ES2587434T3 - Método de detección, cuantificación y cartografía del daño y/o de la reparación de cadenas de ADN - Google Patents

Abstract

Un método de detección de la presencia o de la ausencia de una o más partes reparadas en uno o más ácidos nucleicos dañados, en el que dicho daño se produjo en el ácido nucleico de células, comprendiendo dicho método: (a) tratar una muestra que contiene células en cultivo antes de extraer el/los ácido/s nucleico/s de dicha muestra mediante la adición de un nucleótido o nucleósido detectable durante un tiempo y en condiciones suficientes para la interacción con los ácidos nucleicos, en el que dicho nucleótido o nucleósido detectable es incorporado por una o más enzimas presentes dentro de dichas células vivas y capaces de escindir dicho daño del ácido nucleico y reemplazarlo por dicho nucleótido o nucleósido detectable; (b) extraer uno o más ácidos nucleicos de dicha muestra y, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra de ácidos nucleicos extraídos; (c) estirar el/los ácido/s nucleico/s extraído/s; (d) detectar el nucleótido o el nucleósido detectable en el/los ácido/s nucleico/s estirado/s; y (e) detectar la presencia de la/s parte/s reparada/s en el ácido nucleico cuando dicho nucleótido o nucleósido detectable se detecta, y detectar la ausencia de una parte reparada en el/los ácido/s nucleico/s cuando dicho nucleótido o nucleósido detectable no se detecta.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de deteccion, cuantificacion y cartograffa del dano y/o de la reparacion de cadenas de ADN Antecedentes de la invencion Campo de la invencion

Metodos y productos de deteccion in vitro de la presencia del dano en el ADN o de la presencia de una respuesta biologica hacia el dano en el ADN a nivel molecular. Se emplea el rastreo molecular u otros metodos de estiramiento de acido nucleico o metodos similares junto con compuestos que reaccionan con el ADN, sondas que se unen al ADN o monomeros de acido nucleico, especialmente, monomeros de acido nucleico marcados.

Descripcion de la tecnica relacionada

El dano en el ADN se produce cuando se genera una alteracion o una perdida a lo largo de la molecula de ADN. Es importante distinguir el dano de la mutacion en el ADN. Una analogfa ilustra la diferencia: el termino "TIME" se puede mutar al termino "TIDE" mediante la sustitucion con la letra "D" de la letra "M", mientras que si la letra "M" se pierde o se altera, se produce un dano, generandose el termino sin significado "TI#E". Por analogfa, la sustitucion de una timina con una adenina sena una mutacion, mientras que la perdida de una adenina o la metilacion de una guanina constituinan un dano. Sin embargo, los fenomenos no son independientes, porque se sabe que la guanina metilada es mutagenica (Warren, Forsberg et al., 2006). La mutacion normalmente da lugar a la transcripcion que produce protemas con funcionalidad disminuida o alterada, y es probable que se perpetue en las celulas en division. El dano en el ADN interfiere en la replicacion y la transcripcion, y puede afectar drasticamente al progreso del ciclo celular si la celula no es capaz de repararlo.

Hay mas de 200.000 danos del ADN por celula de mairnfero al dfa (Saul y Ames, 1986) que se reparan continuamente para recuperar la actividad normal de las celulas y garantizar la supervivencia celular. Las fuentes de los danos pueden ser endogenas o exogenas con respecto a la celula. El dano endogeno se debe principalmente a los radicales de oxfgeno producidos durante la respiracion celular normal, o la alquilacion e hidrolisis de los compuestos. El dano exogeno se produce cuando las celulas se exponen a un agente genotoxico (un agente que afecta a la integridad del material genetico de una celula, tal como un mutageno o un carcinogeno). Estos agentes incluyen ciertas longitudes de onda de la radiacion: rayos gamma y rayos X, rayos UV-C (-260 nm) y UV-B que penetran en la capa de ozono; radicales de oxfgeno altamente reactivos producidos por vfas bioqmmicas externas; productos qmmicos del medio ambiente: hidrocarburos, productos vegetales y microbianos, farmacos usados como agentes terapeuticos (por ejemplo, antimicrobianos o farmacos usados en la quimioterapia).

Los efectos de los agentes genotoxicos o daninos para los acidos nucleicos a nivel molecular se pueden clasificar en cuatro grupos principales: alteraciones, desapareamientos, entrecruzamientos y roturas de las bases.

Las cuatro bases del ADN (A, T, C, G) se pueden modificar covalentemente en varias posiciones, dando lugar a la perdida o a la alteracion covalente de las bases. Las lesiones mas frecuentes son el resultado de la desaminacion, despurinacion, despirimidacion, metilacion (7-metilguanina, 1-metiladenina, 6-O-metilguanina) y oxidacion (8-hidroxi- 2-desoxi-guanosina y 8-oxo-7,8-dihidroguanina u 8-oxoG) de los acidos nucleicos (Zharkov, 2008). El fallo de la prueba de lectura mediante mecanismos celulares durante la replicacion del ADN puede generar desapareamientos de las bases normales: un ejemplo comun es la incorporacion de la pirimidina U (que normalmente solo se encuentra en el ARN) en lugar de T (Larson, Bednarski et al., 2008.) al aDn. Se pueden formar entrecruzamientos entre las bases de la misma cadena de ADN ([6-4]-PP, dfmeros de pirimidina) (Pfeifer, 1997) o en cadenas opuestas ("entrecruzamientos entre cadenas") (McCabe, Olson et al., 2009). Las roturas de la cadena principal pueden limitarse a una de las dos cadenas (rotura de una sola cadena o "RUC") (Caldecott, 2008) o pueden cortar la molecula en ambas cadenas, produciendo una rotura de doble cadena ("RDC") (Shrivastav, De Haro et al., 2008).

En la Tabla 1, se ilustran los tipos y la frecuencia de fondo del dano en el ADN.

Tabla 1: Distribucion basal del dano en el ADN que se produce diariamente en una celula eucariota

Tipo de dano

n.° %

Roturas de una sola cadena

120.000 50,9

N7-Metilguanina

84.000 35,6

Despurinacion

24.000 10,2

O6-Metilguanina

3.120 1,3

8-oxo-7,8-dihidroguanina

2.880 1,2

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Tipo de dano

n.° %

Despirimidacion

1.320 0,5

Desaminacion de la citosina

360 0,2

Dfmeros de pirimidina

200 0,1

Roturas de doble cadena

9 0,01

Entrecruzamientos entre cadenas

8 0,01

El resultado del dano en el ADN es diverso y complejo, pero, en general, constituye un peligro para la celula.

Surgen efectos a corto plazo de la obstruccion de las operaciones basicas en el ADN, desencadenando la detencion del ciclo celular o la muerte celular. Muchas lesiones estancan la transcripcion y generan estres de transcripcion agudo, lo que constituye un eficaz desencadenante de la apoptosis dependiente de p53 (Evan y Vousden, 2001). Para evitar dichos mecanismos, las celulas desarrollaron un sistema de reparacion de alta prioridad denominado reparacion acoplada a la trascripcion (TCR), que desplaza o elimina la aRn polimerasa detenida y garantiza la reparacion rapida (Tornaletti y Hanawalt, 1999).

Los efectos a largo plazo son el resultado de la correccion erronea o la conversion de las lesiones que causan mutaciones irreversibles y que contribuyen a la oncogenesis (Hoeijmakers, 2001). Suele ser el caso de las lesiones que interfieren en la replicacion del ADN (en general, RUC, alquilaciones, distorsiones de la helice). Se recluta una clase de polimerasas con propiedades de apareamiento de bases flexible cuando se produce un estres de la replicacion inducido por el dano. Estas enzimas recientemente descubiertas se hacen cargo temporalmente de la aDn polimerasa replicativa bloqueada y permiten la smtesis de translesiones. Este proceso puede ser beneficioso, pero se produce a expensas de una mayor tasa de error. Parece ser responsable de la mayona de las mutaciones puntuales inducidas por danos, siendo, por tanto, particularmente relevante para la oncogenesis (Kunkel y Bebenek, 2000).

Las lesiones que afectan a ambas cadenas (RDC y entrecruzamientos entre cadenas) son la causa directa de la recombinacion. Si la informacion genetica se interrumpe, la integridad de los cromosomas no se puede restaurar con alta fidelidad y la segregacion no puede progresar adecuadamente durante la mitosis. Las consecuencias estan estrechamente relacionadas con la carcinogenesis: aberraciones cromosomicas, incluyendo la aneuploidfa, deleciones y translocaciones cromosomicas (Khanna, K. K. y S. P. Jackson, 2001).

Para hacer frente a todos los posibles danos que amenazan la integridad del ADN y controlar su impacto en la informacion genetica vital, las celulas han desarrollado complejos sistemas de reparacion que suelen interactuar y apoyarse mutuamente.

Un criterio de extension espacial permite dibujar una imagen intuitiva de como la maquinaria de reparacion de la celula se organiza tras la activacion de un puesto de control de los danos.

En el caso de una lesion localizada en una sola cadena, se reclutan dos complejos enzimaticos basados en moldes, dependiendo de la extension espacial del dano: la reparacion de la escision de bases (BER) se dirige a pequenas alteraciones qrnmicas de bases individuales (Lindahl y Wood, 1999); la reparacion de la escision de nucleotidos (NER) reconoce alteraciones de multiples bases, de mayor tamano, (de Laat, Jaspers et al., 1999). En una reaccion de tipo “corte y parche", la lesion se retira y el hueco de una sola cadena resultante se rellena usando la cadena complementaria intacta como molde. La BER es uno de los principales metodos para corregir errores en la secuencia de bases y, por lo tanto, es particularmente relevante para la prevencion de la mutagenesis. La NER es un sistema flexible que reconoce diferentes tipos de lesiones de distorsion de la helice, que impiden el apareamiento adecuado de las bases. La NER se compone de dos subvfas dependiendo del sustrato: la NER del genoma global (GG-NER) examina todo el genoma en busca de las distorsiones de la helice, y la reparacion acoplada a la trascripcion (TCR) se centra en las distorsiones que bloquean la transcripcion (Tornaletti y Hanawalt 1999). La NER tambien se recupera para apoyar el sistema de reparacion de apareamientos erroneos (MMR), que coordina espedficamente la maquinaria de replicacion cuando se introduce un error durante la replicacion del ADN normal (Plotz, Zeuzem et al., 2006).

En el caso de los danos que afectan a ambas cadenas, no se dispone de cadena molde para realizar la reparacion. Como consecuencia directa, estas lesiones son diffciles de corregir y constituyen un peligro real para la celula. En dichos casos, se han de activar los mecanismos de recombinacion (recombinacion homologa (HR) y union de extremos (EJ)), que tambien participan en otras vfas celulares (Shrivastav, De Haro et al., 2008).

La deteccion de las lesiones del genoma tiene que tener lugar rapidamente para activar los puntos de control espedficos (la denominada respuesta SOS) que detengan el ciclo celular y permitan la reparacion del dano antes de

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que se convierta en mutaciones permanentes (Zhou, Elledge, 2000). Cuando el dano es demasiado importante (en terminos de cantidad y/o gravedad), la celula entera se sacrifica mediante el inicio de la apoptosis, con el objetivo de prevenir la transmision del material genetico mutado (Evan y Vousden, 2001). El destino de las celulas depende de este delicado equilibrio entre la importancia del dano y la conversion del dano en elementos que se vuelven permanentes, independientemente de si representan o no una mutacion. Este equilibrio es el paradigma comun que subyace al mecanismo de envejecimiento y a la carcinogenesis (Finkel, Serrano et al., 2007). El juego con este equilibrio es lo que confiere un potencial terapeutico a los agentes genotoxicos, especialmente a las radiaciones ionizantes (Asaithamby y Chen, 2009). Mas directamente, la importancia biologica del dano en el ADN se evidencia por la predisposicion a la malignidad inducida por los defectos hereditarios en las vfas de reparacion. A modo de ejemplo, la deficiencia en las vfas de NER causa enfermedades graves (xeroderma pigmentoso, smdrome de Cockayne) y predisposicion al cancer de piel. La falta de respuesta o reparacion adecuada de la RDC esta implicada en el smdrome de la ataxia telangiectasia y se correlaciona directamente con el linfoma, el cancer de mama y el cancer de ovario (Hoeijmakers 2001).

El rastreo molecular es una tecnica que permite el estiramiento uniforme de las macromoleculas y, en particular, de los acidos nucleicos sobre un substrato mediante la accion de una superficie de contacto en movimiento. La tecnologfa de rastreo molecular se ha desvelado en diversas patentes y publicaciones cienffficas, por ejemplo, en los documentos US 6303296, W09818959, WO0073503, US2006257910, US2004033510, US6130044, US6225055, US6054327, WO2008028931 y Michalet, Ekong et al. 1997, Herrick, Michalet et al. 2000, Herrick, Stanislawski et al. 2000, Gad, Aurias et al. 2001, Gad, Caux-Moncoutier et al. 2002, Gad, Klinger et al. 2002, Herrick, Jun et al. 2002, Pasero, Bensimon et al. 2002, Gad, Bieche et al. 2003, Lebofsky y Bensimon 2003, Herrick, Conti et al. 2005, Lebofsky y Bensimon 2005, Lebofsky, Heilig et al. 2006, Patel, Arcangioli et al. 2006, Rao, Conti et al. 2007, y Schurra y Bensimon 2009 (Veanse las referencias). Tambien se han usado el rastreo molecular y los sustratos relacionados para inmovilizar acidos nucleicos sobre una superficie en forma parcialmente estirada o no estirada (Allemand, Bensimon et al., 1997).

El estiramiento del acido nucleico, en particular, el ADN viral o genomico, proporciona acidos nucleicos inmovilizados en cadenas lineales y paralelas, y se realiza preferentemente con un factor de estiramiento controlado, sobre una superficie adecuada (por ejemplo, portaobjetos de vidrio tratado en superficie). Es posible estirar acidos nucleicos que contienen monomeros modificados (por ejemplo, nucleotidos modificados con biotina). Por lo tanto, es posible linealizar una cadena de acido nucleico sintetizada por una celula viva o in vitro en presencia de nucleotidos modificados, y detectarla, por ejemplo, mediante la conversion de los nucleotidos modificados en fluorescentes (Herrick, Jun et al. 2002). Por otra parte, tras el estiramiento, es posible hibridar sondas espedficas de la secuencia detectables de manera similar por microscopfa de fluorescencia (Herrick, Michalet et al. 2000). Asf pues, se puede visualizar una determinada secuencia directamente, a nivel de una sola molecula. La longitud de las senales fluorescentes y/o su numero, y su separacion en el portaobjetos proporciona una lectura directa del tamano y de la separacion relativa de las secuencias diana.

Se ha usado la elongacion del ADN rudimentaria que implica la elongacion no homogenea del ADN para estimar la longitud del ADN y evaluar el numero de lesiones en el ADN mediante la medicion de la intensidad fluorescente sin el uso de sondas para localizar los danos en las secuencias genomicas o la cartograffa. Sin embargo, se ha producido la necesidad de una manera muy sensible y espedfica de identificacion, localizacion o cartograffa del dano o de la reparacion del ADN que no se base principalmente en la medicion de la intensidad fluorescente y que permita simultaneamente la visualizacion de diferentes tipos de danos.

Teniendo en cuenta las implicaciones para la salud del dano y de la reparacion de los acidos nucleicos, incluyendo la evaluacion del cancer y el tratamiento de la enfermedad mediante varios agentes, o para el desarrollo o la identificacion de nuevos agentes, se ha vuelto fundamental desarrollar metodos sensibles y eficaces para caracterizar y cuantificar el estado danado y reparado de un acido nucleico, especialmente, el ADN celular.

Alcance de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo de deteccion de la presencia o de la ausencia de una o mas partes reparadas en uno o mas acidos nucleicos danados, en el que dicho dano se produjo en el acido nucleico de celulas, comprendiendo dicho metodo:

(a) tratar una muestra que contiene celulas en cultivo antes de extraer el/los acido/s nucleico/s de dicha muestra mediante la adicion de un nucleotido o nucleosido detectable durante un tiempo y en condiciones suficientes para que interactue con los acidos nucleicos, en el que dicho nucleotido o nucleosido detectable es incorporado por una o mas enzimas presentes dentro de dichas celulas vivas y capaces de escindir dicho dano del acido nucleico y reemplazarlo por dicho nucleotido o nucleosido detectable;

(b) extraer uno o mas acidos nucleicos de dicha muestra y, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra de acidos nucleicos extrafdos;

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(c) estirar el/los acido/s nucleico/s ex^do/s;

(d) detectar el nucleotido o el nucleosido detectable en el/los acido/s nucleico/s estirado/s; y

(e) detectar la presencia de la/s parte/s reparada/s en el acido nucleico cuando dicho nucleotido o nucleosido detectable se detecta, y detectar la ausencia de una parte reparada en el/los acido/s nucleico/s cuando dicho nucleotido o nucleosido detectable no se detecta.

