ES2587365T3 - Polipéptidos de Fusobacterium y procedimientos de uso - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para el aislamiento de polipéptidos a partir de una especie de Fusobacterium que comprende: incubar una especie de Fusobacterium en un medio que comprende 15 - 20 μg/ml de 2,2-dipiridilo; alterar la especie de Fusobacterium para dar como resultado una mezcla que comprende membranas celulares rotas; solubilizar la mezcla mediante la adición a la mezcla de un detergente biológico para dar como resultado una preparación que comprende polipéptidos solubilizados y no solubilizados; y aislar los polipéptidos no solubilizados.

Description

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colaboradores, de linfocitos T supresores y/o de linfocitos T citotóxicos, dirigidos contra un epítopo o epítopos del polipéptido. "Epítopo" se refiere al sitio de un antígeno al que responden específicamente los linfocitos B y/o los linfocitos T, de forma que se produce un anticuerpo.

La presente divulgación también proporciona preparaciones de células completas de una especie de Fusobacterium, en las que la especie de Fusobacterium expresa uno o más de los polipéptidos de la presente divulgación. Las células presentes en una preparación de células completas están preferentemente inactivadas, de forma que las células no pueden replicarse, pero se conserva la inmunogenicidad de los polipéptidos de la presente divulgación expresados por la especie de Fusobacterium. Normalmente, las células son destruidas mediante una exposición a agentes tales como glutaraldehído, formalina o formaldehído.

La presente divulgación también proporciona composiciones que incluyen al menos 1 de los polipéptidos de la presente divulgación, más preferentemente al menos 2, al menos 3, al menos 4, y así sucesivamente, hasta al menos 14 polipéptidos de la presente divulgación. Una composición puede incluir polipéptidos aislables a partir de 1 especie de Fusobacterium, o pueden ser aislables a partir de una combinación de 2 o más especies de Fusobacterium, por ejemplo, de F. necrophorum y de F. nucleatum. Adicionalmente, una composición puede incluir polipéptidos aislables a partir de 2 o más cepas de la misma especie de Fusobacterium. Por ejemplo, una composición puede incluir polipéptidos aislables a partir de 2 cepas aisladas diferentes de F. necrophorum subesp. necrophorum. La presente divulgación también proporciona composiciones que incluyen una preparación de células completas de al menos 1 especie de Fusobacterium, de 2, 3, 4, 5 o 6especies de Fusobacterium.

Opcionalmente, un polipéptido de la presente divulgación puede estar unido covalentemente a un polipéptido portador para mejorar las propiedades inmunológicas del polipéptido. Algunos polipéptidos portadores útiles son conocidos en la materia, e incluyen, por ejemplo, leucotoxina derivada de una especie de Fusobacterium. El acoplamiento químico de un polipéptido de la presente divulgación puede llevarse a cabo mediante el uso de procedimientos conocidos y rutinarios. Por ejemplo, pueden usarse diversos reactivos de reticulación homobifuncionales y/o heterobifuncionales, tales como suberato de bis(sulfosuccinimidilo), bis(diazobenzidina), adipimidato de dimetilo, pimelimidato de dimetilo, superimidato de dimetilo, suberato de disuccinimidilo, glutaraldehído, m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, sulfo-m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, 4-(Nmaleimidometil)ciclohean-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo, 4-(p-maleimido-fenil) butirato de sulfosuccinimidilo y (1etil-3-(dimetil-aminopropil) carbodiimida (Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, de forma general, y en el capítulo 5, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, NY (1988)).

Preferiblemente, dichas composiciones de la presente divulgación incluyen unas bajas concentraciones de lipopolisacárido (LPS). El LPS es un componente de la membrana externa de la mayoría de los microbios gramnegativos (véase, por ejemplo, Nikaido y Vaara, Outer Membrane, en: Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology, Neidhardt et al., (eds.) American Society for Microbiology, Washington,

D. C., páginas 7 -22 (1987), y normalmente incluye polisacáridos (específicos de la cadena O, el núcleo externo e interno) y la región lipídica A. El componente lipídico A del LPS es el componente más biológicamente activo de la estructura del LPS y conjuntamente inducen un amplio espectro de efectos fisiopatológicos en los mamíferos. Los efectos más drásticos son fiebre, coagulación intravascular diseminada, activación del complemento, choque por hipotensión y muerte. La actividad inmunoestimulante no específica del LPS puede aumentar la formación de un granuloma en el sitio de la administración de las composiciones que incluyan el LPS. Dichas reacciones pueden dar como resultado un estrés excesivo en el animal, por lo que el animal puede rechazar el alimento o el agua durante un periodo de tiempo, y exacerbar afecciones infecciosas en el animal. Además, la formación de un granuloma en el sitio de la inyección puede aumentar la probabilidad de un posible deterioro del cadáver debido a la formación de cicatrices o de imperfecciones de tejido en el sitio de inyección (véase, por ejemplo, Rae, Injection Site Reactions, disponible en www.animal.ufl.edu/extension/beef/documents/SHORT94/RAE.HTM, que está disponible en el sitio web mantenido por el Department of Animal Sciences of the University of Florida, Gainesville, FL).

