ES2583688T3 - FEN1 como marcador de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) - Google Patents

Abstract

Método in vitro para evaluar la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) en un sujeto humano, que comprende: a) determinar la concentración de proteína FEN1 en una muestra de suero, plasma o sangre completa, y b) comparar la concentración de proteína FEN1 determinada en la etapa (a) con una concentración de referencia de proteína FEN1, en la que una concentración de proteína FEN1 superior a una concentración de referencia es indicativa de EPOC.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

15

25

35

45

55

65

Tal como se utiliza en la presente memoria, cada uno de los términos siguientes presenta el significado asociado a los mismos en la presente sección.

Los artículos "un" y "una" se utilizan en la presente memoria para referirse a uno o a más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A título de ejemplo, "un marcador" se refiere a un marcador o a más de un marcador. El término "por lo menos" se utiliza para indicar que opcionalmente puede encontrarse presente uno

o más objetos adicionales.

La expresión "uno o más" se refiere a 1 a 50, preferentemente 1 a 20, resultando preferentes también 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 ó 15.

El término "marcador" o "marcador bioquímico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una molécula que debe utilizarse como diana para el análisis de una muestra de ensayo de un paciente. En una realización, son ejemplos de dichas dianas moleculares las proteínas o polipéptidos. Las proteínas o polipéptidos utilizados como marcador en la presente invención se contempla que incluyan variantes naturales de dichas proteínas, así como fragmentos de dichas proteínas o de dichas variantes, en particular fragmentos inmunológicamente detectables. Los fragmentos inmunológicamente detectables preferentemente comprenden por lo menos 6, 7, 8, 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos contiguos de dicho polipéptido marcador. El experto en la materia reconocerá que las proteínas liberadas por las células o que se encuentran presentes en la matriz extracelular pueden resultar dañadas, por ejemplo durante la inflamación, y que podrían resultar degradadas o cortadas formando dichos fragmentos. Determinados marcadores se sintetizan en una forma inactiva, que puede ser activada posteriormente mediante proteolisis. Tal como apreciará el experto en la materia, también pueden encontrarse presentes proteínas o fragmentos de las mismas como parte de un complejo. Dicho complejo también puede utilizarse como marcador en el sentido de la presente invención. Además, o alternativamente, un polipéptido marcador o una variante del mismo puede portar una modificación post-traduccional. Las modificaciones post-traduccionales preferentes son la glucosilación, la acilación y/o la fosforilación.

El término "marcaje" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier sustancia que es capaz de producir una señal mediante detección directa o indirecta.

Para la detección directa, el grupo de marcaje o marcaje adecuado para la utilización en la presente invención puede seleccionarse de entre cualesquiera grupos marcadores detectables conocidos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, cromógenos, fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (por ejemplo ésteres de acridinio o dioxetanos), compuestos electroquimioluminiscentes, catalizadores, enzimas, sustratos enzimáticos, pigmentos, pigmentos fluorescentes (por ejemplo fluoresceína, coumarina, rodamina, oxazina, resorufina, cianina y derivados de los mismos), partículas coloidales metálicas y no metálicas y partículas de látex polimérico orgánico. Otros ejemplos de grupos de marcaje son los complejos metálicos luminiscentes, tales como los complejos de rutenio o de europio; enzimas, por ejemplo los utilizados para ELISA y los isótopos radioactivos.

Los sistemas de detección indirecta comprenden, por ejemplo, que el reactivo de detección, por ejemplo el anticuerpo de detección, se marque con un primer elemento de una pareja de unión bioafín. Son ejemplos de parejas de unión adecuadas hapteno o antígeno/anticuerpo, biotina o análogos de biotina, tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina/avidina o estreptavidina, azúcar/lectina, ácido nucleico o análogo de ácido nucleico/ácido nucleico complementario y receptor/ligando, por ejemplo receptor de hormona esteroidea/hormona esteroidea. Los elementos de la primera pareja de unión preferentes comprenden hapteno, antígeno y hormona. Resultan especialmente preferentes haptenos como la digoxina y la biotina y los análogos de los mismos. El segundo componente de dicha pareja de unión, por ejemplo un anticuerpo, estreptavidina, etc., habitualmente se marca para permitir la detección directa, por ejemplo los marcajes indicados anteriormente.

La expresión "evaluación de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica" o "evaluación de la EPOC" se utiliza para indicar que el método según la presente invención solo o conjuntamente con otros marcadores o variables, por ejemplo, ayuda al médico a establecer o a confirmar la ausencia o la presencia de EPOC. El método resultará útil, por ejemplo, para establecer o confirmar la ausencia o la presencia de EPOC.

Un "marcador de EPOC" en el sentido de la presente invención es un marcador que, como marcador único, o en caso de que se combine con el marcador FEN1, añade información relevante en la evaluación de la EPOC a la cuestión diagnóstica investigada. La información se considera relevante o de valor aditivo en el caso de que, a una especificidad dada, la sensibilidad, o la especificidad a una sensibilidad dada, respectivamente, en la evaluación de la EPOC, pueda mejorarse mediante la inclusión de dicho marcador en un panel de marcadores (una combinación de marcadores) que ya comprende el marcador FEN1. Preferentemente, la mejora de la sensibilidad o especificidad, respectivamente, es estadísticamente significativa a un nivel de significación de p=0,05, 0,02, 0,01 ó inferior.

El término "muestra" o "muestra de ensayo" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una muestra biológica obtenida de un individuo para el propósito de la evaluación in vitro. En los métodos de la presente invención, la muestra o muestra del paciente puede comprender en una realización de la presente invención

imagen6

imagen7

15

25

35

45

55

65

Entre los fragmentos de anticuerpo monovalente se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los fragmentos Fab, Fab’-SH, anticuerpo de dominio único, Fv y scFv, tal como se proporciona posteriormente.

