ES2581978T3 - Un método de presensibilización de cánceres antes de radioterapia y/o quimioterapia y una nueva mezcla de citoquinas - Google Patents

Abstract

Uso de una cantidad terapéuticamente activa de una mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitógeno para la fabricación de un medicamento para presensibilizar tumores de carcinoma espinocelular antes de un tratamiento terapéutico, en donde dicha mezcla de citoquinas comprende las relaciones específicas de IL-1-, TNF-0, IFN-1 y GM-CSF a interleuquina 2 (IL-2) como sigue: (a) IL-1- a IL-2 en un intervalo de relación de 0,4 - 1,5; (b) TNF-0 a IL-2 en un intervalo de relación de 3,2 - 11,3; (c) IFN-1 a IL2 en un intervalo de relación de 1,5 - 10,9; y, (d) GM-CSF a IL-2 en un intervalo de relación de 2,2 - 4,8, en donde la mitad de dicha mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitógeno se va a administrar peritumoralmente en un margen perimetral de la masa tumoral y la otra mitad de dicha mezcla se va a administrar en la cadena linfática submandibular ipsilateral respecto a la masa tumoral tres veces a la semana durante un periodo de dos semanas en un intervalo de aproximadamente 20 UI a 1600 UI en donde UI representa unidades internacionales para la interleuquina 2 proporcionadas en el 1er Estándar Internacional de la Organización Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.

Description

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DESCRIPCION

Un metodo de presensibilizacion de canceres antes de radioterapia y/o quimioterapia y una nueva mezcla de citoquinas

Introduccion

La presente invencion se refiere a un avance muy importante con el uso de una nueva mezcla de citoquinas para presensibilizar los tumores del carcinoma espinocelular oral (OSCCT) antes de un tratamiento terapeutico tal como quimioterapia, radioterapia o inmunoterapia. La mezcla de citoquinas es una mezcla exenta de suero y una mezcla exenta de mitogeno comprendida por relaciones especificas de citoquinas tales como IL-1p, TNF-a, IFN-y y GM-CSF a interleuquina 2 QDL-2), que es eficaz para inducir las celulas cancerosas a iniciar una fase de ciclo celular proliferativo aumentando de esta forma su vulnerabilidad a la quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia. Una de dichas nuevas mezclas de citoquinas es la inyeccion de interleuquina leucocitica (LI) o Multikine® que se puede usar sola o junto con otros farmacos para el tratamiento del cancer, aumentando por lo tanto el exito del tratamiento del cancer y la supervivencia sin enfermedad de los pacientes de cancer.

Antecedentes de la invencion

Los tratamientos actuales del cancer, y en concreto de los tumores solidos, comprenden principalmente la intervencion quirurgica seguida por radioterapia y/o quimioterapia. Dunne-Daly CF, "Principles of radiotherapy and radiobiology", Semin Oncol Nurs. 1999 Nov;15(4):250-9; Hensley ML et al., "American Society of Clinical Oncology clinical practice guidelines for the use of chemotherapy and radiotherapy protectants.", J Clin Oncol. octubre de 1999; 17(10): 3333-55. Junto con los mencionados tratamientos, se usan agentes quimioterapeuticos toxicos tales como Gemcidabina, Vinblastina, Cisplatino, Fluorouracilo, Gleevec, Metotrexato, que son incapaces de diferenciar entre celulas normales y celulas cancerosas. Aunque eficaces, estos y otros agentes quimioterapeuticos toxicos han hecho poco para aumentar la supervivencia global del paciente. Ademas, los tratamientos actuales en general fracasan tambien en aumentar la tasa de supervivencia de 5 anos de los pacientes con cancer a pesar de la combinacion sinergica de quimioterapias y radioterapias. Incluso los agentes receptores del factor de crecimiento antiepidermico, los farmacos antiangiogenicos y los tratamientos inmunologicos e inmunoadyuvantes que utilizan farmacos tales como Rituximab, Erbitux y Herceptin han fracasado en aumentar significativamente la tasa de supervivencia de 5 anos de los pacientes con cancer. Adicionalmente, la remision completa o supervivencia sin enfermedad de los pacientes con cancer sin tener en cuenta el tipo de cancer no ha aumentado para ninguno de los tratamientos anteriormente mencionados o las combinaciones sinergicas de los mismos.

Una modalidad de tratamiento investigada que aumenta las tasas de supervivencia sin enfermedad o que conduce a la remision completa es la manipulacion del ciclo de division celular de las celulas cancerosas. En particular, las celulas tumorales que ciclan son generalmente mas vulnerables a las radioterapias y a las quimioterapias que las celulas tumorales que no ciclan debido a los procesos bioquimicos complejos y a procesos biomoleculares tales como la replication del ADN dependiente de la enzima, fosforilacion dependiente de la enzima, cascadas de senalizacion, asociacion y disociacion de los complejos moleculares activadores de la transcription, y se requiere la formation y disociacion de ensamblajes macromoleculares de elementos citoestructurales durante el ciclo celular. Mediante la induction de las celulas tumorales a iniciar una fase del ciclo celular, se pueden usar agentes antimetabolicos que inhiben cualquiera de los procesos bioquimicos complejos tales como inhibidores de la ribonucleotido reductasa (RNR), inhibidores de la dihidrofolato reductasa o del aDn polimerasa para detener el ciclo celular y evitar por tanto la proliferation del tumor.

Sin embargo, los metodos conocidos que aprovechan el ciclo celular estan limitados a sincronizar la detention del ciclo celular con aplicaciones secuenciales de un agente quimioterapeutico. Por ejemplo, un metodo conocido de detener las celulas malignas en una fase S del ciclo celular con analogos de pirimidina seguido por la exposition a altas concentraciones de antimetabolitos. B. Bhutan et al., Cancer Res. 33:888-894 (1973). Pocas o ninguna celula en la poblacion puede continuar mas alla de este punto de detencion tras la aplicacion del antimetabolito. W Vogel et al., Hum. Genet. 45:193-8 (1978).

Otros esfuerzos incluyen metodos para manipular el ciclo de division celular alterando la distribution del ciclo celular en la poblacion de celulas. Estos protocolos estimulan las celulas malignas desde una fase durmiente a una fase del ciclo celular aumentando por tanto su vulnerabilidad a los farmacos antimetabolicos que actuan durante la fase vulnerable de la replicacion del ADN. H Euler et al., Ann. Med. Interne. (Paris) 145:296-302 (1994); B C Lampkin et al., J. Clin. Invest. 50:2204-14 (1971); Alama et al., Anticancer Res. 10:853-8 (1990). Por el contrario, otros metodos conocidos impiden a las celulas normales penetrar en la fase S protegiendo por tanto a las celulas normales de los farmacos quimiotacticos.

Otros metodos mas conocidos de sincronizar la fase del ciclo celular con agentes quimioterapeuticos es la denominada quimioterapia de dosis pulsante, descrita por R E Moran et al., Cancer Treat. Rep. 64:81-6 (1980). En esta solution, las celulas tumorales leucemicas en ratones se detuvieron en la fase S del ciclo celular con una infusion de hidroxiurea. Tras la infusion, las celulas se "liberaron" para continuar el ciclo celular momento en que se

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proporciona un "pulso" de un segundo agente (Ara-C) a los ratones. El intento era aumentar al maximo la incidencia del segundo agente a medida que las celulas que ciclan desplazandose a la fase S del ciclo fueran vulnerables. Sin embargo, los resultados indicaron que, aunque los ratones tratados con Ara-C exactamente despues de la infusion de hidroxiurea mostraron una mayor supervivencia, los ratones tratados con Ara-C posteriormente despues de la infusion de hidroxiurea no muestra supervivencia aumentada. Claramente, un ciclo celular con una sincronizacion simple con un segundo agente que no actua de forma simultanea no mejora la actuacion de los dos agentes.

Sin embargo, los metodos conocidos que toman ventaja del ciclo celular continuan buscando una sinergia optima pero pasiva entre la dosificacion, la farmacocinetica, la secuencia y el calendario.

Debe esperarse que confinar una poblacion de celulas en una fase vulnerable del ciclo celular en la que las celulas son especificamente vulnerables al dano puede cambiar la dinamica de la destruccion celular hacia una mayor eficacia con una mayor reduccion en los efectos secundarios disminuyendo la exposicion a los farmacos toxicos. Sin embargo, los experimentos actuales toman ventaja de la detencion del ciclo celular o la sincronizacion estatica ha sido decepcionante debido a que los metodos conocidos son incapaces de inducir realmente las celulas a un ciclo celular. En su lugar, todos los metodos conocidos necesitan tiempo para llevar a cabo la combination sinergica de la detencion del ciclo celular o la sincronizacion estatica con la poblacion de celulas diana. Ademas, agentes tales como pirimidina e hidroxiurea usados para efectuar el ciclo celular pueden producir dano a celulas normales.

Otra solution seria, por supuesto, inducir a las celulas a entrar en la fase del ciclo celular en vez de detener el ciclo celular o sincronizar el ciclo celular. Sin embargo, como se preveia de otra forma en la tecnica, inducir a las celulas a entrar en el ciclo celular aumenta el riesgo de crecimiento y recurrencia rapida del tumor. Pero el fracaso continuado de composiciones conocidas por aumentar las tasas de supervivencia sin enfermedad o conducir a la remision completa sugiere una necesidad de inducir a las celulas malignas a entrar en el ciclo celular de manera que no prolifere el tumor, pero aumente la susceptibilidad del tumor residual al seguimiento del tratamiento con radiation y/o quimioterapia.

Por tanto, existe una necesidad de metodos para inducir celulas tumorales en un ciclo celular seleccionado entre el grupo de (diferentes fases del ciclo celular) Gi, S, G2 y M donde los nuevos metodos pueden aplicarse de forma sinergica con quimioterapia, inmunoterapia y radioterapia. Existe tambien una necesidad de presensibilizar tumores cancerosos en general junto con la necesidad de una nueva mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogenos comprendida por relaciones especificas de IL-I p a IL-2, TNF-a a IL-2, IFN-y a IL-2 y GM-CSF a IL-2 que demostro de forma inesperada mucha mejor eficacia sobre composiciones conocidas en la induction de celulas tumorales a entrar en una fase de ciclo celular o para presensibilizar un cancer.

Sumario de la invencion

La presente invencion se basa, en parte, en presensibilizar OSCCT utilizando una nueva mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogenos que tiene relaciones especificas de IL-I p a IL-2, TNF-a a IL-2, IFN-y a IL-2 y GM-CSF a IL-2. Se describe tambien en el presente documento el desarrollo de composiciones utiles como agentes farmaceuticos o como un adyuvante para utilizarse junto con tratamientos terapeuticos anticancerosos tales como quimioterapia, inmunoterapia y radioterapia.

Se divulga tambien en el presente documento un metodo para mejorar la quimioterapia o radioterapia convencional de neoplasmas o enfermedades del sistema inmunitario con una mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogenos. Los metodos proporcionan una etapa de presensibilacion para el tratamiento del cancer junto con radioterapias u otras modalidades fisicas de muerte celular. Se contempla tambien un metodo para inducir celulas tumorales en una fase vulnerable del ciclo celular seleccionada entre el grupo de (diferentes fases del ciclo celular) Gi, S, G2 y M. La presente divulgation no esta limitada a cualquier tipo concreto de cancer y puede incluir cualquier tipo de cancer. Las aplicaciones especificas incluyen administrar una mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno peritumoralmente tres veces a la semana durante un periodo de dos semanas en un intervalo de aproximadamente 20 UI a 1600 UI o especificamente a 400 UI o a 800 UI o mas adicionalmente en cinco veces a la semana en un intervalo de aproximadamente 20 UI a 1600 UI o a 400 UI o a 800 UI, en el que UI representa unidades internacionales de interleuquina-2 segun el 1er Estandar Internacional de la Organization Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.

En el presente documento tambien se describe una preparation de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogenos tal como una inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® a concentraciones nuevas y no evidentes. La preparacion de citoquinas puede ser, adicionalmente, parte de una composition farmaceutica. En la presente invencion, la nueva preparacion exenta de suero y exenta de mitogenos tiene relaciones especificas de citoquina a interleuquina 2 (IL-2) como sigue: IL-1p a IL-2 en un intervalo de relation de 0,4 - 1,5, y preferentemente a 0,7+/- 0,1 (IL-1 p/IL-2), TNF-a a IL-2 en un intervalo de relacion de 3,2 - 11,3, y preferentemente a 9,5+/- 1,8 (TNF- a/IL-2), IFN-y a iL2 en un intervalo de relacion de 1,5 - 10,9, y preferentemente a 6,0+/- 1,1 (IFN-y/IL-2), y GM-CSF a IL-2 en un intervalo de relacion de 2,2 - 4,8, y preferentemente a 4,0+/- 0,5 (GM-CSF/IL-2).

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En la presente invencion, la preparacion de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogenos, o la composicion farmaceutica, tienen ademas diferentes citoquinas y otras moleculas pequenas biologicamente activas en la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® en el que la relacion de cada una de las moleculas pequenas biologicamente activas a IL-2 es como sigue: IL-3 a IL-2 en un intervalo de relacion de 0,38 - 0,68, preferentemente a 0,53+/- 0,15, IL-6 a IL-2 en un intervalo de relacion de 37,2 - 53,8, preferentemente a 46+/- 5,9, IL-8 a IL-2 en un intervalo de relacion de 261 - 561,5, preferentemente a 411+/- 10,6, IL-1 a a IL-2 en un intervalo de relacion de 0,56 - 0,94, preferentemente a 0,75+/- 0,19, IL-10 a IL-2 en un intervalo de relacion de 2,82 - 3,22, preferentemente a 3,0+/- 0,18, IL-16 a IL-2 en un intervalo de relacion de 1,16 - 2,84, preferentemente a 1,84+/-0,68, G-CSF a IL-2 en un intervalo de relacion de 2,16 - 3,78, preferentemente a 2,97+/- 0,81, TNF-p a IL-2 en un intervalo de relacion de 1,17 - 2,43, preferentemente a 1,8+/- 0,63, MIP-1a a IL-2 en un intervalo de relacion de 15,7 - 37,16, preferentemente a 22,7+/- 7,0, MIP-1p a IL-2 en un intervalo de relacion de 17,1 - 28,5, preferentemente a 22,8+/- 5,7, un RANTES a IL-2 en un intervalo de 2,3 - 2,7, preferentemente a 2,5+/- 0,13, un EGF a IL-2 en un intervalo de relacion de 0,267 - 0,283, preferentemente a 0,275+/- 0,008, PGE2 a IL-2 en un intervalo de relacion de 3,63 - 5,42, preferentemente 4,5+/- 0,87 y TxB2 a IL-2 en un intervalo de relacion de 23,47 - 25,13, preferentemente a 24,3+/- 0,83.

