ES2581482T3 - Derivados de amino y amonio hidroxi-sustituidos y su uso médico - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la siguiente fórmula 1**Fórmula** en la que: R1 es un grupo hidrocarburo C10-20; R2 es un grupo alquilo C1-4, y R3 es H, un grupo alquilo C1-4 o R3 está ausente; o R2 y R3 están unidos entre sí para formar un anillo de pirrolidina, un anillo de piperidina o un anillo de azepano junto con el átomo de nitrógeno X al que están unidos, en el que dicho anillo de pirrolidina, dicho anillo de piperidina o dicho anillo de azepano está opcionalmente sustituido con uno o más grupos independientemente seleccionados de -OH, -O(alquilo C1-3), -OC(O)-(alquilo C1-3), alquilo C1-3, -NH2, -NH(alquilo C1-3) o -N(alquilo C1-3)(alquilo C1-3). R4 es H o un grupo alquilo C1-4; R5 es un grupo alquilo C2-8, en el que uno o más átomos de hidrógeno de dicho grupo alquilo C2-8 está remplazado por -OH, o R5 es un grupo cicloalquilo C5-7, en el que un átomo de carbono del anillo de dicho grupo cicloalquilo C5-7 está opcionalmente remplazado por un átomo de oxígeno y en el que uno o más átomos de hidrógeno de dicho grupo cicloalquilo C5-7 están remplazados independientemente por -OH o -CH2OH; X es N+ o, si R3 está ausente, X es N; y p es 1, 2 o 3; o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer bucal, cáncer orofaríngeo, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinativas del ovario, tumor pancreático, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma, adenoma hipofisario, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células de transición, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, síndrome de Sézary, cáncer de piel, carcinoma broncopulmonar microcítico, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de útero, sarcoma uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva o tumor de Wilms.

Los compuestos de la invención, que han demostrado exhibir una eficacia en la supresión de la respuesta inflamatoria al menos equivalente a la del corticoesteroide dexametasona, como también se muestra en los Ejemplos 7 y 8 son, además, ventajosos porque no muestran los efectos adversos observados para los corticoesteroides, tales como la reducción de peso de los ganglios linfáticos y el número de células que se observó para el corticoesteroide diflorasona en el Ejemplo 8, que los hace particularmente útiles en el tratamiento, prevención o mejora de trastornos inflamatorios, autoinmunitarios y/o alérgicos.

Además, los compuestos de la presente invención, incluyendo los compuestos de fórmula 1 o 2, tienen una citotoxicidad particularmente baja y, por tanto, un perfil ventajoso de toxicidad, como también se demostró en el Ejemplo 5.

El compuesto de fórmula 1, como se define anteriormente, se describe con más detalle a continuación.

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R1 es un grupo hidrocarburo C10-20. Preferentemente, R1 es un grupo alquilo, un grupo alquenilo o un grupo alquinilo; más preferentemente, R1 es un grupo alquilo lineal, un grupo alquenilo lineal, o un grupo alquinilo lineal; incluso más preferentemente, R1 es un grupo alquilo lineal. El número de átomos de carbono del grupo hidrocarburo, el grupo alquilo, el grupo alquenilo o el grupo alquinilo es de 10 a 20, preferentemente 12, 14 o 16. En consecuencia, es preferente particularmente que R1 sea -(CH2)11-CH3, -(CH2)13-CH3, o -(CH2)15-CH3.

R2 es un grupo alquilo C1-4, y R3 es H, un grupo alquilo C1-4 o R3 está ausente; o R2 y R3 están unidos entre sí para formar un anillo de pirrolidina, un anillo de piperidina o un anillo de azepano junto con el átomo de nitrógeno X al que están unidos, en el que dicho anillo de pirrolidina, dicho anillo de piperidina o dicho anillo de azepano está opcionalmente sustituido con uno o más grupos independientemente seleccionados de -OH, -O(alquilo C1-3), -OC(O)-(alquilo C1-3), alquilo C1-3, -NH2, -NH(alquilo C1 -3) o -N(alquilo C1-3)(alquilo C1-3).

En un modo de realización preferido, R2 es metilo, y R3 es -H, un grupo alquilo C1-4 o R3 está ausente. Más preferentemente, R2 es metilo, y R3 es -H, metilo o R3 está ausente.

En otro modo de realización preferido, R2 y R3 están unidos entre sí para formar un anillo de pirrolidina, un anillo de piperidina o un de azepano junto con el átomo de nitrógeno X al que están unidos. Más preferentemente, R2 y R3 están unidos entre sí para formar un anillo de piperidina junto con el átomo de nitrógeno X al que están unidos. El anillo de pirrolidina, el anillo de piperidina o el anillo de azepano pueden estar sustituidos con uno o más (tal como, por ejemplo, uno, dos, tres, o cuatro), preferentemente uno o dos, más preferentemente uno, grupos independientemente seleccionados de -OH, -O(alquilo C1-3), -OC(O)-(alquilo C1-3), alquilo C1-3, -NH2, -NH (alquilo C1-3) o -N(alquilo C1-3)(alquilo C1-3). Preferentemente, el anillo de pirrolidina, el anillo de piperidina o el anillo de azepano está no sustituido o sustituido con un grupo -OH. En consecuencia, es preferente particularmente que estén unidos entre sí para formar un anillo de piperidina junto con el átomo de nitrógeno X al que están unidos, en el que el anillo de piperidina está opcionalmente sustituido con un grupo -OH, preferentemente en posición para con respecto al átomo de nitrógeno X.

R4 es -H o un grupo alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo, etilo, propilo o butilo). Preferentemente, R4 es metilo.

R5 es un grupo alquilo C2-8, en el que uno o más átomos de hidrógeno de dicho grupo alquilo C2-8 está remplazado por -OH, o R5 es un grupo cicloalquilo C5-7, en el que un átomo de carbono del anillo de dicho grupo cicloalquilo C5-7 está opcionalmente remplazado por un átomo de oxígeno y en el que uno o más átomos de hidrógeno de dicho grupo cicloalquilo C5-7 están sustituidos independientemente por -OH o -CH2OH. En consecuencia, R5 es un grupo alquilo C2-8 sustituido con uno o más (tal como, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7) grupos hidroxilo o R5 es un grupo cicloalquilo C5-7 sustituido con uno o más (tal como, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6) grupos seleccionados independientemente de -OH o -CH2OH, en el que un átomo de carbono del anillo de dicho grupo cicloalquilo C5-7 está opcionalmente

remplazado por un átomo de oxígeno. Preferentemente, R5 es un grupo alquilo C2-8, en el que uno o más (tal como, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7) átomos de hidrógeno están remplazados por -OH. Más preferentemente, R5 es -CH2CH2OH, -CH2CH(OH)CH2OH, -CH2CH(OH)CH(OH)CH2OH, -CH2 CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH2OH, -CH2CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH2OH o -CH(CH2OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH2OH. Incluso

5 -CH2CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH2OH.

X es N+ o, si R3 está ausente, X es N.

p es 1, 2 o 3. Preferentemente, p es 1.

Un experto en la técnica entiende que, si se proporciona el compuesto de fórmula 1 en solución y si R3 en la fórmula 1 es -H o está ausente, la protonación del átomo de nitrógeno X y, en consecuencia, la carga en el átomo de nitrógeno

10 X depende del pH de la solución. Por tanto, dependiendo del pH de la solución, R3 puede ser -H y X puede ser N+, R 3 puede estar ausente y X puede ser N.