El término "anticuerpo" se utiliza en la presente memoria en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo los anticuerpos biespecíficos) formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos con la condición de que muestren la actividad biológica deseada. En determinadas realizaciones preferentes, el agente de unión específica es un anticuerpo o un fragmento monovalente de anticuerpo, preferentemente un fragmento monovalente derivado de un anticuerpo monoclonal.

Un anticuerpo “aislado” es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de investigación, diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y entre ellos pueden incluirse enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas realizaciones, el anticuerpo se purifica (1) a más de 95% en peso de anticuerpo según se determina mediante el método de Lowry y, en algunas realizaciones, a más de 99% en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal

o interna mediante la utilización de, por ejemplo, un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que no se encontrará presente por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo. Sin embargo, habitualmente el anticuerpo aislado se prepara mediante por lo menos una etapa de purificación.

Los "anticuerpos nativos" habitualmente son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y cada cadena ligera también presenta puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada presenta en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera presenta un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se encuentra alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se encuentra alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que algunos residuos aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada.

La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios aminoterminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede denominarse "VH". El dominio variable de la cadena ligera puede denominarse "VL". Estos dominios generalmente son las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas partes de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se encuentra distribuida uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables (RHV) en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden, cada uno, cuatro regiones FR, adoptando mayoritariamente una configuración de lámina beta, conectada mediante tres RHV, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las RHV en cada cadena se mantienen en estrecha proximidad gracias a las regiones FR y, con las RHV de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., National Institute of Health, Bethesda, MD, 1991). Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa (κ) y lambda (λ), según las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se dividen en clases diferentes. Existen cinco clases principales de inmunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunas de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulina son bien conocidas y se describen de manera general en, por ejemplo, Abbas et al., Cellular y Mol. Immunology, 4a ed., W.B. Saunders, Co., 2000. Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión de mayor tamaño, formada mediante asociación covalente o no covalente del anticuerpo con otra u otras proteínas o péptidos.

15

25

35

45

55

65

Las expresiones "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo tal como se definen posteriormente. Las expresiones en particular se refieren a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fc.

La expresión “fragmentos de anticuerpo” comprende una parte de un anticuerpo intacto, que preferentemente comprende la región de unión a antígeno del mismo. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen, los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento residual "Fc", una denominación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina rinde un fragmento F(ab')2 que presenta dos sitios de unión a antígeno y todavía es capaz de entrecruzarse con el antígeno.

Un fragmento "Fv" es un fragmento mínimo de anticuerpo que contiene un sitio de unión de antígeno completo. En una realización, una especie Fv de dos cadenas consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. En una especie Fv de cadena sencilla (scFv), puede unirse covalentemente un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera mediante un conector peptídico flexible, de manera que las cadenas ligera y pesada pueden asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la presente en una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres RHV de cada dominio variable interactúan definiendo un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente las seis RHV confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres RHV específicas para un antígeno) presenta la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque habitualmente a una afinidad más baja que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab contiene los dominios variables de las cadenas ligera y pesada y también el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos cuantos residuos al extremo carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente memoria para Fab' en la que el residuo o residuos de cisteína de los dominios cisteína portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se producen como parejas de fragmentos Fab' que presentan cisteínas de bisagra entre ellas. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en los que estos dominios se encuentran presentes en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido scFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de scFv, ver, por ejemplo, Pluckthuen A., en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (editores), Springer-Verlag, New York (1994), páginas 269-315.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo los fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante la utilización de un conector excesivamente corto para permitir el apareamiento los dos dominios en la misma cadena, se fuerza el apareamiento de los dominios con dominios complementarios de otra cadena y crea dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, la patente EP nº 404.097 y el documento nº WO 1993/01161; Hudson P.J. et al., Nat. Med. 9:129-134, 2003, y Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993. Los triacuerpos y tetracuerpos también se encuentran descritos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134, 2003.

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo las mutaciones naturales que pueden encontrarse presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador "monoclonal" caracteriza al anticuerpo como no formando una mezcla de anticuerpos discretos. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo monoclonal típicamente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en la que la secuencia polipeptídica de unión a diana se obtuvo mediante un procedimiento que incluye la selección de una secuencia polipeptídica de unión a única diana de entre una pluralidad de secuencias polipeptídicas. Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser la selección de un único clon de entre una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones fágicos o clones de ADN recombinante. Debe entenderse que una secuencia de unión a diana seleccionada puede alterarse adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad para la diana, para humanizar la secuencia de unión a diana, para mejorar su producción en

imagen8

15

25

35

45

55

En una realización adicional, se detecta la proteína FEN1 en un ensayo competitivo. En dicho formato de ensayo, se utiliza un agente de unión que se une específicamente a FEN1 de SEC ID nº 4. En una mezcla, la proteína FEN1 marcada que ha sido añadida a la mezcla y FEN1 comprendida en la muestra compiten para la unión al agente de unión específica. El grado de dicha competencia puede medirse siguiendo procedimientos estándares.

La concentración de la proteína FEN1 en muestras de ensayo puede determinarse in vitro utilizando un ELISA específico, tal como ya se ha indicado anteriormente. Utilizando dicho formato de ensayo, los inventores han demostrado que las muestras de pacientes ya diagnosticados de EPOC mediante métodos clásicos, por ejemplo espirometría, pueden distinguirse de las muestras de individuos aparentemente sanos. Se muestran resultados en la sección de ejemplos de la presente solicitud.

