ES2582605T3 - Decorina para su uso en el tratamiento de afecciones neurológicas traumáticas por administración por vía intratecal - Google Patents
Decorina para su uso en el tratamiento de afecciones neurológicas traumáticas por administración por vía intratecal Download PDFInfo
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Abstract
Una decorina o un fragmento funcional de la misma para su uso en un método de tratamiento de una afección neurológica traumática del sistema nervioso central (SNC) en un paciente, en el que la decorina o fragmento funcional de la misma se administra en la cavidad intratecal del paciente sin administración directa de la decorina o el fragmento funcional de la misma en los tejidos del sistema nervioso central.
Description
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DESCRIPCION
Decorina para su uso en el tratamiento de afecciones neurologicas traumaticas por administracion por v^a intratecal Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general al uso de composiciones en el tratamiento y promocion de la recuperacion funcional de afecciones neurologicas que incluyen lesiones y/o enfermedades del sistema nervioso central.
Antecedentes de la invencion
Las afecciones neurologicas son trastornos del sistema nervioso del cuerpo. Las anormalidades estructurales, bioqmmicas o electricas del cerebro, medula espinal, o en los nervios dan lugar a o por ellas pueden producirse, smtomas tales como paralisis, debilidad muscular, falta de coordinacion, perdida de sensibilidad, as^ como dolor. Las intervenciones incluyen medidas preventivas, cambios en el estilo de vida, fisioterapia u otras terapias, neuro- rehabilitacion, manejo del dolor, medicacion, u operaciones llevadas a cabo por neurocirujanos (WHO Neurological Disorders: Public Health Challenges, 2006). Estas afecciones o trastornos se pueden clasificar de acuerdo con la localizacion primaria afectada, el tipo primario de disfuncion implicado, o el tipo primario de causa. La division mas amplia es entre trastornos del sistema nervioso central (SNC) y trastornos del sistema nervioso periferico (SNP) (Merck Manual: Brain, Spinal Cord and Nerve Disorders, 2010-2011).
La lesion traumatica del sistema nervioso central (SNC) del adulto se asocia con diferentes tipos de danos, los cuales plantean desaffos sustanciales a los intentos de conseguir la reparacion tisular. La restauracion de la funcion neurologica tras una lesion grave necesita el crecimiento regenerativo de los axones sensoriales y motores danados mediante la provision de factores de crecimiento, sustratos apropiados y/o superacion de una variedad de inhibidores que evitan la regeneracion de los axones.
Actualmente hay una demanda clmica acuciante de nuevas terapias que promuevan niveles de recuperacion funcional robustos cuando se administran al sistema nervioso central (SNC) enfermo o lesionado traumaticamente. El tejido cicatricial que se forma tras la lesion traumatica del SNC en el mamffero adulto es rico en proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) inhibidores del crecimiento del axon y que inhiben el crecimiento de los axones (Davies, S.J., et al. Regeneration of adult axons in white matter tracts of the central nervous system. Nature 390, 680-683 (1997); Davies, S.J. et al., Robust regeneration of adult sensory axons in degenerating white matter of the adult rat spinal cord J. Neurosci 19, 5810-5822 (1999)). El tejido cicatricial fibrotico mal alineado en las grandes lesiones del SNC presentan claramente una barrera ffsica al crecimiento de los axones, sin embargo el fallo de la regeneracion de los axones se puede producir incluso con lesiones mmimas en las que el alineamiento del tejido se restaura rapidamente. Se ha demostrado que varios CSPG individuales, tales como neurocan, NG2, brevican y fosfacan, son inhibidores del crecimiento de los axones in vitro y estan regulados positivamente en los sitios de lesion del SNC del adulto (revisado en Morgenstern D.A., et al., Chondroitin sulphate proteoglycans in the CNS injury response. Prog. Brain Res 137, 163-173 (2002)). Se ha demostrado que tambien estan regulados positivamente otros inhibidores del crecimiento de los axones tales como la semaforina 3A, en el tejido cicatricial en los sitios de la lesion cerebral y de la medula espinal (Pasterkamp R.J. et al. Expression of the gene encoding the chemorepellent semaphorin III is induced in the fibroblast component of neural scar tissue formed following injuries of adult but not neonatal CNS, Mol. Cell Neurosci 13: 143-166(1999); Pasterkamp R.J.et al. Peripheral nerve injury fails to induce growth of lesioned ascending dorsal column axons into spinal cord scar tissue expressing the axon repellent Semaphorin3A, Eur. J. Neurosci. 13: 457-471(2001); Pasterkamp R.J. y Kolodkin A.L, Semaphorin junction: making tracks toward neural connectivity, Curr. Opin. Neurobiol. 13:79-89 (2003)). Ademas de la regulacion positiva de CSPG inhibidores en el tejido cicatricial que se forma directamente en los sitios de la lesion, se sabe que los CSPG inhibidores y la semaforina 3A tambien estan presentes con altos niveles en la materia gris normal de la medula espinal y tras la lesion del SNC (Pasterkamp R.J. et al. Expression of the gene encoding the chemorepellent semaphorin III is induced in the fibroblast component of neural scar tissue formed following injuries of adult but not neonatal CNS, Mol. Cell Neurosci 13: 143-166(1999); Pasterkamp R.J. y Kolodkin A.L, Semaphorin junction: making tracks toward neural connectivity, Curr. Opin. Neurobiol. 13:79-89 (2003); Andrews E.M. et al. Alterations in chondroitin sulfate proteoglycan expression occur both at and far from the site of spinal contusion injury, Exp. Neurol. ePub ahead of print (2011); Tang X., et al. Changes in distribution, cell associations, and protein expression levels of NG2, neurocan, phosphacan, brevican, versican V2, and tenascin-C during acute to chronic maturation of spinal cord scar tissue, J. Neurosci. Res. 71: 427-444(2003). Ademas, se ha demostrado que las vainas de mielina alrededor de los axones en la materia blanca del SNC tambien presentan una variedad de moleculas inhibidoras del crecimiento de axones tales como NOGO (inhibidor del crecimiento de neurita), glucoprotema asociada a la mielina (MAG) y glucoprotema mielmica oligodendrodtica (OMgp: revisado en Yiu G. y He Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration, Nat. Rev. Neurosci. 7: 617-627 (2006).). Los axones lesionados que intentan regenerarse de esta manera a traves de los sitios de la lesion, luego a traves de la materia blanca rica en mielina mas alla de los sitios de la lesion y finalmente extienden ramas laterales “colaterales” axonales a partir de la materia blanca en la materia gris (con el fin de establecer conexiones sinapticas funcionales), deben navegar a traves de diferentes dominios del SNC lesionado que contiene multiples moleculas inhibidoras del crecimiento de los axones.
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Los pequenos proteoglicanos ricos en leucina (SLRP) de la matriz extracelular (ME) comprenden una familia en expansion de proteoglicanos y glucoprotemas actualmente engloban cinco grupos distintos (Hocking, A.M., et al. Leucine-rich repeat glycoproteins of the extracellular matrix. Matrix Biol. 17, 1-19 (1998); Lozzo RV. The biology of the small leucine-rich proteoglycans Functional network of interactive proteins. J. Biol. Chem 274, 18843-18846 (1999)). La familia de los SLRP comprende aproximadamente 17 genes que comparten homologfas estructurales, tales como restos de cistema, repeticiones ricas en leucina y al menos una cadena lateral de glucosaminoglicano. La decorina y el biglican pertenecen a la clase I, que presentan similitudes en su secuencia de aminoacidos, en las cadenas laterales de sulfato de condroitina o dermatan y un agrupamiento tfpico de restos de cistema en el extremo N que forman dos enlaces disulfuro. La fibromodulina y lumican pertenecen a la clase II, ambos presentan cadenas laterales de sulfato de queratina y poliactosaminas, asf como agrupamientos de restos de sulfato de tirosina en su extremo N (Schaefer, L., et al. Biological functions of small leucine-rich proteoglycans: from genetics to signal transduction. J. Biol. Chem 283(31), 21305-21309, (2008)). Algunos SLRP actuan como un deposito de factores de crecimiento en la matriz extracelular, modulando procesos biologicos, tales como la proliferacion y diferenciacion celular (Hocking, A.M., et al. Leucine-rich repeat glycoproteins of the extracellular matrix. Matrix Biol. 17, 1-19 (1998); Vogel, K.G., et al. Specific inhibition of type I and type II collagen fibrilogenesis by the small proteoglycan of tendon. Biochem J, 222, 587-597 (1984)). Son capaces de inducir cascadas de senalizacion por medio de receptores tirosina cinasa, tipo-toll y TGF-p/BMP (Schaefer, L., et al. Biological functions of small leucine-rich proteoglycans: from genetics to signal transduction. J. Biol. Chem 283(31), 21305-21309, (2008)).
La decorina es un SLRP de origen natural que se encuentra en la matriz extracelular (ME) de muchos tipos de tejidos en mairnferos, es un antagonista de origen natural de la formacion de la cicatriz (revisado por Hocking, A.M., et al. Leucine-rich repeat glycoproteins of the extracellular matrix. Matrix Biol. 17, 1-19 (1998), y se sabe que inhibe la actividad de al menos tres isoformas de TGF-p (Yamaguchi, Y., et al. Negative regulation of transforming growth factor-beta by the proteoglycan decorin. Nature 346, 281-284 (1990)). La decorina tambien es un antagonista del receptor tirosina cinasa del factor de crecimiento epidermico (EGF) (Santra, M., et al. Decorin binds to a narrow region of the epidermal growth factor (EGF) receptor, partially overlapping but distinct from the EGF-binding epitope. J. Biol. Chem. 277, 35671-35681 (2002)) y se sabe que tiene propiedades tanto anti-inflamatorias como antifibroticas. Tras la lesion del SNC, la decorina se sintetiza en los astrocitos en el neuropilo danado del SNC (Stichel, C.C., et al. Differential expression of the small chondroitin/dermatan sulfate proteoglycans decorin and biglycan after injury of the adult rat brain. Brain Res 704(2), 263-274 (1995)) y por lo tanto puede que represente un intento endogeno para regular negativamente la actividad de citocinas y promover la plasticidad de los circuitos neuronales en el SNC lesionado en mamfferos.
En muchos casos en los que se ha perdido la funcion neurologica, tal como en una lesion de la medula espinal, actualmente no hay ninguna intervencion aprobada por la FDA (Administracion de alimentos y farmacos de Estados Unidos) para revertir el dano y para restaurar la funcion neurologica. La mayona de los tratamientos se enfocan a la prevencion de lesiones adicionales. En consecuencias, sigue existiendo la necesidad en la tecnica de nuevas terapias que promuevan niveles robustos de recuperacion neurologica funcional cuando se administran a pacientes que sufren afecciones neurologicas, incluyendo lesiones y/o enfermedades del SNC.
Sumario de la invencion
La invencion se refiere al tratamiento de una afeccion neurologica en un paciente administrando un pequeno proteoglicano rico en leucina (SLRP) en la cavidad intratecal del paciente. La etapa de administracion se lleva a cabo sin la administracion directa del SLRP en los tejidos del sistema nervioso central. En otro aspecto, la etapa de administracion incluye la administracion del SLRP en una parte de la cavidad intratecal que se selecciona de entre la cisterna cerebellomedullaris (cisterna magna), la cavidad intratecal a niveles cervical, toracico, lumbar de la medula espinal, y la infusion en el lfquido cefalorraqrndeo (LCR) alrededor de la cauda equina.
