ES2583641T3

ES2583641T3 - Composición que comprende el extracto de una combinación de hierbas para la prevención o el tratamiento de la neuropatía periférica diabética

Info

Publication number: ES2583641T3
Application number: ES11860864.5T
Authority: ES
Inventors: Soon-Hoe Kim; Mi-Won Son; Sang-Zin Choi; Hye-Ju Kim; Ja-Young RYU; Sun-Yeou Kim
Original assignee: Dong A ST Co Ltd; Dong-A ST Co Ltd
Current assignee: Dong A ST Co Ltd; Dong-A ST Co Ltd
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2016-09-21
Anticipated expiration: 2031-12-29
Also published as: US10398747B2; EP2685997A2; US20170209515A1; KR20120106914A; PL2685997T3; WO2012124888A3; US10813973B2; JP2014508189A; RU2566721C2; HUE029291T2; CN103619346B; EP2685997A4; KR101341692B1; PT2685997T; CN103619346A; JP5763224B2; US20180318377A1; US20140017345A1; US20210113648A1; EP2685997B1

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de la neuropatía periférica diabética, que comprende un extracto de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1 (p/p) como un principio activo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que Dioscorea Rhizoma es un rizoma fresco de Dioscorea batatas Decaisne o Dioscorea japonica Thunberg, o un rizoma fresco de Dioscorea batatas Decaisne o Dioscorea japonica Thunberg que se ha cocido al vapor y se ha secado.

Description

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DESCRIPCION

Composicion que comprende el extracto de una combinacion de hierbas para la prevencion o el tratamiento de la neuropatia periferica diabetica

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a una composicion para la profilaxis y el tratamiento de la neuropatfa periferica diabetica, que comprende un extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma.Dioscorea nipponica a 3,5:1 (p/p).

Reconocimiento

La presente obra recibio el apoyo del Programa de Tecnologfa Lfder Global de la Oficina de Planificacion Estrategica de I + D (OSP), financiada por el Ministerio de Econoirna del Conocimiento, Republica de Corea. (n.° 10039303).

Antecedentes de la tecnica

La frecuencia de la diabetes mellitus esta aumentando rapidamente en todo el mundo. La Organizacion Mundial de la Salud estima que aproximadamente 180 millones de personas padecen diabetes mellitus desde 2008, con la perspectiva de que el numero de diabeticos se duplique para el ano 2030. Por consiguiente, los costos financieros y sociales asociados con la diabetes han aumentado, y se ha producido un aumento de la mortalidad por las complicaciones de la diabetes. Sin embargo, es posible retardar el comienzo o la progresion de la diabetes mediante el tratamiento riguroso del nivel de azucar en sangre, por lo que es importante mantener la euglucemia con una modificacion del estilo de vida y un tratamiento adecuado.

La diabetes mellitus es la principal causa conocida de neuropatfa en los pafses desarrollados. La neuropatfa periferica diabetica es la expresion que se usa para describir los smtomas de acuerdo con la disfuncion inducida por la diabetes del sistema nervioso periferico. Es la complicacion mas comun a la que se enfrentan los diabeticos.

La neuropatfa periferica diabetica deteriora la calidad de vida de los pacientes con diabetes, y es la mayor fuente de mortalidad de los pacientes. La frecuencia de la neuropatfa periferica diabetica en pacientes con diabetes aumenta con la edad del paciente y la duracion de la diabetes. La neuropatfa periferica diabetica se presenta en los pacientes con diabetes tanto de tipo 1 como de tipo 2, con mayor frecuencia en los pacientes con diabetes de tipo 2 (32,1 %) que en los pacientes con diabetes de tipo 1 (22,7 %) (“Primary Care Diabetes”, Volumen 1, numero 3, septiembre de 2007, paginas 129-134; “Diagnosis of diabetic peripheral neuropathy among patients with type 1 and type 2 diabetes in France, Italy, Spain, and the United Kingdom”).

Aproximadamente el 10 % de los pacientes con diabetes se quejan de dolor constante, que puede ser espontaneo o puede ser inducido por estfmulos. El dolor puede empeorar y convertirse incurable. El dolor neuropatico periferico diabetico normalmente se agrava por la noche, y se describe principalmente como una sensacion de quemazon, dolor punzante, molestias, sensacion de malestar, y similares. Ademas, el dolor neuropatico periferico diabetico se siente con mayor frecuencia en las piernas que en las manos. A menudo, el dolor grave puede conducir a la perdida de peso o a la depresion (“Pain Medicine”, Volumen 8, numero S2 2007, “Diabetic Peripheral Neuropathic Pain: Recognition and Management”).

La neuropatfa periferica diabetica se diagnostica mediante una prueba de fuerza muscular, y mediante la medicion de la sensacion tactil, la sensacion de temperatura, la sensacion vibratoria, el caudal sangumeo de la piel periferica y la conduccion nerviosa. La neuropatfa periferica diabetica actualmente se trata mediante el control del nivel de azucar en sangre, el tratamiento etiologico y el tratamiento sintomatico. Dado que la correlacion entre la hiperglucemia y la progresion de la neuropatfa esta bien establecida y se ha puesto de manifiesto por muchos estudios que definen las altas tasas de frecuencia de la neuropatfa periferica diabetica en pacientes con diabetes que no han mantenido sus niveles de azucar en sangre bajo control, el control del azucar en sangre se reconoce como una metodo primario de prevencion/tratamiento de la neuropatfa periferica diabetica (N Engl J Med 1993;329:977-86, “The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus”).

Entre los agentes terapeuticos etiologicos de la neuropatfa diabetica son representativos el acido alfa-lipoico, los inhibidores de la aldosa reductasa y el acido gamma linoleico. El acido a-lipoico (acido tioctico), un antioxidante, reduce el estres oxidativo inducido por la hiperglucemia que conduce a la muerte de las celulas nerviosas, bloqueando de este modo la etiologfa de la neuropatfa diabetica. Funcionando para evitar que la glucosa entre en la via de los polioles de las celulas nerviosas, los inhibidores de la aldosa reductasa pueden suprimir la acumulacion de sorbitol, que conduce a un dano de las celulas nerviosas, para bloquear la progresion de la neuropatfa diabetica. Sin embargo, el desarrollo de la mayona de ellos se detuvo a medio camino debido a los efectos secundarios y a la eficacia insuficiente. Actualmente, solo se utiliza Epalrestat en Japon. El acido Y-linolenico, que es tanto un componente de los fosfolfpidos de la membrana nerviosa como un componente de la prostaglandina E, que

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desempena un papel importante en la homeostasis del flujo sangumeo en las celulas nerviosas, ha resultado mejorar algunos smtomas de la neuropatia diabetica (BMJ. 14 de julio de 2007; 335(7610):87. Epub 11 de junio de 2007, “Review. Effects of treatments for symptoms of painful diabetic neuropathy: systematic review”).

Los agentes terapeuticos sintomaticos para aliviar el dolor de la neuropatfa diabetica incluyen antidepresivos tridclicos, anticonvulsivos, inhibidores selectivos de la recaptacion de serotonina y capsaicina topica. Los antidepresivos tridclicos (ATC) actuan para inhibir la recaptacion de la serotonina y la norepinefrina en el sistema nervioso central para bloquear la transmision del dolor, asf como para aumentar el nivel de endorfina endogena para aliviar el dolor. Los anticonvulsivos y los inhibidores selectivos de la recaptacion de serotonina se usan como alternativas para los pacientes que son incompatibles con los ATC. La capsaicina topica, conocida por su utilidad para la disestesia dolorosa, provoca la liberacion del neuropeptido, la sustancia P de fibras nociceptivas de tipo C, y suprime la reposicion de la sustancia P para interrumpir con la conduccion y la propagacion de las senales perifericas del dolor, lo que resulta en una reduccion del dolor.

Sin embargo, es diffcil encontrar terapias que traten adecuadamente a los pacientes con neuropatfa periferica diabetica, porque hay una gran versatilidad de etiologfas y smtomas. En la practica, se da preferencia al tratamiento sintomatico para aliviar el dolor y suprimir la progresion de la neuropatfa periferica diabetica frente al tratamiento etiologico. Por lo tanto, hay una creciente necesidad de una terapia que pueda curar la neuropatfa periferica diabetica mediante la regeneracion de los nervios afectados por la diabetes. El factor de crecimiento nervioso, que funciona para facilitar la regeneracion de las neuronas, esta surgiendo como un potente candidato para la terapia de la neuropatfa periferica diabetica.

Muchos estudios anteriores indican que se reducen tanto la biosmtesis del factor de crecimiento nervioso como el transporte retrogrado en las neuronas de sujetos con diabetes, y por ello, se consideran una etiologfa de la neuropatfa periferica diabetica. En las personas sanas, el NGF se produce en los queratinocitos dermicos e interactua con el receptor trkA. Por otro lado, se observa un bajo nivel de NGF en los queratinocitos dermicos de los pacientes diabeticos, lo que se sabe que esta asociado con la descompensacion de las fibras nerviosas sensoriales (Diabetes Obes Metab. Febrero de 2008; 10(2):99-108. Epub 26 de junio de 2007, “Review. Diabetic neuropathy: new strategies for treatment”).

