ES2584317T3 - Promotores preferidos del cámbium/xilema y usos de los mismos - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 4 que tiene la capacidad de iniciar, en una planta, la transcripción de un gen de una manera preferida de tejido de xilema y cámbium.
Description
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y abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). Los casetes de expresión pueden incorporarse de manera estable en los genomas de las plantas mediante transformación mediada por Agrobacterium (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:4803-4807) o mediante el método biobalístico (Klein et al. (1987) Nature. 327:70-73).
Todos los términos técnicos que se utilizan en el presente documento son términos comúnmente usados en bioquímica, biología molecular y agricultura, y un experto habitual en la materia, a la cual pertenece la presente invención, los conoce. Estos términos técnicos pueden encontrarse en: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., vol. 1-3, ed. Sambrook y Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2001; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience, Nueva York, 1988 (con actualizaciones periódicas); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 5th ed., vol. 1-2, ed. Ausubel et al., John Wiley y Sons, Inc., 2002; Genome Analysis: A Laboratory Manual, vol. 1-2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997. En el presente documento se describen métodos que implican técnicas de biología vegetal y se describen con detalle en tratados de metodología, tales como Methods in Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1995. Se describen diversas técnicas que usan PCR, por ejemplo, en Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, 1990 y en Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003. Los pares de cebadores de PCR pueden proceder de secuencias conocidas usando programas informáticos diseñados para ese propósito (por ejemplo, Primer, versión 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Se analizan métodos de síntesis química de ácidos nucleicos, por ejemplo, en Beaucage y Caruthers (1981) Tetra. Lett. 22:1895-1862 y en Matteucci y Caruthers (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos específicos. Los ejemplos se proporcionan únicamente como ilustración y no debe considerarse que limitan, de ningún modo, el ámbito o contenido de la invención.
EJEMPLO 1
Perfil de expresión de genes que se expresan preferentemente en el Cámbium/Xilema
Las etiquetas de secuencia expresada (EST) de Populus sp se agruparon usando el programa CAP3 (Huang and Madan (1999) Genome Res. 9:868-877). Dichas EST se obtuvieron de bibliotecas que representaban los siguientes tejidos: brote apical, corteza, cámbium, semilla, xilema, hoja y raíz. El conjunto de grupos así generados se investigó para los grupos compuestos por al menos el 90 % de las EST de bibliotecas que representaban tejidos de xilema y cámbium de Populus. Se seleccionaron 12 grupos basándose en su nivel de expresión alto y preferido en el cámbium y/o xilema de Populus. Después, se realizó una búsqueda con BLASTX frente a la base de datos del GenBank no redundante con cada uno de los doce grupos, y se llegó a la conclusión de que representaban secuencias expresadas de los siguientes genes: sacarosa sintasa (SuSy), alfatubulina (TUB), proteína arabinogalactánica (ARAB), ácido cafeico 3-O-metiltrasferasa (COMT), cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD), cinamato 4-hidroxilasa (C4H), cinamoil CoA reductasa (CCR), ferulato-5-hidroxilasa (F5H), sinapil alcohol deshidrogenasa (SAD), UDP-D-glucuronato carboxi-liasa (UDP), proteína de transferencia de lípidos (LTP) y ag-13 (AG13). Las Figuras 2 y 3 muestran el perfil de expresión en diversos tejidos de Populus para cada uno de los grupos que representan los genes cuyos promotores se desvelan en el presente documento. La serie de histogramas en las Figuras 2 y 3 representan finalmente la abundancia relativa de cada gen en genotecas de ADNc que representan los tejidos anteriormente mencionados (brote apical, corteza; cámbium, semilla, xilema, hoja y raíz). Por tanto, los histogramas componen un conjunto de datos de expresión digitales que es una aproximación del nivel de expresión relativa de los doce genes cuyos promotores se desvelan en el presente documento.
EJEMPLO 2
Aislamiento de secuencias promotoras
Se realizó BLASTN para cada uno de los doce grupos frente a las secuencias genómicas de Populus trichocarpa disponibles en el Joint Genome Institute US Department of Energy como parte del "Proyecto de Secuenciación del Genoma de Populus" (http://genome.jgi-psf.org/poplar0/poplar0.info.html). Las regiones de nucleótidos seleccionadas de cada grupo, correspondientes a supuestos exones, se usaron como secuencias conductoras en la recuperación de lecturas de secuencia genómica que comprendían la región de inicio de la transcripción y secuencias promotoras aguas arriba adyacentes. Estas lecturas genómicas se ensamblaron usando el programa PHRAP (Gordon et al. (1998) Genome Res. 8:195-202) para obtener un cóntigo que incluía aproximadamente de 700 a 3.500 nucleótidos de la supuesta región promotora aguas arriba desde el punto de inicio de la transcripción (+1 nucleótido, que correspondía al inicio del ARNm respectivo). Se llegó a la conclusión de que estos cóntigos, que contenían las regiones promotoras de cada uno de los genes que codifican los ARNm representados por los doce grupos, se expresaban preferentemente en los tejidos del cámbium y/o xilema de Populus. Estas doce regiones
8