El SLRP es la decorina. En un aspecto, la decorina se puede modificar qmmicamente.
La afeccion neurologica que se va a tratar en el paciente es una afeccion neurologica traumatica.
En otros aspectos, la afeccion neurologica es una afeccion neurologica traumatica que se selecciona de entre una lesion cerebral traumatica, una lesion de la medula espinal traumatica, ictus, smdrome de medula espinal anclada, e isquemia hipoxica global.
En otros aspectos mas, la etapa de administracion del SLRP puede ser en varios puntos de tiempo despues de que se produzca una afeccion neurologica traumatica. Por ejemplo, la etapa de administracion se puede llevar a cabo poco despues de la afeccion neurologica traumatica, tal como en aproximadamente 24 horas. Ademas, la etapa de administracion del SLRP se puede administrar en tiempos mas largos tras la afeccion neurologica traumatica y aun ser eficaz. Por ejemplo, la administracion se puede iniciar tras aproximadamente 1 mes despues de que se produzca la afeccion neurologica traumatica.
En otro aspecto mas, el presente uso incluye ademas un tratamiento adicional para una afeccion neurologica traumatica. El tratamiento adicional para la afeccion neurologica traumatica puede ser la administracion de agentes
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anti-inflamatorios, agentes reductores de la temperatura, inmovilizacion, terapias basadas en trasplante celular, terapias basadas en infusion celular, implantes de biomateriales, infusion intratecal de nano-partmulas que liberan SLRP, terapias de ejercicio, terapias de rehabilitacion basadas en estimulacion funcional electrica, intervenciones quirurgicas, terapias del SNC basadas en hipotermia inducida clmicamente o intervenciones basadas en terapia genetica. En algunos aspectos de la invencion, la afeccion neurologica traumatica se estabiliza en el paciente en el momento de la administracion.
La etapa de administracion de un SLRP puede incluir la administracion de una embolada del SLRP al paciente. De manera alternativa, o ademas, la etapa de administracion puede incluir el suministro continuo del SLRP al paciente.
Los usos de la presente invencion pueden dar como resultado la recuperacion de la funcion neurologica del paciente. En un aspecto, el metodo da como resultado un indicio, en comparacion con un control, en el que el indicio es un aumento de la extension y la ramificacion del axon, un aumento en la extension dendntica neuronal, la ramificacion y formacion de espmulas, la promocion de sinaptogenesis en el sistema nervioso central enfermo o lesionado, la regulacion positiva de los niveles proteicos de plasminogeno, la regulacion positiva de los niveles proteicos de plasmina, la supresion de las acciones inhibidoras del crecimiento del axon de la cicatriz de glfa, la supresion de la smtesis de inhibidores del crecimiento del axon asociados con la cicatriz de glfa, los inhibidores del crecimiento del axon asociados a la materia gris y la mielina, la supresion de la inflamacion, la supresion de la astrogliosis, la supresion de la smtesis aberrante de multiples proteoglicanos de sulfato de condroitina inhibidores del crecimiento del axon, supresion de formacion de cicatriz fibrotica, supresion de los niveles de cadenas laterales de glucosaminoglicanos (GAG) / centros proteicos de multiples proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) inhibidores del crecimiento del axon y des-sensibilizacion de neuronas frente a la influencia de las moleculas inhibidoras del crecimiento del axon.
El paciente en la invencion puede incluir cualquier mairnfero, incluyendo mairnferos humanos y no humanos.
La invencion desvela un kit para tratar una afeccion neurologica que incluye (a) un medio para administrar un SLRP en la cavidad intratecal de un paciente; y (b) un SLRP. En un aspecto el medio para la administracion puede ser una bomba intratecal, un cateter, intubacion, una derivacion de lfquido cefalorraqrndeo, una derivacion ventriculoperitoneal con una valvula que conecta/desconecta un deposito de LCR (RO-VPS), nano-partmulas o combinaciones de los mismos. El SLRP es la decorina.
La invencion se refiere a una composicion que incluye un primer pequeno proteoglicano rico en leucina (SLRP) y un segundo compuesto terapeutico para tratar una afeccion neurologica. En un aspecto, el segundo compuesto terapeutico puede seleccionarse de entre un segundo SLRP que sea diferente del primer SLRP, agentes anti- inflamatorios, agentes reductores de la temperatura, condroitinasas, litio, hidrogeles, factores de crecimiento neurotroficos disenados para promover el crecimiento del axon o la re-mielinizacion de los axones, agentes anti- apoptoticos para promover la supervivencia de las neuronas del SNC y glfa y combinaciones de los mismos. El primer SLRP es la decorina.
Una realizacion adicional de la invencion es la supresion de la expresion de semaforina 3A en el tejido del sistema nervioso central lesionado, que comprende la administracion a un paciente de una composicion farmaceutica en la cavidad intratecal de un paciente, en la que la composicion farmaceutica comprende un SLRP y en la que se inhibe la expresion de la semaforina 3A. En un aspecto, la etapa de administracion incluye la administracion del SLRP en una parte de la cavidad intratecal que se selecciona de entre la cisterna cerebellomedullaris (cisterna magna), la cavidad intratecal a niveles cervical, toracico, lumbar y sacro de la medula espinal, y la infusion en el lfquido cefalorraqrndeo (LCR) alrededor de la cauda equina. En un aspecto, la etapa de administracion se lleva a cabo con la administracion directa del SLRP en los tejidos del sistema nervioso central. El SLRP es la decorina.
Breve descripcion de los dibujos
Fig. 1 GALACORIN™ infundido por medio de un cateter en el LCR de la Cisterna cerebellomedullaris (cisterna magna) en seres humanos para promover la recuperacion de la funcion neurologica. (Esquema adaptado de Grays Anatomy, Trigesima Edicion Americana). Duramadre (area sombreada mas oscura); Lfquido cefalorraqrndeo (area sombreada mas clara).
Fig. 2 Esquema que muestra el metodo experimental de la infusion de GALACORIN™ en el lfquido cefalorraqrndeo de la cisterna magna en ratas adultas con lesion de la medula espinal. Notese que la infusion en la cisterna magna evita el dano asociado con el contacto del cateter con la superficie de la piamadre de la medula espinal.
Fig. 3 La infusion de GALACORIN™ retardada en la cisterna magna que comienza a los 12 dfas tras la lesion promueve la recuperacion robusta de la funcion neurologica locomotora en ratas adultas con lesion en la medula espinal. Notese que el numero de malos pasos que hacen las ratas tratadas con GALACORIN™ sigue mejorando durante varias semanas tras el periodo de 8 dfas de infusion con GALACORIN™ (datos no mostrados). (*) denota la diferencia estadfsticamente significativa en las puntuaciones medias entre las ratas con lesion de la medula espinal (SCI) tratadas y el grupo de Control 1 de ratas con SCI sin tratar. Analisis estadfstico: mediciones ANOVA de 2 vfas repetidas seguidas por comparaciones multiples tras ensayo de Holm-Sidak
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Fig. 4A-4H Analisis CatWalk. Ademas de la recuperacion observada en el ensayo Grid Walk / escalera horizontal, las ratas tratadas con decorina mostraban una recuperacion robusta de tres parametros estaticos del comportamiento de extremidades delanteras y cinco de extremidades traseras a continuacion del tratamiento retardado de la contusion de la medula espinal a las 5 semanas tras la lesion. RF: garra delantera derecha; RH: garra trasera derecha.
Fig. 5 Analisis de la actuacion en GridWalk/escalera horizontal. El grafico muestra las puntuaciones GridWalk/escalera horizontal (malos pasos) a las 8 semanas tras la lesion para las ratas lesionadas por contusion cervical en la medula espinal tratadas por infusion intratecal de decorina que comenzaba a: Aguda (inmediatamente tras la lesion); 12 dfas (12d) y 1 mes (1 mes) de puntos de tiempo cronicos tras la lesion.
Fig. 6 La decorina promueve el brote de circuitos espinales de control motor. Las medulas espinales tratadas con decorina a los 12 dfas post-SCI presentaban una aumento de la densidad de los axones de los tractos cortico/espinales (CST) en el cuerno dorsal de la materia gris caudal a los sitios de la lesion en comparacion con las medulas espinales lesionadas sin tratar a las 9 semanas tras el tratamiento. El analisis cuantitativo demostraba una densidad del axon del CST 2,8 veces mayor en el cuerno dorsal de materia gris en las laminas mediales I-VI en las medulas espinales tratadas con decorina frente a los controles sin tratar. El asterisco indica una diferencia significativa (p<0,05) como se determino utilizando la estadfstica ANOVA de una via.
Fig. 7 La decorina promueve la sinaptogenesis en el sistema nervioso central lesionado. Las medulas espinales tratadas con decorina presentaban mayor inmunodensidad de la protema sinapsina-1 de la vesfcula pre-sinaptica en comparacion con los controles no tratados en la materia gris del cuerno ventral a nivel C6 de la medula caudal al sitio de la lesion. El grafico del analisis de densidad mostraba un aumento medio de 3,2 veces de inmunodensidad de Sinapsina-1 para las medulas espinales tratadas con decorina frente a los controles tratados. (*) indica una diferencia significativa (p<0,05) como se determina por la comparacion estadfstica con ANOVA de una via.
Descripcion detallada
La presente invencion se refiere a los usos para tratar afecciones neurologicas en un paciente. La invencion incluye la administracion de un pequeno proteoglicano rico en leucina (SLRP) en la cavidad intratecal (es decir, en el espacio intratecal) del paciente.
Una afeccion neurologica se refiere en general a un trastorno del sistema nervioso. En consecuencia, estas afecciones incluyen pero no se limitan a trastornos que implican musculos, trastornos estructurales del cerebro y la medula espinal, trastornos estructurales de los nervios de la cara, tronco y extremidades, asf como afecciones que no estan producidas por una enfermedad estructural tales como muchas variedades de dolores de cabeza y afecciones tales como la epilepsia, smcopes y mareos. La afeccion neurologica es una afeccion neurologica traumatica. Una afeccion neurologica traumatica es una lesion grave o choque del cuerpo. Una afeccion neurologica traumatica incluye pero no se limita a lesion traumatica del cerebro, lesion traumatica de la medula espinal, ictus, smdrome de lesion de medula espinal anclada e isquemia hipoxica global.
En otras realizaciones de la presente invencion, la practica de la presente invencion tratara eficazmente la afeccion neurologica traumatica, en la que la presente invencion puede estabilizar un paciente, sola o en combinacion con otros tratamientos. En general, una afeccion neurologica traumatica se estabiliza cuando la afeccion no supone mas un peligro inmediato de muerte o perjuicio al paciente y los signos vitales del paciente son estables (en los lfmites normales).
La presente invencion puede utilizarse para tratar una variedad de diferentes pacientes. En una realizacion de la invencion, los pacientes pueden incluir todos los vertebrados. En una realizacion espedfica de la invencion, los vertebrados son preferentemente mairnferos. En una realizacion preferida de la invencion, los pacientes incluyen, pero no se limitan a, mamfferos tales como mamfferos no humanos y seres humanos. Los mamfferos no humanos incluyen, pero no se limitan a, perros y gatos. Los pacientes pueden tener afecciones neurologicas, tales como afecciones neurologicas agudas, afecciones neurologicas cronicas o afecciones neurologicas traumaticas.