Estudios anteriores han demostrado que la administracion de NGF provoco una reduccion del dolor y de los smtomas de los animales inducidos con neuropatfa periferica diabetica. Basandose en estos resultados, tambien se han realizado ensayos clmicos en pacientes con neuropatfa diabetica. En un ensayo clmico aleatorizado y controlado con placebo de fase 2, se aliviaron los smtomas y el dolor de los pacientes con neuropatfa periferica diabetica tras recibir NGF humano recombinante tres veces/semana durante 6 meses. Sin embargo, se realizo un ensayo clmico aleatorizado, controlado con placebo, de fase 3 durante 48 semanas, que no fue significativamente eficaz debido al dolor en el sitio de inyeccion y a efectos farmaceuticos irrelevantes. Asf pues, los estudios posteriores se han dirigido a potenciar la biosmtesis del NGF endogeno en lugar de suministrar NGF externo (Am J Med. 30 de agosto de 1999;107(2B):345-42S, “Review. Neurotrophic factors in the therapy of diabetic neuropathy”).

La Dioscorea Rhizoma, una planta que pertenece a Dioscoreaceae, es la expresion para el rizoma fresco de Dioscorea batatas Decaisne o Dioscorea japonica Thunberg, vado de peridermis, o para el que se obtiene tras cocer el rizoma fresco al vapor y secarlo en la medicina a base de hierbas. La planta contiene la saponina dioscina de tipo esterol y alantoma.

Dioscorea nipponica, un rizoma de la planta perenne trepadora Dioscorea nipponica Makino, contiene diversas saponinas de tipo esterol, incluyendo dioscina, prosapogeno A y prosapogeno C.

En la medicina a base de hierbas, estas hierbas se han usado solas o en combinacion con otras hierbas. En ninguna parte de los documentos anteriores se ha informado de la eficacia medicinal de un extracto de una combinacion de estas dos hierbas en la neuropatfa periferica diabetica.

La patente coreana n.° 854621 proporciona una composicion para la prevencion y el tratamiento de la neuropatfa periferica, que comprende un extracto de una planta seleccionada entre Dioscorea nipponica, Dioscorea quinqueoloba, Dioscorea batatas, Dioscorea japonica y Dioscorea tokora, que desvela que la composicion induce el crecimiento de las neuritas y aumenta la secrecion del factor de crecimiento nervioso endogeno, siendo asf eficaz para la prevencion y el tratamiento de la neuropatfa periferica.

Los presentes inventores confirmaron que la funcion del extracto de una planta seleccionada entre Dioscorea nipponica, Dioscorea quinqueoloba, Dioscorea batatas, Dioscorea japonica y Dioscorea tokora era inducir el crecimiento significativo de las neuritas y aumentar la secrecion de NGF endogeno segun lo desvelado en la patente coreana n.° 854621. Sorprendentemente, los presentes inventores encontraron a traves de experimentos con modelos animales que un extracto de una mezcla de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica, en una proporcion espedfica, garantiza efectos terapeuticamente sinergicos sobre la neuropatfa periferica diabetica, elevando el nivel de NGF in vivo, por ejemplo, en el plasma y en la glandula salival, en un grado muy significativo, y aliviando el dolor inducido por la neuropatfa diabetica altamente sensible a los estfmulos termicos y mecanicos, mientras que los

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extractos de cada una o una combinacion de estas hierbas tienen casi los mismos efectos en terminos del crecimiento de neuritas y de la secrecion del factor de crecimiento nervioso endogeno, lo que culmino en la presente invencion.

Divulgacion de la invencion Problema tecnico

Es un objeto de la presente invencion proporcionar una composicion a base de hierbas, derivada de las hierbas desveladas en la patente coreana n.° 854621, que presenta la actividad de elevar significativamente in vivo el nivel de factor de crecimiento nervioso (NGF) terapeuticamente eficaz para la neuropatia periferica diabetica.

Es otro objeto de la presente invencion proporcionar una composicion farmaceutica y un alimento funcional para la salud para la profilaxis y el tratamiento de la neuropatfa periferica diabetica, que comprende la composicion a base de hierbas.

Solucion al problema

Los objetos de la presente invencion pueden llevarse a cabo mediante una disposicion de una composicion farmaceutica y un alimento funcional para la salud que comprende un extracto de hierbas fabricado a partir de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p) util para prevenir y tratar la neuropatfa periferica diabetica.

De acuerdo con un aspecto de la misma, la presente invencion proporciona un extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica. Mas particularmente, el extracto de hierbas proporcionado por la presente invencion se obtiene a partir de una mezcla que contiene Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica en una proporcion en peso de 3,5:1 (p/p).

El extracto de hierbas de acuerdo con la presente invencion se puede preparar a partir de una mezcla de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica secos mediante precipitacion en fno en etanol al 50 % a temperatura ambiente durante 48 horas, seguido de la concentracion al vado. En detalle, se lavan Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica, se secan, se cortan y se mezclan a una proporcion en peso de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica de 3,5:1, y se precipita en fno la mezcla de hierbas una vez en 5 pesos de etanol al 50 % a temperatura ambiente durante 48 horas, seguido de la concentracion del extracto a presion reducida.

De acuerdo con otro aspecto de la misma, la presente invencion proporciona una composicion para la profilaxis y el tratamiento de la neuropatfa periferica diabetica, que comprende un extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p) como principio activo en combinacion con un vehnculo, diluyentes o excipiente farmaceuticamente aceptables.

La composicion de acuerdo con la presente invencion contiene el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p) en una cantidad del 0,01 al 80% en peso basado en el peso total de la composicion, y preferentemente en una cantidad del 1 al 50 % en peso.

Debe ser evidente para los expertos en la materia que los smtomas de la neuropatfa diabetica incluyen la perdida de sensibilidad, tal como la sensacion tactil, la sensacion vibratoria, la sensacion de temperatura, etc., y el dolor, tal como sensacion de quemazon, dolores punzantes, molestias, sensacion de malestar, y similares.

La composicion a base de un extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p) de acuerdo con la presente invencion puede comprender ademas un vehnculo, excipiente o diluyente.

Los ejemplos del vehnculo, excipiente o diluyentes utiles en la composicion de la presente invencion incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidon, goma arabiga, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio y aceite mineral.

La composicion de la presente invencion se puede formular en formas de dosificacion orales tales como polvos, granulos, comprimidos, capsulas, suspensiones, emulsiones, jarabes, aerosol, etc., agentes topicos, supositorios o soluciones para inyeccion esteriles. La composicion farmaceutica de la presente invencion se puede formular en combinacion con un diluyente o excipiente, tal como una carga, un agente espesante, un aglutinante, un agente humectante, un disgregante, un tensioactivo, etc. Los preparados solidos destinados a la administracion oral pueden adoptar la forma de comprimidos, pfldoras, polvos, granulos, capsulas y similares. En lo que respecta a estos agentes solidos, el extracto de hierbas combinado de la presente invencion se formula en combinacion con al menos un excipiente tal como almidon, carbonato de calcio, sacarosa, lactosa o gelatina. Ademas de dichos excipientes simples, se pueden usar lubricantes tales como estearato de magnesio y talco. Los preparados lfquidos destinados a la administracion oral incluyen suspensiones, soluciones de uso interno, emulsiones, jarabes y similares. Ademas de

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un diluyente simple tal como agua o aceite de parafina, diversos excipientes tales como agentes humectantes, agentes edulcorantes, compuestos aromaticos, conservantes y similares pueden estar contenidos en los preparados Kquidos. Ademas, la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede administrar por una via no oral. Para ello, se pueden usar soluciones acuosas esteriles, disolventes no acuosos, suspensiones, emulsiones, liofilizados, supositorios y similares. El propilenglicol inyectable, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres tales como oleato de etilo pueden ser adecuados para los disolventes no acuosos y las suspensiones. Los materiales basicos de supositorios incluyen Witepsol, macrogol, Tween 61, manteca de cacao, manteca de laurina y glicerogelatina.

De acuerdo con un aspecto adicional de la misma, la presente invencion proporciona el uso de extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p) en la preparacion de un agente terapeutico para la neuropatfa periferica diabetica.

De acuerdo con otro aspecto adicional de la misma, la presente invencion proporciona un metodo de tratamiento de la neuropatfa diabetica, que comprende administrar una composicion farmaceutica en una cantidad terapeuticamente eficaz a un mamffero que la necesita, comprendiendo dicha composicion farmaceutica un extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p).

La dosis de la composicion farmaceutica que comprende un extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p) puede variar dependiendo de varios factores incluyendo la edad, el sexo, el peso y el estado de salud de los pacientes, la dieta, el tiempo de administracion, la via de administracion, la tasa de excrecion y similares. Por lo general, la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede administrar en una sola dosis o en multiples dosis al dfa, a una dosis diaria que vana de 0,01 a 10 g/kg y preferentemente de 1 a 5 g/kg. Sin embargo, los expertos en la materia han de entender que, de ningun modo, la dosis limita la presente invencion.