La invencion proporciona ademas un metodo de diagnostico de una enfermedad, trastorno o afeccion en un sujeto, que comprende la deteccion de una o mas partes reparadas en acido/s nucleico/s extrafdo/s de una muestra de este sujeto mediante el metodo anterior.

La invencion proporciona demas un proceso de determinacion del efecto de un agente de ensayo en uno o mas acidos nucleicos de una celula, que comprende:

poner en contacto la celula con dicho agente de ensayo durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dane el/los acido/s nucleico/s de la celula; y

detectar una parte reparada en el/los acidos nucleico/s de dicha celula mediante el metodo anterior.

Las realizaciones espedficas del metodo anterior se definen en las reivindicaciones.

En el presente documento, se desvelan realizaciones espedficas de la invencion y realizaciones relacionadas que forman parte de la invencion solo en la medida en que esten comprendidas en el alcance de las reivindicaciones.

Breve sumario de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo de deteccion in vitro de la presencia de dano en el ADN o la presencia de la respuesta biologica al dano en el ADN a nivel molecular. Dicho metodo comprende el uso del rastreo molecular, u otros metodos de estiramiento de acidos nucleicos o metodos similares (en los que el estiramiento del acido nucleico comprende la elongacion de la molecula hasta la longitud de su contorno o mas) junto con compuestos que reaccionan con el ADN, sondas de union al ADN o monomeros de acido nucleico, especialmente monomeros de acido nucleico marcados. Estos metodos pueden proporcionar, al mismo tiempo, sensibilidad a bajos niveles de dano y alta precision en la cuantificacion tanto del dano como de la capacidad de reparacion.

Tambien se proporcionan metodos de cuantificacion in vitro de la presencia de dano en el ADN o la presencia de la respuesta biologica al dano en el ADN. Dicha cuantificacion se puede realizar de una manera directa o indirecta: en el primer caso, las entidades diana se visualizan directamente y se cuentan; en el segundo caso, la cantidad de entidades diana se deduce comparando un perfil de la muestra con un perfil de referencia.

Estos metodos tambien se pueden usar para determinar la ubicacion genomica del dano en un acido nucleico o para evaluar las respuestas al dano en el ADN por medio de la hibridacion del ADN.

Se proporcionan metodos para seguir in vitro la presencia de dano o la respuesta al dano en el ADN tras el tratamiento con un agente genotoxico o antimicrobiano como ensayos auxiliares, por ejemplo, para la evaluacion de la eficacia de un farmaco antimicrobiano o contra el cancer. Los metodos desvelados se aplican como ensayos auxiliares cuando el efecto de un compuesto de interes consiste en una accion directa sobre el ADN o en una via de reparacion espedfica. Tambien sirven como ensayos auxiliares cuando el compuesto de interes se dirige a un factor relacionado o via de senalizacion relacionada, cuyo funcionamiento alterado puede influir en la respuesta global de la celula a la exposicion genotoxica o a otros mecanismos implicados en la generacion o la persistencia del dano en el ADN.

Se desvelan kits que son utiles para la practica de estos metodos, que comprenden los elementos necesarios para llevar a cabo un metodo de la invencion, en particular, los elementos necesarios para la deteccion de la lesion o reparacion diana en las moleculas estiradas. Dichos elementos detectables pueden actuar sobre la lesion o la reparacion diana sustituyendola, uniendose a ella o convirtiendola en una extremidad molecular.

La sustitucion de la diana surge cuando la entidad diana del acido nucleico se reemplaza parcial o completamente por un elemento detectable. Los ejemplos de elementos detectables que sustituyen los acidos nucleicos danados o reparados diana comprenden: nucleotidos y nucleosidos modificados qmmicamente o marcados, que portan una molecula de biotina, una molecula de digoxigenina, una molecula de avidina, una molecula de transferencia con carga electrica, un nanocristal semiconductor, una nanopartfcula semiconductora, un nanocristal de oro coloidal, un ligando, una nanoperla, una microperla, una perla magnetica, una partfcula paramagnetica, un punto cuantico, un sustrato cromogenico, un hapteno, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un lfpido, un complejo metalico, un complejo de Rh, un complejo de Ru o cualquier combinacion de los mismos. El reemplazo de una entidad diana por un elemento detectable tiene lugar en presencia de una o mas enzimas capaces de escindir la lesion del acido

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nucleico y reemplazarlo por el acido nucleico recien sintetizado que contiene uno o mas elementos detectables. Estas enzimas estan presentes dentro de las celulas vivas, dentro de extractos de celulas o pueden sintetizarse in vitro. La escision puede realizarse tambien usando soluciones alcalinas u otros tratamientos qmmicos, seguidos de la incorporacion enzimatica de un elemento detectable en el acido nucleico.

La union tiene lugar cuando el elemento detectable se situa y se une al acido nucleico en correspondencia con la entidad diana, espontaneamente o mediante la accion de una enzima. La union puede seguir a la modificacion covalente de la entidad diana, o uniones no covalentes tales como interacciones o formacion de complejos de anticuerpo-ligando. La entidad diana se puede modificar qmmicamente a traves de la union, pero no se escinde del acido nucleico. Los ejemplos de elementos detectables que se unen con los acidos nucleicos danados o reparados diana comprenden: un nucleotido o nucleosido modificado qmmicamente o marcado, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un lfpido, un complejo metalico, un complejo de Rh, un complejo de Ru, una molecula capaz de reaccionar qmmicamente con la entidad diana o cualquier combinacion de los mismos. Las sustancias mencionadas se detectan directamente o portan una molecula que permite la deteccion, tal como una molecula de biotina, una molecula de digoxigenina, una molecula de avidina, una molecula de transferencia con carga electrica, un nanocristal semiconductor, una nanopartfcula semiconductora, un nanocristal de oro coloidal, un ligando, una nanoperla, una microperla, una perla magnetica, una partfcula paramagnetica, un punto cuantico, un sustrato cromogenico, un hapteno, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un lfpido, un complejo metalico, un complejo de Rh, un complejo de Ru o cualquier combinacion de los mismos.

La conversion en una extremidad molecular tiene lugar mediante la escision de la molecula de acido nucleico en correspondencia con las entidades diana. Los fragmentos resultantes de la molecula de acido nucleico inicial tienen nuevas extremidades moleculares, que constituyen los elementos detectables. La conversion de la diana en una extremidad molecular se puede inducir mediante tratamiento qmmico, tratamiento termico, tratamiento enzimatico o cualquier combinacion de los mismos. Cualquier tipo de extremidad molecular constituye un elemento detectable: extremidad de acido nucleico duplex, extremidad de acido nucleico no duplex, "extremidades cohesivas", extremidad de tipo enzima de restriccion y extremidad de acido nucleico romo.

Se desvelan metodos de deteccion o de diagnostico del dano (alteracion o perdida) en la estructura o secuencia de ADN o de otro acido nucleico. Dicho dano desencadena vfas de senalizacion que conducen a una alteracion en el ciclo celular normal. La presente invencion se refiere a la deteccion de dicho dano tanto en las celulas capaces de restablecer el progreso normal del ciclo celular despues de la reparacion como en las celulas que carecen de actividad de reparacion normal (por ejemplo, celulas cancerosas, celulas que carecen de vfas de reparacion espedficas). La presente invencion tambien se refiere a la deteccion de los sitios del acido nucleico que han sido reparados tras un dano. El metodo de la invencion permite seguir la actividad de reparacion en las celulas tanto normales como anormales, evaluar la capacidad de reparacion de los sistemas de reparacion seleccionados, medir la eficacia de reparacion, la cinetica y la influencia de los factores ambientales.

En otro aspecto, se desvelan metodos que permiten evaluar los efectos de un agente genotoxico o un compuesto citotoxico en una muestra biologica, en terminos de cuantificacion del dano inducido y reparado, y la localizacion de dichos hechos en el ADN. El presente metodo tambien es util para predecir la muerte celular o la perdida de la actividad normal debido a una reparacion insuficiente o alterada del dano inducido por un agente genotoxico.

Otros aspectos de la invencion incluyen un metodo de deteccion de la presencia o de la ausencia de una secuencia reparada, danada, alterada o mutada en un acido nucleico que comprende: (a) extraer uno o mas acidos nucleicos de una muestra y, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra extrafda; (b) estirar el al menos un acido nucleico en dicha muestra extrafda; (c) anadir una sustancia detectable al acido nucleico estirado, sustancia que se situe en una o mas partes danadas o reparadas del acido nucleico estirado mediante la sustitucion, la union al mismo o su conversion en una extremidad molecular; (d) detectar la sustancia detectable en el acido nucleico estirado; y (e) detectar la presencia de acido nucleico danado o reparado cuando dicha sustancia se detecta y detectar la ausencia de una secuencia de acido nucleico danada o reparada cuando dicha sustancia detectable no se detecta; o (a) extraer uno o mas acidos nucleicos de una muestra y, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra extrafda, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra de acido nucleico extrafda; (b) anadir una sustancia detectable a dicho acido nucleico durante un tiempo y en condiciones suficientes para la interaccion, sustancia que se situe en una o mas partes danadas o reparadas del acido nucleico estirado mediante la sustitucion, la union al mismo o su conversion en una extremidad molecular, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra de acido nucleico tras ponerla en contacto con la sustancia detectable; (c) estirar el al menos un acido nucleico en dicha muestra de acido nucleico interaccionada; (d) detectar la sustancia detectable en el acido nucleico estirado; y (e) detectar o diagnosticar la presencia de acido nucleico danado o reparado cuando dicha sustancia se detecta y detectar o diagnosticar la ausencia de una secuencia de acido nucleico danada o reparada cuando dicha sustancia detectable no se detecta; o (a) tratar una muestra que contiene celulas antes de la extraccion de los acidos nucleicos de dicha muestra mediante la adicion de una sustancia detectable durante un tiempo y en condiciones suficientes para la interaccion con los acidos nucleicos, sustancia que se situe en una o mas partes danadas o reparadas del acido nucleico mediante la sustitucion, la union al mismo o su conversion en una extremidad molecular; (b) extraer uno o mas acidos nucleicos de una muestra y, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra de acidos nucleicos extrafda; (c) estirar el al menos un acido nucleico en dicha muestra de acido nucleico interaccionada; (d) detectar la sustancia

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detectable en el acido nucleico estirado; y (e) detectar o diagnosticar la presencia de acido nucleico danado o reparado cuando dicha sustancia se detecta y detectar o diagnosticar la ausencia de una secuencia de acido nucleico danada o reparada cuando dicha sustancia detectable no se detecta.

En los metodos descritos anteriormente, la sustancia se puede situar en una o mas partes danadas del acido nucleico estirado mediante la sustitucion, la union al mismo o su conversion en una extremidad molecular; puede situarse en una o mas partes reparadas del acido nucleico estirado mediante la sustitucion, la union al mismo o su conversion en una extremidad molecular; puede situarse en una o mas partes danadas o reparadas del acido nucleico estirado mediante sustitucion; puede situarse en una o mas partes danadas o reparadas del acido nucleico estirado mediante la union al mismo; o situarse en una o mas partes danadas o reparadas del acido nucleico estirado mediante su conversion en una extremidad molecular.

Estos metodos se pueden dirigir ademas al diagnostico de una enfermedad, un trastorno o una afeccion mediante la deteccion de una parte danada o reparada en el acido nucleico; o dirigirse al diagnostico de la recuperacion de una enfermedad, un trastorno o una afeccion mediante la deteccion de una parte danada o reparada en el acido nucleico. Estos metodos tambien se pueden usar para detectar modificaciones en el genoma de las celulas de ensayo cultivadas in vitro cuando se exponen a un agente o condicion que modifica o altera sus componentes genomicos.

Las muestras usadas en estos metodos no tienen ninguna limitacion en particular, siempre que contengan acido nucleico e incluyan muestras de tejido, o muestras de sangre, de lfquido cefalorraqmdeo, de lfquido sinovial o de linfa. Las muestras se pueden obtener de sujetos en necesidad de diagnostico de una enfermedad, un trastorno o una afeccion en particular incluyendo sujetos que tienen enfermedades o trastornos geneticos, cancer, enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes o trastornos inflamatorios, o que se hayan sometido al tratamiento de estas enfermedades o trastornos. Las muestras pueden extraerse en un momento determinado o extraerse longitudinalmente durante un penodo de tiempo para detectar las diferencias entre las celulas producidas debido al envejecimiento, la exposicion repetida a determinados agentes u otros cambios dependientes del tiempo.

En otra realizacion, este metodo implicara (a) hibridar una o mas sondas espedficas de secuencias correspondientes a una o mas posiciones o regiones conocidas espedficas del acido nucleico y, opcionalmente, (b) medir la distancia o la distribucion espacial entre las sondas hibridadas y los elementos detectables correspondientes a una o mas secuencias de acido nucleico danadas o reparadas.

En otra realizacion, la invencion se dirige a un proceso de determinacion del efecto de un agente de ensayo o un compuesto citotoxico en una secuencia de acido nucleico de una celula, que engloba poner en contacto la celula con dicho agente de ensayo durante un tiempo y en condiciones suficientes para que repare, dane, altere o mute el acido nucleico de la celula, y detectar un acido nucleico reparado, danado, alterado o mutado de dicha celula mediante el metodo de la reivindicacion 1; en el que el acido nucleico reparado, danado, alterado o mutado se puede evaluar comparandolo con el acido nucleico de una celula identica por lo demas que no se haya expuesto a dicho agente de ensayo. Este metodo puede comprender ademas la seleccion de un agente de ensayo que repare, dane, altere o mute un acido nucleico de la celula o de un segundo agente que inhiba, mejore o modifique las acciones de dicho agente de ensayo. Un agente de ensayo puede ser un compuesto genotoxico o un agente ffsico tal como una radiacion ionizante tal como rayos UV, rayos X o rayos gamma. En general, los metodos descritos en el presente documento se ponen en practica con celulas eucariotas y ADN extrafdo de dichas celulas, aunque es posible usar otros tipos de celulas o acidos nucleicos. En la aplicacion del metodo, la comparacion normalmente se realiza entre una muestra celular de control o una muestra molecular de control que contiene los acidos nucleicos de control, y una muestra celular de ensayo o una muestra molecular de ensayo que contiene el acido nucleico alterado. Para evaluar el efecto de un agente de ensayo, los acidos nucleicos de control normalmente se obtienen del mismo tipo y de la misma cantidad de celulas que estan contenidas en la muestra de ensayo, pertenecientes al mismo individuo, extrafdas del mismo tipo de tejido, pero no expuestas al agente de ensayo. Para evaluar la susceptibilidad intnnseca al dano o la capacidad de reparacion de una muestra de ensayo, los acidos nucleicos de control normalmente se obtienen del mismo tipo y de la misma cantidad de celulas que estan contenidas en la muestra de ensayo, pero aisladas de tejido aparentemente sano del mismo tipo y posiblemente pertenecientes a un mismo individuo o a individuos de edad y raza similares. Los criterios pertinentes que permiten la distincion entre los controles y los acidos nucleicos alterados incluyen, pero sin limitacion: la cantidad de entidades diana detectadas en un momento determinado o a lo largo de un penodo de tiempo; la distribucion molecular local de las entidades diana detectadas en un momento determinado o a lo largo de un penodo de tiempo; la correlacion entre la distribucion molecular local y la persistencia/desaparicion con el tiempo de las entidades diana detectadas; la posicion genomica de las entidades diana detectadas; la correlacion entre la posicion genomica y la persistencia/desaparicion con el tiempo de las entidades diana detectadas; la correlacion entre los procesos celulares y la persistencia/desaparicion en el tiempo de las entidades diana detectadas; la correlacion entre la estructura molecular local del acido nucleico y la persistencia/desaparicion en el tiempo de las entidades diana detectadas; la correlacion entre la organizacion nuclear del acido nucleico y la persistencia/desaparicion en el tiempo de las entidades diana detectadas, donde una entidad diana puede corresponder a una lesion, un dano, una lesion reparada o una respuesta biologica a un dano encontrado en las muestras de acido nucleico estudiadas.

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Otra realizacion es un proceso de prevencion, profilaxis, tratamiento o terapia de un organismo o huesped que comprende la administracion de un agente de ensayo seleccionado mediante los metodos descritos anteriormente. Como se ha mencionado anteriormente, dicho organismo o huesped normalmente sera un organismo eucariota.

Tambien se contemplan kits que comprenden uno o mas ingredientes utiles para poner en practica el metodo descrito en el presente documento, y contendran al menos un elemento detectable que se situa en una o mas partes danadas o reparadas de un acido nucleico estirado mediante la sustitucion, la union al mismo o su conversion en una extremidad molecular; uno o mas reactivos adecuados para la visualizacion del al menos un elemento detectable; y una o mas sondas que se unen a lugares espedficos de un acido nucleico; y, opcionalmente, uno o mas reactivos usados para el estiramiento de un acido nucleico.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: Distribucion de la longitud de las moleculas de ADN rastreadas tras la exposicion a UV-C. La longitud de las moleculas de ADN tras el rastreo molecular se ve influida por el numero de "regiones fragiles" a lo largo del ADN, ya que aumentan la probabilidad de fragmentacion del aDn durante la manipulacion. El dano inducido por la exposicion a la radiacion UV crea dichos "sitios fragiles" de una manera dependiente de la dosis. Las curvas muestran los efectos de este fenomeno: cuando se aumenta la dosis de UV (de 150 (gris) a 250 J/m2 (negro)), la longitud de las moleculas de ADN rastreadas se reduce progresivamente.