La concentración del LPS puede ser determinada mediante el uso de procedimientos rutinarios conocidos en la materia. Dichos procedimientos normalmente incluyen la medición de la unión de colorante por parte del LPS (véase, por ejemplo, Keler y Nowotny, Analyt. Biochem., 156, 189 (1986)) o el uso de una prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (véase, por ejemplo, Endotoxins and Their Detection With the Limulus Amebocyte Lystate Test, Alan R. Liss, Inc., 150 Fifth Avenue, Nueva York, NY (1982)). Existen cuatro procedimientos básicos disponibles comercialmente que normalmente se usan en una prueba de LAL: la prueba de coagulación en gel; la prueba turbidimétrica (espectrofotométrica); la prueba colorimétrica; y la prueba cromogénica. Un ejemplo de una prueba de coagulación en gel está disponible con el nombre comercial E-TOXATE (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; véase Sigma Technical Bulletin Nº 210) y PYROTELL (Associates of Cape Cod, Inc., East Falmouth, MA). Normalmente, las condiciones del ensayo incluyen poner en contacto la composición con una preparación que contiene un lisado de los amebocitos circulantes del cangrejo herradura, Limulus poliphemus. Cuando es expuesto al LPS, el lisado aumenta su opacidad, así como su viscosidad, y puede gelificar. Se añaden aproximadamente 0,1 mililitros de la composición al lisado. Normalmente, el pH de la composición es de entre 6 y 8, preferentemente, de entre 6,8 y 7,5. La mezcla de la composición y el lisado se incuba durante 1 hora sin perturbaciones a 37 ºC. Después de la incubación, la mezcla se usará para determinar si se produjo una gelificación de la mezcla. Una gelificación indica la presencia de la endotoxina. Para determinar la cantidad de endotoxina presente en la composición, se realizan diluciones de una solución estandarizada de la endotoxina y se ensayan al mismo tiempo

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También se incluyen normalmente las instrucciones de uso de los polipéptidos envasados.

Según se usa en el presente documento, la frase "material de envasado" se refiere a una o más estructuras físicas usadas para alojar el contenido de un kit. El material de envasado se fabrica mediante unos procedimientos conocidos, preferentemente para proporcionar un entorno estéril exento de contaminantes. El material de envasado tiene una etiqueta que indica que los polipéptidos pueden usarse para la detección de los anticuerpos inducidos por una infección por una especie de Fusobacterium. Además, el material de envasado contiene instrucciones que indican cómo se emplean los materiales del kit para la detección de dichos anticuerpos. Según se usa en el presente documento, el término "envase" se refiere a una matriz o un material sólido, tal como vidrio, plástico, papel, aluminio, y similares, capaz de contener en unos límites fijos los polipéptidos. Por lo tanto, por ejemplo, un envase puede ser un pocillo de una placa de microtitulación al que se han fijado cantidades de microgramos de los polipéptidos. Las "instrucciones de uso" normalmente incluyen una expresión tangible que describe la concentración del reactivo o al menos un parámetro del procedimiento de ensayo, tal como las cantidades relativas de reactivo y de muestra que se van a mezclar, los periodos de tiempo de mantenimiento de las mezclas de reactivo/muestra, la temperatura, las condiciones de tampón, y similares.

La presente invención está ilustrada por los siguientes ejemplos. Hasta el punto en que cualquiera de los ejemplos contenga materia en cuestión que esté fuera del ámbito de la presente invención, están incluidos simplemente con fines de referencia.

Ejemplos

Ejemplo 1

Condiciones de cultivo de la especie de Fusobacterium

Fusobacterium spp. necrophorum puede cultivarse en unas condiciones de fermentación controlada de forma que exprese proteínas, incluyendo las proteínas asociadas a la membrana externa. Las bacterias pueden recogerse y a continuación aislarse las proteínas y usarse como inmunógenos en una composición.

