ES2587395T3 - Procedimientos para la producción de células IPS usando un enfoque no vírico - Google Patents

Procedimientos para la producción de células IPS usando un enfoque no vírico Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para proporcionar una población celular que tiene un estado de diferenciación alterado respecto a una población celular de partida y que tiene células que están esencialmente exentas de elementos genéticos vectoriales de programación, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) obtener una población de partida de células que tienen un primer estado de diferenciación, b) obtener uno o más vectores de programación de la diferenciación, comprendiendo cada vector un origen de replicación y uno más módulos de expresión que codifican uno o más factores de programación de la diferenciación que, en combinación, pueden alterar el estado de diferenciación de la población celular de partida hasta un segundo estado de diferenciación, en el que uno o más de dichos módulos de expresión comprenden una secuencia nucleotídica que codifica un factor de acción en trans que se une al origen de replicación para replicar un molde extracromosómico y/o en el que las células de la población de partida expresan dicho factor de acción en trans, c) introducir el vector o vectores de programación de la diferenciación en células de la población de partida, d) cultivar las células para efectuar la expresión de dicho uno o más factores de programación de la diferenciación de tal modo que surjan los atributos consistentes con el segundo estado de diferenciación en al menos una porción de las células en las células cultivadas y e) cultivar además células que tienen los atributos durante un número suficiente de generaciones para proporcionar una población celular diana que comprenda células que tienen el segundo estado de diferenciación, pero estando dichas células esencialmente exentas de elementos genéticos vectoriales de programación.

Description

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error inherente del dispositivo, del procedimiento que se esté empleando para determinar el valor o de la variación que exista entre los sujetos de estudio.
Resultarán evidentes otros objetos, rasgos y ventajas dados a conocer en la presente memoria a partir de la siguiente descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar además ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en la presente memoria.
FIG. 1A-C: Genoma de EBV y origen de replicación latente del plásmido (oriP).
FIG. 2: Un modelo basado en dominios y representación de la estructura parcial de EBNA-1.
FIG. 3: Un ejemplo ilustrativo de un plásmido de esqueleto receptor usado en la presente invención.
FIG. 4: Ejemplos de módulos para integrar en un plásmido de esqueleto receptor. Los ejemplos de promotores que podrían usarse para expresión incluyen, pero sin limitación, PGK, CMV, SV40 y EF1a.
FIG. 5: Un ejemplo ilustrativo de un plásmido de reprogramación que codifica Sox-2, Oct-4, Nanog y Lin28 (opcionalmente).
DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS
I. La presente invención
La presente invención supera varios problemas importantes con las tecnologías actuales de reprogramación o programación de la diferenciación de diversas etapas de desarrollo de células, tales como generar células madre pluripotentes inducidas que estén esencialmente exentos de vectores víricos o elementos exógenos. En contraposición con los procedimientos anteriores que usan vectores víricos integrativos, estos procedimientos usan vectores de reprogramación o programación de la diferenciación extracromosómicos, por ejemplo plásmidos basados en elementos de EBV, para transducir los factores de reprogramación o programación de la diferenciación hasta células somáticas o células madre, cultivar estas células y seleccionar en las células de progenie una o más características de células madre embrionarias o en las células atributos consistentes con el estado de diferenciación alterado deseado. Los vectores replicados extracromosómicamente, como vectores basados en elementos de EBV, no se integrarán en el genoma de la célula hospedadora y se perderán con el tiempo después de un periodo suficiente para inducir a las células hasta un estado celular pluripotente o deseado. Un rasgo inherente de estos procedimientos producirá células de progenie esencialmente exentas de elementos genéticos exógenos y una selección negativa puede facilitar el proceso. Estos procedimientos posibilitan el aislamiento de iPS o de cualquier tipo celular deseado esencialmente exento de elementos vectoriales mediante la alteración del estado de diferenciación. Por tanto, las nuevas composiciones y procedimientos posibilitarán la fabricación iPS exentos de vector u otros tipos celulares deseados para terapia sin el riesgo de mutagénesis causado por la inserción aleatoria
o expresión persistente de elementos víricos en las células. Se describen a continuación realizaciones y ventajas adicionales de la invención.
II. Definiciones
“Reprogramación” es un proceso que confiere a una célula una capacidad aumentada mensurablemente de formar progenie de al menos un nuevo tipo celular, tanto en cultivo como in vivo, distinto del que tendría en las mismas condiciones sin reprogramación. Más específicamente, la reprogramación es un proceso que confiere a una célula somática el potencial pluripotente. Esto significa, después de una proliferación suficiente, una proporción mensurable de progenie que tiene características fenotípicas del nuevo tipo celular si esencialmente dicha progenie no podría haberse formado antes de reprogramar; de otro modo, la proporción que tiene características del nuevo tipo celular es mensurablemente mayor que antes de reprogramar. En ciertas condiciones, la proporción de progenie con características del nuevo tipo celular puede ser de al menos aproximadamente un 1, 5, 25 % o más en orden de preferencia creciente.
“Programación de la diferenciación” es un proceso que cambia una célula formando progenie de al menos un nuevo tipo celular con un nuevo estado de diferenciación, tanto en cultivo como in vivo, distinto del que tendría en las mismas condiciones sin reprogramación de la diferenciación. Este proceso incluye diferenciación, desdiferenciación y transdiferenciación. “Diferenciación” es el proceso mediante el cual una célula menos especializada se vuelve un tipo celular más especializado. “Desdiferenciación” es un proceso celular en que una célula parcial o terminalmente diferenciada revierte a una etapa de desarrollo previa, tal como pluripotencia o multipotencia. “Transdiferenciación” es un proceso de transformación de un tipo celular diferenciado en otro tipo celular diferenciado.
Un “origen de replicación” ("ori") es una secuencia de ADN, p.ej. en un herpesvirus linfotrófico, que cuando está 8
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presente en un plásmido en una célula es capaz de mantener las secuencias ligadas en el plásmido y/o en un sitio en o cerca de donde se inicia la síntesis de ADN. El ori de EBV incluye secuencias de FR (20 copias imperfectas de una repetición de 30 pb) y preferiblemente secuencias de DS, sin embargo, otros sitios de EBV se unen a EBNA-1, p.ej. las secuencias Rep* pueden sustituir a DS como origen de replicación (Kirshmaier y Sugden, 1998). Por tanto, un origen de replicación de EBV incluye secuencias FR, DS o Rep* o cualquier secuencia funcionalmente equivalente mediante modificaciones de ácido nucleico o combinación sintética derivada de las mismas. Por ejemplo, la presente invención puede usar también un origen de replicación genomanipulado de EBV, tal como mediante la inserción o mutación de elementos individuales, como se describe específicamente en Lindner, et al., 2008.
Un herpesvirus “linfotrófico” es un herpesvirus que se replica en un linfoblasto (p.ej. un linfoblasto B humano) u otro tipo celular y se replica extracromosómicamente durante al menos una parte de su ciclo vital natural. Después de infectar un hospedador, estos virus infectan latentemente el hospedador manteniendo el genoma vírico como un plásmido. El herpesvirus simple (HSV) no es un herpesvirus “linfotrótico”. Los herpesvirus linfotróficos ejemplares incluyen, pero sin limitación, EBV, herpesvirus de sarcoma de Kaposi (KSHV), herpesvirus de Saimiri (HS) y virus de la enfermedad de Marek (MDV).
Un “vector” o “constructo” (al que a veces se hace referencia como “vehículo” de suministro génico o transferencia génica) hace referencia a una macromolécula o complejo de moléculas que comprende un polinucleótido para suministrar a una célula hospedadora, tanto in vitro como in vivo.
Un “plásmido”, un tipo común de vector, es una molécula de ADN extracromosómica separada del ADN cromosómico que es capaz de replicarse independientemente del ADN cromosómico. En ciertos casos, es circular y bicatenario.
Un “molde”, como se usa en la presente memoria, es una molécula de ADN que se une específicamente a una proteína de tipo silvestre de un herpesvirus linfotrófico, correspondiendo dicha proteína de tipo silvestre a EBNA-1, como resultado de la presencia en ese molde de una secuencia de ADN que se une a la proteína de tipo silvestre con una afinidad que es al menos un 10 % de la de unión de una secuencia de ADN correspondiente al oriP de EBV por la proteína de tipo silvestre, y desde la que se inicia y/o potencia opcionalmente la transcripción del molde después de la unión de la proteína y/o la potenciación del mantenimiento de dicho molde en una célula. Un “molde integrado” es aquel que se mantiene establemente en el genoma de la célula, p.ej. integrado en un cromosoma de esa célula. Un “molde extracromosómico” es aquel que se mantiene establemente en una célula pero que no se integra en el cromosoma.
Se entiende por “constructo de expresión” o “módulo de expresión” una molécula de ácido nucleico que es capaz de dirigir la transcripción. Un constructo de expresión incluye, al menos, un promotor o una estructura funcionalmente equivalente a un promotor. Pueden incluirse también elementos adicionales tales como un potenciador y/o una señal de terminación de la transcripción.