Figura 2: Ejemplo de senales de replicacion observadas en el ADN rastreado extrafdo de fibroblastos humanos normales tras 30 min de incubacion con BrdU (5-bromo-2'-desoxiuridina, en blanco) y 30 min de incubacion con EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina, en negro). BrdU se detecta usando una tecnica de inmunofluorescencia de dos capas, mientras que EdU se detecta mediante la reaccion qmmica con los fluoroforos (que aparece en negro). Las senales blancas de anticuerpos aparecen discontinuas cuando se comparan con las senales negras producidas por la deteccion qmmica. Por otra parte, la adsorcion no espedfica de anticuerpos fluorescentes produce un fondo irregular, que no se observa para el canal negro.

Figura 3: Ejemplo de senales de EdU (que aparecen en negro) observadas en el ADN rastreado extrafdo de fibroblastos normales humanos tras la exposicion a UV-C y 1 hora de incubacion con EdU. La senal negra lineal corresponde a la replicacion del ADN, y la senal negra irregular a la UDS (smtesis de ADN no programada). El ADN se tine con colorante YOYO-1 (que aparece en blanco).

Figura 4: Evolucion del numero de la senal irregular y de su distancia media en el genoma con el aumento de la exposicion a UV-C. El numero de sitios de la UDS aumenta exponencialmente con la dosis de UV-C (A), segun lo confirma la reduccion lineal de su distancia media en las moleculas de ADN rastreadas (B). La capacidad de reparacion de escisiones de nucleotidos (NERCA) parece constante hasta la dosis de UV-C de ensayo. Una desviacion del perfil lineal se interpreta como una variacion en la NERCA de la muestra celular estudiada.

Figura 5: Evolucion de la frecuencia de las senales de la UDS detectadas en el ADN rastreado extrafdo de fibroblastos humanos normales HS 707 (B) y fibroblastos deficientes en la reparacion de las escisiones de nucleotidos XP17BE expuestos a cuatro dosis de luz UV-C. La aparicion de una smtesis UDS fue modelizada como una variable de Poisson. Las barras de error corresponden a los lfmites de confianza de Poisson. Se observa la saturacion en la frecuencia de las reparaciones para la muestra competente en la reparacion tras una dosis cntica de 20 J/m2 de UV-C.

Figura 6: Evolucion del tamano de los parches de la UDS con la dosis de UV-C. La representacion grafica de las distribuciones del contenido de fluorescencia de las senales de UDS tras la normalizacion interna de los fibroblastos normales (izquierda) y para las celulas XP-C (derecha). Los histogramas se representan en forma de curvas continuas para facilitar la visualizacion.

Figura 7: Deteccion de las extremidades moleculares (asociados a la RDC) y RUC en el ADN del fago lambda rastreado. Se marcaron previamente los extremos 3'-OH durante 3 horas usando la enzima TdT y BrdUTP. El tamano de la cola se estima en 150-200 monomeros de BrdUTP. La senal negra es producida por anticuerpos anti- BrdU marcados con fluorescencia. El ADN se tine con YOYO-1 (que aparece en blanco).

Figura 8: Desviacion relativa del perfil de fragmentacion revelada por el tratamiento con la enzima formamidopirimidina-ADN glicosilasa (Fpg) en 5 muestras de ADN humano extrafdas de celulas expuestas a dosis en incrementos de H2O2. La figura de la izquierda muestra la distribucion de los tamanos (eje X) de fragmentos de ADN en cada muestra. Las distribuciones se ajustaron usando exponenciales de la desintegracion y = Ae-x/I ay la evolucion de las constantes de desintegracion t se ilustra en el grafico de la derecha.

Figura 9: Enfoque teorico para la estimacion de la cantidad de RDC generadas mediante la exposicion a la radiacion ionizante. Para facilitar la identificacion de las extremidades moleculares inducidas por la radiacion (Bio RDC); la fragmentacion aleatoria del ADN inducida por la manipulacion (RDC de cizalla) se reduce al mmimo mediante la introduccion de una etapa de digestion con endonucleasas de restriccion (ER). La digestion con ER permite reducir

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el tamano del ADN en el tamano cntico de cizalla y las extremidades de ER (RDC de ER) se pueden marcar para identificarlas de forma inequvoca tras el estiramiento del ADN. Las pocas extremidades no identificadas restantes contienen la RDC original, inducida por la radiacion, que se puede cuantificar comparandola con el perfil de referencia.

Descripcion detallada de la invencion

Los ensayos de alta sensibilidad son cruciales para los estudios generales de biomonitorizacion. El nivel basal de dano en el ADN se ve influido por una variedad de estilos de vida y exposiciones ambientales, incluyendo el ejercicio, la contaminacion del aire, la luz del sol y la dieta. Las condiciones de vida normales son responsables de danos constantes, pero a dosis bajas, sobre el aDn que impactan directamente en los procesos celulares. En este contexto, el metodo de la invencion es una solucion util para la deteccion de la exposicion genotoxica en los seres humanos, y proporciona una herramienta eficaz para la caracterizacion de los compuestos y los riesgos en la evaluacion del riesgo publico. Tambien se requiere una alta sensibilidad en el campo de la dermatologfa y la cosmetica: a diferencia de otros organos, la piel esta en contacto directo con el medio ambiente y, por tanto, envejece como consecuencia de los danos ambientales. El factor ambiental principal que provoca el envejecimiento de la piel humana es la radiacion UV del sol. El fotoenvejecimiento y la fotosensibilidad de la piel se correlacionan con el desarrollo del cancer de piel, y se han convertido en un problema social para varios pafses. Se necesita una mejor caracterizacion de los tipos de piel y de la respuesta a la exposicion solar para desarrollar pantallas mas eficaces con proteccion la radiacion UV. En el Ejemplo 2, el metodo de la invencion se usa con exito para visualizar la reparacion de danos individuales o agrupados producidos en las celulas normales de la piel expuesta a la radiacion UV, con una resolucion jamas alcanzada con anterioridad.

La quimioterapia y la radioterapia tienen por objetivo la generacion de danos en el ADN de alta importancia, para inducir selectivamente las celulas cancerosas a la muerte, aprovechando sus sistemas de reparacion defectuosos. El metodo de la invencion, que permite la cuantificacion rapida y exacta de la proporcion de los sitios danados/reparados, representa una herramienta valiosa para la prediccion de la respuesta al tratamiento y el seguimiento de los pacientes. La evaluacion exacta de los danos solo representana un comienzo en el complejo campo de la terapia personalizada: la relacion entre la respuesta molecular a los danos y la respuesta celular es compleja y depende de una serie de factores ademas de la importancia de los danos: el tipo de celula (tipo de tejido normal, cancer), el momento del ciclo celular, el medio ambiente celular (Gerweck, Vijayappa et al. 2006). La variabilidad individual introduce un segundo grado de complejidad, que es muy amplia en este campo y hace de la correlacion de la respuesta celular con la respuesta clmica una ardua labor (Stausbol-Gron y Overgaard 1999).

Al igual que en la terapia del cancer, el dano del ADN es la diana citotoxica de muchos farmacos antimicrobianos. El ejemplo mas importante es la gran familia de las fluoroquinolonas, que son los unicos inhibidores directos de la smtesis de ADN microbiano. Las fluoroquinolonas actuan uniendose al complejo de enzima-ADN y estabilizan las roturas de las cadenas de ADN creadas por la ADN girasa y la topoisomerasa IV (Hooper, 2001). Debido a que la resistencia a los farmacos antimicrobianos es generalizada, resultan vitales la comprension de sus mecanismos de accion y un control de calidad preciso. Tambien en este contexto, el metodo de la invencion resulta valioso para la evaluacion exacta de la eficacia de los farmacos antimicrobianos, de la especificidad, y para el estudio de los factores que intervienen en el desarrollo de la resistencia a los farmacos.

El metodo de la invencion es particularmente interesante por su potencial para detectar y analizar, al mismo tiempo, los diferentes tipos de danos o de respuestas al dano. En la actualidad, ningun ensayo es capaz de describir el dano del ADN por completo, debido a la variedad de las lesiones del ADN y al hecho de que son dirigidas por diferentes mecanismos, y tienen diferentes potenciales mutagenicos y cineticas de reparacion. Existen dos enfoques principales para analizar el dano del ADN: el primer grupo incluye las tecnicas que identifican los tipos espedficos de lesiones del ADN; el segundo grupo comprende ensayos bioqmmicos centrados en la medicion de los efectos del dano del ADN.

Los ejemplos del primer grupo comprenden el uso de tecnicas de calibrado del ADN combinadas con un tratamiento enzimatico selectivo dirigido a lesiones espedficas del ADN y su conversion en RDC o RUC (Collins 2004). El perfil de la fragmentacion del ADN resultante se puede obtener mediante tecnicas tradicionales como la transferencia de Southern (Bohr, Smith et al. 1985), la electroforesis en gel de campo pulsado (Cedervall, Wong et al. 1995) o medios de mayor rendimiento como la deteccion fluorescente en un microchip (Filippova, Monteleone et al. 2003). Estas tecnicas carecen de sensibilidad para la deteccion de eventos de baja frecuencia (como las RDC) debido a su naturaleza voluminosa (la senal media de un grupo de moleculas procedentes de mas de una celula). Por otra parte, los tamanos de los fragmentos se extrapolan de la medicion de la intensidad de fluorescencia, lo que reduce drasticamente la exactitud y la precision del calibrado. Finalmente, los fragmentos de ADN se manipulan en la forma enrollada, lo que impide los estudios de localizacion.

La electroforesis en gel de una sola celula (SCGE, tambien denominada ensayo del cometa) es una herramienta versatil que permite la evaluacion de bajos niveles de dano al nivel de una sola celula. Las celulas se extienden sobre una superficie y se introducen en gel de agarosa. Las membranas celulares se permeabilizan en presencia de un compuesto que tine el ADN, y se aplica un campo electrico. El concepto basico es que el ADN danado (en

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particular, las cadenas rotas localmente) puede relajarse y migrar cuando se aplica el campo electrico, mientras que el ADN intacto conserva su organizacion en las protemas de compactacion y no sale del nucleo. Las celulas observadas por microscop^a de fluorescencia se ven como "cometas", cuyo tamano de la cola corresponde a la cantidad de ADN que sale de la cavidad y es una medida de la cantidad del dano en el ADN en la celula (Ostling y Johanson 1984). Cuando se acopla a tratamientos qmmicos (Singh, McCoy et al. 1988) o enzimaticos (Collins, Dobson et al., 1997), la SCGE puede proporcionar alta sensibilidad y especificidad para ciertos tipos de danos. El inconveniente es su caracter cualitativo: la extension del dano en el ADN se estima mediante la comparacion visual o la comparacion con ayuda de un software de la intensidad de la fluorescencia en la cabeza del cometa (ADN intacto) y en la cola (ADN danado) (Collins, 2004).

Recientemente, los ensayos inmunoqmmicos han permitido la visualizacion directa y la cuantificacion de bajos niveles de RDC dentro de las celulas fijas. El mas ampliamente empleado es la inmunodeteccion de la forma y- fosforilada de la histona H2AX, que se sabe que se forma muy rapidamente cuando se genera una RDC (Rogakou, Pilch et al. 1998). Estas tecnicas son las mas sensibles y directas, pero son complicadas de realizar desde un punto de vista experimental y no son aptas para su uso clmico.

Los sitios abasicos se pueden marcar directamente con haptenos como la biotina a traves de una reaccion qmmica con reactivos de sonda reactiva con aldehndos (ARP) (Nakamura, Walker et al., 1998; Kurisu, Miya et al., 2001). Las lesiones de bases (por ejemplo, 8-OH-Guanina) se pueden detectar mediante cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC) o mediante espectrometna de masas-GC (Dizdaroglu, 1984).

El segundo grupo de metodos se dirige, en general, a mecanismos que estan bloqueados por la presencia de dano en el ADN. Por consiguiente, a menudo dan puntos de vista sobre la importancia biologica de los danos investigados y sus consecuencias en terminos de mutagenesis.

Los ensayos de PCR de largo alcance extrapolan la cantidad y el impacto de los danos midiendo la reduccion de la amplificacion de una secuencia representativa. Cuando una polimerasa se encuentra con una lesion en la secuencia monitorizada, la amplificacion se detiene. El resultado es una reduccion proporcional al dano de la eficacia de la amplificacion (Lisby, Gniadecki et al., 2005). Su sensibilidad depende de la cantidad del dano y de las limitaciones de la tecnica de PCR.

Los ensayos de mutagenesis suelen basarse en la transfeccion de celulas con un plasmido que contiene un gen indicador. Los danos convertidos en mutaciones provocaran el silenciamiento genico, dando como resultado una reduccion de la cantidad de producto genico (White y Sedgwick, 1985). Estos metodos permiten la evaluacion de la relevancia biologica de los danos inducidos a la celula y pueden proporcionar modelos para estudiar la reparacion por recombinacion. Sin embargo, solo se pueden realizar in vitro limitando la posibilidad de usarlos en el tejido humano.

La deteccion de la reparacion de danos espedficos se puede realizar de una manera directa cuando implica la smtesis de ADN no programada (UDS), es decir, para los sistemas BER y NER. La smtesis de ADN no programada (UDS) se refiere a la smtesis de ADN que se produce como una respuesta espedfica, local, inducida por la presencia de una alteracion en la estructura de la molecula de ADN. Los parches producidos durante la UDS se definen como no programados para distinguirlos del ADN replicado normal, que se considera una actividad celular programada. En el caso de BER, el ensayo se suele realizar in vitro usando protemas reconstituidas y nucleotidos radiomarcados. Los recuentos de la radiactividad permiten estimar el numero de lesiones de bases que se han reparado (Srivastava, Berg et al. 1998). Los ensayos in vivo requieren sistemas que usan plasmidos, que normalmente portan una lesion qmmica definida (Sattler, Frita et al., 2003). En el caso de los parches de NER, los ensayos se realizan en las celulas vivas, proporcionandoles nucleosidos marcados de diferentes tipos como se describe en mas detalle a continuacion en el Ejemplo 2.

En muchos casos, las capacidades de reparacion se deducen indirectamente estudiando la evolucion de los sitios danados durante diferentes tiempos de reparacion.

El metodo de la invencion es mas exhaustivo y flexible que los ensayos mencionados, ya que permite la deteccion tanto directa como indirecta de los danos y de la reparacion a la vez. Se pueden estudiar y cuantificar danos y reparaciones espedficos mediante la combinacion de tres estrategias diferentes de moleculas de ADN estiradas. Con el primer enfoque, la deteccion de la lesion o de la reparacion se realiza a traves de la sustitucion parcial o total de la diana (es decir, la alteracion seleccionada de la molecula de ADN) con un elemento detectable; el segundo enfoque se basa en un elemento detectable que se une espedficamente a la diana; y el tercer enfoque consiste en la transformacion de la diana en una extremidad molecular. Los procedimientos experimentales detallados para la aplicacion de estas tres estrategias se proporcionan, respectivamente, en los Ejemplos 2, 3 y 4.

El metodo de la invencion permite evaluar la deteccion de multiples lesiones o lesiones reparadas en moleculas de ADN de forma fiable, de una manera que requiere poco tiempo y que es rentable, y con pequenas cantidades de diversos materiales de partida: ADN comercial, partmulas virales, parasitos, celulas procariotas, celulas eucariotas cultivadas, sangre y biopsia de tejido de un organismo eucariota u hospedador (es decir, plantas, hongos o animales

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incluyendo seres humanos). El rastreo molecular es una potente tecnica que permite la visualizacion directa de las moleculas individuales, y se ha usado con exito para el estudio de la cinetica de replicacion mediante la visualizacion directa del ADN recien sintetizado (Herrick, Conti et al. 2005) y para estudios de cartograffa del genoma (Conti, Bensimon, 2002). Se ha sugerido que el uso de la elongacion del ADN mediada por nanocanales como herramienta para la investigacion del dano y la reparacion en el ADN proporciona una alternativa a las tecnicas de calibrado de los fragmentos como PFGE o la intensidad de la fluorescencia (documento WO/2008/121828). A diferencia del rastreo molecular, todos estos metodos de calibrado basados en la PFGE, moleculas individuales que fluyen en micro- (Filippova, Monteleone et al., 2003) o nano-canales (Tegenfeldt, Prinz et al., 2004) no permiten el procesamiento posterior de las moleculas de ADN, y los estudios de hibridacion son muy diffciles de realizar. Ademas, estos metodos no proporcionan o solo proporcionan la elongacion parcial de las moleculas de ADN. Por consiguiente, la longitud de los fragmentos de ADN se ha de estimar a partir de las mediciones de la intensidad de la fluorescencia, lo que reduce la resolucion y la precision de la medicion en comparacion con las tecnicas de estiramiento del ADN. Nada anticipa el uso del rastreo molecular u otras tecnicas de estiramiento del ADN como herramientas de alta resolucion, visualizacion directa y localizacion genomica de los sitios del ADN en los que se han producido los danos y la reparacion biologica. Cao et al. intentaron construir perfiles de fragmentacion espedficos mediante la conversion de los sitios danados en RDC y la medicion de la longitud de los fragmentos de aDn parcialmente elongados resultantes (documento WO/2008/121828, documento US 7.670.770). Ninguna de estas publicaciones menciona la posibilidad ya sea de detectar directamente y de contar los sitios danados o sitios reparados en los acidos nucleicos estirados o de estimar indirectamente la cantidad de dano mediante la determinacion de la distribucion del tamano de los fragmentos estirados. Ademas, nada sugiere la aplicacion de la hibridacion del ADN en el ADN elongado o estirado para investigar la distribucion de los danos y la reparacion con respecto a la secuencia del genoma o la organizacion de la cromatina.

