 2 % de suero y se incubo sobre celulas diana durante 2 horas a temperatura ambiente en placas negras de 96W. Se uso un anticuerpo de control en cada placa para generar una curva de union de saturation para formas humanas y de cino del antigeno. Las placas se analizaron entonces en un FMAT8200 y los valores de intensidad de fluorescencia media para cada dilucion se representaron en la curva de union de saturacion para estimar la afinidad por el anticuerpo de prueba en formas humanas y de cino del antigeno. Los hibridomas que mostraron union equivalente a antigeno humano y de cino se adelantaron para estudios de citotoxicidad. Los estudios de citotoxicidad se hicieron sembrando 5.000 celulas por pocillo en el medio de crecimiento apropiado. Los conjugados mixtos se anadieron a una dilucion final de 1:100 y 1:1000, respectivamente. Se incubaron celulas tumorales con conjugados de farmaco/fluoroforo durante 96 horas a 37 °C. Se uso Cell Titer Glo (Promega) para medir la viabilidad celular y se evaluo la potencia de conjugados de farmaco/fluoroforo basandose en el porcentaje de viabilidad con respecto a celulas de control no tratadas. Los conjugados de farmaco/fluoroforo que produjeron <70 % de viabilidad de celulas tumorales a concentraciones 1 nM se adelantaron para prueba adicional.

Ejemplo 8 - Agotamiento de IgG

Se usa comunmente factor de donation como componente de medio en la expansion de lineas celulares de hibridoma despues de la fusion con linfocitos B murinos. El factor de clonacion contiene mediadores celulares importantes que se recogieron del sobrenadante de celulas prosperas sanas y estos ayudan a nuevas fusiones de hibridoma a recuperarse y a empezar a crecer mas robustamente. Se sospecha que el sobrenadante recogido de las celulas prosperas sanas que constituye el factor de clonacion contiene suero bovino como componente del medio que incluiria albumina bovina, IgG y otras proteinas del suero. En este caso, es la IgG bovina la que es preocupante

debido a que incluso una pequena cantidad de IgG contaminante puede afectar la recuperacion cuantitativa de los anticuerpos y a la cuantificacion de los ADC resultantes.

El metodo para eliminar la IgG bovina del factor de clonacion se realiza del siguiente modo. Se equilibra una 5 columna de proteina G de 5 ml con 1X PBS (5 volumenes de columna, CV), 25 ml. Los contenidos del factor de clonacion de hibridomas se cargan en una jeringa de 60 cc. Una jeringa esta unida a la columna de proteina G y conectada a una bomba de jeringa. La bomba se establece a 3 ml/min, el factor de clonacion se pasa sobre la columna de proteina G y se recoge el efluente. El efluente contiene el factor de clonacion con empobrecimiento de IgG. La IgG bovina se unira a la columna de proteina G. El factor de clonacion de hibridomas con empobrecimiento 10 de IgG se esteriliza por filtracion en una vitrina de bioseguridad usando un filtro de jeringa de 0,22 |jm.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de preparation de conjugados de anticuerpo para su uso en ensayos de cribado de anticuerpos que comprende las etapas de:

   proporcionar una pluralidad de muestras que contienen anticuerpo que varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y a la secuencia de anticuerpo a condition de que, en una mayoria de la pluralidad de las muestras que contienen anticuerpo, sustancialmente todo el anticuerpo presente en una unica muestra sea de la misma secuencia;

   inmovilizar los anticuerpos sobre un soporte solido para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados;

   reducir completamente los enlaces disulfuro reducibles de los anticuerpos inmovilizados para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados reducidos, en donde la reduction es selectiva para enlaces disulfuro reducibles;

   y

   o bien

   a) hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con un agente de termination, un farmaco o un conector de farmaco, y opcionalmente un agente de detection, para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden conjugados de anticuerpo inmovilizado, en donde el agente de terminacion, el farmaco o el conector de farmaco y el agente de deteccion opcional reaccionan selectivamente con tioles reactivos, el agente de terminacion, el farmaco o el conector de farmaco y el agente de deteccion opcional se proporcionan en exceso molar y la relation de agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de farmaco;