El término “exógeno”, cuando se usa con relación a una proteína, gen, ácido nucleico o polinucleótido en una célula u organismo, hace referencia a una proteína, gen, ácido nucleico o polinucleótido que se ha introducido en la célula u organismo por medios artificiales o naturales, o con relación a una célula hace referencia a una célula que se ha aislado e introducido posteriormente en otras células o un organismo por medios artificiales o naturales. Un ácido nucleico exógeno puede ser de un organismo o célula diferente, o puede ser una o más copias adicionales de un ácido nucleico que aparece naturalmente dentro del organismo o célula. Una célula exógena puede ser de un organismo diferente, o puede ser del mismo organismo. A modo de ejemplo no limitante, un ácido nucleico exógeno está en una localización cromosómica diferente de las células naturales, o está flanqueado de otro modo por una secuencia de ácido nucleico diferente a la encontrada en la naturaleza.
El término “corresponde a” se usa en la presente memoria para indicar que una secuencia polinucleotídica es homóloga (concretamente, es idéntica, y no evolutivamente relacionada estrictamente) de todo o una porción de una secuencia polinucleotídica de referencia, o que una secuencia polipeptídica es idéntica a una secuencia polipeptídica de referencia. En contraposición, el término “complementario de” se usa en la presente memoria para indicar que la secuencia complementaria es homóloga de toda o una porción de una secuencia polinucleotídica de referencia. Para ilustración, la secuencia nucleotídica “TATAC” corresponde a una secuencia de referencia “TATAC” y es complementaria de una secuencia de referencia “GTATA”.
Un "gen," "polinucleótido”, “región de codificación”, “secuencia”, “segmento”, “fragmento” o “transgén” que “codifica” una proteína particular es una molécula de ácido nucleico que se transcribe y opcionalmente también se traduce en un producto génico, p.ej. un polipéptido, in vitro o in vivo cuando se dispone bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. La región de codificación puede estar presente en forma de ADNc, ADN genómico o ARN. Cuando está presente en forma de ADN, la molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria (concretamente la hebra codificante) o bicatenaria. Los límites de la región de codificación se determinan por un codón de inicio en el extremo 5’ (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3’ (carboxilo). Un gen puede incluir, pero sin limitación, ADNc de ARNm procariótico o eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN procariótico o eucariótico y secuencias de ADN sintético. La secuencia de terminación de la transcripción estará habitualmente
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localizada en 3’ de la secuencia génica.
El término “elementos de control” hace referencia colectivamente a regiones promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores en dirección 5’, orígenes de replicación, sitios de entrada a ribosoma internos (“IRES”), potenciadores, uniones de corte y empalme y similares, que colectivamente proporcionan la replicación, transcripción, procesamiento postranscripcional y traducción de una secuencia de codificación en una célula receptora. No todos estos elementos de control tienen que estar presentes, a condición de que la secuencia de codificación seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una célula hospedadora adecuada.
El término “promotor” se usa en la presente memoria en su sentido ordinario para hacer referencia a una región nucleotídica que comprende una secuencia reguladora de ADN, en el que la secuencia reguladora deriva de un gen que es capaz de unirse a ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación en dirección 3’.
Se entiende por “potenciador” una secuencia de ácido nucleico que, cuando se dispone próxima a un promotor, confiere una actividad de transcripción aumentada respecto a la actividad de transcripción resultante del promotor en ausencia del dominio potenciador.
Se entiende por “ligado operativamente”, con referencia a moléculas de ácido nucleico, que dos o más moléculas de ácido nucleico (p.ej. una molécula de ácido nucleico para transcribir, un promotor y un elemento potenciador) se conectan de tal modo que permitan la transcripción de la molécula de ácido nucleico. “Ligado operativamente” con referencia a moléculas de péptido y/o polipéptido significa que dos o más moléculas de péptido y/o polipéptido están conectadas de tal modo que procuran una única cadena polipeptídica, concretamente un polipéptido de fusión, que tiene al menos una propiedad de cada péptido y/o componente polipeptídico de la fusión. El polipéptido de fusión es preferiblemente quimérico, concretamente compuesto por moléculas heterólogas.
“Homología” hace referencia al porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos polipéptidos. La correspondencia entre una secuencia y la otra puede determinarse mediante técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, la homología puede determinarse mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas polipeptídicas por alineación de la información de secuencia y uso de programas informáticos fácilmente disponibles. Como alternativa, la homología puede determinarse mediante la hibridación de polinucleótidos en condiciones que formen dúplex estables entre regiones homólogas, seguido de digestión con nucleasa o nucleasas específicas de una cadena y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos secuencias de ADN, o polipeptídicas, son “sustancialmente homólogas” entre sí cuando al menos aproximadamente un 80 %, preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 95 % de los nucleótidos o aminoácidos coinciden respectivamente en una longitud definida de las moléculas, como se determina usando los procedimientos anteriores.
El término “célula” se usa en la presente memoria en su sentido más amplia en la materia y hace referencia a un cuerpo vivo que es una unidad estructural de tejido de un organismo multicelular, está rodeado por una estructura de membrana que la aísla del exterior, tiene la capacidad de autorreplicación y tiene información genética y un mecanismo para expresarla. Las células usadas en la presente memoria pueden ser células de origen natural o células modificadas artificialmente (p.ej., células de fusión, células modificadas genéticamente, etc.).
Como se usa en la presente memoria, el término “célula madre” hace referencia a una célula capaz de autorreplicación y pluripotencia. Típicamente, las células madre pueden regenerar un tejido lesionado. Las células madre de la presente memoria pueden ser, pero sin limitación, células madre embrionarias (ES) o células madre de tejido (también llamados células madre específicas de tejido o células madre somáticas). Cualquier célula producida artificialmente que pueda tener las capacidades anteriormente descritas (p.ej. células de fusión, células reprogramadas o similares usadas en la presente memoria) puede ser un citoblasto.
Los “células madre embrionarias (ES)” son células madre pluripotentes derivadas de embriones tempranos. Se estableció por primera vez un ES en 1981, que se ha aplicado también a la producción de ratones con desactivación génica desde 1989. En 1998, se estableció un ES humano, que se está poniendo actualmente a disposición para medicina regenerativa.
Al contrario que los ES, las células madre de tejido tienen un potencial de diferenciación limitado. Las células madre de tejido están presentes en localizaciones particulares en tejidos y tienen una estructura intracelular indiferenciada. Por lo tanto, la pluripotencia de las células madre de tejido es típicamente baja. Las células madre de tejido tienen una alta relación de núcleo/citoplasma y tienen pocos orgánulos intracelulares. La mayoría de células madre de tejido tienen una baja pluripotencia, un ciclo celular largo y capacidad proliferativa más allá de la vida del individuo. Las células madre de tejido se separan en categorías basándose en los sitios de los que derivan las células, tales como el sistema dérmico, el sistema digestivo, el sistema medular óseo, el sistema nervioso y similares. Las células madre de tejido en el sistema dérmico incluyen células madre epidérmicos, células madre de folículo piloso y similares. Las células madre de tejido del sistema digestivo incluyen células madre pancreáticas (comunes), células madre hepáticas y similares. Los células madre de tejido del sistema medular óseo incluyen células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimáticas y similares. Los células madre de tejido del sistema nervioso
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incluyen células madre neurales, células madre retinianas y similares.
“Células madre pluripotentes inducidas”, abreviado comúnmente como iPS o iPSC, hace referencia a un tipo de célula madre pluripotente preparada artificialmente a partir de una célula no pluripotente, típicamente una célula somática adulta, o célula terminalmente diferenciada tal como un fibroblasto, una célula hematopoyética, un miocito, una neurona, una célula epidérmica o similares, mediante la inserción de ciertos genes a los que se hace referencia como factores de reprogramación.
"Pluripotencia” hace referencia a una célula madre que tiene el potencial de diferenciarse en todas las células constituyentes de uno o más tejidos u órganos, o preferiblemente cualquiera de las tres capas germinales: endodermo (revestimiento interior del estómago, tracto gastrointestinal, pulmones), mesodermo (músculo, hueso, sangre, sistema urogenital) y ectodermo (tejidos epidérmicos y sistema nervioso). Las “células madre pluripotentes” usados en la presente memoria hacen referencia a células que pueden diferenciarse en células derivadas de cualquiera de las tres capas germinales, por ejemplo descendientes directas de células totipotentes o células pluripotentes inducidas.
Como se usa en la presente memoria, “células madre totipotentes” hace referencia a células que tienen la capacidad de diferenciarse en todas las células constituyentes de un organismo, tales como las células que se producen por la fusión de un óvulo y un espermatozoide. Las células producidas por las primeras pocas divisiones del óvulo fertilizado son también totipotentes. Estas células pueden diferenciarse en tipos celulares embrionarios y extraembrionarios. Las células madre pluripotentes pueden dar lugar a cualquier tipo celular fetal o adulto. Sin embargo, solos no pueden desarrollarse hasta un animal fetal o adulto porque carecen del potencial de contribuir al tejido extraembrionario, tal como la placenta.