Las condiciones anaerobias para el cultivo de F. necrophorum en placas y en pequeños cultivos líquidos fueron establecidas mediante la incubación en un frasco anaeróbico que contiene un sistema generador de gas anaeróbico. Se preparó una solución madre de siembra maestra de Fusobacterium necrophorum subesp. necrophorum procedente de una oveja y disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de la ATCC 27852, mediante la inoculación de la cepa aislada en 200 ml de caldo de infusión de corazón y cerebro porcino (P-BHI, Difco) que contiene un 0,05 % de cisteína (Sigma) y que contiene entre 15 y 20 microgramos por mililitro (μg/ml) de 2,2-dipiridilo (Sigma-Aldrich St. Louis, MO). El cultivo se cultivó sin agitación durante 16 horas a 37 ºC en condiciones anaerobias. Antes de ser cultivado en un cultivo inicial, el F. necrophorum subsp. necrophorum fue adaptado para crecer en el quelante de hierro 2,2-dipiridilo mediante subcultivos repetidos de la cepa aislada en concentraciones crecientes del delante de hierro, comenzando a 0,0025 μg/ml, y aumentando hasta 20 μg/ml. Las bacterias se recogieron mediante una centrifugación a 10.000 x g. El sedimento bacteriano se resuspendió en 20 ml de P-BHI que contiene un 20 % de glicerol, y se dispensó estérilmente en viales criogénicos de 2 ml (1 ml por vial) y se almacenó a -90 ºC. A la cepa aislada se le asignó el número de identificación MS 040525, y se estableció como una siembra maestra. La siembra maestra se expandió en una siembra de trabajo que a continuación se usó para la producción de las proteínas reguladas por metales.

Ejemplo 2

Producción de las proteínas reguladas por metales

Fermentación: se usó un vial criogénico de la siembra de trabajo (1 ml a 109 UFC/ml) para inocular 130 ml de P-BHI a 37 ºC que contiene 15 microgramos (μg) de 2,2-dipiridilo y un 0,05 % de cisteína (Sigma) y se incubó en un tarro de vela. El cultivo se incubó a 37 ºC durante 12 horas, punto en el cual se transfirió estérilmente a 1,3 litros del medio anterior. El segundo cultivo se dejó crecer durante 10 horas adicionales a 37 ºC. Este cultivo se usó para inocular un fermentador de 20 litros Bioflo IV bench-top (New Brunswick Scientific Co, Edison NJ) cargado con 13 litros del medio anterior. El pH se mantuvo constante a entre 6,9 y 7,1 mediante una valoración automática con un 30 % de NaOH y un 10 % de HCL. La velocidad de agitación se ajustó a 100 revoluciones por minuto (rpm), y el cultivo se purgó con nitrógeno puro para mantener un estado anaeróbico. El cultivo se dejó crecer de forma continua en estas condiciones durante 24 horas, punto en el cual se terminó la fermentación reduciendo la temperatura del fermentador hasta 10 ºC.

Recogida: la fermentación bacteriana se concentró y se lavó mediante el uso de un conjunto de filtro de flujo tangencial de Millipore Pellicon (Millipore Corporation, Bedford, MA), equipado con una serie de filtros en canal de 2,32 m2 de pantalla de la serie Alpha 300K Centrasette (Pall Filtron). El volumen original del cultivo de 13 litros se redujo hasta 2,5 litros. El retenido bacteriano se ajustó entonces a 25 litros mediante el uso de solución salina fisiológica (al 0,85 %) y después se concentró de nuevo hasta 2,5 litros para ayudar a eliminar cualquier contaminante no asociado con las células, por ejemplo, las proteínas secretadas. El retenido (2,5 litros) se ajustó a 15 litros mediante el uso de tampón de choque osmótico estéril (OMS) que contiene 7,26 gramos/litro de Tris-base y

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0,93 gramos/litro de EDTA ajustado a un pH de 8,5. El retenido se mezcló concienzudamente y se dispensó por igual (3,0 litros en cada uno) en 5 recipientes estériles Nalgene de cuatro litros y se colocaron en un congelador a 20 ºC para su almacenamiento. La masa de sedimento se calculó mediante la centrifugación de muestras de 30 ml del cultivo fermentado y la cosecha final. En resumen, los tubos cónicos de 50 ml Nalgene pesados previamente se centrifugaron a 39.000 x g durante 90 minutos en una centrífuga Beckman J2-21 mediante el uso de un rotor JA-21 (Beckman Instruments, Palo Alto, CA). Al final del análisis, el sobrenadante se eliminó vertiéndolo y los tubos se pesaron de nuevo. Se calculó la masa de sedimento para cada etapa.