Los usos de la presente invencion que se utilizan para tratar afecciones neurologicas en un paciente incluyen una etapa de administracion de un SLRP por via intratecal al paciente, que se lleva a cabo sin la administracion directa del SLRP en los tejidos del sistema nervioso central del paciente. En general, el tejido del sistema nervioso es el componente principal del sistema nervioso (cerebro, medula espinal y nervios) que regula y controla la funcion corporal. Los tejidos del sistema nervioso central pueden comprender la medula espinal, el cerebro, el cortex cerebral, la corteza cerebelar, las meninges, las celulas de la glfa y el plexo coroideo.
En realizaciones de la presente invencion, la etapa de administracion puede ser la administracion del SLRP en una parte de la cavidad intratecal que se selecciona de entre el grupo que consiste en la cisterna cerebellomedullaris (cisterna magna), la cavidad intratecal a niveles cervical, toracica, lumbar y sacra de la medula espinal, y la infusion en el lfquido cefalorraqrndeo (LCR) que roda la cauda equina. en realizaciones preferidas, el SLRP se administra en la cavidad intratecal y en la cisterna cerebellomedullaris. La cavidad intratecal se refiere en general al espacio bajo la membrana aracnoidea que cubre el cerebro y la medula espinal del paciente. La membrana aracnoidea es una de
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las tres meninges, las membranas que cubren el cerebro y la medula espinal. El Ifquido cefalorraqmdeo fluye bajo esta membrana en el espacio subaracnoideo.
En realizaciones de la invencion, el SLRP se puede administrar en la cavidad intratecal de acuerdo con la presente invencion, por medio de una variedad de medios. Por ejemplo, una fuente del SLRP se puede poner en contacto con la cavidad intratecal por medio de una derivacion o un cateter que permita el suministro del SLRP en la cavidad intratecal.
En realizaciones de la invencion, la etapa de administracion se lleva a cabo tras producirse una afeccion neurologica traumatica. En algunas realizaciones, la etapa de administracion se lleva a cabo lo antes posible despues del incidente que produce la afeccion neurologica traumatica. Por ejemplo, la etapa de administracion se puede llevar a cabo aproximadamente 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas o 24 horas tras el incidente. En otras realizaciones, la administracion se inicia en un tiempo mayor a partir del incidente que produce una afeccion neurologica traumatica, y el metodo sigue siendo eficaz. Por ejemplo, la administracion se puede iniciar despues de aproximadamente 1 dfa, 2 dfas, 3 dfas, 4 dfas, 5 dfas, 6 dfas, 7 dfas, 8 dfas, 9 dfas, 10 dfas, 20 dfas o 30 dfas y en puntos de tiempo mas extensos sub-agudos (1 mes) y cronicos a largo plazo despues de que se produzca la afeccion neurologica traumatica. En otras realizaciones mas, la administracion se inicia en tiempos significativamente mas largos despues de que se produzca una afeccion neurologica traumatica. Por ejemplo, la administracion se puede iniciar tras aproximadamente 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 3 anos, 5 anos, 7 anos, o 9 anos despues de producirse la afeccion neurologica traumatica.
En otras realizaciones, la etapa de administracion puede llevarse a cabo administrando una embolada de SLRP al paciente y/o un suministro continuo del SLRP al paciente durante un periodo de tiempo, tal como durante
aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas,
aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 12 horas,
aproximadamente 15 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 24 horas o
durante un periodo de 8 dfas.
En consideracion al uso espedfico de un SLRP, tal como la decorina, para el tratamiento de las afecciones neurologicas que incluyen las lesiones o enfermedades del SNC, los estudios publicados previos en modelos de lesion del SNC en ratas, demostraban que la infusion de decorina era anti-inflamatoria y que disminma los niveles de inhibidores del crecimiento del axon asociados a la cicatrizacion (Davies, J.E., et al. Decorin Promotes Plasminogen/Plasmin Expression within Acute Spinal Cord Injuries and by Adult Microglia In vitro. J Neurotrauma 23, 397-408 (2006); Davies, J.E., et al. Decorin suppresses neurocan, brevican, phosphacan and NG2 expression and promotes axon growth across adult rat spinal cord injuries. Eur. J Neurosci. 19, 1226-1242 (2004); Logan, A., et al. Decorin attenuates gliotic scar formation in the rat cerebral hemisphere. Exp. Neurol. 159, 504-510 (1999)). Notablemente, sin embargo, estos estudios previos de la administracion de decorina para las lesiones de medula espinal y cerebro se basaban en una inyeccion directa de decorina relativamente traumatica en o a traves del parenquima (tejidos) del cerebro o medula espinal lesionados (Davies, J.E., et al. Decorin Promotes Plasminogen/Plasmin Expression within Acute Spinal Cord Injuries and by Adult Microglia In vitro. J Neurotrauma 23, 397-408 (2006); Davies, J.E., et al. Decorin suppresses neurocan, brevican, phosphacan and NG2 expression and promotes axon growth across adult rat spinal cord injuries. Eur. J Neurosci. 19, 1226-1242 (2004); Logan, A., et al. Decorin attenuates gliotic scar formation in the rat cerebral hemisphere. Exp. Neurol. 159, 504-510 (1999)). De manera importante, estos metodos de administracion de decorina no mostraban como resultado la recuperacion de la funcion neurologica (Davies, J.E., et al. Decorin Promotes Plasminogen/Plasmin Expression within Acute Spinal Cord Injuries and by Adult Microglia In vitro. J Neurotrauma 23, 397-408 (2006); Davies, J.E., et al. Decorin suppresses neurocan, brevican, phosphacan and NG2 expression and promotes axon growth across adult rat spinal cord injuries. Eur. J Neurosci. 19, 1226-1242 (2004); Logan, A., et al. Decorin attenuates gliotic scar formation in the rat cerebral hemisphere. Exp. Neurol. 159, 504-510 (1999)).
En consecuencia, los metodos de la presente invencion comprenden la administracion de SLRP en la cavidad intratecal del paciente, preferentemente en la cisterna cerebellomedullaris que proporciona un medio de distribucion simultanea de un SLRP en el LCR tanto del cerebro como de la medula espinal. Los SLRP son una familia de proteoglicanos compuesta por varios miembros que dirigen el ensamblaje y organizacion de la matriz por medio de interacciones protema: protema y/o protema: carbohidratos. La familia se caracteriza por la presencia de varias regiones conservadas que se encuentran en sus centros proteicos. Estas regiones conservadas incluyen un dominio central de repeticiones ricas en leucina, cuatro restos de cisterna en el extremo amino y 2 restos de cisterna en el extremo carboxilo. (Johnson, J.M., et al. Small leucine rich repeat proteoglycans (SLRPs) in the human sclera: Identification of abundant level of PRELP Mol. Vis. 12, 1057-1066 (2006)). Los SlRp son organizadores tisulares que orientan y ordenan varias matrices de colageno durante la ontogenia, reparacion de heridas y cancer e interaction con varios receptores de superficie y factores de crecimiento, regulando de esta manera el comportamiento celular (Lozzo RV. The biology of the small leucine-rich proteoglycans Functional network of interactive proteins. J. Biol. Chem 274, 18843-18846 (1999)). El SLRP es la decorina. Una forma preferida de decorina es GALACORIN™ (Catalent Pharma Solutions, Somerset, NJ) que es una forma de centro proteico de decorina que carece de una cadena lateral de glucosaminoglicano (GAG) de sulfato de condroitina o dermatan.
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En otras realizaciones, los SLRP que se utilizan en la presente invencion se pueden modificar qmmicamente para alterar la naturaleza qmmica del SLRP. Por ejemplo, un pequeno peptido derivado del centro proteico de un SLRP que mantenga una bioactividad beneficiosa espedfica del SLRP del que se deriva. Por ejemplo, un SLRP se puede pEGilar (union covalente de cadenas de polfmero de polietilenglicol para prolongar su tiempo circulatorio y ayudar a su captacion por los tejidos). Los SLRP pueden PEGilarse por metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, la PEGilacion selectiva en un unico sitio de glucosilacion de la protema diana asf como la PEGilacion selectiva de un aminoacido no natural que se ha modificado en las protemas diana. En algunos casos es posible PEGilar el extremo N de una protema a la vez que se evita la PEGilacion de las cadenas laterales de lisina en la protema diana controlando cuidadosamente las condiciones de la reaccion. En otra estrategia de PEGilacion espedfica del sitio de las protemas diana es la introduccion de restos de cistema que permitan la conjugacion selectiva.
La decorina se expresa en muchos tipos de tejidos y se ha demostrado que suprime la cicatrizacion fibrotica en varios trastornos tisulares incluyendo las lesiones del cerebro y la medula espinal. La decorina es capaz de inhibir la actividad del factor beta transformante del crecimiento y modular la actividad de las rutas de senalizacion corriente abajo ligadas a varios miembros de la familia del receptor homologo del oncogen vmco de leucemia eritroblastica (ErbB). La infusion de un centro proteico de decorina recombinante humano en la lesion de medula espinal aguda en ratas adultas podfa suprimir los niveles de multiples proteoglicanos de sulfato de condroitina inhibidores del crecimiento del axon (CSPG) y hacer que los sitios lesionados permitan el crecimiento del axon.
En otras realizaciones de la presente invencion, el uso comprende la utilizacion de una protema de fusion que comprende un SLRP y otra protema funcional. Por ejemplo, un SLRP se puede fusionar con un receptor de virus Coxsackie y adenovirus (CAR) (Jarvinen T.A. y Ruoslahti E. Target-seeking antifibrotic compound enhances wound healing and suppresses scar formation in mice, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 107: 21671-21676 (2010)) un peptido vascular de direccionamiento que esta disenado para promover la captacion de un SLRP tal como la decorina o pequenos peptidos bioactivos derivados de los centros proteicos de SLRP en el parenquima del SNC lesionado, meninges o rames del sistema nervioso periferico dorsal y ventral.
Algunos aspectos del uso del tratamiento de las afecciones neurologicas en un paciente administrando un SLRP en la cavidad intratecal del paciente incluyen el aumento de la densidad de los axones del tracto corticoespinal (CST) en el paciente. En el caso de lesiones traumaticas, el efecto del aumento de densidad en los axones supramedulares que se proyectan (del cerebro a la medula espinal) tales como los axones del CST puede producirse en el cerebro y la medula espinal por encima, adyacente o por debajo del sitio de la lesion. Otros aspectos del uso del tratamiento de las afecciones neurologicas en un paciente administrando un SLRP en la cavidad intratecal del paciente incluyen el aumento de la densidad de la sinapsina-1 en el paciente. En el caso de lesiones traumaticas, el efecto del aumento de la densidad de sinapsina-1, que indica un aumento en el numero de sinapsis activas, puede producirse en todas las laminas de la materia gris de la medula espinal asf como en y alrededor de los grupos de neuronas motoras en la materia gris del cuerno ventral en niveles medulares por encima y por debajo de los sitios de la lesion.
