ES2582655T3 - Proteína linfopoyetina estromal tímica canina y usos de la misma - Google Patents

Proteína linfopoyetina estromal tímica canina y usos de la misma Download PDF

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Abstract

Una proteína linfopoyetina estromal tímica (TSLP), en donde dicha proteína TSLP comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 80 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, excluyendo la secuencia señal de 28 restos de aminoácidos; y en donde dicha proteína TSLP reacciona de forma cruzada con un anticuerpo inducido contra la TSLP canina que comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 2 o un fragmento antigénico del mismo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, o una combinación de dos o más de las mismas.

Description

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desnaturalizante, por ejemplo, CHS (colesteril hemisuccinato) o CHAPS (3[3 colamidopropil) dimetilamonio]1propano sulfonato), o una concentración suficientemente baja para evitar la alteración significativa de las propiedades estructurales o fisiológicas de la proteína. En otros casos, puede usarse un detergente duro para efectuar desnaturalización significativa.
Como alternativa, pueden aislarse proteínas heterólogas funcionales de E. coli u otras bacterias a partir de cuerpos de inclusión por medio de solubilización usando desnaturalizantes fuertes y replegamiento posterior. Los desnaturalizantes conocidos en la técnica incluyen, simplemente como ejemplo, urea, tiocianato de potasio, guanidina HCl (“GuHCl”), yodato potásico y/o yoduro sódico y combinaciones de estos. Preferentemente, se emplea GuHCl como un agente reductor, por ejemplo, de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 M de concentración, en condiciones alcalinas, por ejemplo, aproximadamente pH 8. Opcionalmente se emplea otro agente reductor, ditiotreitol (“DTT”), bien solo o bien en combinación con GuHCl. Cuando se emplea DTT, la concentración varía, simplemente como ejemplo, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 0,5 mM de DTT. Durante la etapa de solubilización, como se conoce bien en la técnica, un agente reductor debe estar presente para separar o desnaturalizar los enlaces disulfuro. Un tampón reductor a modo de ejemplo es: Tris 0,1 M pH 8,0, guanidina 6 M, EDTA 2 mM y DTE 0,3 M (ditioeritritol).
La renaturalización se consigue normalmente mediante dilución (por ejemplo, 100 veces) de la proteína desnaturalizada y reducida en un tampón de replegamiento, en presencia de un agente oxidante. Puede emplearse cualquier agente oxidante adecuado conocido en la técnica, siempre que permita el replegamiento correcto en buenos rendimientos. Por ejemplo, puede proporcionarse oxidación y replegamiento por reactivos de tiol de bajo peso molecular en forma reducida y oxidada, como se describe en Saxena, et al., 1970, Biochemistry 9: 50155021, incorporada por referencia en el presente documento, y especialmente como se describe en Buchner, et al., mencionado anteriormente. La renaturalización se consigue normalmente por dilución (por ejemplo, 100 veces) de la proteína desnaturalizada y reducida en un tampón de replegamiento. Un tampón de replegamiento a modo de ejemplo es: Tris HCl 100 mM, pH 10,0, EDTA 25 mM, NaCl 0,1 M, GSSG 551 mg/l, arginina 0,5 M. GSSG es la forma oxidada de glutatión.
El tamaño y la estructura del polipéptido deberían en general estar en un estado sustancialmente estable, y habitualmente no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede asociarse con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo, para conferir solubilidad, o asociarse con lípidos o detergentes.
