ES2586851T3

ES2586851T3 - Tratamiento de infecciones de la superficie del cuerpo humano o animal

Info

Publication number: ES2586851T3
Application number: ES10718677.7T
Authority: ES
Inventors: Paul Davis; Andrew Austin
Original assignee: Insense Ltd
Current assignee: Insense Ltd
Priority date: 2009-05-01
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2016-10-19
Anticipated expiration: 2030-04-30
Also published as: RU2011148938A; KR20160110561A; US20120058101A1; AU2010243349A1; DK2424578T3; JP2012525366A; GB0907553D0; US8815234B2; BRPI1009976A2; CN102405065A; EP2424578A2; EP2424578B1; WO2010125398A2; CA2758471C; BR122016023717B1; RU2527341C2; KR20120013358A; WO2010125398A3; KR101723534B1; CA2758471A1

Abstract

Una combinación de un líquido acuoso para reblandecer una infección por hongos en una superficie del cuerpo humano o animal, y un apósito, que comprende una fuente de peróxido de hidrógeno, para la subsiguiente aplicación a la superficie del cuerpo, para uso en el tratamiento de una infección por hongos en la superficie del cuerpo humano o animal.

Description

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DESCRIPCION

Tratamiento de infecciones de la superficie del cuerpo humano o animal Campo tecnico

La presente invencion se refiere al tratamiento de infecciones de la superficie del cuerpo humano o animal, en particular una infeccion por hongos de una zona de las unas humanas.

Antecedentes

Unas unas sanas en un estado visiblemente bueno son aspectos importantes y altamente apreciados del aspecto humano. Con frecuencia, el aspecto, la fuerza y la salud de las unas pueden verse afectados adversamente por la infeccion con celulas de hongos patogenos, tfpicamente del genero Trychophyton, y existe una fuerte demanda de terapias que mejoran la apariencia de unas afectadas por la eliminacion de los hongos infestantes. Aunque existen numerosos remedios en el comercio, existe una insatisfaccion generalizada con las tecnologfas y los productos disponibles.

Agentes suministrados sistemicamente pueden alcanzar la zona de las unas a traves del torrente sangumeo, pero una penetracion deficiente en la zona de las unas a partir de la circulacion y efectos secundarios graves limitan la utilidad del enfoque.

Unas infectadas por hongos a menudo se vuelven porosas o abiertas por la accion de los hongos invasores. Por lo tanto, a menudo la una se co-coloniza con bacterias que pueden exacerbar los efectos daninos de los hongos mediante la liberacion de enzimas destructivas adicionales y toxinas activas a nivel local.

Es bien reconocido que incluso si una infeccion por hongos de las unas es reducida por una terapia conocida, rara vez se elimina por completo y es habitual que las infecciones vuelvan poco despues de interrumpir el tratamiento.

Sumario de la invencion

Los autores de la invencion han descubierto que los ingredientes activos no penetran facilmente en la una y, en todo caso, poco del material aplicado a la superficie superior llega a las estructuras subyacentes donde las celulas fungicas pueden residir en relativa seguridad.

La invencion se refiere a una combinacion de un lfquido acuoso y un aposito que comprende una fuente de peroxido de hidrogeno en el tratamiento de una infeccion por hongos en la superficie del cuerpo humano o animal, particular pero no exclusivamente una zona de las unas humanas o animales.

Mediante la aplicacion de un lfquido acuoso a la superficie del cuerpo infectada, la superficie del cuerpo se ablanda y se hace mas porosa. Por ejemplo, esto puede permitir que el lfquido pase hacia el interior de la region de las unas a traves de la porosidad existente. Asf, el lfquido proporciona una trayectoria de flujo acuoso en el interior de la superficie del cuerpo, p. ej., la zona de las unas.

La aplicacion subsiguiente de un aposito que comprende una fuente de peroxido de hidrogeno da lugar asf a la difusion eficaz del peroxido de hidrogeno a lo largo de la trayectoria del flujo acuoso generado en las parte interiores, menos accesibles de la superficie del cuerpo, p. ej., la zona de las unas, permitiendo que el peroxido de hidrogeno penetre profundamente permitiendo una reduccion significativa o eliminacion de la infeccion, p. ej., infeccion por hongos en todos los componentes de, p. ej., la zona de las unas.