Disrupción (homogenización): se descongelaron tres litros de la suspensión celular bacteriana congelada en OMS a 4 ºC (180 gramos de masa de sedimento). La suspensión del cultivo líquido se transfirió asépticamente a un tanque de procesado de 50 litros revestido que contiene 44 litros de OMS a pH 8,5 que contiene 0,1 gramos de timerosal/litro como conservante. El volumen de la suspensión bacteriana se enfrió hasta 4 ºC con una mezcla continua durante 18 horas a 200 rpm, momento en el cual se alteró mediante una homogeneización. En resumen, el tanque de 50 litros que contiene la suspensión bacteriana se conectó a un homogeneizador modelo 12.51 H Rannie, (APV Systems, Rosemont, IL). Se conectó un segundo tanque de procesado de 50 litros revestido (vacío) al homogeneizador de forma que el líquido del tanque de procesado pudiera pasar a través del homogeneizador hacia el tanque vacío y atrás de nuevo, permitiendo múltiples pases de homogeneización mientras todavía se mantenía un sistema cerrado. La temperatura durante la homogeneización se mantuvo a 4 ºC. Al comienzo de cada pase, el líquido se hizo circular a 70 psi a través del homogeneizador y atrás de nuevo al tanque original, mientras que la presión del homogeneizador se ajustó a 13.500 psi. Antes del primer pase se extrajeron dos muestras previas a la homogeneización del homogeneizador para establecer un momento inicial para la determinación del grado de disrupción y para la monitorización del pH. El grado de disrupción se controló mediante la comparación de la transmitancia (% de T a 540 nanómetros (nm) a una dilución de 1:100) en comparación con la muestra no homogeneizada. La suspensión bacteriana se hizo pasar tres veces a través del homogeneizador para dar un porcentaje final de transmitancia de entre el 78 -83 % de T a una dilución de 1:100.

Después de la homogenización se añadió asépticamente lauroil sarcosinato de sodio (Hamptosil L-30, Chem/Serv, Minneapolis, MN) a la suspensión bacteriana homogeneizada para su solubilización. La cantidad de sarcosina (30 %) añadida equivalía a 0,0664 veces el volumen de solubilización, en litros, (1,0 gramos de sarcosina / 4,5 gramos de masa de sedimento). El tanque de procesado se retiró del homogeneizador y se mantuvo a 4 ºC con agitación a 240 rpm durante entre 60 -70 horas.

Recogida de las proteínas: las proteínas insolubles del líquido solubilizado del proceso se recogieron mediante una centrifugación mediante el uso de Sharples T-1, (Alfa Laval Seperations, Warminster, PA). En resumen, el homogeneizado solubilizado se suministró a seis Sharples a una velocidad de suministro de 250 ml/minuto a 17 psi con una fuerza centrífuga de 60.000 x g. La temperatura durante la centrifugación se mantuvo a 4 ºC. El homogeneizado solubilizado se hizo pasar 2 veces a través de las centrífugas. La proteína se recogió, se resuspendió y se dispensó en 10 litros de tampón Tris a pH 8,5 que contiene un 0,3 % de formalina (Sigma) como conservante.

Diafiltración: la suspensión de proteínas (10 litros) se ajustó a 60 litros mediante el uso de tampón Tris estéril, a pH 8,5. La suspensión se lavó y se dializó mediante el uso de un conjunto de filtro de flujo tangencial de Millipore Pellicon (Millipore Corporation), equipado con una serie de filtros en canal de 2,32 m2 de pantalla de la serie Alpha 10K Centrasette (Pall Filtron) para eliminar la sarcosina residual. La solución de proteínas se concentró mediante una filtración hasta un volumen objetivo de 10 litros, punto en el cual se añadieron lentamente 50 litros de tampón Tris a pH 7,4 que contiene un 5 % de alcohol isopropílico al concentrado procedente de un segundo tanque de procesado. Se cree que el alcohol isopropílico provoca un ligero desplegamiento de la estructura de las proteínas, permitiendo la eliminación de la sarcosina unida sin comprometer la inmunogenicidad de las proteínas. La diafiltración continúa hasta que el pH se estabiliza en 7,4, punto en el cual se añadieron lentamente 50 litros de tampón Tris a pH 7,4 mediante una diafiltración para eliminar el alcohol residual. La suspensión de proteínas se concentró después hasta aproximadamente 5 litros. El concentrado de proteínas se dispensó por igual (500 ml) en diez en recipientes estériles de 1 litro Nalgene y se almacenó a -20 ºC hasta su uso.

Ejemplo 3

Análisis de las proteínas

El perfil de proteínas de la cepa aislada de F. necrophorum subesp. necrophorum cultivada en medio con hierro y/o en medio sin hierro se analizó mediante una SDS-PAGE. En resumen, el organismo se cultivó a partir de una solución madre de siembra maestra congelada mediante un subcultivo en 25 ml de P-BHI que contiene un 0,05 % de cisteína (sigma) y entre 15 y 20 microgramos por mililitro (μg/ml) de 2,2-dipiridilo (Sigma-Aldrich St. Louis, MO) y/o P-BHI que contiene cloruro férrico 200 μM incubado durante 18 horas a 37 ºC con agitación a 100 rpm. A las 18 horas de incubación, se transfirieron 5 ml de cada cultivo a 500 ml de medio incubado previamente (37 ºC) sin hierro y/o con hierro. Los cultivos se dejaron crecer durante 18 horas a 37 ºC con agitación a 100 rpm. A las 18 horas tras la incubación cada cultivo se centrifugó a 10.000 x g durante 20 minutos. El sedimento bacteriano se resuspendió en 100 ml de tampón salino con Tris y se centrifugó a 10.000 x g durante 10 minutos para eliminar cualquier proteína contaminante del medio. El sedimento bacteriano del medio con hierro y sin hierro se resuspendió en 40 ml de