Los expertos en la materia que tratan rutinariamente pacientes con cancer saben que existen muchos regimenes diferentes para el tratamiento de los mencionados canceres y la aplicacion de aquellos regimenes a pacientes concretos dependera de la consideracion de varios factores, por ejemplo, el estadio del cancer, la extension de la diseminacion de las celulas cancerosas, por ejemplo, las que han metastatizado, y los atributos fisicos del paciente. Los expertos en la materia ajustan rutinariamente los parametros de un tratamiento concreto, por ejemplo, la dosis, la duracion, la ruta de administracion y la forma administrada, para pacientes concretos, y una persona normalmente experta en la materia ajusta, sin experimentacion innecesaria, dichos parametros. Los dibujos y las tablas acompanantes, que constituyen una parte de la divulgacion, ilustran y, junto con la descripcion, explican el principio de la invencion. Una persona normalmente experta en la materia apreciara que llegaran a ser evidentes otros aspectos de la presente invencion tras la referencia a las figuras adjuntas y la siguiente descripcion detallada.

Breve descripcion de los dibujos

La patente o solicitud contiene al menos contiene al menos un dibujo ejecutado a color. La Oficina proporcionara copias de esta solicitud o publication de solicitud de patente con dibujo(s) a color tras solicitarlo y el pago de los honorarios necesarios.

La invencion se explicara ahora con mayor detalle mediante la siguiente descripcion y las realizaciones especificas y con la ayuda de los dibujos acompanantes.

La Fig. 1 representa el modo de actuation de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine®.

La Fig. 2 representa el efecto del tratamiento de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) sobre el porcentaje de celulas tumorales en ciclo en pacientes que tienen carcinoma espinocelular oral (OSCC) de la cabeza y el cuello con respecto a las evidencias inmunohistoquimicas de celulas positivas para Ki-67 en OSCC en un grupo tratado con LI. Se proporcionan los datos como valores promedios ± SEM (n = 25, control, n = 11, grupo tratado con LI) (*P < 0,05) (0 = control, grupo sin tratar).

La Fig. 3 representa el efecto de aumentar la dosis de tratamiento de inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) en las celulas linfoides detectadas por el marcador CD45 con respecto a la morfometria de densidad de celulas linfoides estromales en el carcinoma espinocelular oral (OSCC) en la superficie del tumor (zona 1.0); centro del tumor (zona 2.0); y la interfase de la superficie tumoral (zona 3.0). Se proporcionan los datos como valores promedios ± SEM (n = 27, grupo control, n = 11, grupo tratado con LI) (*P < 0,05).

La Fig. 4 representa el efecto de aumentar la dosis de tratamiento de inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) sobre el porcentaje de celulas en ciclo en el carcinoma espinocelular oral (OSCC) con respecto a la morfometria. Se han contado celulas positivas para Ki-67 en el compartimento estromal y en los nidos epiteliales tumorales. Se proporcionan los datos como valores promedios ± SEM (n = 25, control, n = 11, grupo tratado con LI) (*P < 0,05) (0 = control, grupo sin tratar).

La Fig. 5 representa el efecto de aumentar la dosis de tratamiento de inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) en las celulas linfoides detectadas por el marcador CD45 con respecto a la morfometria de celulas linfoides intraepiteliales en OSCC. Zona 1.0 = superficie tumoral; Zona 2.0 = centro del tumor; Zona 3.0 = interfase tumor- estroma. Se proporcionan los datos como valores promedios ± SEM (n = 27, grupo control, n = 11, grupo tratado con LI) (*P < 0,05).

La Fig. 6 representa el efecto de aumentar la dosis de tratamiento de inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) sobre la densidad de la interleuquina-2, celulas linfoides positivas a receptor (CD-25) en carcinoma espinocelular oral (OSCC) (morfometria) sobre la densidad estromal. Zona 1.0 = superficie tumoral; Zona 2.0 = centro del tumor; Zona 3.0 = interfase tumor-estroma. Se proporcionan los datos como valores promedios ± SEM (n = 27, grupo control; n = 11, grupo tratado con LI) (*P < 0,05).

La Fig. 7 representa el efecto de aumentar la dosis de tratamiento de inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) sobre la densidad de la interleuquina-2, celulas linfoides positivas a receptor (CD-25) en carcinoma espinocelular oral (OSCC) (morfometria) sobre la densidad intraepitelial. Zona 1.0 = superficie tumoral; Zona 2.0 = centro del tumor; Zona 3.0 = interfase tumor-estroma. Se proporcionan los datos como valores promedios ± SEM (n = 27,

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grupo control; n = 11, grupo tratado con LI) (*P < 0,05).

La Fig. 8 representa un caso control de carcinoma espinocelular oral sobre la densidad de linfocitos T; la inmunolocalizacion de celulas positivas para CD3 en el grupo control (caso 10) en este ensayo (aumento original X400).

La Fig. 9 representa el efecto del tratamiento de inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) del carcinoma espinocelular sobre la densidad de linfocitos T positivos para CD3; la inmunolocalizacion de celulas positivas para CD3 tratadas con LI (caso 31 que tiene un aumento original X400).

La Fig. 10 representa el efecto de aumentar la dosis de tratamiento de inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) sobre la densidad de linfocitos T positivos para CD3 en la morfometria del carcinoma espinocelular oral (OSCC) con respecto a la densidad estromal. Zona 1.0 = superficie tumoral; Zona 2.0 = centro del tumor; Zona 3.0 = interfase tumor-estroma. Se proporcionan los datos como valores promedios ± SEM (n = 27, grupo control; n = 25, grupo tratado con LI) (*P < 0,05).

La Fig. 11 representa el efecto de aumentar la dosis de tratamiento de inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) sobre la densidad de linfocitos T positivos para CD3 en la morfometria del carcinoma espinocelular oral (OSCC) con respecto a la densidad tumoral intraepitelial. Zona 1.0 = superficie tumoral; Zona 2.0 = centro del tumor; Zona 3.0 = interfase tumor-estroma. Se proporcionan los datos como valores promedios ± SEM (n = 27, grupo control; n = 25, tratado con LI

Descripcion detallada de la invencion y de las realizaciones preferidas

La presente invencion se refiere al uso de una nueva mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogenos comprendida por relaciones especificas de IL-I p a IL-2, TNF-a a IL-2, IFN-y a IL-2 y GM-CSF a IL-2 para presensibilizar OSCCT. Una de dichas nuevas mezclas de citoquinas es la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine®, que ha demostrado capacidades inmunomoduladoras. La significacion clinica de la inmunosupresion en pacientes de OSCCT afecta inesperadamente a los metodos de presensibilizar el cancer antes del tratamiento terapeutico y, en particular, a la entrada de celulas tumorales en una fase del ciclo celular.

La inmunorrestauracion de pacientes con cancer de cabeza y de cuello se lleva a cabo mediante la infusion de citoquinas tales como IL2, IFN a-Y o IL-12. Whiteside, "Immunobiology and immunotherapy of head and neck cancer", Curr Oncol Rep 2001; 3:46-55. En cancer de cabeza y cuello, el tratamiento con citoquinas basado en interleuquina dio como resultado el aumento de la inmunidad. Cortesina G et al., "Interleukin-2 injected around tumor-draining lymph nodes in head and neck cancer", Head Neck 1991; 13:125-31; De Stefani et al., "Treatment of oral cavity and oropharynx squamous cell carcinoma with perilymphatic interleukin-2: clinical and pathologic correlations", J Immunother 1996;19:125-33; Valente et al., "Infiltrating leukocyte populations and T-lymphocyte subsets in head and neck squamous cell carcinomas from patients receiving perilymphatic injections of recombinant interleukin 2", Mod Pathol 1990;3:702-8; Whiteside TL et al., "Evidence for local and systemic activation of immune cells by peritumoral injections of interleukin 2 in patients with advanced squamous cell carcinoma of the head and neck", Cancer Res 1990;53:5654-62; Barrera et al., "Combination immunotherapy of squamous cell carcinoma of the head and neck", Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2000;126:345-51; Verastegui et al., "A natural cytokine mixture (IRX-2) and interference with immune suppression induce immune mobilization and regression of head and neck cancer", Int J Immunopharmacol 1997;19:619-27; Hadden et al., "Interleukins and contrasuppression induce immune regression of head and neck cancer", Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1994;120:395-403. Por ejemplo, se uso (r)hIL-2 humano satisfactoriamente para aumentar la funcion inmunitaria de los pacientes de cancer de cabeza y cuello como se midio mediante los linfocitos T citotoxicos [LTC] y las respuestas de hipersensibilidad de tipo retrasado [DTH]. Se mostro la respuesta disminuida de los linfocitos T mediante la expresion disminuida del receptor de linfocitos T (TCR), sus componentes de senalizacion claves, la cadena ^ y zap-70, la ausencia de production de IL-2 y la apoptosis aumentada de los linfocitos T. Whiteside TL., "Immunobiology and immunotherapy of head and neck cancer", Curr Oncol Rep 2001;3:46-55. Los estudios que investigaban las causas de la alteration de la funcion de los linfocitos T en el cancer de cabeza y cuello mostraron que los sistemas Fas-FasL, TGF-P y PGE2 se expresaban a niveles elevados.

Sin embargo, la administration in vivo de rIL-2 aumento la densidad de las celulas CD25+ asi como la de los linfocitos citoliticos naturales (NK, natural killer), los linfocitos (HLA)-DR+ del antigeno de los leucocitos humanos y los linfocitos T. En otra serie de estudios se han observado respuestas clinicas positivas cuando se administro una mezcla de citoquinas por via perilinfatica o peritumoral. Sin embargo, ninguno de estos estudios correlaciono una respuesta inmunitaria aumentada con un tratamiento de seguimiento definitivo tal como cirugia, radioterapia y/o quimioterapia.

La tecnologia

Multikine® o inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI), es una preparation exenta de suero, exenta de mitogenos, exenta de antibioticos, producida a partir de celulas mononucleares de sangre periferica humanas que incluye linfocitos T, linfocitos B y macrofagos. Existen tres "familias" de citoquinas en la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® que transmiten juntas la actividad biologica unica de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine®. Incluyen citoquinas citotoxicas/citostaticas y virocidas/virostaticas directas tales como TNF-a, e IFN-y, citoquinas linfoproliferativas tales como IL-1, e IL-2 y citoquinas quimiotacticas tales como IL-6, IL-8

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y MIP-1a. Adicionalmente, las diferentes citoquinas y pequenas moleculas biologicas que constituyen la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se derivan de la estimulacion in vitro de la lectina (por ejemplo, PHA) de celulas mononucleares de sangre periferica humana que incluyen linfocitos T, linfocitos B, y macrofagos. La centrifugacion en un gradiente de Ficoll-Paque separa los globulos blancos (incluyendo los linfocitos T, linfocitos B, y macrofagos) del donante de sangre completa, y una serie de lavados (en medios fisiologicamente tamponados) facilita el aislamiento de linfocitos, y la eliminacion de globulos rojos, residuos celulares y otros componentes celulares no deseados procedentes de componentes de globulos blancos aislados del sonante de sangre completa.

La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® contiene diferentes citoquinas presentes en relaciones especificas de cada citoquina a interleuquina 2 (IL-2) como sigue: IL-1p a IL-2 en un intervalo de relacion de 0,4 - 1,5, y preferentemente a 0,7+/- 0,1 (IL-1p/IL2), TNF-a a IL-2 en un intervalo de relacion de 3,2 - 11,3, y preferentemente a 9,5+/- 1,8 (TNF-a/IL-2), IFN-y a IL-2 en un intervalo de relacion de 1,5 - 10,9, y preferentemente a 6,0+/- 1,1 (IFN-y/IL-2), y GM-CSF a IL-2 en un intervalo de relacion de 2,2 - 4,8, y preferentemente a 4,0+/- 0,5 (GM- CSF/IL-2).

El resto de las diferentes citoquinas y otras moleculas pequenas biologicamente activas en la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® que estan tambien presentes en cada preparacion de la pequenas molecula biologicamente activa a IL-2 es como sigue: IL-3 a IL-2 en un intervalo de relacion de 0,38 - 0,68, preferentemente a 0,53+/- 0,15, IL-6 a IL-2 en un intervalo de relacion de 37,2 - 53,8, preferentemente a 46+/- 5,9, IL-8 a IL-2 en un intervalo de relacion de 261 - 561,5, preferentemente a 411+/- 10,6, IL-1a a IL-2 en un intervalo de relacion de 0,56 - 0,94, preferentemente a 0,75+/- 0,19, IL-10 a IL-2 en un intervalo de relacion de 2,82 - 3,22, preferentemente a 3,0+/- 0,18, IL-16 a IL-2 en un intervalo de relacion de 1,16 - 2,84, preferentemente a 1,84+/-0,68, G-CSF a IL-2 en un intervalo de relacion de 2,16 - 3,78, preferentemente a 2,97+/- 0,81, TNF-p a IL-2 en un intervalo de relacion de 1,17 - 2,43, preferentemente a 1,8+/- 0,63, MIP-1a a IL-2 en un intervalo de relacion de 15,7 - 37,16, preferentemente a 22,7+/- 7,0, MIP-1p a IL-2 en un intervalo de relacion de 17,1 - 28,5, preferentemente a 22,8+/- 5,7, un RANTES a IL-2 en un intervalo de 2,3 - 2,7, preferentemente a 2,5+/- 0,13, un EGF a IL-2 en un intervalo de relacion de 0,267 - 0,283, preferentemente a 0,275+/- 0,008, PGE2 a IL-2 en un intervalo de relacion de 3,63 - 5,42, preferentemente 4,5+/- 0,87 y TxB2 a IL-2 en un intervalo de relacion de 23,47 - 25,13, preferentemente a 24,3+/- 0,83.

La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se ensayo utilizando un protocolo de caracterizacion y no contiene las siguientes citoquinas y otras moleculas pequenas biologicamente activas: IL-4, IL-7, e IL-15, TfR, sICAM, PDGFAB, IFN-a, EpO, LTC 4, TNF-p2, FGF basico, Angiogenina, sE-selectina, SCF, y LIF. La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® contiene solo cantidades traza (exactamente por encima del nivel de deteccion del ensayo) de iL-12, y LTB 4.