promotoras corresponden a las secuencias desveladas en el presente documento como SEQ ID NOS: 1-12. Para el aislamiento de regiones promotoras específicas, se diseñaron pares de promotores específicos de genes (normalmente de una longitud de 30 nt) de las secuencias de los cóntigos promotores descritos anteriormente, para ampliar por PCR un fragmento de 700 a 3.500 nucleótidos desde la región promotora de cada uno de los doce
5 genes cuyas secuencias promotoras se desvelan en el presente documento. La primera ronda de PCR se realizó sobre una muestra de ADN genómico de Populus deltoides o P. trichocarpa, que se preparó de hojas usando el método de extracción del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) (Aldrich y Cullis (1993) Plant Mol. Biol. Report. 11:128-141). Los cebadores se diseñaron para amplificar la región aguas arriba de la región codificante, es decir, la región no traducida 5’ y la región promotora del gen seleccionado. A continuación se ofrecen las secuencias de los
10 cebadores usados para cada promotor:
alfatubulina (TUB)
proteína arabinogalactánica (ARAB)
cinamil alcohol deshidrogenasa (CAD)
cinamato 4-hidroxilasa (C4H)
cinamoil CoA reductasa (CCR)
sinapil alcohol deshidrogenasa (SAD)
UDP-D-glucuronato-carboxi-liasa (UDP)
9
proteína de transferencia de lípidos (LTP)
ag-13 (AG13)
La PCR se realizó usando reactivos disponibles en el comercio y los parámetros de ciclo de 5 minutos a 94 ºC seguido de 35 ciclos de 94 ºC durante 1 minuto, después una temperatura de hibridación modificada, como se describe más adelante durante un minuto, después 72 ºC durante 3 minutos. La temperatura (T) de hibridación se 10 ajustó para cada par de cebadores y varió de 50 ºC a 59 ºC. Finalmente, las muestras se mantuvieron a 72 ºC durante 7 minutos, después a 4 ºC hasta análisis posterior. Diez µl de cada uno de los fragmentos de ADN amplificados resultantes se procesaron en un gel de agarosa al 0,8 %, se purificaron usando el kit de Purificación de gel GFX (Amersham), se subclonaron en el vector pGEM-T-Easy (Promega) y después en sitios EcoRI y BgIII del vector pAPROM-ATG. Las secuencias finales se determinaron en los plásmidos resultantes. La Figura 1 ilustra
15 esquemáticamente el casete de expresión pAPROM-ATG que comprende el gen GUS unido operativamente a un promotor desvelado en el presente documento. La Figura 4 ilustra esquemáticamente el vector plasmídico que comprende un gen de interés unido operativamente a un promotor de la invención.
EJEMPLO 3
20 Transformación de plantas de Arabidopsis
Usando un protocolo de transformación mediado por Agrobacterium tumefaciens (Bechtold et al., (1993) C. R. Acad. Sci. Paris 316:1194-1199; Bent et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396) se transformaron plantas de 25 Arabidopsis thaliana Columbia con construcciones individuales que contenían uno cualquiera de los promotores de la invención unido operativamente a un gen de interés. Las construcciones también contenían el gen marcador de selección Bar que confiere resistencia a análogos de fosfinotricina herbicida como glufosinato de amonio (Thompson et al. (1987) EMBO J. 9:2519-2523). En este ejemplo, el gen de interés unido operativamente a los promotores preferidos de cámbium/xilema de la invención es el gen indicador GUS que codifica la enzima beta-glucuronidasa
30 (GUS) (Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405) que posibilita la inspección visual del fenotipo deseable, es decir, la expresión de GUS de una manera preferida de cámbium/xilema.
Se sembraron semillas de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia en macetas que contenían vermiculita. Las plantas se cultivaron en un régimen de oscuridad/luz de 16/8 horas a 22 ºC. Después de 4-5 semanas, las plantas se
35 transformaron con la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con Bent et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 204:383-396; que lleva el vector plasmídico que comprende el gen de interés unido operativamente a cada uno de los promotores descritos en el presente documento.
Para la transformación de la planta, 1 litro de medio LB que contenía rifampicina, gentamicina y kanamicina se
40 inoculó con una alícuota de cultivo iniciador de Agrobacterium durante una noche. Después, el cultivo se dejó crecer durante una noche a 28 ºC en un agitador rotativo, hasta que la DO600 fue ≥ 8,0. La Agrobacterium se precipitó por centrifugación y el sedimento bacteriano se resuspendió en ~300 ml de sacarosa al 5 % y Silwet L-77 al 0,03 %. Esta suspensión de Agrobacterium se pulverizó sobre las plantas. Las macetas se colocaron en una bandeja que se cubrió con una envoltura de plástico para mantener la humedad y las plantas se dejaron crecer bajo el régimen
45 anterior para madurar y asentar las semillas.
Las semillas se recogieron y la superficie se esterilizó con una solución que contenía lejía 50 % y Tritón X-100 al 0,02 % durante 7 minutos. Después, las semillas se lavaron 3 veces con agua destilada estéril y se sembraron en placas en medio MS que contenía 6 mg/l de Finale como agente de selección. Después de 5 a 7 días, los
50 transformantes eran visibles como plantas verdes. Las plantas transformadas se transfirieron sobre nuevas placas de selección y después de 6-10 días se transfirieron a macetas que contenían vermiculita y se cultivaron en condiciones de 16 horas de luz/ 8 horas de oscuridad a 22 ºC.
EJEMPLO 4
55 Ensayo de expresión de GUS en plantas de Arabidopsis
Tallos con inflorescencias de las plantas transformadas descritas en el Ejemplo 3 se cortaron y se tiñeron histológicamente para determinar la actividad GUS. Esquejes posteriores indujeron la formación de xilema
60 secundario en la base de plantas que también pudieron teñirse histológicamente para determinar la actividad GUS.
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