Las unas tienen una anatoirna distintiva y la composicion que debe ser apreciada al considerar nuevos enfoques para la terapia dirigida a la placa ungueal y al lecho ungueal subyacente, asf como todas las estructuras asociadas. La parte mas visible de una una, la placa ungueal, consiste en una estructura queratinizada dura, formada a partir de celulas cornificadas muertas (corneocitos), que es empujada hacia arriba a partir de la matriz en la base de la una. La mayor parte de la placa ungueal es semi-transparente, permitiendo que el color del suministro de sangre en la dermis sea transparente, dando un color rosaceo. La una esta por sf misma relativamente desprovista de humedad, pero, cuando se expone al agua, puede llegar a ser relativamente hidratada, suponiendo un estado ablandado y flexible.

La pared de la una, un pliegue de la piel que solapa los lados de la una, mantiene la placa ungueal en su lugar y protege sus bordes. La unica parte viva que reproduce parte de la una es la matriz ungueal, situada directamente por debajo de la cutmula. En este punto se forman nuevas celulas y continuamente empujan hacia delante a medida que maduran para producir la placa ungueal. La matriz tambien es suministrada con nervios, asf como abundantes vasos sangumeos para proporcionar las celulas con nutrientes y oxfgeno.

La placa ungueal reposa sobre el lecho de la una, que se continua con la matriz. Esta tambien es suministrada abundantemente con los vasos sangumeos y los nervios. Su superficie se transforma en numerosas crestas paralelas que encajan exactamente con las crestas en la superficie inferior de la placa ungueal. La cutmula es la parte de la epidermis de la piel que se superpone a la una. Protege a la matriz de bacterias invasoras y de danos

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Las celulas fungicas pueden residir y crecer en cualquier parte de estas estructuras y es importante que cualquier tratamiento impregne todos los ambitos con el fin de eliminar cualquier foco residual de infeccion, as^ como la eliminacion de la infeccion en las principales zonas de la placa ungueal.

La expresion "zona de la una" se define en esta memoria para comprender la placa ungueal, el lecho ungueal, la matriz ungueal, el pocillo ungueal y la cuticula.

En una realizacion preferida, el lfquido acuoso comprende una enzima peroxidasa. La peroxidasa se difunde en el interior de la superficie del cuerpo, p. ej., la zona de la una.

La enzima peroxidasa, una vez que ha penetrado en la zona interior de la superficie del cuerpo, p. ej., las unas, permanece esencialmente inactiva hasta que el peroxido de hidrogeno se difunde a traves de la via acuosa desde el aposito. En presencia de peroxidasa se potencian los efectos oxidativos de peroxido de hidrogeno.

Asf, se ha encontrado que la peroxidasa potencia sustancialmente la actividad, especialmente la actividad antifungica, del peroxido de hidrogeno, ya que cataliza la oxidacion de moleculas de hongos vulnerables pero esenciales sobre o en la membrana celular y/o citoplasma de las celulas fungicas.

Se puede emplear cualquier peroxidasa adecuada, incluyendo lactoperoxidasa, peroxidasa de rabano picante, peroxidasa de yoduro, peroxidasa de cloruro y mieloperoxidasa. Sin embargo, se prefieren actualmente la lactoperoxidasa y la peroxidasa de rabano picante.

La concentracion de enzima peroxidasa en el lfquido acuoso esta preferiblemente en el intervalo de 1 a 1000 pg/ml, preferiblemente de 50 a 1000 pg/ml, mas preferiblemente de 100 a 500 pg/ml.

El lfquido acuoso tambien comprende preferiblemente tensioactivos y/o disolventes, que se ha encontrado que potencian la penetracion del lfquido en la superficie del cuerpo, p. ej., las unas.

El aposito esta preferiblemente en una condicion hidratada, con el fin de que el peroxido de hidrogeno pueda difundirse en la region de las unas con eficacia una vez que se aplica el aposito. Se requiere suficiente agua en el aposito para formar una union de contacto lfquido entre la zona de la una y el aposito.