En el proceso de fabricacion, las celulas mononucleares se separaron de la "capa leucocitaria" del donante humano mediante centrifugacion en gradiente por etapas y se cultivaron con PHA para potenciar la produccion y la secrecion de IL-2 y otras citoquinas de los globulos blancos del donante en cultivo como se divulga en las patentes de Estados Unidos 5.093.479, 4.390.623, 4.388.309, 4.406.830, 4.661.447, 4.681.844 y 4.464.355, que se han incorporado por referencia en el presente documento. Posteriormente, el cultivo del sobrenadante se recogio asepticamente, se clarifico y se sometio a un proceso de exclusion del virus comercial. El sobrenadante se concentro a continuacion adicionalmente aproximadamente 10 veces mediante ultrafiltracion y microfiltracion.

En ese momento, se anadio una inyeccion USP de seroalbumina humana y el concentrado se tampono a continuacion a pH fisiologico y se llevo a una concentracion diana de IL-2 para la etiqueta reivindicada (ejemplo 400 Ul/ml). El concentrado se sometio a continuacion a una segunda microfiltracion (filtro de un tamano de 0,22 micrometros) y se dispenso asepticamente en viales de tipo suero esteriles y se etiqueto por su contenido de IL-2. Se midio la potencia del producto por la incorporacion de timidina radiomarcada por una linea linfoide de linfocitos T citotoxicos (CTLL-2). El agente inyectable final se ensayo adicionalmente mediante ELISA para la presencia de cinco citoquinas marcadoras: IL-2, IL1p, GM-CSF, IFN-y, y TNF-a.

La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se proporciona congelada en un vial de vidrio borosilicatado para suero que contiene 2,2 ml de farmaco en la etiqueta reivindicada como IL-2 (400 lU/ml) para administracion peritumoral, intratumoral, perilinfatica o subcutanea. La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se sometio a ensayos de control de calidad para determinar la identidad, esterilidad, endotoxinas bacterianas, pH, y concentracion de proteinas totales. Cada vial se inspecciono para determinar la contamination particulada y el aspecto. La preparacion tiene un contenido de proteinas totales de aproximadamente 3 mg/ml (o +/- 1 mg/ml) en el que el material se suministra esteril y exento de pirogenos. La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® tiene una fecha de caducidad asignada de 24 meses desde la fecha de fabricacion cunado el farmaco se almacena a -20 °C.

Definiciones

IL-2 - Interleuquina 2 (IL-2): una glicoprotema de 15,5 kD sintetizada mediante linfocitos T auxiliares CD4+ (conocida formalmente como factor de crecimiento de linfocitos T). IL-2 tiene un efecto autocrino que actua sobre los linfocitos

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T CD4+ que producen esta y en otras celulas del sistema inmune (incluyendo los linfocitos B, linfocitos T CD8+, linfocitos NK [citoliticos naturales] y otros).

IL-1p - Interleuquina 1 beta (IL-1p): una citoquina de 17 kD sintetizada por fagocitos mononucleares activados, se encuentra en forma libre en la circulacion y media en las respuestas inflamatorias. Actua sobre los linfocitos CD4+ para ayudar a facilitar su proliferacion, y actua sobre los linfocitos B como un factor de crecimiento y diferenciacion. Induce tambien la smtesis de IL6 por los fagocitos mononucleares.

TNF-a - Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-a): una proteina de 157 restos de aminoacidos (aa), sintetizada por monocitos estimulados, macrofagos, linfocitos B, linfocitos T, y linfocitos NK entre otros, se encuentra en forma trimerica en la circulacion. TNF media en la accion antitumoral directa, produciendo la lisis de celulas tumorales, facilita el reclutamiento de leucocitos, induciendo la angiogenesis y promueve la proliferacion de linfoblastos.

IFN-y- Interferon Gamma (IFN-y): un homodimero de la glicoprotema de 21-24 kD sintetizada por los linfocitos T activados y los linfocitos NK, es un potente activador de los monocitos que aumenta la capacidad de los monocitos de destruir microorganismos intracelulares y celulas tumorales. Tiene una actividad antivirica y antiproliferativa directa, y da lugar a que muchos tipos celulares expresen el complejo molecular superficial celular MHC de Clase II (complejo mayor de histocompatibilidad), asi como al aumento de la expresion del MHC de Clase I.

GM-CSF - Factor estimulador de colonias de macrofagos granulocitos (GM-CSF): Una proteina de 127 aa se encuentra como un monomero en la circulacion, producida por macrofagos y linfocitos T, fibroblastos y celulas endoteliales. Es un factor de crecimiento para celulas hemopoyeticas, y estimula el crecimiento y la diferenciacion del linaje mielomonocitico.

IL-3 - Interleuquina - 3 (IL-3): una linfoquina de 20 kD sintetizada por los linfocitos T auxiliares CD4+, actua como un factor estimulador de colonias facilitando la proliferacion de algunas celulas hematopoyeticas y promoviendo la proliferacion y la diferenciacion de los linfocitos T.

IL-6 - Interleuquina - 6 (IL-6): una citoquina de 26 kD producida por linfocitos T activados, fagocitos mononucleares, celulas endoteliales, y fibroblastos. Actua sobre muchas celulas, pero tiene una funcion especial de permitir a los linfocitos B activados diferenciarse en las celulas plasmaticas que secretan anticuerpos, e induce a los hepatocitos a formar proteinas en fase aguda (implicadas en respuestas inflamatorias) asi como fibrinogeno.

IL-8 - Interleuquina - 8 (IL-8): Una proteina de 8 kD producida por macrofagos y celulas endoteliales. Es un potente factor quimiotactico para neutrofilos y linfocitos T, y facilita la adherencia de los neutrofilos a las celulas endoteliales.

IL-1 a - Interleuquina 1 alfa (IL-1 a): Una citoquina de 17-kD (similar a IL-1 p) se escinde de una molecula precursora de 33-kD, sintetizada por fagocitos mononucleares activados, se encuentra raramente en forma libre en la circulacion y actua como una sustancia asociada a membrana. Ayuda a IL-1p en la mediacion de las respuestas inflamatorias.

IL-10 - Interleuquina - 10 (IL-10): Un polipeptido de 18 kD producido por linfocitos T CD4+ y CD 8+, monocitos, macrofagos, linfocitos B activados, y queratinocitos. Inhibe la capacidad de los macrofagos de presentar antigenos, particularmente a celulas de tipo Th1 , y secretar IL-6 y TNF.

IL-16 - Interleuquina - 16 (IL-16): una proteina tetramerica de 14 kD producida por linfocitos T CD8+, eosinofilos, mastocitos y celulas epiteliales respiratorias. Tiene fuertes propiedades quimioatractivas para los linfocitos T CD4+ y los monocitos.

G-CSF - Factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF): una glicoprotema homodimerica de 22 - 25 kD producida por macrofagos, celulas endoteliales, fibroblastos y celulas estromales. Aumenta las celulas progenitoras de granulocitos en la medula osea, y sostiene el aumento de neutrofilos en sangre. Potencia tambien la capacidad de los neutrofilos para presentar produccion potenciada de superoxido que se piensa que es importante en la de destruccion de celulas infectadas microbianamente y celulas tumorales.

TNF-p - Factor de necrosis tumoral beta (TNF-p): una proteina de 25 kD producida por linfocitos activados. Puede destruir celulas tumorales en cultivo, y estimula la proliferacion de fibroblastos. Ademas, imita la mayoria de las diferentes acciones de TNF-a.

MIP-1a - Proteina inflamatoria de macrofagos - 1 alfa (MIP-1a): Una proteina monomerica de 66 aa producida por macrofagos y celulas endoteliales. Es un quimioatrayente de los monocitos, linfocitos T y eosinofilos.

RANTES - Una proteina de 8 kD producida por los linfocitos T es un quimioatrayente de monocitos, linfocitos T y eosinofilos, y promueve la inflamacion.

EGF - Factor de crecimiento epidermico (EGF): Un polipeptido trisulfatado de 53 restos aa. EGF es un miembro de la familia de la tirosina quinasa, y tiene multiples funciones, incluyendo la estimulacion de la respuesta mitogena y

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ayuda en la cicatrizacion de la herida.

PGE2 - Prostaglandina E2 (PGE2): PGE2 pertenece a una familia de lipidos biologicamente activos derivados de acido araquidonico a traves de la reaccion enzimatica de la ciclooxigenasa. Se libera mediante monocitos activados y bloquea la expresion de MHC de Clase II en los linfocitos T y los macrofagos.

TxB2 - Tromboxano B2 (TXB2): TxB2 es un miembro de compuestos biologicamente activos derivados de acidos grasos poliinsaturados por isomerizacion de la prostaglandina y la endoperoxidasa PGH2 mediante la enzima tromboxano sintetasa. TxB2 tiene un papel fisiologico en la enfermedad tromboembolica, y reacciones anafilacticas.

celulas CD25+ - CD25 es una glicoproteina de cadena unica, denominada a menudo como la cadena a del receptor de la interleuquina 2 (IL-2R) o el antigeno Tac que tiene un peso molecular de 55 kDa y esta presente en los linfocitos T y B activados y en los macrofagos activados. Funciona como un receptor de IL2. Junto con la cadena p de la IL-2R, el antigeno CD25 forma un complejo receptor de elevada afinidad para IL-2.

CTLL-2 (linea celular) - Una linea de linfocitos T citotoxicos de raton obtenidos de ratones C57B1/6. Esta linea de linfocitos T es dependiente de una fuente exogena de IL-2 para el crecimiento y la proliferacion.

Fas - FasL-El sistema Fas/Ligando de Fas. La combinacion de un antigeno de Fas, una proteina transmembrana de la superficie celular que media en la apoptosis, y una citoquina activada por Fas complementaria en un neutrofilo que transduce una senal apoptotica en las celulas. Fas es una proteina de membrana de tipo I que pertenece a la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF), y FasL es un miembro de la familia TNF. El ligando FAS es una proteina de union a membrana de 31 kDa [kilo Dalton] (278 aminoacidos). El sistema FAS-ligando de Fas juega importantes papeles en muchos procesos biologicos, incluyendo la eliminacion de celulas linfoides autorreactivas. El ligando de Fas se expresa predominantemente en linfocitos T activados y es una de las moleculas efectoras principales de los linfocitos T citotoxicos y linfocitos citoliticos naturales.

Linfocitos HLA-DR+ - Linfocitos que contienen el antigeno de los leucocitos humanos, los antigenos (HLA)-DR, un grupo de glicoprotemas polimorficas determinado por una secuencia glue que se encuentra en los loci de leucocitos localizados en el cromosoma 6, los loci de histocompatibilidad mayor en seres humanos.

UI (Unidades Internacionales) - Una unidad de medida de la potencia de preparaciones biologicas mediante comparacion con un patron de referencia internacional de un peso y una resistencia especificas, por ejemplo, 1er Estandar Internacional de la OMS para la IL-2 humana, 86/504. Las Unidades Internacionales son el unico metodo reconocido y normalizado para notificar las unidades de actividad biologica que se publican y se derivan de un esfuerzo internacional de colaboracion en investigacion.

U (Unidades como una medida de la actividad biologica) - Abreviaturas para varias "unidades" nombradas, que cada laboratorio deriva como una referencia, que es ademas unica para el laboratorio donde se esta realizando el trabajo. Cada "unidad" es diferente de un laboratorio a otro y no es un estandar globalmente reconocido tal como las Unidades Internacionales (UI).

Infiltrado mononuclear - Presencia de monocitos, celulas plasmaticas, y linfocitos, en tejido donde no deberia estar "normalmente" presente; o la presencia de estas celulas en gran cantidad o abundancia en agrupaciones en donde estarian presentes de otra forma en solo un pequeno numero.

Cadena ^ de TCR - cadena zeta del receptor de linfocitos T. La subunidad zeta es parte del complejo TCR y se dirige hacia la interaccion del receptor superficial celular de TCR con su ligando (antigeno). La subunidad zeta que se extiende en el citoplasma celular (citosol) se fosforila en sus restos tirosina tras la activacion de los linfocitos T y esta implicada en la transduccion de la senal tras la ligadura de TCR.

TIL (Linfocitos infiltradores del tumor) - Linfocitos T aislados del tumor en el que se infiltran. Los linfocitos infiltradores del tumor tienen poco o ninguna citotoxicidad. Los TIL incluyen linfocitos T, predominantemente CD4+ CD8+, y se pueden expandir in vitro mediante cultivo en presencia de IL-2. Estas celulas se activan por el tratamiento con IL-2 y son frecuentemente mas agresivas hacia el tumor del cual se aislaron que las celulas activadas por linfoquinas normales. La actividad citotoxica de los TIL puede potenciarse mediante IFN-y. La actividad antitumoral de las TIL in vivo puede bloquearse mediante TNF-p.

ZAP 70 - Una proteina Zeta de 70 kD asociada con la cadena ^ de TCR que es una tirosina quinasa presente en el citosol. Se piensa que ZAP 70 participa en el mantenimiento de la senalizacion del receptor de los linfocitos T, que media en la transduccion de la senal que eventualmente produce IL-2. El gen ZAP70 se expresa en linfocitos T y en linfocitos citoliticos naturales y en las cartografias del cromosoma 2q12 humano.

Cadena ^ (Zeta) - Vease Cadena ^ de TCR. El gen de la cadena Zeta se localiza en el cromosoma 1 en seres humanos. El dominio extracelular de esta proteina tiene nueve aminoacidos de longitud mientras que el dominio transmembrana contiene un resto de acido aspartico cargado negativamente y el dominio citoplasmatico tiene 113

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aminoacidos de longitud. La cola citoplasmatica contiene tres de los motivos de reconocimiento de antigenos que se encuentran en las colas citoplasmaticas de las cadenas CD3. La cadena zeta se asocia tambien con otros receptores tales como el receptor gamma del FC (fragmento cristalino) de los linfocitos NK.

USP - U.S. Pharmacopeia Monographs.

P - "p < 0,01": Un termino en estadistica matematica que denota el nivel de probabilidad de un acontecimiento que se produce en condiciones preestablecidas.

ANOVA (Analisis de varianzas) - Un analisis de un solo factor como se describe en libros de texto de estadistica y matematicas, por ejemplo, "Handbook of Statistical Methods for Engineers and Scientists", Harrison M. Wadsworth, Jr., Ed., McGraw Hill 1990, y "Statistical Operations Analysis of Health Research Data", Robert P. Hirsch y Richard K. Riegelman, Eds. Blackwell Science Inc., 1996.

Modo de actuacion y caracterizacion de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine®

La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® es una mezcla inmunomoduladora biologicamente activa, minimamente toxica, de citoquinas humanas derivadas naturalmente o que se producen naturalmente producidas en condiciones establecidas como se describe en el presente documento. La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se puede usar como un tratamiento anticanceroso y antivirico o como una terapia neoadyuvante con una aplicacion de amplio espectro para el cancer, una enfermedad infecciosa, y otros estados de enfermedad que responden a la inmunomodulacion.