Sustancialmente puro, por ejemplo, en un contexto de proteínas, normalmente significa que la proteína está libre de otras proteínas contaminantes, ácidos nucleicos u otros productos biológicos derivados del organismo fuente original. La pureza puede ensayarse mediante métodos convencionales, normalmente en peso, y habitualmente será al menos aproximadamente 40 % puro, generalmente al menos aproximadamente 50 % puro, con frecuencia al menos aproximadamente 60 % puro, normalmente al menos aproximadamente 80 % puro, preferentemente al menos aproximadamente 90 % puro y, en las realizaciones más preferidas, al menos aproximadamente 95 % puro. Se añadirán con frecuencia vehículos o excipientes. La pureza puede evaluarse por cromatografía, electroforesis en gel, inmunoensayo, análisis de composición, ensayo biológico y otros métodos conocidos en la técnica. Desde el punto de vista funcional, una proteína TSLP canina aislada de acuerdo con la invención es una suficientemente separada de otros materiales, incluyendo proteína TSLP precursora y/o proteína TSLP canina madura, para poder inducir una respuesta inmunitaria que sea específica para la proteína TSLP canina.
La solubilidad de un polipéptido o fragmento depende del ambiente y el polipéptido. Muchos parámetros afectan a la solubilidad del polipéptido, incluyendo temperatura, ambiente de electrolitos, tamaño y características moleculares del polipéptido y naturaleza del disolvente. Normalmente, la temperatura a la que se usa el polipéptido varía de aproximadamente 4 ºC a aproximadamente 65 ºC. Habitualmente la temperatura es mayor de aproximadamente 18 ºC. Para fines de diagnóstico, la temperatura será aproximadamente temperatura ambiente o más cálida, pero menor que la temperatura de desnaturalización de componentes en el ensayo. Para fines terapéuticos, la temperatura será habitualmente temperatura corporal, normalmente aproximadamente 36 ºC a 40 ºC (por ejemplo, aproximadamente 39 ºC para un perro) aunque en ciertas situaciones la temperatura puede elevarse o reducirse in situ o in vitro.
Como se usa en el presente documento la expresión “fragmento antigénico” con respecto a una proteína particular es un fragmento de esa proteína (incluyendo fragmentos grandes que carecen de tan poco como un único aminoácido de la proteína de longitud completa) que es antigénico, es decir, capaz de interaccionar específicamente con una molécula de reconocimiento de antígenos del sistema inmunitario, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o un receptor de antígeno de linfocitos T. Por ejemplo, un fragmento antigénico de la TSLP canina de la presente invención es un fragmento de la TSLP canina que es antigénico. No es necesario que dichos fragmentos sean en sí mismos inmunogénicos, es decir, capaces de inducir una respuesta inmunitaria sin un vehículo, siempre que puedan usarse para generar un anticuerpo para la proteína TSLP después de conjugar el fragmento con una molécula vehículo para inmunización. Preferentemente, sin embargo, un fragmento antigénico de la presente invención es inmunodominante para reconocimiento de anticuerpos y/o receptores de linfocitos T.
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Fase = 2
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5
SEQ ID NO: 106: TSLP humana SEQ ID NO: 107 >gi|36442813|gb|AACN011084208.1| secuencia aleatoria de genoma completo = 370 Canis familiaris ctg19866851499233, longitud de
10
Acierto 4
Puntuación = 38,9 bits (89), Expectativa = 0,047 Identidades = 15/32 (46 %), Positivos = 22/32 (68 %) Fase de lectura = +1
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SEQ ID NO: 108: TSLP humana SEQ ID NO: 109 >gi|36211043|gb|AACN010354273.1| secuencia aleatoria de genoma completo = 1369 Acierto 5 Canis familiaris ctg19866851087147, longitud de