Preferiblemente, la resistencia osmotica del lfquido acuoso es la misma o similar a la del lfquido en el aposito para potenciar los flujos de fluidos y solutos deseados.

El aposito dona preferiblemente agua a la zona de la una en uso, lo cual se logra mediante la seleccion de propiedades osmoticas apropiadas de manera conocida.

El material del aposito puede ser en forma de hidrogel, una esponja, una espuma o alguna otra forma de matriz hidrofila que puede contener agua suficiente para permitir una via de difusion controlada entre el aposito y la zona de la una. Preferiblemente, el aposito contendra solutos que sirven para regular el paso de peroxido de hidrogeno, p. ej., por enlaces hidrogeno, que se puede conseguir por concentraciones apropiadas de polfmeros, p. ej., polisacaridos, incluyendo glicosaminoglicanos.

El aposito puede comprender un aposito de algodon humedo o puede incluir un material de mecha estructural con ingredientes humedos. Preferiblemente, sin embargo, el aposito incluye uno o mas geles a base de agua o acuosos, a los que tambien se alude como hidrogeles hidratados. Tales geles pueden formarse de una diversidad de materiales y pueden contener una diversidad de reactivos tal como se discutira a continuacion.

Tfpicamente, el aposito estara en forma de una hoja, capa o pelfcula. El aposito puede estar, alternativamente, en forma de un gel o locion amorfo, preferiblemente un hidrogel, no teniendo una forma o configuracion fija, que puede ser deformado y conformado en tres dimensiones, incluyendo el ser exprimido a traves de una boquilla. Geles amorfos no son tipicamente reticulados o tiene niveles bajos de reticulacion. Se puede utilizar un gel amorfo reductor de la cizalla. Un gel de este tipo es lfquido cuando se somete a esfuerzo de cizalla (p. ej., cuando se vierte o se exprime a traves de una boquilla) pero se endurece cuando es estatico.

Hidrogeles hidratados adecuados se describen en el documento WO 03/090800. El hidrogel hidratado comprende convenientemente material polimerico hidrofilo. Materiales polimericos hidrofilos adecuados incluyen poliacrilatos y metacrilatos, p. ej., tal como se suministra por First Water Ltd en forma de hidrogeles laminares, incluyendo el acido poli-2-acrilamido-2-metilpropano-sulfonico (poliAMPS) o sales de los mismos (p. ej., tal como se describe en el documento WO 01/96422), polisacaridos, p. ej., gomas de polisacaridos, particularmente goma de xantano (p. ej., disponible bajo la Marca Comercial Keltrol), diversos azucares, acidos policarboxflicos (p. ej., disponibles bajo la Marca Comercial Gantrez AN-169 BF de ISP Europe), poli (metil-vinil-eter co-anhfdrido maleico) (p. ej., disponible bajo la Marca Comercial Gantrez AN 139, que tiene un peso molecular en el intervalo de 20.000 a 40.000), polivinilpirrolidona (p. ej., en forma de calidades disponibles comercialmente conocidas como PVP K-30 y K-90), poli(oxido de etileno) (p. ej., disponible bajo la Marca Comercial Polyox WSR-301), poli(alcohol vimlico) (p. ej., disponible bajo la Marca Comercial Elvanol), polfmero poliacrilico reticulado (p. ej., disponible bajo la Marca

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Comercial Carbopol EZ-1), celulosas y celulosas modificadas, incluyendo hidroxipropil-celulosa (p. ej., disponible bajo la Marca Comercial Klucel EEF), carboximetilcelulosa sodica (p. ej., disponible bajo la Marca Comercial Cellulose Gum 7LF) e hidroxietil-celulosa (p. ej., disponible de la Marca Registrada Natrosol 250 LR).

Mezclas de materiales poKmeros hidrofilos pueden utilizarse en un gel.

En un hidrogel hidratado de material polimerico hidrofilo, el material polimerico hidrofilo esta presente deseablemente en una concentracion de al menos 0,1%, preferiblemente al menos 0,5%, preferiblemente al menos 1%, preferiblemente al menos 2%, mas preferiblemente al menos 5%, aun mas preferiblemente al menos 10%, o al menos 20%, deseablemente al menos 25% e incluso mas deseablemente al menos 30% en peso, basado en el peso total del gel. Se pueden utilizar incluso mayores cantidades, hasta aproximadamente 40% en peso, basado en el peso total del gel.