La composicion farmaceutica que comprende un extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p) de acuerdo con la presente invencion se puede administrar por diversas vfas a mairnferos tales como ratas, ratones, ganado, seres humanos, etc. Cabe esperar todas las vfas de administracion, por ejemplo, la composicion farmaceutica se puede administrar por via oral, intrarrectal, intravenosa, intramuscular, subcutanea, intrauterina, intradural o intracerebrovascular.

Estando casi exento de toxicidad y de efectos secundarios, el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p) se puede ingerir con seguridad durante un largo penodo de tiempo con el fin de prevenir la neuropatfa diabetica.

En la presente invencion, se realizaron ensayos in vivo para examinar la capacidad del extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p) para elevar el nivel de factor de crecimiento nervioso in vivo y aliviar los smtomas de la neuropatfa periferica diabetica. Los datos de modelos de animales que eran sanos y que padedan neuropatfa diabetica, respectivamente, expusieron que el extracto de la mezcla de hierbas a la proporcion espedfica de acuerdo con la presente invencion tuvo efectos terapeuticamente sinergicos en comparacion con los extractos de hierbas solos o mezclas de hierbas a otras proporciones en peso.

De acuerdo con otro aspecto mas de la misma, la presente invencion contempla un alimento funcional para la salud para la prevencion y la mejora de la neuropatfa diabetica, que comprende un extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p) y un aditivo alimentario sitologicamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, la expresion "alimento funcional para la salud" pretende incluir los definidos en la "Ley en materia de alimentos funcionales para la salud de 2002", tales como los alimentos para la salud que se encuentran en la lista que estipula los materiales alimentarios funcionales para la salud o los ingredientes verificados para la funcionalidad y seguridad para los seres humanos de acuerdo con la noticia de KFDA n.° 2004-12 de la Administracion de Alimentos y Medicamentos de Corea.

Mas particularmente, la presente invencion proporciona un alimento funcional para la salud para la prevencion y la mejora de la neuropatfa diabetica, que comprende un extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 y un aditivo alimentario sitologicamente aceptable.

La composicion que comprende un extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 de acuerdo con la presente invencion se puede aplicar a farmacos, alimentos y bebidas para aliviar los smtomas de la neuropatfa diabetica. Por ejemplo, los alimentos a los que se puede anadir el extracto de hierbas de la presente invencion incluyen bebidas, goma de mascar, tes, complejos vitammicos y complementos alimentarios. Para su uso en farmacos, el extracto de hierbas puede estar en forma de pfldoras, polvos, granulos, comprimidos, capsulas o lfquidos.

Cuando se aplica a alimentos solidos, el extracto de hierbas de la presente invencion se puede usar en una cantidad del 0,1 al 15 % en peso basado en el peso total del alimento, y preferentemente en una cantidad del 0,2 al 10 % en

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peso. En una forma Ifquida saludable, el extracto de hierbas de la presente invencion puede variar en cantidad de 0,1 a 30 g por 100 ml de lfquido y preferentemente de 0,2 a 5 g.

A excepcion de la proporcion espedfica dada a los ingredientes de hierbas indispensables, no se aplican limitaciones particulares en la composicion Kquida saludable. Como bebidas tipicas, la composicion lfquida saludable puede comprender, ademas, diversos agentes aromatizantes, hidratos de carbono naturales u otros aditivos.

Los ejemplos preferidos de hidratos de carbono naturales incluyen monosacaridos tales como glucosa, fructosa, etc.; disacaridos tales como maltosa, sacarosa, etc.; polisacaridos tales como dextrina, ciclodextrina, etc.; y alcoholes de azucar tales como xilitol, sorbitol, eritritol, etc. Los agentes aromatizantes utiles en la presente invencion pueden ser extracto de estevia natural (taumatina), (por ejemplo, rebaudiosido A, glicirricina) o sinteticos (sacarina, aspartamo). Los hidratos de carbono naturales se pueden usar en una cantidad de aproximadamente 1 a 20 g por 100 ml de la composicion lfquida saludable, y preferentemente en una cantidad de aproximadamente 5 a 12 g.

Ademas, la composicion de la presente invencion puede contener diversos nutrientes, vitaminas, minerales (electrolitos), agentes aromatizantes sinteticos y/o naturales, colorantes, cargas (queso, chocolate, etc.), acido pectico y sus sales, acido algmico y sus sales, acidos organicos, espesantes coloidales protectores, modificadores del pH, estabilizantes, conservantes, glicerina, alcoholes, y agentes de carbonatacion para bebidas carbonatadas. Para el uso en el zumo de fruta natural, bebidas de zumo de frutas o bebidas vegetales, la composicion de la presente invencion puede contener ademas pulpa de fruta. Estos aditivos se pueden usar solos o en combinacion. Las cantidades tfpicas, pero sin importancia, de los aditivos son del orden de 0 a 20 partes en peso por 100 partes en peso de la composicion.

Efectos ventajosos de la invencion

Como se ha descrito hasta ahora, el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (p/p) de acuerdo con la presente invencion muestra efectos sinergicos significativamente mas altos en terminos de la elevacion del nivel in vivo del factor de crecimiento nervioso (NGF), del crecimiento de neuritas y de la capacidad cognitiva en comparacion con los extractos de Dioscorea Rhizoma o Dioscorea nipponica solos o una mezcla de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica en otras proporciones en peso, y por lo tanto, se puede usar en composiciones farmaceuticas y alimentos funcionales para la salud para la prevencion y el tratamiento de la neuropatfa periferica diabetica.

Breve descripcion de las figuras

La FIG. 1 es de fotograffas electronicas que muestran el efecto del extracto del Ejemplo 1 sobre el nervio ciatico de ratones con diabetes de tipo 1.

La FIG. 2 es de fotograffas electronicas que muestran el efecto del extracto del Ejemplo 1 sobre el nervio ciatico de ratas con diabetes de tipo 1.

Modo para la invencion

La presente invencion se puede comprender mejor a traves de los siguientes ejemplos, que se exponen a modo ilustrativo, y que no se han de interpretar como limitantes de la presente invencion.

EJEMPLO 1: Preparacion de extracto de una mezcla de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica

La Dioscorea Rhizoma y la Dioscorea nipponica, ambas en estado seco, se adquirieron en una tienda de medicinas a base de hierbas del mercado Kyoungdong, Corea. Tras eliminar las impurezas de las mismas, se cortaron las hierbas con una cuchilla y se mezclaron en una proporcion en peso de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica de 3,5:1. A 2 kg de la mezcla, se anadieron 10 l de una solucion de etanol al 50%, seguidos de la incubacion a temperatura ambiente durante 48 horas con agitacion. Se retiro la mezcla de hierbas por filtracion, y se concentro la sustancia filtrada al vado y se liofilizo, proporcionando un extracto mixto de hierbas (extracto en bruto) (vease la Tabla 1).

Tabla 1

[Tabla 11

Rendimiento del extracto de hierbas combinadas de la invencion

Ex.: Cantidad del material Disolvente Cantidad de disolvente Lavado Temperatura de la extraccion Tiempo de extraccion Extracto en bruto (g) Rendimiento (%)

D. Rhizoma: D. nipponica

Ej. 1: 1,55 kg 0,45 kg EtOH al 50 % 10 l 1 l Temperatura ambiente 2 dfas 212,85 10,64

EJEMPLO COMPARATIVO 1: Preparacion de extracto de Dioscorea Rhizoma

Se preparo un extracto de Dioscorea Rhizoma (extracto en bruto) de la misma manera que en el Ejemplo 1, con la excepcion de que se usaron 2 kg de Dioscorea Rhizoma en lugar de 2 kg de la mezcla (vease la Tabla 2).

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EJEMPLO COMPARATIVO 2: Preparacion de extracto de Dioscorea nipponica

Se preparo un extracto de Dioscorea nipponica (extracto en bruto) de la misma manera que en el Ejemplo 1, con la excepcion de que se usaron 2 kg de Dioscorea nipponica en lugar de 2 kg de la mezcla (vease la Tabla 2).