La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se puede preparar mediante metodos conocidos en la tecnica. Mizel et al., "Purification to Apparent Homogeneity of Murine Interleukin 1", J. Immunol. 126:834 (1981); Togawa et al., "Characterization of Lymphocyte-Activating Factor (LAF) Produced by Human Mononuclear Cells: Biochemical Relationship of High and Low Molecular Weight Forms of LAF", J. Immunol. 122: 2112 (1979); Lachman et al., "Purification of Human Interleukin 1", Chem. Abstr. 94: 137539t (1981) de J. Supramolec. Struct. 13: 457 (1980); Lachman et al., "Partial Purification of Human Lymphocyte Activating Factor", Chem. Abstr. 93: 165824e (1980) of Prep. Biochem. 10: 387 (1980); Mizel et al., "Characterization of Lymphocyte Activating Factor Obtained from the Murine Microphage Cell Line P388D1", Chem. Abstr. 93:93346a (1980), of Biochem. Charact. Lymphokines, Proc. Int. Lymphokine Workshop 2nd (1979) pp. 411-418; Economou et al., "Purification, Physicochemical Characterization and a Biological Role of Lymphocyte Activating Factor (LAF)", Chem. Abstr. 93: 93347b (1980) of Biochem. Charact. Lymphokines, Proc. Int. Lymphokine Workshop, 2nd (1979) pp. 419-421; Simon et al., "The Role of Subcellular Factors in Pulmonary Immune Function: Physicochemical Characterization of Two Distinct Species of Lymphocyte-Activating Factor Produced by Rabbit Alveolar Macrophages", J. Immunol. 126: 1534 (1981). Animal studies also demonstrated that "mixed interleukins" may have immunomodulatory and immunostimulatory activity in vitro. Hadden et al., "Mixed Interleukins and Thymosin Fraction V Synergistically Induce T Lymphocyte Development in Hydrocortisone-Treated Aged Mice", Cell. Immunol. 144:228-236 (1992). Sin pretender quedar limitado a teoria alguna de la invencion, una posible hipotesis es que la inyeccion local/regional de "interleuquinas mixtas" tales como la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® supera la inmunosupresion local. Posteriormente, se produce una tolerancia a la rotura y permite que se produzca una respuesta inmunitaria antitumoral local eficaz.

Se ha mostrado que la instilacion local de interleuquinas en la region del tumor o la transfeccion real de genes de la interleuquina en un tumor aumenta marcadamente la respuesta inmunitaria antitumoral resultante en la regresion del tumor como ha notificado Golumbek et al., "Treatment of Established Renal Cancer by Tumor Cells Engineered to Secrete Interleukin4", Science 254:713-716 (1991). Sin embargo, ninguno de estos estudios descubrio el efecto muy esperado de inducir celulas malignas en una fase del ciclo celular sin producir la proliferacion activa del tumor.

Inesperadamente, la administracion de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® antes de la cirugia conduce a un aumento en el numero de celulas tumorales en la fase del ciclo celular sin aumentar el riesgo de un crecimiento y de un tumor que se produce mas rapidamente como se preveria de otra forma a partir de la tecnica. La capacidad de inducir celulas tumorales en el ciclo celular parece ser unica para la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® y puede ser debida al efecto sinergico de diferentes citoquinas presentes en el farmaco en investigacion y el efecto diferencial de estas citoquinas sobre el sistema inmune del hospedador y las celulas tumorales.

Los datos con respecto a la tasa de reincidencia de pacientes tratados con la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® antes de la cirugia no mostraron reincidencia del cancer a los 24 meses despues del tratamiento con inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine®. De forma remarcable, una cohorte pequena de 8 pacientes tratados secuencialmente que no han tenido un paciente individual recurrente en los 24 meses del periodo de seguimiento. En marcado contraste, la bibliografia ensena que la tasa de reincidencia de pacientes similares es aproximadamente del 50 % a los 18-24 meses despues de la cirugia.

El tratamiento de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® no induce la proliferacion del tumor que reside en las celulas linfoides. De forma correspondiente, disminuyeron las celulas Ki-67+ estromales aunque la

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frecuencia de las celulas cancerosas Ki-67+ aumento tras el tratamiento de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine®. Por tanto, el tratamiento mediante inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® induce un aumento en el numero de celulas tumorales que ciclan que conduce a una susceptibilidad aumentada del tumor residual para el seguimiento del tratamiento con radiacion y/o quimioterapia. Aunque otros estudios llevados a cabo con citoquinas naturales y recombinantes han mostrado eficacia en el tratamiento de la terapia contra el cancer, aquellos estudios han fracasado en ensenar la induccion de entrada en la fase del ciclo celular o el nuevo metodo de combinar sinergicamente la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® con quimioterapia, inmunoterapia y radioterapia.

Por ejemplo, los estudios con el uso de IL-2 humana y recombinante natural y otras citoquinas, asi como en el tratamiento local-regional demostraron el aumento de la inmunidad y la actividad anticancerosa en varios sitios. En particular, IL2 demuestra actividad en la cavidad pleural, el higado y la vejiga urinaria mientras que IFN-a demuestra actividad en el ovario mientras que IFN-p demuestra actividad en el cerebro, como notificaron Yasumoto et al., "Induction of lymphokine-activated killer cells by intrapleural instillations of recombinant interleukin-2 in patients with, malignant pleurisy due to lung cancer", Cancer Res 1987;47:2184-7; Mavilgit et al., "Splenic versus hepatic artery infusion of interleukin-2 in patients with liver metastases", J Clin Oncol 1990;8:319-24; Pizza et al., "Tumor regression after intralesional injection of interleukin-2 (IL2) in bladder cancer. Preliminary report", Int J Cancer 1984;34:359-67; Berek et al., "Intraperitoneal recombinant ainterferon for "salvage" immunotherapy in stage III epithelial ovarian cancer: a gynecologic oncology group study", Cancer Res 1985;45:4447-53; y Fettel et al., "Intratumor administration of beta-interferon in recurrent malignant gliomas-A phase I clinical and laboratory study", Cancer 1990;65:78-83. Mas aun, Se ha mostrado que IFN-y demuestra actividad en la piel mientras que TNF-a demuestra actividad en los genitales mientras que una mezcla de diversas citoquinas demuestra actividad en la cabeza y el cuello como han notificado Edwards et al., "The effect of intralesional interferon gamma on basal cell carcinomas", J Am Acad Dermatol 1990;22:496-500; Irie et al., "A case of vulva cancer responding to the recombinant human tumor necrosis factor (PT-950) local injection therapy", Gan No Rinsho 1988;34:946-50; y Pulley et al., "Intravenous, intralesional and endolymphatic administration of lymphokines in human cancer", Lymph Res 1986;5:S157-63. Ademas, los estudios de las administraciones de IL-2 recombinante durante 10 dias antes de la cirugia en la yugular por via perilinfatica o en la yugular por via perilinfatica y bajo la barbilla mostraron una necrosis variable y una infiltracion iinfocitica como notificaron Valente et al., "Infiltration leukocyte populations and T-lymphocyte subsets in head and neck squamous cell carcinomas from patients receiving perilymphatic injections of recombinant interleukin-2", Mod Pathol 1990;3:702-8 and DeStefani et al., "Treatment of oral cavity and oropharynx squamous cell carcinoma with perilymphatic interleukin-2: clinical and pathologic correlations", J Immunother 1996;19:125-33. Ademas, el examen microscopico de los tumores extirpados demostro un aumento en el infiltrado linfocitico que se correlacionaba con las observaciones clinicas de iL-2 como notificaron Saito et al., "Immunohistology of tumor tissue in local administration of recombinant interleukin-2 in head and neck cancer", Nip Jibi Gakkai Kaiho 1989;92:1271-6.

Sin embargo, ninguno de los estudios anteriormente mencionados mostro ningun cambio en las dimensiones en grosor de los tumores extirpados a pesar de dos remisiones a dosis presuntamente elevadas de IL-2 recombinante (800.000 U durante cuatro semanas [U=Unidades]) en 20 pacientes de cancer de cabeza y de cuello como notificaron Saito et al., "Clinical evaluation of local administration of rIL-2 in head and neck cancer", Nip Jibi Gakkai Kaiho. 1989;921271-6. Adicionalmente, los estudios anteriormente mencionados han estado limitados por el pequeno numero de pacientes y obstaculizados por la ausencia de comparaciones patologicas con un grupo del control. Vlock et al., "Phase Ib trial of the effect of peritumoral and intranodal injections of interleukin-2 in patient with advanced squamous cell carcinoma of the head and neck: An Eastern Cooperative Oncology Group trial", Immunother 1994;15:134-139; Musiani et al., "Effect of low doses of interleukin-2 injected perilymphatically and peritumorally in patients with adviced primary head and neck squamous cell carcinoma", J Biol Res Modi 1989;8:571- 578.

Aunque un reciente estudio en fase III multicentrico, aleatorizado de 202 pacientes de OSCC realizado por Stefani et al. indico que la administracion perilinfatica de dosis bajas (5000 U/dia [U=Unidades]) de IL-2 humano recombinante durante 10 dias antes de la cirugia, en la cadena de ganglios linfaticos del cuello del utero ipsilateral, dio como resultado un aumento significativo (p< 0,01) en la supervivencia exenta de enfermedad, que a la vez dio como resultado una supervivencia global mas larga (p< 0,03), De Stefani et al. fracasaron en evaluar el papel de este regimen de tratamiento sobre el ciclo celular y su efecto sobre la mejora de la radiacion y la quimioterapia. De Stefani et al., "Improved Survival With Perilymphatic Interleukin 2 in Patients With Resectable Squamous Cell Carcinoma of the Oral Cavity and Oropharynx", Cancer 2002; 95: 90-97. Adicionalmente, a pesar de la ensenanza, podrian prepararse 5000 U/dia, sin comparaciones entre la presente invention y De Stefani et al. con respecto a las ensenanzas de De Stefani et al de una dosis "alta" y "baja" de un tratamiento biologico administrado debido a que la potencia del farmaco se midio por U no definibles (Unidades). Por el contrario, la presente divulgation valido y completo el programa de validation de metodos analiticos de la USP para determinar la actividad biologica de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® en UI (Unidades Internacionales).

Metodos

Un experto en la materia apreciara que se puede usar la proliferation de celulas tumorales medidas mediante un marcador Ki-67 inmunohistoquimico u otros medios equivalentes tales como mediante el uso de un marcador PCNA,

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un marcador p53, como un parametro de pronostico, de Vicente et al., "Expression of cyclin D1 and Ki-67 in squamous cell carcinoma of the oral cavity: clinico-pathological and prognostic significance", Oral Oncol 2002; 38: 301-8; Bettendorf et al., "Prognostic relevance of Ki-67 antigen expression in 329 cases of oral squamous cell carcinoma", ORL J Otorhinolaryngeol Relat Spec 2002;64:200-5. En conjunto, se usaron la citometria de flujo o los metodos de tincion convencionales y el uso del microscopio con metodos clinicos, histopatologicos y de estadios y clasificacion tumorales (TNM, Tumor, Ganglio, Metastasis) con otros para indicar la agresividad del proceso de enfermedad. Kerdpon et al., "Expression of p53 in oral mucosal hyperplasia, dysplasia and squamous cell carcinoma", Oral Disease 1997;3:86-92.

Un marcador de proliferation celular Ki67 se diferencia y es especifico solo de celulas en los estadios del ciclo celular. Gi es la primera fase de crecimiento; S es la segunda fase marcada por el inicio de la sintesis de ADN por la celula donde se replica el ADN celular, y G2, la segunda fase de crecimiento de la celula sigue la replication del ADN en la que la celula duplica el tamano. M es la ultima fase en el ciclo celular donde se produce la mitosis en la que la celula se divide en la celula hermana de la celula progenitora original. Cada celula resultante contiene una replica completa del ADN de la celula progenitora original. Siendo el marcador celular Ki67 especifico de las celulas en el ciclo celular que no se pueden encontrar en las celulas que estan en Go, que es una fase restante de la celula. Durante Go, la celula no experimenta la replicacion celular, proliferacion o replicacion de ADN. De forma notable, el fenomeno de la fase del ciclo celular es adecuadamente comun a todas las celulas eucariotas vivas incluyendo las celulas tumorales.

Para detectar la proliferacion de celulas tumorales, se determino la presencia de ki-67 en nidos de celulas tumorales residuales tras la resection quirurgica. Raybaud et al., "Nuclear DNA content, an adjunct to p53 and Ki-67 as a marker of resistance to radiation therapy in oral cavity and pharyngeal squamous cell carcinoma", Int J. Oral Maxillofac Surg 2000; 29:36-41; Koelbl et al., "p53 and Ki-67 as predictive markers for radiosensitiveity in squamous cell carcinoma of the oral cavity? An immunohistochemical and clinicopathologic study", Int J Radiat Oncol Biol Phys 2001; 49:147-54. En general, Ki-67 se puede encontrar en celulas que experimentan el ciclo celular Gi, S, G2, y M pero no en el "resto" de celulas tumorales (Go). Debido a que las celulas tumorales que ciclan son mas radiosensibles y quimiosensibles, y a que las celulas tumorales que no ciclan son por lo general radiorresistentes y quimiorresistentes.

Se estudiaron los tumores de los pacientes de cancer de cabeza y cuello tratados con la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® antes de la extirpation quirurgica del tumor residual y se analizaron mediante inmunohistopatologia. Timar et al., "The effect of Leukocyte Interleukin, Injection on the peri- and intratumoral subpopulation of mononuclear cells and on tumor epithelia - A possible new approach to augmenting sensitivity to radiation and chemotherapy in oral cancer. A multi-center Phase I/[pi] clinical trial", The Laryngoscope 113, diciembre 2003. El estudio se llevo a cabo de una manera enmascarada y se ejecuto por tres patologos calificados independientes que se enmascararon al tratamiento y a la poblacion de pacientes, tratados o del control. El estudio clinico analizo una cohorte de 54 pacientes de cancer espinocelular oral (HyNC) como parte de un ensayo clinico en fase I-II. Se investigaron estos pacientes para la seguridad del regimen terapeutico, el tumor y las respuestas clinicas, y para la composition del infiltrado mononuclear y las tasas del ciclo celular.

El regimen de tratamiento en la presente section de ejemplo para la presensibilizacion del cancer con la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se basa en un protocolo de tratamiento desarrollado para los pacientes de cancer de cabeza y cuello en los que se ha demostrado de una manera estadisticamente significativa el aumento del ciclo de celulas tumorales volviendo estos tumores mas sensibles a seguir el tratamiento con radiation y/o quimioterapia. El tratamiento incluyo la administration de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® intradermicamente en los margenes perimetrales de la masa tumoral visible o palpable.