Los ejemplos preferentes del compuesto de fórmula 1 son los compuestos 1a, 1b, 1c y 1d mostrados a continuación o sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos:

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En un modo de realización descrito anteriormente, R2 y R3, en la fórmula 1, están unidos entre sí para formar un anillo de pirrolidina, un anillo de piperidina o un anillo de azepano junto con el átomo de nitrógeno X al que están unidos, en el que dicho anillo de pirrolidina, dicho anillo de piperidina o dicho anillo de azepano está opcionalmente sustituido con uno o más grupos independientemente seleccionados de -OH, -O(alquilo C1-3), -OC(O)-(alquilo C1-3), alquilo C1-3,

20 -NH2, -NH(alquilo C1 -3) o -N(alquilo C1-3)(alquilo C1-3).

En consecuencia, el compuesto de fórmula 1 puede ser un compuesto de la siguiente fórmula 2

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o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. En la fórmula 2, los grupos R1, R4 y R5, así como la variable p tienen los significados o los significados preferentes

25 definidos en el presente documento anteriormente para el compuesto de fórmula 1.

n es 1, 2 o 3. Preferentemente, n es 2.

m es un número entero de 0 a 4. Preferentemente, m es 0, 1, o 2; más preferentemente, m es 0 o 1; aún más

preferentemente, m es 1.

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Cada R6 se selecciona independientemente de -OH, -O(alquilo C1-3), -OC(O)-(alquilo C1-3), alquilo C1-3, -NH2, -NH(alquilo C1-3) o -N(alquilo C1-3)(alquilo C1-3). Preferentemente, cada R6 es -OH.

Debe entenderse que cada R6 está unido a un átomo de carbono del anillo de pirrolidina, piperidina o azepano. Además, debe entenderse que, si m es 0, el anillo de pirrolidina, piperidina o azepano (al que se une R6) está no sustituido, es decir, está sustituido con hidrógeno.

En un modo de realización, n es 1 o 3, y m es 0.

En un modo de realización preferido, n es 2, m es 1, y R6 es -OH, -O(alquilo C1-3), -OC(O)-(alquilo C1-3), -NH2, -NH(alquilo C1-3) o -N(alquilo C1-3) (alquilo C1-3), en particular, -OH. En este modo de realización, es preferente además que R6 esté en posición para respecto del átomo de nitrógeno N+ del anillo.

Los compuestos a usarse de acuerdo con la presente invención, en particular los compuestos de fórmula 1 o 2, se pueden preparar por procedimientos conocidos en el campo de la química sintética.

Por ejemplo, los compuestos de fórmula 1 o 2 se pueden preparar en analogía a las rutas sintéticas descritas en la sección de ejemplos. La N-acilación selectiva de aminopolioles tales como N-metil-D-glucamina con un éster activo (por ejemplo OSu-éster, OBt-éster) de un ácido carboxílico adecuado produce los compuestos diana, que se purifican por cromatografía, particularmente cromatografía de fase inversa. Los ácidos carboxílicos requeridos se pueden preparar por alquilación por etapas de R1-NH2 usando procedimientos conocidos, por ejemplo acilación y reducción o reacción de Hinsberg. El resto carboxílico se puede introducir por alquilación de aminas como R1-NHMe o R1-NMe2. con carboxilatos ω-halogenados o ésteres tales como éster del ácido terc-butil bromoacético y posterior desprotección.

Los compuestos de fórmula 2, es decir, compuestos de fórmula 1 en la que R2 y R3 están unidos entre sí para formar un N-heterociclo, se pueden preparar por N-alquilación por etapas de dicho heterociclo con un R1-halogenuros y un carboxilato ω-halogenado o éster tal como éster terc-butílico de ácido bromoacético y posterior desprotección. El ácido carboxílico resultante se usa para N-acilar aminopolioles, como se describe anteriormente.

Se pueden obtener productos polihidroxilados, estereoquímicamente uniformes de los carbohidratos por síntesis a partir de combinación quiral. Las síntesis estereoselectivas, tales como la reducción asimétrica de cetonas, la abertura de epóxidos quirales o la inversión de estereocentros proporcionan rutas de acceso a componentes básicos polihidroxilados enantioméricamente puros adicionales.

Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo hidrocarburo" se refiere a un grupo que consiste en átomos de carbono y átomos de hidrógeno, dicho grupo puede ser saturado o insaturado, lineal, ramificado o cíclico, alifático o aromático. Un "grupo hidrocarburo C10-20" es un grupo hidrocarburo que tiene de 10 a 20 átomos de carbono.

Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo acíclico alifático (es decir, no aromático) saturado monovalente, que puede ser lineal o ramificado y que no comprende ningún doble enlace carbono-carbono o ningún triple enlace carbono-carbono.

Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo acíclico alifático insaturado monovalente, que puede ser lineal o ramificado y que comprende al menos un doble enlace carbono-carbono mientras que no comprende ningún triple enlace carbono-carbono.

Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo acíclico monovalente alifático insaturado, que puede ser lineal o ramificado y que comprende al menos un triple enlace carbono-carbono y opcionalmente uno o más dobles enlaces carbono-carbono.

Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo alquileno" se refiere a un grupo hidrocarburo acíclico alifático (es decir, no aromático) saturado divalente, que puede ser lineal o ramificado y que no comprende ningún doble enlace carbono-carbono o ningún triple enlace carbono-carbono.

Como se usa en el presente documento, la expresión "grupo cicloalquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático (es decir, no aromático) saturado cíclico monovalente, que no comprende ningún doble enlace carbono-carbono o ningún triple enlace carbono-carbono. Los ejemplos no limitantes de grupos cicloalquilo y, en particular, de grupos cicloalquilo C5-7 son ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo.

El alcance de la invención abarca todas las formas farmacéuticamente aceptables de sal de los compuestos de fórmula 1 o 2, que se pueden formar, por ejemplo, por la protonación de un átomo que lleva un par solitario de electrones que es susceptible a protonación, tal como un grupo amino, con un ácido inorgánico u orgánico, o como una sal de un grupo ácido carboxílico con un catión fisiológicamente aceptable, que son bien conocidas en la técnica. Las sales de adición de bases ejemplares comprenden, por ejemplo, sales de metales alcalinos tales como sales de sodio o potasio; sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de calcio o magnesio; sales de amonio; sales de aminas alifáticas, tales como trimetilamina, trietilamina, diciclohexilamina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina,

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gelatina, cápsulas duras de gelatina, pastillas para chupar, trociscos, soluciones, emulsiones, suspensiones, jarabes, elixires, polvos y gránulos para reconstitución, polvos dispersables y gránulos, gomas medicadas, comprimidos de mascar y comprimidos efervescentes. Las formas de dosificación para administración parenteral incluyen soluciones, emulsiones, suspensiones, dispersiones y polvos y granulados para su reconstitución. Las emulsiones son una forma de dosificación preferente para administración parenteral. Las formas de dosificación para administración rectal y vaginal incluyen supositorios y óvulos. Las formas de dosificación para administración nasal se pueden administrar por inhalación e insuflación, por ejemplo, mediante un inhalador dosificado. Las formas de dosificación para administración tópica incluyen cremas, geles, pomadas, ungüentos, parches y sistemas de administración transdérmica.