Otros usos de la presente invencion se refieren a un metodo para suprimir la expresion de semaforina 3A (Sema3A) en el tejido lesionado del sistema nervioso central que comprende la administracion de una composicion farmaceutica que comprende un SLRP en la cavidad intratecal de un paciente. En un aspecto del metodo, se inhibe la expresion de Sema3A. La sema3A es el miembro de semaforinas de clase 3 segregadas que se sabe que comprenden una gran familia de glucoprotemas secretadas y unidas a la membrana que funcionan en la direccion del axon, fasciculacion y formacion de sinapsis. La Sema3A se expresa durante el desarrollo y en la madurez y puede funcionar como un potente quimio-repelente para poblaciones neuronales seleccionadas del sistema nervioso central y periferico. Se ha demostrado que la Sema3A no esta regulada en los sitios de lesion traumatica del sistema nervioso central donde se piensa que actua como un inhibidor de la regeneracion axonal promoviendo el colapso del cono de crecimiento ((Pasterkamp R.J. et al. Expression of the gene encoding the chemorepellent semaphorin III is induced in the fibroblast component of neural scar tissue formed following injuries of adult but not neonatal CNS, Mol. Cell Neurosci 13: 143-166(1999); Pasterkamp R.J. y Kolodkin A.L, Semaphorin junction: making tracks toward neural connectivity, Curr. Opin. Neurobiol. 13:79-89 (2003); Andrews E.M. et al. Alterations in chondroitin sulfate proteoglycan expression occur both at and far from the site of spinal contusion injury, Exp. Neurol. ePub ahead of print (2011); Tang X., et al. Changes in distribution, cell associations, and protein expression levels of NG2, neurocan, phosphacan, brevican, versican V2, and tenascin-C during acute to chronic maturation of spinal cord scar tissue, J. Neurosci. Res. 71: 427-444(2003)).
Otras realizaciones de la presente invencion comprenden el tratamiento de una afeccion neurologica administrando un SLRP en la cavidad intratecal del paciente en combinacion con un tratamiento adicional para una afeccion neurologica traumatica. En una realizacion preferida, el tratamiento adicional para tratar una afeccion neurologica traumatica comprende la administracion de agentes anti-inflamatorios, agentes reductores de la temperatura, inmovilizacion, terapias basadas en trasplante celular, terapias basadas en infusion celular, implante de biomateriales, infusion intratecal de nano-partmulas liberadoras de SLRP, ejercicio y terapias de rehabilitacion basadas en estimulacion funcional electrica, intervenciones quirurgicas, terapias del SNC basadas en hipotermia inducida clmicamente e intervenciones basadas en terapia genetica. Los agentes anti-inflamatorios se conocen
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bien en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, farmacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) tales como aspirina, ibuprofeno y naproxeno, y analgesicos tales como el paracetamol. Los agentes reductores de la temperature tambien se conocen bien en la tecnica y pueden incluir el ibuprofeno y el paracetamol.
En algunas realizaciones de la presente invencion, el tratamiento de una afeccion neurologica puede incluir, ademas de la administracion de un SLRp, la administracion de un segundo compuesto terapeutico para tratar una afeccion neurologica. Dichos segundos compuestos terapeuticos pueden ser un segundo SLRP que sea diferente del primer SLRP, agentes anti-inflamatorios, agentes reductores de la temperatura, enzimas condroitinasa, factores de crecimiento neurotroficos disenados para promover el crecimiento del axon o la re-mielinizacion de los axones, y agentes anti-apoptoticos para promover la supervivencia de las neuronas del SNC y la glfa y combinaciones de los mismos.
Una realizacion adicional de la presente invencion, es la administracion de un SLRP en la cavidad intratecal en la que el SLRP se une a una matriz o armazon auto-ensamblable (SAP) (Cigognini D., et al. Evaluation of early and late effects into the acute spinal cord injury of an injectable functionalized self-assembling scaffold PLoS ONE 6:e19782 (2011)). Los SAP son una categona de peptidos que se someten a ensamblaje espontaneo en nanoestructuras ordenadas. Los SAP proporcionan un armazon para los SLRP y presentan una molecula activa con actividad biologica mejorada. En otras realizaciones, el complejo SLRP-SAP se infunde en la cavidad intratecal. En otras realizaciones, el complejo SLRP-SAP es un complejo decorina-SAP.
En realizaciones de la presente invencion, los presentes usos pueden dar como resultado la recuperacion de la funcion neurologica en el paciente. En otras realizaciones, los usos pueden dar como resultado uno o mas de los siguientes indicios, en comparacion con un control, un aumento de la extension y ramificacion del axon, regulacion positiva de los niveles proteicos de plasminogeno, regulacion positiva de los niveles proteicos de plasmina, supresion de la smtesis de inhibidores del crecimiento del axon asociados a la cicatriz de la glfa, supresion de las acciones inhibidoras del crecimiento del axon de la cicatriz de la glfa, moleculas inhibidoras del crecimiento del axon asociadas a la materia gris, supresion de la inflamacion, supresion de la astrogliosis, supresion de la expresion aberrante de multiples proteoglicanos de sulfato de condroitina inhibidores del crecimiento del axon, supresion de la formacion de la cicatriz fibrotica y supresion de niveles cadenas laterales de glucosaminoglicanos (GAG)/ centros proteicos de los proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) inhibidoras del crecimiento del axon, y des- sensibilizacion de las neuronas a la influencia de las moleculas inhibidoras del crecimiento del axon en el sistema nervioso central enfermo o lesionado de un mairnfero adulto con el fin de promover la plasticidad y la funcion de los circuitos neurales.
La presente invencion tambien desvela un kit para tratar una afeccion neurologica. En una realizacion, el kit comprende un medio para administrar un SLRP en la cavidad intratecal de un paciente. En una realizacion, el medio de administracion comprende una bomba intratecal. En otra realizacion, el medio de administracion comprende un cateter. En otra realizacion, el medio de administracion de un SLRP comprende una derivacion de desvfo del lfquido cefalorraqrndeo. En otra realizacion, los medios de administracion de un SLRP comprenden una derivacion ventriculoperitoneal (RO-VPS) con valvula que conecta/desconecta un deposito de LCR. En otra realizacion, los medios de administracion comprenden la intubacion. En otra realizacion, los medios de administracion del SLRP comprenden su liberacion por nano-partfculas inyectadas o infundidas en la cavidad intratecal del SNC. El SLRP que se administra con el kit es la decorina. La presente invencion tambien desvela una composicion que comprende decorina y un compuesto terapeutico adicional o secundario para su uso en el tratamiento de afecciones neurologicas. Dichos compuestos adicionales pueden incluir, pero no se limitan a un segundo SLRP que sea diferente al primer SLRP, agentes anti-inflamatorios, agentes reductores de la temperatura, factores neurotroficos de crecimiento disenados para promover el crecimiento del axon y la re-mielinizacion de los axones, agentes anti- apoptoticos para promover la supervivencia de la glfa del SNC, lfquido cefalorraqrndeo artificial, condroitinasas, hidrogeles, litio y combinaciones de los mismos. Las condroitinasas son enzimas que catalizan la eliminacion de los restos de glucuronato de condroitina A, B y C y es un tratamiento para los proteoglicanos de sulfato de condroitina (protemas de la matriz extracelular entre las celulas donde afectan la actividad neural) que se han utilizado para el tratamiento de lesiones medulares experimentales pre-clmicas en animales. El litio puede aumentar la regeneracion neuronal y la diferenciacion (Wong et al., Spinal Cord; 49 2011). Los hidrogeles pueden mejorar la curacion cuando se inyectan en el sitio de la lesion de la medula espinal (Chen, B.K. et al. Comparison of polymer scaffolds in rat spinal cord: a step toward quantitative assessment of combinatorial approaches to spinal cord repair, Biomaterials 32:8077-8086 (2011)).
En otra realizacion de la presente invencion, el SLRP se selecciona de entre el grupo que consiste en decorina, una forma modificada de decorina, una forma modificada qmmicamente de decorina.
Ademas de la regeneracion de los axones lesionados, las estrategias que tambien promuevan la “plasticidad neural”, es decir, la capacidad de supervivientica de los axones en los circuitos neurales para que broten y se formen nuevas sinapsis probablemente tambien promoveran la recuperacion de la funcion neurologica. Por lo tanto, las estrategias terapeuticas que puedan suprimir la formacion de la cicatriz inhibidora del crecimiento del axon en puntos de tiempo agudos tras la sesion y puedan promover tambien la plasticidad de regeneracion y supervivencia de los circuitos neurales en el SNC enfermo o lesionado de manera aguda o cronica despues de que se haya formado el tejido
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cicatricial, pueden proporcionar una recuperacion significativa de las funciones neurologicas.
Las moleculas activas de la presente invencion (SLRP), que incluyen espedficamente la decorina, un antagonista de origen natural de la formacion de la cicatriz, son muy eficaces en la supresion de la inflamacion, la astrogliosis en los bordes de la sesion, la smtesis de multiples CSPG inhibidores y la formacion de cicatriz fibrotica cuando se infunden en las lesiones agudas de la medula espinal en las ratas (Davies, J.E., et al. Decorin suppresses neurocan, brevican, phosphacan and NG2 expression and promotes axon growth across adult rat spinal cord injuries. Eur. J. Neurosci. 19, 1226-1242 (2204)). De manera mas importante, la infusion directa de decorina en la medula espinal permitfa el rapido crecimiento de los axones a traves de los sitios de la lesion solo en 4 dfas (Davies, J.E., et al. Decorin suppresses neurocan, brevican, phosphacan and NG2 expression and promotes axon growth across adult rat spinal cord injuries. Eur. J. Neurosci. 19, 1226-1242 (2004)). La capacidad de la decorina para inhibir tanto la transformacion del factor de crecimiento beta (Yamaguchi, Y., et al. Negative regulation of transforming growth factor-beta by the proteoglycan decorin. Nature 346, 281-284 (1990)) y la senalizacion del receptor del factor de crecimiento epidermico (Csordas, G., et al. Sustained down-regulation of the epidermal growth factor receptor by decorin. A mechanism for controlling tumor growth in vivo. J. Biol. Chem. 275, 32879-32887 (2000)) son probablemente los mecanismos moleculares a traves de los cuales la decorina puede suprimir la formacion de la cicatriz en el SNC ya que los ligandos de TGFp y EGFR, EGF y TGFa, han demostrado regular positivamente la smtesis de CSPG por los astrocitos in vitro (Asher, R.A., et al. Neurocan is upregulated in injured brain and in cytokine-treated astrocytes, J. Neurosci. 20, 2427-2438 (2000); Properzi, F., et al. Chondroitin 6-sulphate synthesis is upregulated in injured CNS, induced by injury-related cytokines and enhanced in axon-growth inhibitory glia, Eur. J. Neurosci. 21, 378-390 (2005); Schnadelbach, O., et al. Expression of DSD-1-PG in primary neural and glial-derived cell line cultures, upregulation by TGF-beta, and implications for cell-substrate inter-actions of the glial cell line Oli- neu. Gila 23, 99-119 (1998)) y promueve la astrogliosis (mal alineamiento de los procesos de astrocitos) in vivo (Rabchevsky, A. G., et al. A role for transforming growth factor alpha as an inducer of astrogliosis. J. Neurosci. 18, 10541-10552 (1998)). Por medio de las interacciones espedficas con el receptor Erb B4, la decorina puede suprimir la expresion de semaforina 3A (Minor, K.H., et al. Decorin, erythroblastic leukaemia viral oncogene homologue B4 and signal transducer and activator of transcription 3 regulation of semaphorin 3A in central nervous system scar tissue, Brain (2010), otra molecula inhibidora asociada a la cicatriz importante que se expresa por los fibroblastos invasores en el centro del tejido cicatricial del cerebro y la medula espinal (R.J. Pasterkamp, A.L. Kolodkin, Semaphorin junction: making tracks toward neural connectivity, Curr. Opin. Neurobiol. 13 (2003) 79-89; F. De Winter, F. De., et al. Injury-induced class 3 semaphorin expression in the rat spinal cord, Exp. Neurol. 175 (2002) 61-75; Pasterkamp, R. J., et al. Role for semaphorin III and its receptor neuropilin-1 in neuronal regeneration and scar formation?, Prog. Brain Res. 117 (1998) 151-170).