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tampón salino con Tris a pH 7,2 y se alteró mediante la aplicación de ultrasonidos. La suspensión bacteriana alterada se clarificó mediante una centrifugación a 32.000 x g durante 12 minutos. El sobrenadante se recogió y se solubilizó mediante la adición de lauroil sarcosinato de sodio al 4 % vol/vol a 4 ºC durante 24 horas. Las proteínas insolubles se recogieron mediante una centrifugación a 32.000 x g durante 2,5 horas a 4 ºC. El sedimento de OMP se resuspendió en 200 μl de tampón Tris a pH 7,2 y se almacenó a -90 ºC. Se resolvió una muestra de cada extracto en un gel de SDS-PAGE al 10 % para comparar los perfiles proteicos. El gel se escaneó mediante el uso de un densitómetro BioRad GS-800 para comparar la diferencia en el perfil proteico de F. necrophorum cultivado en unas condiciones con hierro y sin hierro. El gel escaneado se muestra en la Figura 3.

Se compararon los perfiles de las bandas electroforéticas de las proteínas aisladas a partir de la cepa aislada de Fusobacterium necrophorum cultivada en las siguientes tres condiciones: medio con hierro (500 ml de P-BHI que contiene cloruro férrico 50 μM), medio sin hierro (500 ml de P-BHI que contiene 15 μg de 2,2-dipiridilo y un 0,05 % de cisteína) y en unas condiciones de fermentación controladas (las condiciones de fermentación sin hierro del Ejemplo 2). Los resultados revelaron unos perfiles de bandas idénticos para cada muestra cultivada en las condiciones sin hierro. Se observaron varias proteínas reguladas por metales que tienen unos pesos moleculares de aproximadamente 82,9 kDa, 79,3 kDa, 65,4 kDa, 49 kDa, 39 kDa, 38,5 kDa, 31 kDa y 27,9 kDa y proteínas no reguladas por hierro que tienen unos pesos moleculares de aproximadamente 45,2 kDa, 40,4 kDa, 39,9 kDa y 33,6 kDa. Varias proteínas reguladas por metales que tienen unos pesos moleculares de aproximadamente 140,5 kDa, 72,9 kDa, 42,7 kDa y 33 kDa parecían estar aumentadas o reguladas por aumento cuando se cultivaban en unas condiciones sin hierro en comparación con la misma banda expresada en unas condiciones con hierro.

Ejemplo 4

Expresión de proteínas por parte de las cepas aisladas de campo

Para determinar si existían diferencias en el perfil de bandas entre las cepas aisladas de campo de Fusobacterium se llevó a cabo el siguiente estudio. Se recogieron hígados bovinos a partir de numerosos carniceros comerciales que tenían unos grandes focos necróticos. Cada foco se subcultivó anaeróbicamente en placas de agar sangre. Se aislaron supuestas colonias de Fusobacterium y se caracterizaron química y nutricionalmente mediante el uso de los kits de ensayo de identificación API 20-A (Biomerieux, Marcy l’Etoile, Francia). Se recogieron seis cepas aisladas (las cepas aisladas 1248, 1250, 1251, 1252, 1253 y 1255) y se identificaron como Fusobacterium necrophorum/ nucleatum. Las cepas aisladas se cultivaron según se ha descrito en el Ejemplo 3, y una muestra de cada extracto se resolvió en un gel de SDS-PAGE al 10 % para comparar el perfil proteico obtenido a partir de cada cepa aislada cultivada en medio con hierro y sin hierro. El gel se escaneó mediante el uso de un densitómetro BioRad GS-800 para comparar la diferencia en el perfil proteico de las cepas aisladas cultivadas en unas condiciones con hierro y sin hierro. Los resultados revelaron unos perfiles de bandas idénticos para cada cepa aislada cultivada en unas condiciones sin hierro. Se observaron varias proteínas reguladas por metales que tienen unos pesos moleculares de aproximadamente 82,9 kDa, 79,3 kDa, 65,4 kDa, 49 kDa, 39 kDa, 38,5 kDa, 31 kDa y 27,9 kDa y proteínas no reguladas por hierro que tienen unos pesos moleculares de aproximadamente 45,2 kDa, 40,4 kDa, 39,9 kDa y 33,6 kDa. Otras diversas bandas que tienen unos pesos moleculares de aproximadamente 140,5 kDa, 72,9 kDa, 42,7 kDa y 33 kDa parecían estar aumentadas o reguladas por aumento cuando se cultivaban en unas condiciones sin hierro en comparación con la misma banda expresada en unas condiciones con hierro. Los perfiles de las bandas de las cepas naturales aisladas de campo de Fusobacterium parecían no variar con respecto a la cepa aislada del ATCC del ejemplo 3. Esto fue sorprendente e inesperado en vista de las diferencias en los supuestos sistemas de captación de hierro observadas recientemente entre 2 especies de Fusobacterium (Kapatral et al., Genome Res., 13, 1180 -1189 (2003).