10 Tabla 2

[Tabla 21

Rendimiento de los respectivos extractos de D. Rhizoma y D. nipponica

n.° del Ej. comp.: Cantidad de materia Disolvente Cantidad de disolvente Lavado Temperatura de la extraccion Tiempo de extraccion Extracto en bruto (g) Rendimiento (%)

D. Rhizoma: D. nipponica

1: 2 kg - EtOH al 50 % 10 l 1 l Temperatura ambiente 2 dfas 253,8 12,69

2: - 2 kg EtOH al 50 % 10 l 1 l Temperatura ambiente 2 dfas 160,0 8,00

EJEMPLO COMPARATIVO 3 a 10: Preparacion de extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea 15 nipponica

Se usaron las mismas hierbas Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica usadas en el Ejemplo 1. Se cortaron Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica con una cuchilla y se mezclaron en las proporciones en peso presentadas en la Tabla 3. A 2 kg de las mezclas, se anadieron 10 l de una solucion de etanol al 50 %, seguidos de la incubacion 20 a temperatura ambiente durante 48 horas con agitacion. Se retiraron las mezclas de hierbas por filtracion, y se concentro la sustancia filtrada al vacfo y se liofilizo, proporcionando extractos mixtos de hierbas (extractos en bruto) Tabla 3

[Tabla 31

Rendimiento del extracto combinado de la mezcla de D. Rhizoma y D. nipponica

n.° del Ej. comp.: Cantidad de materia Disolvente Lavado Temperatura de la extraccion Tiempo de extraccion Extracto en bruto (g) Rendimiento (%)

D. Rhizoma: D. nipponica Tipo Cantidad

3: 1 1 EtOH al 50 % 10 l 1 l Temperatura ambiente 2 dfas 179,05 8,95

4: 1,33 0,67 EtOH al 50 % 10 l 1 l Temperatura ambiente 2 dfas 135,96 6,80

5: 1,67 0,33 EtOH al 50 % 10 l 1 l Temperatura ambiente 2 dfas 160,07 8,00

6: 1,82 0,18 EtOH al 50 % 10 l 1 l Temperatura ambiente 2 dfas 138,75 6,93

7: 0,67 1,33 EtOH al 50 % 10 l 1 l Temperatura ambiente 2 dfas 153,56 7,68

8: 0,45 1,55 EtOH al 50 % 10 l 1 l Temperatura ambiente 2 dfas 139,15 6,96

9: 0,33 1,67 EtOH al 50 % 10 l 1 l Temperatura ambiente 2 dfas 181,06 9,05

10: 0,18 1,82 EtOH al 50 % 10 l 1 l Temperatura ambiente 2 dfas 146,43 7,32

5

10

15

20

25

30

35

40

EJEMPLO DE ENSAYO 1: Ensayo para el nivel in vivo de factor de crecimiento nervioso en el modelo de raton normal

Se evaluo la capacidad del extracto en bruto con etanol al 50 % del Ejemplo 1 para inducir la secrecion de factor de crecimiento nervioso in vivo (O. Arrieta y J. Sotelo et al., “Retinoic acid increases tissue and plasma contents of nerve growth factor and prevents neuropathy in diabetic mice”. European Journal of Clinical Investigation (2005) 35).

Se aclimataron ratones ICR machos, con un peso de 25 ~ 30 g, durante 1 semana a 22-24 °C a una humedad relativa del 60-80 %, mientras que se alimentaban con agua y una dieta convencional. Se dividieron en grupos segun el peso. Se administraron oralmente los extractos preparados en los ejemplos anteriores a los ratones en cantidades predeterminadas, con gabapentina usada como control positivo a una dosis de 100 mg/kg, y 16 horas despues, se tomaron muestras de sangre de los ratones. Posteriormente, fueron sacrificados para extraer el nervio ciatico y las glandulas salivales.

Tras centrifugar las muestras de sangre a 10.000 rpm durante 10 min, se midieron los niveles de factor de crecimiento nervioso en el plasma asf separado mediante ELISA (absorbancia a 450 nm). Se pesaron el nervio ciatico y las glandulas salivales, y se anadio una solucion que contema Tris-HCl 100 mM, NaCl 1 M, BSA al 2 %, EDTA 4 mM, Trtion®X-100 al 2,0 %, azida de sodio al 0,02 %, 0,1 mg/ml de pepstatina A, 5 mg/ml de aprotinina, 0,5 mg/ml de antipama, 167 mg/ml de benzamidina y 5,2 mg/ml de PMSF en cantidades proporcionales a los pesos, seguido de la homogeneizacion. Se incubaron los las sustancias homogenizadas durante 15 min con HCl 1 N en una cantidad de 1 pl/50 pl para la oxidacion y se neutralizaron con NaOH 1 N en una cantidad de 1 pl/50 pl. Se realizo la centrifugacion a 10.000 rpm durante 10 min, obteniendose sobrenadantes. Como el plasma, se analizaron cuantitativamente el nervio ciatico y las glandulas salivales para determinar el nivel de factor de crecimiento nervioso.

Los datos se resumen en la Tabla 4 para los niveles de NGF en plasma, en la Tabla 5 para los niveles de NGF del nervio ciatico, y en la Tabla 6 para los niveles de NGF de las glandulas salivales.

Tabla 4

[Tabla 41

Nivel de NGF en plasma

Grupo: Cantidad de material (kg) Proporcion en peso de D. Rhizoma:D. nipponica Dosis (mg/kg) Nivel de NGF en plasma (pg/ml)

D. Rhizoma: D. nipponica

Control: 601,5

Ej. 1: 1,55 0,45 3,5:1 100 1106,9

Ej. comp. 1: 2 - - 100 606,2

Ej. comp. 2: - 2 - 100 602,1

Ej. comp. 3: 1 1 1:1 100 663,6

Ej. comp. 4: 1,33 0,67 1:2 100 689,9

Ej. comp. 5: 1,67 0,33 5:11 100 725,6

Ej. comp. 6: 1,82 0,18 10:1 100 696,8

Ej. comp. 7: 0,67 1,33 1:2 100 607,0

Ej. comp. 8: 0,45 1,55 1:3,5 100 656,0

Ej. comp. 9: 0,33 1,67 15 100 642,6

Ej. comp. 10: 0,18 1,82 1:10 100 640,7

Gabapentina: 100 610,4

Cuando se administraron a la misma dosis, como se puede observar en la Tabla 4, el extracto de Dioscorea Rhizoma del Ejemplo comparativo 1, el extracto de Dioscorea nipponica del Ejemplo comparativo 2 y los extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica de los Ejemplos comparativos 3 a 10, mostraron inducir la secrecion del factor de crecimiento nervioso en plasma en un grado similar al del control. Por el contrario, el extracto del Ejemplo 1 aumento el nivel de NGF en plasma frente al obtenido por el extracto de Dioscorea Rhizoma, el extracto de Dioscorea nipponica o los extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica en otras proporciones en peso.

5

10

15

20

25

El aumento del nivel de factor de crecimiento nervioso en plasma, una v^a a traves de la que el factor de crecimiento nervioso se mueve hacia las dianas, indica la potenciacion de la secrecion de factor de crecimiento nervioso. Por lo tanto, el extracto de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1 (p/p) de acuerdo con la presente invencion potencia ademas la secrecion de factor de crecimiento nervioso para aumentar significativamente el nivel de NGF in vivo, en comparacion con los extractos de Dioscorea Rhizoma solo, Dioscorea nipponica solo o de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica en otras proporciones en peso.

Tabla 5

[Tabla 51

Nivel de NGF en el nervio ciatico

Grupo: Cantidad de material (kg) Proporcion en peso de D. Rhizoma:D. nipponica Dosis (mg/kg) Nivel de NGF en el nervio ciatico (pg/mg)

D. Rhizoma: D. nipponica

Control: 3.3

Ej. 1: 1,55 0,45 3,5:1 100 7,5

Ej. comp. 1: 2 - - 100 3,8

Ej. comp. 2: - 2 - 100 3,6

Ej. comp. 3: 1 1 1:1 100 4,6

Ej. comp. 4: 1,33 0,67 1:2 100 4,1

Ej. comp. 5: 1,67 0,33 5:1 100 4,0

Ej. comp. 6: 1,82 0,18 10:1 100 3,2

Ej. comp. 7: 0,67 1,33 1:2 100 5,1

Ej. comp. 8: 0,45 1,55 1:3,5 100 4,6

Ej. comp. 9: 0,33 1, 67 15 100 4,0

Ej. comp. 10: 0,18 1,82 1:10 100 4,9

Acido a- lipoico: 50 5,0

Gabapentina: 100 4,2

Las observaciones mostraron que, cuando se administraron a la misma dosis, como se puede observar en la Tabla 5, el extracto de Dioscorea Rhizoma del Ejemplo comparativo 1, el extracto de Dioscorea nipponica del Ejemplo comparativo 2 y los extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica de los Ejemplos comparativos 3 a 10, secretaron factor de crecimiento nervioso en el nervio ciatico en un grado similar al del control. Por el contrario, el extracto del Ejemplo 1 aumento el nivel de NGF en el nervio ciatico frente al obtenido por el extracto de Dioscorea Rhizoma, el extracto de Dioscorea nipponica o los extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica en otras proporciones en peso

Por consiguiente, el extracto de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1 de acuerdo con la presente invencion puede inducir la secrecion de NGF en la sangre, lo que resulta en un aumento significativo del nivel de NGF en el nervio ciatico, el tejido diana.