Un hidrogel hidratado preferido comprende acido poli-2-acrilamido-2-metilpropano-sulfonico (poli AMPS) o sales del mismo, preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 20% en peso del peso total del gel.

La fuente de peroxido de hidrogeno puede comprender peroxido de hidrogeno per se o peroxido de hidrogeno en combinacion con o formando complejo con otra entidad.

Alternativamente, la fuente de peroxido de hidrogeno puede ser un medio de generacion de peroxido de hidrogeno.

En una realizacion preferida, la fuente de peroxido de hidrogeno es un medio de generacion de peroxido de hidrogeno que comprende enzima oxidorreductasa, una fuente de oxfgeno y una fuente de sustrato para la enzima. La enzima oxidorreductasa cataliza una reaccion de un sustrato apropiado con oxfgeno para producir peroxido de hidrogeno.

Enzimas oxidorreductasa adecuadas para uso en la invencion y los sustratos correspondientes (que estan presentes en la sangre y fluidos de tejidos) incluyen los siguientes:

Enzima

Glucosa oxidasa Hexosa oxidasa Colesterol oxidasa Galactosa oxidasa Piranosa oxidasa Colina oxidasa Piruvato oxidasa Glicolato oxidasa

Sustrato

p-D glucosa

Hexosa

Colesterol

D-galactosa

Piranosa

Colina

Piruvato

Glicolato

Aminoacido oxidasa Aminoacido

La enzima oxidorreductasa actualmente preferida es la glucosa oxidasa. Esta cataliza la reaccion del sustrato p-D glucosa para dar peroxido de hidrogeno y acido gluconico.

Se puede utilizar una mezcla de enzimas oxidorreductasa.

La enzima oxidorreductasa y glucosa pueden ser rntimamente mezcladas opcionalmente junto con una fuente de oxfgeno. El oxfgeno puede ser proporcionado por cualquier donante de oxfgeno conveniente, pero una fuente conveniente es el oxfgeno atmosferico.

Cuando la fuente de oxfgeno es oxfgeno atmosferico, el aposito comprende preferiblemente primera y segunda capas discretas. La primera capa comprende la enzima oxidorreductasa y se encuentra en la vecindad de las partes exteriores del aposito, es decir, a distancia de la zona de la una en uso, en donde los niveles de oxfgeno atmosferico son los mas altos. La segunda capa comprende la fuente de sustrato y se encuentra en las proximidades de las partes internas del aposito, es decir, adyacente a la zona de la una, de modo que el peroxido de hidrogel producido puede penetrar directamente en la zona de la una.

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Una forma preferida de la realizacion estratificada es en los casos en los que la primera y segunda capas incluyen hidrogeles hidratados reticulados. Los hidrogeles se pueden colar en torno a una estructura de refuerzo mecanica tal como una lamina de gasa de algodon o una malla flexible inerte, p. ej., para proporcionar una capa de hidrogel estructuralmente reforzada o plancha.

Alternativamente, la primera capa que contiene la enzima puede estar en estado seco, pero colocada en comunicacion de fluido con la segunda capa durante el uso, resultando la migracion de agua a la primera capa para hidratar la enzima.

En la realizacion estratificada es preferible que la primera capa sea relativamente fina, es decir, de 0,01 a 2,0 mm y que la segunda capa sea relativamente gruesa, es decir, de 0,5 a 5,0 mm. Si la primera capa es un hidrogel hidratado, entonces este es preferiblemente de 0,1 a 2,0 mm de espesor. Si la primera capa es una pelfcula seca, entonces es preferiblemente de 0,01 a 0,1 mm de espesor.

La relacion de espesor de la primera capa a la segunda capa es preferiblemente de 1:2 a 1:200, preferiblemente de 1:5 a 1:50, mas preferiblemente de 1:5 a 1:20.

La enzima oxidorreductasa puede ser convenientemente inmovilizada de manera que se impida la migracion hacia la segunda capa.

