ES2582802T3 - Uso de lisozima como marcador - Google Patents
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Abstract
Un método para la producción de un polipéptido o proteína monómero aislado, comprendiendo dicho método los pasos de (a) expresión de dicho polipéptido o proteína monómero como proteína de fusión en una célula hospedadora, en donde dicha proteína de fusión comprende dicho polipéptido o proteína monómero y lisozima y (b) aislamiento de dicha proteína de fusión, En donde dicho polipéptido o proteína monómero tiene una longitud de al menos 110 aminoácidos.
Description
de adquirir una configuración de estructura tridimensional definida por la formación de estructuras secundarias, terciarias, o cuaternarias dentro de y/o entre su o sus cadenas polipeptídicas. Las proteínas pueden ser monómeras (compuestas de una sola cadena polipeptídica) o multímeras (compuestas de dos o más cadenas polipeptídicas).
5 El término "célula hospedadora", como se utiliza en esta memoria, puede ser cualquiera de cierto número de células utilizadas comúnmente en la producción de polipéptidos o proteínas exógenos, con inclusión de células hospedadoras eucariotas y procariotas. Células hospedadoras preferidas de la presente invención son células hospedadoras eucariotas, tales como células de hongos, células de levadura, células de plantas, células de insecto
o células de mamífero. Son muy preferidas las células hospedadoras de mamífero. En otras realizaciones preferidas adicionales, dicha célula hospedadora de mamífero se selecciona de una célula CHO (European Collection of Cell Culture; ECACC #85050302), una célula PER.C6 (Crucell, Leiden, Países Bajos), una célula HKB11 (Bayer Health-Care, Berkley/CA, USA) y una célula HEK293 (American Type Culture Collection; Order no. CRL-1573).
15 refiere a condiciones que conducen a la expresión de un polipéptido dado. La selección intencionada de las condiciones de la célula hospedadora hace posible la activación (o la desactivación) de la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Típicamente, dicho cambio de condiciones se lleva a cabo por la adición de un producto químico o un compuesto existente naturalmente, un "inductor", al medio de crecimiento de la célula hospedadora. Dependiendo del promotor específico utilizado, la naturaleza del inductor varía. Otros cambios de condiciones que pueden conducir a la expresión de polipéptidos son un aumento de temperatura o una exposición a la luz o UV.
El término "lisozima", como se utiliza en esta memoria, incluye todas las lisozimas existentes naturalmente, tales como lisozima de clara de huevo de gallina, lisozimas sintéticas y lisozimas recombinantes, tales como lisozima
25 recombinante humana, así como sales de lisozima. En una realización preferida, la lisozima es lisozima de pollo (SEQ ID NO: 1). En una realización, el término "lisozima" se refiere a lisozima procedente de microorganismos tales como algas, archea, bacterias, levaduras, hongos filamentosos, o protozoos. En una realización, el término "lisozima" se refiere a lisozima de mamíferos, aves, reptiles y anfibios. En una realización, el término "lisozima" se refiere a lisozima de ratón (SEQ ID NO: 2), conejo (SEQ ID NO: 3), cabra (SEQ ID NO: 4), humana (SEQ ID NO: 5), de vaca (SEQ ID NO: 6), de rata (SEQ ID NO: 7) o de cinomolgus (SEQ ID NO: 8).
En una realización preferida, la lisozima utilizada en la presente descripción comparte al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100 de identidad con la secuencia de aminoácidos de la lisozima que es expresada
35 por un organismo existente naturalmente.
El término "variante" se define en esta memoria como un polipéptido que comprende una alteración, tal como una sustitución, inserción, y/o deleción, de uno o más (varios) residuos de aminoácido en una o más (varias) posiciones específicas. El polipéptido alterado (variante) puede obtenerse por intervención humana mediante modificación de la secuencia de polinucleótidos que codifica la lisozima parental. La lisozima parental puede estar codificada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o una secuencia que es al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98 % o al menos 99% idéntica a una de estas secuencias. La secuencia de polipéptido variante es preferiblemente una que no se encuentra en la naturaleza. La presente invención se refiere a variantes de lisozima, que comprenden una alteración,
45 preferiblemente en la forma de una sustitución y/o una inserción y/o una deleción en una o más posiciones (varias).