Tabla 6

[Tabla 61

Nivel de NGF en la glandula salival

Grupo: Cantidad de material (kg) Proporcion en peso de D. Rhizoma:D. nipponica Dosis (mg/kg) Nivel de NGF en la glandula salival (ng/mg)

D. Rhizoma: D. nipponica

Control: 166,1

Ej. 1: 1,55 0,45 3,5: 1 100 221,7

Ej. comp. 1: 2 - - 100 171,6

5

10

15

20

25

30

35

40

Nivel de NGF en la glandula salival

D. Rhizoma: D. nipponica

Ej. comp. 2: - 2 - 100 170,1

Ej. comp. 3: 1 1 1:1 100 206,2

Ej. comp. 4: 1,33 0,67 2:1 100 193,3

Ej. comp. 5: 1,67 0,33 5:1 100 177,4

Ej. comp. 6: 1,82 0,18 10:1 100 202,5

Ej. comp. 7: 0,67 1,33 1:2 100 173,4

Ej. comp. 8: 0,45 1,55 1:3,5 100 200,2

Ej. comp. 9: 0,33 1,67 15 100 181,2

Ej. comp. 10: 0,18 1,82 1:10 100 188,1

Acido a- lipoico: 50 164,4

Gabapentina: 100 193,1

Como resulta evidente a partir de los datos de la Tabla 6, cuando se administraron a la misma dosis el extracto de Dioscorea Rhizoma del Ejemplo comparativo 1 y el extracto de Dioscorea nipponica del Ejemplo comparativo 2 aumentaron el nivel de nGf en las glandulas salivales solamente en un 2 ~ 3 %, en comparacion con el control, mientras que los extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica de los Ejemplos comparativos 3 a 10 indujeron la secrecion de NGF en las glandulas salivales en grados similares o inferiores a los obtenidos por el control positivo de gabapentina. Por el contrario, el nivel de NGF en las glandulas salivales fue aumentado en un 33,5 % por el extracto del Ejemplo 1. Es decir, el extracto de la presente invencion permitio un aumento significativo del nivel de NGF en la glandula salival, en comparacion con los extractos de Dioscorea Rhizoma solo, Dioscorea nipponica solo o mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica en otras proporciones en peso. El aumento del nivel de NGF en la glandula salival, que funciona como una fuente de NGF, significa potenciar la smtesis de NGF.

Por consiguiente, el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1 (p/p) puede aumentar significativamente el nivel de NGF in vivo.

Por lo tanto, gracias a su capacidad de aumentar significativamente el nivel de NGF in vivo, el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1 (p/p) de acuerdo con la presente invencion se puede aplicar a una composicion farmaceutica o a un alimento funcional para la salud para la prevencion y el tratamiento de la neuropatfa periferica diabetica.

EJEMPLO DE ENSAYO 2: Ensayo de los efectos sobre el dolor, la secrecion de NGF y la neurodegeneracion en ratas macho SD con diabetes de tipo 1 inducida por estreptozotocina

Se evaluaron el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1, preparada en el Ejemplo 1, y los extractos de los Ejemplos comparativos 1 a 10 para determinar los efectos sobre el dolor, el nivel de nGf in vivo y la neurodegeneracion en ratas macho SD con diabetes de tipo 1.

Se aclimataron ratas macho SD, cada una con un peso de 220~250 g, durante una semana a 22-24 °C a una humedad relativa del 60-80 % con una dieta convencional y agua suministrada en la misma. A partir de entonces, se administro por via intravenosa una solucion de estreptozotocina en solucion salina una vez a una dosis de 50 mg/kg a las ratas para inducir la diabetes de tipo 1. Cuatro semanas despues de la induccion de la diabetes, las ratas se dividieron en grupos segun el nivel de azucar en sangre. Se administraron los extractos preparados en los ejemplos anteriores por via oral una vez al dfa durante 8 semanas a dosis predeterminadas a las ratas, mientras que el acido a-lipoico y la gabapentina se usaron como controles positivos a dosis de 50 mg/kg y 100 mg/kg, respectivamente. A continuacion, se sacrificaron para extraer el nervio ciatico y las glandulas salivales. El nervio ciatico y las glandulas salivales se procesaron de la misma manera que en el Ejemplo de ensayo 1 y se midieron para determinar el nivel de NGF mediante ELISA. Los resultados se resumen en la Tabla 7 que se presenta a continuacion.

Se examino la capacidad de los extractos para aliviar el dolor causado por la neuropatfa diabetica. En este sentido, se separaron las ratas con diabetes inducida por estreptozotocina y recibieron por via oral los extractos a una dosis predeterminada una vez al dfa durante 14 semanas, con 50 mg/kg de acido a-lipoico y 100 mg/kg de gabapentina

como controles positivos. Se realizo un ensayo de RandaN-Sellito para medir un umbral de respuesta a la presion sobre una pata. Se midio el tiempo de latencia adoptado para responder a un dolor termico usando un ensayo de retirada de la cola. Los resultados se resumen en la Tabla 8. Con el fin de evaluar la neurodegeneracion que habfa progresado con el comienzo de la neuropatia diabetica, se fijo el nervio ciatico ex^do de las ratas de cada grupo 5 con formalina y se observo bajo un microscopio electronico para medir el tamano y el espesor de la vaina de mielina, y los resultados se resumen en la Tabla 9.

Tabla 7

10 __________________________________________[Tabla 71

Nivel de NGF en el nervio ciatico de modelo de rata con diabetes de tipo 2 (rata macho SD)

Grupo: Cantidad de material (kg) Proporcion en peso de D. Rhizoma:D. nipponica Dosis (mg/kg) Nivel de NGF

D. Rhizoma: D. nipponica Nervio ciatico (pg/mg) Glandula salival (ng/mg)

Normal: 25,5 4,1

Control: 11,9 2,1

Ej. 1: 1,55 0,45 3,5:1 100 35,4 3,8

Ej. comp. 1: 2 - - 100 13,1 2,0

Ej. comp. 2: - 2 - 100 12,7 1,7

Ej. comp. 3: 1 1 1:1 100 19,2 1,9

Ej. comp. 4: 1,33 0,67 2:1 100 27,9 2,4

Ej. comp. 5: 1,67 0,33 5:1 100 25,1 2,9

Ej. comp. 6: 1,82 0,18 10:1 100 24,6 2,8

Ej. comp. 7: 0,67 1,33 1:2 100 19,1 3,3

Ej. comp. 8: 0,45 1,55 1:3,5 100 19,8 2,9

Ej. comp. 9: 0,33 1,67 15 100 20,9 2,9

Ej. comp. 10: 0,18 1,82 1:10 100 16,4 2,5

Acido a- lipoico: 50 13,8 2,8

Gabapentina: 100 14,9 2,4

Cuando se administran a la misma dosis, como puede observarse en la Tabla 7, el extracto del Ejemplo 1 aumento significativamente el nivel de NGF, tanto en el nervio ciatico como en la glandula salival, en comparacion con el extracto de Dioscorea Rhizoma del Ejemplo comparativo 1, el extracto de Dioscorea nipponica del Ejemplo 15 comparativo 2 o los extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica de los Ejemplos comparativos 3 a 10.

Por lo tanto, se probo la induccion del extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1 de un aumento significativo de NGF en los tejidos diana (nervio ciatico, glandula salivar), incluso 20 en animales con diabetes de tipo 1.

Tabla 8

[Tabla 81

Ensayo para determinar la respuesta al dolor en modelo de rata con diabetes de tipo 1 (rata macho SD)

: Cantidad de material (kg) Proporcion en peso de D. Rhizoma:D. nipponica Dosis (mg/kg) Umbral de dolor a la presion (g) Tiempo de latencia de la reaccion al dolor (s)

D. Rhizoma: D. nipponica

Normal: 270.0 9.9

Control: 128,8 5.4

Ej. 1: 1.55 0.45 3.5: 1 100 191,7 11.4

5

10

15

20

25

D. Rhizoma: D. nipponica

Ej. comp. 1: 2 - - 100 130,1 6.3

Ej. comp. 2: - 2 - 100 129,8 6,7

Ej. comp. 3: 1 1 1:1 100 169,0 8,0

Ej. comp. 4: 1,33 0,67 2:1 100 163,7 7,8

Ej. comp. 5: 1,67 0,33 5:1 100 138,0 7,4

Ej. comp. 6: 1,82 0,18 10:1 100 150,0 7,2

Ej. comp. 7: 0,67 1,33 1:2 100 153,5 7,9

Ej. comp. 8: 0,45 1,55 1:3,5 100 157,0 7,6

Ej. comp. 9: 0,33 1,67 15 100 157,6 7,1

Ej. comp. 10: 0,18 1,82 1:10 100 129,2 7,5

Acido a- lipoico: 50 150,0 7,4

Gabapentina: 100 137,7 7,7

Como se puede observar en la Tabla 8, cuando se administran a la misma dosis, el extracto del Ejemplo 1 aumento significativamente tanto el umbral de dolor a la presion como el tiempo de latencia de respuestas a la presion, en comparacion con el extracto de Dioscorea Rhizoma del Ejemplo comparativo 1, el extracto de Dioscorea nipponica del Ejemplo comparativo 2 o los extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica de los Ejemplos comparativos 3 a 10.

Un aumento del umbral de los estimulos mecanicos define un aumento del umbral de dolor. En el ensayo de retirada de la cola, un aumento del tiempo de latencia para la respuesta al dolor se corresponde con un aumento del umbral de estfmulos termicos, lo que indica el alivio del dolor.

Por lo tanto, el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 de acuerdo con la presente invencion presenta un efecto significativo de alivio del dolor, un smtoma de la neuropatfa periferica diabetica.

