ES2581738T3 - Método para recolectar células madre de sangre placentaria de cordón umbilical - Google Patents

Abstract

Un método de recoger células madre hematopoyéticas de sangre de cordón, que comprende: proporcionar una placenta de mamífero no exanguinada aislada, que comprende sangre del cordón que comprende células madre hematopoyéticas de sangre de cordón; realizar perfusión pulsátil en máquina de la placenta de mamífero aislada no exanguinada con un flujo pulsátil mediado por presión de una solución de perfusión para producir un líquido de perfusión que comprende sangre de cordón que comprende células madre hematopoyéticas de sangre de cordón; recoger el líquido de perfusión; y aislar las células madre hematopoyéticas de sangre de cordón del líquido de perfusión para producir células madre hematopoyéticas de sangre de cordón aislado.

Description

2 DESCRIPCIÓN Métodos para recolectar células madre de sangre placentaria de cordón umbilical. Campo de la invención 5 La presente materia objeto se refiere a un método eficiente para recolectar células madre hematopoyéticas de sangre placentaria del cordón umbilical. Antecedentes de la invención 10 1. Campo de la invención La presente materia objeto se refiere a la recolección de células madre de la placenta detallando un nuevo método que es clínicamente viable, cómodo y altamente eficiente. 15 En particular, la presente materia objeto describe un nuevo hallazgo de que las células de sangre placentaria de cordón umbilical residuales recogidas por perfusión pulsátil automática están más enriquecidas con fenotipos de células madre hematopoyéticas primitivas en comparación con las extraídas con jeringa/aguja convencional o la recolección mediante drenaje por gravedad y permite que las células sanguíneas de 20 cordón umbilical se usen para fines de medicina regenerativa. El aumento del número de células madre obtenidas de una sola placenta usando el método descrito también puede mejorar los resultados del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y obviar el uso de injertos dobles o triples de sangre de cordón umbilical de diferentes donantes con el fin de compensar las células madre insuficientes a partir de un injerto de 25 un solo donante. 2. Descripción de la técnica anterior Método de recolección de sangre de cordón umbilical y trasplante de sangre del cordón 30 umbilical en adultos Las células de SC son una fuente prometedora de CMH para llevar a cabo el trasplante alogénico de CMH para las neoplasias malignas hematológicas y el síndrome de insuficiencia de la médula ósea (Kurtzberg et al., 1996; Wagner et al., 1996; Gluckman et 35 al., 1997; Rubinstein et al., 1998). Entre las importantes ventajas se incluyen un rápido acceso a las células de se. que se almacenan en los bancos de se en todo el país, y la aceptación de 1-2 injertos mal apareados del antígeno leucocitario humano debido a la escasa frecuencia grave de la enfermedad del injerto contra huésped (EICH) en comparación con los injertos de donantes no relacionados apareados (Barker et al., 40 2002). Las células de SC permiten a los pacientes elegir un trasplante alogénico como una opción curativa de las neoplasias malignas hematológicas, en las que, de otro modo, no hay donantes apareados adecuados, en particular entre los pacientes de los grupos minoritarios. A pesar de las ventajas anteriores, el uso de SC está limitado en los adultos debido a un número insuficiente de células, incluyendo las células CD34+ y progenitoras. 45 El trasplante de SC usando niveles bajos de recuento total de células nucleadas conduce a importantes retrasos en el prendimiento tras el trasplante de neutrófilos y plaquetas o fallos del injerto (Wagner et al., 2002; Laughlin et al., 2004). Los procedimientos conocidos para la recolección de se incluyen el drenaje de la sangre por gravedad de la placenta expulsada y el drenaje de la sangre por punción venosa en bolsas o jeringas de 50 recogida. 3 Dado que los suministros de SC son apenas suficientes para un solo uso o, más recientemente, el uso de suministros dobles de se de dos donantes no idénticos, los trasplantes de se en adultos se han llevado a cabo en general bajo investigación clínica solo cuando donantes no relacionados adecuados no están disponibles. En la práctica, una recuperación de solo el 20-40 ml no es inusual y estas células de SC, por tanto, ni 5 siquiera se usan o almacenan (Lasky et al., 2002; George et al., 2006). En tales casos, una cantidad significativa de células de SC no recolectadas aún permanecen en la placenta y se descartan ya que no hay método suplementario estandarizado que pueda recogerlas después de la cosecha inicial para complementarlo. Para expandir el futuro grupo de donantes para el banco de se. es importante investigar los métodos de 10 recolección de se mejorados, incluyendo cómo recolectar las células de SC residuales que quedan después de la cosecha de SC convencional (Harris et al., 1994). Más importante, la disponibilidad de una mayor cantidad de células de se de la misma placenta puede permitir el almacenamiento de una cantidad de células de SC suficiente para múltiples usos, incluyendo una copia de seguridad o la ingeniería de injerto como 15 una expansión e inmunoterapia adoptiva ex vivo. Conocimientos actuales de plasticidad de las CMH y regeneración de los tejidos Durante la última década, en seres humanos se han identificado muchos tipos de células 20 madre que tienen la capacidad de replicarse, autorenovarse y diferenciarse. Las células madre totipotenciales son capaces de formar todos los tipos de células del cuerpo y estas células están dentro del embrión temprano y son las denominadas células madre embrionarias humanas. Las células madre pluripotenciales son capaces de desarrollarse en el endodermo, el mesodermo o el ectodermo. Las células madre específicas de tejido 25 están comprometidas a la formación de ciertos tejidos únicamente. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (CMH) son responsables de todos los tipos de células sanguíneas pero no de otros tipos de tejido y su presencia continuada en un adulto permite la capacidad de reparación. Sin embargo, los investigadores han descubierto que células como las CMH adultas que se consideraron responsables de la producción de 30 diferentes tipos de células progenitoras hematopoyéticas incluso daban lugar a células del tejido u órgano diferentes, tales como las células neuronales o células musculares. Los estudios de investigación sobre la transdiferenciación de las CMH adultas siguen siendo investigaciones polémicas y activas y están en marcha. En contraste, se han 35 notificado un número de casos clínicos de los signos de generación de células no hematopoyéticas después de un trasplante de MO o de un trasplante cardíaco. Un estudio retrospectivo para buscar transdiferenciación de la MO en el cerebro después de un trasplante de MO mostró pruebas de neuropoyesis, detección de astrocitos y microglía en un escenario a largo plazo sin fusión celular (Cogle et al., 2004). Otros informes han 40 señalado la detección de células del donante en osteoblastos, hepatocitos, epitelio del tracto gastrointestinal (GI), estroma después del trasplante de MO; queratinocitos/ hepatocitos/tracto Gl/epitelios de la piel después del trasplante de células madre de sangre periférica; y cardiomiocitos con y sin endotelio después del trasplante cardiaco con una amplia gama de cantidades en porcentaje (Hruban et al., 1993; Theise et al., 45 2000; Korbling et al., 2002; Muller et al., 2002; Okamoto et al., 2002; Quaini et al., 2002). Células de sangre de cordón umbilical como fuente de células madre adultas Aunque las células ME humanas pueden diferenciarse y expandirse in vitro para producir 50 diferentes tipos de progenitores, su aplicación en los pacientes está frenada actualmente 4 por múltiples cuestiones éticas. Además, el tema de la pureza de las células progenitoras derivadas de células madre embrionarias tiene que resolverse. Por el contrario, se encontró que las poblaciones de células madre adultas derivadas de tejidos hematopoyéticos, incluyendo la médula ósea y las células de SC del cordón umbilical podían diferenciarse en el ectodermo o el endodermo tras la exposición a los estímulos 5 adecuados (Eglitis y Mezey, 1997; Brazelton et al., 2000; Mezey et al., 2000; Sanchez-Ramos et al., 2001 ; Chen et al., 2005). En particular, las células madre derivadas de SC tienen otras ventajas en comparación con las otras fuentes, ya que se obtienen de la placenta, que normalmente se desecha, por lo que no se produce daño tisular al huésped con la recogida de las células. En comparación con las células de la MO, las del SC 10 tienen una ontogenia primitiva con el estado inmune intacto y longitud de los telómeros relativamente acortada. Entre los debates sobre si existen las células madre somáticas verdaderamente pluripotenciales, las células derivadas de la SC y la placenta han atraído cada vez más la 15 atención en cuanto a que contienen propiedades interesantes para la potencial explotación clínica. Recientemente, se ha demostrado que la SC contiene una población celular heterogénea y se ha reconocido como una fuente de células madre pluripotenciales (Goodwin et al., 2001; Sanchez-Ramos et al., 2001; Bicknese et al., 2002; Sanchez-Ramos, 2002; Zigova et al., 2002). Otros informaron de que la población 20 de células adherentes aislada de un cultivo en suspensión de una semana de duración de células de se después de la depleción de células de linaje positivo expresaba signos inmunohistoquímicos de las características endodérmicas y ectodérmicas (McGuckin et al., 2004). Hay una serie de informes sobre el éxito de trasplantes de se en niños que sufren el trastorno neurodegenerativo de leucodistrofia de Krabbe (Escolar et al., 2005). 