Los inventores han demostrado que el rastreo molecular, que permite un analisis de alta resolucion del acido nucleico estirado, se puede aplicar con exito para la deteccion directa e indirecta, la cuantificacion y la localizacion genomica de la presencia de sitios danados (alteraciones o perdidas en la secuencia o estructura de un acido nucleico) y los sitios reparados (sitios danados reconvertidos en la forma original o en una forma normal por los sistemas celulares) en moleculas de ADN estiradas, algo que no se ha sugerido con anterioridad. El metodo de la invencion que implica el estiramiento de ADN, y en particular, el rastreo molecular, es el unico metodo, hasta la fecha, que permite la visualizacion directa, la cuantificacion precisa y la localizacion de los eventos distribuidos en el ADN a distancias aleatorias (de 1 base a varios millones de bases) con una resolucion de al menos 500 pb debido al lfmite optico actual de las imagenes de fluorescencia. Los principios de la presente invencion no pueden verse limitados por las limitaciones del metodo de marcaje de fluorescencia y deteccion que existe en la actualidad.

Aspectos espedficos de la invencion incluyen un metodo de deteccion de la presencia o de la ausencia de una secuencia reparada, danada, alterada o mutada en un acido nucleico que comprende: (a) extraer uno o mas acidos nucleicos de una muestra y, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra extrafda; (b) estirar el al menos un acido nucleico de dicha muestra extrafda; (c) anadir una sustancia detectable al acido nucleico estirado, sustancia que se situe en una o mas partes danadas o reparadas del acido nucleico estirado mediante la sustitucion, la union al mismo o su conversion en una extremidad molecular; (d) detectar la sustancia detectable en el acido nucleico estirado; y (e) detectar la presencia de acido nucleico danado o reparado cuando dicha sustancia se detecta y detectar la ausencia de una secuencia de acido nucleico danada o reparada cuando dicha sustancia detectable no se detecta. Como alternativa, dicho metodo puede comprender (a) extraer uno o mas acidos nucleicos de una muestra y, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra extrafda, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra de acido nucleico extrafda; (b) anadir una sustancia detectable a dicho acido nucleico durante un tiempo y en condiciones suficientes para la interaccion, sustancia que se situe en una o mas partes danadas o reparadas del acido nucleico estirado mediante la sustitucion, la union al mismo o su conversion en una extremidad molecular, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra de acido nucleico tras ponerla en contacto con la sustancia detectable; (c) estirar el al menos un acido nucleico en dicha muestra de acido nucleico interaccionada; (d) detectar la sustancia detectable en el acido nucleico estirado; y (e) detectar o diagnosticar la presencia de acido nucleico danado o reparado cuando dicha sustancia se detecta y detectar o diagnosticar la ausencia de una secuencia una secuencia de acido nucleico danada o reparada cuando dicha sustancia detectable no se detecta. Como alternativa, dicho metodo puede comprender: (a) tratar una muestra celular antes de la extraccion de los acidos nucleicos de dicha muestra mediante la adicion de una sustancia detectable durante un tiempo y en condiciones suficientes para la interaccion con los acidos nucleicos, sustancia que se situe en una o mas partes danadas o reparadas del acido nucleico mediante la sustitucion, la union al mismo o su conversion en una extremidad molecular; (b) extraer uno o mas acidos nucleicos de dicha muestra y, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra de acidos nucleicos extrafda; (c) estirar el al menos un acido nucleico en dicha muestra de acido nucleico interaccionada; (d) detectar la sustancia detectable en el acido nucleico estirado; y (e) detectar o diagnosticar la presencia de acido nucleico danado o reparado cuando dicha sustancia se detecta y detectar o diagnosticar la ausencia de una secuencia de acido nucleico danada o reparada cuando dicha sustancia detectable no se detecta. Ambos metodos anteriores pueden emplear una sustancia que se situe en una o mas partes danadas del acido nucleico estirado mediante la sustitucion, la union al mismo o su conversion en una extremidad molecular. Estos metodos pueden comprender etapas espedficas tales como la hibridacion de una o mas sondas espedficas de secuencia correspondiente a una o mas posiciones o regiones conocidas espedficas en el acido nucleico, y/o la medicion de la distancia o la distribucion espacial entre las sondas hibridadas y los elementos detectables correspondientes a una o mas secuencias de acido nucleico danadas o

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reparadas.

Estos metodos tambien pueden comprender el diagnostico de una enfermedad, un trastorno o una afeccion mediante la deteccion de una parte danada o reparada en el acido nucleico; o comprender el diagnostico de la recuperacion de una enfermedad, un trastorno o una afeccion mediante la deteccion de una parte danada o reparada en el acido nucleico. Tambien se puede evaluar el dano producido en el acido nucleico como resultado del envejecimiento o usarlo por un forense para determinar la edad de un sujeto.

En el metodo, se usan muestras que contienen acidos nucleicos, y se pueden obtener de una fuente in vitro o in vivo tal como de una muestra de tejido o de sangre, lfquido cefalorraqmdeo, lfquido sinovial o linfa de un sujeto. Los sujetos pueden ser sujetos normales o aquellos que tienen enfermedades o trastornos tales como cancer, enfermedad infecciosa, enfermedad autoinmune o enfermedad inflamatoria, o el tratamiento previo o en curso de estas enfermedades o trastornos. Las muestras tambien se pueden adquirir en un penodo de tiempo, por ejemplo, para evaluar las alteraciones relacionadas con el tratamiento o relacionadas con el envejecimiento en los acidos nucleicos celulares. Las muestras se pueden expandir, procesar o tratar antes de la extraccion de los acidos nucleicos.

Un proceso para determinar el efecto de un agente de ensayo en una secuencia de acido nucleico de una celula que comprende poner en contacto la celula con dicho agente de ensayo durante un tiempo y en condiciones suficientes para que reparare, dane, altere o mute el acido nucleico de la celula, y detectar un acido nucleico reparado, danado, alterado o mutado de dicha celula mediante los metodos descritos en el presente documento; en el que el acido nucleico reparado, danado, alterado o mutado se puede evaluar comparandolo con el acido nucleico de una celula identica por lo demas que no se haya expuesto a dicho agente de ensayo. Dichos metodos se pueden usar para identificar nuevos agentes, o identificar y seleccionar entre los agentes agrupados o existentes uno que repare, dane, altere o mute un acido nucleico de una celula en particular. Las celulas representativas incluyen celulas eucariotas, celulas de mairnfero, incluyendo las de animales domesticos o de granja, y seres humanos. Los metodos del presente documento pueden ponerse en practica con diferentes acidos nucleicos. En general, las muestras de ADN se usaran mas convenientemente debido a su estabilidad. Los efectos de los agentes genotoxicos, genorreparadores o estabilizantes, incluyendo los compuestos qmmicos o diversas formas de agentes ffsicos, tales como la radiacion ionizante genotoxica, se pueden rastrear a nivel molecular, y su resultado final sobre los procesos celulares puede estar relacionado con sus mecanismos de accion sobre los acidos nucleicos. Los agentes identificados y caracterizados mediante los metodos desvelados en el presente documento se pueden usar para tratar a un sujeto.

Se pueden formular kits que comprenden uno o mas ingredientes utiles para la practica de los metodos desvelados en el presente documento, opcionalmente, con instrucciones sobre como usarlos para la practica de estos metodos, y recipientes apropiados y materiales de envasado para los componentes que contienen. Estos kits pueden contener elementos necesarios para realizar las diferentes etapas de los metodos, tales como una combinacion que comprende al menos un elemento detectable que se situa en una o mas partes danadas o reparadas de un acido nucleico estirado mediante la sustitucion, la union al mismo o la conversion en una extremidad molecular; uno o mas reactivos adecuados para la visualizacion de al menos un elemento detectable; y una o mas sondas que se unen a lugares espedficos de un acido nucleico; y, opcionalmente, uno o mas reactivos usados para el estiramiento de un acido nucleico.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un ensayo de deteccion del dano y de la reparacion en el ADN in vitro o ex vivo de acuerdo con cualquiera de los metodos descritos en la presente invencion.

Los siguientes ejemplos no limitantes describen realizaciones particulares de la invencion.

Ejemplo 1: Cuantificacion del dano y de la capacidad de reparacion del ADN en linfoblastos humanos normales expuestos a la radiacion UV-C.

La exposicion a la radiacion UV-C induce lesiones inespedficas en la molecula de ADN, por ejemplo, RUC, sitios de AP, bases oxidadas, etc., junto con productos fotoqmmicos mas espedficos: dfmeros de pirimidina ciclobutano (CPD) y productos fotoqmmicos (6-4) (6-4PP). El siguiente procedimiento experimental describe en detalle el protocolo y los materiales necesarios para poner en practica el metodo de la invencion para la deteccion y la cuantificacion simultaneas de un conjunto de danos: en este ejemplo, la 8-oxoguanina (indirecta), varios CPD y 6- 4PP (inmunodeteccion directa) y productos fotoqmmicos reparados (marcaje de UDS directa). Se podnan abordar otros tipos de lesiones mediante un procedimiento experimental analogo.

Procedimientos experimentales

Cultivo de linfoblastos humanos normales

Los experimentos se realizaron usando linfoblastos humanos normales, la lmea celular GM17749 en P5. Se descongelaron rapidamente celulas de las reservas criogenizadas, y se cultivaron en un matraz de cultivo T25 a

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37 °C, CO2 al 5 % hasta alcanzar una cantidad final de 2 x 106 celulas. El medio de crecimiento usado fue RPMI 1640 (medio de Roswell Park Memorial Institute, Invitrogen) con FBS al 15 % v/v (Invitrogen) y L-glutamina 2 mM (Gibco, Invitrogen). Las celulas se incubaron durante 6 h con RPMI 1640 que contema FBS al 0,5 % para reducir la replicacion antes del experimento.

Tratamiento con luz UV y marcaje de UDS

Se vertio la suspension celular en cuatro placas de Petri abiertas y se expusieron dos de ellas a la luz UV-C (UV1 y UV2) producida por una lampara germicida (Philips, 254 nm, 15 W, 0,8 pW/m2), con la tapa abierta. Se fijo la dosis de exposicion en 100 J/m2, medida con un radiometro UV-C (LT Lutron, ref. Q569239). Las dos muestras de control (CT1 y CT2) se expusieron simplemente al aire. Tras la exposicion, las celulas se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. Se volvieron a suspender las muestras UV1 y CT1 en 1 x PBS (solucion salina tamponada con fosfato, Invitrogen) a una concentracion de 5.000 celulas/pl para la preparacion inmediata de tapones de agarosa. Se volvieron a suspender las muestras UV2 y CT2 en RPMI 1640 que contema FBS al 0,5% v/v y 5-etinil-2'- desoxiuridina (EdU) 100 pM (Invitrogen) y se incubaron las celulas durante 60 min a 37 °C, CO2 al 5 % para permitir la UDS y el marcaje de la replicacion residual.

Preparacion de tapones de ADN embebidos a partir de celulas cultivadas

Tras el marcaje con EdU, se mezclo cada suspension de celulas de las muestras UV2 y CT2 con un volumen igual de 1 x PBS a 4 °C, se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C, se aclararon una vez con 1 x PBS 20 a 4 °C, se volvieron a centrifugar a 1.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C y se volvieron a suspender en 1 x PBS 20 a una concentracion de 5.000 celulas/pl. Para la preparacion de los tapones de agarosa, a continuacion, se mezclo bien la suspension de celulas en una proporcion de 1:1 con una solucion al 1,2 % p/v de agarosa de bajo punto de fusion (Nusieve GTG, ref. 50081, Cambrex) preparada en 1 x PBS a 50 °C. Se vertieron 90 pl de la mezcla de celulas/agarosa en un pocillo de formacion de tapones (BioRad, ref. 170-3713) y se dejo que se enfriara al menos 15 minutos a 4 °C. La lisis de las celulas en los bloques se realizo como se ha descrito previamente (Schurra y Bensimon, 2009). En resumen, se incubaron los tapones de agarosa durante la noche a 50 °C en 250 pl de una solucion de EDTA 0,5 M (pH 8), Sarkosyl al 1 %, 250 pg/ml de proteinasa K (Eurobio, codigo: GEXPRK01, Francia), y, a continuacion, se lavaron tres veces en un Tris 10 mM, solucion de EDTA 1 mM durante 30 min a temperatura ambiente.

Escision de 8-oxoguanina mediante el tratamiento con hOGGI

Se transfirieron tapones de agarosa a tampon de digestion de hOGG1 (NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, MgCh 10 mM, DTT 1 mM) y se trataron con 1 pg/tapon de enzima hOGGI (New England Biolabs) a 37 °C durante 3 h. Se incubaron los tapones durante 1 h a 50 °C en 250 pl de una solucion de EDTA 0,5 M (pH 8), 250 pg/ml de proteinasa K para eliminar la hOGG1 residual, y despues se lavaron tres veces en una solucion de Tris 10 mM, EDTA 1 mM durante 30 min a temperatura ambiente.

Extraccion final del ADN y rastreo molecular

Se trataron tapones de ADN embebido de linfoblastos humanos para el rastreo del ADN como se ha descrito anteriormente (Schurra y Bensimon, 2009). En resumen, se fundieron los tapones a 68 °C en una solucion de MES 0,5 M (pH 5,5) durante 20 min, y se anadieron 1,5 unidades de beta-agarasa (New England Bio Labs, ref. M0392S, MA, EE.UU.) y se dejaron incubar durante un maximo de 16 horas a 42 °C. Luego se vertio la solucion de ADN en un deposito de teflon y se realizo el rastreo molecular usando el sistema de rastreo molecular (Genomic Vision S.A., Paris, Francia) y CombiCoverslips (20 mm x 20 mm, Genomic Vision S.A., Pans, Francia). Las superficies rastreadas se curaron durante 4 horas a 60 °C.

Deteccion de la UDS y senal de replicacion

Se realizo la deteccion de nucleotidos marcados con alquino mediante la reaccion de cicloadicion de Huisgen catalizada por Cu (I) (clic) como se ha descrito previamente (Salic y Mitchison, 2008). En resumen, se preparo una mezcla de reaccion de tampon de Tris 100 mM, pH 8,5, CuSO4 0,5 mM (Sigma), azida Alexa Fluor® 594 1 pM (Invitrogen) y L-ascorbato de sodio 50 mM (Sigma) (anadido el ultimo a la mezcla de una solucion 0,5 M) y se mezclo con Block-Aid (Invitrogen, ref. B-10710) en una proporcion de 1:1. Se vertieron 20 pl de mezcla de reaccion sobre portaobjetos de vidrio limpios y se cubrieron con una superficie de rastreo. Se incubaron los portaobjetos durante 30 min a TA protegidos de la luz, luego se aclararon durante 1 min en agua desionizada con agitacion a 500 rpm. Se realizo una segunda incubacion con una mezcla de reaccion recien preparada durante otros 30 min. Las superficies se aclararon dos veces en 1 x PBS durante 5 minutos y una vez en agua desionizada durante 1 minuto, ambas veces con agitacion a 500 rpm. El agua residual se seco con aire comprimido.

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Deteccion inmunoqwmica de los CPD y 6-4PP

La deteccion se realizo usando capas de anticuerpos. Para cada capa, se anadieron 20 pl de la solucion de anticuerpos al portaobjetos, y se cubrio con un cubreobjetos de rastreo, y el portaobjetos se incubo en atmosfera humeda a 37 °C durante 20 min. Se lavaron los portaobjetos 3 veces en una solucion de 2 x SSC y Tween 20 al 1 % durante 3 minutos a temperatura ambiente entre cada capa y tras la ultima capa. La deteccion se llevo a cabo en este ejemplo usando anti-CPD de raton (CosmoBioCo, Ltd, Clon: TDM-2) y anti-6-4PP de raton (CosmoBioCo, Ltd, Clon: 64M-2) en una dilucion de 1:25. Como segundo anticuerpo de la capa, se uso anticuerpo anti-raton de cabra acoplado con Alexa Fluor ® 350 (Invitrogen, Francia) diluido a 1:25.