El término "aislado(a)", como se utiliza en esta memoria, se refiere a un polipéptido o proteína o variantes de los mismos que se aísla de una fuente, v.g. la célula hospedadora a partir de la cual se expresa. Preferiblemente, el polipéptido tiene una pureza de al menos 40%, tal como una pureza de al menos 60%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95%, como se determina por SDS-PAGE.
El término "proteína de fusión" se refiere a una sola cadena de polipéptido que tiene al menos dos dominios polipeptídicos que no están presentes normalmente en un polipéptido natural simple. Así, las proteínas existentes naturalmente no son "proteínas de fusión", como se utiliza en esta memoria. Preferiblemente, un polipéptido de
55 interés está fusionado con al menos un dominio polipeptídico por un enlace peptídico y la proteína de fusión puede incluir también las realizaciones enlazadoras de aminoácidos entre porciones de aminoácidos derivadas de proteínas separadas. El dominio polipeptídico fusionado al polipéptido de interés puede aumentar la solubilidad y/o expresión del polipéptido de interés y puede proporcionar también un marcador de purificación para permitir la purificación de la proteína de fusión recombinante de la célula hospedadora o sobrenadante de cultivo, o ambos. El dominio polipeptídico fusionado al polipéptido de interés puede fusionarse en el término N o en el término C del polipéptido de interés.
El término "recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia, separados en caso contrario, v.g., por síntesis química o por la manipulación de segmentos aislados de aminoácidos o de ácidos
65 nucleicos por técnicas de ingeniería genética.
8
El término "expresión", como se utiliza en esta memoria, se refiere a la producción de un producto final funcional (v.g., un mRNA o una proteína (precursora o madura).
5 El término "vector" tiene por objeto hacer referencia a una molécula de polinucleótido capaz de transportar otro polinucleótido al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de DNA bicatenario circular en el cual pueden insertarse segmentos de DNA adicionales. Además, la secuencia codificante del gen de interés puede transcribirse a partir de ciertos vectores por la maquinaria de transcripción celular y traducirse ulteriormente en la proteína de interés. A tales vectores se hace referencia en esta memoria como "vectores de
10 expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de DNA recombinante se encuentran a menudo en forma de plásmido. En la presente descripción, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente, dado que el plásmido es la forma de vector utilizada más comúnmente. Sin embargo, la descripción tiene por objeto incluir tales otras formas de vector de expresión, tales como vectores virales (v.g., retrovirus deficientes en replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), que desempeñan funciones equivalentes.
15 El término "monómero", y sus equivalentes gramaticales, como se utilizan en esta memoria, se refieren a un polipéptido o proteína que está constituido una sola cadena de polipéptido. Los polipéptidos o proteínas monómeros de la presente invención no están asociados covalentemente ni de manera no covalente con o unidos a otro polipéptido o proteína.
20 El término "marcador" se utiliza en esta memoria y se refiere a una secuencia de péptido o polipéptido que puede unirse a un segundo polipéptido. Preferiblemente, un marcador es un marcador de purificación o un marcador de expresión, o ambas cosas.
25 El término "marcador de purificación", como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier secuencia peptídica adecuada para purificación o identificación de un polipéptido. El marcador de purificación se fija específicamente a otro resto con afinidad para el marcador de purificación. Tales restos que se fijan específicamente a un marcador de purificación están unidos usualmente a una matriz o una resina, tal como cuentas de agarosa. Restos que se fijan específicamente a marcadores de purificación incluyen anticuerpos, otras proteínas (v.g. Proteína A o
30 Estreptavidina), iones níquel o cobalto o resinas, biotina, amilosa, maltosa, y ciclodextrina. Marcadores de purificación ilustrativos incluyen marcadores histidina (HIS) (tales como un péptido hexahistidina), que se fijan a iones metálicos tales como los iones níquel o cobalto. Otros marcadores de purificación ilustrativos son el marcador myc (EQKLISEEDL), el marcador Strep (WSHPQFEK), el marcador Flag (DYKDDDDK) y el marcador V5 (GKPIPNPLLGLDST). El término "marcador de purificación" incluye también "marcadores epitópicos", es decir
35 secuencias peptídicas que son reconocidas específicamente por anticuerpos. Marcadores epitópicos ilustrativos incluyen el marcador FLAG, que es reconocido específicamente por un anticuerpo monoclonal anti-FLAG. La secuencia peptídica reconocida por el anticuerpo anti-FLAG está constituida por la secuencia DYKDDDDK o una variante sustancialmente idéntica de la misma. El término "marcador de purificación" incluye también variantes sustancialmente idénticas de marcadores de purificación. "Variante físicamente idéntica" como se utiliza en esta
40 memoria, se refiere a derivados o fragmentos de marcadores de purificación que están modificados en comparación con el marcador de purificación original (v.g. por sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos), pero que retienen la propiedad del marcador de purificación de fijarse específicamente a un resto que reconoce específicamente el marcador de purificación.