25 El presente inventor plantea la hipótesis de que estas características únicas que se encuentran en las cél ulas madre de SC pueden ser de un concepto emergente recientemente publicado DE que la placenta gestacional puede ser un nicho hematopoyético durante el desarrollo embrionario (Gekas et al., 2005; Ottersbach y 30 Dzierzak, 2005). Es una suposición simple que una placenta a término también puede contener células madre primitivas remanentes adherente al nicho vascular, o, posiblemente, debido a la tensión asociada con el "nacimiento", puede haber un mayor número de células madre que se liberan de la MO fetal o del hígado que han migrado al nicho de la placenta. Por lo tanto, el presente inventor plantea la hipótesis de que las 35 células de SC derivadas de la placenta obtenidas por esta innovación pueden contener más células madre más primitivas (células similares a las células ME) que quedan como células madre remanentes depositadas en un nicho de lecho vascular de la placenta desde la embriogénesis. 40 Aislamiento y selección de las células de SC primitivas, incluyendo células similares a /as células ME y CMH primitivas Para identificar marcadores de células madre comunes mediante el uso de análisis de comparación de patrones de expresión de células madre neurales y hematopoyéticas 45 embrionarias, solo se identificó un gen (probablemente debido a dificultades técnicas (Fortunel et al., 2003). Por lo tanto, para identificar y seleccionar las células madre todavía pueden ser necesarios varios marcadores para aislar estas células. Una de las características que se pueden utilizar para distinguir las células madre es la ausencia de marcadores de diferenciación. Este enfoque ha sido utilizado ampliamente en el campo 50 de las CMH para llevar a cabo enriquecimiento de células madre para su uso en terapia. 5 Este rasgo "de linaje negativo (Lin-)" es una propiedad frecuente de muchas poblaciones de células madre (Cai et al., 2004segundo). Para enriquecer aún más la población de células madre a partir de células de SC Lin-, se ha informado de que el marcador CD133+ demostró un alto potencial de proliferación sobre la estimulación del factor de crecimiento (Forraz et al., 2004). Otros informaron de que la subpoblación CD133+/CD34-5 podría representar células madre más primitivas, ya que no produjeron células formadoras de colonias (CFC) en metilcelulosa, pero exhibieron la frecuencia más alta de de repoblación de SCID (Kuci et al., 2003). Los marcadores de células madre embrionarias tales como el antígeno embrionario específico de etapa (SSEA) -3, SSEA-4, TRA-1 60 y TRA-1-81 solo se expresan en las células ME que se han utilizado 10 ampliamente en la caracterización de células madre pluripotenciales y anticuerpos compatibles para el análisis FACS (que están disponibles en el mercado). Más recientemente, Kucia et al. describieron una población de células madre primitivas llamada "células madre de tipo embrionario muy pequeñas (TEMP)", portadoras del fenotipo Lin-/CD45-/CXCR4+/CD133+/CD34+ (Kucia et al., 2006). Estas células también 15 fueron positivas para los factores de transcripción embrionarios Oct-4 y Nanog. Como alternativa, el método que utiliza la presencia de marcadores metabólicos generales también se ha utilizado para identificar y aislar células madre. Uno de los marcadores metabólicos que se ha descrito es la aldehído deshidrogenasa (ALDH) 20 (Takebe et al., 2001 ). El sustrato fluorescente de la ALDH, Aldefluor (StemCell), se ha utilizado para demostrar la mayor actividad de la ALDH en las células madre neurales (Cai et al., 2004b; Corti et al., 2006) y las CMH (Storms et al., 1999). Este método de marcaje no tóxico en vivo se puede usar para identificar otras poblaciones de células madre, también (Cai et al., 2004a). Adicionalmente, la captación de rodamina y el 25 marcaje con colorante Hoechst se han utilizado para seleccionar poblaciones de células madre de MO, SC, mesenquimatosas, musculares y de cerebro adulto (Kim et al., 2002; Bhattacharya et al., 2003; Migishima et al., 2003; Parmar et al., 2003). La población lateral (PL) que se demuestra por la baja absorción de colorante Hoechst 33342 representa la más alta capacidad de autorenovación y pluripotencia más alta. La 30 absorción del colorante Hoechst está regulada por un transportador de membrana ABCG2 y la población PL se define como la expresión de la proteína ABCG2 (Zhou et al., 2001; Scharenberg et al., 2002). La proteína ABCG2 también se expresa específicamente en las células madre neurales y disminuye la expresión cuando las células precursoras se diferencian (Caí et al., 2002). 35 Evidencia de la transdiferenciación de células ectodérmicas de linaje de células hematopoyéticas humanas Cada vez hay más informes progenitoras derivadas del estroma de MO que se 40 diferencian en células neuronales, ya que estas células se notificaron por primera vez que mostraban diferenciación en células musculares, células gliales, y en hepatocitos de ratón (Azizi et al., 1998; Ferrari et al., 1998; Petersen et al., 1999). Las pruebas in vitro de inducciones de proteínas específicas de neuronas, tales como nestina, proteína nuclear específica de neuronas (NeuN) y proteína fibrilar ácida glial (GFAP) en células derivadas 45 de células estromales de MO humanas y de roedor se notificaron después de la estimulación con ácido retinoico, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) (Sanchez-Ramos et al., 2000). Entre los progenitores hematopoyéticos no mesenquimatosos, varios informes han demostrado que se indujeron las células mononucleares de SC humana, incluyendo células CD133+ 50 separadas para que expresaran marcadores neuronales y gliales in vitro tales como beta- 6 tubulina III, GFAP después de la exposición al factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y hEGF, y también Musashi-1 tras la exposición al ácido retinoico y al factor de crecimiento nervioso (NGF) (Sanchez-Ramos et al., 2001; Bicknese et al., 2002). 5 Evidencia de la transdiferenciación de células endodérmicas de linaje de células hematopoyéticas Anteriormente se pensaba que los hepatocitos se transformaban a partir de células de MO infundidas en un modelo de ratón (Lagasse et al., 2000), pero se encontró que se 10 produce por la fusión de células en dicho modelo de regeneración hepática en particular (Wang et al., 2003b). Otros también encontraron que las células mielomonocíticas de CMH de MO eran la principal fuente de parejas de fusión de hepatocitos (Camargo et al., 2004). Las células de SC aisladas a partir de un procedimiento de depleción de células de linaje positivo seguido de una semana de cultivo en suspensión forman una población 15 de células adherentes que se encontró que expresaban marcadores de células hepáticas después de una incubación adicional con medio de crecimiento de hepatocitos (McGuckin et al., 2005). Se notificaron pruebas del desarrollo de células de tipo hepatocitos en el hígado tratado con CCI4 en ratones inmunológicamente deficientes tras el transplante de CD34+.CD38-CD7- de SC (Wang et al., 2003a) y, más recientemente, 20 en un modelo sin lesiones usando hepatocitos de oveja fetal, humanos se generaron mediante reconstitución de la MO de oveja fetal con CMH humanas, incluyendo células CD34+/Lin-, CD34-/Lin-, CD34+/Lin-/CD38-, CD34-/Lin-/CD38-, CD34+/Lin-/CD133+, CD34+/Lin-/CD133- derivadas de MO, sangre periférica o SC (Almeida-Porada et al., 2004). 