El sustrato, p. ej., glucosa, puede estar presente en diversas formas, incluyendo disuelto dentro de una estructura de hidrogel hidratado, presente como un solido de disolucion lenta, o encapsulado dentro de otra estructura para una liberacion lenta.

Es preferible disponer el aposito de modo que tenga un exceso de sustrato, de manera que el aposito es capaz de funcionar en uso para generar peroxido de hidrogeno a lo largo de un penodo prolongado de tiempo, p. ej., al menos una hora, p. ej., de 1 a 10 horas o mas.

La combinacion de acuerdo con la invencion es tfpicamente un kit envasado que comprende una combinacion de una disolucion acuosa y un aposito que comprende una fuente de peroxido de hidrogeno tal como se describio anteriormente.

Los componentes se encuentran tfpicamente en paquetes sellados, impermeables al agua,

La invencion se ilustrara ahora, a modo de ejemplo, y con referencia a las siguientes figuras, en las que:

la Figura 1 es un grafico que muestra la corriente medida en funcion del tiempo que muestra la generacion de peroxido de hidrogeno.

La Figura 2a es un grafico que muestra las curvas de exterminio del hongo T.rubrum.

La Figura 2b es otro grafico que muestra las curvas de exterminio del hongo T. rubrum.

Ejemplos

Sumario Experimental

Discos de prueba se sumergieron en suero al 50% que contiene 107 celulas fungicas para volver a crear un alto entorno de protemas. Estos discos se colocaron en un lecho de gel, que tambien contema suero al 50% para imitar el contacto con el lecho ungueal. Los discos fueron dosificados con disoluciones acuosas de peroxidasa de rabano picante o lactoperoxidasa, teniendo cada uno de los conjuntos de discos diferentes niveles de dosis de las enzimas. Los discos de control se dejaron sin peroxidasa de ningun tipo. El experimento se inicio mediante la aplicacion de peroxido de hidrogeno generando parches estratificados (vease mas adelante) a las superficies de la mayona de los discos de prueba, y estos se dejaron reposar durante penodos definidos de tiempo. Algunos discos se dejaron al descubierto como controles experimentales adicionales para determinar lo bien que sobrevivieron las celulas fungicas cuando se dejan sin tratamiento. A intervalos de tiempo establecidos, los discos representativos fueron retirados para el muestreo y el numero de celulas fungicas supervivientes se determinaron por metodos estandares. Estos experimentos demostraron que el peroxido de hidrogeno suministrado por los parches de gel estratificados podna exterminar a las celulas fungicas si se dejan en reposo durante varias horas. Sin embargo, la tasa de exterminio de los hongos fue fuertemente potenciada por la presencia adicional de la enzima peroxidasa en contacto con el hongo. La enzima peroxidasa de rabano picante era mas potente que la lactoperoxidasa, y el efecto generalmente aumentaba con la dosis.

Ejemplo 1: Construccion y evaluacion de un parche de capa estratificada que dona peroxido de hidrogeno en terminos de generacion de peroxido de hidrogeno

La generacion de peroxido de hidrogeno (H2O2) se midio utilizando la electroqmmica (tecnica crono lenta). Un aposito se coloco sobre un sensor disenado a medida, se aplico un potencial a traves de los electrodos y se midio la presencia de H2O2.

El aposito se compoma de dos capas: (i) la capa de hidrogel hidratado y (ii) la capa de activacion de la pelfcula seca que contienen glucosa oxidasa.

Preparacion de la Capa 1: una lamina de hidrogel se preparo como sigue:

Se preparo una disolucion acuosa de acido 2-acrilamido-2-metilpropanosulfonico sodico al 20% (Lubrizol 5 Corporation, disolucion madre acuosa al 50%), glucosa al 10% (Fisher Scientific, calidad analttica) y lactato de zinc al 0,1% (Aldrich). Diacrilato de Peg 700 (Aldrich) se incluyo como agente de reticulacion y 2-hidroxi-2-metil- propiofenona (Aldrich) como el fotoiniciador. 6,5 g y 13 g de la disolucion se dispensaron en una placa de Petri de 10x10 cm y se sometieron a 100 mW/cm2 de luz ultravioleta durante 20 segundos.

