ES2582385T3 - Método de diversificación aleatoria de una secuencia genética que permite preservar la identidad de determinados segmentos internos de dicha secuencia genética - Google Patents
Método de diversificación aleatoria de una secuencia genética que permite preservar la identidad de determinados segmentos internos de dicha secuencia genéticaInfo
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Abstract
Metodo de PCR que permite mutar aleatoriamente una secuencia nucleotidica S, delimitada en sus extremos 5' y 3' por dos segmentos F1 y F2, mientras conserva al mismo tiempo la identidad de un segmento interno D de dicha secuencia nucleotidica S, 5 caracterizado por que comprende las siguientes etapas: i) se efectua una PCR propensa a error en toda la secuencia S utilizando al menos dos cebadores, uno de los cuales es sentido y el otro antisentido, respectivamente, de los segmentos F1 y F2, de modo que se amplifica la secuencia S al introducir mutaciones aleatoriamente; ii) se purifican los productos de amplificacion obtenidos, que corresponden a las copias de S mutadas aleatoriamente; iii) se efectua una PCR de alta fidelidad a partir de los productos de amplificacion purificados en la etapa ii), utilizando pares de cebadores sentido y antisentido, respectivamente, al menos: - un cebador sentido de F1 y un cebador antisentido se hibridan en su totalidad con el segmento D, a fin de amplificar la region F1-D de las copias de S mutadas, - un cebador sentido se hibrida en su totalidad con el segmento D y un cebador antisentido de F2, a fin de amplificar la region D-F2 de las copias de S mutadas; iv) se purifican los productos de amplificacion obtenidos en la etapa iii), que consisten en copias de los segmentos F1-D y D-F2 de la secuencia S mutada en la etapa i) en las que el segmento D ha conservado su identidad; v) se efectua una PCR de alta fidelidad a partir de los productos de amplificacion purificados en la etapa iv) utilizando los cebadores sentido y antisentido, F1 y F2 respectivamente; vi) se purifican los productos de PCR obtenidos, que corresponden a las secuencias nucleotidicas S mutadas en la etapa i) en las que el segmento D ha conservado su identidad.
Description
p12NF5R 5’-TCATTCTTTTACCTTAATTAT (SEQ ID NO.11)
Cada uno de estos productos de reacción presenta una superposición parcial con otros dos productos de reacción y los cebadores utilizados corresponden a los dominios invariantes conservados en la proteína gp12. Estos dominios
5 deben preservarse fielmente en las estructuras producidas de genes mutados finales. No obstante, algunos de los fragmentos producidos por las reacciones de PCR sensibles a error pueden mutagenizarse perfectamente en estas regiones. A fin de preservar los dominios intactos, cada uno de los productos mencionados previamente ha de someterse a reacciones de PCR de alta fidelidad que tienen por objeto amplificar selectivamente solo los fragmentos en los que se ha retenido el dominio conservado.
Etapa 3: Amplificación selectiva de los fragmentos deseados.
Esto se efectúa mediante dos series de reacciones de PCR de alta fidelidad que comprenden cada una 25 ciclos.
15 Las PCR de alta fidelidad se llevan a cabo en un volumen de reacción de 50 µl, utilizando plantillas y cebadores en concentraciones finales respectivamente iguales a 250 ng y 40 pM, en tampón para pfu 1X (20 mM de Tris-HCI en pH 9,0, 10 mM de KCl, 1 mM de MgSO4, 6 mM de (NH4)2SO4, Tritón X-100 al 0,1 %, 0,1 mg/ml de SAB) con 200 µM de dNTP y 5 U de polimerasa pfu (Promega). Los perfiles de PCR son los siguientes: 94 ºC durante 20 s, 45 ºC durante 15 s y 72 ºC durante 30 s, con repetición durante 20 ciclos.
En la primera serie de reacciones (P1-2 a P4-2), una porción alícuota (aproximadamente 250 ng) de cada uno de los productos de PCR previos se amplifica utilizando los cebadores "F" correspondientes (por ejemplo: p12NF1F) biotinilados al extremo 5'. Esto es necesario para separar los productos deseados de las plantillas no amplificables (dominios conservados mutados) con longitudes prácticamente idénticas y que no pueden separarse por
25 electroforesis en gel.