25 El artículo "A Modified Cord Blood Collection Method Achieves Sufficient Cell Levels for Transplantation in Most Adult Patients" de R. Bornstein et al., Stem Cells 2005; 23, pp. 324-334, describe un método modificado de dos etapas de recogida de la placenta/cordón umbilical en el que una fracción de sangre estándar obtenida por punción 30 venosa umbilical se combina con una segunda fracción recogida después de perfusión placentaria con 50 ml de solución salina al 0,9% heparinizada. Sumario de la invención 35 La presente materia objeto se refiere a un método de recolección de sangre del cordón umbilical (SC) derivada de células madre hematopoyéticas a partir de una placenta según la reivindicación 1. La perfusión placentaria se realiza mediante una máquina de perfusión placentaria pulsátil (PMPP). En el método de acuerdo con la reivindicación 1, la PPM se combina con ausencia de recogida anterior. Como alternativa, la PMPP se puede 40 combinar con realización de un método de recogida convencional, por lo general punción venosa (aspiración de la vasculatura del cordón umbilical con una aguja y jeringa) o drenaje por gravedad. La PMPP se puede realizar con una solución de perfusión de órganos que contiene anticoagulante para lavar las células de sangre de cordón y posteriormente recoger el líquido de perfusión resultante que contiene las células madre. 45 Este método no requiere ninguna preparación o la inyección de anticoagulantes en la placenta tras el parto para prevenir la coagulación. La placenta aislada puede enfriarse, por ejemplo, mediante la colocación en hielo, antes de la perfusión. Si la perfusión se realiza en el plazo de una hora desde el aislamiento de la placenta, la placenta no tiene que enfriarse antes de la perfusión. El método descrito en el presente documento todavía 50 se puede realizar si la placenta se prepara o se inyecta con un anticoagulante antes de 7 realizar la perfusión. Si las células de sangre de cordón se recogen primero usando métodos convencionales, las células de sangre de cordón residuales obtenidas con PMPP se pueden añadir a esta recogida inicial. Las células de sangre de cordón obtenidas por PMPP también se pueden almacenar como células de reserva o conservar para fines de futura ingeniería de injerto celular y de medicina regenerativa. La 5 comodidad de no necesitar la extracción inmediata de las células madre del cordón umbilical de la placenta y la posibilidad de enviarla directamente en hielo solo sin ninguna preparación adicional a una instalación central hace que este método sea potencialmente atractivo para su incorporación en el sistema de bancos de células de sangre de cordón actualmente establecido. 10 La perfusión comprende someter a la placenta de mamífero no exanguinada a un flujo mediado por presión de solución de perfusión, comprendiendo el flujo mediado por presión de la solución de perfusión un flujo pulsátil de la solución de perfusión. El flujo mediado por presión de la solución de perfusión puede comprender uno o más de un flujo 15 mediado por presión positiva de la solución de perfusión o un flujo mediado por presión negativa de la solución de perfusión. La perfusión se puede llevar a cabo en condiciones suficientes para producir una placenta de mamíferos sustancialmente libre de células madre de sangre de cordón. La 20 perfusión placentaria se puede realizar utilizando una bomba peristáltica. El método implica el aislamiento de células madre hematopoyéticas presentes en la sangre del cordón umbilical de una placenta aislada. Como alternativa, las células madre aisladas pueden comprender células madre de tipo células madre embrionarias (ME), 25 células madre mesenquimatosas o combinaciones de las mismas. Otras células de sangre de cordón que se pueden obtener incluyen células T, monocitos, células dendríticas y células B. El procedimiento puede además comprender: antes de la perfusión, el aislamiento de una 30 placenta de mamífero de un donante mamífero para producir una placenta de mamífero aislada; y el enfriamiento de la placenta de mamífero aislada para producir una placenta de mamífero enfriada. En una realización, la placenta aislada se mantiene en hielo después de la extracción, y 35 antes de la perfusión. La placenta aislada enfriada puede mantenerse a una temperatura que varía de aproximadamente > 0ºC a aproximadamente 6ºC, o de aproximadamente 1ºC a aproximadamente 4ºC, siempre que la placenta no se congele, antes de realizar la perfusión. Como alternativa, la placenta puede mantenerse a una temperatura que varía de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 10ºC durante cuatro horas, antes de 40 realizar la perfusión. La placenta también puede mantenerse a 4ºC, antes de realizar la perfusión. La placenta enfriada aislada puede mantenerse durante un periodo de tiempo de hasta aproximadamente 40 horas, después de la extracción y antes de la perfusión. El método puede no requerir la administración o la inyección de un anticoagulante en la 45 placenta antes de la perfusión. Por lo tanto, la placenta no se puede administrar o inyectar con un anticoagulante antes de la perfusión. La solución de perfusión puede comprender una solución fisiológicamente compatible Belzer (RPMI de IMDM para uso no humano) o la solución de perfusión puede 50 comprender un anticoagulante. En una realización, la solución de perfusión comprende 8 heparina como anticoagulante. Como alternativa, se puede usar creatina fosfato dextrosa (CPDA), o una combinación de heparina y creatina fosfato dextrosa (CPDA). En una realización no cubierta por el método de acuerdo con la reivindicación 1, la placenta puede exanguinarse parcialmente antes de realizar la perfusión placentaria. En 5 general, la sangre del cordón umbilical puede exanguinarse de la placenta utilizando métodos estándar tales como punción venosa (por ejemplo, mediante aguja y jeringa) o drenaje por gravedad (por ejemplo, con aguja y bolsa). En general, las células madre pueden aislarse de la sangre de cordón exanguinado de la 10 placenta mediante tales métodos estándar. Las células madre aisladas de la placenta exanguinada usando métodos estándar se pueden combinar con las células madre aisladas utilizando el método de perfusión de la invención. Las células madre combinadas de ambos métodos se pueden utilizar para derivar adicionalmente la ontogenia de células madre. 15 En una realización, la placenta se perfunde a través de una o dos de las arterias umbilicales. La placenta puede perfundirse y la sangre del cordón umbilical extraída puede 20 comprender células madre viables, hasta aproximadamente 40 horas después del parto. La placenta puede perfundirse y la sangre del cordón umbilical extraída puede comprender células madre viables, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 40 horas después del parto. 25 La PMPP de la placenta unida se puede realizar en un entorno de pulso de aproximadamente 15 -60 latidos/min. La PMPP de la placenta unida se puede realizar a una presión sistólica que varía de 15 a 70 mmHg. La PMPP de la placenta unida se puede realizar durante un tiempo que varía de 5 min a 90 m in, tiempo durante el cual la sangre del cordón se extrae de la placenta. La PMPP de la placenta unida se puede 30 realizar durante un tiempo que varía de 15 min a 35 min. La PMPP de la placenta unida se puede realizar durante un tiempo que varía de 20 min a 30 min. La PMPP de la placenta unida se puede realizar para una cantidad mínima de tiempo seleccionada de al menos 10 min, al menos 15 min, al menos 20 min, al menos 25 min, al menos 30 min, al menos 40 min, al menos 50 min y al menos 60 min, en el que el tiempo máximo de 35 perfusión no es mayor de 90 minutos para la cantidad mínima de tiempo seleccionada. Los fenotipos de células madre hematopoyéticas primitivas aisladas pueden comprender uno o más de células CD34+/CD38-, células CD133+, células CD133+/CD34+, células CD133+/CD34-, células CD117+, células CD90+, células CD59+, células Thy1+, células 40 Lin-, células CXCR4+, células ALDHhigh, células de la población lateral (PL), células SSEA-3+, células SSEA-4+, células TRA-1-60, células TRA-1-81 o combinaciones de las mismas. Las células madre aisladas pueden comprender fenotipos de células madre hematopoyéticas primitivas que pueden diferenciarse en células que no sean células CD34+/CD38-, células CD133+, células CD133+/CD34+ o células CD133+/CD34-. 