Ademas de disminuir los niveles de multiples moleculas inhibidoras en los sitios de la lesion en el SNC, otros medios potenciales de promocion de la regeneracion de los axones lesionados y la plasticidad de supervivencia de los circuitos neurales son eliminar los inhibidores, activar los factores de crecimiento para superar los inhibidores o cambiar directamente la sensibilidad de los axones a los inhibidores.
La infusion de decorina humana directamente en las lesiones de la medula espinal en ratas adultas puede aumentar significativamente los niveles medulares de la serina proteasa Plasmina (Davies J.E., et al. Decorin promotes plasminogen/plasmin expression within acute spinal cord injuries and by adult microglia in vitro. J Neurotrauma. 23 (2006) 397-408). La plasmina es una enzima que se sabe que tiene la capacidad de descomponer los CSPG inhibidores (Wu, Y.P., et al. The tissue plasminogen activator (tPA)/plasmin extra-cellular proteolytic system regulates seizure-induced hippocampal mossy fiber outgrowth through a proteoglycan sub-strate, J. Cell Biol. 148 (2000) 12951304) y el colageno IV {Mackay, 1990 6466 /id}, un componente principal de la lamina basal cicatricial de la glfa (Stichel, C.C., et al. Basal membrane-depleted scar in lesioned CNS: characteristics and relationships with regenerating axons, Neuroscience 93 (1999) 321-333). La plasmina puede activar tambien varias metaloproteinasas de la matriz (MMP) (Murphy, G., et al. The role of plasminogen activators in the regulation of connective tissue metalloproteinases, Ann. N. Y. Acad. Sci. 667 (1992) 1-12) que pueden degradar la lamina basal y promover el crecimiento del axon en presencia de CSPG inhibidores (Ferguson, T.A., y Muir, D. MMP-2 and MMP-9 increase the neurite-promoting potential of schwann cell basal laminae and are upregulated in degenerated nerve, Mol. Cell Neurosci. 16 (2000) 157-167).
Se penso durante mucho tiempo que el equilibrio entre la promocion del crecimiento del axon y las senales inhibidoras tema un papel importante en la regulacion de la capacidad de los axones en regeneracion para atravesar las lesiones del SNC (Ramon y Cajal, S. Degeneration and regeneration of the nervous system, Oxford University Press, London, UK, 1928). Es probable que las neurotrofinas, factores de crecimiento que se expresan transitoriamente en las lesiones del SNC (Nakamura, M. y Bregman, B.S. Differences in neurotrophic factor gene expression profiles between neonate and adult rat spinal cord after injury, Exp. Neurol. 169 (2001) 407-415), promuevan el brote de los axones cortados como describio en primer lugar Ramon y Cajal y que la rapida regulacion positiva de los inhibidores del crecimiento del axon asociados a la cicatriz tales como los CSPG resulte en la naturaleza abortiva final de los brotes (Davies, S. J., et al. Robust regeneration of adult sensory axons in degenerating white matter of the adult rat spinal cord, J. Neurosci. 19 (1999) 5810-5822; Davies, S. J. y Silver, J. Adult axon regeneration in adult CNS white matter [letter; comment], Trends Neurosci. 21 (1998) 515; S.J. Davies, S. J., et al. Regeneration of adult axons in white matter tracts of the central nervous system, Nature 390 (1997) 680-
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683). El aumento de las senales de promocion del crecimiento por el suministro de neurotrofinas exogenas a los cuerpos celulares de las neuronas axotomizadas (Hiebert, G.W., et al. Brain-derived neurotrophic factor applied to the motor cortex promotes sprouting of corticospinal fibers but not regeneration into a peripheral nerve transplant, J. Neurosci. Res. 69 (2002) 160-168; Plunet, W., et al. Promoting axonal regeneration in the central nervous system by enhancing the cell body response to axotomy, J. Neurosci. Res. 68 (2002) 1-6) o en la vecindad de los sitios de la lesion en combinacion con puentes celulares (Oudega, M. y Hagg, T. Nerve growth factor promotes regeneration of sensory axons into adult rat spinal cord, Exp. Neurol. 140 (1996) 218-229); revisado en (Bregman, B.S., et al. Transplants and neurotrophic factors prevent atrophy of mature CNS neurons after spinal cord injury, Exp. Neurol. 149 (1998) 13-27; Murray, M., et al. Transplantation of genetically modified cells contributes to repair and recovery from spinal injury, Brain Res. Brain Res. Rev. 40 (2002) 292-300) han demostrado que promueven el crecimiento del axon a traves del tejido cicatricial del SNC. Las neurotrofinas promueven tambien el crecimiento del axon in vitro en presencia de mielina y glucoprotemas asociadas a mielina (MAG) (Cai, D., et al. Prior exposure to neurotrophins blocks inhibition of axonal regeneration by MAG and myelin via a cAMP-dependent mechanism, Neuron 22 (1999) 89-101). Las neurotrofinas maduras que promueven el crecimiento del axon se derivan de pro-neurotrofinas por escision enzimatica post-traduccional (Edwards, R. H., et al. Processing of the native nerve growth factor precursor to form biologically active nerve growth factor, J Biol. Chem. 263 (1988) 6810-6815). Principalmente, el proNGF (pro- peptido del Factor de Crecimiento de Nervios humano) y proBDNF (precursor del factor Neurotrofico derivado del cerebro) son escindidos por la plasmina y las metaloproteinasas de la matriz selectivas (MMP) (Dougherty, K.D., et al. Brain-derived neurotrophic factor in astrocytes, oligodendrocytes, and micro-glia/macrophages after spinal cord injury, Neurobiol. Dis. 7 (2000) 574-585; Lee, R., et al. Regulation of cell survival by secreted proneurotrophins, Science 294 (2001) 1945-1948; Pang, P.T., et al. Cleavage of proBDNF by tPA/plasmin is essential for long-term hippocampal plasticity, Science 306 (2004) 487-491). Los aumentos de plasmina inducidos por la decorina en el CNS lesionado o enfermo por lo tanto puede aumentar los niveles de las neurotrofinas maduras disponibles para promover la regeneracion del axon y la plasticidad en la medula espinal y cerebro, lesionados o enfermos aguda y cronicamente.
La decorina puede tener un efecto directo sobre las neuronas y puede des-sensibilizarlas eficazmente frente a los efectos inhibidores de crecimiento del axon de multiples CSPG e inhibidores asociados a la mielina (Minor, K., et al. Decorin promotes robust axon growth on inhibitory CSPGs and myelin via a direct effect on neurons, Neurobiol. Dis. 32 (2008) 88-95). Se observaron aumentos robustos en el crecimiento del axon de 14,5 y 4,8 veces en neuronas sensoriales adultas tratadas con decorina que crecieron sobre los CSPG de la cicatriz inhibidores del crecimiento del axon y la mielina respectivamente (Minor, K., et al. Decorin promotes robust axon growth on inhibitory CSPGs and myelin via a direct effect on neurons, Neurobiol. Dis. 32 (2008) 88-95). El potencial para promover el crecimiento del axon a pesar de la presencia de inhibidores asociados a los CSPG y mielina hace que la infusion de decorina en los tejidos del SNC lesionados tenga un atributo importante para su uso como terapia potencial para promover la regeneracion del axon y la plasticidad de la conexion en el SNC lesionado sub-aguda y cronicamente en el que se sabe que los niveles de esas moleculas inhibidoras son altos en la materia blanca y la materia gris (Tang, X., et al. Changes in distribution, cell associations, and protein expression levels of NG2, neurocan, phosphacan, brevican, versican V2, and tenascin-C during acute to chronic maturation of spinal cord scar tissue, J. Neurosci. Res. 71 (2003) 427-444; Schwab, M.E. Nogo and axon regeneration, Curr. Opin. Neurobiol. 14 (2004) 118-124). Los datos que se presentan en los ejemplos del presente documento muestran que el tratamiento de ratas adultas con lesiones por contusion de la medula espinal por medio de la infusion intratecal de decorina utilizando el nuevo paradigma de tratamiento de la presente invencion puede promover el brote robusto de axones en la medula espinal, la plasticidad sinaptica de las neuronas motoras medulares y una recuperacion robusta de una variedad de funciones locomotoras.
Como se demuestra en los ejemplos posteriores, se ensayo la capacidad de la infusion intratecal de decorina humana para promover la recuperacion funcional en un modelo de lesion por contusion de la medula espinal cervical en roedores relevante clmicamente. En la busqueda para establecer un medio clmicamente relevante de administracion de decorina al sistema nervioso central lesionado, se administro el centro proteico de decorina recombinante humana por via intratecal a grupos distintos de ratas lesionadas en la medula espinal comenzando inmediatamente despues de la lesion, 12 dfas despues de la lesion de la medula espinal y 1 mes despues de la lesion. Notablemente en el punto de tiempo de los 12 dfas y 1 mes tras la lesion, el tejido cicatricial del sistema nervioso central que inhibe del crecimiento del axon ya estaba bien establecido y la oportunidad de promover una neuroproteccion significativa de las neuronas lesionadas estaba enormemente reducida. Entonces, se evaluo la capacidad de la decorina para promover la recuperacion por medio de mecanismos que impliquen la promocion de la plasticidad de conexion de los circuitos neurales supervivientes. El tratamiento con decorina de las ratas adultas con lesiones de la medula espinal daba como resultado una recuperacion funcional robusta de las funciones locomotoras segun se media por los analisis GridWalk/escalera horizontal y CatWalk. El analisis CatWalk de las ratas tratadas a los 12 dfas tras la lesion demostraba la recuperacion tanto de las extremidades anteriores y posteriores en el lado lesionado despues del tratamiento con decorina que se correlacionaba con una recuperacion de ~85% de las puntuaciones de actuacion en GridWalk/escalera horizontal. En particular, la sorprendente recuperacion del uso tanto de los dedos de la extremidad delantera y trasera en las ratas con lesion de la medula espinal tratadas con decorina tema implicaciones importantes en la capacidad potencial del tratamiento intratecal con decorina para promover la recuperacion de la funcion de los dedos de la mano y el pie en seres humanos con lesiones en la medula espinal. Como se proporciona en los datos de la seccion de Ejemplos, la recuperacion
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funcional que se observa en las ratas con lesion de la medula espinal tratadas hasta 12 d^as tras la lesion se correlacionaban con el aumento de la densidad de los axones del tracto corticoespinal (CST) adyacentes y por debajo del sitio de lesion y tambien el aumento de la densidad de la sinapsina-1 (una protema que se expresa en las sinapsis activas) en los sitios por debajo de la materia gris del cuerno ventral. Estos hallazgos apoyan ademas que la infusion intratecal de decorina puede ser un tratamiento del sistema nervioso central del ser humano adulto lesionado por traumatismo o enfermo (cerebro y medula espinal). De manera importante, la capacidad de la decorina para promover la plasticidad de los circuitos de control motor importantes, tales como el tracto corticoespinal y la densidad de sinapsis activas en las neuronas motoras medulares, extiende la ventana terapeutica de la infusion intratecal de decorina a la promocion de la recuperacion funcional a las lesiones del sistema nervioso central cronicas y sub-agudas.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la presente invencion.
Ejemplos
Ejemplo 1
Este ejemplo demuestra el efecto del tratamiento con decorina de acuerdo con la presente invencion sobre la capacidad de ratas adultas con lesiones de la medula espinal para cruzar un Grid-Walk / escalera horizontal en comparacion con ratas no tratadas.