Analisis de las senales fluorescentes

Para la visualizacion directa del ADN rastreado, se montaron cubreobjetos con 20 pl de una mezcla de Block-Aid (Invitrogen, ref. B-10710) y yoduro YOYO-1 (Molecular Probes, codigo Y3601) (10000:1 v/v) para la tincion de contraste de todas las moleculas estiradas. La generacion de imagenes se realizo con un microscopio de epifluorescencia invertido automatico, dotado de un objetivo de 40 aumentos (ImageXpress Micro, Molecular Devices, EE.UU.). Se midio la longitud de las fibras de ADN tenidas con YOYO-1 y se convirtio a kb, usando un factor de ampliacion de 2 kb/pm (Schurra y Bensimon, 2009), con un software interno GVlab v0.4.6 (Genomic Vision S. A., Paris, Francia). Se construyeron histogramas de distribucion de la longitud a partir de las mediciones del ADN y se compararon para la evaluacion indirecta de la cantidad de lesiones de 8-oxoguanina presentes en las muestras justo despues de la exposicion UV (UV1 frente a CT1) y tras la reparacion de 1 h (UV2 frente a CT2). Se analizo una cantidad total de ADN de 20 Gpb. Se identificaron senales azules y senales rojas espedficas, correspondientes respectivamente a anticuerpos anti-productos fotoqmmicos y a UDS, cuando se encentraban en las moleculas de ADN tanidas de YOYO-1 y luego se cuantificaron como el numero de eventos/kpb. La comparacion de las muestras UV1 y UV2 normalizadas con respecto a sus controles permitio la evaluacion de la capacidad de reparacion a corto plazo de la muestra de linfoblastos.

Ejemplo 2: Deteccion de lesiones o de reparaciones a traves de la sustitucion parcial o completa de la diana con un elemento detectable.

Deteccion de la capacidad de reparacion de NER (NERCA)

El sistema de reparacion de escisiones de nucleotidos (NER) es una via enzimatica de reparacion del ADN versatil que participa en la reparacion de una amplia variedad de lesiones del ADN estructural con propiedades de distorsion de la helice del ADN (van der Wees, Jansen et al., 2007), incluyendo dfmeros de pirimidina ciclobutano inducidos por UV (CPD) y productos fotoqmmicos (6-4) (6-4PP). Se han identificado dos subvfas de NER, es decir, la reparacion del genoma global (GGR) y una via especializada denominada reparacion acoplada a la transcripcion (TCR). La GGR elimina las lesiones del ADN en todo el genoma, mientras que la TCR se dirige a las lesiones en la transcripcion de genes activos (Fousteri, Mullenders, 2008).

La NER es un complejo proceso de reparacion de multiples etapas que incluye mas de 30 polipeptidos. El heterodfmero XPC-hHR23B es el principal factor de reconocimiento de danos de la GGR y es estrictamente necesario para el reclutamiento de las siguientes protemas NER con el ADN danado. Para una revision de los factores que intervienen en la via de NER, vease de Laat, Jaspers et al., (1999).

El reconocimiento de las distorsiones voluminosas conduce a la eliminacion de un segmento corto de ADN bicatenario, de aproximadamente 30 pares de bases de longitud, que incluye la lesion, creandose un hueco de una sola cadena en el ADN. La escision se produce exclusivamente en la cadena de ADN que contiene el aducto de ADN: las protemas implicadas en la NER son capaces de distinguir no solo el ADN de duplex danado frente al intacto, sino tambien que cadena contiene el aducto (Shuck, Short et al., 2008). El hueco es rellenado posteriormente por la ADN polimerasa (lo que se denomina normalmente parches reparados), que usa la cadena intacta como molde. Los parches de ADN reparado normalmente se definen como la smtesis de ADN no programada (UDS) para distinguirlos del ADN replicado normal, que se considera una actividad celular programada.

La falta o la mala regulacion de la via de NER dan lugar a enfermedades graves (xeroderma pigmentoso (XP), smdrome de Cockayne y tricotiodistrofia) y a la predisposicion al desarrollo de cancer. Los genes NER han sido objeto de una intensa exploracion en busca de posibles SNP relacionados con la carcinogenesis (Kiyohara y Yoshimasu, 2007; Crew, Gammon et al., 2007). La comunidad cienrtfica en general ha intentado delimitar las conexiones entre la capacidad de reparacion del ADN y la inestabilidad genetica que, con el tiempo, se correlacionan con la probabilidad de aparicion del cancer. Muchos de estos analisis son contradictorios y representan un reto considerable, ya que suelen ser capaces de medir el parametro de partida: la capacidad de reparacion del ADN. Los resultados recientes sobre los modelos que contienen multiples SNP dentro de la via de reparacion han demostrado una mayor correlacion con el riesgo de cancer y la respuesta a los farmacos quimioterapeuticos (Bartsch, Dally et al., 2007).

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Ademas de un papel en la carcinogenesis, la capacidad de NER tambien es relevante en el contexto del tratamiento del cancer. Numerosos agentes quimioterapeuticos, incluyendo derivados de platino (el cisplatino, el oxaliplatino y el carboplatino son los mas comunes) actuan a traves de la formacion de aductos de ADN voluminosos, que son dianas de la NER (Jamieson y Lippard, 1999). Por lo tanto, la sensibilidad a la quimioterapia individual se ve influida por la capacidad de reparacion NEr, y esta se podna usar para predecir la respuesta al tratamiento. Los derivados de platino son el tratamiento principal para una variedad de canceres, incluyendo los canceres testicular, de pulmon y de ovario, asf como los tumores de la cabeza y del cuello (Shuck, Short et al., 2008). La importancia de la capacidad de reparacion del ADN se demuestra por la discrepancia drastica en la eficacia del cisplatino en dos casos clmicos: el cancer testicular, que se caracteriza por una gran reduccion de la capacidad de reparacion del ADN, muestra una tasa de supervivencia del 95 % tras el tratamiento con cisplatino (Einhorn, 2002), mientras que el cancer de pulmon no microcftico (NSCLC), presente con mayores niveles de capacidad de reparacion del ADN, tiene una baja supervivencia (Spitz, Wei et al., 2003). Ademas, la NER deficiente parece desempenar un papel importante en la etiologfa del cancer de mama esporadico. De este modo, se espera de los derivados de platino sean eficaces en el tratamiento del cancer de mama en fase temprana (Latimer, Johnson et al., 2010) y la capacidad de reparacion NER se podna usar para predecir la respuesta al tratamiento tambien para este tipo de cancer. Teniendo en cuenta estas correlaciones, las mediciones precisas de la capacidad de reparacion NER ayudanan a aumentar la eficacia de los agentes quimioterapeuticos actuales que funcionan danando el ADN (Kartalou y Essigmann, 2001). Ademas, el metodo de la invencion se podna usar para identificar epitelio de mama que muestre la reduccion en la capacidad de NER y, por lo tanto, servir como ensayo de prediccion de la tumorigenesis.

La actividad de NER se calcula a partir de mediciones de la UDS. La UDS, en general, se detecta mediante la incorporacion de nucleosidos modificados/marcados durante cultivos celulares, de manera similar a la replicacion del ADN. Sin embargo, debido al pequeno tamano (parches de aproximadamente 30 pb) y una menor frecuencia de estos eventos en todo el genoma, resulta diffcil cuantificar la UDS con alta sensibilidad o localizar parches en todo el genoma. Las mediciones se deben realizar en celulas que no se encuentren en fase S o se ha de silenciar la smtesis de ADN de replicacion para detectar la UDS (Lehmann y Stevens, 1980), que, de lo contrario, sera enmascarada por la senal de replicacion. Los ensayos convencionales de los laboratorios de diagnostico son: la incorporacion de 3H- timidina, seguida del recuento de centelleo lfquido o la autorradiograffa de sustratos de cultivo de tejidos y la evaluacion del recuento de granos; la incorporacion de bromodesoxiuridina (BrdU), seguida de la deteccion inmunofluorescente por anticuerpos anti-BrdU (Kelly y Latimer, 2005). La radiactividad permite alcanzar sensibilidades mas altas que la inmunodeteccion, pero requiere mas mano de obra y tiempo. Los resultados se usan para el diagnostico de trastornos de reparacion deficiente clmicamente y proporcionar una base para la investigacion de la deficiencia de la reparacion de tejidos o tumores humanos. En la actualidad, no existe ningun otro ensayo funcional que mida directamente la capacidad para realizar la NER en todo el genoma sin el uso de radiactividad o anticuerpos espedficos.

Los inventores han desarrollado metodos para detectar la UDS directamente sobre ADN estirado, de una manera que requiere poco tiempo y que es rentable, y con ninguna de las limitaciones de manipulacion de la radioactividad o los inconvenientes del uso de anticuerpos. Ademas, el metodo de la invencion permite estimar la capacidad de reparacion NER de una muestra celular expuesta al tratamiento que dana el ADN, independientemente del tipo de tratamiento considerado. Con una metodologfa de una sola molecula como el rastreo molecular, la deteccion de la UDS ganana sensibilidad, y sena posible realizar estudios de resolucion y cartograffa gracias a la hibridacion simultanea. Cuando se proporcionan nucleosidos modificados a las celulas en cultivo tras la exposicion UV, la NER producira pequenos oligoparches (por ejemplo, de 20 a 40 pb, y preferentemente de 30 pb) y la maquinaria de replicacion producira fragmentos marcados mucho mas largos. Como resultado de ello, la senal fluorescente de la UDS aparecera como una senal irregular en las moleculas de ADN estiradas, mientras que la replicacion se corresponded con las senales lineales largas. La metodologfa es la unica que permite la deteccion simultanea de senales de replicacion y de UDS. Esto ayudana significativamente a descubrir farmacos con una mayor especificidad, ya que los compuestos candidatos pueden perturbar varias vfas metabolicas del ADN, incluyendo la replicacion y la recombinacion del ADN, y los efectos generales puede producir respuestas clmicas drasticas.

Los inventores tambien desvelan un metodo de deteccion in vitro de la presencia de UDS impulsada por la NER en las celulas expuestas a agentes genotoxicos, en particular, la deteccion de la UDS en los fibroblastos normales humanos expuestos a la luz UV. Dicho metodo comprende una etapa de incubacion con nucleosidos modificados con alquino durante el cultivo celular y la deteccion qmmica de los parches de NER sobre ADN estirado. Nunca se ha demostrado la visualizacion directa de segmentos fluorescentes de 30 pb en el ADN estirado. Segun la experiencia de los presente inventores, las senales irregulares en las moleculas estiradas corresponden a varios cientos de bases segun lo observado usando una camara CCD convencional. Se podnan visualizar los parches individuales usando una camara de alta sensibilidad. Los parches de NER probablemente estan concentrados en agrupaciones (Svetlova, Solovjeva et al., 2002): las agrupaciones que cubren una region inferior a 1.000 pb aparecenan como manchas intensas debido a la resolucion optica, mientras que los parches espaciados mas de dicha resolucion se podnan distinguir como manchas mas pequenas separadas. Por lo tanto, para realizar la deteccion de la UDS, se requiere un protocolo que no produzca ruido de fondo irregular: se excluyen los metodos de inmunoqmmica, porque se sabe que los anticuerpos producen ruido de fondo en forma de manchas. Por otra parte, una secuencia de 30 pb debe contener un promedio de 6-10 timidinas. Esto significa que solo unos cuantos nucleotidos marcados se incorporaran durante la reparacion, incluso en las mejores condiciones. A continuacion, la

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deteccion tras la smtesis debe convertir los nucleotidos marcados en fluorescencia con la mayor eficacia. Estos elementos orientaron a los presentes inventores al desarrollo de un metodo de deteccion qmmica. Se adapto una nueva deteccion fluorescente posterior a la smtesis basada en la qmmica clic: las uridinas marcadas con alquino (EdU) incorporadas al ADN por las celulas se convierten en nucleotidos fluorescentes en el ADN rastreado por una reaccion qmmica espedfica con fluoroforos marcados con azida (Salic y Mitchison, 2008).

Procedimientos experimentales

Cultivo de fibroblastos humanos normales

Los experimentos se realizaron usando fibroblastos de piel humana normales GM08402 y HS 707(B), y fibroblastos de piel de donantes XP-C humanos XP17BE (todos del banco de celulas ATCC). Se descongelaron rapidamente celulas de las reservas criogenizadas, se sembraron a una densidad de 104 celulas/cm2 y se cultivaron hasta la confluencia en placas de Petri convencionales a 37 °C, CO2 al 5 %. El medio de crecimiento usado fue MEM (medio Eagle modificado, Invitrogen) con FBS al 15 % v/v (Invitrogen), glutamina al 2 % v/v (Gibco, Invitrogen) y NEAA al 2 % v/v (Gibco, Invitrogen). Se mantuvieron las celulas GM08402 hasta la confluencia durante 1 dfa y despues se incubaron durante 6 h con MEM que contema FBS al 0,5 %, para reducir aun mas la replicacion. Las celulas HS 707(B) y XP17BE se recogieron al 80 % de confluencia.

Tratamiento con luz ultravioleta y marcaje de UDS

Se expusieron las celulas en placas de Petri a la luz UV-C producida por una lampara germicida (Philips, 254 nm, 15 W, 0,8 |jW/m2), con la tapa abierta. Se fijo la dosis de exposicion en 150 y 250 J/m2 para la lmea celular GM08402, y en 10, 20 y 30 J/m2 para las lmeas de celulas HS 707(B) y XP17BE. Las dosis de radiacion se midieron con un radiometro UV-C (LT Lutron, ref. Q569239). Las muestras de control se expusieron simplemente al aire, abriendo la tapa de la placa de Petri. Tras la exposicion, se reemplazo el medio por MEM que contema 5-etinil-2'- desoxiuridina (EdU) 100 jM (Invitrogen) y FBS al 0,5 % v/v para GM08402 o FBS al 15 % v/v para el resto de lmeas celulares. Se incubaron las celulas durante 60 min a 37 °C, CO2 al 5 % para permitir la uDs y el marcaje de la replicacion residual.

Reparacion de tapones de ADN embebido a partir de celulas cultivadas

Tras el marcaje con EdU, se aclararon las celulas una vez con 1 x PBS 20 (solucion salina tamponada con fosfato, Invitrogen) a 4 °C y una vez con 1 x PBS 20 a TA. Se recogieron las celulas mediante incubacion de 3 minutos con 1 ml de solucion de tripsina-EDTA comercial (tripsina al 0,05 % en EDTA 0,53 mM, Invitrogen). Se detuvo la digestion con tripsina mediante la adicion de 9 ml de medio de crecimiento y se contaron las celulas usando 25 camaras de recuento desechables (Kova slide, CML), se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos y se volvieron a suspender en 1 x tampon de PBS/EDTA de tripsina, proporcion de 1:1 hasta concentraciones finales de 5 x 105 a 2 x 106 celulas/ml. A continuacion, se mezclo la suspension celular a fondo a una proporcion de 1:1 con una solucion al 1,2 % p/v de agarosa de bajo punto de fusion (Nusieve GTG, ref. 50081, Cambrex) preparada en 1 x PBS a 50 °C. Se vertieron 90 jl de la mezcla de celulas/agarosa en un pocillo de formacion de tapones (BioRad, ref. 170-3713) y se dejo que se enfriaran al menos 15 minutos a 4 °C. La lisis de las celulas en los bloques se realizo como se ha descrito previamente (Schurra y Bensimon, 2009). En resumen, los tapones de agarosa se incubaron durante la noche a 50 °C en 250 jl de una solucion de eDtA 0,5 M (pH 8), Sarkosyl al 1 %, 250 jg/ml de proteinasa K (Eurobio, codigo: GEXPRK01, Francia), despues se lavaron tres veces en una solucion de Tris 10 mM y EDTA 1 mM durante 30 min a temperatura ambiente.

Extraccion final del ADN y rastreo molecular

Se trataron tapones de ADN embebido de fibroblastos humanos para el rastreo del ADN como se ha descrito anteriormente (Schurra y Bensimon, 2009). En resumen, se fundieron los tapones a 68 °C en una solucion de MES 0,5 M (pH 5,5) durante 20 min, y se anadieron 1,5 unidades de beta-agarasa (New England Bio Labs, ref. M0392S, MA, EE.UU.) y se dejaron incubar durante un maximo de 16 horas a 42 °C. A continuacion, se vertio la solucion de ADN en un deposito de teflon y se realizo el rastreo molecular usando el sistema de rastreo molecular (Genomic Vision S.A., Pans, Francia) y Combicoverslips (20 mm x 20 mm, Genomic Vision S.A., Pans, Francia). Las superficies rastreadas se curaron durante 4 horas a 60 °C.