45 El líquido de perfusión de la PMPP más aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional, tal como una aguja y una jeringa, puede dar lugar a un incremento de 1,5 veces del recuento de células mononucleares totales obtenido de una placenta en comparación con la aspiración de 50 sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y jeringa solo. Es 9 posible una recuperación total de células comparable si la placenta no se exanguinó antes de realizar el método de perfusión de la invención. El líquido de perfusión de la PMPP más aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional, tal como una aguja 5 y una jeringa, pueden dar lugar a un incremento de 5,5 veces del porcentaje de células CD34+ obtenidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y jeringa solo. Es posible una recuperación total de células comparable si la placenta no se exanguinó antes de realizar el método de perfusión de la invención. 10 El líquido de perfusión de la PMPP más aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional, tal como una aguja y una jeringa, pueden dar lugar a un incremento de 4,9 veces de las células CD34+ totales obtenidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la 15 vasculatura umbilical con una aguja y jeringa solo. Es posible una recuperación total de células comparable si la placenta no se exanguinó antes de realizar el método de perfusión de la invención. El líquido de perfusión de la PMPP más aspiración de sangre del cordón umbilical de la 20 vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional, tal como una aguja y una jeringa, pueden dar lugar a un incremento de 14,8 veces del porcentaje de células CD34+/CD38-obtenidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y jeringa solo. Es posible una recuperación total de células comparable si la placenta no se exanguinó antes de realizar el método de 25 perfusión de la invención. El líquido de perfusión de la PMPP más aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional, tal como una aguja y una jeringa, pueden dar lugar a un incremento de aproximadamente 11 veces de las 30 células I CD34+/CD38- recogidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y jeringa solo. Es posible una recuperación total de células comparable si la placenta no se exanguinó antes de realizar el método de perfusión de la invención. 35 El líquido de perfusión de la PMPP más aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional, tal como una aguja y una jeringa, pueden dar lugar a un enriquecimiento por 5 veces del porcentaje de células CD133+ obtenidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y jeringa solo. Es posible una 40 recuperación total de células comparable si la placenta no se exanguinó antes de realizar el método de perfusión de la invención. El líquido de perfusión de la PMPP más aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional, tal como una aguja 45 y una jeringa, pueden dar lugar a una población de células 7 CD133+ aproximadamente 7 veces mayor obtenidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y jeringa solo. Es posible una recuperación total de células comparable si la placenta no se exanguinó antes de realizar el método de perfusión de la invención. 50 10 Las células madre del cordón umbilical pueden someterse a crioconservación. Breve descripción de las figuras En la descripción detallada de la invención que se presenta a continuación, se hace 5 referencia a los dibujos adjuntos en los que: Figura 1. La máquina de perfusión placentaria pulsátil (PMPP) permite aumentar el recuento total de células mononucleares 1,5 veces por placenta (fracción de venopunción más fracción de PMPP) en comparación con la punción venosa sola. La figura representa 10 un análisis de las 8 muestras de SC derivada de placenta obtenidas por el método de punción venosa (negro) seguido del método de la máquina de perfusión placentaria (patrón de rayas). Los números arábigos debajo de cada barra representan los números de las muestras que se muestran en la Tabla 1. (Figura 1). Los datos en bruto se presentan en la Tabla 3. 15 Figura 2. El porcentaje de la fracción de células CD34+ obtenidas mediante el método de PMPP contenía un porcentaje 4,9 veces mayor en comparación con la fracción obtenida mediante punción venosa. 20 Figura 3. El recuento de células CD34+ de la fracción obtenida por punción venosa y de la fracción obtenida por PMPP fue 7,4 x 106 ± 5,9 x 106 (media+ DE.) (intervalo de 8 pacientes, 1,1 - 18,2 x 106) y 28,8 x 106 + 37 x 106 (media + DE.) (intervalo de 1,6 - 116 x 106), respectivamente, lo que indica que la fracción de PMPP contenía una cifra 3,9 veces mayor de células totales CD34+. Aguja y una jeringa, se traduce en un porcentaje de la 25 población de células CD34+ 14,8 veces mayor obtenidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y una jeringa solo. Es posible una recuperación total de células comparable si la placenta no se exanguinó antes de realizar el método de perfusión de la invención. 30 En aún otra realización, el perfundido de la PMPP más aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional, tal como una aguja y una jeringa, da lugar a un incremento de aproximadamente 11 veces de las células 1CD34+/CD38- recogidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y jeringa solo. Es posible una 35 recuperación total de células comparable si la placenta no se exanguinó antes de realizar el método de perfusión de la invención. En una realización adicional en la que el perfundido de la PMPP más aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación 40 convencional, tal como una aguja y una jeringa, da lugar a un enriquecimiento por 5 veces del porcentaje de células CD133+ obtenidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y jeringa solo. Es posible una recuperación total de células comparable si la placenta no se exanguinó antes de realizar el método de perfusión de la invención. 45 En aún otra realización adicional en la que el perfundido de la PMPP más aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional, tal como una aguja y una jeringa, da lugar a una la población 7 veces mayor de células CD133+ obtenidas en comparación con la aspiración de sangre del 50 cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y jeringa solo. Es posible una 11 recuperación total de células comparable si la placenta no se exanguinó antes de realizar el método de perfusión de la invención. En otras realizaciones, las células madre del cordón umbilical pueden someterse a crioconservación. 5 En algunas realizaciones, la materia sujeto descrita incluye un método para tratar a un mamífero en necesidad de reconstitución hematopoyética que comprende (a) aislar células madre hematopoyéticas derivadas de la sangre del cordón placentario de acuerdo con un método descrito en el presente documento y (b) cultivar in vitro las células madre 10 hematopoyéticas aisladas de acuerdo con un método descrito en el presente documento, produciendo de este modo células madre de la progenie. En ciertas realizaciones, estas células madre de la progenie se pueden utilizar inmediatamente o almacenar, por ejemplo, mediante crioconservación, para su uso futuro, tal como en una unidad para partos a un paciente en necesidad de las mismas. En realizaciones adicionales, el 15 método puede comprender además (c) introducir en el mamífero una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de las células madre de la progenie, con lo que se efectúa la reconstitución hematopoyética. En algunas realizaciones, el mamífero se selecciona de entre un ser humano o un primate, por ejemplo, tal como un mandril u otro primate. 20 En otras realizaciones, la materia sujeto descrita incluye un método para tratar a un mamífero en necesidad de reconstitución hematopoyética que comprende (a) aislar células madre hematopoyéticas derivadas de la sangre del cordón placentario de acuerdo con un método descrito en el presente documento y (b) introducir en el mamífero una 25 composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de las células madre hematopoyéticas aisladas, con lo que se efectúa la reconstitución hematopoyética. En algunas realizaciones, el mamífero se selecciona de entre un ser humano o un primate, por ejemplo, tal como un mandril u otro primate. 