Los inventores de la presente invención inesperadamente han podido detectar la proteína FEN1 en una muestra de suero, plasma o sangre completa. Todavía más inesperadamente, han podido demostrar que la presencia de proteína FEN1 en dicha muestra de suero, plasma o sangre completa obtenida de un individuo puede correlacionarse con la EPOC. No resulta necesaria ninguna muestra de tejido y de biopsia para utilizar el marcador FEN1 en la evaluación de la EPOC. La medición del nivel de proteína FEN1 en (por ejemplo una alícuota pequeña) de una simple muestra de suero, plasma o sangre completa se considera muy ventajosa en el campo de la EPOC.

En una realización preferente, se pone en práctica el método según la presente invención con suero como material de muestra. En una realización preferente adicional, se pone en práctica el método según la presente invención con plasma como material de muestra. En una realización preferente adicional, se pone en práctica el método según la presente invención con sangre completa como material de muestra.

En una realización preferente adicional, la presente invención se refiere a la utilización de proteína FEN1 como molécula marcadora en la evaluación in vitro de la EPOC a partir de una muestra de suero, plasma o sangre completa obtenida de un individuo.

El escenario ideal para el diagnóstico sería una situación en la que un suceso o un proceso individual causaría la enfermedad respectiva, tal como, por ejemplo, en las enfermedades infecciosas. En todos los demás casos, el diagnóstico correcto puede resultar muy difícil, especialmente en el caso de que la etiología de la enfermedad no se comprenda completamente, tal como es el caso de la EPOC. Tal como apreciará el experto en la materia, ningún marcador bioquímico es diagnóstico con una especificidad de 100% y simultáneamente con una sensibilidad de 100% para una enfermedad multifactorial dada, tal como, por ejemplo, la EPOC. Por el contrario, se utilizan marcadores bioquímicos para evaluar con una determinada probabilidad o valor predictivo una cuestión diagnóstica subyacente, por ejemplo la presencia, ausencia o gravedad de una enfermedad. Por lo tanto, en el diagnóstico clínico rutinario, generalmente se consideran diversos síntomas clínicos y marcadores biológicos conjuntamente en la evaluación de una enfermedad subyacente. Al experto en la materia estará totalmente familiarizado con los métodos matemáticos/estadísticos que se utilizan rutinariamente para calcular el riesgo relativo o probabilidad para la cuestión diagnóstica que debe evaluarse. En la práctica clínica rutinaria, generalmente se consideran diversos síntomas clínicos y marcadores biológicos conjuntamente en el diagnóstico, tratamiento y control de la enfermedad subyacente.

Los pacientes de EPOC tradicionalmente se tratan con broncodilatadores o esteroides y se examinan mediante espirometría para reversibilidad de la obstrucción de las vías respiratorias. En el caso de que la reversibilidad sea inferior a 15% y en particular en el caso de que presenten una larga historia de tabaquismo, se clasificarían como pacientes de EPOC.

Los criterios de la ATS (American Thoracic Society) para el diagnóstico de la EPOC son los siguientes:

 proporción VEF1/CVF < 0,7

 VEF1 < 70% lo predicho, < 15% reversibilidad con agonista de B2 inhalado:

 prueba de 2 semanas con prednisolona oral-reversibilidad inferior a 15% en VEF1

 Historia de tabaquismo

VEF1 es el volumen de aire expulsado de los pulmones en un segundo, partiendo de una posición de máxima inspiración y realizando el sujeto el máximo esfuerzo. VEF1 (%) es el VEF1 expresado como porcentaje de la capacidad vital forzada (CVF). CVF es el volumen total de aire expulsado de los pulmones partiendo de una posición de máxima inspiración con el sujeto realizando el máximo esfuerzo. Puede medirse VEF1 utilizando un espirómetro para medir el volumen de aire expulsado en el primer segundo de espiración.

La clasificación espirométrica de la EPOC según la ATS (American Thoracic Society)/European Respiratory Society 2004, se muestra en la Tabla 1. El estadio 0 de EPOC de la ATS actualmente ya no se utiliza en el sistema de clasificación de la ATS.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tabla 1:

Estadio de la EPCO

Severidad VEF1/CVF postbroncodilatador % VEF1 pred

0

En riesgo# > 0,7 > 80%

I

EPOC leve ≤ 0,7 ≥ 80%

II

EPOC moderada ≤ 0,7 50%-80%

III

EPOC severa ≤ 0,7 30% -50%

IV

EPOC muy severa ≤ 0,7 < 30%

VEF1: volumen espiratorio forzado en un segundo; CVF: capacidad vital forzada; #: pacientes que fuman o han sido expuestos a contaminantes, presentan tos, esputo o disnea, presentan una historia familiar de enfermedad respiratoria.

En la evaluación de la EPOC, la proteína marcadora FEN1 resultará ventajosa en uno o más de los aspectos siguientes: evaluación, cribado, estadificación de enfermedad, seguimiento de la progresión de la enfermedad, pronóstico, guía de la terapia y seguimiento de la respuesta a la terapia.

Las áreas preferentes de relevancia diagnóstica en la evaluación de un individuo que se sospecha o que se conoce que presenta EPOC son el cribado, la estadificación de la enfermedad, el seguimiento de la progresión de la enfermedad y el seguimiento de la respuesta a la terapia.

Cribado (evaluación de si los individuos presentan riesgo de desarrollar EPOC o que presentan EPOC):

Se define "cribado" como la aplicación sistemática de un ensayo para identificar individuos, por ejemplo individuos de riesgo, para indicadores de una enfermedad, por ejemplo la presencia de EPOC. Preferentemente, la población de cribado está compuesta de individuos que es conocido que presentan un riesgo superior al medio de sufrir EPOC. Por ejemplo, la población de cribado para la EPOC está compuesta de individuos que es conocido que presentan un riesgo superior al medio de sufrir EPOC, tal como fumadores y ex-fumadores.