Se ensayo el centro proteico de decorina humana, GALACORIN™ en un protocolo de tratamiento retardado (sub- agudo) para ratas adultas con lesiones en la medula espinal cervical. Se llevaron a cabo las lesiones de la medula espinal experimentales utilizando un dispositivo de Impacto Infinite Horizon (IH) (Precision Systems and Instrumentation, LLC) para generar una contusion unilateral moderadamente grave a nivel cervical (niveles vertebrales C4-C5; contusion unilateral en el lado derecho; diametro de punta de 1,7 mm; fuerza 75 kDinas; desplazamiento 1,1 mm) en ratas adultas Sprague Dawley (hembras de tres meses de edad). Comenzando en el punto de tiempo de doce semanas tras la lesion de la medula espinal, las ratas con lesion en la medula espinal (n=9) se trataron con GALACORIN™ utilizando el nuevo paradigma de tratamiento en el que el GALACORIN™ se infundio en el lfquido cefalorraqrndeo (LCR) y no directamente en los tejidos del sistema nervioso central de la medula espinal o el cerebro (Figura 2). Para conseguir el suministro en el LCR de GALACORIN™, se implanto una canula de pequeno tamano por medio de un pequeno agujero taladrado en el hueso occipital del craneo (Figuras 1 y 2). Se retiro aproximadamente el 20% (0,1 ml) del total de lfquido cefalorraqrndeo y se sustituyo con un vehuculo de solucion salina fosfato tamponada (PBS) que contema GALACORIN™ a una concentracion de 5 mg/ml (es decir, 1 mg de GALACORIN™). Las canulas se anclaron entonces al craneo utilizando cemento dental y se conectaron a bombas osmoticas Alzet precargadas con solucion salina que contema GALACORIN™ a una concentracion de 5 mg/ml para el suministro continuo intratecal a una velocidad de 0,1 mg de GALACORIN™ al dfa durante 8 dfas. Se administraron por lo tanto un total de 1,43 mg de GALACORIN™ durante el periodo de 8 dfas de infusion. Los grupos de control de ratas con lesion de la medula espinal sin tratar consistfan en las que solo recibieron una canula en la cisterna magna (grupo de control 1: n = 9 ratas) o la canula en la cisterna magna mas infusion de PBS (grupo de control 2: n = 7 ratas).
Despues de la cirugfa, tanto las ratas tratadas como no tratadas con GALACORIN™ se sometieron a ensayo del comportamiento neurologico durante un periodo de 6 semanas. El ensayo Grid-walk o escalera horizontal es un ensayo riguroso ampliamente reconocido de la recuperacion locomotora de colocacion voluntaria de la garra en roedores con lesion en la medula espinal en el que se registra el numero medio de errores (fallos) que cometen las ratas al andar tres pasos en una escalera de longitud determinada. Los resultados de la recuperacion funcional neurologica en Grid walk (Figura 3 y Tabla 1) demostraban claramente una reduccion robusta del numero de malos pasos (errores) durante el tiempo que se hacfa en los animales tratados con GALACORIN™ en comparacion con los grupos de control de animales lesionados en la medula espinal sin tratar. Al final de las 6 semanas tras comenzar el tratamiento de GALACORIN™ a los 12 dfas tras la lesion, las ratas tratadas con GALACORIN™ presentaban una robusta reduccion del 61% en el numero de errores en comparacion con las puntuaciones conseguidas por las ratas con lesion de la medula espinal sin tratar que recibfan solo una canula en la cisterna magna (grupo de control 1) o las que eran infundidas de manera identica con solo el vetnculo de PBS (grupo de control 2).
Tabla 1
- Grupo Experimental
- Malos pasos en Grid-walk Pre- tratamiento Malos pasos Grid-walk a las 6 semanas post- tratamiento
- SCI + Galacorin (n = 9 ratas)
- 12,67 (SD +/-1,04) 3,78 (SD +/-1,56)
- Control 1 SCI + canula (n = 9 ratas)
- 12,74 (SD +/-0,10) 9,70 (SD +/- 2,16)
- Control 2 SCI + PBS (n = 7 ratas)
- 13,07 (SD +/-1,29) 9,71 (SD +/- 2,89)
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- Grupo Experimental
- Malos pasos en Grid-walk Pre- tratamiento Malos pasos Grid-walk a las 6 semanas post- tratamiento
- SD = Desviacion Estandar
Los analisis histologicos de un grupo piloto de 4 ratas que recibieron una lesion por contusion de la medula espinal identica seguida por la infusion inmediata de GALACORIN™ marcado con Alexa-488 en la cisterna magna, mostraba que el GALACORIN™ que se administraba de esta manera era localizable tanto en los tejidos medulares lesionados asf como en las meninges de alrededor (duramadre y aracnoides) y en las rafces del sistema nervioso periferico (rafces dorsal y ventral). En este analisis se hizo una lesion unilateral por contusion con un Impactador Infinite Horizon en ratas hembra adultas de tres meses de edad (n = 4) con una infusion aguda de GALACORIN™ marcada con Alexa-488 en la cisterna magna. El analisis histologico se llevo a cabo a las 18 horas tras la infusion. La imagen histologica del analisis era una seccion de corte a nivel medular C5 (justo caudal al sitio de la lesion).
Ejemplo 2
Este ejemplo es un analisis CatWalk de la recuperacion locomotora de ratas lesionadas en la medula espinal tratadas con decorina en comparacion con ratas lesionadas en la medula espinal no tratadas con decorina (control). Tambien se llevo a cabo la comparacion de los animales tratados y no tratados con marcaje de tejidos de la medula espinal con dextrano amina biotinilada (BDA). Se llevo a cabo un analisis cuantitativo automatico de la marcha en todos los grupos experimentales utilizando el sistema CatWalk XT (Version 8.1, Noldus Information Technology, Leesburg, VA, USA). El sistema CatWalk se habfa descrito anteriormente con gran detalle (F.P. Hamers, et al. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. J. Neurotrauma 23, 537-548 (2006)). El sistema de hardware consiste en un camino de cristal translucido bajo el que una videocamara (Fujinon Corporation, Japon) graba las huellas de las garras de las ratas segun atraviesan el camino. La adquisicion de los datos del CatWalk y los analisis se llevaron a cabo por individuos que eran ignorantes respecto a los grupos de tratamiento. Se recolectaron de cada animal tres ejecuciones que se consideraron conformes en cada punto de tiempo y se determino el promedio de cada parametro. La conformidad se determino basandose en el tiempo total utilizado para atravesar el camino y la variacion en la velocidad de la marcha. La longitud recorrida minima era de 2 segundos; la longitud maxima fue de 12 segundos, y la variacion maxima de velocidad de la marcha del 60%. La camara se posiciono de manera que la longitud del camino medido eran 70 cm. Se ensayaron los animales de todos los grupos inmediatamente antes de la lesion, inmediatamente antes del tratamiento a los 12 dfas tras la lesion, y a las 5 semanas tras la lesion. Se analizaron los siguientes parametros: area de la huella, area de la huella de maximo contacto, intensidad de la huella, contacto maximo respecto a la estacion, e intensidad maxima en el contacto maximo. Los archivos de video de las ejecuciones conformes de todos los grupos se procesaron utilizando el software CatWalk. El uso de los dedos se determino adquiriendo imagenes de las huellas en el punto de Contacto Maximo como define el software. Se seleccionaron de manera aleatoria las imagenes de las huellas en maximo contacto para cada extremidad de una manera seriada, seleccionandose 2 huellas por ejecucion conforme para un total de 6 huellas seleccionadas aleatoriamente para las cuatro extremidades. Esta seleccion aleatoria se llevo a cabo sobre las imagenes recolectadas de todos los animales en los tres puntos de tiempo de evaluacion. Las imagenes de huellas en maximo contacto se generaron utilizando la caractenstica de visualizacion 3D del CatWalk XT 8.1. Las huellas de los dedos para cada imagen de huellas se contaron de manera ciega. Las mediciones de los parametros estaticos y dinamicos de las huellas y la marcha se exportaron entonces a Microsoft Excel y se llevo a cabo el analisis estadfstico utilizando el software SigmaStat.
Calculo del porcentaje de recuperacion por puntuaciones de actuacion locomotora CatWalk
Para estimar el porcentaje de recuperacion con los resultados del GridWalk y CatWalk, se utilizaron las puntuaciones medias de cada grupo experimental medidas en los periodos pre-lesional, pre-tratamiento, y 5 semanas tras la lesion. A partir de estas medias, el calculo del porcentaje de recuperacion (% de Recuperacion) se calculo de la siguiente manera:
donde
Xpre Les = Puntuacion media del parametro de comportamiento antes de la lesion
Xpre Tx = Puntuacion media para el parametro justo antes del tratamiento
Xpost Les = Puntuacion media para el parametro a un tiempo espedfico tras la lesion
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Seguimiento anterogrado de la amina dextrano biotinilada (BDA) al tracto corticoespinoso (CST) de la extremidad anterior
Dos semanas antes de la eutanasia, todos los animales se anestesiaron y se colocaron en un instrumento estereotaxico (Kopf) para el seguimiento del CST de la extremidad anterior. Tras la exposicion del craneo, se hicieron cuatro perforaciones utilizando una broca quirurgica y se inyectaron 4 inyecciones a presion de 0,5 ml de una solucion al 10% de amina dextrano biotinilada (BDA PM 10,000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en PBS en la corteza sensomotora de la extremidad delantera izquierda (coordenadas estereotaxicas: 1,0 y 2,0 mm anteriores al bregma, 2,5 y 3,5 mm laterales a bregma, y 1,6 mm de profundidad en la superficie cortical).
Las inyecciones se hicieron por medio de capilaridad con cristal empujado finamente que permaneda en la posicion durante 2 minutos despues del suministro. A continuacion de las inyecciones de BDA, los animales se suturaron y se les dejo en recuperacion. Se llevo a cabo la visualizacion de los axones marcados con BDA en las secciones de cortes histologicos de los tejidos de la medula espinal con procedimientos de inmunohistoqmmica convencionales (vease Davies J.E., et al. Astrocytes derived from glial restricted precursors promote spinal cord repair Journal of Biology 5:7 (2006). Las secciones de medula espinal se visualizaron y se tomaron imagenes en un microscopio Zeiss Observer Z1 utilizando un software AxioVision.
Analisis de densidad de CST/BDA y sinapsina-1 en la materia gris medular
Se utilizo el software ImageJ para el umbral y para medir las densidades de los axones del CST marcados con BDA y la sinapsina-1. Las densidades del CST se midieron en la materia gris del cuerno dorsal a nivel medular C5. En cada sexta seccion de una serie se midieron aproximadamente 400 mm de tejido. Las densidades de sinapsina-1 se midieron de manera similar por debajo de la cavidad de lesion (C6) en los cuernos ventrales alrededor de los grupos neuronales de la lamina IX.
El analisis CatWalk muestra que la infusion intratecal de decorina promueve una recuperacion robusta de la funcion locomotora y el uso de los dedos tras la lesion traumatica de la medula espinal.