30 En realizaciones adicionales, el método para tratar a un mamífero en necesidad de reconstitución hematopoyética puede comprender además crioconservar las células madre aisladas antes de que ellas, o sus células de la progenie derivadas, se introduzcan en un mamífero en necesidad del mismo. En realizaciones adicionales, las células aisladas madre, o sus células de la progenie derivadas, que se introducen en un 35 mamífero en necesidad de los mismos pueden ser alogénicas, autólogas, o una combinación de las mismas, para el mamífero que recibe las células. En ciertas realizaciones, las células madre aisladas de más de una placenta se pueden agrupar juntas para su uso en el tratamiento de un mamífero en necesidad de las mismas. En realizaciones adicionales, la progenie derivada de las células madre aisladas de una 40 placenta aislada puede agruparse junto con la progenie derivada de una o más placentas aisladas adicionales para su uso en el tratamiento de un mamífero en necesidad de la misma. En algunas realizaciones, el método para tratar a un mamífero en necesidad de 45 reconstitución hematopoyética implica un mamífero que tiene anemia aplásica, una neoplasia maligna hematopoyética, una enfermedad autoinmune, un trastorno genético, una inmunodeficiencia, un tumor sólido maligno, o una combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, el mamífero en necesidad de reconstitución hematopoyética 50 tiene una neoplasia maligna hematopoyética seleccionada de leucemia, linfoma, mieloma 12 múltiple, síndrome mielodisplásico. En realizaciones adicionales, el mamífero en necesidad de reconstitución hematopoyética tiene una inmunodeficiencia resultante de la irradiación, la quimioterapia, la infección por un microorganismo patógeno, o una combinación de los mismos. 5 En una realización, la materia sujeto descrita incluye un método para la regeneración de tejido dañado en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende: (a) cultivar in vitro las células madre de sangre de cordón aislado de acuerdo con la reivindicación 1, produciendo de este modo células diferenciadas o células madre expandidas; y (b) introducir en el mamífero por vía intravenosa o inyección directa en el órgano diana una 10 composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de las células diferenciadas o células madre expandidas, mediante lo cual se efectúa la regeneración de tejidos. En una realización adicional se describe un método para la regeneración de tejido dañado en un mamífero en necesidad del mismo, que comprende introducir en el mamífero por vía intravenosa o inyección directa en el órgano diana una composición que 15 comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de las células madre de sangre de cordón aislado de acuerdo con la reivindicación 1, con lo cual se efectúa la regeneración de tejidos. En otras realizaciones se describe un método para la regeneración de tejido dañado en 20 un mamífero en necesidad del mismo, en el que el tejido comprende una o más de tejido cardíaco, tejido muscular, tejido hepático, piel, tejido neural, tejido óseo, epitelios, estroma, o endotelio. Breve descripción de las figuras 25 En la descripción detallada de la invención que se presenta a continuación, se hace referencia a los dibujos adjuntos en los que: Figura 1. La máquina de perfusión placentaria pulsátil (PMPP) permite aumentar el 30 recuento total de células mononucleares 1,5 veces por placenta (fracción de venopunción más fracción de PMPP) en comparación con la punción venosa sola. La figura representa un análisis de las 8 muestras de SC derivada de placenta obtenidas por el método de punción venosa (negro) seguido del método de la máquina de perfusión placentaria (patrón de rayas). Los números arábigos debajo de cada barra representan los números 35 de las muestras que se muestran en la Tabla 1. (Figura 1). Los datos en bruto se presentan en la Tabla 3. Figura 2. El porcentaje de la fracción de células CD34+ obtenidas mediante el método de PMPP contenía un porcentaje 4,9 veces mayor en comparación con la fracción obtenida 40 mediante punción venosa. Figura 3. Recuento de células CD34+ de la fracción obtenida mediante punción venosa y la fracción obtenida mediante PMPP fue 7,4 x 106 ± 5,9 x 106 (media ± DE) (intervalo de 8 pacientes, 1,1 a 18,2 x 106) y 28,8 x 106 ± 37 x 106 (media ± DE) (intervalo de 1,6 a 116 x 45 106), respectivamente, lo que indica que la fracción de PMPP contenía una cifra de células CD34+ totales 3,9 veces mayor. Figura 4. El porcentaje medio de células CD34+/CD38- en las fracciones obtenidas mediante venopunción y mediante PMPP fue de 0,32 ± 0,17% (media ± DE) (intervalo 50 0,04-0,66) y 4,4 ± 4,1% (media ± DE) (intervalo 1,3 a 14), respectivamente, lo que 13 demuestra que la fracción de PMPP contenía un aumento del porcentaje de la población de células CD34+/CD38- de 13-14 veces en comparación con la fracción de venopunción. Figura 5. El número absoluto de células CD34+/CD38-en las fracciones obtenidas 5 mediante punción venosa y mediante PMPP fue de 1,7 ± 1,5 x 106 (media ± DE) (intervalo 0,12 a 5,2) y 17 ± 22 x 106 (media ± DE) (intervalo 0,86 a 65), respectivamente (Figura 5), lo que indica que la fracción de PMPP contenía 10 veces más células CD34+/CD38-. 10 Figura 6. El porcentaje de células CD133+ en la fracción de punción venosa y de PMPP fue de 0,55 ± 0,8% (media ± DE) (intervalo 0-2,5) y 2,4 ± 2,0% (media ± DE) (intervalo 0,5 a 6,8), respectivamente, lo que demuestra un enriquecimiento del porcentaje de las células CD133+ 4 veces mayor en la fracción de PMPP. 15 Figura 7. El número de células CD133+ en la fracción obtenida por punción venosa y la fracción obtenida por PMPP fue 0,98 ± 0,8 x 106 (media ± DE) (intervalo de 0 a 2,3) y 6,3 ± 0,8 x 106 (media ± DE) (intervalo de 0,55 a 11,2), respectivamente. La población de células CD133+ en la fracción obtenida por PMPP se enriqueció de manera significativa a un nivel de 6,3 veces mayor. 20 Figura 8A y 8B. La media del porcentaje y el número absoluto de células CD34+/CD38+ en las fracciones de venopunción y de PMPP fue de 1,34 ± 0,6% (media ± DE) (intervalo de 0,26 a 2), 6,1 ± 5,1 x 106 (media ± DE) (intervalo de 1,0 a 16,2), y 3,5 ± 1,6% (media ± DE) (intervalo de 0,82 a 6), 11,9 ± 15 x 106 (media ± DE) (intervalo de 0,78 a 50), 25 respectivamente, lo que demuestra un incremento de 2,6 veces y 1,95 veces del porcentaje y el número absoluto de CD34+/CD38+, respectivamente, a favor de la PMPP. Figura 9A y 9B. La media del porcentaje y el número absoluto de células CD133+/CD34-en las fracciones de venopunción y de máquina de perfusión placentaria pulsátil fue de 30 0,37 ± 0,7% (media ± DE) (intervalo de 0 a 2), 0,36 ± 0,7 x 106 (media ± DE) (intervalo de 0 a 1,9), y 1,16 ± 1,5% (media ± DE) (intervalo de 0 a 5), 2,4 ± 3,3 x 106 (media ± DE) (intervalo de 0 a 9,9), respectivamente, lo que indica que la fracción de PMPP contenía un enriquecimiento 3 veces mayor del número de células CD133+/CD34- y 6,6 veces mayor de CD133+/CD34-. 35 Figura 10A y 10B. La media del porcentaje y el número absoluto de células CD133+/CD34+ en las fracciones de venopunción y de máquina de perfusión placentaria pulsátil fue de 0,62 ± 0,5% (media ± DE) (intervalo de 0 a 0,6), 0,68 ± 0,6 x 106 (media ± DE) (intervalo de 0 a 1,89), y 1,26 ± 0,8% (media ± DE) (intervalo de 0,35 a 2,9), 4,0 ± 5,6 40 x 106 (media ± DE) (intervalo de 0,35 a 16,5), respectivamente, lo que demuestra que la fracción de PMPP contenía un enriquecimiento 2 veces mayor del número de células CD133+/CD34+ y 5,9 veces mayor del número absoluto de células CD133+/CD34+. Descripción detallada de la invención 45 En la siguiente descripción detallada, los métodos de la presente invención se pueden realizar en un número de diferentes variaciones y debe entenderse que se pueden usar otras realizaciones y se pueden realizar cambios lógicos sin apartarse del alcance de la presente invención. Por tanto, la siguiente descripción detallada no debe tomarse en un 50 14 sentido limitativo y el alcance de la presente invención viene definido por las reivindicaciones adjuntas. Aunque a continuación se describen una serie de realizaciones discretas, debe entenderse que estos son ejemplos meramente no limitantes, y que cualquier realización 5 dada de la invención puede comprender algunas de las características de una realización mostrada y/o algunas de las características de otra realización mostrada. Se describe un método de recogida de células madre de sangre de cordón que puede comprender o consistir en perfusión, por ejemplo perfusión pulsátil, de una placenta de 10 mamífero parcialmente exanguinada o no exanguinada aislada con una solución de perfusión para producir un líquido de perfusión que comprende células madre de sangre de cordón; recoger el líquido de perfusión que comprende las células madre de sangre de cordón; y aislar las células madre del cordón umbilical del líquido de perfusión para producir células madre aisladas de sangre de cordón. 