Los compuestos de acuerdo con la invención, en particular los compuestos de fórmula 1 o 2, o las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente que comprenden uno o más compuestos de fórmula 1 o 2, se pueden administrar a un sujeto por cualquier ruta conveniente de administración, ya sea de forma sistémica/periférica o en el sitio de acción deseada, incluyendo, pero sin limitarse a, uno o más de: oral (por ejemplo, como un comprimido, cápsula, o como una solución ingerible), tópica (por ejemplo, transdérmica, intranasal, ocular, bucal, y sublingual), parenteral (por ejemplo, usando técnicas de inyección o técnicas de infusión, e incluyendo, por ejemplo, por inyección, por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intratecal, intraespinal, intracapsular, subcapsular, intraorbital, intraperitoneal, intratraqueal, subcuticular, intraarticular, subaracnoidea, o intraesternal por, por ejemplo, implante de un depósito, por ejemplo, de forma subcutánea o intramuscular), pulmonar (por ejemplo, por tratamiento de inhalación o insuflación usando, por ejemplo, un aerosol, por ejemplo, a través de la boca o la nariz), gastrointestinal, intrauterina, intraocular, subcutánea, oftálmica (incluyendo intravítrea o intracameral), rectal, y vaginal.

Si dichos compuestos o composiciones farmacéuticas se administran de forma parenteral, entonces los ejemplos de dicha administración incluyen uno o más de: administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular o subcutánea de las composiciones de compuestos farmacéuticos, y/o mediante el uso de técnicas de infusión. Para administración parenteral, los compuestos se usan mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, sales o glucosa suficientes para hacer la solución isotónica con la sangre. Las soluciones acuosas deben estar adecuadamente tamponadas (preferentemente a un pH de 3-9), si es necesario. La preparación de formulaciones parenterales adecuadas en condiciones estériles se consigue fácilmente mediante técnicas farmacéuticas habituales bien conocidas para los expertos en la técnica.

Dichos compuestos o composiciones farmacéuticas también se pueden administrar de forma oral en forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes aromatizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retardada, modificada, sostenida, por pulsos o controlada.

Los comprimidos pueden contener excipientes, tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico y glicina, disgregantes, tales como almidón (preferentemente almidón de maíz, de patata o de tapioca), almidón glicolato de sodio, croscarmelosa de sodio y ciertos silicatos complejos, y aglutinantes de granulación tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y gorma arábiga. Adicionalmente, se pueden incluir agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco. También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina. Los excipientes preferentes a este respecto incluyen lactosa, almidón, una celulosa, azúcar de la leche o polietilenglicoles de alto peso molecular. Para suspensiones acuosas y/o elixires, el agente se puede combinar con diversos agentes edulcorantes o aromatizantes, materia colorante o tintes, con agentes emulsionantes y/o agentes de suspensión y con diluyentes, tales como agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.

De forma alternativa, dichos compuestos o composiciones farmacéuticas se pueden administrar en forma de un supositorio o pesario, o se pueden aplicar de forma tópica en forma de un gel, hidrogel, loción, solución, crema, pomada o polvo de espolvoreo. Los compuestos de la presente invención también se pueden administrar de forma dérmica o transdérmica, por ejemplo, mediante el uso de un parche para la piel.

Dichos compuestos o composiciones farmacéuticas se pueden administrar también por la ruta pulmonar, rutas rectales, o la ruta ocular. Para uso oftálmico, se pueden formular como suspensiones micronizadas en solución salina isotónica, de pH ajustado, estéril o, preferentemente, como soluciones en solución salina isotónica, de pH ajustado, estéril, opcionalmente en combinación con un conservante, tal como un cloruro de benzalconio. De forma alternativa, se pueden formular en una pomada, tal como vaselina.

Para aplicación tópica a la piel, dichos compuestos o composiciones farmacéuticas se pueden formular como una pomada adecuada que contiene el compuesto activo suspendido o disuelto en, por ejemplo, una mezcla con uno o más de los siguientes: aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, cera emulsionante y agua. De forma alternativa, se pueden formular como una loción o crema adecuada, suspendidos o disueltos en, por ejemplo, una mezcla de uno o más de los siguientes: aceite mineral, monoestearato de sorbitán, un polietilenglicol, parafina líquida, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.

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Típicamente, un médico determinará la dosificación real que será más adecuada para un sujeto individual. El nivel de dosis específico y la frecuencia de dosificación para cualquier sujeto individual particular se puede variar y dependerá de diversos factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de ese compuesto, la edad, peso corporal, el estado de salud general, el sexo/dieta, el modo y el momento de la administración, la tasa de eliminación, la combinación de fármacos, la gravedad de la afección particular y el sujeto individual sometido a tratamiento.

Una dosis propuesta, pero no limitante, de la de los compuestos de fórmula 1 o 2 para su administración a un ser humano (de aproximadamente 70 kg de peso corporal) puede ser de 0,05 a 5000 mg, preferentemente de 0,1 mg a 1000 mg del principio activo por dosis unitaria. La dosis unitaria se puede administrar, por ejemplo, de 1 a 4 veces por día. La dosis dependerá de la ruta de administración. Se apreciará que puede ser necesario realizar variaciones rutinarias de la dosificación dependiendo de la edad y peso del paciente/sujeto, así como de la gravedad de la afección a tratar. La dosis y la ruta de administración precisas serán, en última instancia, según el criterio del médico

o veterinario especialista.

Los compuestos de la presente invención, incluyendo los compuestos de fórmula 1 o 2, se pueden administrar en el contexto de una monoterapia o en tratamiento combinado con uno o más de otros agentes farmacéuticos. Por ejemplo, un compuesto de la presente invención o dos o más compuestos de la invención se pueden usar en combinación con uno o más fármacos inmunomoduladores y/o fármacos antinflamatorios para el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno inflamatorio, autoinmunitario y/o alérgico.

Una composición farmacéutica puede comprender dicho compuesto o compuestos, fármaco o fármacos inmunomoduladores y/o fármaco o fármacos antinflamatorios. El tratamiento combinado también puede incluir la administración de dos o más compuestos de la presente invención en ausencia de fármacos inmunomoduladores o fármacos antinflamatorios adicionales. También se prevé en el presente documento que el compuesto o compuestos, fármaco o fármacos inmunomoduladores y/o fármaco o fármacos antinflamatorios podrían estar vinculados, por ejemplo, mediante la formación de conjugados. En consecuencia, los compuestos, fármacos inmunomoduladores y/o fármacos antinflamatorios se pueden administrar a un sujeto simultáneamente. Además, una composición farmacéutica puede comprender solamente el compuesto o compuestos de la presente invención, mientras que el uno o más fármacos inmunomoduladores y/o fármacos antinflamatorios están comprendidos en una composición farmacéutica diferente. En ese caso, todavía puede ser posible administrar el compuesto o compuestos de la invención, los fármacos inmunomoduladores y/o los fármacos antinflamatorios simultáneamente; sin embargo, el compuesto o compuestos de la invención también se pueden administrar antes y/o después del uno o más fármacos inmunomoduladores y/o fármacos antinflamatorios. Es fácilmente evidente para un experto en la técnica el modo de administrar, por ejemplo, uno o más compuestos de la presente invención, uno o más fármacos inmunomoduladores, y/o uno o más fármacos antinflamatorios en el tratamiento combinado.