En contraposición, muchas células progenitoras son multipotentes, concretamente son capaces de diferenciación en un número limitado de destinos celulares. Las células progenitoras multipotentes pueden dar lugar a varios otros tipos celulares, pero esos tipos están limitados en número. Es un ejemplo de una célula madre multipotente una célula hematopoyética, una célula madre sanguínea que puede desarrollarse hasta varios tipos de células sanguíneas, pero no puede desarrollarse hasta células cerebrales u otros tipos de células. Al final de la larga serie de divisiones celulares que forman el embrión, están las células que están terminalmente diferenciadas, o que se considera que están permanentemente dedicadas a una función específica.
“Autorrenovación” hace referencia a la capacidad de pasar por numerosos ciclos de división celular manteniendo el estado indiferenciado.
Como se usa en la presente memoria, el término “célula somática” hace referencia a cualquier célula distinta de las células germinales, tales como óvulo, esperma o similares, que no transfiere directamente su ADN a la siguiente generación. Típicamente, las células somáticas tienen una pluripotencia limitada o nula. Las células somáticas usadas en la presente memoria pueden ser de origen natural o modificadas genéticamente.
Las células están “sustancialmente exentas” de elementos genéticos exógenos, como se usa en la presente memoria, cuando tienen menos de un 10 % del elemento o elementos y están “esencialmente exentas” de elementos genéticos exógenos cuando tienen menos de un 1 % del elemento o elementos. Sin embargo, son aún más deseables las poblaciones celulares en las que menos de un 0,5 % o menos de un 0,1 % de la población celular total comprende elementos genéticos exógenos. Por tanto, poblaciones de iPS en las que menos de un 0,1 a un 10 % (incluyendo todos los porcentajes intermedios) de las células de la población comprenden elementos genéticos exógenos.
III. Antecedentes generales para células madre pluripotentes inducidas
En ciertas realizaciones de la invención, se dan a conocer procedimientos de reprogramación de células somáticas mediante la introducción de factores de reprogramación en las células somáticas con un sistema basado en vector extracromosómico. La progenie de estas células podría ser idéntica a las células madre embrionarios en diversos aspectos como se describen a continuación, pero esencialmente exentas de elementos genéticos exógenos. La comprensión de las características de las células madre embrionarios podría ayudar a seleccionar las células madre pluripotentes. Podrían usarse para estos procedimientos novedosos factores de reprogramación conocidos de los estudios de reprogramación de células madre. Se contempla además que estas células madre pluripotentes inducidas podrían usarse potencialmente para reemplazar a células madre embrionarias para aplicaciones terapéuticas y de investigación debido a la traba ética de usar estos últimos,
A. Células madre
Los células madre son células encontradas en la mayoría, si no todos, los organismos multicelulares. Se caracterizan por la capacidad de autorrenovarse mediante división celular mitótica y diferenciación en un diverso intervalo de tipos celulares especializados. Los dos tipos genéricos de células madre de mamífero son: células madre embrionarias que se encuentran en los blastocitos y células madre adultas que se encuentran en tejidos adultos. En un embrión en desarrollo, las células madre pueden diferenciarse en todos los tejidos embrionarios especializados. En organismos adultos, las células madre y células progenitoras actúan como un sistema de
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reparación para el cuerpo, reponiendo las células especializadas pero manteniendo también el recambio normal de órganos regenerativos, tales como sangre, piel o tejidos intestinales.
Como las células madre pueden crecer y transformarse en células especializadas con características consistentes con las células de diversos tejidos tales como músculos o nervios mediante cultivo celular, se ha propuesto su uso en terapias médicas. En particular, las líneas celulares embrionarias, células madre embrionarias autólogas generados mediante clonación terapéutica y células madre adultas altamente plásticas de la sangre del cordón umbilical o de la médula ósea se publicitan como candidatos prometedores. Más recientemente, la reprogramación de células adultas hasta células madre pluripotentes inducidas tiene un enorme potencial para reemplazar a los células madre embrionarias.
B. Células madre embrionarias
Las líneas celulares de células madre embrionarias (líneas celulares de ES) son cultivos de células derivadas del tejido epiblástico de la masa celular interna (ICM) de embriones de etapa de blastocito o mórula temprana. Un blastocito es un embrión de etapa temprana de aproximadamente 4 a 5 días en seres humanos y que consiste en 50-150 células. Los ES son pluripotentes y dan lugar durante el desarrollo a todos los derivados de las tres capas germinales primarias: ectodermo, endodermo y mesodermo. En otras palabras pueden desarrollarse hasta cualquiera de los más de 200 tipos celulares del cuerpo adulto cuando se les da la estimulación suficiente y necesaria para un tipo celular específico. No contribuyen a las membranas extraembrionarias o a la placenta.
Casi toda la investigación hasta la fecha ha tenido lugar usando células madre embrionarias de ratón (mES) o células madre embrionarias humanas (hES). Ambos tienen las características de células madre esenciales, aunque requieren entornos muy diferentes para mantener un estado indiferenciado. Los ES de ratón pueden crecer en una capa de gelatina y requieren la presencia del factor inhibidor de leucemia (LIF). Los ES humanos podrían crecer en una capa alimentadora de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y requieren a menudo la presencia de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF o FGF-2). Sin condiciones de cultivo óptimas o manipulación genética (Chambers et al., 2003), las células madre embrionarias se diferenciarán rápidamente.
Una célula madre embrionaria humana puede definirse también por la presencia de varios factores de transcripción y proteínas de superficie celular. Los factores de transcripción Oct-4, Nanog y Sox-2 forman la red reguladora principal que asegura la supresión de los genes que conducen a la diferenciación y el mantenimiento de la pluripotencia (Boyer et al., 2005). Los antígenos de superficie celular más comúnmente usados para identificar hES incluyen los glicolípidos SSEA3 y SSEA4 y los antígenos de sulfato de queratano Tra-1-60 y Tra-1-81.
Después de 20 años de investigación, no hay tratamientos aprobados ni ensayos humanos que usen células madre embrionarias. Los ES, al ser células pluripotentes, requieren señales específicas para una correcta diferenciación, si se inyectan directamente al cuerpo, los ES se diferenciarán en muchos tipos diferentes de células, causando un teratoma. Diferenciar los ES en células utilizables evitando el rechazo de trasplante es solo una de las trabas a las que los investigadores de células madre embrionarias se enfrentan. Muchos países tienen actualmente moratorias sobre la investigación de ES o la producción de nuevas líneas de ES. Debido a sus capacidades combinadas de expansión ilimitada y pluripotencia, las células madre embrionarias siguen siendo una fuente teóricamente potencial de medicina regenerativa y reemplazo de tejido después de lesión o enfermedad. Sin embargo, un modo de evitar estos problemas es inducir el estado pluripotente en células somáticas mediante reprogramación directa.
C. Factores de reprogramación
La generación de iPS es crucial en los genes usados para inducción. Los siguientes factores o combinaciones de los mismos podrían usarse en el sistema vectorial dado a conocer en la presente invención. En ciertos aspectos, los ácidos nucleicos que codifican Sox y Oct (preferiblemente Oct3/4) se incluirán en el vector de reprogramación. Por ejemplo, un vector de reprogramación puede comprender módulos de expresión que codifican Sox-2, Oct-4, Nanog y opcionalmente Lin-28, o módulos de expresión que codifican Sox-2, Oct-4, Klf4 y opcionalmente c-myc, o módulos de expresión que codifican Sox-2, Oct-4 y opcionalmente Esrrb. Los ácidos nucleicos que codifican estos factores de reprogramación pueden estar comprendidos en el mismo módulo de expresión, diferentes módulos de expresión, el mismo vector de reprogramación o diferentes vectores de reprogramación.
Se ha identificado a Oct-3/4 y ciertos miembros de la familia del gen Sox (Sox-1, Sox-2, Sox-3 y Sox-15) como reguladores transcripcionales cruciales implicados en el proceso de inducción cuya ausencia hace imposible la inducción. Sin embargo, se han identificado genes adicionales, que incluyen ciertos miembros de la familia de Klf (KIf-2, Klf-2, Kif-4 y Klf-5), la familia de Myc (C-myc, L-myc y N-myc), Nanog y LIN28, que aumentan la eficacia de inducción.
Oct-3/4 (Pou5f1) es uno de la familia de factores de transcripción octaméricos ("Oct") y desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la pluripotencia. La ausencia de Oct-3/4 en las células Oct-3/4+, tales como blastómeros y células madre embrionarias, conduce a una diferenciación trofoblástica espontánea, y la presencia de Oct-3/4 da lugar por tanto a la pluripotencia y el potencial de diferenciación de las células madre embrionarias. Diversos otros genes de la familia de “Oct”, incluyendo parientes cercanos a Oct-3/4, Oct1 y Oct6, no consiguen desencadenar la inducción, demostrando por tanto la exclusividad de Oct-3/4 para el proceso de inducción.