Ademas del analisis Gridwalk, la recuperacion de la funcion locomotora de los grupos experimentales se evaluo tambien utilizando el analisis de la marcha CatWalk a las 5 semanas tras la lesion / 3 semanas tras el tratamiento. Como habfa informado previamente Gensel, et al. (Behavior and histological characterization of unilateral cervical spinal cord contusion injury in rats. J. Neurotrauma 23, 36-54 (2006)) a continuacion de una contusion cervical unilateral, no habfa cambios significativos en los parametros dinamicos para las extremidades en el lado ipsilateral despues de la lesion, tales como cambios en las posiciones de las huellas, la base del soporte, la longitud de zancada, o patron de pisada. Sin embargo se encontraron cambios estadfsticamente significativos en comparacion con los valores pre-lesionales en el pre-tratamiento / 12 dfas tras las lesion en una variedad de parametros espedficos de la garra tales como en el area de huella, intensidad de huella, area de huella en maximo contacto, maximo contacto respecto a la estacion, y maxima intensidad en maximo contacto (Figs. 4A- 4H).
Area media de huella
El area de huella se define como la superficie del area de una huella completa durante el tiempo completo que la garra esta en contacto con la placa de cristal, comparable al metodo de tampon de tinta de determinacion del area de huella (F.P. Hamers, et al. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. J. Neurotrauma 23, 537-548 (2006)). El analisis de las areas de las huellas para los animales de experimentacion revelaba valores comprables con la lmea base pre-lesional para las areas de huellas medias de las extremidades derechas (ipsilaterales) traseras y delanteras en todas las ratas individuales antes de la lesion y antes del tratamiento. Las lesiones por contusion unilateral a nivel medular C4/C5 daba como resultado una reduccion significativa de las areas medias de huellas de las extremidades delantera y trasera ipsilaterales a los sitios de la lesion para todas las ratas de experimentacion. El tratamiento con decorina de las ratas lesionadas en la medula espinal a los 12 dfas tras la lesion daba como resultado una recuperacion estadfsticamente significativa en el area media de huella tanto para las extremidades delanteras como traseras a las cinco semanas tras la lesion en comparacion con las ratas lesionadas en la medula espinal no tratadas solo con solucion salina y con un cateter.
El porcentaje de aumento de la recuperacion del area media de huella se determino restando los valores del area media pre-tratamiento de la lmea base de los valores pre-lesionales y expresa los aumentos como un porcentaje de la diferencia. En comparacion con los valores pre-tratamiento, las ratas con SCI tratadas con decorina mostraban una recuperacion del 37,36% en el area media de la huella de la extremidad delantera derecha (Fig. 4B) y un 79,23% de recuperacion en el area media de la huella de la extremidad trasera derecha (Fig. 4E) es decir, volviendo cerca de los niveles de la lmea base pre-lesionales. Los animales tratados con solucion salina presentaban una modesta recuperacion del 26,08% en el area media de la huella de la extremidad delantera pero una perdida adicional del 13,3% en el area media de la huella de la extremidad trasera a las cinco semanas tras la lesion (Figs. 4B y 4E) en comparacion con los valores de pre-tratamiento. Las ratas con lesion en la medula espinal que recibieron un cateter y sin infusion presentaban un grado de recuperacion del 9,45% cinco semanas tras la lesion en el area de huella media de la extremidad anterior y una perdida en cafda del 38,67% en el area de huella de la
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extremidad trasera, es dedr, una perdida adicional de la funcion de la garra en comparacion con el punto de tiempo de pre-tratamiento a los 12 dfas despues de la lesion (Fig. 4B y 4E).
Area de la huella de maximo contacto
Durante la locomocion, cada garra genera un area de huella de maximo contacto, que se produce cuando progresa la fase de frenada a la fase de propulsion del contacto de las garras con el camino de cristal (manual del usuario de Noldus Catwalk XT 8.1: (F.P. Hamers, et al. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. J. Neurotrauma 23, 537-548 (2006))). Cada grupo de tratamiento tema valores de base pre-lesionales para el area de huella de maximo contacto tanto de las extremidades anteriores como posteriores que no eran diferentes estadfsticamente unas de otras. A los 12 dfas tras la lesion / punto de tiempo pre-tratamiento, todos los grupos de tratamiento presentaban reducciones significativas en las areas de maximo contacto de las huellas de la extremidad anterior y extremidad posterior derechas ipsilaterales en comparacion con los valores de la lmea base. A las 5 semanas tras la lesion. las ratas con SCI tratadas con decorina presentaban una recuperacion significativa en el area media de contacto maximo de las extremidades delantera y trasera derechas ipsilaterales con areas de huella de maximo contacto para las extremidades delantera y trasera ipsilaterales que alcanzaban un 35,92% y un 88,82% de recuperacion respectivamente. A las 5 semanas tras la lesion, los animales tratados con solucion salina sin embargo presentaban una pequena recuperacion del 29,15% en el area media de maximo contacto de la extremidad delantera derecha y un 16,49% de perdida en el area media de contacto maximo de la extremidad trasera derecha. Los animales con SCI sin tratar de control presentaban una recuperacion incluso mas pequena del 14,34% en el area media de contacto maximo de la extremidad delantera derecha en comparacion con las ratas tratadas con solucion salina, y una perdida incluso mayor del 43,35% del area media de contacto maximo en comparacion con los valores pre-tratamiento a las 5 semanas tras la lesion / 3 semanas post-tratamiento (Figs. 4C y 4F).
Intensidad media de la huella
Los valores de la intensidad de la huella son directamente proporcionales a la presion que ejerce la garra cuando esta en contacto con la placa de cristal (F.P. Hamers, et al. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. J. Neurotrauma 23, 537-548 (2006)). La SCI resultaba en deficits significativos constantes en la intensidad media de las huellas de las extremidades delanteras y extremidades traseras derechas a lo largo de los grupos de tratamiento. A las 5 semanas tras la lesion los animales tratados con decorina presentaban una recuperacion estadfsticamente significativa del 10,84% en los valores medios de intensidad de la huella de la extremidad delantera derecha, y una recuperacion del 89,28% en la intensidad media de la huella de la extremidad trasera derecha. Sin embargo los animales tratados con solucion salina presentaban un 41,16% de perdida de la intensidad media de la huella en la extremidad delantera derecha y una recuperacion del 6,53% en la intensidad media de la huella de la extremidad trasera derecha. Los controles con SCI no tratados presentaban una perdida del 58,87% de la intensidad media de la huella de la extremidad delantera derecha y una perdida de la intensidad media de la huella en la extremidad trasera derecha (Fig. 4A y 4D).
Maximo contacto en porcentaje en estacion
Este parametro como se define en el presente documento es el periodo de tiempo durante el cual la garra esta en contacto con el camino de cristal (al que se hace referencia como la “estacion”) y el punto de maximo contacto que divide la fase de frenado de la fase de propulsion (conocido de otra manera como maximo contacto en %: Manual Noldus). Aunque cada garra se utiliza tanto para el frenado y la propulsion, las extremidades delanteras y las extremidades traseras se utilizan de manera diferente durante cada estacion. Las extremidades anteriores se utilizan predominantemente para el frenado, mientras que las extremidades posteriores se utilizan principalmente para la propulsion (Webb, A.A., et al. Compensatory locomotor adjustments of rats with cervical or thoracic spinal cord hemisections, J. Neurotrauma 19, 239-256 (2002); Webb, A.A., et al. Unilateral dorsal column and rubrospinal tract injuries affect overground locomotion in the unrestrained rat, Eur. J. Neurosci. 18, 412-422 (2003)). Por lo tanto, las extremidades traseras tienen un porcentaje mayor de estacion (duracion de contacto con en cristal) unido a la propulsion, y por lo tanto el area de huella alcanza un maximo contacto antes en la estacion. El CatWalk mide este parametro que es el porcentaje de estacion cuando la extremidad trasera alcanza el maximo contacto. Por lo tanto, antes de la lesion, las extremidades traseras alcanzan el maximo contacto con un porcentaje menor de estacion en comparacion con las extremidades delanteras, debido a su papel en la propulsion durante la locomocion.
El modelo de lesion por contusion cervical de los inventores daba como resultado un deficit funcional en el que la extremidad trasera derecha que alcanzaba un contacto maximo con un porcentaje significativamente mayor de la estacion (Maximo Contacto en %) en comparacion con los valores de la lmea base pre-lesionales en todos los animales. A las cinco semanas tras la lesion, los animales tratados con decorina presentaban una disminucion significativa en el maximo contacto en % de la extremidad trasera derecha, que correspondfa con un 56,38% de recuperacion de la propulsion en esta extremidad (Fig. 4H). Los animales tratados con solucion salina presentaban un descenso mmimo en el maximo contacto en % (una mejona del 17,46%), mientras que los controles con SCI no tratados continuaban presentando una perdida de funcion a las cinco semanas tras la lesion (una perdida de funcion del 5,52%). Por lo tanto, el tratamiento con decorina promovfa una vuelta hacia la division normal del uso de frenado frente a propulsion en la extremidad trasera del lado lesionado del animal, permitiendo en ultimo termino una
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propulsion mejorada de la extremidad trasera durante la locomocion (Fig. 4H). [Notese que en el tftulo de la Figura 4H debena leerse “Max. Contacto en % de la extremidad trasera derecha” y NO “Max. Contacto en Media de la extremidad trasera derecha”] Corrijan esto por favor en los archivos Excel.
Maxima intensidad de maximo contacto
La maxima intensidad en el punto de maximo contacto es una medida de la presion y soporte del peso ejercido en la placa de cristal durante la frontera entre las fases de frenado y propulsion (Noldus Catwalk manual: (F.P. Hamers, et al. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. J. Neurotrauma 23, 537-548 (2006))). El modelo de lesion por contusion cervical de los inventores produda una reduccion estadfsticamente significativa de este parametro en comparacion con los valores de la lmea base, que indicaban la disfuncion durante la transicion entre las fases de frenado y propulsion. Las ratas con SCI tratadas con decorina presentaban una recuperacion del 63,51% en este parametro en la extremidad trasera derecha cinco semanas tras la lesion, mientras que los animales tratados con solucion salina presentaban una recuperacion mucho mas pequena del 17,81% y los controles sin tratar presentaban una perdida mayor del 37,02% cinco semanas tras la lesion (Fig. 4G).
Dedos en maximo contacto
Hamers, et al. (CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. J. Neurotrauma 23, 537-548 (2006)) habfan demostrado anteriormente que en el punto de maximo contacto, casi todos los dedos de la garra estaran en contacto con la placa de cristal en las extremidades traseras de las ratas normales no lesionadas. El estudio de los inventores confirmaban esto, y tambien demostraban que cuando la garra delantera alcanza el maximo contacto con la placa de cristal en las ratas lesionadas, todos los dedos (3,89 ± 0,04 de 4 dedos posibles) hacen contacto con el cristal en este punto tambien. Para la extremidad trasera en el estudio de los inventores, los animales no lesionados presentaban una media de 3,75 ± 0,11 de 5 dedos a maximo contacto (Tabla 2). El modelo de lesion por contusion cervical de los inventores daba como resultado una reduccion significativa del numero medio de huellas de dedos en maximo contacto, tanto en las garras delanteras (1,95 ± 0,12 dedos) como en las garras traseras (1,26 ± 0,14 dedos) ipsilaterales a la lesion en los puntos de tiempo de 12 dfas tras la lesion / pre- tratamiento. Las ratas con SCI tratadas con decorina presentaban una recuperacion significativa con una media de 3,76 ± 0,58 de huellas de dedos de la garra delantera a las 5 semanas tras la lesion, y de 3,88 ± 0,69 huellas de dedos de la garra trasera. Las ratas tratadas con solucion salina presentaban una recuperacion menor en el numero de huellas de dedos en contacto maximo, con 2,58 ± 0,47 huellas de dedos de la garra anterior y 1,37 ± 0,78 huellas de dedos de la garra posterior. Los controles sin tratamiento presentaban incluso menos huellas de dedos en maximo contacto, con medias de 2,19 ± 0,60 en las garras anteriores, y 0,96 ± 0,68 en las garras posteriores.