Un proceso de dos semanas de diez (10) inyecciones subcutaneas/subdermicas diarias de inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® en una dosis diaria que varia de aproximadamente 20 UI a 1600 UI como IL-2 se administro peritumoralmente en el margen perimetral de la masa tumoral. Otra trayectoria de tratamiento esta en el intervalo de 40 UI a 800 UI. Otra trayectoria mas esta en el intervalo de 35UI a 75 Ui. Otro ejemplo no limitante mas de un tratamiento sugerido contempla la administracion de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® a una dosis diaria de 55 UI como IL-2 en un proceso de 2 semanas de inyecciones diarias subcutaneas/subdermicas a menudo diariamente (10).

Pacientes

Information con respecto a la Interleuquina Leucocitaria, En las Tablas 1 y 2 se proporcionan grupos de pacientes del control y tratados con la inyeccion (LI). Se incluyeron cincuenta y cuatro pacientes con veintisiete pacientes en un grupo del control en un grupo de tratamiento.

Tabla 1

Inyeccion de interleuquina leucocitaria, grupo de control: Informacion del paciente

Paciente n.° Sexo

Edad (a) Localizacion del tumor

1

Mujer 65 S. boca

2

Hombre 54 Lengua

3

Hombre 52 Lengua

4

Hombre 53 Lengua

5

Hombre 52 Lengua

6

Hombre 57 Lengua

7

Hombre 40 Lengua

8

Hombre 59 Lengua

9

Hombre 43 S. boca

10

Hombre 53 Lengua

11

Hombre 45 Lengua

12

Mujer 50 Lengua

13

Hombre 66 Labio

14

Hombre 75 Labio

15

Hombre 67 Labio

16

Hombre 55 Lengua

17

Hombre 58 Lengua

18

Mujer 53 S. boca

19

Hombre 46 S. boca

20

Hombre 71 Lengua

21

Hombre 61 Lengua

22

Mujer 43 Lengua

23

Hombre 75 Labio

24

Hombre 77 Labio

25

Hombre 76 Parte ventral de la lengua

26

Hombre 61 Parte ventral de la lengua

27

Hombre 54 Lengua

S. boca =

suelo de la boca

Tabla 2

Informacion del paciente para la inyeccion de interleuquina

leucocitaria (LI) Grupo de tratamiento

Paciente n.° Sexo

Edad (a) Localizacion del tumor

Dosis alta (HD)

24

Hombre 58 Lengua

29

Hombre 74 Lengua

27

Hombre 55 Retromolar

26

Hombre 43 S. boca

31

Hombre 64 Parte ventral de la lengua

30

Hombre 45 S. boca

21

Hombre 47 Parte ventral de la lengua

Dosis media (MD)

25

Hombre 65 Labio

20

Hombre 46 Parte ventral de la lengua

07

Hombre 52 S. boca

13

Hombre 56 S. boca

14

Hombre 50 S. boca

15

Hombre 64 Lengua

23

Hombre 49 S. boca

17

Hombre 41 Parte ventral de la lengua

18

Hombre 51 S. boca

06

Hombre 51 Lengua

12

Mujer 57 Orofaringe

22

Hombre 62 S. boca

Dosis baja (LD)

08

Hombre 62 S. boca

04

Mujer 65 Lengua

09

Mujer 49 Retromolar

03

Mujer 63 S. boca

01

Hombre 58 Parte ventral de la lengua

02

Hombre 62 Lengua

05

Hombre 55 Parte ventral de la lengua

11

Hombre 57 Parte ventral de la lengua

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

HD = dosis acumulativa alta de interleuquina leucocitaria, Iny (8000 UI, como IL-2 equivalente), MD= dosis media (4800 UI) LD= dosis baja (2400 UI)________________________________________________________

Regimen de tratamiento con inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® para el cancer

Otra realizacion contemplada por la presente divulgacion para un regimen de tratamiento para la presensibilizacion del cancer con la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se basa en un protocolo de tratamiento desarrollado para los pacientes de cancer de cabeza y cuello en los que se ha demostrado de una manera estadisticamente significativa el aumento del ciclo de celulas tumorales volviendo estos tumores mas sensibles a seguir el tratamiento con radiacion y/o quimioterapia. El tratamiento incluyo la administracion de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® por via subcutanea en el area submandibular de la cadena de ganglios linfaticos del cuello del utero.

Un proceso de dos semanas de diez (10) inyecciones subcutaneas/subdermicas diarias de inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® en una dosis diaria que varia de aproximadamente 20 UI a 1600 UI como IL-2 se administro 1/2 peritumoralmente en el margen perimetral de la masa tumoral, y 1/2 en la cadena de ganglios linfaticos submandibular ipsilateral a la masa tumoral. Otra trayectoria de tratamiento esta en el intervalo de 40 UI a 800 UI. Otra trayectoria mas esta en el intervalo de 35UI a 75 UI. Otro ejemplo no limitante mas de un tratamiento sugerido contempla la administracion de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® a una dosis diaria de 55 UI como IL-2 en un proceso de 2 semanas de inyecciones diarias subcutaneas/subdermicas a menudo diariamente (10).

Veintisiete pacientes del grupo de tratamiento recibieron la administracion peritumoral de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® en un estudio con una dosis creciente. Las administraciones de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se llevaron a cabo de la siguiente manera: la dosis diaria se inyecto peritumoralmente durante un periodo de dos semanas (3 veces por semana) a las siguientes dosis de cada uno de los grupos de dosis sometidos a ensayo; dosis baja, 400 UI (Unidades Internacionales de IL-2) [IL-2 equivalente] diaria (8 pacientes), dosis media, 800 UI (IL-2 equivalente) diaria (12 pacientes), y 5 veces por semana a la dosis alta, 800 IU (IL-2-equivalente) diaria (7 pacientes). Todas las inyecciones de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se administraron intradermicamente en el margen perimetral de la masa de tumor visible/palpable. La cirugia destinada a la reseccion de la masa tumoral residual se llevo a cabo entre el dia 21 y el dia 28 tras la administracion inicial de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine®. La radioterapia local/regional comenzo en pacientes despues de la operacion siguiendo la cicatrizacion de la herida en tiempos variables tras la cirugia y fue dependiente de la recuperacion del paciente individual de la intervencion quirurgica. La radioterapia se inicio generalmente entre dos a cuatro semanas despues de la cirugia.

La administracion de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® estuvo precedida por una unica infusion intravenosa de ciclofosfamida, 300 mg/m2 tres dias antes de la primera administracion Multikine®. Se autoadministro indometacina (25 mg) por via oral (con el alimento), tres veces al dia, comenzando tres dias despues de la administracion con ciclofosfamida y hasta 24 horas antes de la cirugia. Se autoadministraron sulfato de cinc (50 mg) y suplemento multivitaminas, una vez al dia, comenzando tres dias despues de la administracion de ciclofosfamida y hasta 24 horas antes de la cirugia. Estos agentes no afectan en absoluto el ciclo celular y se proporcionaron a dosis que estan 3-5 veces por debajo de las dosis terapeuticas normales contra el cancer para estos farmacos.

La interleuquina leucocitaria se prepara y suministra por los Chesapeake Biological Laboratories, Inc., Baltimore, MD, CEL-SCI Corporation, proporcionada en un vial de tipo suero de vidrio de borosilicato precintado que contiene 2,2 ml de farmaco en 400 UI/ml (IL-2 equivalente) para la administracion peritumoral, intratumoral, perilinfatica, o subcutanea. La preparacion tiene un contenido total de proteinas de aproximadamente 3 mg/ml (o +/- 1 mg/ml). El material se suministro esteril y exento de pirogenos. El farmaco en investigacion tiene una fecha de caducidad asignada de 24 meses desde la fecha de fabrication cuando el farmaco se almacena a -20 °C.

Ciclofosfamida USP (Bristol-Myers-Squibb, Morton, Reino Unido) se suministro como un polvo esteril que contiene 45 mg de cloruro de sodio, 75 mg de manitol, o aproximadamente 82 mg de bicarbonato de sodio por 100 mg de ciclofosfamida para la reconstitution antes de la infusion intravenosa.

Indometacina USP (Sanofi-Synthelabo, Paris, Francia) se suministro como comprimidos de 25 mg para la autoadministracion con alimentos.

Sulfato de cinc (50 mg) (R. P. Scherer Corporation, Clearwater, FL) y el medico proporciono multivitaminas sin receta a cada paciente para la autoadministracion.

Se llevaron a cabo estudios patologicos por el Department of Tumor Progression, National Institute of Oncology, Budapest, Hungria (J.T.). Un unico protocolo de patologia controlo el presente estudio y describe la preparacion y fijacion de los especimenes extirpados quirurgicamente y el grosor, el examen macroscopico y microscopico, asi como los procedimientos histologicos e inmunohistoquimicos. Los especimenes se recogieron y procesaron

5

10

15

20

25

30

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55

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65

inicialmente por el departamento de patolog^a de cada institucion participante, como se detalla en el protocolo de patolog^a. Los espedmenes se enviaron a continuacion al laboratorio central de patologia para el registro, procesamiento adicional, y evaluacion patologica.

El diagnostico de las lesiones orales se baso en una biopsia de prueba por escision de la lesion sospechosa, y los canceres clasificados como T2-3N0-2M0 se seleccionaron para la inmunoterapia con el regimen de tratamiento LI o Multikine® como se ha descrito inicialmente. Al final del periodo de tratamiento de la LI o Multikine® y despues de la cirugia, se evaluaron las respuestas clinicas de acuerdo con la respuesta tumoral, se programo a los pacientes para la reseccion del tumor (eliminacion quirurgica del tumor residual), una biopsia con una pequena escision, o sin biopsia en el caso de una respuesta clinica completa. De acuerdo con ello, estuvieron disponibles dos formas de especimenes patologicos para el tratamiento post-LI o Multikine® para el analisis inmunohistoquimico y de patologia: 1) tumores completos y 2) especimenes procedentes de la biopsia del tumor. Los ultimos, debido a su pequeno tamano, limitaron la extension del analisis patologico de estas muestras.

Analisis histologico

El tejido extirpado se introdujo en recipientes etiquetados previamente con formaldehido tamponado con solucion salina, se fijo durante la noche antes de incluirse el tejido en parafina y se prepararon portas de 5 mm para la tincion de HyE y el analisis inmunohistologico. Se llevaron a cabo los analisis histologicos y la clasificacion de los tumores a partir las secciones tenidas con HyE de acuerdo con el American Joint Committee on Cancer. El analisis histopatologico se llevo a cabo sobre tres regiones tumorales diferentes (zona 1.0), centro del tumor (zona 2.0), y la interfase tumor-estroma (zona 3.0). Se evaluo tambien la incidencia de celulas tumorales necroticas a partir de los portas de HyE. Se determino el porcentaje del componente epitelial frente al estroma en los tumores cancerosos de cabeza y cuello mediante dos metodos. En primer lugar, el tejido conector se tino de acuerdo con Mallory (tincion del tricoma), y se midieron los portas para el area de los nidos de cancer (epitelio tumoral) utilizando el software de analisis ImagePro (MediaCibemetics, Silver Spring, MD). En segundo lugar, los portas que contenian el tejido extirpado se marcaron inmunohistoquimicamente para la citoqueratina utilizando el anticuerpo contra pan- citoqueratina de DAKO (Glostrup, Dinamarca) (A1A3+CK19), que marca las celulas cancerosas, y se examinaron microscopicamente y se analizaron mediante el uso del software de analisis ImagePro.

Determinacion de la fraccion de proliferacion de las celulas cancerosas

Se marcaron secciones de parafina con un anticuerpo monoclonal de raton que reconoce el antigeno ki-67 (DAKO) para demostrar la proporcion de poblacion de celulas que ciclan. Se conto la frecuencia de celulas tumorales que ciclan al aumento original x 20 en tres areas separadas del campo seleccionado. Adicionalmente, se determinaron tambien las celulas estromales que ciclan utilizando los mismos criterios que para las celulas tumorales intraepiteliales. Se evaluaron al menos 3 x 100 celulas tumorales por area.

Caracterizacion del infiltrado de celulas mononucleares

Se determinaron las celulas mononucleares presentes en estrecha proximidad de los nidos de celulas tumorales mediante analisis inmunohistoquimico llevado a cabo en secciones de parafina de las muestras tumorales. Se desparafinaron secciones y se trataron con microondas para recuperar la antigenicidad. Se usaron solo anticuerpos comerciales, para los que se habia demostrado previamente que tenian secciones de parafina consistentemente. Se marcaron neutrofilos utilizando anticuerpo dirigido contra mieloperoxidasa (anticuerpo monoclonal de raton, DAKO), y citoblastos hemopoyeticos con anticuerpo monoclonal de raton dirigido contra CD34 (DAKO). La poblacion de celulas macrofagas se identifico mediante la expresion del antigeno CD68 (anticuerpo monoclonal de raton dirigido contra CD68, DAKO), y se identificaron celulas dendriticas mediante la expresion del marcador Cilia (anticuerpo de raton dirigido contra Cilia, Immunotech, Paris, Francia). Se identificaron celulas linfoides mediante la expresion del antigeno LCA (anticuerpo monoclonal de raton dirigido contra CD45, DAKO). Se marco la poblacion de linfocitos B con anticuerpo monoclonal de raton dirigido contra CD20 y se identificaron los linfocitos T mediante un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra CD3 (ambos de DAKO). Se identificaron los linfocitos T citotoxicos mediante la expresion de CD8 (mediante un anticuerpo monoclonal de raton dirigido contra CD8, DAKO), y se identificaron los linfocitos NK utilizando el antigeno CD57 (anticuerpo monoclonal de raton dirigido contra CD57, Novocastra, Newcastle on Tyne, Reino Unido). Se identificaron las celulas que expresaban el receptor de la interleuquina-2 (IL2R) en el epitelio tumoral y el estroma utilizando un anticuerpo monoclonal de raton hacia IL2R, CD25 (Novocastra). En todos los casos, se uso un anticuerpo de control con un isotipo adecuado como control negativo.

Se llevo a cabo todo el marcado inmunohistoquimico con el kit DAKO LSAB-2 un enlazador de la inmunoglobulina G dirigida contra IgG de raton e IgG de conejo biotinilado y peroxidasa de rabano picante-estreptavidina para revelar los anticuerpos unidos especificamente. El cromogeno utilizado era una marca de amino-etil-carbazol (AEC) (rojo). Las secciones se tineron con contraste para los nucleos con hematoxilina.