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en el genoma hospedador de modo estable. Contienen una transcriptasa inversa que permite la integración en el genoma del hospedador. Los lentivirus son una subclase de retrovirus. Están ampliamente adaptados como vectores gracias a su capacidad de integrarse en el genoma de células no en división así como en división. Estos vectores víricos se han usado ampliamente también en un contexto más amplio: la programación de la diferenciación de células, incluyendo desdiferenciación, diferenciación y transdiferenciación. El genoma vírico en forma de ARN se transcribe de forma inversa cuando el virus entra en la célula produciendo ADN, que se inserta entonces en el genoma en una posición aleatoria por la enzima integrasa vírica. Por lo tanto, la tecnología actual de reprogramación exitosa depende de enfoques víricos basados en la integración.
Sin embargo, con la presente tecnología, la integración orientada no es aún rutinaria (Bode et al., 2000b) y la alternativa convencional, integración aleatoria, puede conducir a mutagénesis de inserción con consecuencias impredecibles sobre las células madre pluripotentes inducidas. Por las mismas razones, no puede controlarse la expresión del transgén, puesto que depende del contexto de cromatina del sitio de integración (Baer et al., 2000). La expresión de alto nivel puede conseguirse solo en loci genómicos favorables, pero existe el peligro de que la integración en sitios altamente expresados interfiera con las funciones celulares vitales de los células madre pluripotentes inducidas.
Además, existen evidencias crecientes de la existencia de mecanismos de defensa celular contra el ADN extraño que funcionan regulando negativamente transgenes en un proceso que está acompañado por la metilación de ADN (Bingham, 1997, Garrick et al., 1998). Además, los componentes víricos pueden actuar junto con otros factores para transformar células. Acompañada de una expresión continua de una serie de genes víricos, la persistencia de al menos parte del genoma vírico en la célula puede causar la transformación celular. Estos genes pueden interferir con una ruta de señalización celular, causando los cambios fenotípicos observados de la célula que conducen a una célula transformada que muestra una división celular aumentada, que es favorable para el virus.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la presente invención desarrolla procedimientos para generar células madre pluripotentes inducidas y otros tipos celulares deseados esencialmente exentos de elementos genéticos exógenos, tales como el vector retrovírico o lentivírico usado en los procedimientos anteriores. Estos procedimientos hacen uso de vectores de replicación extracromosómica, o vectores capaces de replicarse episómicamente. Una serie de plásmidos que contienen virus de ADN, tales como adenovirus, virus vacuolante de simio 40 (SV40) o papilomavirus bovino (BPV) o ARS de levadura incipiente (secuencias de replicación autónoma), se replican extracromosómica o episómicamente en células de mamífero. Estos plásmidos episómicos están intrínsecamente exentos de todas aquellas desventajas (Bode et al., 2001) asociadas a vectores integrativos, pero nunca se han dado a conocer públicamente para generar células madre pluripotentes inducidas. Uno basado en herpesvirus linfotrófico, incluyendo virus de Epstein Barr (EBV) como se define anteriormente, puede replicarse también extracromosómicamente y ayudar a suministrar genes de reprogramación a células somáticas. Aunque los orígenes de replicación de estos virus o elementos de ARS están bien caracterizados, nunca se han conocido públicamente para reprogramar células diferenciadas hasta esta divulgación.
Por ejemplo, el enfoque basado en plásmido usado en la invención extrae elementos robustos necesarios para la replicación exitosa y mantenimiento de un sistema basado en elementos de EBV sin comprometer la manejabilidad del sistema en un entorno clínico como se describe con detalle a continuación. Los elementos de EBV esenciales son oriP y EBNA-1 o sus variantes o equivalentes funcionales. Es una ventaja adición de este sistema que estos elementos exógenos se perderán con el tiempo después de introducirse en células, conduciendo a iPS automantenidos esencialmente exentos de estos elementos.
A. Virus de Epstein-Barr
El virus de Epstein-Barr (EBV), también llamado herpesvirus humano 4 (HHV-4), es un virus de la familia del herpes (que incluye herpesvirus simple y citomegalovirus) y es uno de los virus más comunes en seres humanos. El EBV mantiene su genoma extracromosómicamente y funciona en colaboración con la maquinaria de la célula hospedadora para una replicación y mantenimiento eficaces (Lindner y Sugden, 2007), basándose solamente en dos rasgos esenciales para su replicación y retención en las células durante la división celular (Yates et al. 1985; Yates et al. 1984). Existe un elemento, al que se hace referencia comúnmente como oriP, en cis y sirve como origen de replicación. El otro factor, EBNA-1, funciona en trans mediante la unión a secuencias en oriP, promoviendo la replicación y mantenimiento de ADN de plásmido. Como ejemplo no limitante, los inventores extraen estos dos rasgos y los usan en el contexto de un plásmido para lanzar los genes necesarios para reprogramar células somáticas, para facilitar la replicación y expresión mantenida de estos genes frente a plásmidos convencionales.
B. OriP
OriP es el sitio en que o cerca del que se inicia la replicación de ADN y está compuesto por dos secuencias de acción en cis separadas por aproximadamente 1 kilopar de bases conocidas como la familia de repeticiones (FR) y la simetría diádica (DS).
FR está compuesta por 21 copias imperfectas de una repetición de 30 pb y contiene 20 sitios de unión de alta afinidad a EBNA-1 (FIG. 1). Cuando FR se une a EBNA-1, sirve tanto como potenciador transcripcional de
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promotores en cis de hasta 10 kb de distancia (Reisman y Sugden, 1986; Yates, 1988; Sugden y Warren, 1989; Wysokenski y Yates, 1989; Gahn y Sugden, 1995; Kennedy y Sugden, 2003; Altmann et al., 2006) como para contribuir a la retención nuclear y el mantenimiento fiel de plásmidos que contienen FR (Langle-Rouault et .al.; 1998; Kirchmaier y Sugden, 1995; Wang et al., 2006; Nanbo y Sugden, 2007). El reparto eficaz de los plásmidos de oriP es también atribuible probablemente a FR. Aunque el virus ha evolucionado para mantener 20 sitios de unión a EBNA-1 en FR, el mantenimiento de plásmido eficaz requiere solo 7 de estos sitios, y puede reconstituirse por un polímero de tres copias de DS, que tiene un total de 12 sitios de unión a EBNA-1 (Wysokenski y Yates, 1989).
El elemento de simetría diádica (DS) es suficiente para la iniciación de la síntesis de ADN en presencia de EBNA-1 (Aiyar et al.) 1998; Yates et al., 2000), y aparece la iniciación en o cerca de DS (Gahn y Schildkraut, 1989; Niller et al., 1995). La terminación de la síntesis de ADN vírico se cree que aparece en FR, porque cuando FR se une a EBNA-1, funciona como barrera de la horquilla de replicación como se observa por electroforesis en gel 2D (Gahn y Schildkraut, 1989; Ermakova et al., 1996; Wang et al., 2006). La iniciación de la síntesis de ADN a partir de DS se permite en un ciclo de una vez por célula (Adams, 1987; Yates y Guan, 1991) y se regula por los componentes del sistema de replicación celular (Chaudhuri et al., 2001; Ritzi et al., 2003; Dhar et al., 2001; Schepers et al., 2001; Zhou et al., 2005; Julien et al., 2004). DS contiene cuatro sitios de unión a EBNA-1, aunque con menor afinidad que aquellos encontrados en FR (Reisman et al., 1985). La topología de DS es tal que los cuatro sitios de unión están dispuestos como dos pares de sitios, con un espaciador de centro a centro de 21 pb entre cada par y un espaciador de centro a centro de 33 pb entre los dos sitios de unión interna no apareados (FIG. 1c) (Baer et al., 1984; Rawlins et al., 1985).
Los papeles funcionales de los elementos en DS se han confirmado por estudios de otra región del genoma de EBV, denominada Rep*, que se ha identificado como un elemento que puede sustituir a DS ineficazmente (Kirchmaier y Sugden, 1998). Polimerizar Rep* 8 veces procuraba un elemento tan eficaz como DS en su apoyo de la replicación (Wang, et al., 2006). La disección bioquímica de Rep* identificaba un par de sitios de unión a EBNA-1 con un espaciador de centro a centro de 21 pb crítico para su función replicativa (ibíd.). Se encontró que el replicador mínimo de Rep* era el par de sitios de unión a EBNA-1, ya que la función replicativa se retenía incluso después de reemplazar todas las secuencias flanqueantes del polímero por secuencias derivadas del fago lambda. Las comparaciones de DS y Rep* han revelado un mecanismo común: estos replicadores apoyan la iniciación de la síntesis de ADN agrupando la maquinaria replicativa celular mediante un par de sitios apropiadamente espaciados, plegados y unidos a EBNA-1.