Se prevé que uno o más de los compuestos como se describe en el presente documento, en particular, los compuestos de fórmula 1 o 2, se pueden usar en combinación con uno o más fármacos inmunomoduladores y/o uno

o más fármacos antinflamatorios.

El uno o más fármacos inmunomoduladores incluyen, sin limitarse a los mismos: antimetabolitos, tales como, por ejemplo, azatioprina, ácido micofenólico, leflunomida, teriflunomida, o metotrexato; macrólidos, tales como, por ejemplo, tacrolimus, ciclosporina o pimecrolimus; inhibidores de IL-2, tales como, por ejemplo, abetimus o gusperimus; inhibidores de TNF-alfa, tales como, por ejemplo, talidomida o lenalidomida; antagonistas de receptores de IL-1 tales como, por ejemplo, anakinra; proteínas diana de mamíferos de rapamicina (mTOR), tales como, por ejemplo, sirolimus, deforolimus, everolimus, temsirolimus, zotarolimus, o A9 biolimus; anticuerpos monoclonales tales como, por ejemplo, eculizumab, infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, afelimomab, golimumab, mepolizumab, omalizumab, nerelimomab, faralimomab, elsilimomab, lebrikizumab, ustekinumab, muromonab-CD3, otelixizumab, teplizumab, visilizumab, clenoliximab, keliximab, zanolimumab, efalizumab, erlizumab, afutuzumab, ocrelizumab, pascolizumab, lumiliximab, teneliximab, toralizumab, aselizumab, galiximab, gavilimomab, ruplizumab, belimumab, ipilimumab, tremelimumab, bertilimumab, lerdelimumab, metelimumab, natalizumab, tocilizumab, odulimomab, basiliximab, daclizumab, inolimomab, zolimomab aritox, atorolimumab, cedelizumab, dorlixizumab, fontolizumab, gantenerumab, gomiliximab, maslimomab, morolimumab, pexelizumab, reslizumab, rovelizumab, siplizumab, talizumab, telimomab aritox, vapaliximab, o vepalimomab; anticuerpos policlonales tales como, por ejemplo, globulina antitimocitos o globulina antilinfocitos; o proteínas de fusión tales como, por ejemplo, abatacept, belatacept, etanercept, pegsunercept, aflibercept, alefacept, o rilonacept.

Además, el uno o más fármacos antinflamatorios incluyen, sin limitarse a los mismos: derivados de pirazolidina o butilpirazolidina tales como, por ejemplo, ampirona, clofezona, kebuzona, metamizol, mofebutazona, oxifenbutazona, fenazona, fenilbutazona, sulfinpirazona o feprazona; derivados de ácido acético tales como, por ejemplo, aceclofenaco, acemetacina, alclofenaco, bromfenaco, bumadizona, bufexamaco, diclofenaco, difenpiramida, etodolaco, fentiazaco, indometacina, ketorolaco, lonazolaco, oxametacina, proglumetacina, sulindaco, tolmetina, zomepiraco, o amfenaco; derivados de oxicam tales como, por ejemplo, ampiroxicam, droxicam, lornoxicam, meloxicam, piroxicam, o tenoxicam; derivados de ácido propiónico tales como, por ejemplo, alminoprofeno, benoxaprofeno, dexibuprofeno, dexketoprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, flunoxaprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, ibuproxam, indoprofeno, ketoprofeno, naproxeno, oxaprozina, pirprofeno, suprofeno, o ácido tiaprofénico; derivados

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mamífero; más preferentemente, el sujeto/paciente es un ser humano o un mamífero no humano (tal como, por ejemplo, una cobaya, un hámster, una rata, un ratón, un conejo, un perro, un gato, un caballo, un simio inferior, un simio superior, un tití, un babuíno, un gorila, un chimpancé, un orangután, un gibón, una oveja, ganado o un cerdo; y en particular un canino tal como un perro); aún más preferentemente, el sujeto/paciente es un ser humano.

La invención también se describe mediante las siguientes figuras ilustrativas. Las figuras adjuntas muestran:

Figura 1: Inhibición de la desgranulación de los mastocitos por los compuestos 1a (Fig. 1A), 1b (Fig. 1B), 1c (Fig. 1C), 1d (Fig. 1D) y miltefosina (Fig. 1E). Se muestran curvas de dosis-respuesta para la inhibición de la liberación de β-hexosaminidasa desde células RBL-2H3 estimuladas con IgE específica de antígeno y desencadenada con antígeno (medias ± error estándar de la media).

Figura 2: Inhibición de la fosforilación de Akt en Ser473 por el compuesto 1a. Se expresa el porcentaje de Akt total fosforilada en Ser473 como un porcentaje de las células no tratadas de control inducidas con IgE y antígeno durante 15 minutos (se muestran las medias ± desviación estándar).

Figura 3: Efecto del compuesto 1a y dexametasona sobre hinchazón en oreja de ratón en la respuesta DTH en ratones (los datos son medias ± desviaciones estándar de 8 ratones; * p <0,01 frente a control de vehículo (prueba a posteriori de Dunnett)).

Figura 4: Efecto del compuesto 1a sobre hinchazón en oreja de ratón en el modelo de dermatitis alérgica de contacto en ratones. La Fig. 4A muestra la comparación del estudio piloto de la actividad inhibidora, del compuesto 1a y miltefosina en diferentes momentos de administración antes de la exposición al antígeno (los datos son medias ± EEM de 7 ratones; * p <0,05, *** p <0,001 frente a control de vehículo (prueba a posteriori de Dunnett), § p <0,05 frente a control de vehículo (prueba de la t)). Las Fig. 4B y 4C muestran la comparación del estudio principal de la actividad inhibidora del compuesto 1a y corticoesteroides después de la aplicación sistémica (oral) (Fig. 4B) o aplicación tópica (Fig. 4C) (los datos son medias ± EEM de 7 ratones; ** p < 0,01, *** p <0,001 frente a control de vehículo (prueba a posteriori de Dunnett)). Las Fig. 4D y 4E muestran la reacción de los ganglios linfáticos locales, comparando el efecto del compuesto 1a y diflorasona tópica sobre el peso de los ganglios linfáticos locales (Fig 4D) y número de células (Fig 4E) (los datos son medias ± EEM de 7 ratones; ** p <0,01, *** p <0,001 frente a control de vehículo (prueba a posteriori de Dunnett)).

Figura 5: Efecto del compuesto 1a sobre artritis inducida por colágeno (AIC) tipo ll en ratones. La Fig. 5A muestra los efectos sobre la puntuación de la artritis durante el curso de AIC tipo II del compuesto 1a y dexametasona usando una pauta profiláctica (los datos son medias de 10-11 ratones; * p <0,02, ** p <0,01, *** p <0,001 frente a control de vehículo (prueba de la t)). La Fig. 5B muestra los efectos sobre los cambios en el peso corporal durante el curso de AIC tipo II del compuesto 1a y dexametasona usando una pauta profiláctica (los datos son medias de 10-11 ratones; * p <0,02, ** p <0,01, *** p <0,001 frente a control de vehículo (prueba de la t)). La Fig. 5C muestra los efectos sobre la puntuación de la artritis durante el curso de AIC tipo II del compuesto 1a usando una pauta terapéutica (los datos son medias de 11 ratones). La Fig. 5D muestra los efectos sobre el peso del bazo y el timo durante el curso de AIC tipo II del compuesto 1a y dexametasona utilizando una pauta profiláctica (los datos son medias de 10-11 ratones; * p <0,05, *** p <0,001 frente a control de vehículo (prueba de la t)).