Tabla 9

[Tabla 91

Ensayo para la neurodegeneracion en modelo de rata con diabetes de tipo 1 (rata macho SD)

: Dosis (mg/kg) Neurodegeneracion

Tamano de la vaina de mielina (pm): Espesor de la vaina de mielina (pm)

Normal: 15,3 3,2

Control: 9,3 2,5

Ej. 1: 30 13,6 3,2

100: 13,8 2,9

Acido a- lipoico: 50 11,2 2,6

Gabapentina: 100 10,4 2,2

Como resulta evidente a partir de los datos de la Tabla 9, tanto el tamano como el grosor de la vaina de mielina del control se redujo, lo que indica el dano o la degeneracion del nervio ciatico debido a la neuropatfa diabetica. Cuando se administro con el extracto del Ejemplo 1, se observo que tanto el tamano como el grosor de la vaina de mielina de las ratas habfan crecido.

5

10

15

20

25

30

35

Por lo tanto, el extracto de la presente invencion puede mejorar la neurodegeneracion, dando lugar a la regeneracion nerviosa en los organos diana, incluso en un aspecto histologico.

Por consiguiente, el extracto de hierbas de acuerdo con la presente invencion se puede aplicar a una composicion farmaceutica que puede dar lugar a un efecto sinergico significativo en la prevencion y el tratamiento de la neuropatia periferica diabetica en sujetos con diabetes de tipo 1.

EJEMPLO DE ENSAYO 3: Ensayo de los efectos sobre el dolor, la secrecion de NGF y la neurodegeneracion en ratones ICR macho con diabetes de tipo 1 inducida por estreptozotocina

Se evaluo el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1, preparado en el Ejemplo 1, para determinar los efectos sobre el dolor, el nivel de NGF in vivo y la neurodegeneracion en ratones ICR macho con diabetes de tipo 1.

Se aclimataron los ratones ICR macho, cada uno con un peso de 25~30 g, durante una semana a 22-24 °C a una humedad relativa del 60-80 % con una dieta convencional y agua suministrada en la misma. A partir de entonces, se administro por via intravenosa una solucion de estreptozotocina en solucion salina una vez a una dosis de 200 mg/kg a los ratones para inducir la diabetes de tipo 1. Cuatro semanas despues de la induccion de la diabetes, los ratones se dividieron en grupos segun el nivel de azucar en sangre. Se administraron los extractos preparados en los ejemplos anteriores por via oral una vez al dfa durante 14 semanas a dosis predeterminadas a los ratones, mientras que el acido a-lipoico y la gabapentina se usaron como controles positivos a dosis de 50 mg/kg y 100 mg/kg, respectivamente. Se dispusieron los ratones de cada grupo sobre una placa caliente a 58 °C y se examinaron para determinar la hiperplasia ante estfmulos de calor, midiendo el tiempo de latencia que tardaron los ratones en sentir dolor por calor en la planta de las patas y saltar. Los resultados se resumen en la Tabla 10.

A continuacion, los ratones se sacrificaron para extraer el nervio ciatico y las glandulas salivales de los mismos. El nervio ciatico y las glandulas salivales se procesaron de la misma manera que en el Ejemplo de ensayo 1 y se midio el nivel de NGF mediante ELISA. Los resultados se resumen en la Tabla 11 que se presenta a continuacion.

Con el fin de evaluar la neurodegeneracion que habfa progresado con el comienzo de la neuropatfa diabetica, se fijo el nervio ciatico extrafdo de los ratones de cada grupo con formalina y se observo bajo un microscopio electronico para medir el tamano y el grosor de la vaina de mielina, y los resultados se resumen en la Tabla 12.

Tabla 10

[Tabla 101

Ensayo para la respuesta al dolor en modelo de raton con diabetes de tipo 1 (ratones ICR macho)

Grupo: Dosis (mg/kg) Tiempo de latencia hasta la respuesta al dolor en placa caliente a 58 °C (s)

Normal: 55,3

Control: 25,2

Ej. 1: 100 45,9

Ej. comp. 1: 100 26,6

Ej. comp. 2: 100 25,7

Ej. comp. 3: 100 35,6

Ej. comp. 4: 100 25,3

Ej. comp. 5: 100 26,0

Ej. comp. 6: 100 35,0

Ej. comp. 7: 100 32,2

Ej. comp. 8: 100 33,0

Ej. comp. 9: 100 26,8

Ej. comp. 10: 100 36,1

Acido a- lipoico: 50 31,1

Gabapentina: 100 33,0

Un aumento del tiempo de latencia hasta la respuesta al dolor en la placa caliente refleja un aumento del umbral del dolor a los estfmulos termicos, lo que indica una reduccion del dolor. Como se puede observar en la Tabla 10, el

extracto del Ejemplo 1 aumento significativamente el tiempo de latencia hasta la respuesta al dolor en una placa caliente, en comparacion con el extracto de Dioscorea Rhizoma del Ejemplo comparativo 1, el extracto de Dioscorea nipponica del Ejemplo comparativo 2 o los extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica de los Ejemplos comparativos 3 a 10, lo que demuestra que la composicion de hierbas de la presente invencion tiene un 5 efecto significativo de alivio del dolor, un smtoma de la neuropatia periferica diabetica.

Tabla 11

[Tabla 111

Niveles de NGF en el nervio ciatico y la glandula salival en modelo de raton con diabetes de tipo 1 (ratones ICR macho)

Grupo: Dosis (mg/kg) Nivel de NGF

Nervio ciatico (pg/mg): Glandula salival (ng/mg)

Normal: 9,7 226,1

Control: 3,9 101,8

Ej. 1: 100 9,2 169,6

Ej. comp. 1: 100 4,1 107,2

Ej. comp. 2: 100 3,9 104,3

Ej. comp. 3: 100 6,2 118,7

Ej. comp. 4: 100 4,8 115,8

Ej. comp. 5: 100 4,0 121,0

Ej. comp. 6: 100 3,6 114,3

Ej. comp. 7: 100 6,2 122,7

Ej. comp. 8: 100 4,8 104 0,7

Ej. comp. 9: 100 4,1 104,7

Ej. comp. 10: 100 3,5 120,4

Acido a-lipoico: 50 5,7 118,7

Gabapentina: 100 5,5 117,1

10

Como se puede observar en la Tabla 11, el extracto del Ejemplo 1 aumento significativamente el nivel de NGF, tanto en el nervio ciatico como en la glandula salival, en comparacion con el extracto de Dioscorea Rhizoma del Ejemplo comparativo 1, el extracto de Dioscorea nipponica del Ejemplo comparativo 2 o los extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica de los Ejemplos comparativos 3 a 10.

15

Por lo tanto, el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1 ha demostrado inducir un aumento significativo de NGF en los organos diana (nervio ciatico, glandula salival) en ratones macho ICR con diabetes de tipo 1, asf como en ratas macho SD con diabetes de tipo 1.

20 Tabla 12

[Tabla 121

Ensayo para la neurodegeneracion en modelo de raton con diabetes de tipo 1 (ratones ICR macho)

Grupo: Dosis (mg/kg) Neurodegeneracion

Tamano de la vaina de mielina (pm): Espesor de la vaina de mielina (pm)

Normal: 14,3 3,4

Control: 9,1 2,0

Ej. 1: 30 13,7 2,9

100: 12,9 2,6

Como resulta evidente a partir de los datos de la Tabla 12, la vaina de mielina del control se redujo tanto en tamano 25 como en espesor, lo que indica el dano o la degeneracion del nervio ciatico debido a la neuropatfa diabetica. Cuando recibieron el extracto del Ejemplo 1, se observo que los ratones teman una vaina de mielina que aumento tanto en tamano como en espesor.

5

10

15

20

25

30

35

40

Por lo tanto, el extracto de la presente invencion puede mejorar la neurodegeneracion en ratones ICR con diabetes de tipo 1, asf como en ratas SD con diabetes de tipo 1, dando lugar a la regeneracion nerviosa de los organos diana, incluso en un aspecto histologico.

Por consiguiente, el extracto de hierbas de acuerdo con la presente invencion se puede aplicar a una composicion farmaceutica que puede dar lugar a un efecto sinergico significativo sobre la prevencion y el tratamiento de la neuropatia periferica diabetica en sujetos con diabetes de tipo 1.

EJEMPLO DE ENSAYO 4: Ensayo de los efectos sobre el dolor y la secrecion de NGF en ratones macho con diabetes de tipo 2 inducida geneticamente (ratones macho db/db)

Se evaluo el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1, preparado en el Ejemplo 1, para determinar los efectos sobre el dolor y el nivel de NGF in vivo en ratones macho db/db con diabetes de tipo 2.