Deteccion de USD y senal de replicacion

Se realizo la deteccion de nucleotidos marcados con alquino mediante la reaccion de cicloadicion de Huisgen catalizada por Cu (I) (clic) como se ha descrito previamente (Salic y Mitchison, 2008). En resumen, se preparo una mezcla de reaccion de tampon de Tris 100 mM, pH 8,5, CuSO4 0,5 mM (Sigma), azida Alexa Fluor® 594 1 jM (Invitrogen) y L-ascorbato de sodio 50 mM (Sigma) (anadido el ultimo a la mezcla de una solucion 0,5 M) y se mezclo con Block-Aid (Invitrogen, ref. B-10710) en una proporcion de 1:1. Se vertieron 20 jl de mezcla de reaccion sobre portaobjetos de vidrio limpios y se cubrieron con una superficie de rastreo. Se incubaron los portaobjetos durante 30 min a TA protegidos de la luz, luego se aclararon durante 1 min en agua desionizada con agitacion a 500

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rpm. Se realizo una segunda incubacion con una mezcla de reaccion recien preparada durante otros 30 min. Las superficies se aclararon dos veces en Tris 10 mM/EDTA 1 mM durante 5 minutos y una vez en agua desionizada durante 1 minuto, ambas veces con agitacion a 500 rpm. El agua residual se seco con aire comprimido.

Analisis de las senales fluorescentes

Para la visualizacion directa de la UDS y las senales de replicacion en el ADN rastreado, se montaron cubreobjetos con 20 |jl de mezcla de agente de bloqueo basado en protemas (por ejemplo Block-Aid de Invitrogen) y yoduro YOYO-1 (Molecular Probes, codigo Y3601) (10000:1 v/v) para la tincion de contraste de todas las moleculas estiradas. La generacion de imagenes se realizo con un microscopio de epifluorescencia invertido automatico, dotado de un objetivo de 40 aumentos (ImageXpress Micro, Molecular Devices, EE.UU.). Se midio la longitud de las fibras de ADN tenidas con YOYO-1 y de las senales lineales de EdU, y se convirtieron en kb, usando un factor de ampliacion de 2 kb/jm (Schurra y Bensimon, 2009), con un software interno GVlab v0.4.6 (Genomic Vision S. A., Paris, Francia).

Resultados

Extraccion del ADN de fibroblastos humanos expuestos a radiacion UV

El rastreo molecular se ha realizado con exito con solucion de ADN de celulas aisladas, incluyendo celulas cultivadas (es decir, las cepas celulares establecidas, celulas primarias inmortalizadas) o fluidos biologicos (es decir, linfocitos de sangre periferica, celulas amnioticas) (Gad, Klinger et al., 2002; Caburet, Conti et al., 2005). Durante la preparacion de muestras convencionales, muchas moleculas de ADN se cortaron en ubicaciones aleatorias debido a las fuerzas de manipulacion no controladas producto de una alta variabilidad en el tamano del ADN preparado. Se ha demostrado que el peso molecular del ADN rastreado se puede aumentar embebiendo cromatina y desproteneizandola en un tapon de agarosa (Lebofsky y Bensimon, 2003). Con este protocolo, las moleculas de ADN analizadas son de longitud variable, pero la longitud media es de aproximadamente 200 kb, alcanzando las moleculas mas largas varias megabases. La distribucion de la longitud de las moleculas tambien se ve afectada por la calidad del ADN: cuando las celulas se exponen a la radiacion UV, se generan RUC, debilitando la resistencia mecanica de las moleculas y aumentando la frecuencia de rotura de las moleculas. Dado que nunca se ha realizado el rastreo molecular sobre los fibroblastos expuestos a UV, se analizo el efecto de la radiacion UV en la distribucion de la longitud del ADN. Los resultados se representan en la Figura 1: el dano inducido por la exposicion UV crea "sitios fragiles" de una manera dependiente de la dosis. Las curvas muestran claramente el efecto de la radiacion sobre la resistencia mecanica del ADN: cuando aumenta la dosis de radiacion UV (de 150 a 250 J/m2), se va reduciendo progresivamente la longitud de las moleculas de ADN rastreado.

Deteccion qumica de las senales en el ADN rastreado

La deteccion qmmica y, en particular, la cicloadicion de Huisgen de alquinos y azidas (qmmica clic), se ha anadido recientemente al repertorio de metodos de marcaje del ADN, mostrando una excepcional eficacia de deteccion en comparacion con las tecnicas inmunoqmmicas (Gierlich, Burley et al., 2006). La principal ventaja de la reaccion clic es su bio-ortogonalidad, porque los grupos reactivos implicados, en general, estan ausentes en los materiales biologicos. Hasta la fecha, no se ha informado de la deteccion qmmica de nucleotidos funcionalizados en ADN estirado y, mas en general, en ADN inmovilizado en sustrato. El metodo se ha empleado con exito para estudiar la replicacion del ADN (Salic y Mitchison, 2008) y la UDS (Limsirichaikul, Niimi et al., 2009) en muestras celulares fijas y tejidos. Sin embargo, las condiciones de reaccion optimizadas para dichos tipos de muestras no son apropiadas en el caso del material biologico inmovilizado sobre un sustrato inorganico, donde se reduce la ortogonalidad de reaccion. Los presentes inventores han ensayado diferentes parametros, incluyendo la concentracion de colorante y las incubaciones repetidas para aumentar la eficacia de conversion final de EdU en (Alexa Fluor ®) dU y reducir el ruido de fondo y de las senales irregulares al mmimo. Un ejemplo de los resultados de la mejor combinacion de los parametros se muestra en la Figura 2: la senal de replicacion del ADN rastreado se detecta posteriormente con anticuerpos anti-BrdU (verde) y la deteccion qmmica (rojo). La deteccion qmmica no requiere la desnaturalizacion del ADN, y produce una senal continua, mientras que se observa la deteccion fragmentada con los anticuerpos. Por otra parte, las manchas de ruido se observan en verde, debido a la adsorcion inespedfica de los anticuerpos, pero no hay manchas rojas presentes: el nivel de fondo de color rojo es bastante intenso, pero uniforme, lo que permite la deteccion fiable de pequenos eventos en las moleculas como UDS.

Visualizacion de la UDS y estimacion de NERCA a altas dosis de UV

La UDS suele detectarse en muestras celulares fijas mediante la medicion de la intensidad de la fluorescencia nuclear de celulas que no se dividen seleccionadas. Las mediciones se realizan comparando el nivel global de la intensidad de la fluorescencia de los nucleos de la muestra con una muestra de referencia. La visualizacion de la actividad de NER distinguida en el nucleo de fibroblastos quiescentes fijos ha sido informada por un solo grupo, que demostro por primera vez la deteccion directa de la uDs agrupada y su posicionamiento global en el nucleo (Svetlova, Solovjeva et al., 2002). En contraste con los ensayos de inmunoqmmica, que tienen una resolucion reducida, con las metodologfas de una sola molecula como el rastreo molecular, es posible detectar parches de

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NER, o estimar el numero o la distancia de las reparaciones presentes en una agrupacion.

Los resultados obtenidos se analizaron primero mediante la exposicion de fibroblastos quiescentes GM08402 a dosis de radiacion UV altas (> 50 J/m2). Se observaron dos tipos de senales en las moleculas rastreadas tenidas con YOYO-1: senales irregulares y lineales (Figura 3). Se analizo el mismo numero de imagenes por muestra. A partir de las mediciones de la longitud de las moleculas, se dedujo la cantidad total de material genetico (en Mpb) presente en las regiones analizadas de los portaobjetos. Este parametro es necesario para estimar la capacidad de reparacion por escision de los nucleotidos (NERCA) a partir de la deteccion de senales de UDS. La NERCA se puede expresar como la proporcion del numero de senales de UDS detectadas en una region R con respecto a la cantidad total de material genetico estirado en la region R, que representa un valor normalizado. Cuando las regiones analizadas son suficientemente grandes (varios genomas analizados), se pueden comparar los valores de NERCA obtenidos de diferentes portaobjetos y condiciones para extrapolar diferencias significativas. Los analisis de las imagenes de GM08402 se resumen en la Tabla 2. En las muestras de control (no expuestas a la luz UV), se observaron 150 senales lineales y 6 senales irregulares; en la muestra expuesta a 150 J/m2 de radiacion UV, 55 senales irregulares y 13 senales lineales; en las muestras expuestas a 250 J/m2 de radiacion UV, 149 senales irregulares y 37 senales lineales. Las senales lineales se atribuyeron a la replicacion del ADN (la quiescencia de 6 h no basto para la replicacion silenciosa por completo). La proporcion de las senales irregulares/lineales indica que cuando se realiza la exposicion a la radiacion UV, aparecen senales mucho mas irregulares. La mayor parte de estas senales irregulares corresponde entonces a la UDS realizada por el sistema de NER. El analisis de varios miles de Mpb de ADN indico que el numero de sitios de UDS aumenta exponencialmente con la dosis aplicada de UV-C (Figura 4, A), segun lo confirma la reduccion lineal de su distancia media en las moleculas de ADN rastreadas (Figura 4, B). Para la muestra celular de GM08402 y el nivel de exposicion genotoxica estudiado, la capacidad de NER (NERCA) parece ser constante hasta la dosis de UV-C ensayada. Si la NERCA se vana, se ha de observar una desviacion del perfil lineal de la distancia de la UDS.

Tabla 2: Frecuencia de las senales observadas en el ADN rastreado extrafdo de fibroblastos humanos normales

GM08402 parcialmente quiescentes expuestos a diferentes dosis de luz UV-C. El numero de senales irregulares, asociadas a la UDS, aumenta con la dosis de UV-C, como lo demuestra la reduccion lineal de su distancia media en

las moleculas de ADN rastreadas.

Dosis de UV-C a 254 nm (J/m2)

Numero de senales irregulares Numero de senales lineales ADN analizado (Mpb) Distancia media de los eventos (Mpb)

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6 150 987 164,5

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55 13 4.094 74,4

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149 37 2.785 18,7

Visualizacion de la UDS y estimacion de la NERCA a dosis fisiologicas de radiacion UV

A continuacion, se compararon los resultados obtenidos mediante la exposicion de HS 707(B) competente en la reparacion, normal, y de fibroblastos XP17BE deficientes en la reparacion a dosis crecientes de UV-C en el intervalo considerado fisiologicamente relevante. Se preparo y se analizo un total de 8 muestras celulares para proporcionar una ba2se de comparacion p2ara la capacidad de2 reparacion a las 4 dosis diferentes de UV-C: ninguna exp°sicion UV, (0 J/m ), y dosis de 10 J/m , 20 J/m y 30 J/m de radiacion UV. La exactitud de los resultados estuvo garantizada por la planificacion experimental, y los datos se acumularon hasta que se contabilizaron al menos 30 senales de UDS para cada condicion, a excepcion de la muestra de 10 J/m2 XP-C. El tamano y la intensidad de las manchas de UDS fluorescentes observadas no es constante: algunas senales muestran mayor difusion y mayor intensidad. De hecho, el metodo de la invencion tiene el potencial de diferenciar el parametro "numero de parches de reparacion" del parametro "tamano de los parches". Por lo tanto, primero se procedio con la cuantificacion de la frecuencia de los eventos por cada condicion y despues se volvieron a analizar los resultados para investigar la intensidad de la fluorescencia de las senales de UDS.

El analisis de la frecuencia de las reparaciones para las 8 condiciones estudiadas se resume en la Tabla 3 y se representa en la Figura 5. Se empleo la proporcion del “numero de senales de UDS” con respecto a la “cantidad de aDn analizada” como estimador de la probabilidad de observacion de un evento de UDS. La distribucion de Poisson es una aproximacion conveniente para modelizar la probabilidad de los eventos de UDS. El parametro A que caracteriza la distribucion es el numero de observaciones del evento, es decir, el numero de senales de UDS detectadas. Los lfmites de confianza de Poisson se proporcionan en la tabla y se ilustran en el grafico de la Figura 5 en forma de barras de error.

La evolucion de la probabilidad P (UDS) con dosis de UV creciente muestra claramente la capacidad de reparacion deficiente de la muestra de celulas XP-C. A la dosis de 0, se observo practicamente la misma frecuencia basal de senales de UDS en ambas muestras. Tras la exposicion a la radiacion UV, se detecto un numero significativo de

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senales de UDS para los fibroblastos normales (HS 707(B)), mientras que solo se observo un ligero aumento de la smtesis de reparacion para la muestra de XP-C (XP17BE). Es importante senalar que la tendencia de P(UDS) de la Fig. 5 cambia tras 20 J/m2 para la muestra competente en la reparacion. La frecuencia de eventos tiende a una meseta. Este hallazgo coincide con las observaciones anteriores realizadas con tecnicas tanto directas como indirectas. Tras una dosis de UV cntica de 20 J/m2, el sistema de NER se satura y la smtesis de reparacion tiene lugar a un rendimiento constante (Ahmed y Setlow, 1977).

La capacidad de reparacion esperada de la lmea celular XP-C esta comprendida entre el 30 y el 60 % del control, de acuerdo con las mediciones de la UDS llevadas a cabo por el proveedor de las celulas. Al calcular la proporcion directa de P(UDS) de las celulas XP-C con respecto a la P(UDS) de las celulas normales, se encontro una capacidad de reparacion de XP-C residual de ~57 % para la condicion de 20 J/m2 y del ~64 % para la condicion de 30 J/m2. Los valores encontrados tambien coinciden el intervalo designado por el proveedor de las celulas y confirma aun mas la fiabilidad del metodo de la invencion.

La observacion directa de las smtesis de reparacion en las moleculas de ADN individuales permite trazar una imagen mucho mas informativa de la actividad de reparacion. Como se ha mencionado, las manchas de UDS vanan de tamano e intensidad de fluorescencia. Por lo tanto, se procedio al analisis del "contenido de fluorescencia" de las senales, que constituye un mdice de la cantidad de smtesis de reparacion realizada en cada sitio. Se empleo un metodo sencillo para cuantificar de manera aproximada, pero equitativamente, las variaciones de la fluorescencia relativa de las manchas que pertenecen a un mismo sustrato. Se cuantificaron las intensidades de los pfxeles y, a continuacion, se aplico una normalizacion interna para todas las senales dentro de un sustrato. Se obtuvieron 8 grupos de datos de "contenido de fluorescencia” (uno por muestra) que se representan en forma de histogramas en la Figura 6.

Tabla 3: Estimacion de la probabilidad P (UDS) de observacion de un evento de UDS sobre el ADN rastreado extrafdo de fibroblastos humanos normales HS 707 (B) y fibroblastos XP17BE deficientes en NER expuestos a 4 dosis de luz UV-C. La ocurrencia de un evento de UDS se modelizo como una variable de Poisson.

Dosis de UV (J/m2)

Lmea celular ADN analizado (N Mpb) Eventos de UDS (A) P (UDS) (p) Intervalo de confianza P(UDS)

0

Fibroblastos normales 9.503,43 36 0,00379 0,00290 0,00488

Fibroblastos XP-C

15.962,53 63 0,00395 0,00322 0,00480

10

Fibroblastos normales 21.555,36 131 0,00608 0,00527 0,00698

Fibroblastos XP-C

4.464,32 18 0,00403 0,00270 0,00558

20

Fibroblastos normales 7.166,16 56 0,00781 0,00624 0,00953

Fibroblastos XP-C

17.170,24 79 0,00460 0,00381 0,00545

30

Fibroblastos normales 11.639,94 96 0,00825 0,00695 0,00963

Fibroblastos XP-C 18.672,59 100 0,00536 0,00453 0,00624

De los histogramas, se desprende una tendencia clara: la distribucion de las intensidades normalizadas cambia a valores mas altos al aumentar la dosis de UV. En las muestras no irradiadas de control, los datos se distribuyen con buena simetna alrededor de un pico claro. Tras la exposicion a dosis crecientes de radiacion, la distribucion de los datos se desvfa progresivamente del modelo de Gauss. En particular, el pico situado en el contenido de fluorescencia relativa igual a 2 cae, ya que mas senales tienen un mayor contenido de fluorescencia. La interpretacion logica es que algunos parches de reparacion se estan ampliando en determinados sitios de la molecula de ADN. El cambio es mucho mas pronunciado para los fibroblastos normales que para las celulas XP-C, aunque hay un efecto visible para ambos tipos de celulas. Por primera vez, un ensayo ofrece una vision sobre la reorganizacion de la via NER en respuesta a dosis cnticas de danos. Como se ha informado en la tecnica anterior, se detecta la saturacion en la frecuencia de la UDS, pero la metodologfa de una sola molecula permite diferenciar dos contribuciones de la mayor parte de la smtesis de reparacion: el numero de sitios se satura, pero el tamano de algunos parches de reparacion sigue creciendo. Estos hallazgos ponen de relieve el gran valor anadido del metodo

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de la invencion para desentranar la compleja relacion que une el dano del ADN con la mutagenesis.

Un metodo variante

La deteccion y cuantificacion global de la smtesis de ADN no programada se pueden realizar de manera similar al metodo descrito en el parrafo anterior usando moleculas de ADN individuales inmovilizadas sobre un sustrato en una configuracion no estirada, por ejemplo, adsorbida en forma de espiral al azar o solo parcialmente elongada. En ausencia de estiramiento de ADN uniforme y constante, la cuantificacion de la cantidad total de ADN se basa en la medicion de la intensidad de fluorescencia del colorante de union al ADN empleado (en el ejemplo, YOYO-1). Del mismo modo, la distincion entre la smtesis de ADN de replicacion y la UDS se puede basar en el nivel de intensidad de la senal de EdU: bajo una intensidad definida, que puede ser absoluta o relativa a la intensidad del colorante de union al ADN, la senal se considera UDS y, en un segundo nivel de intensidad, la senal esta asociada a la replicacion. Nunca se ha informado con anterioridad de este tipo de deteccion en moleculas de ADN individuales inmovilizadas, y ofrece una mejora espectacular de la resolucion y de la sensibilidad con respecto a los metodos convencionales que usan celulas o cromosomas inmovilizados en sustratos.