El cribado en el sentido de la presente invención se refiere a la evaluación no sesgada de individuos respecto al riesgo de los mismos de desarrollar EPOC. En una realización, el método según la presente invención se utiliza con fines de cribado, es decir, se utiliza para evaluar sujetos humanos sin un diagnóstico previo de EPOC mediante: a) la determinación de la concentración de la proteína FEN1 en una muestra de suero, plasma o sangre completa, y b) la comparación de la concentración de proteína FEN1 determinada en la etapa (a) con una concentración de referencia de proteína FEN1, en la que una concentración de proteína FEN1 superior a una concentración de referencia es indicativa de EPOC.

La medición de la proteína FEN1 ayudará al médico a evaluar la presencia o la ausencia de EPOC en un individuo que se sospecha que presenta EPOC.

En una realización, la presente invención se refiere a un método in vitro para evaluar la presencia o ausencia de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) en un sujeto humano, que comprende: a) determinar la concentración de la proteína FEN1 en una muestra de suero, plasma o sangre completa, y b) comparar la concentración de proteína FEN1 determinada en la etapa (a) con una concentración de referencia de proteína FEN1, en la que una concentración de proteína FEN1 superior a una concentración de referencia es indicativa de EPOC.

En una realización, la presente invención se refiere a un método in vitro para evaluar la presencia o ausencia de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) en un sujeto humano, que comprende: a) determinar la concentración de la proteína FEN1 en una muestra de suero, plasma o sangre completa, y b) comparar la concentración de proteína FEN1 determinada en la etapa (a) con una concentración de referencia de proteína FEN1, y c) evaluar la presencia o ausencia de EPOC basándose en la comparación de la etapa (b), en la que una concentración de proteína FEN1 superior a una concentración de referencia es indicativa de la presencia de EPOC.

En una realización, la presente invención se refiere a un método in vitro para evaluar la presencia o ausencia de EPOC en un sujeto humano, comprendiendo el método: a) determinar la concentración de la proteína FEN1 en una muestra de suero, plasma o sangre completa, y b) comparar la concentración de proteína FEN1 determinada en la etapa (a) con una concentración de referencia de proteína FEN1 establecida en una población de referencia, en la que una concentración de proteína FEN1 superior a una concentración de referencia es indicativa de la presencia de EPOC. En una realización, la presente invención se refiere a un método in vitro para evaluar la presencia o ausencia de EPOC en un sujeto humano, comprendiendo el método: a) determinar la concentración de la proteína FEN1 en una muestra de suero, plasma o sangre completa, y b) comparar la concentración de proteína FEN1 determinada en la etapa (a) con un valor de referencia de proteína FEN1 establecida en una población de referencia, en la que una concentración de proteína FEN1 inferior al valor de referencia es indicativa de la ausencia de EPOC.

15

25

35

45

55

En una realización adicional, la presente invención se refiere a la utilización de la proteína FEN1 en la evaluación in vitro de EPOC en una muestra de suero, plasma o sangre completa, en la que una concentración de proteína FEN1 superior a una concentración de referencia para la proteína FEN1 es indicativa de EPOC.

En una realización preferente, dicha muestra según la utilización se selecciona de entre el grupo que consiste de suero, plasma y sangre completa.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a la utilización de la proteína FEN1 en la evaluación in vitro de la EPOC en una muestra de suero, plasma o sangre completa, en la que una concentración de proteína FEN1 superior a una concentración de referencia para la proteína FEN1 en una muestra de suero, plasma o sangre completa es indicativa de la presencia de EPOC.

Una realización de la presente invención se refiere al cribado de una población con el fin de distinguir entre individuos que probablemente no presentan EPOC y los individuos que probablemente presentan EPOC. A continuación el último grupo de individuos podría someterse a procedimientos diagnósticos adicionales, por ejemplo mediante pruebas de función pulmonar, espirometría u otros medios adecuados.

En una realización, el método in vitro según la presente invención se caracteriza porque tiene lugar la evaluación de la proteína FEN1 para clasificar un paciente según presente riesgo de EPOC para tomar decisiones clínicas, particularmente para el tratamiento posterior utilizando medicación para el tratamiento o terapia de la EPOC, y para el tratamiento o la terapia de infección/enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias y el pulmón, así como para el control de la terapia de tratamiento antibiótico o de anticuerpos terapéuticos.

En una realización, la presente invención se refiere a un método in vitro para evaluar si un individuo presenta riesgo de desarrollar EPOC, comprendiendo las etapas de: a) determinar la concentración de la proteína FEN1 en una muestra de suero, plasma o sangre completa, y b) evaluar dicho riesgo del individuo de desarrollar EPOC mediante la comparación de la concentración de proteína FEN1 determinada en la etapa (a) con una concentración de referencia de proteína FEN1, en la que una concentración de proteína FEN1 superior a una concentración de referencia es indicativa para el individuo de que presenta riesgo de desarrollar EPOC.

Pronóstico

Los indicadores pronósticos pueden definirse como características clínicas, patológicas o bioquímicas de los pacientes de EPOC que predicen con una determinada probabilidad el resultado de la enfermedad. Su utilización principal es en la ayuda a la planificación racional del control de un paciente, es decir, para evitar el infratratamiento de una enfermedad agresiva o el sobretratamiento de una enfermedad indolente, respectivamente.

Debido a que el nivel de proteína FEN1 por sí solo contribuye significativamente a la diferenciación de los pacientes de EPOC respecto a los controles sanos o a otras enfermedades del pulmón, por ejemplo asma, bronquitis, fibrosis pulmonar y tuberculosis, preferentemente para diferenciar la EPOC del asma, debe esperarse que ayudará a evaluar el pronóstico de los pacientes que sufren de EPOC. La concentración de proteína FEN1 probablemente se combinará con los resultados de las pruebas de función pulmonar o espirometría.

Diferenciación de EPOC y asma

En una realización adicional, el método según la presente invención se utiliza para diferenciar la EPOC de otros tipos de enfermedad pulmonar, preferentemente el asma.