La invención se describirá ahora por referencia a los siguientes ejemplos que son meramente ilustrativos y no se deben interpretar como una limitación del alcance de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de cloruro de N-(2-(dimetil(tetradecil)amonio)acetil)-N-metil-D-glucamina 1a

Se agita una mezcla de acetato de 2-(dimetil(tetradecil)amonio) (449 mg, 1,5 mmol), HBTU (569 mg, 1,5 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (DIEA) (279 µl, 1,6 mmol) en una mezcla de dimetilformamida (DMF) seca (10 ml) y diclorometano (5 ml), durante 5 min a temperatura ambiente en una atmósfera de argón. Se añade N-metil-D-glucamina (351 mg, 1,8 mmol) sólida y la agitación se continuó durante otras 3 h. La mezcla de reacción se concentra a presión reducida hasta sequedad, se recoge en una mezcla de tetrahidrofurano y etanol y se purificó por HPLC preparativa para producir 375 mg (42 %) de 1a como sal trifluoroacetato. Después, se realiza intercambio iónico en el modo discontinuo usando una resina de tipo (P)-NMe3+ en forma de cloruro y etanol/agua como disolvente. La mezcla disolvente se elimina a presión reducida y el residuo se seca al vacío para proporcionar 1a como la sal de cloruro correspondiente.

ESI-EM, Positivo: 477,4 (M)+, 989,2 (2M+CI)+. Negativo 547,5 (M+2CI), 1059,2 (2M+3CI).

RMN de 1H (600 MHz, DMSO-d6): δ = 0,84 (t, J = 7,1, 3H), 1,18-1,30 (m, 22H), 1,64 (m, 2H), 2,87 (s, 2,1 H), 3,00 (s, 0,9H), [3,19 (s), 3,19 (d, J = 1,7), 3,20 (s), Σ = 6H], 3,24 (d/d, J = 15,0/3,0, 0,8H), 3,45-3,63 (me, 8,4 H), 3,80 (m, 1H), [4,36-4,43 (me), 4,46 (d, J = 7,2), 4,49 (s), Σ = 3,6H], [4,56 (d), 4,58 (t, J = 6,5), Σ = 1,7H ], 4,63 (d, J = 5,5, 0,7H), 4,80 (d, J = 5,1, 0,3H), 5,15 (d, J = 5,4, 0,7H). (el análisis de RMN se complica por la naturaleza compleja del espectro y la rotación impedida alrededor del enlace amida.)

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Materiales y procedimientos

Materiales

Productos químicos El anticuerpo monoclonal IgE de rata anti-DNP se adquirió de Biozol (BZL06936), la albúmina de suero humano conjugada con dinitrofenilo (A6661) y el Triton X-100 (T9284) eran de Sigma-Aldrich, la 4-metilumbeliferil-N-acetil-β-D-glucosaminida (474502), el forbol-12-miristato-13-acetato (524400) y la tapsigargina (586005) de Calbiochem. La ionomicina (ALX-450-006) se adquirió de Alexis Biochemicals. El DMSO era de Merck (1.02950.0500) o Sigma-Aldrich (D2650). Los medios de cultivo celular y suplementos, medio esencial mínimo (21090-022), medio esencial mínimo sin rojo fenol (51200-046), medio RPMI 1640 (31870-025), L-glutamina (25030-024) y tripsina al 0,05 %-EDTA (25300-054), se obtuvieron de Invitrogen. El suero bovino fetal (A15-151) era de PAA Laboratories. Otros reactivos eran de calidad de laboratorio convencional o mejores.

Tampones y soluciones: la solución salina tamponada con fosfato (PBS) y HEPES 1 M se proporcionaron por la propia instalación de servicios. El tampón de Tyrode (TYB) consistía en medio esencial mínimo sin rojo fenol suplementado con L-glutamina 2 mM y HEPES 20 mM. El tampón de lisis consistía en Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM y Triton X-100 al 0,1 % (p/v). Se disolvió DNP-HSA hasta 1 mg/ml en agua. La solución de sustrato MUG consistía en 4-metilumbeliferil-N-acetil-PD-glucosaminida 2,5 mM en citrato 0,05 M, pH 4,5; la solución de parada era NaHCO3 0,1 M/Na2CO3 0,1 M, pH 10.

Equipo y materiales fungibles: Para los procedimientos de manipulación de líquidos de pequeño volumen, se usaron de forma rutinaria pipetas electrónicas Rainin LTS (Mettler-Toledo). Las placas de 24 pocillos Costar-Corning (3337) se centrifugaron en una centrífuga Eppendorf 5804 R. Se usó una incubadora de sobremesa Heraeus B15 para incubaciones a 37 ºC en condiciones no estériles. Se midió la fluorescencia en placas negras Nunc de 96 pocillos (237105) usando un lector de microplaca (Tecan Safire) o lector de placa multi-modo FlexStation 3 (Molecular Devices). Las células se mantuvieron en incubadoras de CO2 Hera Cell 240 (Thermo Scientific). Las pipetas serológicas (4487, 4488 y 4489) y frascos de cultivo celular (431080) eran de Corning-Costar, los tubos de microcentrífuga de 1,5 y 2 ml (0030 120.086 y 0030 120.094 ) eran de Eppendorf.

Cultivo celular: Las células RBL-2H3 obtenidas de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (ACC312) (Braunschweig, Alemania) se mantuvieron en medio esencial mínimo al 70 % con sales de Earle, RPMI 1640 al 20 %, FBS al 10 % y L-glutamina 2 mM en 95 % de aire/5 % de CO2 a 37 ºC y se comprobaron rutinariamente para contaminación por micoplasma. Las células se pasaron cada 3-4 días; después de lavar las células una vez con 35 ml de PBS, las células se incubaron 8 min con 5 ml de solución de tripsina al 0,05 %-EDTA a 37 ºC. Las células se retiraron de la incubadora, se añadieron 15 ml de medio de cultivo y las células se resuspendieron mediante pipeteo repetido.

Siembra de células: las células se recogieron con tripsina-EDTA como se describe y se sembraron 50-100 μl de suspensión de células en placas de agrupación de 24 pocillos Costar Cellbind (n.º 3337). Las placas se mantuvieron durante 30 min a TA en la campana estéril antes de transferirse a la incubadora. Las células se usaron en uno o dos días después de la siembra.