Consideraciones criticas

Se determino la densidad de celulas mononucleares basandose en la tecnica de punto caliente ('hot-spot') similar a

5

10

15

20

25

30

35

las medidas de la densidad microvascular. En cada area tumoral estudiada, se midio la densidad de las celulas infiltrantes en la region de la mayor densidad de celulas mononucleares infiltrantes en el tumor minimizando por lo tanto la extrema heterogeneidad de los infiltrados celulares en los tejidos.

Diseno del estudio de patologia

Se evaluaron los espedmenes de las biopsias tumorales de los grupos tratados con Li o Multikine® y control (no tratados con Li) con la tincion HyE usando las evidencias microscopicas del tumor. CD3, CD8, Cilia, y CD25 con la condition de que el tamano de la muestra permitiera la ejecucion de los cuatro procedimientos de marcado. En el grupo del control y en el grupo tratado con LI, en el que se llevo a cabo la elimination completa del tumor, el tejido tumoral completo estuvo disponible para el analisis; por tanto, se empleo el programa analitico completo. Se uso un aumento x40 original para seleccionar los portas para la observation y un aumento x100 original durante el analisis histologico de las areas seleccionadas de los portas.

Tres patologos correspondientes llevaron a cabo la evaluation histologica de cada section de tumor del paciente. Se alcanzaron determinaciones consensuadas donde existia desacuerdo entre los patologos. Los mismos tres patologos llevaron a cabo medidas morfometricas sin conocer los antecedentes clinicos y el resultado del tratamiento de cada uno de los casos (casos tratados con LI o casos del control).

Analisis estadistico

Los datos se analizaron mediante el analisis ANOVA de un solo factor, y un valor p menor de 0,05 (a a = 0,05) se considero que era estadisticamente significativo.

Evaluacion histologica de los resultados

El grupo control de OSCC consistio en canceres planocelulares con diversos grados de queratinizacion (BRI-BR3), como se ha determinado mediante la clasificacion de Broder. Odell et al., "The Progostic Value of Individual Histologic Grading Parameters in Small Lingual Squamous Cell Carcinomas; The Importance of the Pattern of Invasion", Cancer 74: 789 (1994). El grupo tratado con LI no difiere del grupo del control con respecto al tipo de tumor como se muestra en las Tablas III y IV. Esto se confirmo adicionalmente por los modelos de tincion de citoqueratina que revelaron una expresion muy heterogenea de CK-19 o de pan-CK en ambos grupos tumorales.

Tabla 3

Histologia, Grupo del control

Paciente n.°

Diagnostico Grado estadio tamano del tumor (mm) Necrosis Tipo de necrosis Necrosis (%)

1

SCC BR3 PT2N0 15 x 8 - -

2

SCC BR1 PT2N0 11 x 6 - -

3

SCC BR2 PT2N0 22 x 10 + Campo 1,4

4

SCC BR1 PT2N0 12 x 8 + Campo 8,3

5

SCC BR3 PT2N1 12 x 7 - -

6

SCC BR3 PT2N0 7 x 5 + Unicelular

7

SCC BR2 PT2N0 11 x 9 - -

8

SCC BR3 PT2N2 15 x 11 + Campo 44

9

SCC BR2 PT2N0 10 x 5 - -

10

SCC BR3 PT3N0 22 x 13 + Campo 2

11

SCC BR3 PT2N0 10 x 5 - -

12

SCC BR3 PT2N0 14 x 10 - -

13

SCC BR1 PT2N0 14 x 10 + Microfocal

14

SCC BR1 PT2N0 9 x 6 - -

15

SCC BR1 PT3N0 24 x 12 - -

16

SCC BR3 PT2N0 12 x 3 - -

17

SCC BR1 PT2N0 18 x 12 + Campo 8,4

18

SCC BR3 PT3N0 20 x 17 - -

19

SCC BR1 PT2N0 13 x 8 + Microfocal

20

SCC BR3 PT2N2 13 x 9 - -

21

SCC BR3 PT2N0 17 x 10 + Campo 12

22

SCC BR3 PT2N0 13 x 8 - -

23

SCC BR2 PT2N0 14 x 9 - -

24

SCC BR1 PT2N0 10 x 2 - -

25

SCC BR3 PT2N0 14 x 4 - -

26

SCC BR1 PT2N0 13 x 4 + Unicelular

27

SCC BR3 PT2N0 14 x 6 + Unicelular

SCC = carcinoma espinocelular BR = Clasificacion de Broder (queratinizacion) tamano = Mayor anchura x mayor profundidad en mm superfic.: superficial (solo una interfase aire-tumor)

Unicelular: Solo necrosis unicelular

Microfocal: La necrosis esta presente solo en los focos microscopicos Campo: zonas confluentes__________________________________

Tabla 4

Histologia y Patologia; Grupo tratado con inyeccion de interleuquina leucocitaria

Paciente n.°

Diagnostico Grado estadio tamano del tumor (mm) Necrosis Tipo de necrosis Necrosis (%)

Dosis alta (HD)

24

SCC BR3 PT3N0 B + Unicelular

29

SCC BR1 PT2N0 10 x 15 + Unicelular

27

SCC PT2N1 1 x 1 -

26

SCC BR3 PT3N0 B + Unicelular

31

displasia - -

30

SCC BR1 PT3N1 5 x 6 - -

21

SCC BR1 PT2N0 10 x 15 - -

Dosis media (MD)

25

SCC BR3 PT3N0 15 x 7,5 + Campo 2

20

SCC BR3 PT2N0 12 x 10 + Campo 10

7

SCC BR3 PT2N1 B - -

13

SCC BR1 PT2N0 B - -

14

SCC BR2 PT1N0 6 x 5 - -

15

SCC BR2 PT1N0 8 x 5 + superfic.

23

SCC BR3 PT3N2 B - -

17

SCC BR3 PT2N0 9 x 3 - -

18

SCC BR2 PT2N0 15 x 13 + Unicelular

6

SCC BR3 PT2N1 8 x 1 + superfic.

12

SCC BR2 PT2N0 1 x 36 - -

22

SCC BR1 PT3N1 B - -

Dosis baja (LD)

8

SCC BR2 PT2N1 4 x 3 + Microfocal

4

SCC BR1 PT2N0 9 x 5 - -

9

SCC BR3 PT2N1 3 x 1,5 - -

3

SCC BR3 PT2N1 B - -

1

SCC BR3 PT2N2 10 x 9 + Campo 10

2

SCC BR2 PT2N0 14 x 8 + superfic.

2

5

SCC BR2 PT2N0 14 x 3 - -

11

SCC BR3 PT2N0 B - -

B = solo biopsia con escision

scc = carcinoma espinocelular

BR = Clasificacion de Broder (queratinizacion)

tamano = Mayor anchura x mayor profundidad en

mm

superfic.: superficial (solo

una interfase aire-tumor)

Unicelular: Solo necrosis unicelular

Microfocal.:

La necrosis esta presente solo en los focos microscopicos

Campo: zonas confluentes

HD = dosis acumulativa alta de interleuquina leucocitaria, Iny. (8000 UI, como IL-2 equivalente)

MD= dosis media (4800 UI)

LD= dosis baja (2400 IU)

Estroma tumoral 5

La "fragmentation" de los nidos de cancer podria no confirmarse a pesar de los informes previos de Hadden et al., "Interleukins and contrasuppression induce immune regression of head and neck cancer", Arch Otolaryngol Head Neck surg 120:395 (1994); Verastegui et al., "A natural cytokine mixture (IRX-2) and interference with immune suppression induce immune mobilization and regression of head and neck cancer", Int J Immunopharmac 19:619 10 (1997); y Barrera et al., "combination Immunotherapy of squamous cell carcinoma of the head and neck", Arch.

(2000). Sin embargo, se identificaron tumores ricos en estroma en 8 de 27 en el grupo del control y 6 de 17 en el grupo tratado con LI. El marcado especifico de los nidos de cancer y del estroma del tumor con la tincion del tricoma de Mallory ayudo a discriminar entre estas areas. El porcentaje de nidos epiteliales en los grupos del control y los grupos tratados con LI se determino usando morfometria. El analisis no revelo diferencias significativas sugiriendo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

por tanto que el tratamiento con LI no afecta la relacion tumor-estroma.

Necrosis y proliferacion

Se evaluaron tambien el efecto del tratamiento LI sobre la necrosis tumoral como se muestra en las Tablas 3 y 4 y la proliferacion de celulas cancerosas (Fig. 2) utilizando el analisis histologico y la identificacion espedfica de celulas que ciclan detectadas por el marcador Ki-67. El analisis histologico identifico necrosis de campo o microfocal, necrosis superficial o unicelular en grupos tratados con LI y grupos del control tal como se muestra en la Tabla 5. La ausencia de cualquier tipo de necrosis en OSCC fue similar en todos los tumores de los diferentes grupos tratados con Li estudiados (57 %-63 %) como se muestra en la Tabla 5. La necrosis de campo medida en el intervalo de mas de un 1 % del volumen tumoral fue tambien similar en los diversos grupos tumorales de las Tablas 3 y 4.

Tabla 5

Efecto del tratamiento de la inyeccion de interleuquina leucocitaria sobre la presencia de necrosis en carcinoma _______________________________________espinocelular_______________________________________

Inyeccion de interleuquina leucocitaria (UI >1 % de Volumen como IL-2)

Ninguno Superficial Unicelular Microfocal (Campo)

Control (No tratado)

16/27 0/27 3/27 2/27 6/27

2400

5/8 0/8 0/8 1/8 2/8

4800

7/12 2/12 1/12 0/12 2/12

8000

4/7 0/7 3/7 0/7 0/7

En la Fig. 2 se muestra la deteccion de celulas que ciclan mediante la expresion de Li-67 que identifico celulas cancerosas y celulas estromales de celulas hospedadoras tal como celulas mononucleares, fibroblastos, celulas endoteliales (aumento x100). El analisis morfometrico de la densidad de celulas cancerosas positivas para Ki-67 indico que el tratamiento con LI indujo un aumento significativo (P < 0,05) en las celulas tumorales que ciclan a la dosis de LI mayor administrada como se muestra en la Fig. 4. por otra parte, la incidencia de celulas hospedadoras que ciclan, se encuentra principalmente en el area estromal del tumor, disminuida con la dosis LI que aumenta (Fig. 4), y los efectos se demostro que eran significativos en el caso de las dosis mas bajas y las dosis mas altas (P < 0,05). Estos hallazgos apoyan la conclusion de que el tratamiento con inyeccion de interleuquina leucocitaria (Li) o Multikine® produce celulas cancerosas que entran en una fase del ciclo celular pero que no dan lugar a que las celulas inmunitarias hospedadoras o las celulas estromales ciclen. De acuerdo con ello, la presente invencion contempla que el tratamiento con inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® para inducir la entrada en el ciclo celular de una elevada proporcion de poblacion de celulas tumorales segun la expresion del antigeno Ki-67.

Los datos con respecto a la tasa de reincidencia de pacientes tratados con la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® antes de la cirugia seguido por radioterapia no mostraron reincidencia del cancer a los 24 meses despues del tratamiento con inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine®. Una cohorte pequena de 8 pacientes tratados secuencialmente con la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® no tienen ningun paciente reincidente en los 24 meses del periodo de seguimiento. Por el contrario, la bibliografia proyecta que la tasa de reincidencia de estos pacientes es aproximadamente del 50 % a los 18-24 meses despues de la cirugia.

El tratamiento con inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® no induce la proliferacion activa del tumor que reside en las celulas linfoides, y de forma correspondiente, las celulas Ki-67+estromales disminuyeron, aunque la frecuencia de las celulas cancerosas Ki-67+ aumento tras el tratamiento de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine®. Por tanto, el tratamiento de LI o Multikine® induce un aumento en el numero de celulas tumorales que ciclan que conduce a una susceptibilidad aumentada del tumor residual para el seguimiento del tratamiento con radiacion y/o quimioterapia.

Infiltrados mononucleares

Se evaluaron los infiltrados mononucleares en el compartimento estromal y en los nidos de cancer definidos como infiltrados intraepiteliales. No se identificaron diferencias claras entre los tumores extirpados procedentes del grupo del control y los del grupo tratado con LI utilizando la tincion HyE convencional. El grupo del control fue tambien muy heterogeneo a este respecto. En particular, determinados tumores se caracterizaron por un denso infiltrado leucocitico mientras que otros por uno plasmocitico. Se caracterizaron otros mas adicionales por uno linfoide.

La densidad de macrofagos identificados por el marcador CD68 se midio intraepitelialmente y en el estroma tumoral. La densidad intraepitelial de los macrofagos fue comparable a la de los del estroma. Una densidad relativamente alta de macrofagos intraepiteliales estaba en los tumores del control de forma similar a los tratados con LI.

Se determino tambien la densidad de los leucocitos neutrofilos positivos para la mieloperoxidasa en OSCC mediante morfometria. Estos estudios indicaron que no hubo diferencias estadisticamente significativas en la densidad de neutrofilos estromales o intraepiteliales tras el tratamiento con LI.

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Se llevaron a cabo las medidas morfometricas en tres areas de OSCC. Se definio una superficie tumoral como la zona 1.0. El centro del tumor se definio como la zona 2.0. La interfase tumor-estroma denominada frecuentemente el borde invasivo se definio como la zona 3.0. No se observo una diferencia significativa en la relacion macrofagos o tejido conectivo para estas areas. Sin embargo, para caracterizar el infiltrado linfoide en el OSCC, se estudio la discriminacion entre estas tres zonas sin tomar en consideracion la similitud o diferencia real entre las muestras.

Efecto del tratamiento de la inyeccion de interleuquina leucocitaria sobre las celulas dendriticas en el carcinoma espinocelular oral

Se identificaron celulas dendriticas mediante el marcador CD1a que revelo un infiltrado rico en epitelios normales peritumorales. Este modelo de infiltrado rico disminuyo inequivocamente en nidos de celulas cancerosas. No se identifico presencia significativa de celulas dendriticas en el estroma tumoral tanto en el grupo del control como en el grupo tratado con LI. El infiltrado de celulas dendriticas intraepiteliales era heterogeneo en casos de cancer sin tomar en consideracion los grupos de tratamiento.

Efecto del tratamiento de la inyeccion de interleuquina leucocitaria sobre el infiltrado de celulas linfoides en el carcinoma espinocelular oral

Se identificaron las celulas linfoides mediante la expresion del marcador del antigeno comun de los leucocitos (1CA, CD45) en diversas zonas de OSCC indicando una presencia marcadamente mas densa de linfocitos en el estroma tumoral que en los nidos de celulas cancerosas en una relacion de aproximadamente 1:10. No hubo diferencias geograficas significativas observadas entre las diversas regiones de OSCC desde la superficie al borde invasivo en cualquier grupo de tratamiento con respecto al infiltrado linfoide. El tratamiento con LI indujo una tendencia creciente en el infiltrado linfoide estromal que no fue estadisticamente significativa, excepto a la dosis mas baja estudiada como se muestra en la Fig. 3. Sin embargo, solo la dosis mas baja de tratamiento con LI indujo un aumento significativo (P < 0,05) en las celulas CD45 intraepiteliales como se muestra en la Fig. 5. La dosis mas alta de 11 disminuyo la densidad intraepitelial de celulas positivas para CD45, aunque los cambios no fueron estadisticamente significativos.