Hay otros plásmidos extracromosómicos permitidos que se replican en células de mamífero que no están relacionados con EBV, y en algunos modos parecen similares a la zona de iniciación en la cepa Raji de EBV. Hans Lipps y colaboradores han desarrollado y estudiado plásmidos que contienen “regiones de enlazamiento con el soporte/matriz nuclear” (S/MAR) y una unidad transcripcional robusta (Piechaczek et al., 1999; Jenke et al., 2004). Su S/MAR deriva del gen de interferón beta humano, es rica en A/T y se define operativamente por su asociación con la matriz nuclear y su relajación preferencial a baja fuerza iónica o cuando se embebe en ADN superenrrollado (Bode et al., 1992). Estos plásmidos se replican semiconservativamente, se unen a proteínas ORC y apoyan la iniciación de la síntesis de ADN eficazmente de forma aleatoria a lo largo de su ADN (Schaarschmidt et al., 2004). Se mantienen eficazmente en células de hámster y humanas en proliferación sin selección de fármaco y, cuando se introducen en embriones porcinos, pueden apoyar la expresión de GFP en la mayoría de tejidos de animales fetales (Manzini et al., 2006).
C. EBNA-1
El antígeno nuclear 1 de Epstein Barr (EBNA-1) es una proteína de unión a ADN que se une a FR y DS de oriP o Rep*, facilitando la replicación y reparto fiel del plásmido de EBV a las células hija independientemente de, pero concertadamente con, los cromosomas celulares durante cada división celular.
Los 641 aminoácidos (AA) de EBNA-1 se han clasificado en dominios asociados a sus funciones variadas mediante análisis mutacional y delecional (FIG. 2). Dos regiones entre AA40-89 y AA329-378 son capaces de ligar dos elementos de ADN en cis o en trans cuando se unen a EBNA-1, y se han denominado por tanto región de ligamiento 1 y 2 (LR1, LR2) (Middleton y Sugden, 1992; Frappier y O'Donnell, 1991; Su et al., 1991; Mackey et al., 1995). Fusionar estos dominios de EBNA-1 con GFP dirige a GFP a los cromosomas mitóticos (Marechal et al., 1999; Kanda et al., 2001). LR1 y LR2 son funcionalmente redundantes para replicación; una deleción de cualquiera procura un derivado de EBNA-1 capaz de apoyar la replicación de ADN (Mackey y Sugden, 1999; Sears et al., 2004). LR1 y LR2 son ricas en residuos de arginina y glicina, y se parecen al motivo de gancho AT que se une a ADN rico en A/T (Aravind y Landsman, 1998), (Sears et al.; 2004). Un análisis in vitro de LR1 y LR2 de EBNA-1 ha demostrado su capacidad de unirse a ADN rico en A/T (Sears et.al., 2004). Cuando LR1, que contiene uno de dichos ganchos AT, se fusionó con el dominio de unión a ADN y dimerización de EBNA-1, se encontró que era suficiente para la replicación de ADN de plásmidos de oriP, aunque menos eficazmente que la EBNA-1 de tipo silvestre (ibíd.).
LR1 y LR2 difieren, sin embargo. La mitad C-terminal de LR1 está compuesta por aminoácidos distintos que los Arg-Gly repetidos de la mitad N-terminal, y se denomina región única 1 (UR1). La UR1 es necesaria para que EBNA-1 active la transcripción eficazmente a partir de ADN informadores transfectados e integrados que contienen FR (Wu et al., 2002; Kennedy y Sugden, 2003; Altmann et al., 2006). La UR1 es también esencial para la transformación
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eficaz de células B infectadas por EBV. Cuando un derivado de EBNA-1 que carece de este dominio reemplaza a la proteína de tipo silvestre en el contexto del virus completo, estos virus derivados tienen un 0,1 % de la capacidad de transformación del virus de tipo silvestre (Altmann et al., 2006).
La LR2 no se requiere para el apoyo por EBNA-1 de la replicación de oriP (Shire et al., 1999; Mackey y Sugden, 1999; Sears et al., 2004). Adicionalmente, la mitad N-terminal de EBNA-1 puede reemplazarse por proteínas celulares que contienen motivos de gancho AT, tales como HMGA1a, y seguir reteniendo función replicativa (Hung et al., 2001; Sears et al., 2003; Altmann et al., 2006). Estos hallazgos indican que es probable que se requieran las actividades del gancho de AT de LR1 y LR2 para el mantenimiento de oriP en células humanas.
Un tercio de los residuos de EBNA-1 (AA91-328) consiste en repeticiones de glicina-glicina-alanina (GGA), implicadas en la capacidad de EBNA-1 de escapar del sistema inmunitario del hospedador al inhibir la degradación y presentación proteosómica (Levitskaya et al., 1995; Levitskaya et al., 1997). Se ha encontrado también que estas repeticiones inhiben la traducción de EBNA-1 in vitro e in vivo (Yin et al., 2003). Sin embargo, la deleción de gran parte de este dominio no tiene efecto aparente sobre las funciones de EBNA-1 en cultivo celular, haciendo el papel que desempeña este dominio difícil de elucidar.
Se codifica una señal de localización nuclear (NLS) por los AA379-386, que se asocia también con la maquinaria de importación nuclear celular (Kim, et al., 1997; Fischer et al., 1997). Las secuencias con las regiones ricas en Arg-Gly de LR1 y LR2 pueden funcionar también como NLS debido a su alto contenido básico.
Por último, el extremo C (AA458-607) codifica los dominios de unión a ADN y dimerización superpuestos de EBNA
1. La estructura de estos dominios unidos a ADN se ha resuelto por cristalografía de rayos X, y se ha encontrado que es similar al dominio de unión a ADN de la proteína E2 de papilomavirus (Hegde et al., 1992; Kim et al., 2000; Bochkarev et al., 1996).
En realizaciones específicas de la invención, un vector de reprogramación contendrá tanto oriP como una secuencia abreviada que codifica una versión de EBNA-1 competente para apoyar la replicación de plásmido y su mantenimiento apropiado durante la división celular. La secuencia altamente repetitiva en el tercio aminoterminal de EBNA-1 de tipo silvestre y la retirada de una región de 25 aminoácidos que ha demostrado toxicidad en diversas células son prescindibles para la función de acción en trans de EBNA-1 asociada a oriP (Yates et al. 1985; Kennedy et al. 2003). Por lo tanto, podría usarse un derivado ejemplar, la forma abreviada de EBNA-1 conocida como deltaUR1 (el derivado con una secuencia proteica de SEQ ID NO:3, que está codificada por la SEQ ID NO: 4), junto con oriP en este sistema basado en plásmido. Más ejemplos de derivados de EBNA-1 pueden activar la transcripción a partir de un molde extracromosómico (véanse, por ejemplo, Kirchmaier y Sugden, 1997 y Kennedy y Sugden, 2003).
Un derivado de EBNA-1 usado en la invención es un polipéptido que, respecto al correspondiente polipéptido de tipo silvestre, tiene una secuencia aminoacídica modificada. Las modificaciones incluyen la deleción, inserción o sustitución de al menos un residuo aminoacídico en una región correspondiente a la región única (residuos de aproximadamente 65 a aproximadamente 89) de LR1 (residuos de aproximadamente 40 a aproximadamente 89) de EBNA-1, y pueden incluir una deleción, inserción o sustitución de uno o más residuos aminoacídicos en las regiones correspondientes a otros residuos de EBNA-1, p.ej. de aproximadamente el residuo 1 a aproximadamente el residuo 40, de aproximadamente el residuo 90 a aproximadamente 328 (región repetida “Gly-Gly-Ala"), de aproximadamente el residuo 329 a aproximadamente 377 (LR2), de aproximadamente el residuo 379 a aproximadamente 386 (NLS), de aproximadamente el residuo 451 a aproximadamente 608 (unión a ADN y dimerización) o de aproximadamente el residuo 609 a aproximadamente 641, a condición de que el derivado resultante tenga las propiedades deseadas, p.ej. dimerice y se una a ADN que contiene un ori correspondiente a oriP, se localice en el núcleo, no sea citotóxico y active la transcripción a partir de un molde extracromosómico pero no active sustancialmente la transcripción a partir de uno integrado. Las sustituciones incluyen sustituciones que utilizan la forma D en lugar de L, así como otros análogos aminoacídicos conocidos, p.ej. aminoácidos no naturales tales como aminoácidos -disustituidos, Nalquilaminoácidos, ácido láctico y similares. Estos análogos incluyen fosfoserina, fosfotreonina, fosfotirosina, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, ácido hipúrico, ácido octahidroindol-2-carboxílico, estatina, ácido 1,2,3,4tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, penicilamina, ornitina, citrulina, -metilalanina, para-benzoilfenilalanina, fenilglicina, propargilglicina, sarcosina, -N,N,N-trimetil-lisina, -N-acetil-lisina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3metilhistidina, 5-hidroxilisina, omega-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares y terc-butilglicina.