Medición de la liberación de β-hexosaminidasa

Procedimientos experimentales

Para la sensibilización, las células para su uso inmediato se sensibilizaron 6-12 h después de la siembra; las células para su uso al día siguiente se sensibilizaron 26-38 h después de la siembra. Las placas de cultivo se retiraron de la incubadora y se comprobaron para el crecimiento celular y la contaminación. El medio se desechó y las células se sensibilizaron con IgE anti-DNP (0,4 µg/ml) en 0,4 ml de medio de cultivo durante la noche. Después de la sensibilización durante la noche, las células se lavaron con 0,8 ml de TyB precalentado y se añadieron 0,38 ml de compuesto de ensayo o control de vehículo (suplementado o no con FBS al 1 %) a pocillos duplicados. Las muestras se ajustaron para que contuvieran vehículo al 1 % para los compuestos de ensayo disueltos en disolventes orgánicos. Se incubaron las células durante 1 h a 37 ºC. Al final del período de incubación, las células se estimularon de forma rutinaria con 20 µl de DNP-HSA (2 µg/ml; concentración final 0,1 mg/ml) diluido en TyB y las células se incubaron durante 15 min a 37 ºC. De forma alternativa, las células se estimularon con 20 µl de ionomicina 5 µM (concentración final 0,25 µM) o 20 µl de tapsigargina 5 µM (concentración final 0,25 µM), tanto en ausencia como en presencia de PMA 20 nM (concentración final).

Las placas se retiraron de la incubadora y se centrifugaron inmediatamente a 4 ºC durante 5 min a 250 xg y se transfirieron a un baño de hielo. Se transfirieron alícuotas de los sobrenadantes, 25 µl, a placas de 96 pocillos. El sobrenadante restante se aspiró de los pocillos de control y las células se lisaron en 400 µl de tampón de lisis durante 5 min a TA en un agitador orbital a 450 rpm en condiciones no estériles. Después de la lisis, se transfirieron alícuotas de 25 µl de lisados a placas de 96 pocillos.

Se añadió solución de sustrato MUG, 100 μl, al sobrenadante y las muestras de lisado y las placas se incubaron 30 min a 37 ºC. La reacción se terminó mediante la adición de 150 μl de solución de parada. Se midió la fluorescencia a longitudes de onda de 365 nm de excitación y de 440 nm de emisión.

Preparación del compuesto de ensayo: los compuestos de ensayo se prepararon en tubos de microcentrífuga de 1,5

o 2 ml y se incubaron durante 30 min a 37 ºC en un Thermomixer Comfort con agitación (750 rpm). Se usó una pipeta multicanal electrónica para la transferencia rápida de diluciones del compuesto desde tubos de microcentrífuga a las células.

5 Controles: los controles usados se definen del siguiente modo: control negativo, se midió el sobrenadante de células no estimuladas de liberación inespecífica de β-hexosaminidasa; control positivo, se midió el sobrenadante de células estimuladas con DNP-HSA para la liberación específica, estimulada por antígeno, de β-hexosaminidasa; control de máximo, se midió el lisado de células no estimuladas para el contenido total de β-hexosaminidasa.

Evaluación del efecto farmacológico

10 Desgranulación (liberación de β-hexosaminidasa): La desgranulación se calculó como el porcentaje de β-hexosaminidasa liberada con respecto a un control de máximo (β-hexosaminidasa total) después de la sustracción de control negativo (liberación no específica) usando la fórmula;

% de desgranulación = 100 * (compuesto de ensayo -control negativo) / (control de máximo -control negativo).

Inhibición de la desgranulación (inhibición de la liberación de β-hexosaminidasa): La inhibición de la desgranulación

15 se calculó como el porcentaje de reducción de la liberación de β-hexosaminidasa con respecto al control positivo (liberación estimulada por antígeno) después de sustraer el control negativo (liberación inespecífica) usando la fórmula;

% de inhibición = 100 * (1 -(compuesto de ensayo -control negativo) / (control positivo -control negativo)).

Medición de la concentración máxima tolerada

20 La concentración máxima tolerada (MTC), es decir, la concentración más alta de compuesto de ensayo que no causa citotoxicidad, que se determina por la liberación de lactato deshidrogenasa, se midió sobre intervalo de concentración ensayado. Se usó una prueba de citotoxicidad disponible comercialmente (Promega Cytotox-One n.º cat. 67891).

El índice de seguridad (SI) de un compuesto de ensayo es la proporción entre la concentración máxima tolerada y la CI50 y se usa como una medida de la seguridad relativa del compuesto de ensayo.

25 Resultados

Se determinó la inhibición dependiente de la concentración de la desgranulación para todos los compuestos de ensayo sobre un intervalo de concentración, como se muestra en la Figura 1, y los valores de CI50 (concentración a la que se alcanza el 50 % de inhibición máxima) para cada compuesto junto con los valores MTC sobre el mismo intervalo de concentración (Tabla 1). Los resultados se recogen de al menos tres experimentos independientes.

30 Tabla 1. Inhibición de la desgranulación: Valores de CI50, MTC y SI

Compuesto

CI50 (µM) MTC (µM) SI

1a

3,8 150 39,5

1b

4,9 50 10,2

1c

12,3, 100 8,1

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3,1 75 24,2

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La MTC de los compuestos de ensayo fue hasta 8-40 veces mayor que sus respectivas CI50 y, por tanto, la inhibición de la desgranulación se puede atribuir a un efecto farmacológico y no a un efecto secundario a la citotoxicidad.

Todas las sustancias descritas en la Tabla 1 muestran los valores de CI50 en el intervalo micromolar bajo combinados con altos valores de MTC cuando se comparan con miltefosina. Por tanto, los compuestos de acuerdo con la invención y, en particular los compuestos 1a a 1d, tienen un citotoxicidad ventajosamente baja. Un compuesto particularmente preferente de la presente invención es el compuesto 1A, que tiene una CI50 muy baja y un alto valor de MTC, que proporciona un alta ventana terapéutica (índice de seguridad).

La desgranulación de mastocitos es un evento celular clave en reacciones alérgicas e inflamatorias, en particular en eventos patológicos que involucran la liberación de mediadores tales como histamina, leucotrienos y prostaglandinas, así como proteasas. Como consecuencia, la inhibición de la desgranulación de mastocitos es una estrategia valiosa para la prevención o tratamiento de procesos patológicos que afectan a los mediadores mencionados anteriormente. Además, el ensayo de desgranulación de mastocitos proporciona una estimación de la actividad de los compuestos de ensayo en otras células que desempeñan un papel clave en la respuesta inflamatoria, tales como granulocitos, macrófagos y timocitos, que liberan citocinas y quimiocinas proinflamatorias y proteasas que erosionan el tejido.

Ejemplo 6: Inhibición de la activación de Akt cinasa.

Introducción

También se usó el ensayo de desgranulación de mastocitos usando la línea celular RBL-2H3 (véase el ejemplo 5) para determinar el estado del eje PI3K/Akt. La activación de PI3K conduce a la producción de PIP3 en el lado citosólico de la bicapa lipídica. Akt se recluta en el dominio PIP3 y posteriormente se activa por fosforilación en los residuos Ser473 y Thr308. (Franke et al., Cell 81: 727-736, (1995)). Una vez reclutados a la membrana, se fosforilan y activan por otras cinasas (Hemmings, Science 275: 628-630 (1997); Hemmings, Science 276: 534 (1997); Downward, Science 279: 673-674 (1998); Alessi et al., EMBO J. 15: 6541-6551 (1996)). La transferencia de Western del residuo Ser473 fosforilado en Akt (fosfo-Akt Ser473) se usa ampliamente para evaluar el nivel de activación del eje PI3K/Akt.