Ejemplo 3

Eiemplo 3A: Deteccion de la lesion o la reparacion mediante un elemento detectable que se une especificamente a la diana.

2.1 Visualizacion directa de RUC y RDC

La radioterapia personalizada mantiene la promesa de que el diagnostico, la prevencion y el tratamiento del cancer se basaran en la evaluacion individual del riesgo. Aunque se han logrado avances en la radioterapia personalizada, los parametros biologicos que definen la radiosensibilidad individual siguen sin estar claros. La prediccion de la radiosensibilidad del tejido tumoral y normal ha sido objeto de una intensa investigacion, pero aun tiene que integrarse de forma habitual en la radioterapia (Torres-Roca y Stevens, 2008). Son muchos los factores predictivos descritos de la radiosensibilidad de los tumores. El numero de celulas clonogenicas, la tasa de proliferacion, la hipoxia y la radiosensibilidad intrmseca, en general, se consideran los principales parametros de control de los tumores (Hennequin, Quero et al., 2008). Actualmente, los riesgos de complicaciones para un determinado paciente irradiado solo se pueden predecir por las tasas de complicaciones observadas en poblaciones similares. Esta evaluacion no tiene en cuenta la variacion en la capacidad de reparacion del ADN del individuo. Ademas, la prediccion de la radiosensibilidad del tumor tiene una importante aplicabilidad clmica. Si se pudiera realizar dicha prediccion con exactitud, las dosis de radiacion se podnan adaptar a la radiocurabilidad de los tumores individuales. Ademas, dicho ensayo podna ser util en la determinacion de las dosis optimas y la programacion de los radiosensibilizadores biologicos y quimioterapeuticos. Varios grupos han publicado datos de modelizaciones que demuestran el valor clmico de la prediccion de la radiosensibilidad del tejido tumoral y normal (Mackay y Hendry 1999; MacKay, Niemierko et al., 1998). Estos datos indican que las probabilidades de tanto el control de los tumores como de complicaciones del tejido normal se pueden mejorar mediante la individualizacion del tratamiento de acuerdo con los resultados de ensayos predictivos.

La radioterapia destruye las celulas principalmente a traves de un dano extenso en el ADN. La radiacion ionizante lleva una gran cantidad de energfa que es capaz de inducir una gran cantidad de roturas en la cadena principal del ADN. Cuando las roturas de una sola cadena (RUC) se aproximan mas de una distancia cntica en la molecula, forman una rotura de doble cadena (RDC), que representa la lesion mas peligrosa para la celula y el efecto citotoxico asociado a la radiacion (Suzuki, Ojima et al., 2003). La radiosensibilidad intrmseca se correlaciona con la capacidad global de la celula para detectar y reparar el dano del ADN, pero mas particularmente con la capacidad de reparacion de las RDC. Ha habido numerosos intentos por extrapolar un biomarcador para la radiosensibilidad basandose en la evaluacion de la capacidad de reparacion y de la cinetica de las RDC. Se ha usado la electroforesis en gel de una sola celula (ensayo de cometa) para estudiar la cinetica de reunion de las RDC y las celulas hipoxicas radiorresistentes en los tumores solidos y en los tejidos (P. L. Olive, 2009). Ismail et al., desarrollaron un ensayo que analiza las RDC a traves de complejos de union de extremos de ADN. El ensayo demostro predecir la radiosensibilidad tanto en fibroblastos primarios como en lmeas celulares de cancer (Ismail, Puppi et al., 2004). Las tecnicas de inmunohistoqmmica recientes han permitido alcanzar una alta sensibilidad en la deteccion de las RDC (Vasireddy, Sprung et al., 2010), pero no se han adoptado en el entorno clmico habitual debido a su complejidad experimental. Los perfiles de expresion genica basados en micromatrices ha contribuido de manera importante a comprender la relacion entre la radiosensibilidad intrmseca y el resultado clmico, permitiendo diferenciar entre pacientes con un riesgo alto y bajo de fibrosis inducida por la radiacion (Fernet y Hall, 2008). Sin embargo, la preparacion tecnica para las mediciones de la expresion genica hace que sea poco probable que este ultimo ensayo se introduzca pronto en un entorno clmico habitual.

A pesar de mas de una decada de esfuerzos de investigacion en la oncologfa de radiacion predictiva, ninguno de estos ensayos ha cumplido con los requisitos de aplicabilidad clmica. Los fragmentos cromosomicos generados por las RDC llevan informacion significativa con respecto a la frecuencia de las roturas de las cadenas, la ubicacion ffsica y espacial de estos eventos, y la relacion con el nivel de exposicion a la radiacion. Sin embargo, son eventos

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raros (60-200 eventos por genoma a dosis convencionales de radiacion ionizante), y existe la necesidad de una tecnica sensible que proporcione un analisis preciso de la cantidad y de la distribucion.

Los inventores han encontrado el empleo con exito de una metodolog^a de marcaje para detectar y cuantificar directamente las roturas de la cadena principal de las moleculas de ADN estiradas. Cada extremo libre de una cadena rota (RUC o RDC) deja al descubierto una extremidad 3' y 5'. Los inventores llegaron a la conclusion de que, si todos los extremos 3' libres se etiquetaban justo tras la exposicion de las celulas a un agente genotoxico, sena posible visualizarlos directamente en las moleculas de aDn individuales y cuantificarlos con precision. Los inventores esperaban detectar RUC como manchas fluorescentes en la mitad de una molecula rastreada y RDC en la extremidad. Para marcar los extremos 3' libres, se uso una potente enzima denominada desoxinucleotido transferasa terminal (TdT), que es capaz de alargar los extremos libres 3'-OH con varios cientos de nucleotidos y sin ADN de molde. Esta metodologfa se ensayo en el ADN del fago lambda para comprobar si se podfan detectar los oligos marcados polimerizados por TdT en las muescas y en las extremidades.

Procedimientos experimentales

Reparacion de la solucion de ADN del fago lambda y rastreo molecular

Se preparo la mezcla de reaccion de marcaje de las colas (50 jl) mezclando EdUTP 1 mM (Invitrogen), ADN de fago Lambda 10 pM (Sigma) y 15 U de la enzima TdT (Invitrogen) en 1 x tampon de reaccion de TdT (Invitrogen), y se incubo a 37 °C durante 3 h. La reaccion se detuvo mediante la adicion de EDTA 0,1 M a la mezcla. Se preparo la solucion de rastreo de ADN diluyendo la mezcla en 2 ml de tampon MES 0,5 M (pH 5,5). Se vertio la solucion en un recipiente de teflon y se realizo el rastreo molecular usando el sistema de rastreo molecular (Genomic Vision S. A., Paris, Francia) y portaobjetos Combicoverslips (20 mm x 20 mm, Genomic Vision S. A., Paris, Francia). Las superficies rastreadas se curaron durante 4 horas a 60 °C.

Deteccion de colas de EdU

La deteccion de las colas marcadas con alquino se realizo mediante la reaccion de cicloadicion de Huisgen catalizada por Cu (I) (clic) como se ha descrito previamente (Salic y Mitchison, 2008). En resumen, se preparo una mezcla de reaccion de tampon de Tris 100 mM, pH 8,5, CuSO4 0,5 mM (Sigma), azida Alexa Fluor® 594 1 jM (Invitrogen) y L-ascorbato de sodio 50 mM (Sigma) (anadido el ultimo a la mezcla de una solucion 0,5 M) y se mezclo con Block-Aid (Invitrogen, ref. B-10710) en una proporcion de 1:1. Se vertieron 20 jl de mezcla de reaccion sobre portaobjetos de vidrio limpios y se cubrieron con una superficie de rastreo. Se incubaron los portaobjetos durante 30 min a TA protegidos de la luz, luego se aclararon durante 1 min en agua desionizada con agitacion a 500 rpm. Se realizo una segunda incubacion con una mezcla de reaccion recien preparada durante otros 30 min. Las superficies se aclararon dos veces en Tris 10 mM/EDTA 1 mM durante 5 minutos y una vez en agua desionizada durante 1 minuto, ambas veces con agitacion a 500 rpm. El agua residual se seco con aire comprimido.

Analisis de las senales fluorescentes

Para la visualizacion directa del ADN rastreado, se montaron cubreobjetos con 20 jl de una mezcla de Block-Aid (Invitrogen, ref. B-10710) y yoduro YOYO-1 (Molecular Probes, codigo Y3601) (10.000:1 v/v) para la tincion de contraste de todas las moleculas estiradas. La generacion de imagenes se realizo con un microscopio de epifluorescencia invertido automatico, dotado de un objetivo de 40 aumentos (ImageXpress Micro, Molecular Devices, EE.UU.).

Resultados

Los resultados de la prueba de concepto sobre el ADN de lambda muestran que el marcaje de extremos tiene una eficacia superior al 60 % y que, como se esperaba, hay muescas (RUC) visibles en la mitad de las moleculas rastreadas (Figura 7).

A partir de la duracion de la reaccion de marcaje de las colas y la cantidad de EdUTP presente en la mezcla, se calculo que la longitud de las colas estaba comprendida entre 150 y 200 nucleotidos, siendo suficiente para detectar una senal de color rojo intenso en el ADN marcado con YOYO-1.

La eficacia del marcaje de los extremos se ha calculado como la proporcion de las extremidades marcadas con respecto a las no marcadas de una muestra constituida por 2.000 moleculas de ADN de lambda estiradas. La eficacia de la prueba de concepto ya supera el 60 % y, sin duda, se puede aumentar con una simple optimizacion.

Debido a su naturaleza directa y de alto rendimiento, este metodo permite la cuantificacion precisa de la fragmentacion del ADN cromosomico, y se puede aplicar a pequenas cantidades de material de partida, incluyendo sangre y biopsia de tejido, de una manera que requiere poco tiempo y rentable. En conjunto, estas caractensticas lo hacen adecuado para los requisitos de aplicabilidad clmica y hacen que sea una potente herramienta para entender los parametros biologicos que influyen en la radiosensibilidad individual. Por otra parte, el metodo de la invencion

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tiene un gran potencial para los estudios de biomonitorizacion en general, mas alia de la cuantificacion de las RUC y RDC: usando la hibridacion del ADN en las moleculas rastreadas, es posible acoplar en un solo ensayo la localizacion cromosomica del dano en el ADN y la deteccion de aberraciones cromosomicas.

Un metodo variante

La deteccion y cuantificacion global de las RUC/RDC se pueden realizar de manera similar al metodo descrito en el parrafo anterior usando moleculas de ADN individuales inmovilizadas sobre un sustrato en una configuracion no estirada, por ejemplo, adsorbida en forma de espiral al azar o solo parcialmente elongada. En ausencia de estiramiento de ADN uniforme y constante, la cuantificacion de la cantidad total de ADN se basa en la medicion de la intensidad de fluorescencia del colorante de union al ADN empleado (en el ejemplo, YOYO-1). Del mismo modo, la cantidad de roturas (RUC y RDC) se puede obtener a partir de la cuantificacion de la intensidad de la senal de EdU, de una forma relativa con respecto a una referencia interna o de una manera mas absoluta teniendo en cuenta la longitud media de la cola, la eficacia del marcaje de los extremos y la eficacia de conversion de EdU en fluorescencia.

Ejemplo 3B: 2.2 Visualizacion y localizacion directas de danos mediante reaccion quimica.

Deteccion y localizacion de sitios abasicos (sitios AP) con sondas reactivas con aldefndo en un gen seleccionado hibridado en el ADN estirado

Procedimientos experimentales

Cultivo de la lmea celular

El metodo de cultivo usado es similar a los metodos descritos anteriormente para los fibroblastos normales humanos en el caso de las celulas adherentes y para los linfoblastos humanos normales en el caso de las celulas en suspension.

Tratamiento con ARP (sondas reactivas con aldeh^do)

Para el marcaje con ARP in vivo, se incubaron las celulas durante 60 min con las sondas reactivas con aldefndo (Cayman Chemical) marcadas con biotina o un fluorocromo a 37 °C, CO2 al 5 % para permitir que las sondas reaccionaran con la forma de anillo abierto de los sitios AP para generar un sitio AP marcado con biotina o marcado fluorescentemente.

Preparacion de tapones de ADN embebido a partir de celulas cultivadas

Tras el marcaje con ARP, se aclararon las celulas una vez con 1 x PBS 20 (solucion salina tamponada con fosfato, Invitrogen) a 4 °C y una vez con 1 x PBS 20 a TA. Se recogieron las celulas mediante incubacion de 3 minutos con 1 ml de solucion de tripsina-EDTA comercial (tripsina al 0,05 % en EDTA 0,53 mM, Invitrogen). Se detuvo la digestion con tripsina mediante la adicion de 9 ml de medio de crecimiento y se contaron las celulas usando 25 camaras de recuento desechables (Kova slide, CML), se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos y se volvieron a suspender en 1 x tampon de PBS/EDTA de tripsina, proporcion de 1:1 hasta concentraciones finales de 5 x 105 a 2 x 106 celulas/ml. A continuacion, se mezclo la suspension celular a fondo a una proporcion de 1:1 con una solucion al 1,2 % p/v de agarosa de bajo punto de fusion (Nusieve GTG, ref. 50081, Cambrex) preparada en 1 x PBS a 50 °C. Se vertieron 90 pl de la mezcla de celulas/agarosa en un pocillo de formacion de tapones (BioRad, ref. 170-3713) y se dejo que se enfriaran al menos 15 minutos a 4 °C. La lisis de las celulas en los bloques se realizo como se ha descrito previamente (Schurra y Bensimon, 2009). En resumen, los tapones de agarosa se incubaron durante la noche a 50 °C en 250 pl de una solucion de eDtA 0,5 M (pH 8), Sarkosyl al 1 %, 250 pg/ml de proteinasa K (Eurobio, codigo: GEXPRK01, Francia), despues se lavaron tres veces en una solucion de Tris 10 mM y EDTA 1 mM durante 30 min a temperatura ambiente.

Extraccion final del ADN y rastreo molecular

Se trataron tapones de ADN embebido de fibroblastos humanos para el rastreo del ADN como se ha descrito anteriormente (Schurra y Bensimon, 2009). En resumen, se fundieron los tapones a 68 °C en una solucion de MES 0,5 M (pH 5,5) durante 20 min, y se anadieron 1,5 unidades de beta-agarasa (New England Bio Labs, ref. M0392S, MA, EE.UU.) y se dejaron incubar durante un maximo de 16 horas a 42 °C. A continuacion, se vertio la solucion de ADN en un deposito de teflon y se realizo el rastreo molecular usando el sistema de rastreo molecular (Genomic Vision S.A., Pans, Francia) y Combicoverslips (20 mm x 20 mm, Genomic Vision S.A., Pans, Francia). Las superficies rastreadas se curaron durante 4 horas a 60 °C.

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Sntesis y marcaje de las sondas para localizar el gen seleccionado en el ADN estirado

En este ejemplo, el tamano de las sondas vana de 100 a 3.000 pb. Las sondas espedficas para el gen seleccionado se produjeron mediante PCR de largo alcance usando ADN polimerasa LR Taq (Roche) usando los cebadores apropiados y el ADN humano comercial como ADN de molde. Se ligaron los productos de PCR en el vector pCR®2.1 usando el kit de clonacion TOPO® TA (Invitrogen, Francia, codigo K455040). Las dos extremidades de cada sonda se secuenciaron para realizar la verificacion. Las sondas aparentes de 4 tamanos diferentes en este ejemplo son mezclas de varias sondas adyacentes o superpuestas. El marcaje de las sondas se realizo con 11- digoxigenina-dUTP usando protocolos de cebado al azar convencionales. Los productos de reaccion se visualizaron en un gel de agarosa para verificar la smtesis del ADN.

Tratamiento con ARP (sondas reactivas con aldeh^do)

La reaccion con ARP se puede realizar durante el cultivo celular antes de la extraccion del ADN o tras el estiramiento del ADN en el portaobjetos rastreado. Los portaobjetos de ADN rastreados se incubaron durante 30 min con las sondas reactivas con aldeddo (Cayman Chemical) marcadas con biotina o un fluorocromo a 37 °C, para permitir que las sondas reaccionaran con la forma de anillo abierto de los sitios AP para generar un sitio AP marcado con biotina o marcado fluorescentemente.