Preparacion de la Capa 2: una pelfcula seca se preparo como sigue:

10 Se preparo una disolucion acuosa de 25% p/p de PVA (poli(alcohol vimlico) Gohsenol, codigo EG05P suministrado por Nippon Gohsei). Ademas, 40,3 mg de glucosa oxidasa (biocatalizadores, 150.000 unidades/gramo) + 300 mg de histidina (Sigma) + 150 mg de acido citrico (Fisher, calidad analftica) + 75 mg de yoduro de potasio (Sigma) se disolvieron en 2 ml de agua de calidad analftica (Fisher). 30 g de disolucion de PVA al 25% se mezclaron con la disolucion de glucosa oxidasa/histidina/acido cftrico/yoduro de potasio y se dejo sedimentar para eliminar las 15 burbujas de aire atrapadas. A continuacion, la mezcla se seco a 50°C para dar una pelfcula seca de 40-45 micras de espesor.

Analisis electroqmmico:

Se utilizo un sensor de 3 electrodos disenado a medida (de trabajo, contador y de referencia) para el analisis. La instrumentacion y el software Ezescan se adquirieron de Whistonbrook Technologies, Luton, Reino Unido. Los 20 electrodos se montaron dentro de una caja de Teflon y se colocan dentro de una incubadora a 25°C. En uso, 20 jl de una disolucion de KCl 0,1 M se aplicaron al extremo del electrodo del sensor. Secciones de 1,5x2 cm de la lamina de hidrogel de la Capa 1 (6,5 g y 13 g de peso de colada) se cortaron y se colocaron en la disolucion de KCl, asegurando incluso el contacto con los electrodos de modo que no hubiera burbujas de aire atrapadas entre el gel y el sensor. Los geles fueron cubiertos para reducir la evaporacion. Se aplico un potencial de + 950mV a traves de los 25 electrodos y el generado se registro en corriente. Cuando se obtuvo una corriente de lmea de base estable, secciones de 1,5x2 cm de la pelfcula seca se aplicaron a las superficies de las laminas de hidrogel de la Capa 1. Se registro la corriente generada. Vease la Figura 1:

La Figura 1 demuestra que cuando se aplico un potencial de + 950mV a la lamina de hidrogel de la Capa 1 en el sensor, hay muy poco corriente de fondo medible, por lo tanto existe poca interferencia de los materiales utilizados 30 en la preparacion del hidrogel a este potencial dado. Despues de la aplicacion de la pelfcula de enzima seca (en torno a 4000 segundos en el grafico), la qmmica de la glucosa oxidasa se activa y se produce H2O2, que rapidamente se difundfa a traves del hidrogel de la Capa 1 al electrodo, en donde se mide un aumento significativo de la corriente. Esto demuestra claramente que el sistema de doble capa genera H2O2 dentro del sistema de doble capa y lo suministra a la superficie de contacto. La corriente generada en relacion a la meseta principal del diagrama 35 (entre 5.000 y 13.000 segundos) generalmente equivale a alrededor de H2O2 (aq) al 0,1%. Ademas, los diferentes espesores de la Capa 1 de hidrogel produdan curvas muy similares, con la excepcion de que el gel mas delgado (6,5 g de gel por area de 10x10 cm) dio una corriente de pico significativamente mas alta (por lo tanto la concentracion de H2O2) en la hora de aplicacion (alrededor de 3000 segundos despues de la activacion). El H2O2 de medicion disminuye luego gradualmente hasta que las curvas vuelven a una respuesta plana en torno a 40,000 40 segundos (aprox. 11 horas) despues de la activacion.

Ejemplo 2: Preparacion de peroxidasa que contiene muestras de cebadores como disoluciones acuosas.

Un soporte de base adecuado para la peroxidasa se preparo como sigue: Tampon fosfato de sodio 50 mM pH 6-6,5 se mezclo con tensioactivo Tween 20 al 0,2% p/p (Sigma). Para ello, la enzima peroxidasa se disolvio para dar una concentracion final de 100 jg/ml.