Los productos de cada reacción se pasan entonces en minicolumnas de exclusión por tamaños (para eliminar el exceso de cebadores), se purifican individualmente en microesferas de estreptavidina, se lavan en tampón de unión, se eluyen, se precipitan y se vuelven a suspender en ddH2O.
En la segunda serie de reacciones, una porción alícuota de los productos de reacción P1-2 purificados se mezcla con una cantidad igual a los productos de reacción P2-2. Estos tienen en común el sitio de cebado F2-R1 y F3-R2. En consecuencia, la cadena "-" de los productos de reacción P2-2 sirve como cebador para la cadena "+" de los productos de reacción P1-2 y la extensión con una polimerasa comienza en el sitio de cebado F2-R1 interno de P1
35 2. La extensión falla para los productos de reacción P1-2 en los que este sitio conservado se ha mutado de manera significativa.
Del mismo modo, la cadena "+" de los productos de reacción P1-2 sirve como cebador para la cadena "-" de los productos de reacción P2-2 y la extensión con una polimerasa comienza en el sitio de cebado F3-R2 interno de P2
2. La extensión falla para los productos de reacción P2-2 en los que este sitio conservado se ha mutado de manera significativa.
Los productos de PCR amplificados con éxito (PA-1) corresponden a una fusión de fragmentos P1-2 y P2-2, en los que en cada uno de los cuatro dominios conservados (F1 + F2-R1+ F3-R2 + F4-R3) se retuvieron en estado no
45 mutado.
Una mezcla similar se prepara a partir de los productos de reacción P3-2 y P4-2. En estas reacciones, una extensión exitosa se basa en los sitios conservados internos F4-R3 (P3-2) y F5-R4 (P4-2) intactos y los productos de PCR resultantes (AP-1 y PB-1) corresponden a una fusión de los fragmentos P3-2 y P4-2, en los que cada uno de los cuatro dominios conservados (F3-R2 + F4-R3 + F5-R4 + R5) se obtuvieron en estado no mutado.
Los productos obtenidos se purifican por electroforesis en gel preparativo dado que las dimensiones de los productos de PCR fusionados son muy diferentes de las de las plantillas individuales.
55 A fin de aumentar el rendimiento en esta segunda serie de reacciones PCR, el protocolo de extensión puede modificarse de la siguiente manera:
10 ciclos con solo los productos P1-2 y P2-2, y P3-2 y P4-2 en las mezclas de reacción.
Las reacciones se interrumpen, 50 ng de cada uno de los cebadores p12NF1F y p12NF3R se añaden a la mezcla PA-1 mientras que 50 ng de cada uno de los cebadores p12NF3F y p12NF5R se añaden a la mezcla PB-1, permitiendo continuar las reacciones PCR durante 15 ciclos suplementarios.
Etapa 4: Reconstitución del dominio de anclaje mutado de gp12.
65 Tras la purificación, las porciones alícuotas iguales de los productos PA-1 y PB-1 se utilizan entre sí en una reacción
10
PCR de alta fidelidad que comprende 30 ciclos con el objetivo de reconstituir el dominio total de unión al receptor de gp12 en fragmentos únicos que contienen las diversas mutaciones introducidas previamente.
En este caso, como en la serie precedente de reacciones, los productos PA-1 se utilizan como cebadores de 5 extensión para los productos PB-1 y viceversa.
El producto de PCR fusionado final (gp12BD-Fu) se purifica por electroforesis en gel dado que sus dimensiones son muy diferentes a las de las plantillas individuales.
A fin de aumentar el rendimiento, el protocolo de extensión puede modificarse mediante la realización de una reacción que comprende 15 ciclos con solo los productos P1-2 y P2-2, y P3-2 y P4-2 en las mezclas de reacción. Las reacciones se interrumpen, 50 ng de cada uno de los cebadores p12NF1F y p12NF5R se añaden a la mezcla, a continuación, se permite continuar las reacciones PCR durante 15 ciclos suplementarios.