45 El término "marcador de expresión" como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier péptido o polipéptido que puede estar unido a un segundo polipéptido y se supone que refuerza la solubilidad, estabilidad y/o expresión de un polipéptido recombinante de interés. Marcadores de expresión ilustrativos incluyen el marcador Fc y el marcador SUMO. En principio, puede utilizarse como marcador de expresión cualquier péptido, polipéptido o proteína.
50 El término "anticuerpo", como se utiliza en esta memoria, incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento o cadena simple del mismo. Un "anticuerpo" existente naturalmente es una proteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. En una realización preferida, el anticuerpo descrito en la solicitud es un "anticuerpo monoclonal". El término "anticuerpo monoclonal", como se
55 utiliza en esta memoria, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular simple. Una composición de anticuerpo monoclonal exhibe un solo sitio de fijación que tiene especificidad de fijación y afinidad singulares para epítopos particulares.
El término "transfección" como se utiliza en esta memoria, se refiere a una gran diversidad de técnicas utilizadas
60 comúnmente para la introducción de DNA exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, v.g., electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano, y análogos. La célula hospedadora puede ser "transfectada" con el vector de la presente invención por cualquier medio convencional conocido por el profesional experto. Por ejemplo, la transfección puede ser una transfección transitoria. Para ello, en ciertas realizaciones de la presente invención, dicho gen codificante de dicha proteína de fusión que comprende el
9
polipéptido o proteína de interés y lisozima se introduce en dicha célula hospedadora eucariota por transfección transitoria.
El término "% de identidad", como se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, se
5 calcula como sigue. La secuencia de consulta se alinea con la secuencia diana utilizando el algoritmo CLUSTALW (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). Se hace una comparación a lo largo de la ventana correspondiente a la más corta de las secuencias alineadas. Se comparan los residuos de aminoácido en dicha posición, y el porcentaje de posiciones en la secuencia de consulta que tienen correspondencias idénticas en la secuencia diana se consigna como % de identidad.
10
- Secuencia de Lisozima
- Secuencia
- #/ Especie
-
imagen7
- SEQ ID NO:1
- Pollo (Gallus Gallus)
-
imagen8
- SEQ ID NO:2
- Ratón (Mus Musculus)
-
imagen9
- SEQ ID NO:3 Conejo (Oryctolagus cuniculus)
-
imagen10
- SEQ ID NO:4
- Cabra (Capra hircus)
-
imagen11
- SEQ ID NO:5
- Humana (Homo sapiens)
-
imagen12
- SEQ ID NO:6
- Vaca (Bos taurus)
-
imagen13
- SEQ ID NO:7
- Rata (Rattus norvegicus)
-
imagen14
- SEQ ID NO:8 Cinomolgus (Macaca fascicularis)
-
imagen15
Todos los reactivos están disponibles comercialmente y se adquieren de, v.g., Sigma-Aldrich, Sartorius, TTP, GE 15 Healthcare, etc. y son reactivos estándar utilizados en un laboratorio de biología molecular.
A no ser que se indique otra cosa, la clonación molecular se llevó a cabo utilizando protocolos estándar, como se describe esencialmente en Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 Vol.; Cold Spring Harbor Laboratory (diciembre de 2000). La expresión y purificación se realizaron conforme a procedimientos estándar como
20 se describe en Current Protocols in Protein Science (Wiley Interscience).