Como se muestra en la Tabla 2, el analisis CatWalk demostraba que la infusion intratecal de decorina promovfa la recuperacion del uso de los dedos de la garra en ratas con lesiones en la medula espinal. Las ratas lesionadas en la medula espinal tratadas con decorina presentaban huellas de la garra a maximo contacto con numeros de contacto digital extraordinariamente similares a las huellas antes de la lesion al contrario de las ratas de control lesionadas en la medula espinal sin tratar que no presentaban recuperacion del uso de los dedos a las 5 semanas tras la lesion de la medula espinal en comparacion con las puntuaciones pre-tratamiento.
Tabla 2
- Analisis CatWalk
- Sin tratamiento Tratadas con decorina
- Uso de los dedos de la garra delantera derecha (4 max.)
- 2,2 +/- 1,3 SD 3,8 +/- 0,6 SD
- Uso de los dedos de la garra trasera derecha (5 max.)
- 1,0 +/- 1,5 SD 3,9 +/- 1,4 SD
Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra el efecto de la administracion de decorina de acuerdo con la presente invencion en distintos puntos de tiempo (tiempo = 0, 12 dfas, 1 mes) despues de la lesion en la actuacion de las ratas lesionadas en la medula espinal en el analisis GridWalk.
Se analizaron los beneficios de la infusion intratecal de la decorina en la cisterna magna de ratas adultas con lesiones por contusion unilateral a niveles medulares cervicales C4/C5. Este analisis comenzaba o inmediatamente tras la lesion o 1 mes despues de la lesion utilizando un numero comparable de animales por grupo experimental y un protocolo de infusion, quirurgico y de ensayo del comportamiento GridWalk/escalera horizontal identico al que se ha descrito para los resultados que se obtienen con la infusion de decorina a los 12 dfas despues de la lesion de la medula espinal. Como se muestra en la Figura 5 habfa reducciones robustas del numero de malos pasos en las ratas al cruzar la escalera horizontal para todas las ratas tratadas con decorina en comparacion con las ratas lesionadas en la medula espinal de control sin tratar que recibfan solo la canula en la cisterna magna pero sin infundir decorina. Las puntuaciones de la actuacion que se muestran en la Figura 5 representan las puntuaciones de actuacion (malos pasos) a las 8 semanas tras la lesion para las ratas lesionadas en la medula espinal por contusion cervical tratadas con infusion de decorina intratecal que comenzaban en: punto de tiempo Agudo (inmediatamente
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despues de la lesion), 12 dfas (12d) y Cronico 1 mes (1 mes), tras la lesion.
Ejemplo 4
Este ejemplo ilustra el efecto del tratamiento con decorina sobre el aumento en la densidad colateral del CST en la materia gris adyacente o debajo de los sitios de la lesion.
Los estudios previos habfan demostrado deficits significativos en la funcion de la extremidad anterior tras la lesion por contusion cervical unilateral a nivel C4-C5 a pesar de la escasa materia blanca de la columna de CST dorsal, y se ha demostrado que el brote colateral del CST a nivel cervical se correlaciona con la recuperacion locomotora tras la lesion en la medula espinal (Schucht, P., et al. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord, Exp. Neurol. 176, 143-153 (2002)). Este ejemplo evalua la capacidad de la infusion intratecal de decorina para promover la plasticidad colateral del CST del axon en la supervivencia de la materia gris caudal a los sitios de la lesion. En las ratas con SCI tratadas con decorina y sin tratar, se inyecto amina dextrano biotinilada (BDA) en el area de la extremidad anterior de la corteza sensomotora del hemisferio izquierdo para hacer el seguimiento de los axones y colaterales de la lamina V de las neuronas motoras superiores en el lado del CST derecho de la medula espinal cervical. El analisis seriado de secciones histologicas de materia gris de las medulas espinales tratadas con decorina frente a las no tratadas, en los sitios por encima, adyacentes, y por debajo de la lesion revelaba que los cambios mas significativos en la densidad colateral del CST + BDA se encontraban en la materia gris dorsomedial de la lamina 1-5 (Fig.6), un campo terminal del CST conocido por su funcion del soporte sensomotor. Los colaterales de los axones del CST de la extremidad delantera presentaban una extensa ramificacion y arborizacion en la materia gris dorsomedial de las laminas 1-5 caudales a los sitios de la lesion cuando se comparaban con los controles sin tratar. El analisis cuantitativo de secciones en serie demostraban que el tratamiento con decorina promovfa un aumento de 2,8 veces en la densidad de los axones del CST marcados con BDA en la materia gris dorsomedial de las laminas 1-5 frente a lo que se observaba en las medulas espinales no tratadas (Fig. 6).
Ejemplo 5
Este ejemplo ilustra la capacidad de la infusion intratecal de decorina para promover la plasticidad sinaptica en la materia gris ventral de los grupos neuronales motores.
Se analizo la plasticidad sinaptica en la materia gris de medulas espinales lesionadas tratadas con decorina y controles sin tratar, enfocandose en la sinapsina-1, una protema pre-sinaptica que se encuentra en sinapsis activas y que se sabe que tiene papeles en la maduracion sinaptica y el mantenimiento de la sinapsis a largo plazo y la transmision (Lu, B. Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse, Neuroscience 74, 1087-1097 (1996); Thiel, G. Synapsin I, synapsin II, and synaptophysin: marker proteins of synaptic vesicles, Brain Pathol. 3, 87-95 (1993); Gulino, R., et al. Synaptic plasticity modulates the spontaneous recovery of locomotion after spinal cord hemisection, Neurosci. Res. 57, 148-156 (2007); Koelsch, A., et al. Transgene-mediated GDNF expression enhances synaptic connectivity and GABA transmission to improve functional outcome after spinal cord contusion, J Neurochem. 113, 143-152 (2010); Mundy, W.R., et al. Protein biomarkers associated with growth and synaptogenesis in a cell culture model of neuronal development, Toxicology 249, 220-229 (2008); De, C.P., et al. Synapsin I (Protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. II. Its specific association with synaptic vesicles demonstrated by immunocytochemistry in agarose-embedded synaptosomes, J Cell Biol. 96, 1355-1373 (1983)). La inmunodensidad de sinapsina-1 estaba elevada en la materia gris ventral por debajo del nivel de la lesion en el nivel C6 medular para los grupos de neuronas motoras de la lamina IX que controlan el movimiento de la extremidad anterior. Como se muestra en la Figura 7, las medulas espinales tratadas con decorina presentaban aumentos sorprendentes en la inmunodensidad de sinapsina-1 en la materia gris ventral en comparacion con los controles no tratados. En las medulas espinales tratadas con decorina, se observaron niveles aumentados de sinapsina-1 puntuales tanto en los cuerpos celulares neuronales como en las dendritas, con poca o ninguna evidencia de sinapsina-1 asociada directamente con GFAP + cuerpos celulares de astrocitos o procesos. Los analisis seriados cuantitativos de las secciones revelaron un aumento de 3,2 veces en la inmunodensidad de sinapsina-1 en la lamina IX de C6 de los grupos de neuronas motoras en las medulas tratadas con decorina en comparacion con las medulas de control sin tratar (Fig. 7).
Claims (15)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Una decorina o un fragmento funcional de la misma para su uso en un metodo de tratamiento de una afeccion neurologica traumatica del sistema nervioso central (SNC) en un paciente, en el que la decorina o fragmento funcional de la misma se administra en la cavidad intratecal del paciente sin administracion directa de la decorina o el fragmento funcional de la misma en los tejidos del sistema nervioso central.
- 2. La decorina o fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la decorina o fragmento funcional de la misma se administra en una parte de la cavidad intratecal que se selecciona de entre el grupo que consiste en la cisterna cerebellomedullaris (cisterna magna), la cavidad intratecal a nivel de la medula espinal cervical, toracica, lumbar y sacra, y la infusion en el lfquido cefalorraqmdeo (LCR) que rodea la cauda equina.
- 3. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que la decorina es la decorina humana, o un fragmento funcional de la misma.
- 4. La decorina o un fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, 2 o 3, en el que la decorina, o fragmento funcional de la misma, esta modificada qmmicamente.
- 5. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, 2, 3 o 4, en el que la afeccion neurologica traumatica se selecciona de entre el grupo que consiste en una lesion cerebral traumatica, una lesion de la medula espinal traumatica, ictus, smdrome de medula espinal anclada, e isquemia hipoxica global.
- 6. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la decorina, o el fragmento funcional de la misma, se administra aproximadamente a las 24 horas despues de producirse la afeccion neurologica traumatica.
- 7. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la decorina, o el fragmento funcional de la misma se empieza a administrar tras aproximadamente 1 mes despues de que se produzca la afeccion neurologica traumatica.
- 8. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que el uso comprende ademas que se administre un tratamiento adicional para la afeccion neurologica traumatica.
- 9. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8 ,en el que el tratamiento adicional que se administra para tratar una afeccion neurologica traumatica comprende agentes anti- inflamatorios, agentes reductores de la temperatura, inmovilizacion, terapias basadas en trasplante celular, terapias basadas en infusion celular, implante de biomateriales, infusion intratecal de nano-partmulas liberadoras de SLRP, terapias de ejercicio, terapias de rehabilitacion basadas en la estimulacion funcional electrica, intervenciones quirurgicas, terapias del SNC basadas en hipotermia inducida clmicamente e intervenciones basadas en terapia genetica.
- 10. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la decorina o el fragmento de la misma estabiliza la afeccion neurologica traumatica en el paciente.
- 11. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que se administra mediante una embolada de decorina, o el fragmento de la misma, al paciente.
- 12. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que se administra por suministro continuo de la decorina, o el fragmento de la misma, al paciente.
- 13. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la afeccion neurologica produce perdida de la funcion neurologica en el paciente y en el que el uso da como resultado la recuperacion de la funcion neurologica en el paciente.
- 14. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el uso da como resultado una mejona con un indicio, en comparacion con un control, que se selecciona de entre el grupo que consiste en un aumento de la extension y ramificacion del axon, un aumento de la extension de dendritas, ramificacion y formacion de espinas neuronales, promocion de la sinaptogenesis en el sistema nervioso central enfermo o lesionado, regulacion positiva de los niveles proteicos de plasminogeno, regulacion positiva de los niveles proteicos de plasmina, supresion de las acciones inhibidoras del crecimiento del axon por la cicatriz de glfa, supresion de la smtesis de inhibidores del crecimiento del axon asociados a la cicatriz de glfa, inhibidores del crecimiento del axon asociados a la materia gris y mielina, supresion de la inflamacion, supresion de astrogliosis, supresion de la smtesis aberrante de multiples proteoglicanos de sulfato de condroitina inhibidores del crecimiento del axon, supresion de la formacion de la cicatriz fibrotica, supresion de los niveles de cadenas laterales deglucosaminoglicano / centro proteico de multiples proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) inhibidores del crecimiento del axon y des-sensibilizacion de las neuronas a la influencia de moleculas inhibidoras del crecimiento del axon.5 15. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que ladecorina comprende un centro proteico de decorina humana.
- 16. La decorina o el fragmento funcional de la misma para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la decorina es un centro proteico de decorina humana.10
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