Ejemplo 5

Preparación de las composiciones inmunizantes derivadas de Fusobacterium necrophorum

Se usó la composición elaborada a partir de F. necrophorum según se ha descrito en el ejemplo 1 para preparar una vacuna. Se preparó una solución madre de vacuna a partir de la composición mediante la dilución del antígeno en suero salino tamponado con fosfato (PBS) que contiene 8,0 g/l de NaCl, 0,2 g/l de KCl, 1,44 g/l de Na2HPO4 y 0,24 g/l de KH2PO4 a pH 7,4 que contiene un 10 % de hidróxido de aluminio (Rehidrogel, Reheis Chemical Company Berkeley Heights, NJ). Después se emulsionó la suspensión de hidróxido de aluminio (500 μg de proteína total/ml) en el adyuvante comercial EMULSIGEN, (MVP Laboratories, Ralston, Nebraska) mediante el uso de un recipiente de homogeneización IKA Ultra Turrax T-50 (IKA, Cincinnati, OH). Se administró una dosis de ratón para dar una dosis final de 50 μg de proteína total en un volumen inyectable de 0,1 ml con una concentración de adyuvante del 22,5 % vol/vol. Se preparó un placebo mediante la sustitución del antígeno por solución salina fisiológica en la formulación anterior y emulsionando la suspensión en EMULSIGEN para dar una concentración de adyuvante del 22,5 %.

Ejemplo 6

Vacunación de los ratones

La eficacia de la vacuna de Fusobacterium necrophorum se llevó a cabo frente a una exposición virulenta viva en ratones. Se distribuyeron por igual treinta (N = 30) ratones hembra CF-1 obtenidos en Harlan Breeding Laboratories

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Según indica la reducción en el número de unidades formadoras de colonias del organismo expuesto en cada periodo de muestreo, los resultados demuestran claramente que la composición era muy eficaz. Los resultados demuestran que la vacunación redujo el número de organismos infecciosos capaces de proliferar con éxito en la circulación sistémica del hospedador. Esta disminución en la dosis infecciosa también reduciría la capacidad del organismo de inducir una enfermedad clínica o de manifestar los síntomas clínicos, principalmente mediante una reducción de la carga sistémica del organismo infeccioso. Esto se observa claramente en la tabla 1 y en la figura 4.

Ejemplo 12

Morbilidad

Los novillos de los grupos 1 y 2 se observaron visualmente diariamente durante 21 días después de la exposición para evaluar anomalías clínicas o signos de enfermedad. Durante el periodo de observación, ninguno de los novillos vacunados mostró ningún signo clínico ni síntoma de enfermedad. Por el contrario, todos los novillos no vacunados estaban visiblemente afectados por la exposición intravenosa. En las 24 horas posteriores a la exposición, los no vacunados dejaron de beber y comer y se volvieron letárgicos, menos agresivos y deprimidos. Una semana después de la exposición todos los novillos no vacunados comenzaron a mostrar un alto grado de debilidad caracterizado por una reducción en la actividad al levantarse y al moverse, adoptando unas posturas inusuales, anormales, que incluyen flaccidez, decaimiento, rigidez y una ausencia de flexión, particularmente en las articulaciones de los espolones y de las rodillas. A los catorce días después de la exposición todos los novillos no vacunados mostraban una gran dificultad para caminar y/o para permanecer erguidos. De nuevo, estas observaciones se correlacionan bien con la capacidad observada de la vacuna para disminuir la carga de la exposición de la dosis infecciosa sistemáticamente, previniendo así la diseminación del organismo de la exposición en múltiples sitios tisulares.

Ejemplo 13

Terminación del ensayo y conclusión

A los 21 días después de la exposición intravenosa, los terneros fueron sacrificados mediante una inyección mortal y se terminó el ensayo. Durante este periodo de tiempo, los novillos no vacunados nunca recuperaron su estado de salud en comparación con los novillos vacunados. Tras un análisis visual a simple vista, los novillos vacunados tenían un mayor peso corporal en comparación con sus compañeros no vacunados. Los resultados mostraron una diferencia positiva en el peso debida a la vacunación, probablemente debida al control de la infectividad del organismo de la exposición.