15 Tras la purificación, una porción alícuota (aproximadamente 250 ng) del dominio de unión al receptor de gp12 reconstituido se utiliza como plantilla en una nueva serie de cuatro reacciones PCR sensibles a error, seguido por amplificaciones selectivas y reconstituciones de los dominios como se ha descrito previamente.
No obstante, dado que en cada etapa de fusión (etapas 3 y 4 previas) todas las posibles mutaciones introducidas individualmente en cada subdominio se fabrican aleatoriamente en el dominio reconstituido final de unión al receptor, existen limitaciones en cuanto al número de ciclos de mutagénesis que pueden efectuarse sin efecto negativo en los dominios conservados. Debido a las etapas necesarias de amplificación selectiva, se estima que, más allá de 4 ciclos sucesivos, todas las mutaciones introducidas recientemente presentan una importante probabilidad de efectos negativos en un dominio conservado o de introducción de una reversión que restituye la secuencia T4 original, no
25 mutada.
Etapa 5: Reconstitución de la copia modificada del gen gp12 en su conjunto
1) Amplificación del segmento de gp12 corriente arriba del dominio de unión al receptor.
El gen gp12, generado por PCR, producido previamente (gp12A) se utiliza como plantilla junto con los cebadores
gp12F 5’-TGAGTAATAATACATATCAACACG (SEQ ID NO.12), y
gp12AR 5’-GTTACGATGCGGTTACCTTGT (SEQ ID NO.13)
35 De ello resulta una purificación de los productos de amplificación obtenidos en un gel de agarosa preparativo, una precipitación y a continuación una resuspensión en ddH2O.
2) Amplificación del dominio de unión mutado de gp12
Una porción alícuota (aproximadamente 500 ng) del producto de PCR (gp12B) se utiliza junto con una cantidad igual del dominio de unión al receptor de gp12 reconstituido (gp12BD-Fu) en una reacción PCR de alta fidelidad. Cabe observar que estos dos productos presentan solamente una superposición en común de 20 pb. En consecuencia, el perfil de la reacción PCR ha de modificarse para tener esto en cuenta.
45 Perfil de PCR modificado: A) 30 min a 96 ºC seguido de 5 ciclos de 1 min a 94 ºC, 10 s a 45 ºC, y a continuación B) 5 ciclos de 1 min a 94 ºC y 20 s a 50 ºC, después C) 5 ciclos de 1 min a 94 ºC, 30 s a 50 ºC y, finalmente, D) 15 ciclos de 1 min a 94 ºC, 1 min a 55 ºC, 5 segundos a 72 ºC.
A fin de aumentar el rendimiento, la reacción puede interrumpirse en la subetapa D previa y los cebadores gp12F y p12NF5R pueden introducirse en la mezcla. A continuación, se deja que la reacción se recupere y se realiza hasta que esta finalice.
Los productos finales (gp12-Mut) se purifican en un gel de agarosa preparativo, se precipitan y se vuelven a 55 suspender en ddH2O hasta su utilización.
Etapa 6: Verificación por secuenciación de los productos de PCR gp12-Mut obtenidos
Los productos de PCR purificados en gel de agarosa se secuencian utilizando un secuenciador automático con el fin de verificar que las mutaciones se han introducido correctamente de forma aleatoria en gp12 mientras se conservan intactos los dominios D1 y D2. La secuenciación se efectúa en dos porciones correspondientes, respectivamente a los nucleótidos 1089 a 1110 (Fig. 6A) y 1195 y 1212 (Fig. 6B) de gp12 (SEQ ID NO.1). Los perfiles de secuenciación obtenidos se muestran en la Fig. 6. Comparando los perfiles de los productos de PCR con respecto a los de la secuencia inicial de gp12, puede notarse que numerosos picos suplementarios se agregan al perfil esperado de 65 gp12. Estos picos adicionales traducen una frecuencia elevada de mutaciones introducidas en la secuencia por el método de PCR. Estos picos no se encuentran en el dominio D1, lo que confirma que este dominio ha conservado
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