También resulta preferente utilizar la proteína FEN1 para diferenciar la EPOC de otros tipos de enfermedad pulmonar, por ejemplo el asma, la bronquitis, la fibrosis pulmonar y la tuberculosis, preferentemente para diferenciar la EPOC del asma. Inesperadamente los inventores han encontrado que la utilización de una combinación de marcadores de un marcador específico de EPOC, preferentemente FEN1, y un marcador de inflamación seleccionado de entre el grupo que consiste de PRC, interleuquina-6, amiloide sérico A, S100 y selectina-E, puede conducir a diferenciar entre la EPOC y otras enfermedades inflamatorias del pulmón, por ejemplo el asma y la inflamación aguda o crónica del pulmón, respectivamente. Los resultados experimentales para la proteína FEN1 y la proteína PRC se muestran en la sección de ejemplos.

Seguimiento de la progresión de la enfermedad

Actualmente resulta muy difícil predecir con una probabilidad razonable si un paciente diagnosticado con EPOC presenta un estado más o menos estable o si la enfermedad progresará o no.

La progresión de la enfermedad, es decir de la EPOC, puede evaluarse mediante el seguimiento in vitro de la concentración de la proteína FEN1 en las muestras de ensayo, especialmente extrayendo una o más muestras

imagen9

15

25

35

45

55

65

boosting/bagging), los modelos lineales generalizados (por ejemplo la regresión logística), los métodos basados en los componentes principales (por ejemplo el SIMCA), los modelos aditivos generalizados, los métodos basados en lógica difusa, y los métodos basados en redes neuronales y los algoritmos genéticos. El experto en la materia no tendrá ninguna dificultad en seleccionar un método estadístico apropiado para evaluar una combinación de marcadores de la presente invención y obtener de esta manera un algoritmo matemático apropiado. En una realización, el método estadístico utilizado para obtener el algoritmo matemático utilizado en la evaluación de la EPOC se selecciona de entre AD (es decir, análisis discriminante lineal, cuadrático o regularizado), los métodos de núcleo (es decir, SVM), los métodos no paramétricos (por ejemplo los clasificadores del vecino k más próximo), PLC (cuadrados mínimos parciales), los métodos basados en árboles (por ejemplo regresión lógica, CART, métodos de bosque aleatorio, métodos de Boosting) o los modelos lineales generalizados (por ejemplo la regresión logística). Pueden encontrarse detalles referentes a dichos métodos estadísticos en las referencias siguientes: Ruczinski I. et al, J. of Computational and Graphical Statistics, 12:475-511, 2003; Friedman J. H., J. of the American Statistical Association 84:165-175, 1989; Hastie T. et al., The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics, 2001; Breiman L. et al., Classification and regression trees, California, Wadsworth International Group, California, 1984; Breiman L., Random Forests, Machine Learning, 45:5-32, 2001; Pepe M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28, 2003; y Duda R. O. et al., Pattern Classification, Wiley Interscience, 2a edición, 2001.

Es una realización de la invención la utilización de un corte multivariante optimizado de la combinación subyacente de marcadores biológicos y para discriminar el estado A del estado B, por ejemplo normales e individuos en riesgo de EPOC, pacientes de EPOC que responden a la terapia y fracasos de la terapia, pacientes que presentan una inflamación aguda de pulmón y pacientes de EPOC, pacientes de EPOC que muestran progresión de la enfermedad y pacientes de EPOC que no muestran progresión de la enfermedad, respectivamente.

El área bajo la curva de receptor-operador (=AUC) es un indicador del rendimiento o precisión de un procedimiento diagnóstico. La precisión de un método diagnóstico se describe mejor a partir de sus características operativas del receptor (COR) (ver especialmente Zweig M.H. y Campbell G., Clin. Chem. 39:561-577, 1993). El gráfico de COR es un gráfico de todas las parejas de sensibilidad/especificidad resultantes de variar continuamente el umbral de decisión a lo largo del intervalo completo de datos observados.

El rendimiento clínico de un ensayo de laboratorio depende de su precisión diagnóstica, o de la capacidad de clasificar correctamente los sujetos en subgrupos clínicamente relevantes. La exactitud diagnóstica mide la capacidad de un ensayo de distinguir correctamente dos condiciones diferentes de los sujetos investigados. Dichas condiciones son, por ejemplo, salud y enfermedad o progresión de la enfermedad frente a ausencia de progresión de la enfermedad.

En cada caso, el gráfico de COR ilustra el solapamiento entre las dos distribuciones a partir de un gráfico de la sensibilidad frente a 1-especificidad para el intervalo completo de umbrales de decisión. En el eje y se encuentra la sensibilidad, o la fracción de positivos verdaderos [definida como (número de resultados de ensayo positivos verdaderos)/(número de positivos verdaderos + números de resultados de ensayo falsos negativos)]. Lo anterior también se ha denominado positividad en presencia de una enfermedad o condición. Se calcula únicamente a partir del subgrupo afectado. En el eje x se encuentra la fracción falsa positiva, o 1-especificidad [definida como (número de resultados falsos positivos)/(número de negativos verdaderos + número de resultados falsos positivos)]. Es un índice de la especificidad y se calcula por completo a partir del subgrupo no afectado. Debido a que las fracciones positivas verdaderas y falsas positivas se calculan completamente por separado, mediante la utilización de los resultados de ensayo de dos subgrupos diferentes, el gráfico de ROC es independiente de la prevalencia de la enfermedad en la muestra. Cada punto del gráfico de ROC representa una pareja de sensibilidad/1-especificidad correspondiente a un umbral de decisión particular. Un ensayo con discriminación perfecta (sin solapamiento de las dos distribuciones de los resultados) presenta un gráfico de COR que pasa a través de la esquina superior izquierda, mientras que la fracción positiva verdadera es 1,0 ó 100% (sensibilidad perfecta) y la fracción de falsos positivo es 0 (especificidad perfecta). El gráfico teórico para un ensayo sin discriminación (distribuciones idénticas de los resultados de los dos grupos) es una línea diagonal a 45º desde la esquina inferior izquierda y la esquina superior derecha. La mayoría de los gráficos se encuentra entre ambos extremos (en el caso de que el gráfico de ROC se encuentre completamente debajo de la diagonal a 45º, se soluciona fácilmente invirtiendo el criterio de "positividad" de "mayor que" a "menor que", o viceversa). Cualitativamente, cuanto más próximo se encuentre el gráfico a la esquina superior izquierda, mayor será la exactitud global del ensayo.