Se aclimataron los ratones macho db/db, cada uno con un peso de 40~45 g, durante una semana a 22-24 °C a una humedad relativa del 60-80 % con una dieta convencional y agua suministrada en la misma. El dfa que cumplfan 9 semanas de vida, se seleccionaron los ratones en los que se habfa inducido la diabetes. Cuatro semanas despues, los ratones que padedan diabetes de tipo 2 se separaron segun el nivel de azucar en sangre. Se administraron los extractos preparados en los ejemplos anteriores por via oral una vez al dfa durante 12 semanas a dosis predeterminadas a los ratones, mientras que el acido a-lipoico y la gabapentina se usaron como controles positivos a dosis de 50 mg/kg y 100 mg/kg, respectivamente. Se dispusieron los ratones de cada grupo sobre una placa caliente a 58 °C y se examinaron para determinar la hiperplasia ante estfmulos de calor, midiendo el tiempo de latencia que tardaron los ratones en sentir dolor por calor en la planta de las patas y saltar. Los resultados se resumen en la Tabla 13.

A continuacion, los ratones se sacrificaron para extraer el nervio ciatico de los mismos. El nervio ciatico se proceso de la misma manera que en el Ejemplo de ensayo 1 y se midio el nivel de NGF mediante ELISA. Los resultados se resumen en la Tabla 14 que se presenta a continuacion.

Tabla 13

[Tabla 13]

Ensayo para la respuesta al dolor en modelo de raton con diabetes de tipo 2 (raton macho db/db)

Control: 12,7

Ej. 1: 100 28,0

Ej. comp. 1: 100 15,1

Ej. comp. 2: 100 14,9

Ej. comp. 3: 100 21,3

Ej. comp. 4: 100 21,0

Ej. comp. 5: 100 20,5

Ej. comp. 6: 100 19,3

Ej. comp. 7: 100 22,3

Ej. comp. 8: 100 17,6

Ej. comp. 9: 100 17,6

Ej. comp. 10: 100 16,8

Acido a-lipoico: 50 15,4

Gabapentina: 100 16,1

Como se puede observar en la Tabla 13, el extracto del Ejemplo 1 aumento significativamente el tiempo de latencia hasta la respuesta al dolor en una placa caliente, en comparacion con el extracto de Dioscorea Rhizoma del Ejemplo comparativo 1, el extracto de Dioscorea nipponica del Ejemplo comparativo 2 o los extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica de los Ejemplos comparativos 3 a 10, lo que demuestra que la composicion de hierbas de la presente invencion tiene un efecto significativo de alivio del dolor, un smtoma de la neuropatfa periferica diabetica.

5

10

15

20

25

30

35

Nivel de NGF en el nervio ciatico en modelo de raton con diabetes de tipo 2 (raton macho db/db)

Grupo: Dosis (mg/kg) Nivel de NGF en el nervio ciatico (pg/mg)

Control: 6,2

Ej. 1: 100 11,6

Ej. comp. 1: 100 6,5

Ej. comp. 2: 100 6,3

Ej. comp. 3: 100 8,4

Ej. comp. 4: 100 8,3

Ej. comp. 5: 100 7,8

Ej. comp. 6: 100 6,9

Ej. comp. 7: 100 8,1

Ej. comp. 8: 100 7,0

Ej. comp. 9: 100 7,1

Ej. comp. 10: 100 7,3

Acido a- lipoico: 50 7,6

Gabapentina: 100 7,2

Como se puede observar en la Tabla 14, el extracto del Ejemplo 1 aumento significativamente el nivel de NGF en el nervio ciatico en comparacion con el extracto de Dioscorea Rhizoma del Ejemplo comparativo 1, el extracto de Dioscorea nipponica del Ejemplo comparativo 2 o los extractos de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica de los Ejemplos comparativos 3 a 10.

Por lo tanto, el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1 ha demostrado inducir un aumento significativo de NGF en el organo diana en condiciones de diabetes de tipo 2.

Teniendo la capacidad de aumentar significativamente los niveles de NGF in vivo, el extracto de hierbas de acuerdo con la presente invencion se puede aplicar a una composicion farmaceutica que puede dar lugar a un efecto sinergico significativo en la prevencion y el tratamiento de la neuropatfa periferica diabetica en sujetos con diabetes de tipo 1 o 2.

EJEMPLO DE ENSAYO 5: Ensayo de la actividad de induccion de la smtesis de NGF y del crecimiento de las celulas nerviosas usando celulas de glioma de rata C6 y celulas nerviosas PC 12

Se examino la capacidad del extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1 (p/p), preparado en el Ejemplo 1, para inducir la smtesis de NGF en celulas de glioma de rata C6 y el crecimiento de celulas nerviosas PC 12 de rata.

Para evaluar la capacidad del extracto para inducir la smtesis de NGF, se sembraron celulas de glioma C6 a la misma densidad por pocillo en placas y se incubaron durante 24 horas. Las celulas se lavaron con PBS, y se cultivaron durante 48 horas en medio de cultivo recien preparado complementado con 50 pg/ml o 250 pg/ml de extractos de hierbas del Ejemplo 1 o los Ejemplos comparativos 1 a 10. A continuacion, se recogieron los medios de cultivo y se analizaron cuantitativamente los niveles de NGF usando ELISA. Los resultados se resumen en la Tabla 15.

Para el uso en ensayo de la capacidad para inducir el crecimiento de celulas nerviosas, se sembraron celulas nerviosas PC 12 a la misma densidad por pocillo en placas y se incubaron durante 24 horas. Las celulas se lavaron con PBS y se cultivaron durante 48 horas en medio de cultivo suplementado con los extractos de hierbas del Ejemplo 1 o los Ejemplos comparativos 1 a 10 o NGF. El crecimiento de las celulas se midio usando el ensayo de MTS, y los resultados se resumen en la Tabla 16.

Efecto potenciador de la smtesis de NGF

Grupo: Dosis (|jg/ml) Nivel de NGF (% de control)

Control: 100

Ej. 1: 50 113

250: 149

Ej. comp. 1: 50 -

250: 107

Ej. comp. 2: 50 -

250: 103

Ej. comp. 3: 50 108

250: 110

Ej. comp. 4: 50 102

250: 105

Ej. comp. 5: 50 101

250: 110

Ej. comp. 6: 50 105

250: 111

Ej. comp. 7: 50 102

250: 122

Ej. comp. 8: 50 107

250: 128

Ej. comp. 9: 50 104

250: 119

Ej. comp. 10: 50 101

250: 123

5 Como se puede observar en la Tabla 15, el extracto del Ejemplo 1 aumento significativamente el nivel de NGF en las celulas C6, en comparacion con el extracto del Ejemplo comparativo 1 (de Dioscorea Rhizoma solo), el extracto del Ejemplo comparativo 2 (de Dioscorea nipponica solo) o los extractos de los Ejemplos comparativos 3 a 10 (de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica en otras proporciones en peso).

10 Por lo tanto, el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1 ha demostrado inducir al maximo la smtesis de NGF.

Tabla 16

15 _________________________________[Tabla 161

Efecto proliferativo sobre las celulas nerviosas

Grupo: Dosis (jg/ml) Efecto sobre la proliferacion de la celula nerviosa (% del control)

Control: 100

NGF: 2 (ng/ml) 112

50 (ng/ml): 118

Ej. 1: 1 111

30: 117

Ej. comp.: 1 -

5

10

15

20

25

30

Efecto proliferativo sobre las celulas nerviosas

Grupo: Dosis (|jg/ml) Efecto sobre la proliferacion de la celula nerviosa (% del control)

1: 30 101

Ej. comp. 2: 1 -

30: 100

Ej. comp. 3: 1 101

30: 105

Ej. comp. 4: 1 98

30: 103

Ej. comp. 5: 1 100

30: 101

Ej. comp. 6: 1 99

30: 102

Ej. comp. 7: 50 104

250: 106

Ej. comp. 8: 50 100

250: 103

Ej. comp. 9: 50 99

250: 101

Ej. comp. 10: 50 104

250: 102

Como se puede observar en la Tabla 16, el extracto del Ejemplo 1 potencio significativamente el crecimiento de las celulas nerviosas PC 12, en comparacion con el extracto del Ejemplo comparativo 1 (de Dioscorea Rhizoma solo), el extracto del Ejemplo comparativo 2 (de Dioscorea nipponica solo) o los extractos de los Ejemplos comparativos 3 a 10 (de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica en otras proporciones en peso).

Por lo tanto, el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1 de acuerdo con la presente invencion ha demostrado tener un efecto significativo sobre la proliferacion de las celulas nerviosas.

EJEMPLO DE ENSAYO 6: Ensayo de la fosforilacion del receptor de NGF en celulas nerviosas PC 12

Se evaluo la capacidad del extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1, preparado en el Ejemplo 1, para potenciar la fosforilacion de los receptores de NGF en celulas nerviosas PC 12 de rata.

Para su uso en dicho ensayo, las celulas nerviosas PC 12 se sembraron a la misma densidad por pocillo en placas y se incubaron durante 24 horas. Las celulas se lavaron con PBS y se cultivaron durante 48 horas en medio de cultivo suplementado con los extractos de hierbas del Ejemplo 1 o los Ejemplos comparativos 1 a 10 o NGF. Tras ello, se detectaron TrkA fosforilados (receptor de NGF) usando transferencia Western, y se analizaron cuantitativamente basandose en el espesor de las bandas detectadas. Los resultados se resumen en la Tabla 17.