Las sustituciones aminoacídicas conservativas son preferidas, es decir, por ejemplo, aspártico-glutámico como aminoácidos ácidos polares; lisina/arginina/histidina como aminoácidos básicos polares; leucina/isoleucina/metionina/valina/alanina/glicina/prolina como aminoácidos no polares o hidrófobos; serina/treonina como aminoácidos hidrófilos polares o no cargados. La sustitución aminoacídica conservativa incluye también agrupamientos basados en las cadenas laterales. Por ejemplo, es un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; es un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxilo alifático serina y treonina; es un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida asparagina y glutamina; es un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas fenilalanina, tirosina y triptófano; es un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas lisina, arginina e histidina y es un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre cisteína y metionina. Por ejemplo, es
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razonable esperar que el reemplazo de una leucina por isoleucina o valina, de un aspartato por un glutamato, de una treonina por una serina o un reemplazo similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un gran efecto sobre las propiedades del polipéptido resultante. Puede determinarse fácilmente si el cambio aminoacídico da como resultado un polipéptido funcional ensayando la actividad específica del polipéptido.
Las sustituciones aminoacídicas que entran dentro del alcance de la divulgación se logran, en general, seleccionando sustituciones que no difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto peptídico en la zona de sustitución, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos basados en las propiedades de cadena lateral comunes:
1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;
3) ácidos: asp, glu;
4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;
5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro y
6) aromáticos; trp, tyr, phe.
La invención concibe también polipéptidos con sustituciones no conservativas. Las sustituciones no conservativas conllevan el intercambio de un miembro de una de las clases descritas anteriormente por otra.
Pueden prepararse sales de adición de ácido del polipéptido o residuos aminoacídicos del polipéptido poniendo en contacto el polipéptido o amina con uno o más equivalentes del ácido inorgánico u orgánico deseado, tal como por ejemplo ácido clorhídrico. Pueden prepararse también ésteres de grupos carboxilo de los polipéptidos mediante cualquiera de los procedimientos habituales conocidos en la materia.
Los análogos incluyen estructuras que tienen uno o más ligamientos peptídicos opcionalmente reemplazados por un ligamiento seleccionado del grupo consistente en: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis y trans), -CH=CFtrans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-y -CH2SO-mediante procedimientos conocidos en la materia y descritos además en las siguientes referencias: Spatola, 1983; Spatola, 1983; Morley, 1980; Hudson et al., 1979 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola et al., 1986 (-CH2-S); Hann, 1982 (-CH-CH-, cis y trans); Almquist et al., 1980 (-COCH2-); Jennings-White et al., 1982 (-COCH2-); Szelke et al., solicitud europea EP 45665 (-CH(OH)CH2-); Holladay et al., 1983 (-C(OH)CH2-) y Hruby; 1982 (-CH2S-). Es un ligamiento no peptídico particularmente preferido -CH2NH-. Dichos análogos pueden tener mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas potenciadas (semivida, absorción, potencia, eficacia, etc.), especificidad alterada (p.ej. un amplio espectro de actividades biológicas), antigenicidad reducida y prepararse económicamente.
D. Rasgo de exención de residuos
De forma importante, la replicación y mantenimiento de plásmidos basados en oriP son imperfectos y se pierden rápidamente (25 % por división celular) de las células al cabo de las primeras dos semanas de su introducción en las células; sin embargo, aquellas células que retienen el plásmido los pierden menos frecuentemente (3 % por división celular) (Leight y Sugden, 2001; Nanbo y Sugden, 2007). Una vez se retira la selección de células que albergan el plásmido, los plásmidos se perderán durante cada división celular hasta que se hayan eliminado todos ellos con el tiempo, sin dejar huella de su existencia anterior dentro de las células hija resultantes. Es este rasgo de ausencia de huellas lo que subraya el atractivo del sistema basado en oriP como alternativa al enfoque asociado a virus actual para suministrar genes para generar iPS y otras células deseadas con programación de la diferenciación. Se perderán también otros vectores extracromosómicos durante la replicación y propagación de células hospedadoras, y podrían emplearse también en la presente invención.
V. Construcción y suministro de vector
En ciertas realizaciones, podrían construirse vectores de reprogramación o de programación de la diferenciación para comprender elementos adicionales además de las secuencias de ácido nucleico que codifican factores de reprogramación o factores de programación de la diferenciación como se describen anteriormente para expresar estos factores de reprogramación en células. Los rasgos novedosos de estos procedimientos son el uso de vectores de replicación extracromosómica, que no se integrarán en el genoma de la célula hospedadora y pueden perderse durante las generaciones de replicación. Se dan a conocer a continuación los detalles de los componentes de estos vectores y procedimientos de suministro.
A. Vector
El uso de vectores extracromosómicos basados en plásmido o liposoma, p.ej. vectores basados en oriP y/o vectores que codifican un derivado de EBNA-1, permite introducir grandes fragmentos de ADN en una célula y mantenerlos
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extracromosómicamente, replicarlos una vez por ciclo celular, repartirlos a las células hija eficazmente y no desencadenar sustancialmente respuesta inmunitaria. En particular, EBNA-1, la única proteína vírica requerida para la replicación del vector de expresión basado en oriP, no desencadena una respuesta inmunitaria celular debido a que ha desarrollado un mecanismo eficaz para evitar el procesamiento requerido para la presentación de sus antígenos en moléculas de MHC de clase I (Levitskaya et al., 1997). Además, EBNA-1 puede actuar en trans para potenciar la expresión del gen clonado, induciendo la expresión de un gen clonado hasta 100 veces en algunas líneas celulares (Langle-Rouault et al., 1998; Evans et al.; 1997). Finalmente, la fabricación de dichos vectores de expresión basados en oriP es barata.
Otros vectores extracromosómicos incluyen otros vectores basados en herpesvirus linfotróficos. El herpesvirus linfotrófico es un herpesvirus que se replica en un linfoblasto (p.ej. un linfoblasto B humano) y se vuelve un plásmido durante parte de su ciclo vital natural. El herpesvirus simple (HSV) no es un herpesvirus “linfotrófico”. Los herpesvirus linfotróficos ejemplares incluyen, pero sin limitación, EBV, herpesvirus de sarcoma de Kaposi (KSHV), herpesvirus de Saimiri (HS) y virus de la enfermedad de Marek (MDV). Están contempladas todas las demás fuentes de vectores basados en episoma, tales como ARS de levadura, adenovirus, SV40 o BPV.
Un especialista en la materia estaría bien capacitado para construir un vector mediante técnicas recombinantes estándares (véanse, por ejemplo, Maniatis et al., 1988 y Ausubel et al; 1994).
Los vectores pueden comprender también otros componentes o funcionalidades que modulen además el suministro génico y/o la expresión génica, o que proporcionen de otro modo propiedades beneficiosas a las células diana. Dichos otros componentes incluyen, por ejemplo, componentes que influyen en la unión u orientación a células (incluyendo componentes que median la unión específica de tipo celular o tejido), componentes que influyen en la captación del ácido nucleico vectorial por la célula, componentes que influyen en la localización del polinucleótido en la célula después de la captación (tales como agentes que median la localización nuclear) y componentes que influyen en la expresión del polinucleótido.
Dichos componentes podrían incluir también marcadores, tales como marcadores detectables y/o de selección, que pueden usarse para detectar o seleccionar células que han captado y están expresando el ácido nucleico suministrado por el vector. Dichos componentes pueden proporcionarse como un rasgo natural del vector (tal como el uso de ciertos vectores víricos que tienen componentes o funcionalidades que median la unión y captación), o los vectores pueden modificarse para proporcionar dichas funcionalidades. Son conocidos en la materia una gran variedad de dichos vectores y están generalmente disponibles. Cuando un vector se mantiene en una célula hospedadora, el vector puede replicarse establemente por las células durante la mitosis como una estructura autónoma incorporada al genoma de la célula hospedadora o mantenerse en el núcleo o citoplasma de la célula hospedadora.
B. Elementos reguladores:
Los módulos de expresión eucariótica incluidos en los vectores contienen preferiblemente (en dirección 5’ a 3’) un promotor transcripcional eucariótico ligado operativamente a una secuencia de codificación de proteína, señales de corte y empalme que incluyen secuencias intermedias y una secuencia de terminación transcripcional/poliadenilación.
i. Promotor/potenciadores
Un “promotor” es una secuencia de control que es una región de una secuencia de ácido nucleico en que se controlan la iniciación e índice de transcripción. Puede contener elementos genéticos a los que pueden unirse proteínas y moléculas reguladoras, tales como ARN polimerasa y otros factores de transcripción, para iniciar la transcripción específica de una secuencia de ácido nucleico. Las frases “operativamente situado”, “operativamente ligado”, “bajo el control” y “bajo el control transcripcional” significan que un promotor está en una localización funcional y/u orientación correcta con relación a una secuencia de ácido nucleico para controlar la iniciación transcripcional y/o la expresión de esa secuencia.