Un modo preferente de cuantificar la precisión diagnóstica de un ensayo de laboratorio es expresar su rendimiento mediante un único número. La medida global más común es el área bajo el gráfico de COR (AUC). Convencionalmente este área en todos los casos es ≥0,5 (en el caso de que no se cumpla esta condición, puede revertirse la regla de decisión para que sí se cumpla). Los valores comprendidos entre 1,0 (separación perfecta de los valores de ensayo de los dos grupos) y 0,5 (sin ninguna diferencia aparente entre las distribuciones de los dos grupos de valores de ensayo). El área no sólo depende de una parte particular del gráfico, tal como el punto más próximo a la diagonal o la sensibilidad a una especificidad del 90%, sino del gráfico completo. Ésta es una expresión descriptiva cuantitativa de la proximidad del gráfico de ROC a un gráfico perfecto (área=1,0).

imagen10

15

25

35

45

55

65

por la IL-1, ya que la IL-1 puede inducir la síntesis de IL-6 por parte de las células de Kupffer en los sinusoides hepáticos. La concentración plasmática normal de CRP es <3 mg/ml (30 nM) en el 90% de la población sana y <10 mg/ml (100 nM) en el 99% de los individuos sanos. Las concentraciones plasmáticas de CRP pueden medirse, por ejemplo, mediante un inmunoensayo. Las concentraciones plasmáticas de CRP pueden medirse, por ejemplo, mediante formatos de ensayo homogéneos o ELISA.

El amiloide A sérico (=AAS) es una proteína de fase aguda de bajo peso molecular, de 11,7 kDa. Es sintetizada predominantemente por el hígado en respuesta a la estimulación por IL-6, IL-6 o TNF-α y participa en la regulación de la respuesta inmunológica dependiente de las células T. En los sucesos agudos la concentración de la AAS se incrementa hasta 1.000 veces, alcanzando un miligramo por mililitro. Se utiliza para realizar un seguimiento de la inflamación en enfermedades tan diversas como la fibrosis quística, el rechazo del injerto renal, traumatismos o infecciones. En la artritis reumatoide se ha utilizado en determinados casos como sustituto de la CRP, aunque el SAA todavía no está tan ampliamente aceptado.

Las proteínas S100 forman una familia constantemente creciente de proteínas ligantes de Ca2+ que actualmente incluye más de 20 miembros. La estructura fisiológicamente relevante de las proteínas S100 es un homodímero, aunque algunas también pueden formar heterodímeros entre sí, por ejemplo S100A8 y S100A9. Las funciones intracelulares abarcan desde la regulación de la fosforilación de las proteínas, las actividades enzimáticas, la dinámica del citoesqueleto y la participación en la proliferación y diferenciación celulares. Debido a que algunas proteínas S100 también son liberadas por las células, también se han descrito funciones extracelulares, por ejemplo la supervivencia neuronal, la proliferación de los astrocitos, la inducción de la apoptosis y la regulación de los procesos inflamatorios. S100A8, S100A9, y los heterodímeros S100A8/A9 y S100A12 se han observado en la inflamación, respondiendo S100A8 a la inflamación crónica, mientras que S100A9, S100A8/A9 y S100A12 se encuentran incrementadas en la inflamación aguda. Se ha asociado S100A8, S100A9, S100A8/A9 y S100A12 a diferentes enfermedades con componentes inflamatorios, incluyendo algunos cánceres, el rechazo del aloinjerto renal, la colitis y, notablemente, con la AR (Burmeister G. y Gallacchi G., Inflammopharmacology 3:221-230, 1995; Foell D. et al., Rheumathology 42:1383-1389, 2003).

La selectina sE (molécula-1 de adhesión leucocitaria endotelial soluble, ELAM-1, por sus siglas en inglés) es una glucoproteína transmembranal de tipo I de 115 kDa que se expresa únicamente sobre las células endoteliales y sólo tras la activación por citoquinas inflamatorias (IL-1β, FNT-α) o endotoxinas. La selectina-E de superficie celular es un mediador de la unión de los leucocitos rodantes al endotelio, una etapa esencial en la extravasación de los leucocitos en el sitio de inflamación, desempeñando de esta manera un papel importante en la respuesta inflamatoria localizada. La selectina-E soluble se observa en la sangre de los individuos sanos, probablemente surgida del corte proteolítico de la molécula expresada en superficie. Los niveles elevados de selectina sE en suero se han informado bajo una diversidad de condiciones patológicas (Gearing A.J. y Hemingway I., Ann. N.Y. Acad. Sci. 667:324-331, 1992).