45 La formulacion de soporte puede ser alterada para proporcionar diferentes propiedades segun sea necesario. Por ejemplo, la concentracion y el tipo de la sal tampon se pueden cambiar para proporcionar un intervalo de lfmites de tamponamiento y para cambiar el pH de la disolucion, dependiendo de la aplicacion y del pH optimo de la enzima (p. ej., peroxidasa) utilizada; la concentracion y el tipo de tensioactivo se pueden cambiar para proporcionar diferentes caractensticas de humectacion; se pueden incluir espesantes polimericos adicionales para reducir las caractensticas 50 de flujo del fluido (p. ej., para ayudar a evitar que la disolucion rebose de la una una vez aplicada); el nivel de enzima utilizada tambien puede ser alterado para permitir una accion fuerte o reducida mediada por peroxidasa en o dentro de la estructura tratada. Los aditivos adicionales pueden tambien incorporarse para mejorar la eficacia del aposito, por ejemplo, agentes anti-microbianos.

Ejemplo 3: Ensayo del sistema de tratamiento antifungico de la invencion contra Trichophyton rubrum en un sistema 55 modelo.

Se utilizo un modelo de difusion estatica en lecho plano in vitro, en base a las tecnicas descritas en "In vitro diffusion

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bed, 3-day repeat challenge 'capacity' test for antimicrobial wound dressings", J. Greenman, R.M.S. Thorn, S. Saad, A. Austin Internacional Wound Journal (2006), 3, 322-329.

El inoculo de prueba se preparo emulsionando la biomasa de crecimiento en superficie madura de Trichophyton rubrum en agar de dextrosa de patata en medio Kquido Saboraud, separando la suspension, mezclando en vortice y luego permitiendo que las partfculas grandes se asienten fuera de la disolucion. La suspension resultante se ajusto a traves de espectrofotometna para dar un inoculo estandarizado alrededor de 107 cfu ml-1, que es lo suficientemente densa para detectar cualesquiera efectos fungicidas (una reduccion de > 103 cfu es indicativa de un efecto cidal).

Un volumen de 100 pl de los inoculos definidos se resuspendio en discos de celulosa replicados en la superficie de un lecho de ensayo de poli-AMPS (cuya formulacion es identica a la Capa 1 de hidrogel tal como se describe en el Ejemplo 1, pero se cuela como una lamina de gel de 25 g por placa 10x10 cm), con lo cual se pueden aplicar luego productos de prueba (Figura 1). Se sometio a ensayo un aposito de dos capas. Las capas se prepararon como se describe en el Ejemplo 1. Enzimas lactoperoxidasa o peroxidasa de rabano picante se prepararon disolviendo en agua analttica a la concentracion requerida antes de su uso. Se cree que la lactoperoxidasa puede potenciar los efectos antifungicos del nuevo tratamiento topico, y para algunos de los sistemas experimentales discos de celulosa fueron tratados previamente con una disolucion de lactoperoxidasa o peroxidasa de rabano picante para determinar efectos diferenciales. La gama de condiciones de prueba y de control experimentales propuestas se muestra en la Tabla 1.

Los apositos de dos capas se activaron al reunir las dos capas. La lamina de hidrogel se puso en contacto con el disco de celulosa y la pelfcula seca se aplico a continuacion a la superficie superior de la lamina de hidrogel. Lechos de ensayo se incubaron a 28°C, y a los intervalos de tiempo establecidos (0, 1, 2, 4 y 24 h); discos de celulosa se retiraron, se resuspendieron en PBSa, se diluyeron en serie y luego se extendieron en espiral sobre agar de dextrosa de Saboraud. Despues de la incubacion (5 dfas) se determino el numero de supervivientes de dermatofitos en diferentes momentos despues de la exposicion al tratamiento por recuento de colonias (disco cfu-1). Los resultados se representaron y analizaron utilizando GraphPad Prism (v.4).