15 Además, se describe un método en el que el líquido de perfusión, por ejemplo, resultado de la perfusión pulsátil, más aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional tiene como resultado un aumento de al menos 1,5 veces en el recuento total de células mononucleares obtenidas 20 de una placenta en comparación con la aspiración de la sangre del cordón umbilical de la vasculatura con una aguja y jeringa solo. Se describe un método adicional, en el que el líquido de perfusión, por ejemplo, como resultado de la perfusión pulsátil, más de la aspiración de sangre del cordón umbilical de 25 la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional da lugar a al menos un aumento de 2 veces, de un aumento > 2 veces a un aumento de 10 veces, de un aumento de 4 veces a un aumento de 6 veces, o un aumento de 5,5 veces del porcentaje de células CD34+ obtenidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y una jeringa solo. 30 Se describe un método en el que el líquido de perfusión, por ejemplo, resultado de la perfusión pulsátil, más aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional tiene como resultado un aumento de 4,9 veces en el recuento total de células CD34+ obtenidas de una placenta 35 en comparación con la aspiración de la sangre del cordón umbilical de la vasculatura con una aguja y jeringa solo. Asimismo, se describe un método, en el que el líquido de perfusión, por ejemplo, como resultado de la perfusión pulsátil, más de la aspiración de sangre del cordón umbilical de 40 la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional da lugar a al menos un aumento de 5 veces, de un aumento > 5 veces a un aumento de 20 veces, de un aumento de 12 veces a un aumento de 18 veces, o un aumento de 14,8 veces del porcentaje de la población celular CD34+/CD38- obtenida en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y una 45 jeringa solo. Se describe un método, en el que el líquido de perfusión, por ejemplo, como resultado de la perfusión pulsátil, más de la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional da lugar a una 50 recogida de al menos 5 veces más, de 5 veces a 20 veces más, de 10 veces a 15 veces 15 más u 11 veces más de células CD34+/CD38- en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y una jeringa solo. Se describe un método adicional, en el que el líquido de perfusión, por ejemplo, como resultado de la perfusión pulsátil, más de la aspiración de sangre del cordón umbilical de 5 la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional da lugar a al menos un aumento de 2 veces, un aumento de 2 veces a un aumento de 10 veces, de un aumento de 4 veces a un aumento de 8 veces o un aumento de 5 veces del porcentaje de células CD34+ enriquecidas obtenidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y una jeringa solo. 10 Se describe un método adicional, en el que el líquido de perfusión, por ejemplo, como resultado de la perfusión pulsátil, más de la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con un método de exanguinación convencional da lugar a al menos un aumento de al menos 3 veces, de 3 veces a 15 veces, de 5 veces a 19 veces o 15 de 7 veces mayor de la población de células CD133+ obtenidas en comparación con la aspiración de sangre del cordón umbilical de la vasculatura umbilical con una aguja y una jeringa solo. l. Definiciones 20 Las definiciones siguientes son para proporcionar una comprensión clara y coherente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluido el alcance a dar a dichos términos. Perfundir. El término "perfundir" o "perfusión" se refiere al acto de inducir un flujo de un flu 25 ido sobre o a través de una placenta no exanguinada o parcialmente exanguinada, preferiblemente el paso de fluido a través de un una placenta no exanguinada o parcialmente exanguinada con suficiente fuerza o presión para eliminar las células residuales, por ejemplo, las células no unidas del órgano o tejido. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "líquido de perfusión" se refiere al fluido recogido 30 después de su paso a través de un órgano o tejido. En una realización preferida, el líquido de perfusión contiene una o más anticoagulantes. Un flujo de solución de perfusión puede comprender un flujo mediado por presión de la solución de perfusión. Un flujo mediado por presión de la solución puede comprender un flujo de la solución mediado por presión positiva o negativa. Un flujo mediado por presión de la solución 35 puede comprender un flujo pulsátil de la solución. La perfusión puede comprender perfundir con al menos un primer volumen de la solución de perfusión durante un período de tiempo de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1 hora; de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 45 40 minutos; o de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 30 minutos. La perfusión puede comprender perfundir una placenta no exanguinada o parcialmente exanguinada en un recipiente abierto o cerrado rígido o deformable. El recipiente puede comprender un volumen de la solución de perfusión de tal manera que la placenta no 45 exanguinada o parcialmente exanguinada se sumerge en la solución de perfusión contenida en el recipiente durante la perfusión, con lo cual se combinan el volumen de la solución de perfusión y la solución de perfusión contenida en el recipiente se combinan antes de aislar las células madre de sangre de cordón. La placenta aislada sumergida y la solución de perfusión circundante pueden estar a presión ambiente o pueden estar 50 sometidas a una presión positiva y/o negativa. 16 La perfusión puede comprender someter a una placenta no exanguinada o parcialmente exanguinada a un flujo pulsátil de la solución de perfusión utilizando una bomba peristáltica o pulsátil, por ejemplo, a de aproximadamente 15 a aproximadamente 90 latidos/min y a una presión sistólica de aproximadamente 15 a aproximadamente 90 mmHg; o a aproximadamente 60 latidos/min y a una presión sistólica de 5 aproximadamente 30 a aproximadamente 70 mmHg. La fuente de presión usada para empujar o tirar de la solución de perfusión a través de la placenta de mamífero será suficiente para generar un flujo de la solución desde un sistema presurizado, por ejemplo, una bomba o dispositivo peristáltico o pulsátil. El uso 10 de sistemas de bombeo peristáltico facilita la retención de la esterilidad en las soluciones cuyo flujo a través de la placenta se está induciendo. El nivel de presión real o la velocidad de bombeo se ajustan para optimizar la extracción de la sangre del cordón umbilical a partir de una placenta no exanguinada o parcialmente exanguinada. 15 Solución de perfusión. La expresión "solución de perfusión" significa cualquier solución o medio fisiológicamente compatible que comprende un anticoagulante suficiente para mantener la viabilidad de las células de sangre de cordón que comprende células madre. Las soluciones de perfusión adecuadas pueden comprender o consistir en un medio RPMI (Roswell Park Memorial lnstitute), que comprende opcionalmente gluconato y/o 20 heparina, por ejemplo 1 000 U de heparina para un volumen total de 1 litro; y Belzer MPS que comprende opcionalmente heparina, por ejemplo heparina 2000U para un volumen total de 600-750 ml. Otras soluciones de perfusión adecuadas son conocidas y pueden seleccionarse y usarse fácilmente por un experto normal en la técnica. La perfusión puede comprender perfundir con al menos un primer volumen de la solución de perfusión. 25 La perfusión se puede llevar a cabo a una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 27ºC, por ejemplo, a temperatura ambiente. Primer volumen La expresión "primer volumen" significa un volumen de una solución de perfusión para la perfusión de una placenta de mamífero no exanguinada o parcialmente 30 exanguinada. El primer volumen de la solución de perfusión puede comprender o consistir en aproximadamente 250 ml de la solución de perfusión a aproximadamente 2 litros, de aproximadamente 400 ml a aproximadamente 1,5 litros; de aproximadamente 500 ml a aproximadamente 1,2 litros, de aproximadamente 600 ml a aproximadamente 1 litro; y de aproximadamente 600 ml a aproximadamente 750 ml de la solución de 35 perfusión. Flujo mediado por presión. La expresión "flujo mediado por presión" significa un flujo de la solución de perfusión inducido por presión positiva o negativa. 40 Presión negativa. La expresión "presión negativa" significa una presión inferior a la presión atmosférica, es decir, menos de una atmósfera. Presión positiva. La expresión "presión positiva" significa una presión de o por encima de una atmósfera, es decir, mayor que o igual a una atmósfera. 