Los promotores adecuados para uso en el vector que codifica EBNA-1 de la invención son aquellos que dirigen la expresión de los módulos de expresión que codifican la proteína EBNA-1, dando como resultado niveles en estado estacionario suficientes de proteína EBNA-1 para mantener establemente vectores que contienen oriP de EBV. Los promotores se usan también para una expresión eficaz de módulos de expresión que codifican factores de reprogramación.
Un promotor comprende generalmente una secuencia que funciona situando el sitio de inicio de la síntesis de ARN. El mejor ejemplo conocido de esto es la secuencia TATA, pero en algunos promotores que carecen de secuencia TATA, tales como por ejemplo el promotor del gen desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y el promotor de los genes tardíos de SV40, un elemento discreto que se superpone con el sitio de inicio mismo ayuda a fijar el lugar de iniciación. Elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de la iniciación transcripcional. Típicamente, estos se localizan en la región a 30-110 pb en dirección 5’ del sitio de inicio, aunque se ha mostrado que una serie de promotores contienen elementos funcionales en dirección 3’ del sitio de inicio también. Para llevar una secuencia de codificación “bajo el control de” un promotor, se sitúa el extremo 5’ del sitio de iniciación de la
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potenciadores de la transcripción apropiados.
En ciertas realizaciones de la invención, se usan elementos de sitio de entrada a ribosoma interno (IRES) para crear mensajes multigénicos o policistrónicos. Los elementos de IRES son capaces de evitar el modelo de barrido ribosómico de traducción dependiente de Cap metilado en 5’ y de empezar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Se han descrito los elementos de IRES de dos miembros de la familia de picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988) así como un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos de IRES pueden ligarse con marcos de lectura abiertos heterólogos. Pueden transcribirse conjuntamente múltiples marcos de lectura abiertos, separado cada uno por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento de IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a ribosomas para una traducción eficaz. Pueden expresarse eficazmente múltiples genes usando un solo promotor/potenciador para transcribir un solo mensaje (véanse las patentes de EE.UU. nº 5.925.565 y 5.935.819).
iii. Sitios de clonación múltiple
Los vectores pueden incluir un sitio de clonación múltiple (MCS), que es una región de ácido nucleico que contiene múltiples sitios de enzima de restricción, cualquiera de los cuales puede usarse junto con tecnología recombinante estándar para digerir el vector (véanse, por ejemplo, Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998 y Cocea, 1997). "Digestión con enzima de restricción” hace referencia a la escisión catalítica de una molécula de ácido nucleico con una enzima que funciona solo en localizaciones específicas de una molécula de ácido nucleico. Muchas de estas enzimas de restricción están comercialmente disponibles. El uso de dichas enzimas es ampliamente comprendido por los especialistas en la materia. Frecuentemente, se linealiza o fragmenta un vector usando una enzima de restricción que corta en el MCS, posibilitando que se liguen con el vector secuencias exógenas. "Ligamiento” hace referencia al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico, que pueden ser
o no contiguos entre sí. Las técnicas que implican enzimas de restricción y reacciones de ligamiento son bien conocidas por los especialistas en la materia de la tecnología recombinante.
iv. Sitios de corte y empalme
La mayoría de moléculas de ARN eucarióticas experimentarán corte y empalme de ARN para retirar los intrones de los transcritos primarios. Los vectores que contienen secuencias eucarióticas genómicas pueden requerir sitios de corte y empalme donantes y/o aceptores para asegurar un procesamiento apropiado del transcrito para expresión de proteína (véase, por ejemplo, Chandler et al., 1997).
v. Señales de terminación
Los vectores o constructos de la presente invención pueden comprender al menos una señal de terminación. Una “señal de terminación” o “terminador” comprende secuencias de ADN implicadas en la terminación específica de un transcrito de ARN por una ARN polimerasa. Por tanto, en ciertas realizaciones se contempla una señal de terminación que finaliza la producción de un transcrito de ARN. Puede ser necesario un terminador in vivo para conseguir niveles de mensaje deseables.
En sistemas eucarióticos, la región terminadora puede comprender también secuencias de ADN específicas que permitan la escisión específica de sitio del nuevo transcrito para exponer un sitio de poliadenilación. Esto señala a una polimerasa endógena especializada para añadir un tramo de aproximadamente 200 residuos de A (poliA) al extremo 3’ del transcrito. Las moléculas de ARN modificadas con esta cola de poliA parecen más estables y se traducen más eficazmente. Por tanto, en otras realizaciones que implican eucariotas, se prefiere que el terminador comprenda una señal para la escisión del ARN, y es más preferido que la señal terminadora promueva la poliadenilación del mensaje. Los elementos de sitio terminador y/o de poliadenilación pueden servir para potenciar los niveles de mensaje y para minimizar la lectura del módulo en otras secuencias.
Los terminadores contemplados para uso en la invención incluyen cualquier terminador de la transcripción conocido descrito en la presente memoria o conocido por un especialista en la materia incluyendo, pero sin limitación, por ejemplo las secuencias de terminación de genes, tales como por ejemplo las secuencias terminadoras de hormona de crecimiento bovino, o de terminación vírica, tales como por ejemplo el terminador de SV40. En ciertas realizaciones, la señal de terminación puede ser la falta de secuencia transcribible o traducible, tal como debido a truncamiento de la secuencia.
vi. Señales de poliadenilación
En la expresión, particularmente la expresión eucariótica, se incluirá típicamente una señal de poliadenilación para efectuar una poliadenilación apropiada del transcrito. La naturaleza de la señal de poliadenilación no se cree que sea crucial para la práctica exitosa de la invención, y puede emplearse cualquiera de dichas secuencias. Las realizaciones preferidas incluyen la señal de poliadenilación de SV40 o la señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovino, conveniente y conocida por funcionar bien en diversas células diana. La poliadenilación puede aumentar la estabilidad del transcrito o puede facilitar el transporte citoplasmático.
vii. Orígenes de replicación
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Para propagar un vector en una célula hospedadora, puede contener uno o más sitios de origen de replicación (a menudo denominados “ori”), por ejemplo una secuencia de ácido nucleico correspondiente a oriP de EBV como se describe anteriormente o un oriP genomanipulado con una función similar o elevada de programación de la diferenciación, que es una secuencia de ácido nucleico específica en que se inicia la replicación. Como alternativa, puede emplearse un origen de replicación de otro virus de replicación extracromosómica como se describe anteriormente o una secuencia de replicación autónoma (ARS).
viii. Marcadores de selección y rastreables
En ciertas realizaciones de la invención, las células que contienen un constructo de ácido nucleico de la presente invención pueden identificarse in vitro o in vivo mediante la inclusión de un marcador en el vector de expresión. Dichos marcadores conferirían un cambio identificable a la célula, permitiendo la fácil identificación de las células que contienen el vector de expresión. Generalmente, un marcador de selección es aquel que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador de selección positiva es aquel en que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador de selección negativa es aquel en que su presencia evita su selección. Es un ejemplo de un marcador de selección positiva un marcador de resistencia a fármaco.
Habitualmente, la inclusión de un marcador de selección de fármaco ayuda a la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, los genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores de selección útiles. Además de marcadores que confieren un fenotipo que permite la discriminación de transformantes basándose en la implantación de condiciones, se contemplan también otros tipos de marcadores que incluyen marcadores rastreables tales como GFP, cuya base es el análisis colorimétrico. Como alternativa, pueden utilizarse enzimas rastreables como marcadores de selección negativa tales como timidina cinasa (tk) o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) de herpesvirus simple. Un especialista en la materia sabría también cómo emplear marcadores inmunológicos, posiblemente junto con análisis de FACS. No se cree que sea importante el marcador usado, a condición de que pueda expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Son bien conocidos ejemplos adicionales de marcadores de selección y rastreables para un especialista en la materia. Un rasgo de la presente invención incluye usar marcadores de selección y rastreables para seleccionar células exentas de vector después de que los factores de programación de la diferenciación hayan producido estado de diferenciación alterado deseado en esas células.