La senalizacion del NGF se inicia con la union del NGF a su receptor (Trk-A), lo que resulta en la fosforilacion del receptor. Por lo tanto, un mayor nivel de receptores fosforilados de NGF significa la amplificacion de la via de senalizacion de NGF.

Como resulta evidente a partir de los datos de la Tabla 17 que se presenta a continuacion, el extracto del Ejemplo 1 indujo un aumento significativo de la fosforilacion de los receptores de NGF, en comparacion con el extracto del Ejemplo comparativo 1 (de Dioscorea Rhizoma solo), el extracto del Ejemplo comparativo 2 (de Dioscorea nipponica solo) o los extractos de los Ejemplos comparativos 3 a 10 (de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica en otras proporciones en peso).

5

10

15

20

25

Efecto potenciador de la fosforilacion del receptor de NGF

Grupo: Dosis Cantidad relativa de NGF fosforilado (% de control)

NGF (ng/ml): Extracto combinado (pg/ml)

Control: 100

NGF: 2 - 241

50: - 337

Ej. 1 + NGF: 2 200 309

500: 389

Ej. comp. 1 + NGF: 2 200 -

500: 232

Ej. comp. 2 + NGF: 2 200 -

500: 229

Ej. comp. 3 + NGF: 2 200 268

500: 299

Ej. comp. 4 + NGF: 2 200 255

500: 287

Ej. comp. 5 + NGF: 2 200 254

500: 274

Ej. comp. 6 + NGF: 2 200 248

500: 277

Ej. comp. 7 + NGF: 2 200 251

500: 268

Ej. comp. 8 + NGF: 2 200 239

500: 287

Ej. comp. 9 + NGF: 2 200 249

500: 296

Ej. comp. 10 + NGF: 2 200 244

500: 280

EJEMPLO DE ENSAYO 7: Ensayo de la actividad de induccion del crecimiento de las neuritas en celulas nerviosas de DRG derivadas de rata

Se evaluo el extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica a 3,5:1, preparado en el Ejemplo 1, para determinar la actividad de potenciacion del crecimiento de las neuritas en celulas nerviosas de DRG (ganglio de la rafz dorsal) obtenidas de embriones de rata

Para su uso en dicho ensayo, las celulas nerviosas de DRG se sembraron a la misma densidad en placas y se incubaron durante 24 horas. Posteriormente, las celulas se lavaron con PBS y se cultivaron durante 48 horas en un medio de cultivo en ausencia o en presencia de una combinacion del eXtracto del Ejemplo 1 o los Ejemplos comparativos 1 a 10, y NGF. Se observaron las celulas nerviosas de cada grupo bajo un microscopio para medir la superficie de neuritas desarrolladas en las mismas. En la Tabla 18, se dan los valores medios de las medidas.

Un aumento de la superficie de neuritas indica que las celulas nerviosas se activan para desarrollar neuritas. Como se puede observar en la Tabla 18 que se presenta a continuacion, el extracto del Ejemplo 1 aumento significativamente una superficie de neuritas, en comparacion con el extracto del Ejemplo comparativo 1 (de Dioscorea Rhizoma solo), el extracto del Ejemplo comparativo 2 (de Dioscorea nipponica solo) o el extractos de los Ejemplos comparativos 3 a 10 (a partir de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica en otras proporciones en peso).

Efecto potenciador de la formacion de neuritas de celula nerviosa de DRG

Grupo: Dosis Superficie de neuritas de celula nerviosa de DRG (pm2)

NGF (ng/ml): Extracto combinado (pg/ml)

Control: 149

NGF: 2 - 235

50: - 461

Ej. 1 + NGF: 2 30 291

100: 502

Ej. comp. 1 + NGF: 2 30 -

100: 234

Ej. comp. 2 + NGF: 2 30 -

100: 236

Ej. comp. 3 + NGF: 2 30 264

100: 288

Ej. comp. 4 + NGF: 2 30 259

100: 271

Ej. comp. 5 + NGF: 2 30 241

100: 294

Ej. comp. 6 + NGF: 2 30 232

100: 301

Ej. comp. 7 + NGF: 2 30 269

100: 288

Ej. comp. 8 + NGF: 2 30 257

100: 279

Ej. comp. 9 + NGF: 2 30 241

100: 266

Ej. comp. 10 + NGF: 2 30 239

100: 248

5 En conjunto, los datos obtenidos de los Ejemplos de ensayo 1 a 7 demuestran que el extracto del Ejemplo 1 puede inducir significativamente la elevacion de los niveles de NGF in vivo, el crecimiento de las celulas nerviosas y las neuritas, el alivio del dolor, un smtoma de la neuropatia diabetica, y la prevencion de la neurodegeneracion histologica (la potenciacion de la regeneracion nerviosa), en comparacion con el extracto del Ejemplo comparativo 1 (de Dioscorea Rhizoma solo), el extracto del Ejemplo comparativo 2 (de Dioscorea nipponica solo) o los extractos de 10 los Ejemplos comparativos 3 a 10 (de mezclas de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica a otras proporciones en peso) y, por lo tanto, se pueden aplicar a composiciones farmaceuticas y a alimentos saludables para la prevencion y el tratamiento de la neuropatfa periferica diabetica.

A continuacion, se dara una descripcion de ejemplos ilustrativos, no limitantes, de formulaciones que contienen el 15 extracto de hierbas de una mezcla de Dioscorea Rhizoma y Dioscorea nipponica.

Ejemplo de formulacion 1. Preparacion de inyeccion

Extracto del Ejemplo 1: 100 mg

Metabisulfito de sodio: 3,0 mg

Metilparabeno: 0,8 mg

5

10

15

20

25

Propilparabeno 0,1 mg

Agua esteril para inyeccion cs

A una mezcla de los ingredientes, se anadio agua esteril hasta formar un volumen total de 2 ml, y se introdujo la solucion en una ampolla de 2 ml y se esterilizo, dando una inyeccion.

EJEMPLO DE FORMULACION 2: Preparacion de comprimido

Extracto del Ejemplo 1 200 mg Lactosa 100 mg

Almidon 100 mg

Estearato de Mg cs

Se mezclaron los ingredientes y se comprimieron en un comprimido usando un metodo de formacion de comprimidos.

EJEMPLO DE FORMULACION 3: Preparacion de capsula

Extracto del Ejemplo 1: 100 mg

Lactosa: 50 mg

Almidon: 50 mg

Talco: 2 mg

Estearato de Mg: cs

Se mezclaron los ingredientes y se introdujeron en una capsula de gelatina de acuerdo con un metodo tfpico de produccion de una capsula.

EJEMPLO DE FORMULACION 4: Preparacion de lfquido

Extracto del Ejemplo 1 1.000 mg Azucar 20 g

Isomerasa 20 g

Aroma de limon cs

Se anadio agua purificada hasta formar un volumen total de 100 ml

Se mezclaron los ingredientes anteriores, se introdujeron en un vial de color marron de 100 ml y se esterilizaron, obteniendose una formulacion lfquida.

Aunque se han desvelado las realizaciones preferidas de la presente invencion con fines ilustrativos, los expertos en la materia apreciaran que son posibles diversas modificaciones, adiciones y sustituciones, sin apartarse del alcance ni del esprntu de la invencion segun lo desvelado en las reivindicaciones que se adjuntan.

Claims

5

10

15

20

25

REIVINDICACIONES

1. Una composicion farmaceutica para su uso en la prevencion o el tratamiento de la neuropatia periferica diabetica, que comprende un extracto de una mezcla de Dioscorea Rhizoma.Dioscorea nipponica a 3,5:1 (p/p) como un principio activo, y un vehnculo farmaceuticamente aceptable, en la que Dioscorea Rhizoma es un rizoma fresco de Dioscorea batatas Decaisne o Dioscorea japonica Thunberg, o un rizoma fresco de Dioscorea batatas Decaisne o Dioscorea japonica Thunberg que se ha cocido al vapor y se ha secado.
2. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la neuropatfa periferica diabetica es una enfermedad desarrollada por al menos una causa seleccionada del grupo que consiste en distrofia, degeneracion y apoptosis de las celulas nerviosas.
3. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la neuropatfa periferica diabetica muestra un smtoma seleccionado del grupo que consiste en una sensacion de quemazon, un dolor punzante, molestias, una sensacion de malestar, perdida de la sensacion tactil, sensacion vibratoria o sensacion de temperatura, y una combinacion de las mismas.
4. Un alimento funcional para la salud para su uso en la prevencion o en la mejora de la neuropatfa periferica diabetica, que comprende un extracto de una mezcla de Dioscorea Rhizoma.Dioscorea nipponica a 3,5:1 (p/p), en el que Dioscorea Rhizoma es un rizoma fresco de Dioscorea batatas Decaisne o Dioscorea japonica Thunberg, o un rizoma fresco de Dioscorea batatas Decaisne o Dioscorea japonica Thunberg que se ha cocido al vapor y se ha secado.
5. La composicion de alimento funcional para la salud para su uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que el extracto se prepara en una forma seleccionada del grupo que consiste en un polvo, un granulo, un comprimido, una capsula, un jarabe y una bebida.