45 Placenta exanguinada. La expresión "placenta exanguinada" significa una placenta aislada de la que se ha eliminado o extraído toda la sangre que circula, es decir, para convertirla en sin sangre. 50 17 No exanguinada. La expresión "placenta no exanguinada" significa una placenta aislada de la que no se ha eliminado ni extraído la sangre circulante. Parcialmente exanguinada. La expresión "placenta parcialmente exanguinada" significa una placenta aislada de la que se ha eliminado o extraído una parte de la sangre 5 circulante. Célula madre. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "célula madre" se refiere a una célula maestra que se puede reproducir indefinidamente para formar las células especializadas de los tejidos y órganos. Una célula madre es una célula 10 pluripotencial o multipotencial en cuanto al desarrollo. Una célula madre se puede dividir para producir dos células madre hijas, o una célula madre hija y una célula progenitora ("de tránsito"), que luego prolifera en las células maduras, completamente formadas del tejido. La "célula madre" usada en el presente documento incluye "células progenitoras" a menos que se indique lo contrario. 15 Las células madre hematopoyéticas son raros progenitores de células sanguíneas primitivas que tienen la capacidad de autorreplicarse, a fin de mantener una fuente continua de células regenerativas, y para diferenciarse, a fin de dar lugar a diversos precursores morfológicamente reconocibles de linajes de células sanguíneas. Estos 20 precursores son células sanguíneas inmaduras que no se autorreplican y deben diferenciarse en células sanguíneas maduras, incluyendo las células eritroides, linfoides y mieloides. Dentro del microambiente de la médula ósea, las células madre autoproliferan y mantienen activamente la producción continua de todos los linajes de células sanguíneas maduras durante toda la vida. 25 Las células CD34+ se definen como la célula madre hematopoyética más temprana identificable en la médula ósea, la sangre periférica o la sangre de cordón neonatal. El suplemento y el medio de la presente invención son particularmente adecuados para el apoyo a la expansión de las células CD34+ y las células de linaje mieloide, incluyendo 30 células BFU-E, eritrocitos, células CFU-MEG, megacariocitos, células CFU-GM, monocitos, macrófagos, neutrófilos eosinófilos, y basófilos. En las etapas tempranas del desarrollo, las células de linaje mieloide expresan la proteína marcadora CD34+. En las últimas etapas del desarrollo, las células de linaje mieloide no expresan niveles detectables de la proteína marcadora CD34+. 35 Un experto normal en la técnica puede determinar si una célula madre de sangre de cordón expresa la proteína marcadora CD34+ usando técnicas bien conocidas, tales como la clasificación de células activadas por fluorescencia. 40 Las células hematopoyéticas CD34+ o "células CD34+" son células hematopoyéticas que expresan la proteína marcadora de CD34+ en la superficie. Tales células incluyen, pero no se limitan a, células madre hematopoyéticas, células progenitoras o precursoras mieloides, células progenitoras o precursoras eritroides y células progenitoras o precursoras linfoides. 45 Las células CD3 + pueden aislarse de la sangre del cordón recogida y/o del líquido de perfusión para producir células madre de sangre de cordón aisladas utilizando métodos que son bien conocidos por los expertos normales en la técnica. Los expertos en la técnica disponen e varios sistemas. Por ejemplo, el Sistema MicroCELLector 50 System.RTM. (Applied lmmune Sciences), el sistema MiniMacs System (Miltenvi Biotec), 18 el sistema StemSep.TM. (StemCell Technologies) se pueden usar para aislar células CD34+. Para preparar una preparación de células enriquecidas en células CD34+ a escala mayor, los sistemas comercializados por Baxter Healthcare y CellPro están disponibles para los expertos normales en la técnica. 5 Las expresiones "células madre hematopoyéticas" y "células madre hematopoyéticas pluripotenciales" se refieren a una célula que puede dar lugar a cualquier tipo de célula progenitora o precursora hematopoyética, incluyendo células progenitoras o precursoras mieloides, células progenitoras o precursoras eritroides y células progenitoras o precursoras linfoides. Las células madre hematopoyéticas muestran un fenotipo CD34+ 10 /CD33- /CD38- o un fenotipo CD34+ /HLD-DR.- /CD38-(Daley, J. P. et al., Focus 18:62-67 (1996); Pimentel, E., Ed., Handbook of Growth Factors Vol. 111: Hematopoietic Growth Factors and Cytokines, pp. 1-2, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1994). 1. Método de recolección de células de SC de placenta con o sin recolección de SC 15 Una prueba piloto de prueba de concepto para la recogida de SC usando una tecnología de perfusión pulsátil utilizando el dispositivo de perfusión pulsátil RM3 de Waters (Waters Medica! Systems, Rochester, MN), utilizada ampliamente para la conservación renal, tuvo éxito. El dispositivo se diseñó originalmente para mejorar la función inmediata de los 20 riñones que se almacenan antes del trasplante. La solución de perfusión consistió en medio RPMI (Roswell Park Memorial lnstitute) con gluconato y heparina 1000 U de heparina para un total de 1 litro o medio Belzer MPS más 1000-2000 U de heparina (600-750 ml de Belzer MPS con 2000 U de heparina sódica). En la actualidad, se ha demostrado con placenta de babuino, la viabilidad de este método y de la perfusión con 25 éxito y la ex1racción de la SC restante de la totalidad de la placenta. La obtención de un recuento absoluto de células mononucleares totales, recuento células formadoras de colonias (CFC) y porcentaje y recuento de CD34+ y de CD34+/CD38- fue aproximadamente 2 veces mayor cuando se añadió la máquina de perfusión al método de punción venosa convencional en comparación con el método de la punción venosa 30 solo. Sobre la base de la prometedora obtención de SC de babuino mediante la máquina de perfusión pulsátil, este método se probó en placentas humanas. Se realizaron ocho extracciones de SC en placentas de 36-41 semanas de 7 partos vaginales normales y 35 una cesárea conforme al protocolo clínico aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Maryland. La obtención parcial de SC s realizó primero por punción venosa con aguja/jeringa para aspirar la máxima cantidad posible tan pronto como el cordón umbilical se punzó y el bebé nació, mientras la placenta aún estaba en el útero. Este método se utiliza tanto para partos transvaginales como por cesárea para maximizar 40 el rendimiento de la recogida de SC y es uno de los varios métodos utilizados ampliamente para la obtención de SC de rutina. La aguja de calibre 18 se acopló a jeringas de 30 o 60 ml y el material de se aspirado se transfirió inmediatamente a un tubo cónico de 50 ml que contiene 5000 U de solución de heparina. La SC recogida se mezcló inmediatamente con heparina para prevenir la coagulación y almacenarla en una nevera 45 portátil. El volumen medio de la SC recogida por este procedimiento fue de 59 ± 18 ml (media ± DE) (intervalo 4090 ml). A continuación, la placenta se ex1rajo de la forma normal y se colocó directamente en una bolsa de aislamiento estéril (3M Health Care St. Paul, MN). Si la placenta requirió un examen visual, se colocó en una bandeja estéril y se transfirió a una bolsa de aislamiento estéril en el momento de la finalización de la 50 exploración. La placenta se pesó dentro de la bolsa estéril también. La bolsa estéril se 19 cerró herméticamente y se colocó en la bolsa de aislamiento triple y se mantuvo en una nevera portátil sin ningún tipo de manipulación hasta que se inició la perfusión de la placenta. Las placentas se perfundieron entre 6,25 y 39 horas después del parto. Una placenta se pueden enfriar después del aislamiento a una temperatura de aproximadamente -3ºC a aproximadamente 15ºC, de aproximadamente -8ºC a 5 aproximadamente 10ºC, de aproximadamente -2ºC a aproximadamente 6ºC, o de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 6ºC, siempre que no se permita la congelación de la placenta. La placenta enfriada puede mantenerse antes de la perfusión a una temperatura por encima de la de congelación, por ejemplo, a de aproximadamente > 0ºC a aproximadamente 15ºC. a aproximadamente > 0ºC a aproximadamente 10ºC, o a 10 aproximadamente 2ºC a aproximadamente 6ºC, durante un período de tiempo de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 60 