El análisis post-mortem no reveló diferencias anormales en los órganos internos. Se extrajeron los hígados y se analizaron para evaluar los focos necróticos mediante una disección. No pudieron observarse focos necróticos ni lesiones visibles en ninguno de los hígados tras un análisis a simple vista. Cada hígado se diseccionó y las secciones se extrajeron para un análisis histológico, para determinar si podían observarse anomalías o cambios debidos a la exposición intravenosa entre los novillos vacunados y los no vacunados. El análisis hepático de las secciones hepáticas teñidas con hematoxilina y eosina revela cambios microscópicos en los controles no vacunados. Los novillos no vacunados mostraron un abanico de patologías, desde pequeños focos de inflamación de linfocitos hasta focos pronunciados con necrosis y hemorragia. Los abscesos hepáticos eran lo suficientemente grandes como para ser observables mediante una observación visual si se deja continuar la infección. Dichas patologías normalmente no se observan en los novillos vacunados.

Estos resultados demuestran claramente que la vacunación con la composición según se describe en los Ejemplos 8 y 10 disminuye la carga del organismo de la exposición sistemáticamente, lo que redujo la morbilidad global de la enfermedad y disminuyó la necrosis hepática del hígado.

Ejemplo 14

Identificación de proteínas de membrana serorreactivas de F. necrophorum mediante el uso de un análisis por inmunotransferencia Western

Las proteínas de la composición de vacuna según se ha descrito en el Ejemplo 5 se sometieron a una electroforesis seguida de un análisis por inmunotransferencia western con suero hiperinmunizado según se ha descrito en el Ejemplo 10. En resumen, las proteínas de membrana derivadas de F. necrophorum cultivadas en unas condiciones limitantes de hierro fueron fraccionadas por tamaños en un gel de SDS-PAGE mediante el uso de un gel adherente al 4 % y de un gel de resolución al 10 %. Se combinaron 10 μl de muestra con 30 μl de tampón reductor de muestra de SDS (Tris-HCL 62,5 mM a pH 6,8, glicerol al 20 %, SDS al 2 %, β-mercaptoetanol al 5 %) y se hirvieron durante 4 minutos. Las muestras se electroforetizaron a una corriente constante de 18 mA durante 5 horas a 4 ºC mediante el uso de una celda Protein II xi y una fuente de energía modelo 1000/500 (BioRad Laboratories, Richmond, CA). La migración de las bandas se visualizó mediante el uso de estándares de caleidoscopio de amplio espectro (BioRad) para ayudar en la electroinmunotransferencia, mientras que se usaron estándares biotinilados de amplio espectro como referencias de peso molecular para la inmunotransferencia, véase la Figura 5. Para el análisis por inmunotransferencia Western, las proteínas se electrotransfirieron desde el gel a membranas de inmunotransferencia de nitrocelulosa (BioRad) durante una noche, a 4 ºC a 50 V, en tampón Towbin (Tris 25 mM,

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glicina 192 mM, metanol al 20 %) mediante el uso de una celda de transferencia BioRad TransBlot y una fuente de energía Pac 300 (BioRad). La membrana de nitrocelulosa se bloqueó mediante el uso de gelatina de pescado al 3 % (Sigma Chemical, St. Louis, Mo) en solución salina tamponada con Tris (TBS, Tris 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5) durante 1 hora con agitación a 37 ºC. La membrana se secó a 37 ºC y se bloqueó con TBS que contiene gelatina de pescado al 3 %, y se repitió este proceso. Después la membrana se sondeó con los sueros policlonales hiperinmunizados recogidos a partir de los novillos inmunizados según se ha descrito en el ejemplo 10. El anticuerpo primario se diluyó a 1/2.500 en TBS que contiene gelatina de pescado al 1 %, Tween 20 al 0,05 % y azida de sodio al 0,2 % (tampón de anticuerpo). La membrana se incubó con la solución de anticuerpo primario durante una noche en un agitador a la temperatura ambiente. Después la membrana se lavó dos veces con TBS que contiene Tween 20 al 0,05 % (TTBS) y se transfirió al tampón de anticuerpo que contiene una dilución 1/10.000 del clon BG-18 de IgG anti-bovina de ratón conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma) y una dilución a 1/3.000 de avidina conjugada con fosfatasa alcalina (BioRad). La membrana se incubó a 37 ºC durante 2 horas en un agitador, después se lavó con TTBS cuatro veces para eliminar el conjugado no unido. El transferido se resolvió en solución de sustrato que contiene reactivo colorante A y B de fosfato alcalino en 1x AP de tampón de desarrollo de color (BioRad) durante 30 min a 37 ºC en un agitador. El inmunotransferido Western resultante fue documentado mediante el uso de un densitómetro BioRad GS-800 (véase la Figura 5 B).

