ES2585400T3 - Proteína CD20 truncada, delta CD20 - Google Patents

Abstract

Un kit de diagnóstico, caracterizado por que comprende al menos un oligonucleótido que comprende una secuencia idéntica a la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 17.

Description

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La proteína truncada posee una secuencia de 131 aminoácidos con un peso molecular predictivo de 15 kD e incluye el dominio C-terminal citoplásmico, una pequeña parte del primer dominio transmembrana y el extremo del dominio N-terminal intracitoplasmático. La proteína truncada potencial no se ancla a la membrana por ausencia de expresión de 4 segmentos transmembrana, como se ha podido demostrar a través de imágenes por microscopía confocal, por transfección de líneas celulares con un vector que expresa una proteína de fusión CD20 n/PVF o ΔCD20/PVF. La proteína ΔCD20 n/PVF o CD20/PVF se expresó en células eucariotas 293T tras la transfección con un vector de expresión pcDNA3.1 CT topo (Invitrogen). La proteína PVF se clonó en la fase de lectura de la secuencia de CD20 (Δ o N). La revelación de la proteína PVF se realizó por excitación directa (color verde) y la proteína CD20 n por un anticuerpo antiCD20 acoplado a TIRTC (color rojo). De este modo, el marcado es citoplásmico en las células transfectadas con la forma truncada de CD20 mientras que se observa una colocalización esencialmente membranal de marcas verdes y rojas correspondientes a PVF y CD20 n. Esto confirma que la expresión de ΔCD20 se limita al citoplasma.

El análisis de la secuencia natural codificante del gen CD20 (CD20 N) utilizando los programas predictivos de los sitios de corte y empalme, sitios donantes y aceptores de corte y empalme (software NNSPLICE v0.9 -http://www. fruitfIy.org/seq_tools/splice.htm) mostró la presencia de un sitio donante (SD) y un sitio aceptor (SA) críptico, correspondiente exactamente a la secuencia codificante del gen CD20 delecionado (ΔCD20). Investigaciones más detalladas con otros paquetes de programas (NetGene 2 -http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2) ayudaron a resaltar un sitio de empalme, situado en una veintena de pares de bases del sitio aceptor.

1. Expresión de la proteína ΔCD20

a. Detección por membrana de Western

A partir de líneas celulares de origen B, se investigó por membrana de Western, con anticuerpos disponibles anti-CD20 que reconocen la parte C-terminal de la proteína (Thermo Fischer, n.º RB9013), la presencia de una proteína truncada (sin parte transmembrana, pero citoplasmática) codificada por los transcritos "cortados y empalmados". Por consiguiente, se ha podido demostrar, además de la banda esperada correspondiente a la proteína CD20 natural, la presencia de una banda de tamaño esperado (~17KD) correspondiente a la proteína ΔCD20. Esta proteína no se expresa en las líneas T.

2. ΔCD20: biomarcador molecular de diagnóstico y/o pronóstico de hemopatías B o complicaciones (rechazo agudo, linfomas) post-aloinjerto renal

a. Transcritos alternativos ΔCD20y hemopatías B

Se ha experimentado, con un ensayo de PCR cualitativa, la amplificación total de la secuencia codificante (flCD20 PCR) de otras líneas obtenidas a partir de hemopatías B de diferentes tipos (Burkitt, LLA pre-B, VEB B transformada) y se ha mostrado que la forma corta del transcrito CD20 estaba presente en todas las líneas B y ausente en las líneas T. A continuación, se desarrolló una herramienta de PCR sensible y específica (PCR ΔCD20), mediante el diseño de un cebador que incluye el sitio de unión de este corte y empalme. Esta nueva herramienta permite poner de relieve únicamente la forma corta de ARNm y de este modo evitar los fenómenos de competencia en PCR, incompatibles con una gran sensibilidad.

Con esta herramienta de PCR más eficiente, se investigó la forma corta de CD20 en CMSP o para ser más sensible en las células B CD19+ o CD20+ de 5 donantes sanos sin ser capaz de detectarla. La investigación específica del transcrito truncado, gracias a nuestra herramienta sensible de PCR mostró una señal positiva en las líneas y una señal negativa en CMSP, lo que sugiere la presencia de este mecanismo de corte y empalme en las células transformadas por VEB, en las células malignas y ausencia en las células B normales. Esta forma truncada de ARN CD20 es pues la firma de un estado de activación de las células B asociado con el fenotipo maligno.

b. Cuantificación en el diagnóstico de ΔCD20 en los diferentes tipos de hemopatías B

A fin de ilustrar la posibilidad de utilizar la cuantificación de los transcritos ΔCD20 en el diagnóstico de ciertas hemopatías, se ha aplicado nuestro ensayo de RT-PCRc en diferentes tipos de hemopatías B. La cuantificación de 2 formas (longitud completa y truncada) se realizó contra un intervalo de diluciones en serie, de cantidades conocidas de plásmidos convencionales que poseen las formas n o Δ de CD20. El cálculo de la relación R = [ΔCD20/(CD20 n + ΔCD20)] x 100 permite expresar la cantidad relativa de transcrito CD20 con respecto a la forma natural. Se ha podido también demostrar una expresión diferencial de estos transcritos alternativos en diferentes hemopatías B. Se ha cuantificado la forma cortada y empalmada de ΔCD20 [expresada en % de ΔCD20: R = (ΔCD20/CD20 n + ΔCD20) x 100] en las líneas VEB B transformadas in vitro (2,9 ± 4,51 %, n=6), en células CD19+ purificadas de amigdalectomías (9 ± 2,2 %, n=7) y blastos B producidos in vitro (activación ligando FLT3) (14 ± 7,8 %, n=5). De forma interesante, se cuantificó ΔCD20 en 3,6 ± 5,1 % en LLA B (n=27), 3,9 ± 5,3 % en linfomas foliculares (n=5); 2,9 ± 4,5 % en linfomas de células de manto (n=6); 3,2 ± 2,2 % en linfomas de alto grado (n=5); y 0,1 ± 0,2 % en LLC B (n=8).

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Claims (1)

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