horas, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 50 horas; de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 40 horas; de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 40 horas; de aproximadamente 15 horas a aproximadamente 40 horas; o de aproximadamente 20 horas a 15 aproximadamente 40 horas. Para llevar una perfusión placentaria pulsátil en máquina (PMPP), la placenta se colocó en un campo estéril y se examinó para determinar si había alguna laceración o desgarro en la placenta. A continuación, el cordón umbilical se examinó para buscar 2 arterias 20 umbilicales y 1 vena del cordón umbilical. Una o más de las dos arterias umbilicales y la vena umbilical se canularon para facilitar la perfusión. En primer lugar, se insertó una cánula recta de 6 mm en una vena del cordón umbilical y se ató en su lugar con el hilo de seda o, después, ambas arterias se insertaron cada una con cánulas rectas de 2 mm y se colocaron en su lugar con hilos de seda o. La placenta se colocó en el circuito de 25 perfusión (bomba de perfusión renal Waters RM3), que se cebó con medio Belzer MPS plus 1000-2000 U de heparina (600-750 ml de Belzer MPS con 2000 U heparina sódica) a una temperatura de 1ºC a 27ºC. El medio Belzer MPS es un líquido de perfusión de órganos aprobado por la FDA usado para la conservación de órganos donados para trasplante de cadáver (Gage et al., 1997). La perfusión pulsátil en máquina se realizó a 30 60 latidos/min y la presión sistólica estaba en entre 30-70 mmHg. El tiempo medio para completar la perfusión fue de 26 minutos (intervalo 20-30 min). Para determinar la finalización de la perfusión placentaria se utilizó el cambio de color del tejido de la placenta desde un color azul oscuro a un color blanco claro como marcador de la evacuación total del contenido vascular en la placenta. 35 Se recogieron ocho muestras de SC mediante punción venosa y el método de la máquina de perfusión placentaria del mismo sujeto y sus descripciones cuantitativas se resumen en la Tabla l. El volumen medio de la se recogida por punción venosa fue como se ha descrito anteriormente. El volumen de la SC obtenida mediante el método placenta 40 máquina de perfusión pulsátil no se pudo medir, ya que el liquido de perfusión y la SC se mezclaron en el extremo. La gestación media de la placenta recogida fue de 38,6 semanas (intervalo de 36-41 semanas) y el tamaño medio de la placenta para el diámetro y el espesor fue de 20 x 1 cm (17 a 22 x 1 cm). Las placentas se obtuvieron de una cesárea (muestra 1) y 7 partos vaginales (muestra 2-8). El tiempo medio desde el parto 45 de la placenta al inicio de la perfusión fue de 17 horas (media) (6,25-39 horas), y el tiempo de duración del procedimiento de perfusión de la placenta fue de menos de 30 min por placenta (media de 26 minutos, intervalo 20-30 min) (Tabla I). Se encontró trombosis en 3 placentas (muestras 3, 5, y 6) y fue de aproximadamente 5%, 10% y 7% de la superficie total de la placenta, pero no se vio en otros sujetos. Estas placentas se 50 introdujeron en hielo a una temperatura de 4ºC en un cofre aislado térmicamente entre 19 20 y 39 horas hasta el inicio de la perfusión. En general, no hubo dificultades en la realización de perfusión en máquina para cada placenta que se analizó, incluyendo aquellas con trombosis, y no se observó barotrauma causado por la máquina de perfusión pulsátil. 5 2. Análisis de la solución obtenida de PMPP en comparación con el método de obtención 10 de sangre de cordón convencional Aislamiento de células mononucleares de SC Las células de SC obtenidas por punción venosa de la vasculatura de la placenta se 15 diluyeron primero con medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) a 1:5 y las células mononucleares se aislaron por Ficoll-Hypaque (Sigma Diagnostic, St Louis, MO) centrifugación por gradiente de densidad como se ha descrito previamente 8Takebe et al., 2002). La capa que contiene las células mononucleares se aspiró suavemente, las células se lavaron dos veces con solución PBS y se contaron mediante citómetro. La 20 viabilidad celular se confirmó por el método de exclusión con azul tripán. Las células de SC obtenidas a través de PMPP se procesaron de manera similar a las células de SC obtenidas mediante punción venosa. Sin embargo, estas células se mezclaron en un gran volumen de líquido de perfusión (650 a 800 ml de volumen total). Este líquido de perfusión se dividió en alícuotas entre varias docenas o similar de tubos cónicos de 50 ml 25 de modo que se centrifugaron juntos a 1800 rpm durante 20 minutos para obtener la capa de la capa leucocitaria. Después, las células se separaron aún más para las células mononucleares con centrifugación por gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque. Las células de SC se lavaron y se contaron tal como se ha descrito anteriormente. 30 Análisis por citometría de flujo Las células mononucleares se tiñeron con anticuerpos monoclonales, incluyendo CD38-FITC, CD34-APC (BD Pharmingen, San Jose, CA), AC133-PE (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) anti-humanos y se analizaron mediante Facstar-plus (Becton Dickinson) según las 35 instrucciones del fabricante. Los controles de isotipo se realizaron con anticuerpos apropiados en paralelo para cada muestra. 40 21 Selección de células CD34+ Las alícuotas de las células mononucleares de SC obtenidas mediante centrifugación por gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque se aislaron adicionalmente para enriquecer la población de células CD34+ mediante el método de separación celular magnética usando 5 el kit de aislamiento de células progenitoras CD34 (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. El número de células purificadas y la viabilidad se determinaron mediante citómetro y prueba de exclusión con azul tripán. El enriquecimiento para las células CD34+ se confirmó por análisis de citometría de flujo, y cada lote aislado mostró más de un 90% de pureza de células CD34+ con una viabilidad 10 superior al 95% por el método de exclusión con azul tripán. Ensayos de unidad formadora de colonias con metilcelulosa Las células de SC CD34+ purificadas (3 x 103 por placa) se sembraron en placas de 15 cultivo de 35 mm como se ha descrito previamente. Las células se cultivaron en el medio de cultivo disponible comercialmente, MethoCult (StemCell Technology, Vancouver, Canadá), compuesto por 1 ml de IMDM, 1% de metilcelulosa, BSA, 2mercaptoetanol, L-glutamina, insulina, transferrina, SCF, GM-CSF, IL -3, IL-6, G-CSF, eritropoyetina según las instrucciones del fabricante. El día 14, las colonias (mayores de 50 células) se 20 enumeraron a partir de las placas de cultivo duplicadas. 25 22 23 24 Referencias Las siguientes referencias se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. 5 ALMEIDA-PORADA, G., PORADA, C.D., CHAMBERLAIN, J., TORABI, A., and ZANJANI, E.D. (2004). Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood 104, 2582-2590. 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Claims (6)

1. 31 REIVINDICACIONES 1. Un método de recoger células madre hematopoyéticas de sangre de cordón, que comprende: 5 proporcionar una placenta de mamífero no exanguinada aislada, que comprende sangre del cordón que comprende células madre hematopoyéticas de sangre de cordón; realizar perfusión pulsátil en máquina de la placenta de mamífero aislada no exanguinada con un flujo pulsátil mediado por presión de una solución de perfusión para producir un 10 líquido de perfusión que comprende sangre de cordón que comprende células madre hematopoyéticas de sangre de cordón; recoger el líquido de perfusión; y 15 aislar las células madre hematopoyéticas de sangre de cordón del líquido de perfusión para producir células madre hematopoyéticas de sangre de cordón aislado.
2. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la perfusión se realiza utilizando una fuente de presión. 20
3. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende: después de proporcionarla, guardar la placenta de mamífero aislada en hielo para producir una placenta de mamífero enfriada. 25
4. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la solución de perfusión comprende heparina.
5. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la perfusión comprende prefundir a través de una o dos de las arterías umbilicales. 30
6. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la perfusión comprende además la canulación de las una o dos arterias umbilicales para producir una placenta canulada; y la colocación de la placenta canulada en un circuito de perfusión. 35