El fin de este análisis era determinar cuáles de las proteínas presentes en la composición inmunizante inducían respuestas de anticuerpos después de la inmunización de los novillos. Los resultados revelaron reactividad inmunológica, con bandas en las regiones de 82,9 kDa, de 65,4 y de 49 kDa, así como bandas en los intervalos de 45,2 kDa -38,5 kDa y de 31 kDa -27,9 kDa. Estos resultados demostraron que las proteínas de membrana de la composición descritas en el Ejemplo 3 reaccionaban con fuerza con los sueros hiperinmunizados descritos en el Ejemplo 10, lo que sugiere que estos componentes de la vacuna pueden proporcionar protección frente a la enfermedad. El resto de las proteínas con unos pesos moleculares aproximados (en kDa) de 140,5, de 72,9, de 42,7, de 40,4, de 39,9, de 33,6 y de 33, no mostraron ninguna reactividad frente a los sueros hiperinmunizados. Sin embargo, los límites de sensibilidad del ensayo pueden haber impedido la detección de unas interacciones más débiles que, aunque menos evidentes, todavía pueden contribuir a la eficacia de la vacuna al aumentar la respuesta inmunitaria frente a la composición. Además, las proteínas que no eran serorreactivas en este ensayo pueden desencadenar respuestas diferentes a la producción de anticuerpos, tales como la estimulación de citocinas, de interferón, de interleucinas, de linfocitos T o de factores estimulantes de colonias. Dichas respuestas podrían mejorar, dirigir o restaurar la capacidad del sistema inmunitario del hospedador para luchar contra la enfermedad.

Ejemplo 15

Procedimientos para la identificación de las proteínas de membrana derivadas de Fusobacterium mediante el uso de una cromatografía líquida de alta presión en fase inversa

La composición de vacuna descrita en los Ejemplos 1 y 5 consiste en múltiples proteínas de membrana derivadas de Fusobacterium cultivadas en unas condiciones restrictivas en hierro. Con objeto de identificar qué proteínas de la composición son eficaces, se llevaron a cabo experimentos para separar estas proteínas para ensayar su antigenicidad individual. Inicialmente se investigó en nuestro laboratorio una electroforesis bidimensional tradicional como un procedimiento para separar las proteínas de membrana derivadas de una bacteria gramnegativa cultivada en unas condiciones limitadas en hierro. El procedimiento demostró tener un éxito limitado, dado que muchas de las grandes proteínas de membrana no pudieron ser separadas mediante este procedimiento. Para conseguir una mejor separación de las proteínas y una clarificación adicional de los antígenos objetivo de la vacuna, se estandarizaron procedimientos para la utilización de una cromatografía líquida de alta presión en fase inversa (RP-HPLC) basada en la hidrofobicidad, y se han usado para separar las proteínas de membrana derivadas de Fusobacterium y de otras bacterias gramnegativas cultivadas en unas condiciones restrictivas en hierro. En resumen, las proteínas de membrana se prepararon según se ha descrito en el Ejemplo 1. Las proteínas se solubilizaron en tampón de solubilización de membrana (urea 5 M, tiourea 2 M, glicerol al 10 %, 2,5 % p/v de sulfonato de N-decil-N,N-dimetil-3amonio-1-propano, Tris 50 mM, n-octilglucósido al 2 %, clorhidrato de Tris-(carboxietil) fosfina 5 mM, inhibidor de la proteasa 1 mM) durante 24 h a 4 ºC. Para la separación de las proteínas se usó un procedimiento de cromatografía líquida bidimensional (CL 2-D). La primera dimensión era una CL de cromatoenfoque, mediante el uso de una columna HPCF-1D (Eprogen, Darien, IL) y de una HPLC System Gold (Beckman Coulter, Buckinghamshire, Inglaterra). El gradiente de pH se generó mediante el uso de un tampón inicial (SB) y un tampón de elución (EB). El SB consistía en urea 6 M y Bis-Tris 25 mM, ajustado a pH 8,5 con ácido iminodiacético. El EB consistía en urea 6 M, un 10 % de Polybuffer™ 74 (Amersham Biosciences), ajustado a pH 4,0 con hidróxido de amonio. Antes de la aplicación de la muestra, se preparó la columna de HPCF-1D mediante un lavado de 1 hora con agua seguido de un equilibrado con 10 volúmenes de SB hasta que el pH del efluyente era de 8,5. Después se aplicó la muestra y se estableció un gradiente de pH mediante la adición del EB a la columna a 0,2 ml/min. El pH del efluyente de la fase móvil se monitorizó en línea mediante el uso de una celda de flujo de pH postdetector con un volumen muerto de aproximadamente 150 μl. Las fracciones se recogieron cada 0,3 unidades de pH mediante el uso de un recolector de fracciones. Se recogió un total de 26 fracciones de la columna de cromatoenfoque. Las separaciones se monitorizaron mediante la medición de la absorbancia (a 280 nm) de las fracciones eluídas. La segunda dimensión de la CL 2-D es una HPLC en fase inversa no porosa. Las separaciones se realizaron con una columna de RP-HPLC empaquetada con microesferas de sílice C-18 no porosa 1,5 μM (ODS-IIE, Eprogen) con un caudal de 700 μl/min. Se usó un gradiente de dos disolventes. El disolvente A consistía en agua nanopura con un 0,1 % de ácido

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Claims (1)

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