Efecto del tratamiento de inyeccion de interleuquina leucocitaria sobre las celulas linfoides alfa positivas (positivas para CD25) del receptor de la interleuquina 2 en el carcinoma espinocelular oral

Aproximadamente un 10 % de las celulas linfoides estromales o intraepiteliales se encontro que expresan IL-2Ra en muestras de OSCC. No hubo diferencias significativas en la incidencia de celulas linfoides positivas para CD25 en las diversas zonas de los casos de OSCC tratados con LI. El tratamiento con LI aumento la superficie de la zona 1 excepto el estroma y la incidencia intraepitelial de las celulas linfoides positivas para CD25 exclusivamente a la dosis de LI mas baja (P < 0,05) como se muestra en las Figs. 6 y 7.

Efecto del tratamiento de la inyeccion de interleuquina leucocitaria sobre la densidad de linfocitos B en el carcinoma espinocelular oral

Los linfocitos B identificados por el marcador CD20 se encontraron en el estroma tumoral exclusivamente en todos los grupos tratados con LI. No hubo diferencia en la densidad de linfocitos B en las diversas zonas en los casos del control. El tratamiento con LI indujo la redistribucion de linfocitos B desde la zona superficial al borde invasivo. Sin embargo, las tendencias no fueron estadisticamente significativas.

Efecto del tratamiento de la inyeccion de interleuquina leucocitaria sobre los linfocitos T en carcinoma espinocelular oral

Se identifico la subpoblacion de linfocitos T del infiltrado mononuclear en OSCC mediante el marcador CD3. La densidad de linfocitos T intraepiteliales estuvo por debajo del 5 % de la densidad estromal de linfocitos T en lo tumores en el grupo del control como se muestra en la Fig. B (aumento X400). Sin embargo, hubo grandes variaciones en el numero y el porcentaje de linfocitos T positivos para CD3 entre los diferentes pacientes del control. Los linfocitos T positivos para CD3 fueron mas prevalentes en el grupo tratado con LI como se muestra en la Fig. 9 (aumento X400).

En los tumores tratados con LI, la densidad estromal de los linfocitos T positivos para CD3 fue menor en un 30 % a 40 % en la mayoria de las zonas tumorales y las dosis de LI estudiadas como se muestra en la Fig. 10. Sin embargo, las diferencias no fueron estadisticamente significativas debido a las variaciones individuales como se muestra en la Fig. 10. En contraste con los hallazgos en el estroma tumoral, El tratamiento con LI indujo un aumento significativo (P < 0,05) en la densidad de linfocitos T intraepiteliales sin una clara dependencia de la dosis de tratamiento con LI como se muestra en la FIG. 11.

En el grupo del control, aproximadamente un 50 % de los linfocitos T que se encuentran en el estroma del OSCC podrian considerarse linfocitos T citotoxicos, caracterizados por el marcador CDB. Similar a las celulas positivas para CD3, El tratamiento con LI indujo la reduccion en la incidencia de las celulas positivas para CDB en el estroma del

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OSCC de normalmente, 30 % - 40 %. Pero las diferencias no fueron estadisticamente significativas. Aproximadamente un 10 % de los linfocitos T citotoxicos estromales se encontraron intraepitelialmente en los casos de OSCC del control que no habian recibido tratamiento anteriormente. Aunque el tratamiento con LI a diversas dosis y principalmente a las dos dosis mas bajas indujo algo de aumento en las celulas CDB intraepiteliales, este aumento dependio de varias zonas en los tumores y en el caso individual estudiado y no fue estadisticamente significativo.

Deteccion de linfocitos citoliticos naturales

Los linfocitos NK que se infiltraron en los canceres orales en el presente estudio no se detectaron en el grupo completo de pacientes. El fracaso en detectar los linfocitos NK en los OSCC no fue debido al fallo tecnico de la inmunorreaccion debido a que se detecto con exito N-CAM (CD57) en las celulas nerviosas y en las celulas musculares en degeneracion en la region adyacente al tejido tumoral estudiado.

Deteccion de citoblastos hematopoyeticos positivos para CD34 en carcinoma espinocelular

Informes previos indicaron que los tumores OSCC pueden contener citoblastos positivos para CD34 en su estroma. Schmidt et al., "Mechanisms of immune suppression in patients with head and neck cancer: presence of CD34+ cells which suppress immune functions within cancers that secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor", Clin Cancer Res 1:95 (1999); Young et al., "Mechanisms of immune suppression in patients with head and neck cancer: influence on the immune infiltrate of the cancer", Int J Cancer 67:333 (1996). Sin embargo, Las celulas mononucleares positivas para CD34 no se detectaron en el presente estudio de 54 muestras incluidas en parafina. Esto no fue debido a fallo tecnico debido a que las celulas endoteliales positivas para CD34- en la microvasculatura del tumor se detectaron facilmente en todos los casos de OSCC estudiados.

Discusion

Los datos del presente estudio patologico de 54 pacientes con OSCC demuestran que OSCC es un tumor inmunogeno y que el tratamiento con LI induce la infiltracion linfocitica en el tumor. Como en otros tipos de cancer, existe una variabilidad individual marcada entre las muestras de tumores obtenidas de diferentes pacientes con respecto a la composicion del infiltrado mononuclear de OSCC sugiriendo que seria necesario un analisis separado para determinar cual de los componentes del infiltrado celular juega un papel significativo en el pronostico de la enfermedad o en la respuesta terapeutica en OSCC.

El tratamiento con interleuquina leucocitaria (LI) tiene un efecto especifico sobre la composicion del infiltrado mononuclear del OSCC. No se observo efecto en el estroma, los macrofagos intraepiteliales, los leucocitos neutrofilos, o las celulas presentadoras de antigenos tales como eD1a positivas. Por otra parte, el epitelio peritumoral normal contenia la densidad mas elevada de celulas dendriticas en los grupos del control y en los grupos tratados con LI. Sin pretender quedar limitado a teoria alguna de la invencion, esto sugiere que OSCC puede secretar factor(es) que interfieren con o inhiben la actividad de las celulas presentadoras de antigenos directamente en el sitio del tumor. Debido a que los pacientes con melanoma maligno tienen similar distribucion de celulas dendriticas, esto puede ser un fenomeno general de OSCC mas bien que ser un tratamiento especifico. El tratamiento con LI a las dosis proporcionadas en el presente documento no tiene una influencia sobre esta caracteristica de OSCC.

El tratamiento de la inyeccion de la interleuquina leucocitarias (LI) con la dosis mas baja indujo una significativa acumulacion de celulas linfoides en los nidos de celulas cancerosas de OSCC sin efecto significativo sobre la densidad estromal. Adicionalmente, El tratamiento con LI a 400 UI por dia, tres veces a la semana aumento la densidad de las celulas linfoides que expresaban eD25 en el estroma tumoral e intraepitelialmente. Existe la posibilidad de un bucle de inhibicion de la retroalimentacion mediante una concentracion local relativamente alta de IL-2 natural en la preparacion de LI.

El analisis de la poblacion de linfocitos B de las celulas linfoides indico que los linfocitos B estromales no se vieron afectados significativamente por el tratamiento con LI y que los linfocitos B no estuvieron presentes intraepitelialmente. El analisis de un subconjunto de linfocitos T como una diana del tratamiento con LI no produce resultados concluyentes. Aunque el tratamiento con LI de OSCC indujo una tendencia de disminucion de la densidad estromal para linfocitos T positivos para CD3 y positivos para CD8, se observo un aumento significativo (P < 0,05) en la densidad intraepitelial tras el tratamiento con LI para las celulas positivas para CD3 independientemente de la dosis de LI. Sin pretender quedar limitado a teoria alguna de la invencion, se senala que otro subconjunto de linfocitos T tal como linfocitos T positivos para CD4 puede verse afectado por el tratamiento con LI.

El tratamiento de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) no tiene efecto sobre varias caracteristicas de OSCC tal como la expresion de la citoqueratina y la clasificacion de Broder. No hubo cambios en la relacion del estroma tumoral tras el tratamiento con LI. No hubo cambios entre el grupo del control que no habia experimentado tratamiento anteriormente y el grupo de tratamiento con LI en la incidencia de formas de necrosis macroscopica o microscopica de nidos de celulas cancerosas al final del ciclo con tratamiento LI y la reseccion quirurgica del tumor

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residual.

El tratamiento con LI indujo la entrada en el ciclo celular de una elevada proporcion de poblacion de celulas tumorales basada en la expresion del antigeno Ki-67. La LI indujo las celulas tumorales OSCC en el ciclo celular debido al efecto sinergico de las diferentes citoquinas presentes en este farmaco en investigacion (que incluye IL-1- p, IL-2, TNF-a, IFN-y, y GM-esF) y el efecto diferencial de estas citoquinas en el sistema inmunitario del hospedador y el tumor.

Una cohorte pequena de 8 pacientes tratados con LI secuencialmente procedentes de un centro de estudio que no han tenido un paciente individual recurrente en los 24 meses del periodo de seguimiento. Debido a que un aumento en el ciclo de celulas tumorales presenta el riesgo de crecer mas rapidamente y de que el tumor reincida mas rapidamente, se estudio la tasa de reincidencia en los pacientes tratados con LI frente al grupo del control (no tratados con LI). Los datos preliminares con respecto a la tasa de reincidencia en pacientes tratados con LI antes de la cirugia que habian continuado tanto con radioterapia como con observacion con cautela no presentan un aumento en la tasa de reincidencia a los 24 meses despues del regimen de tratamiento.

Un reciente estudio en fase III multicentrico, aleatorizado, de 202 pacientes de OSCC realizado por Stefani et al., indico que la administration perilinfatica de dosis bajas (5000 UI/dia) de IL-2 recombinante humana durante 10 dias antes de la cirugia en la cadena ipsilateral de ganglios linfaticos del cuello del utero, daba como resultado un aumento significativo (P < 0,01) en la supervivencia exenta de enfermedad, que a su vez dio como resultado una supervivencia global mas larga (p< 0,03). Sin embargo, la poblacion diana principal del tratamiento con LI es la de los linfocitos T positivos para CD3. Por tanto, el tratamiento con LI indujo un desplazamiento de los linfocitos T infiltrantes estromales hacia el intraepitelio tumoral que es importante para la actuation y destruction antitumoral.

El tratamiento con LI no parece inducir la proliferation activa del tumor que reside en las celulas linfoides. De forma correspondiente, las celulas estromales positivas para Ki-67 disminuyeron mientras que la frecuencia de las celulas cancerosas positivas para Ki-67. Por tanto, el tratamiento con LI parece que induce la migration de los linfocitos T antitumorales comprometidos hacia el nido de celulas cancerosas y el aumento del numero de celulas tumorales que conducen a una susceptibilidad aumentada del tumor residual al tratamiento de seguimiento con radioterapia, quimioterapia o ambos.

Seguridad del farmaco, eficacia piloto y composiciones

Se ha ensayado la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® en 190 pacientes de cancer, e infectados con VIH y VIH/VPH, sin efectos secundarios graves relacionados con la administracion de LI o Multikine® como notifico Harris et al., "Immunologic approaches to the treatment of prostate cancer", Semin Oncol. agosto de 1999;26(4):439-7; Timar et al., "The effect of Leukocyte Interleukin, Injection on the peri- and intratumoral subpopulation of mononuclear cells and on tumor epithelia - A possible new approach to augmenting sensitivity to radiation and chemotherapy in oral cancer. A multi- center Phase I/II clinical trial", The Laryngoscope [1 13 diciembre 2003]; Brown et al., "A Phase I Open-Label Study of Leukocyte Interleukin, Injection in HIV-I infected individuals: preliminary evidence for improved delayed-type hypersensitivity responses to recall antigens", Antiviral Therapy 5 (supplement) 18, 2000; Taylor et al., "Immunotherapy with Leukocyte Interleukin, Injection for human papilloma virus (HPV) induced cervical dysplasia in HIV patients", Annual Meeting of the International Society for Interferon and Cytokine Research, Cleveland, OH, octubre de 2001; Taylor et al., "Immunotherapy with Leukocyte Interleukin, Injection for human papilloma virus (HPV) induced cervical dysplasia in HIV patients", 33rd SGO Conference, Miami, fL, marzo de 2002. Multikine® se mostro tambien que era seguro en estudios toxicologicos en ratones, ratas, cobayas y perros. Adicionalmente, se ensayo Multikine(R) para, y ha demostrado una eficacia piloto, en el cancer de cabeza y cuello y en la displasia de cuello de utero.

La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® puede utilizarse como un componente de una composicion inmunomoduladora junto con uno o mas transportadores o adyuvantes farmaceuticamente aceptables, tanto profilactica como terapeuticamente. Cuando se proporciona para uso profilactico, la composition inmunomoduladora se proporciona por adelantado de cualquier evidencia de infeccion o enfermedad. Aunque es posible administrar la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® en una forma pura o sustancialmente pura, se puede usar tambien una composicion, formulation o preparation farmaceutica.

Las formulaciones de la presente divulgation, para su uso tanto clinico como humano, pueden comprender la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® como se ha descrito anteriormente junto con uno o mas transportadores farmaceuticamente aceptables y, opcionalmente, otros agentes terapeuticos, especialmente adyuvantes inmunologicos terapeuticos. El transportador o transportadores deben ser "aceptables" en el sentido de ser compatible con los ingredientes de la formulacion y no ser perjudicial para el receptor de los mismos.

En general, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme y estrecha el principio activo con transportadores liquidos o transportadores solidos finamente divididos, o ambos, y despues, si es necesario, llevar el producto en la formulacion deseada. El termino "transportador farmaceuticamente aceptable" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier transportador, diluyente, excipiente, agente suspensor, agente lubricante,

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adyuvante, vehiculo, sistema de administracion, emulsionante, disgregante, absorbente, conservante, tensioactivo, colorante, aromatizante, o edulcorante. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en una forma farmaceutica unitarias y se pueden preparar mediante cualquier metodo bien conocido en la tecnica farmaceutica.