Una matriz es una colección de marcadores individuales localizables. Dichos marcadores pueden ser espacialmente direccionables, tales como matrices contenidos en placas de microtitulación o impresos sobre superficies planas en las que cada marcador se encuentra presente en coordenadas X e Y diferentes. Alternativamente, los marcadores pueden ser direccionables basándose en etiquetas, perlas, nanopartículas o propiedades físicas. Puede prepararse una matriz biochip según los métodos conocidos por el experto ordinario en la materia (ver, por ejemplo, la patente US nº 5.807.522; Robinson W.H. et al., Nat. Med. 8:295-301, 2002; Robinson W.H. et al., Arthritis Rheum. 46 (2002) 885-893). El término "matriz" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier ensayo inmunológico con múltiples marcadores direccionables. Un matriz biochip, también conocido por el experto en la materia como micromatriz, es una forma miniaturizada de una matriz.

Los términos "chip", "biochip", "chip de polímero" o "chip de proteína" se utilizan intercambiablemente y se refieren a una colección de un gran número de sondas, marcadores o marcadores bioquímicos dispuestos sobre un sustrato compartido que podría ser una parte de una oblea de silicio, una tira de nilón, una tira de plástico o un portaobjetos de vidrio.

Una "matriz", "macromatriz" o "micromatriz" es una colección deliberadamente creada de sustancias, tales como moléculas, marcadores, aberturas, microbobinas, detectores y/o sensores, unidos o fabricados sobre un sustrato o superficie sólida, tal como vidrio, plástico, chip de silicio u otro material que forma una matriz. Las matrices pueden utilizarse para medir los niveles de gran número, por ejemplo decenas, miles o millones, de reacciones o combinaciones simultáneamente. Una matriz puede contener además un número reducido de sustancias, por ejemplo una, unas cuantas o una docena. Las sustancias en la matriz pueden ser idénticas o diferentes. La matriz puede adoptar una diversidad de formatos, por ejemplo bibliotecas de moléculas solubles, bibliotecas de moléculas inmovilizadas, bibliotecas de anticuerpos inmovilizados, bibliotecas de compuestos anclados en perlas de resina, chips de sílice u otros soportes sólidos. La matriz puede ser una macromatriz o una micromatriz, según el tamaño de las almohadillas en la matriz. Una macromatriz generalmente contiene tamaños de almohadilla de aproximadamente 300 micrómetros o mayores y puede obtenerse una imagen fácilmente mediante escáners de gel y de filtro. Una micromatriz generalmente contendría tamaños de almohadilla inferiores a 300 micrómetros.

imagen11

15

25

35

45

55

65

SEC ID nº 6 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína seprasa humana (base de datos SwissProt, número de acceso: Q12884).

SEC ID nº 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína DPPIV humana (base de datos SwissProt, número de acceso: P27487). SEC ID nº 8 Cebador directo. SEC ID nº 9 Cebador inverso (SEC ID nº 10 extensión peptídica N-terminal.

Ejemplo 1

población de estudio de EPOC

Fuentes de muestras de suero:

Con el fin de identificar las proteínas específicas de EPOC como potenciales marcadores diagnósticos de EPOC, se obtuvieron muestras de suero de pacientes bien caracterizados con EPOC (sistema de clasificación de la ATS según la Tabla 1) en un estudio multicéntrico nacional. Se llevó a cabo una espirometría en cada donante de muestras. Se documentó la función pulmonar, otras pruebas diagnósticas así como el motivo para la remisión, el diagnóstico y las comorbilidades en un formulario de informe de caso (FIC). Las muestras de EPOC se evaluaron en comparación con muestras de control obtenidas de los grupos de control 1 a 4, tal como se muestra en la Tabla 2.

Preparación de muestras de suero:

Se introdujeron muestras de suero en un tubo de suero y se dejó que coagulasen durante como mínimo 60 minutos y hasta 120 minutos, a temperatura ambiente. Tras la centrifugación (10 min., 2.000g), se dividió el sobrenadante en alícuotas de 1 ml y se congelaron a -70ºC. Antes de las mediciones se descongelaron las muestras, se dividieron nuevamente en alícuotas de volumen más pequeño, apropiado para los ensayos de prototipo y de referencia y se congelaron nuevamente. Las muestras se descongelaron inmediatamente antes del análisis. Por lo tanto, cada muestra en el panel se sometió a únicamente dos ciclos de congelación-descongelación antes de las mediciones.

Ejemplo 2.1

Generación de anticuerpos contra la proteína marcadora FEN1

Se generó anticuerpo policlonal contra la proteína FEN1 marcadora de cáncer pulmonar para la utilización posterior del anticuerpo en la medición de los niveles en suero, plasma y sangre de FEN1 mediante ensayos de inmunodetección, por ejemplo mediante transferencia western y ELISA.

Expresión de proteínas recombinantes en E. coli:

Con el fin de generar anticuerpos contra FEN1, se produjo el antígeno recombinante en E. coli: Por lo tanto, se amplificó por PCR la región codificante de FEN1 a partir del clon de ADNc de longitud completa obtenido del German Resource Center for Genome Research (RZPD, Berlín, Alemania) utilizando los cebadores siguientes:

Cebador directo (SEC ID nº 8):

5’-cacacacaattgattaaagaggaaattaactATGAGAGGATCGCATCACCAT CACCATCACATTGAAGGCCGT-GGAATTCAAGGCCTGGCC-3’ (el sitio MunI se encuentra subrayado; los nucleótidos codificantes se muestran en mayúsculas).

Cebador inverso (SEC ID nº 9):

5’-acgtacgtaagcttTCATTATTTTCCCCTTTTAAACTTC-3’ (el sitio HindIII se encuentra subrayado; los nucleótidos codificantes se muestran en mayúsculas).