Materiales y procedimientos

Materiales

Todos los tampones y soluciones usados para el ensayo de fosfo-Akt Ser473 eran de Meso Scale Discovery. El tampón de lisis Tris consistía en NaCl 150 mM, Tris 20 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM y Triton-X-100 al 1 %. Se preparó tampón de lisis Tris completo antes de su uso mediante la adición de inhibidor de proteasa, inhibidores de fosfatasa y PMSF. El tampón de lavado Tris 10x consistía en Tris 500 mM, pH 7,5, NaCl 1,5 M y Tween-20 al 0,2 %. El bloqueador A se compone de albúmina de suero bovino en tampón de lavado Tris. Se usó tampón de lectura T de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los kits de lisado de células completas usados fueron fosfo-Akt Ser473 (K11100D, Lote K0011749) y ERK1/2 (K11107D, Lote K0011698) como control de carga.

Equipo

Se usaron pipetas multicanal de 12 pocillos (30-300 µl) de Eppendorf. Las placas de ensayo se agitaron en un control TiMix 5 (Edmund Buhler). La detección de electroquimioluminiscencia se realizó en un SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery).

Medición de la fosfo-Akt Ser473

Procedimientos experimentales

Ensayo de proteínas: la concentración de proteínas se determinó usando el kit de ensayo de proteínas de BCA (ácido bicinconínico) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, se incubaron muestras duplicadas de 10 µl de patrones de albúmina de suero bovino (BSA), el blanco y lisados en una placa de 96 pocillos con 0,2 ml de reactivo de trabajo durante 30 min a 37 ºC. Las placas se enfriaron hasta temperatura ambiente durante 5 min y se midió la absorbancia a 562 nm en un lector de placa multi-modo. Las concentraciones de proteínas se calcularon usando el software FlexStation 3 (SoftMax Pro versión 5.3). La concentración de proteínas de los lisados se determinó a partir de una curva de patrón (BSA) usando un ajuste de curva lineal.

Ensayo de fosfoproteína: se determinó la fosforilación de proteínas usando el sistema de ensayo MULTI-SPOT® (Meso Scale Discovery), proporcionando detección simultánea de proteínas fosforiladas y totales. En pocas palabras, los anticuerpos de captura contra la proteína fosforilada y total forman patrones en puntos distintos en el mismo

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Materiales

La ovoalbúmina (fracción V, polvo liofilizado), el adyuvante completo de Freund (ACF) y la metilcelulosa se obtuvieron de Sigma-Aldrich, la dexametasona de Pharmaceutical Works Polfa (Pabianice, Polonia).

Animales

Se criaron ratones BALB/cJW hembra en la Universidad de Lodz, Lodz, Polonia y se alojaron en grupos de 8 en jaulas Makrolon con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. A los ratones se les dio acceso libre a la comida (Agropol S.j., Motycz, Polonia) y el agua.

Sensibilización a antígeno y exposición

El tamaño del grupo fue n = 8 ratones a menos que se establezca de otro modo. El compuesto de ensayo estaba recién preparado antes de la administración.

Sensibilización: El antígeno proteico, ovoalbúmina, se reconstituyó en PBS a 4 mg/ml. Se preparó una emulsión de ovoalbúmina-ACF mezclando la solución de proteína con la suspensión ACF en una proporción de 1:1, utilizando dos jeringas Luer-Lock. La emulsión se sometió a prueba poniendo una gota de emulsión en PBS; si la emulsión se mantenía como una gotita apretada en el PBS, la emulsión se consideraba lista. Los ratones se sensibilizaron por inyección subcutánea de 25 µl de emulsión en cada lado de la cola (100 µg de ovoalbúmina por ratón).

Exposición: En el sexto día después de la sensibilización, se provocó DTH exponiendo los animales por vía subcutánea (aguja de calibre 30, B. Braun Melsungen, Melsungen, Alemania) en la oreja izquierda con 10 µl de una suspensión al 1 % de ovoalbúmina agregada por calor (HOVA) (100 µg de ovoalbúmina por ratón). A la oreja derecha se le administró por vía subcutánea PBS y sirvió para determinar las diferencias individuales en grosores de oreja. Se preparó HOVA calentando una solución al 5 % de ovoalbúmina en solución salina durante 1 hora a 80 ºC con agitación ocasional. Después de enfriar hasta temperatura ambiente y centrifugación (400 g, 10 min a 4 ºC), el sedimento se lavó dos veces con solución salina, se resuspendió al 2 % en PBS y las alícuotas se almacenaron a -30 ºC. Antes de la inyección, se diluyó la HOVA con un volumen igual de PBS y se sonicó. Se midió el grosor de la oreja con un calibre cargado por resorte (Art. n.º 7309, Mitutoyo, Kawasaki, Japón) antes de la exposición y 24 horas después de la exposición.

La sensibilización, la exposición y la medición del grosor de la oreja se realizaron bajo anestesia (ketamina 80 mg/kg más xilazina 8 mg/kg, por vía intraperitoneal).

Administración del compuesto

Los efectos antinflamatorios del compuesto 1a se compararon con un control de vehículo (solución de metilcelulosa al 0,5%) y con el fármaco de referencia, dexametasona. El compuesto de ensayo se administró a 25 o 100 mg/kg por vía oral mediante sonda nasogástrica (Art. n.º 432093, Harvard Apparatus GmbH, March-Hugstetten, Alemania) 16 h y 3 h antes de la sensibilización y luego dos veces al día con la dosis final administrada 3 h antes de la exposición en la oreja (un total de 14 administraciones). La dexametasona se administró a 0,1 o 1 mg/kg por vía oral mediante sonda nasogástrica 3 h antes de la sensibilización y una vez al día con la dosis final administrada 3 h antes de la exposición al antígeno (un total de 7 administraciones): Todas las administraciones se dan en un volumen de 10 ml/kg.

Cuantificación de los resultados del ensayo

Para tener en cuenta la variabilidad individual, se sustrajo el aumento del grosor de la oreja derecha, antes y 24 h después de la administración de PBS, del aumento inducido por HOVA en el grosor de la oreja izquierda. El aumento en el grosor de la oreja se calculó por la diferencia entre el grosor de la oreja antes y 24 h después de la exposición al antígeno. El porcentaje de inhibición de la hinchazón de la oreja se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:

% de inhibición — 100x (IETvehículo–lETcompuesto)/IETvehículo

en la que IET = (ET24 h pc-ETantes de la dosis)orejas tratadas con HOVA (ET24 h pc ETantes de la dosis)orejas tratadas con PBS

(IET, aumento en el grosor de la oreja; ET, grosor de la oreja; PC, después de la exposición)

Evaluación estadística

La media y la desviación estándar (DE) se calcularon a partir de valores individuales de edema en la oreja. La evaluación estadística fue un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con prueba a posteriori de Dunnett o prueba de la t de Student según los apropiado.

Resultados

La supresión de la hinchazón de la oreja de ratón por el compuesto 1a, así como por dexametasona, en comparación con el control de vehículo se muestra en la Figura 3. La Tabla 3 resume la inhibición de DTH para el compuesto 1a.

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atópica, y los productos farmacéuticos clínicamente relevantes, tales como los corticoesteroides, los inhibidores de calcineurina y los inhibidores de PDE4, son eficaces en este modelo.