25
Puntuación = 42,0 bits (97), Expectativa = 0,006 Identidades = 21/44 (47 %), Positivos = 27/44 (61 %) Fase de lectura = 2
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30
SEQ ID NO: 110: TSLP humana SEQ ID NO: x111 >gi|36211043|gb|AACN010354273.1| secuencia aleatoria de genoma completo = 1369 Canis familiaris ctg19866851087147, longitud de
Acierto 6
35
Puntuación = 38,9 bits (89), Expectativa = 0,047 Identidades = 15/32 (46 %), Positivos = 22/32 (68 %) Fase = +1
imagen17
40 SEQ ID NO: 112: TSLP humana SEQ ID NO: 113: >gi|36211043|gb|AACN010354273.1| Canis familiaris ctg19866851087147, longitud de secuencia aleatoria de genoma completo = 1369
Una comparación de esta secuencia construida electrónicamente con TSLP humana, de mono, de rata y de ratón
45 demostró los límites de intrón/exón conservados e identidad de secuencia sustancial, lo que conduce a la identificación de esta secuencia como parte del ortólogo canino de TSLP. Se diseñaron posteriormente cebadores de PCR basándose en este descubrimiento y se usaron para amplificar los segmentos ausentes del gen. Se obtuvieron dos clones parciales solapantes por PCR anidada doble a partir de una biblioteca de ADNc de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) activado canino. Los intentos adicionales de descubrir el ADNc de
50 TSLP canina completa por PCR anidada o intentando extender secuencias hacia los extremos 5’ o 3’ no tuvieron éxito. Sin embargo, los ciclos por iteraciones de búsquedas en base de datos usando la información de secuencia extendida a partir de estos clones en los datos de secuencias aleatorios de genoma completo canino (misma
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9 EVIYQALEKYMDGTR
16 56 EQVAHLIGLWRRFSR 63
10 IYQALEKYMDGTRST
17 57 VAHLIGLWRRFSRIS 64
11 QALEKYMDGTRSTEF
18 58 YNFIDCDFEKIRWKY 65
12 LEKYMDGTRSTEFSH
19 59 FIDCDFEKIRWKYQE 66
13 KYMDGTRSTEFSHPV
20 60 DCDFEKIRWKYQEVI 67
14 MDGTRSTEFSHPVYC
21 61 DFEKIRWKYQEVIYQ 68
15 GTRSTEFSHPVYCAN
22 62 EKIRWKYQEVIYQAL 69
16 RSTEFSHPVYCANPP
23 63 IRWKYQEVIYQALEK 70
17 TEFSHPVYCANPPDC
24 64 WKYQEVIYQALEKYM 71
18 FSHPVYCANPPDCLA
25 65 YQEVIYQALEKYMDG 72
19 HPVYCANPPDCLARI
26 66 EVIYQALEKYMDGTR 73
20 VYCANPPDCLARIER
27 67 IYQALEKYMDGTRST 74
21 CANPPDCLARIERLT
28 68 QALEKYMDGTRSTEF 75
22 NPPDCLARIERLTLH
29 69 LEKYMDGTRSTEFSH 76
23 PDCLARIERLTLHRI
30 70 KYMDGTRSTEFSHPV 77
24 CLARIERLTLHRIRG
31 71 MDGTRSTEFSHPVYC 78
25 ARIERLTLHRIRGCA
32 72 GTRSTEFSHPVYCAN 79
26 IERLTLHRIRGCASG
33 73 RSTEFSHPVYCANPP 80
27 RLTLHRIRGCASGAR
34 74 TEFSHPVYCANPPDC 81
28 TLHRIRGCASGAREA
35 75 FSHPVYCANPPDCLA 82
29 HRIRGCASGAREAFA
36 76 HPVYCANPPDCLARI 83
30 IRGCASGAREAFAEG
37 77 VYCANPPDCLARIER 84
31 GCASGAREAFAEGTV
38 78 CANPPDCLARIERLT 85
32 ASGAREAFAEGTVAA
39 79 NPPDCLARIERLTLH 86
33 GAREAFAEGTVAALA
40 80 PDCLARIERLTLHRI 87
34 REAFAEGTVAALAAE
41 81 CLARIERLTLHRIRG 88
35 AFAEGTVAALAAECP
42 82 ARIERLTLHRIRGCA 89
36 AEGTVAALAAECPGY
43 83 IERLTLHRIRGCASG 90
37 GTVAALAAECPGYAA
44 84 RLTLHRIRGCASGAR 91
38 VAALAAECPGYAAAP
45 85 TLHRIRGCASGAREA 92
39 ALAAECPGYAAAPIN
46 86 HRIRGCASGAREAFA 93
40 AAECPGYAAAPINNT
47 87 IRGCASGAREAFAEG 94
41 ECPGYAAAPINNTQA
48 88 GCASGAREAFAEGTV 95
42 PGYAAAPINNTQAKK
49 89 ASGAREAFAEGTVAA 96
43 YAAAPINNTQAKKKR
50 90 GAREAFAEGTVAALA 97
44 AAPINNTQAKKKRKK
51 91 REAFAEGTVAALAAE 98
45 PINNTQAKKKRKKRG
52 92 AFAEGTVAALAAECP 99
46 NNTQAKKKRKKRGVT
53 93 AEGTVAALAAECPGY 100
25

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  1. imagen1
ES07867705.1T 2006-12-14 2007-12-11 Proteína linfopoyetina estromal tímica canina y usos de la misma Active ES2582655T3 (es)

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US875135P 2006-12-14
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