El cebador directo muestra (aparte de los sitios MunI de clonación y de unión ribosómica) los oligonucleótidos codificantes de una extensión peptídica N-terminal MRGSHHHHHHIEGR (SEC ID nº 10) fusionado en el mismo marco en el extremo 5' del gen FEN 1. El fragmento de PCR digerido con MunI/HindIII se liga en el vector pQE80L (Qiagen, Hilden, Alemania). A continuación, se transforman células competentes E. coli XL1-blue con el plásmido generado. Tras el análisis de secuencias, las células competentes E. coli C600 se transforman con el plásmido generado para la expresión inducible con IPTG bajo el control del promotor de T5 de la serie de vectores pQE siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para la purificación de la proteína de fusión MRGSHHHHHHIEGR-FEN1, se peletizó mediante centrifugación 1 litro de un cultivo bacteriano inducido durante la noche y el pellet celular se resuspendió en tampón de lisis (fosfato sódico 20 mM, pH 7,4, cloruro sódico (NaCl) 500 mM). Las células se fragmentaron en una prensa francesa con una

presión de 1.500 bar. El material insoluble se peletizó mediante centrifugación (25.000 g, 15 min., 4ºC) y el sobrenadante se hizo pasar por una columna de afinidad de Ni-ácido nitriloacético (Ni-NTA). La columna se lavó con varios volúmenes de lecho de tampón de lavado (tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM, imidazol 20 mM). Finalmente, el antígeno unido se eluyó utilizando el tampón de lavado con un gradiente lineal de imidazol

5 20 mM-500 mM, las fracciones que contenían antígeno (7 ml cada una) se identificaron a DO280 en un detector de UV. Se agruparon las fracciones que contenían antígeno, se dializaron frente a tampón de almacenamiento (HEPES 75 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, sacarosa al 6,5% (p/v)) y se almacenaron a 4ºC o a -80ºC, respectivamente.

10 Generación de inmunogenes de péptido para la inmunización:

Para generar anticuerpos policlonales específicos para FEN1, se identificaron las secuencias de péptido que no mostraban una homología significativa respecto a otras proteínas humanas conocidas. Se comparó la secuencia de aminoácidos de FEN1 con el banco de datos de proteínas humanas disponible en el Swiss Institute of Bioinformatics

15 utilizando el software Blast. La secuencia de aminoácidos 260-273 no mostraba homologías significativas respecto a otras proteínas humanas y por lo tanto se seleccionó para generar anticuerpos específicos para FEN1. Se sintetizó la secuencia respectiva y se conjugó químicamente con HLA (=hemocianina de lapa americana) con el fin de obtener un inmunogén para la inmunización.

20 Generación de anticuerpos policlonales:

a) Inmunización

Para la inmunización, se preparó una emulsión fresca de la solución de proteína (100 μg/ml de proteína SCRN1 ó

25 500 μg/ml de HLA acoplada con un péptido entre los aminoácidos 260 a 273 de FEN1) y adyuvante completo de Freund en una proporción 1:1. Se inmunizó cada conejo con 1 ml de la emulsión los días 1, 7, 14 y 30, 60 y 90. Se extrajo sangre y el suero anti-FEN1 resultante se utilizó para experimentos adicionales tal como se describe en los Ejemplos 3 y 4.

30 b) Purificación de IgG (inmunoglobulina G) procedente de suero de conejo mediante precipitación secuencial con ácido caprílico y sulfato amónico

Se diluyó un volumen de suero de conejo con 4 volúmenes de tampón acetato (60 mM, pH 4,0). Se ajustó el pH a 4,5 con base Tris 2 M. Se añadió gota a gota ácido caprílico (25 µl/ml de muestra diluida) bajo agitación vigorosa.

35 Tras 30 minutos, la muestra se centrifugó (13.000 x g, 30 minutos, 4ºC), se descartó el pellet y se recogió el sobrenadante. Se ajustó el pH del sobrenadante a 7,5 mediante la adición de base Tris 2 M y se filtró (0,2 μm).

Se precipitó la inmunoglobulina en el sobrenadante bajo agitación vigorosa mediante la adición gota a gota de una solución 4 M de sulfato amónico hasta una concentración final de 2 M. Las inmunoglobulinas precipitadas se

40 recogieron mediante centrifugación (8.000 x g, 15 minutos, 4ºC).

Se descartó el sobrenadante. Se disolvió el pellet en NaH2PO4/NaOH 10 mM, pH 7,5, NaCl 30 mM y se dializó exhaustivamente. Se centrifugó el dializado (13.000 x g, 15 minutos, 4ºC) y se filtró (0,2 µm).

45 Biotinilación de IgG policlonal de conejo:

Se llevó la IgG policlonal de conejo a 10 mg/ml en NaH2PO4 10 mM/NaOH, pH 7,5, NaCl 30 mM. Por cada ml de solución de IgG se añadieron 50 µl de biotín-N-hidroxisuccinimida (3,6 mg/ml en DMSO). Tras 30 minutos a temperatura ambiente, la muestra se cromatografió en Superdex 200 (NaH2PO4 10 mM/NaOH, pH 7,5, NaCl 30

50 mM). Se recogieron las fracciones que contenían IgG biotinilada. Los anticuerpos monoclonales se biotinilaron siguiendo el mismo procedimiento.

Digoxigenilación de IgG policlonal de conejo:

55 Se llevó la IgG policlonal de conejo a 10 mg/ml en NaH2PO4 10 mM/NaOH, pH 7,5, NaCl 30 mM. Por cada ml de solución de IgG, se añadieron 50 μl de N-hidroxisuccinimida-éster de ácido digoxigenín-3-O-metilcarbonil-εaminocaproico (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania, nº de cat. 1 333 054) (3,8 mg/ml en DMSO). Tras 30 minutos a temperatura ambiente, la muestra se cromatografió en Superdex 200 (NaH2PO4 10 mM/NaOH, pH 7,5, NaCl 30 mM). Se recogieron las fracciones que contenían IgG digoxigenilada. Los anticuerpos monoclonales se

60 marcaron con digoxigenina siguiendo el mismo procedimiento.

imagen12

imagen13

imagen14

Claims (1)

1. imagen1