Resultados

Los resultados experimentales se muestran en la Figura 2 y es evidente que todas las condiciones de ensayo provocaron efectos antimicrobianos significativos, y hacia las 3 horas despues de la exposicion al tratamiento no se pudieron detectar celulas viables por debajo de cualquiera de los tratamientos topicos. Lactoperoxidasa dentro del disco parece potenciar los efectos del tratamiento topico de una manera dependiente de la concentracion, aunque 1 |jg ml-1 no tuvo efecto significativo en comparacion con el tratamiento de ensayo solo (Figura 2a). Peroxidasa de rabano picante dentro del disco tambien potencia los efectos del tratamiento topico de una manera dependiente de la concentracion, en los casos de incluso la concentracion mas baja (1 jg ml-1) tiene un efecto significativo (Figura 2b). Dentro de las muestras de control se produjo un ligero descenso en los numeros de celulas de T. rubrum, lo que demuestra que este organismo no esta muy bien soportado en las placas de ensayo de lecho de pruebas de hongos, particularmente despues de 24 horas de incubacion; aunque todos los tratamientos de las pruebas mostraron efectos significativos en comparacion con los controles. Curiosamente, parece que el control de tratamiento inactivo esta ofreciendo una cierta proteccion para el organismo en comparacion con el control sin tapar a las 24 horas.

Conclusiones

Es evidente a partir de los resultados que el tratamiento topico solo tiene un efecto antimicrobiano significativo en T.rubrum, reduciendo el numero de celulas viables por debajo del punto mmimo de deteccion para este sistema (2x102 celulas) en el espacio de 3 horas, indicativo de un efecto fungicida (reduccion de > 3 veces log). Tanto peroxidasa como peroxidasa de rabano picante potencian los efectos del tratamiento topico, aunque es evidente que la peroxidasa de rabano picante es mas eficaz.

Tabla 1. Test experimental y condiciones de control para determinar el potencial antifungico de diversos nuevos tratamientos.

Control 1: disco no cubierto

Control 2: Tratamiento topico inactivo

Prueba 1: Tratamiento topico activo

Prueba 2: Tratamiento topico activo + 1 jg/ml de lactoperoxidasa en disco

Prueba 3: Tratamiento topico activo + 100 jg/ml de lactoperoxidasa en disco

Prueba 4: Tratamiento topico activo + 500 |jg/ml de lactoperoxidasa en disco

Prueba 5: Tratamiento topico activo + 1 jg/ml de peroxidasa de rabano picante en disco

Prueba 6: Tratamiento topico activo + 100 jg/ml de peroxidasa de rabano picante en disco

Prueba 7: Tratamiento topico activo + 500 jg/ml de peroxidasa de rabano picante en disco

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REIVINDICACIONES

1. Una combinacion de un l^quido acuoso para reblandecer una infeccion por hongos en una superficie del cuerpo humano o animal, y un aposito, que comprende una fuente de peroxido de hidrogeno, para la subsiguiente aplicacion a la superficie del cuerpo, para uso en el tratamiento de una infeccion por hongos en la superficie del cuerpo humano o animal.
2. La combinacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la superficie del cuerpo es una zona de las unas, particularmente una zona de las unas humanas.
3. La combinacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el lfquido acuoso comprende una enzima peroxidasa.
4. La combinacion de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde la peroxidasa comprende lactoperoxidasa, peroxidasa de rabano picante o una mezcla de las mismas.
5. La combinacion de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, en donde la concentracion de la enzima peroxidasa en el lfquido acuoso esta en el intervalo de 1 a 1000 pg/ml.
6. La combinacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el lfquido acuoso comprende tensioactivos y/o disolventes.
7. La combinacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el aposito dona agua a la zona de la una en uso.
8. La combinacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el aposito comprende un material de hidrogel hidratado.
9. La combinacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la fuente de peroxido de hidrogeno son medios de generacion de peroxido de hidrogeno que comprende una enzima oxidorreductasa, una fuente de oxfgeno y una fuente de sustrato para la enzima.
10. Combinacion de acuerdo con la reivindicacion 9, en donde la enzima oxidorreductasa comprende glucosa oxidasa.
11. La combinacion de acuerdo con la reivindicacion 9 o 10, en donde el aposito comprende primera y segunda capas discretas, comprendiendo la primera capa la enzima oxidorreductasa y se encuentra en la vecindad de las partes exteriores del aposito, comprendiendo la segunda capa la fuente de sustrato y se encuentra en la vecindad de las partes internas del aposito.