Ejemplo 1: Generación de un vector adecuado para uso en los métodos de la presente invención
Para realizar la presente invención se utilizaron vectores de expresión eucariotas, v.g. un vector estándar pcDNA 3.1 25 (Invitrogen) o un vector de expresión pMAX (Figura 1, Figura 2), que es un vector de expresión modificado basado en pcDNA 3.1. El vector de expresión pMAX comprende v.g. un origen de replicación, resistencia a los antibióticos y
10
cantidades significativamente mayores en comparación con la purificación por la vía de IMAC. Adicionalmente, no era detectable agregación alguna de la proteína purificada.
- Constructo
- Expresión Purificación Rendimiento [mg/L] Agregados 2[%]
- pMAX_Proteína 1_His
- 200 ml transitoria IMAC 0 n.d.
- pMAX_Proteína 1_Lys
- 200 ml transitoria Lys (MOR3207) 2,0 0
En las Tablas 2 y 3 se ejemplifican proteínas adicionales que no podían expresarse utilizando una combinación de marcador Fc o marcador His. Sin embargo, la fusión con lisozima permitía la expresión y purificación de ambas proteínas. Proteína 2 y Proteína 3. Para Proteína 2, se consiguió un aumento de rendimiento después de purificación
10 desde 0,3 mg/L a 4,0 mg/L por fusión de lisozima a Proteína 2. Adicionalmente, el nivel de agregaciones era inferior a 7% de las proteínas de fusión purificadas.
- Constructo
- Expresión Purificación Rendimiento [mg/L] Agregados [%]
- pMAX_Proteína 2_Fc-Avi_His
- 600 ml transitoria IMAC 0,3 n.d.
- pMAX_Proteína 2 Avi-His
- 600 ml transitoria IMAC 0 n.d.
- pMAX_Proteína 2_Lys-Avi
- 200 ml transitoria Lys (MOR3207) 4,0 3,44%
Tabla 3: Expresión y purificación de Proteína 3 fusionada a un marcador Fc, His o lisozima. La Proteína 3tiene un tamaño de 257 aminoácidos
- Constructo
- Expresión Purificación Rendimiento [mg/L] Agregados [%]
- pMAX_Proteína 3_Fc_His
- 200 ml transitoria IMAC 0 n.d.
- pMAX_Proteína 3_His
- 200 ml transitoria IMAC 0 n.d.
- pMAX_Proteína 3-Lys-His
- 200 ml transitoria Lys (MOR3207) 0,4 6,6
- pMAX_Proteína 3_Lys-Avi
- 200 ml transitoria Lys (MOR3207) 0,1 2
3.2 Las proteínas de fusión de lisozima exhiben menos agregación
20 Las proteínas analizadas 4, 5 y 6 no sólo mostraban tasas de expresión aumentadas sino también menos agregación si se expresaban como proteína de fusión con lisozima. La expresión de la proteína 4 aumentaba más de tres veces y la agregación se reducía más de tres veces si la proteína se marcaba con lisozima en lugar de His (Tabla 4).
25
- Constructo
- Expresión Purificación Rendimiento [mg/L] Agregados [%]
- pMAX_Proteína 4_His
- 200 ml transitoria IMAC 3,4 7
- pMAX_Proteína 4_Lys-Avi
- 200 ml transitoria Lys (MOR3207) 13 2
Se observaron resultados similares con las proteínas 5 (Tabla 5) y 6 (Tabla 6) cuando se comparó el marcador 30 lisozima con el marcador GST.
- Constructo
- Expresión Purificación Rendimiento [mg/L] Agregados [%]
- pMAX_Proteína 5_GST_His
- 200 ml transitoria IMAC 3,8 13,4
- pMAX_Proteína 5_Lys-Avi
- 200 ml transitoria Lys (MOR3207) 10,4 5,7
12
<210> 8
< 211> 91 5 < 212> PRT
< 213> Macaca fascicularis
<220>
- <
- 221> FUENTE
- <
- 222> 1..91
10 < 223> /tipo de molécula = "proteína" /nota="Lisozima de Cinomolgus" /organismo="Macaca fascicularis"
<400> 8
<210> 9 20 < 211> 6
- <
- 212> PRT
- <
- 213> constructo sintético
<220>
< 221> FUENTE 25 < 222> 1..6
< 223> /tipo de molécula = "proteína" /nota="MOR3207 HCDR1" /organismo="constructo sintético"
18
23
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-
imagen1
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