Las formulaciones adecuadas para la administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, o intraperitoneal, nasal, etc., comprenden convenientemente soluciones acuosas esteriles del (de los) principio(s) activo(s) con soluciones que son preferentemente isotonicas con la sangre del receptor. Los compuestos de la presente divulgacion pueden administrarse tambien por via oral, parenteral, mediante pulverizador de inhalacion, topica, rectal, bucal, vaginal o mediante deposito implantado en formulaciones farmaceuticas que contienen transportadores, adyuvantes y vehiculos convencionales no toxicos, farmaceuticamente aceptables. El termino parenteral tal como se usa en el presente documento incluye inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por via intratecal, intraventricular, intraesternal e intracraneal o tecnicas de infusion.

Dichas formulaciones pueden prepararse convenientemente disolviendo principios activos solidos en agua conteniendo sustancias compatibles tales como cloruro de sodio (por ejemplo, 0,1-2,0 M), glicina, y similares, y que tienen un pH tamponado compatible con las condiciones fisiologicas para producir una solucion acuosa y volver la solucion esteril. Estas pueden estar presentes en recipientes monodosis o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales precintados.

Los compuestos de la presente divulgacion tambien se pueden administrar en forma de preparaciones inyectables esteriles, por ejemplo, como suspensiones inyectables acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con tecnicas conocidas en la materia haciendo uso de agentes dispersantes o hidratantes y agentes suspensores adecuados. Las preparaciones esteriles inyectables pueden ser tambien soluciones o suspensiones inyectables esteriles en un diluyente o disolvente no toxico aceptable desde el punto de vista parenteral, por ejemplo, como soluciones en 1,3-butanodiol. Entre los vehiculos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran agua, solucion de Ringer y solucion de cloruro de sodio isotonica. Ademas, se emplean convencionalmente, aceites fijos esteriles en forma de disolventes o como medio de suspension. Con este fin, se puede emplear cualquier aceite blando fijo incluyendo mono o digliceridos sinteticos. Los acidos grasos tales como acido oleico y sus derivados gliceridos, incluyendo aceite de oliva y aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas son utiles en la preparacion de inyectables. Estas soluciones o suspensiones oleosas pueden tambien contener diluyentes o dispersantes alcoholicos de cadena larga.

Los compuestos de esta divulgacion se pueden administrar por via topica, especialmente cuando las condiciones dirigidas al tratamiento implican areas u organos facilmente accesibles mediante aplicacion topica que incluyen trastornos del ojo, la piel, o del tracto intestinal inferior. Las formulaciones topicas adecuadas se preparan facilmente para cada una de estas areas.

Para la aplicacion topica en el ojo, o el uso oftalmico, los compuestos se pueden formular como suspensiones micronizadas en solucion salina isotonica, de pH ajustado, o preferentemente, como soluciones salinas esteriles isotonicas, de pH ajustado, tanto con o sin un conservante tal como cloruro de bencilalconio. Como alternativa, los usos oftalmicos de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se pueden formular en una pomada tal como vaselina blanca.

Para aplicar a la piel por via topica, los compuestos se pueden formular con una pomada adecuada que contiene el compuesto suspendido o disuelto en, por ejemplo, una mezcla con uno o mas de lo siguiente: aceite mineral, vaselina liquida, vaselina blanca, propilenglicol, compuesto de polioxietileno polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, los compuestos se pueden formular en una locion o crema adecuada que contiene el principio activo suspendido o disuelto en, por ejemplo, una mezcla de uno o mas de los siguientes: aceite mineral, monoestearato de sorbitan, polisorbato 60, esteres de cetilo de cera, alcohol cetearilico, 2-octildodecanol, alcohol bencilico y agua.

La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales transportadores para producir una forma de dosificacion unitaria variara dependiendo del hospedador tratado y del modo de administracion particular. Algunos factores incluyen la actividad del compuesto especifico empleado, la edad, peso corporal, el estado de salud general, sexo, y la dieta de los pacientes; el momento de administracion, tasa de excrecion, combinacion de farmacos, y la gravedad de la enfermedad concreta que se esta tratando y la forma de administracion.

Se pueden emplear tambien los metodos farmaceuticos para controlar la duracion de la actuacion. Se pueden conseguir preparaciones de liberacion controlada mediante el uso de polimero para complejar o absorber el peptido. Se puede ejercitar la administracion controlada seleccionando las macromoleculas adecuadas (por ejemplo, poliester, poliaminoacidos, polivinilo, pirrolidona, acetato de etilenvinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o sulfato de protamina) y la concentration de macromoleculas, asi como los metodos de incorporation con el fin de controlar la liberacion.

Por ejemplo, Se puede incorporar la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® en una matriz polimerica hidrofoba para la liberacion controlada durante un periodo de dias. Dichas peliculas de liberacion controlada don

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bien conocidas en la materia. Particularmente preferidos son los sistemas de administracion transdermicos. Otros ejemplos de poKmeros comunmente empleados para este fin que se pueden usar en la presente invencion incluyen un copoKmero de etileno-acetato de vinilo no degradable y copolimeros de acido lactico-acido glicolico que se pueden usar externa o internamente. Determinados hidrogeles tales como poli(hidroxietilmetacrilato) o poli(alcohol vimlico) pueden ser tambien utiles, pero para ciclos de liberacion mas cortos, entonces, los otros sistemas de liberacion de polimeros, tal como los mencionados anteriormente.

Como alternativa, en vez de incorporar estos agentes en particulas polimericas, es posible atrapar estos materiales en microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsulas de gelatina y microcapsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, o en sistemas de administracion de farmacos coloidales, por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanoparticulas, y nanocapsulas o en macroemulsiones,.

Para ser terapeuticamente eficaz como dianas del sistema nervioso central, La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® debe tambien penetrar facilmente la barrera hematoencefalica cuando se administra perifericamente. Los compuestos que no pueden penetrar la barrera hematoencefalica pueden administrarse eficazmente mediante una ruta intraventricular u otro sistema de administracion adecuado para la administracion al cerebro.

La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® puede tambien suministrarse en la forma de un kit, solo, o en la forma de una composicion farmaceutica como se describe anteriormente. La administracion de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se puede llevar a cabo mediante metodos convencionales. Por ejemplo, La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se puede usar en un diluyente adecuado tal como solucion salina o agua, o adyuvantes completo o incompleto. La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se puede administrar mediante cualquier ruta adecuada para la estimulacion del sistema inmunitario, tal como intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea, nasal, oral, rectal, vaginal, y similares.

Tal como se ha indicado anteriormente, La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® puede ser tanto para fines profilacticos como terapeuticos. Cuando se proporciona profilacticamente, La inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se proporciona antes de cualquier evidencia o por adelantado de cualquier sintoma debido a enfermedad. Cuando se proporciona terapeuticamente, la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® se proporciona durante (o despues) del inicio de la enfermedad o al inicio de cualquier sintoma de la enfermedad. La administracion terapeutica de la inyeccion de interleuquina leucocitaria (LI) o Multikine® sirve para atenuar la enfermedad y mejora los resultados del tratamiento convencional.

Una vez descrita la divulgacion de esta manera; sera evidente que la misma puede variarse de muchas maneras.

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   REIVINDICACIONES

   1. Uso de una cantidad terapeuticamente activa de una mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno para la fabricacion de un medicamento para presensibilizar tumores de carcinoma espinocelular antes de un tratamiento terapeutico, en donde dicha mezcla de citoquinas comprende las relaciones espedficas de IL-1p, TNF-a, IFN-y y GM-CSF a interleuquina 2 (IL-2) como sigue:

   (a) IL-1 p a IL-2 en un intervalo de relacion de 0,4 - 1,5;

   (b) TNF-a a IL-2 en un intervalo de relacion de 3,2 - 11,3;

   (c) IFN-y a IL2 en un intervalo de relacion de 1,5 - 10,9; y,

   (d) GM-CSF a IL-2 en un intervalo de relacion de 2,2 - 4,8,

   en donde la mitad de dicha mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno se va a administrar peritumoralmente en un margen perimetral de la masa tumoral y la otra mitad de dicha mezcla se va a administrar en la cadena linfatica submandibular ipsilateral respecto a la masa tumoral tres veces a la semana durante un periodo de dos semanas en un intervalo de aproximadamente 20 UI a 1600 UI en donde UI representa unidades internacionales para la interleuquina 2 proporcionadas en el 1er Estandar Internacional de la Organization Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.
2. 2. Uso de una cantidad terapeuticamente activa de una mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno para la fabricacion de un medicamente para presensibilizar tumores de carcinoma espinocelular antes de un tratamiento terapeutico, en el que dicha mezcla de citoquinas comprende las relaciones especificas de IL-1 p, TNF-a, IFN-y y GM-CSF a interleuquina 2 (IL-2) como sigue:

   a) IL-1 p a IL-2 en un intervalo de relacion de 0,4 - 1,5;

   b) TNF-a a IL-2 en un intervalo de relacion de 3,2 - 11,3;

   c) IFN-y a IL2 en un intervalo de relacion de 1,5 - 10,9; y,

   d) GM-CSF a IL-2 en un intervalo de relacion de 2,2 - 4,8,

   en donde dicha mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno se va a administrar perilinfaticamente tres veces a la semana durante un periodo de dos semanas entre aproximadamente 20 UI a 1600 UI en donde UI representa las unidades internacionales para la interleuquina 2 proporcionadas en el 1er Estandar Internacional de la Organizacion Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.
3. 3. El uso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho tratamiento terapeutico se selecciona entre el grupo que consiste en quimioterapia, inmunoterapia y radioterapia.
4. 4. El uso de la reivindicacion 1, en el que la mitad de dicha mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno se va a administrar peritumoralmente en un margen perimetral de la masa tumoral y la otra mitad de dicha mezcla se va a administrar en la cadena linfatica submandibular ipsilateral respecto a la masa tumoral tres veces a la semana durante un periodo de dos semanas en un intervalo de aproximadamente 40 UI a 800 UI en donde UI representa unidades internacionales para la interleuquina 2 proporcionadas en el 1er Estandar Internacional de la Organizacion Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.
5. 5. El uso de la reivindicacion 1, en el que la mitad de dicha mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno se va a administrar peritumoralmente en un margen perimetral de la masa tumoral y la otra mitad de dicha mezcla se va a administrar en la cadena linfatica submandibular ipsilateral respecto a la masa tumoral tres veces a la semana durante un periodo de dos semanas a 400 UI en donde UI representa unidades internacionales para la interleuquina 2 proporcionadas en el 1er Estandar Internacional de la Organizacion Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.
6. 6. El uso de la reivindicacion 1, en el que la mitad de dicha mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno se va a administrar peritumoralmente en un margen perimetral de la masa tumoral y la otra mitad de dicha mezcla se va a administrar en la cadena linfatica submandibular ipsilateral respecto a la masa tumoral tres veces a la semana durante un periodo de dos semanas a 800 UI en donde UI representa unidades internacionales para la interleuquina 2 proporcionadas en el 1er Estandar Internacional de la Organizacion Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.
7. 7. El uso de la reivindicacion 1, en el que la mitad de dicha mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno se va a administrar peritumoralmente en un margen perimetral de la masa tumoral y la otra mitad de dicha mezcla se va a administrar en la cadena linfatica submandibular ipsilateral respecto a la masa tumoral cinco veces a la semana durante un periodo de dos semanas a 800 UI en donde UI representa unidades internacionales para la interleuquina 2 proporcionadas en el 1er Estandar Internacional de la Organizacion Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35
8. 8. El uso de la reivindicacion 2, en el que dicha mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno se va a administrar perilinfaticamente tres veces a la semana durante un periodo de dos semanas entre aproximadamente 40 UI a 800 UI en donde UI representa las unidades internacionales para la interleuquina 2 proporcionadas en el 1er Estandar Internacional de la Organization Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.
9. 9. El uso de la reivindicacion 2, en el que dicha mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno se va a administrar perilinfaticamente tres veces a la semana durante un periodo de dos semanas a aproximadamente 400 UI en donde UI representa las unidades internacionales para la interleuquina 2 proporcionadas en el 1er Estandar Internacional de la Organizacion Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.
10. 10. El uso de la reivindicacion 2, en el que dicha mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno se va a administrar perilinfaticamente tres veces a la semana durante un periodo de dos semanas a aproximadamente 800 UI en donde UI representa las unidades internacionales para la interleuquina 2 proporcionadas en el 1er Estandar Internacional de la Organizacion Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.
11. 11. El uso de la reivindicacion 2, en el que dicha mezcla de citoquinas exenta de suero y exenta de mitogeno se va a administrar perilinfaticamente cinco veces a la semana durante un periodo de dos semanas a aproximadamente 800 UI en donde UI representa las unidades internacionales para la interleuquina 2 proporcionadas en el 1er Estandar Internacional de la Organizacion Mundial de la Salud para la IL-2 Humana, 86/504.
12. 12. El uso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la mezcla de citoquina comprende, ademas

    (a) una relation de IL-3 a IL-2 en un intervalo de relation de 0,38 - 0,68, preferentemente a 0,53+/- 0,15;

    (b) una relacion de IL-6 a IL-2 en un intervalo de relacion de 37,2 - 53,8, preferentemente a 46+/- 5,9;

    (c) una relacion de IL-8 a IL-2 en un intervalo de relacion de 261 - 561,5, preferentemente a 411+/- 10,6;

    (d) una relacion de IL-1 a IL-2 en un intervalo de relacion de 0,56 - 0,94, preferentemente a 0,75+/- 0,19;

    (e) una relacion de IL-10 a IL-2 en un intervalo de relacion de 2,82 - 3,22, preferentemente a 3,0+/- 0,18;

    (f) una relacion de IL-16 a IL-2 en un intervalo de relacion de 1,16 - 2,84, preferentemente a 1,84+/- 0,68;

    (g) una relacion de G-CSF a IL-2 en un intervalo de relacion de 2,16 - 3,78, preferentemente a 2,97+/- 0,81;

    (h) una relacion de TNF-ft a IL-2 en un intervalo de relacion de 1,17 - 2,43, preferentemente a 1,8+/- 0,63;

    (i) una relacion de MIP-1a a IL-2 en un intervalo de relacion de 15,7 - 37,16, preferentemente a 22,7+/- 7,0;

    (j) una relacion de MIP-1G a IL-2 en un intervalo de relacion de 17,1 - 28,5, preferentemente a 22,8+/- 5,7;

    (k) una relacion de RANTES a IL-2 en un intervalo de 2,3 - 2,7, preferentemente a 2,5+/- 0,13;

    (l) una relacion de EGF a IL-2 en un intervalo de relacion de 0,267 - 0,283, preferentemente a 0,275+/- 0,008;

    (m) una relacion de PGE a IL-2 en un intervalo de 3,63 - 5,42, preferentemente a 4,5+/- 0,87; y/o

    (n) una relacion TxB2 2 a IL-2 en un intervalo de 23,47 - 25,13, preferentemente a 24,3+/- 0,83.