Materiales y procedimientos

Materiales

El dihidrogenofosfato de dexametasona (Dexa-lnject) se obtuvo de Mibe GmbH, Jena, Alemania y el diacetato de diflorasona de Basotherm, Biberach an der Riss, Alemania

Animales

Se obtuvieron ratones BALB/c hembra de Charles River (Sulzfeld, Alemania) a la edad de 8 semanas. Todos los animales se alojaron en grupos de ocho por jaula a 22 ºC con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. El agua y una dieta convencional (Altromin, Lage/Lippe, Alemania) estaban disponibles ad libitum. Todos los animales se aclimataron durante una semana antes de que se iniciaran los procedimientos experimentales.

Sensibilización con TDI, exposición al alérgeno y prueba de hinchazón de la oreja de ratón

Los procedimientos experimentales para los ratones BALB/c alojados, la sensibilización y exposición a TDI, y la medición del grosor de la oreja se realizaron como se describió previamente (Baumer et al., J Pharm Pharmacol. 55: 1107-1114 (2003)) con las siguientes modificaciones. Para la sensibilización activa, se administraron 100 µl de TDI al 5 % (p/v) a la epidermis abdominal afeitada y pelada en el día uno, y durante los siguientes tres días consecutivos, se aplicaron 50 µl de TDI al 5 % (p/v). La reacción alérgica se reforzó 21 días después mediante la aplicación de 50 μl de TDI al 5 % (p/v). Para el examen de los efectos del compuesto de ensayo, se usó la oreja izquierda para la exposición a TDI (20 μl de un 0,5 % en acetona) y el grosor de la oreja se midió 3 horas antes y 24 horas después de la exposición.

Administración del compuesto para tratamiento sistémico

El tamaño del grupo fue n = 7 ratones a menos que se establezca de otro modo. El compuesto de ensayo estaba recién preparado antes de la administración.

Tiempo de administración: para determinar el tiempo óptimo para la administración, los grupos de tratamiento se trataron por vía oral mediante sonda nasogástrica con 100 mg/kg del compuesto 1a (suspendido en tilosa al 0,5 %, 10 ml/kg) 1, 4 o 16 h antes de la exposición tópica a TDI. Un grupo se trató con 100 mg/kg de miltefosina por vía oral, 16 h antes de la exposición (basándose en los datos disponibles para el tiempo óptimo de administración para miltefosina) y los ratones tratados con vehículo recibieron tilosa (10 ml/kg) por vía oral, 4 h antes de la exposición.

Comparación con dexametasona: un grupo de ratones se trató por vía oral con el compuesto 1a a 100 mg/kg suspendido en tilosa al 0,5 %, 4 h antes de la exposición tópica a TDI. Los ratones tratados con vehículo recibieron tilosa al 0,5 % por vía oral 4 horas antes de la exposición. Como control positivo, se administró dexametasona en solución salina a 1 mg/kg o 3 mg/kg, 2 h y 30 min antes de la exposición y 1 h después de la exposición. La dosis y el esquema de dosificación de dexametasona se basaba en la experiencia previa que muestra un efecto máximo en este modelo.

Administración del compuesto para tratamiento tópico

El compuesto 1a se administró a dos grupos de ratones por vía tópica en 20 µl de una solución al 2 % o 6 % en propilenglicol. Se aplicó la solución, 2 h antes de la exposición tópica a TDI mediante la administración de 10 µl en cada una de las superficies interior y exterior de la oreja izquierda. Un grupo de vehículo (n = 5) se trató con propilenglicol. Como control positivo, se administró diacetato de diflorasona al 0,01 % (dosis baja) y al 0,05 % (dosis alta) en 20 µl de acetona, 2 h antes de la exposición. Un grupo de control basal se dejó sin tratar.

Determinación del peso de los ganglios linfáticos locales y recuento de células

Directamente después del sacrificio, se preparó el ganglio linfático de drenaje del oído (Ln. auricularis) y se extirpó. Se determinó el peso de los órganos por medio de una balanza analítica (Kern, Balingen, Alemania). Se prepararon suspensiones de células individuales por medio de un Potter de vidrio (WVR, Darmstadt, Alemania) y las células se contaron con un hemocitómetro (Neubauer, VWR, Alemania).

Evaluación estadística

La media y el error estándar de la media (EEM) se calcularon a partir de valores individuales de edema en la oreja. La evaluación estadística fue un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) (si se ha pasado la prueba para la distribución normal) o el ANOVA unidireccional de Kruskal-Wallis sobre los rangos (si no se ha pasado la prueba de distribución normal). Ambos fueron seguidos por una prueba a posteriori (procedimiento de Dunnett o prueba de Dunn, respectivamente). Un p <0,05 se consideró significativo.

Resultados

La supresión de la hinchazón de oreja de ratón por el compuesto 1a después de administración oral, en comparación con el control de vehículo se muestra en la Figura 4A. La Tabla 4 resume la inhibición de la respuesta de dermatitis alérgica de contacto por el compuesto 1a.

Tabla 4. Efecto del compuesto 1a administrado por vía oral sobre la hinchazón de la oreja en la respuesta de dermatitis alérgica de contacto en ratones.

Compuesto

Inhibición de la hinchazón en orejade ratón

Tiempo de administración (oral)

1a, 100 mg/kg, 1 h

43,5*

1a, 100 mg/kg, 4 h

62,9***

1a, 100 mg/kg, 16 h

43,5§

Miltefosina, 100 mg/kg, 16 h

47,3§

Comparación con dexametasona (oral)

1a, 100 mg/kg

32,0**

Dexametasona, 1 mg/kg

78,6***

Dexametasona, 3 mg/kg

87,1***

*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 frente a control de vehículo (prueba a posteriori de Dunnett) en comparación con el vehículo, §p <0,05 frente a control de vehículo (prueba de la t)

10 En el estudio del tiempo de administración con administración oral, el compuesto 1a redujo la hinchazón de la oreja significativamente (63 % del control de vehículo) cuando se administraba 4 h antes de la exposición, como también se muestra en la Figura 4A. La miltefosina ha demostrado previamente ser eficaz al máximo después de administración oral cuando se da 16 h antes de la exposición y también en este estudio redujo significativamente la hinchazón de la oreja (47 % del control de vehículo). Sin embargo, la miltefosina no fue tan eficaz al máximo como el compuesto 1a en

15 su tiempo óptimo de administración de 4 h, alcanzando solamente un 75 % de la eficacia inhibidora de 1a.

En la comparación con dexametasona, el compuesto 1a administrado 4 h antes de la exposición redujo la hinchazón de la oreja significativamente (32 %) a 100 mg/kg, como se muestra en la Figura 4B. En comparación, la dexametasona administrada por vía oral a dosis de 1 y 3 mg/kg inhibió la hinchazón de la oreja en un 78 y 87 %, respectivamente. Como se analizó en el ejemplo 7 para la respuesta DTH, dichas dosis altas (sobredosis) de

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Los datos demuestran que el compuesto 1a a 25 o 100 mg/kg ejercía notables efectos antinflamatorios en la AIC tipo II murina, lo que conduce a una reducción significativa de los parámetros clínicos asociados al desarrollo de la enfermedad. A la dosis clínicamente más eficaz de 25 mg/kg, el compuesto 1a no mostró ningún efecto tóxico, mientras que la dexametasona provocó una pérdida significativa en el peso corporal y los pesos de bazo y timo. Estos resultados sugieren que los compuestos de la presente invención, incluyendo el compuesto 1a, son particularmente eficaces y, por tanto, útiles para la intervención médica en artritis reumatoide.

Claims (1)

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