C. Suministro de vector
La introducción de un vector de reprogramación o programación de la diferenciación en células somáticas con la actual invención puede usar cualquier procedimiento adecuado para el suministro de ácido nucleico para transformación de una célula, como se describe en la presente memoria o como sería conocido por un especialista en la materia. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitación, el suministro directo de ADN tal como mediante transfección ex vivo (Wilson et al., 1989, Nabel et al., 1989); mediante inyección (patentes de EE.UU. nº 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859), incluyendo microinyección (Harland y Weintraub, 1985; patente de EE.UU. nº 5.789.215); mediante electroporación (patente de EE.UU. nº 5.384.253; Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984); mediante precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990); mediante el uso de DEAE-dextrano seguido de polietilenglicol (Gopal, 1985); mediante carga sónica directa (Fechheimer et al., 1987); mediante transfección mediada por liposoma (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991) y transfección mediada por receptor (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988); mediante bombardeo de microproyectiles (solicitudes PCT nº WO 94/09699 y 95/06128; patentes de EE.UU. nº 5.610.042, 5.322.783, 5.563.055, 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880); mediante agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler et al., 1990; patentes de EE.UU. nº 5.302.523 y 5.464.765); mediante transformación mediada por Agrobacterium (patentes de EE.UU. nº 5.591.616 y 5.563.055); mediante transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh et al., 1993; patentes de EE.UU. nº 4.684.611 y 4.952.500); mediante captación de ADN mediada por desecación/inhibición (Potrykus et al., 1985) y cualquier combinación de dichos procedimientos. Mediante la aplicación de técnicas tales como estas, pueden transformarse estable o transitoriamente un orgánulo u orgánulos, una célula o células, un tejido o tejidos, un organismo u organismos.
i. Transfección mediada por liposoma
En una cierta realización de la invención, puede atraparse un ácido nucleico en un complejo lipídico tal como, por ejemplo, un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de bicapa fosfolipídica y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando se suspenden fosfolípidos en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos experimentan una autorredistribución antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan el agua y los solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, 1991). Se contempla también un ácido nucleico complejado con Lipofectamine (Gibco BRL) o Superfect (Qiagen). La cantidad de liposomas usada puede variar con la naturaleza del liposoma así como de la célula usada, por ejemplo, pueden contemplarse de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 μg de ADN de vector por 1 a 10 millones de células.
El suministro de ácido nucleico mediado por liposoma y la expresión de ADN extraño in vitro han sido muy exitosos
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dirigen la unión específica de célula. Por ejemplo, se ha incorporado lactosilceramida, un asialgangliósido galactosaterminal, a liposomas y se ha observado un aumento de la captación del gen de insulina por hepatocitos (Nicolau et al., 1987). Se contempla que los constructos transformantes específicos de tejido dados a conocer en la presente memoria puedan suministrarse específicamente a una célula diana de manera similar.
vii Bombardeo de microproyectiles
Las técnicas de bombardeo de microproyectiles pueden usarse para introducir un ácido nucleico en al menos un orgánulo, célula, tejido u organismo (patente de EE.UU. nº 5.550.318, patente de EE.UU. nº 5.538.880, patente de EE.UU. nº 5.610.042 y solicitud PCT WO 94/09699). Este procedimiento depende de la capacidad de acelerar microproyectiles recubiertos con ADN a una alta velocidad, permitiéndoles atravesar membranas celulares y entrar en células sin destruirlas (Klein et al., 1987). Hay una amplia variedad de técnicas de bombardeo de microproyectiles conocidas en la materia, muchas de las cuales son aplicables a la invención.
En este bombardeo de microproyectiles, una o más partículas pueden recubrirse con al menos un ácido nucleico y suministrarse a células mediante una fuerza propulsora. Se han desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas. Uno de dichos dispositivos se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica que, a su vez, proporciona la fuerza motora (Yang et al., 1990). Los microproyectiles usados han consistido en sustancias biológicamente inertes tales como partículas o perlas de wolframio u oro. Las partículas ejemplares incluyen aquellas que comprenden wolframio, platino y preferiblemente oro. Se contempla que, en algunos casos, la precipitación de ADN sobre partículas metálicas no sería necesaria para el suministro de ADN a una célula receptora usando bombardeo de microproyectiles. Sin embargo, se contempla que las partículas pueden contener ADN en lugar de recubrirse con ADN. Las partículas recubiertas con ADN pueden aumentar el nivel de suministro de ADN a través del bombardeo de partículas pero no son necesarias en sí mismas.
Para el bombardeo, se concentran células en suspensión sobre filtros o medio de cultivo sólido. Como alternativa, pueden disponerse embriones inmaduros u otras células diana sobre medio de cultivo sólido. Se colocan las células para bombardear a una distancia apropiada por debajo de la placa de detención de macroproyectiles
VI. Selección de iPS
En ciertos aspectos de la invención, después de introducir un vector de reprogramación en células somáticas, las células se cultivarán para expansión (opcionalmente seleccionadas por la presencia de elementos vectoriales como un marcador de selección positiva o rastreable para concentrar células transfectadas) y los vectores de reprogramación expresarán factores de reprogramación en estas células y se replicarán y repartirán junto con la división celular. Estos factores de reprogramación expresados reprogramarán el genoma de células somáticas para establecer un estado pluripotente automantenido, y mientras tanto o después de la retirada de la selección positiva de la presencia de vectores, se perderán gradualmente los elementos genéticos exógenos. Estas células madre pluripotentes inducidas podrían seleccionarse de la progenie derivada de estas células somáticas basándose en las características de los células madre embrionarias, porque se espera que sean sustancialmente idénticos a los células madre embrionarias pluripotentes. Podría emplearse también una etapa de selección negativa adicional para acelerar o ayudar a la selección de iPS esencialmente exentos de elementos genéticos exógenos ensayando la ausencia de ADN de vector de reprogramación o usando marcadores de selección.
A. Selección de las características de células madre embrionarias
Los iPSC generados exitosamente de estudios anteriores eran notablemente similares a las células madre pluripotentes aislados naturales (tales como células madre embrionarias de ratón y humanos, mESC y hESC, respectivamente) en los siguientes aspectos, confirmando por tanto la identidad, autenticidad y pluripotencia de los iPSC con células madre pluripotentes aisladas naturales. Por tanto, las células madre pluripotentes inducidas generadas con los procedimientos dados a conocer en esta invención podrían seleccionarse basándose en una o más de las siguientes características de células madre embrionarias
i. Propiedades biológicas celulares
Morfología: Los iPSC son morfológicamente similares a los ESC. Cada célula puede tener forma redonda, un nucleolo grande y citoplasma escaso. Las colonias de iPSC podrían ser similares también a las de ESC. Los iPSC humanos forman colonias de bordes agudos, planas y estrechamente empaquetadas similares a los hESC y los iPSC de ratón forman colonias similares a mESC, colonias menos planas y más agregadas que las de hESC.
Propiedades de crecimiento: El tiempo de duplicación y la actividad mitótica son pilares de los ESC, ya que las células madre deben autorrenovarse como parte de su definición. Los iPSC podrían ser mitóticamente activos, autorrenovarse activamente, proliferar y dividirse a un índice igual a los ESC.
Marcadores de células madre: Los iPSC pueden expresar marcadores antigénicos de superficie celular expresados en ESC. Los iPSC humanos expresaban los marcadores específicos de hESC incluyendo, pero sin limitación, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E y Nanog. Los iPSC de ratón expresaban SSEA-1, pero no SSEA-3 ni SSEA-4, de forma similar a mESC.
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inadecuado para promover los niveles de expresión requeridos para una apropiada reprogramación y pueda dar como resultado la rotura de los módulos de tal modo que cada gen de reprogramación sea impulsado por su propio promotor humano.
En resumen, el plásmido lanzadera maestro o plásmido de reprogramación podría codificar Sox-2, Oct-4, Nanog y posiblemente Lin28 (FIG. 5), mientras que su replicación y mantenimiento podrían promoverse por la presencia de oriP y deltaUR1. Este plásmido podría estar preparado también para futuras modificaciones que incluyen un marcador de selección negativa tal como timidina cinasa y un marcador de selección positiva adicional tal como secuencias que codifican la proteína fluorescente verde o roja.
Ejemplo 2. Uso de un plásmido de reprogramación exento de residuos
La reprogramación eficaz dependerá de la introducción eficaz de este gran plásmido (15-20 kb) en células de mamífero. Los inventores están empleando actualmente un enfoque basado en la lipofilia para introducir el ADN en fibroblastos humanos; sin embargo, este enfoque es probable que sea modificado según el tipo celular que se esté transfectando. Por ejemplo, probablemente elegirían electroporación para la introducción de plásmidos de ADN en células hematopoyéticas. Una vez las células se transfectan apropiadamente, los inventores dispondrán estas células en un lecho de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) irradiados o Matrigel sobre discos de cultivo de 10 cm usando medios adecuados para las células transfectadas. Aproximadamente 6 días después de la transfección, se cambiarán los medios por medios especializados en reprogramación de células y se reemplazarán diariamente cada dos días (Yu et al., 2007).
Basándose en el procedimiento actual de generación de iPS, los inventores seleccionarán probablemente colonias que se parezcan a células madre aproximadamente 20 días después de la transfección y las transferirán a MEF o Matrigel en placas de cultivo de 6 pocillos alimentando diariamente o cada dos días con medios especializados. Una vez ha tenido lugar una expansión suficiente, se cariotiparán los clones y se probarán los marcadores específicos apropiados para células madre.
Todos los procedimientos dados a conocer y reivindicados en la presente memoria pueden elaborarse y ejecutarse sin experimentación indebida a la vista de la presente divulgación.
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