   o bien

   b) hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con un agente de terminacion y un agente de deteccion para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden conjugados de anticuerpo inmovilizado, en donde el agente de terminacion y de deteccion reaccionan selectivamente con tioles reactivos, en donde el agente de terminacion y el agente de deteccion se proporcionan en exceso molar y la relacion de agente de terminacion y agente de deteccion esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de agente de terminacion y/o de agente de deteccion; y

   eluir los conjugados de anticuerpo para proporcionar una pluralidad de composiciones de conjugado de anticuerpo.
2. 2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que los anticuerpos comprenden uno o mas dominios Fc y la inmovilizacion de los anticuerpos sobre el soporte solido comprende la union al soporte solido a traves de uno o mas dominios Fc.
3. 3. Un metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que comprende hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y, opcionalmente, un agente de deteccion, para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden conjugados de anticuerpo inmovilizado, en donde el agente de terminacion, el farmaco o el conector de farmaco y el agente de deteccion opcional reaccionan selectivamente con tioles reactivos, agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y agente de deteccion opcional se proporcionan en exceso molar y la relacion de agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y el agente de deteccion opcional esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de farmaco.
4. 4. Un metodo segun la reivindicacion 3 que comprende las etapas de:

   proporcionar una primera y una segunda muestras que contienen anticuerpo en donde la primera y la segunda muestras que contienen anticuerpo varian con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo, a condicion de que sustancialmente todo el anticuerpo presente en la primera muestra sea de la misma secuencia y sustancialmente todo el anticuerpo presente en la segunda muestra sea de la misma secuencia; inmovilizar los anticuerpos sobre un soporte solido para proporcionar una primera y una segunda muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados;

   reducir completamente los enlaces disulfuro reducibles de los anticuerpos inmovilizados para proporcionar una primera muestra que comprende anticuerpos inmovilizados reducidos y una segunda muestra que comprende anticuerpos inmovilizados reducidos, en donde la reduccion es selectiva para enlaces disulfuro reducibles; hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y, opcionalmente, un agente de deteccion para proporcionar conjugados de anticuerpo inmovilizado, en donde el agente de terminacion, el farmaco o el conector de farmaco y el agente de deteccion opcional reaccionan selectivamente con tioles reactivos, el agente de terminacion, el farmaco o el conector de farmaco y el agente de deteccion opcional se proporcionan en exceso molar y la relacion de agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y agente de deteccion opcional esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de farmaco; y

   eluir los conjugados de anticuerpo para proporcionar una primera y una segunda composiciones de conjugado de

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   anticuerpo-farmaco.
5. 5. Un metodo segun la reivindicacion 4, en el que los enlaces disulfuro reducibles son los enlaces disulfuro intercatenarios de origen natural del anticuerpo y el anticuerpo en la primera y la segunda muestras que contienen anticuerpo tienen el mismo numero de enlaces disulfuro reducibles y los anticuerpos inmovilizados reducidos se ponen en contacto con la misma relacion de agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y agente de deteccion opcional.
6. 6. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que los anticuerpos inmovilizados reducidos se hacen reaccionar con un agente de deteccion.
7. 7. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que tras la elucion de los conjugados de anticuerpo se determina la cantidad real o relativa de anticuerpo presente en las composiciones de conjugado de anticuerpo.
8. 8. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo, presente en las muestras que contienen anticuerpo antes de la inmovilizacion, es impuro.
9. 9. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que no se conoce la cantidad de anticuerpo presente en las muestras que contienen anticuerpo antes de la inmovilizacion, la reduccion, la conjugacion y la elucion.
10. 10. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo en las muestras que contienen anticuerpo es de la misma especie.
11. 11. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en el que la carga de conector de farmaco entre las muestras es sustancialmente uniforme.
12. 12. Un metodo segun la reivindicacion 11, en el que las composiciones de conjugado de anticuerpo tienen una carga de conector de farmaco promedio de aproximadamente 4 conectores de farmaco por anticuerpo.
13. 13. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las muestras que contienen anticuerpo son muestras de sobrenadante de cultivo celular.
14. 14. Un metodo segun la reivindicacion 13, en el que el sobrenadante de cultivo celular es sobrenadante de cultivo de celulas de hibridoma no purificado o sobrenadante de cultivo de celulas CHO no purificado.
15. 15. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 14, en el que dicho metodo comprende ademas la etapa de:

    ensayar una actividad de los conjugados de anticuerpo y

    hacer una comparacion entre los anticuerpos que constituyen las composiciones de conjugado de anticuerpo basandose en una actividad del conjugado de anticuerpo correspondiente, en donde la actividad es citotoxicidad.
16. 16. Un metodo segun la reivindicacion 3, en el que dicho metodo comprende las etapas de:

    proporcionar una pluralidad de muestras de sobrenadante de hibridoma no purificado que comprende anticuerpo no cuantificado producido a partir de una pluralidad de clones de hibridoma, en donde la pluralidad de muestras varia con respecto a la cantidad de anticuerpo y la secuencia de anticuerpo a condicion de que, en una mayoria de la pluralidad de las muestras, sustancialmente todo el anticuerpo presente en cada muestra sea de un unico clon de hibridoma;

    inmovilizar los anticuerpos no cuantificados sobre un soporte solido para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados;

    reducir completamente los disulfuros intercatenarios de los anticuerpos inmovilizados para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden anticuerpos inmovilizados reducidos;

    hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y un agente de deteccion para proporcionar conjugados de anticuerpo inmovilizado, en donde el agente de terminacion, el farmaco o el conector de farmaco y el agente de deteccion reaccionan selectivamente con tioles reactivos, el agente de terminacion, el farmaco o el conector de farmaco y el agente de deteccion opcional se proporcionan en exceso molar y la relacion de agente de terminacion, farmaco o conector de farmaco y agente de deteccion esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de farmaco; y eluir los conjugados de anticuerpo de los soportes solidos para proporcionar una pluralidad de composiciones de conjugado de anticuerpo.

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17. 17. Un metodo segun la reivindicacion 16 que comprende ademas las etapas de:

    determinar la cantidad real o relativa de anticuerpo presente en las composiciones de conjugado de anticuerpo; ensayar una actividad de los conjugados de anticuerpo; y

    basandose en los resultados del ensayo y en la cantidad real o relativa de anticuerpo presente en las composiciones de conjugado de anticuerpo, seleccionar un anticuerpo con caracteristicas deseables.
18. 18. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que sustancialmente todo el medio de cultivo celular usado para la produccion de anticuerpos era medio con empobrecimiento de IgG.
19. 19. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en el que en cada muestra de sobrenadante de cultivo celular hay presente de 1 |jg a 100 |jg, de 1 |jg a 50 |jg o de 1 |jg a 20 |jg de anticuerpo.
20. 20. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente de terminacion, el farmaco o el conector de farmaco y el agente de detection comprenden un grupo maleimida.
21. 21. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente de deteccion es un fluoroforo.
22. 22. Un metodo segun la reivindicacion 21, en el que el agente de deteccion es un fluoroforo y las composiciones de conjugado de anticuerpo resultantes tienen una carga de fluoroforo promedio de aproximadamente 3 fluoroforos por anticuerpo.
23. 23. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 22, en el que el ensayo de cribado de anticuerpos es para seleccionar un anticuerpo para su uso en un conjugado de anticuerpo-farmaco.
24. 24. Un metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que comprende hacer reaccionar los anticuerpos inmovilizados reducidos con agente de terminacion y un agente de deteccion para proporcionar una pluralidad de muestras que comprenden conjugados de anticuerpo inmovilizado, en donde el agente de terminacion y de deteccion reaccionan selectivamente con tioles reactivos, el agente de terminacion y el agente de deteccion se proporcionan en exceso molar y la relation de agente de terminacion y agente de deteccion esta seleccionada para lograr un nivel deseado de carga de agente de terminacion y/o de agente de deteccion.