Hibridacion de sondas para localizar el gen seleccionado

Las etapas posteriores tambien se realizaron esencialmente como se ha descrito anteriormente en Schurra y Bensimon, 2009 (Schurra y Bensimon, 2009). En resumen, se precipito una mezcla de sondas marcadas (250 ng de cada sonda) en etanol junto con 10 |jg de ADN de esperma de arenque y 2,5 |jg de ADN de Cot-1 humano (Invitrogen, ref. 15279-011, CA, EE.uU.), se volvio a suspender en 20 jl de tampon de hibridacion (formamida al 50%, 2 x SSC, SDS al 0,5%, Sarkosyl al 0,5%, NaCl 10 mM, Block-Aid al 30% (Invitrogen, ref. B-10710, CA, EE.UU.). Se desnaturalizaron por calor la solucion de la sonda y el ADN extendido conjuntamente en el hibridizador (Dako, ref. S2451) a 90 °C durante 5 min, y se dejo que la hibridacion tuviera lugar en el hibridizador durante la noche a 37 °C. Se lavaron los portaobjetos 3 veces en formamida al 50 %, 2 x SSC y 3 veces en soluciones de 2x SSC, durante 5 min a temperatura ambiente.

Deteccion de sitios AP marcados y sondas hibridadas

Los sitios AP tratados con las ARP marcadas fluorescentemente se pudieron visualizar directamente con un microscopio de epifluorescencia. Los sitios AP marcados con biotina se detectaron usando estreptavidina marcada fluorescentemente (Invitrogen). A continuacion, se aclararon las superficies dos veces en Tris 10 mM/EDTA 1 mM durante 5 minutos y una vez en agua desionizada durante 1 minuto, ambas veces con agitacion a 500 rpm. El agua residual se seco con aire comprimido. La deteccion de las sondas se realizo usando capas de anticuerpos. Para cada capa, se anadieron 20 jl de la solucion de anticuerpos al portaobjetos y se cubrieron con un cubreobjetos de rastreo, y se incubo el portaobjetos en atmosfera humeda a 37 °C durante 20 min. Se lavaron los portaobjetos 3 veces en 2 x solucion de SSC y Tween 20 al 1 % durante 3 minutos a temperatura ambiente entre cada capa y tras la ultima capa. La deteccion se llevo a cabo en este ejemplo usando un anticuerpo anti-digoxigenina de raton acoplado con fluorescencia (Jackson Immunoresearch, Francia) en una dilucion 1:25. Como segunda capa, se uso un anticuerpo anti-raton de cabra acoplado con fluorescencia (Invitrogen, Francia) diluido a 1:25. Tras las ultimas etapas de lavado, se deshidrataron todos los cubreobjetos de vidrio en etanol y se secaron al aire.

Analisis de senales fluorescentes

Para la visualizacion directa del ADN estirado, se montaron cubreobjetos con 20 jl de una mezcla de Block-Aid (Invitrogen, ref. B-10710) y yoduro YOYO-1 (Molecular Probes, codigo Y3601) (10.000:1 v/v) para la tincion de contraste de todas las moleculas estiradas. La generacion de imagenes se realizo con un microscopio de epifluorescencia invertido automatico, dotado de un objetivo de 40 aumentos (ImageXpress Micro, Molecular Devices, EE.UU.). Se midio la longitud de las fibras de ADN tenidas con YOYO-1 y la longitud de las senales lineales de las sondas hibridadas y de las distancias entre los sitios AP, y se convirtieron en kb, usando un factor de extension de 2 kb/jm (Schurra y Bensimon, 2009), con un software interno GVlab v0.4.6 (Genomic Vision S. A., Paris, Francia).

Ejemplo 3C: 2.3 Visualizacion y cuantificacion directas de los danos por inmunofluorescencia.

Posibles anticuerpos: anti-dfmeros de pirimidina de ciclobutano (CPDS), anti-productos fotoqmmicos (6-4) (6-4 PP), anti productos fotoqmmicos Dewar (Dewar PP), anti-8-OH-dG, 8-oxo-G y productos de oxidacion similares, anti- aductos de ADN de BPDE (benzo(a)pireno Diol-epoxido) y cualquier anticuerpo futuro que se una espedficamente a alteraciones de la molecula de ADN.

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Procedimientos experimentales Cultivo de la tfnea celular

El metodo de cultivo usado es similar a los metodos descritos anteriormente para los fibroblastos normales humanos en el caso de las celulas adherentes y para los linfoblastos humanos normales en el caso de las celulas en suspension.

Reparacion de tapones de ADN embebido a partir de celulas cultivadas

Se aclararon las celulas una vez con 1 x PBS 20 (solucion salina tamponada con fosfato, Invitrogen) a 4 °C y una vez con 1 x PBS 20 a TA. Se recogieron las celulas mediante incubacion de 3 minutos con 1 ml de solucion de tripsina-EDTA comercial (tripsina al 0,05 % en EDTA 0,53 mM, Invitrogen). Se detuvo la digestion con tripsina mediante la adicion de 9 ml de medio de crecimiento y se contaron las celulas usando 25 camaras de recuento desechables (Kova slide, CML), se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos y se volvieron a suspender en 1 x tampon de pBs/EDTA de tripsina, proporcion de 1:1 hasta concentraciones finales de 5 x 105 a 2 x 106 celulas/ml. A continuacion, se mezclo la suspension celular a fondo a una proporcion de 1:1 con una solucion al 1,2% p/v de agarosa de bajo punto de fusion (Nusieve GTG, ref. 50081, Cambrex) preparada en 1 x PBS a 50 °C. Se vertieron 90 pl de la mezcla de celulas/agarosa en un pocillo de formacion de tapones (BioRad, ref. 170-3713) y se dejo que se enfriaran al menos 15 minutos a 4 °C. La lisis de las celulas en los bloques se realizo como se ha descrito previamente (Schurra y Bensimon, 2009). En resumen, los tapones de agarosa se incubaron durante la noche a 50 °C en 250 pl de una solucion de EDTA 0,5 M (pH 8), Sarkosyl al 1 %, 250 pg/ml de proteinasa K (Eurobio, codigo: GEXPRK01, Francia), despues se lavaron tres veces en una solucion de Tris 10 mM y EDTA 1 mM durante 30 min a temperatura ambiente.

Extraccion final de ADN y rastreo molecular

Se trataron tapones de ADN embebido de fibroblastos humanos para el rastreo del ADN como se ha descrito anteriormente (Schurra y Bensimon, 2009). En resumen, se fundieron los tapones a 68 °C en una solucion de MES 0,5 M (pH 5,5) durante 20 min, y se anadieron 1,5 unidades de beta-agarasa (New England Bio Labs, ref. M0392S, MA, EE.UU.) y se dejaron incubar durante un maximo de 16 horas a 42 °C. A continuacion, se vertio la solucion de ADN en un deposito de teflon y se realizo el rastreo molecular usando el sistema de rastreo molecular (Genomic Vision S.A., Pans, Francia) y Combicoverslips (20 mm x 20 mm, Genomic Vision S.A., Pans, Francia). Las superficies rastreadas se curaron durante 4 horas a 60 °C.

Deteccion de los productos de oxidacion 8-OH-dG y 8-oxo-G sobre el ADN estirado

La 8-hidroxi-2-desoxiguanosina (8-OH-dG) y la 8-oxo-guanina (8-oxo-G) son productos del dano oxidativo del ADN producido por las especies reactivas de oxfgeno y nitrogeno, y sirven como marcadores establecidos del estres oxidativo. La deteccion se realizo usando capas de anticuerpos. Para cada capa, se anadieron 20 pi de la solucion de anticuerpos al portaobjetos y se cubrieron con un cubreobjetos de rastreo, y se incubo el portaobjetos en atmosfera humeda a 37 °C durante 20 min. Se lavaron los portaobjetos 3 veces en 2 x solucion de SSC y Tween 20 al 1 % durante 3 minutos a temperatura ambiente entre cada capa y tras la ultima capa. La deteccion se llevo a cabo en este ejemplo usando anticuerpos monoclonales anti-8-OH-G de raton y anti-8-oxoG de raton (Abeam) en una dilucion 1:25. Como segunda capa, se uso un anticuerpo anti-raton de cabra acoplado con fluorescencia (Invitrogen, Francia) diluido a 1:25. Tras las ultimas etapas de lavado, se deshidrataron todos los cubreobjetos de vidrio en etanol y se secaron al aire.

Analisis de senales fluorescentes

Para la visualizacion directa del ADN estirado, se montaron cubreobjetos con 20 pl de una mezcla de Block-Aid (Invitrogen, ref. B-10710) y yoduro YOYO-1 (Molecular Probes, codigo Y3601) (10.000:1 v/v) para la tincion de contraste de todas las moleculas estiradas. La generacion de imagenes se realizo con un microscopio de epifluorescencia invertido automatico, dotado de un objetivo de 40 aumentos (ImageXpress Micro, Molecular Devices, EE.UU.). Se midio la longitud de las fibras de ADN tenidas con YOYO-1 y la longitud de las distancias entre los sitios de 8-OH-dG y 8-oxo-G detectados, y se convirtieron en kb, usando un factor de extension de 2 kb/pm (Schurra y Bensimon, 2009), con un software interno GVlab v0.4.6 (Genomic Vision S. A., Pans, Francia).

Un metodo variante

La deteccion y cuantificacion global del dano usando anticuerpos espedficos se pueden realizar de manera similar al metodo descrito en el parrafo anterior usando moleculas de ADN individuales inmovilizadas sobre un sustrato en una configuracion no estirada, por ejemplo, adsorbida en forma de espiral al azar o solo parcialmente elongada. En ausencia de estiramiento de ADN uniforme y constante, la cuantificacion de la cantidad total de ADN se basa en la medicion de la intensidad de fluorescencia del colorante de union al ADN empleado (en el ejemplo, YOYO-1). La

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cantidad relativa de dano se puede estimar con respecto a una referencia interna de la cuantificacion de la senal de fluorescencia asociada a los anticuerpos marcados

Ejemplo 4: Deteccion y cuantificacion indirectas de la lesion o la reparacion mediante la conversion de las dianas en extremidades moleculares

Determinacion del perfil del dano mediante desviacion del perfil inducido por la fragmentacion relativa (PD)

Se crea la construccion de un perfil de referencia de la longitud del ADN de una poblacion celular sana y se realiza la comparacion del perfil obtenido de la misma poblacion tras la exposicion a un agente genotoxico. Los perfiles de referencia de la longitud del ADN de alta resolucion se construyen mediante la medicion del tamano de miles de moleculas de ADN estiradas uniformemente en un portaobjetos de rastreo.

En el caso del dano generado a alta frecuencia a lo largo del genoma (por ejemplo las RUC, sitios abasicos, metilados, alquilados, bases oxidadas, productos fotoqmmicos), la conversion de la mayona de las lesiones diana en RDC teoricamente genera tantas extremidades de aDn nuevas como lesiones hay presentes en las moleculas. Al comparar el perfil de distribucion de la longitud de la muestra danada con el patron intacto, aparece una desviacion del perfil (PD) asociada a un dano espedfico. Entonces, a partir de la PD, se puede estimar directamente la cantidad de las lesiones generadas por el compuesto genotoxico.

La conversion de una lesion espedfica en una extremidad molecular se puede realizar a traves de tratamiento enzimatico (Collins, Dobson et al. 1997), qmmico o termico (Singh, McCoy et al. 1988). El metodo mas fiable es el uso de nucleasas espedficas de la lesion, que convierten los tipos espedficos de danos en una RUC o una RDC. Si la etapa de conversion genera RUC, se puede realizar una segunda etapa enzimatica o qmmica para generar RDC. Las enzimas comunes que se pueden emplear y sus dianas se resumen en la Tabla 3. Mediante el uso de un conjunto seleccionado de enzimas o tratamientos dirigidos a danos, el metodo de la invencion permite el estudio de mas de un tipo de lesion al mismo tiempo.

Tabla 3: Enzimas comunes empleadas para la conversion de las lesiones del ADN espedficas en RUC o RDC y las dianas respectivas. 1Formamidopirimidina-ADN glicosilasa; 28-hidroxiguanina ADN-glicosilasa humana, 3Glicosilasa de dfmero de pirimidina de T4; 4Glicosilasa de dfmero de pirimidina del virus Chlorella; 5 ADN endonucleasa

ultravioleta.

Enzima

Dano reconocido

Fpg1

8-oxoguanina, restos de formamidopirimidina que contienen ADN,

Endonucleasa III

Timinaglicol, 5,6-dihidrotimina, urea, 5-hidroxi-6-hidrotimina, 5,6-dihidrouracilo, aloxana, 5-hidroxi-6-hidrouracilo, uracilglicol, 5- hidroxi-5-metilhidantoma, 5-hidroxicitosina, 5-hidroxiuracilo,

metiltartonilurea, producto saturado o de fragmentacion de anillo de timina

hOGGl2

8-oxoguanina, restos de formamidopirimidina que contienen ADN

T4-PDG3

Isomeros cis-sin de dfmeros de pirimidina de ciclobutano

cv-PDG4

Isomeros cis-sin y trans-sin de dfmeros de pirimidina de ciclobutano

UVDE5

Dfmeros de pirimidina de ciclobutano, productos fotoqmmicos (6-4)

Los inventores han reconocido que el rastreo molecular, que permite el calibrado de alta resolucion de matrices densas de fragmentos de ADN uniformemente estirados, se aplica con exito para la cuantificacion indirecta de la mayona de las lesiones del ADN. A diferencia del rastreo molecular, los metodos de calibrado basados en SCGE (FRAME™, Trevigen, documento WO1996040902), o moleculas individuales que fluyen en microcanales (Filippova, Monteleone et al., 2003) o en nanocanales (Tegenfeldt, Prinz et al., 2004) no permiten el procesamiento posterior de las moleculas de ADN, y los estudios de hibridacion son muy diffciles de realizar. Ademas, estos metodos no proporcionan o solo proporcionan la elongacion parcial de las moleculas de ADN. Por consiguiente, para estos metodos, la longitud de los fragmentos de ADN se ha de estimar a partir de mediciones de la intensidad de fluorescencia, lo que reduce la resolucion y la precision de la medicion en comparacion con las tecnicas de estiramiento del aDn. Nada anticipa la posibilidad de estudiar la cantidad y la distribucion del dano en el ADN por la media del estiramiento del acido nucleico. Ademas, nada sugiere la aplicacion de la hibridacion del ADN en el ADN elongado o estirado para investigar la distribucion de los danos y de las reparaciones con respecto a la secuencia del genoma o la organizacion de la cromatina.

En el siguiente ejemplo no limitante, el metodo de desviacion del perfil inducido por la fragmentacion relativa (PD) se aplica con exito para la cuantificacion del dano oxidativo inducido por la exposicion a H2O2.

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Procedimientos experimental Cultivo de la tfnea celular

El metodo de cultivo usado es similar a los metodos descritos anteriormente para los fibroblastos normales humanos en el caso de las celulas adherentes y para los linfoblastos humanos normales en el caso de las celulas en suspension.

Tratamiento con H2O2

Se incubaron las celulas durante 10 min en medio de crecimiento que contema H2O2 0 (muestra de control) 1, 5, 10 y 20 mM a 37 °C, CO2 al 5 % para inducir diferentes dosis de dano oxidativo.

Extraccion de ADN y tratamiento con Fpg

Tras el tratamiento con H2O2, se recogieron las celulas de las 5 muestras y se volvieron a suspender en 1 x PBS 20 (solucion salina tamponada con fosfato, Invitrogen) a una concentracion de 106 celulas/ml. La extraccion se realizo usando el kit de extraccion de ADN de sangre PreAnalytiX (Qiagen) con un procedimiento habitual. En resumen, se vertio 1 ml de suspension de celulas por condicion en 10 ml de tampon BG1 (del kit PreAnalytiX), seguido de centrifugacion durante 5 min a 2.500 g. Tras la eliminacion del sobrenadante, se volvio a suspender el sedimento y se aclaro mezclando durante 5 s en tampon BG2 (del kit PreAnalytiX). Se volvieron a centrifugar los tubos durante 3 minutos a 2.500 g. Se volvieron a suspender los sedimentos en 100 pl de tampon de digestion de Fpg segun las indicaciones del proveedor (New England Bio Labs) y se incubaron con 3 U de enzima Fpg (New England Bio Labs) durante 3 horas a 37 °C. Tras la digestion, se anadio 1 ml de tampon BG3 (en el kit PreAnalytiX) que contema 250 pg/ml de proteinasa K (Eurobio) a las soluciones, y se incubaron los tubos a 65 °C durante 15 min para permitir la proteolisis. Tras ello, se precipito el ADN mediante la adicion de 2-propanol a los tubos en una proporcion v/v de 1:1 e invirtiendo los tubos 20 veces. Se incubaron los tubos durante la noche a 4 °C antes de retirar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento de ADN en 100 pl de tampon de Tris 40 mM/EDTA 2 mM por un par de horas a temperatura ambiente.

Extraccion final de ADN y rastreo molecular

Antes de realizar el rastreo molecular, se anadieron 3 ml de tampon MES 0,5 M (pH 5,5) a cada muestra de ADN, y se invirtieron los tubos suavemente varias veces. A continuacion, se vertio la solucion de ADN en un deposito de teflon y se realizo el rastreo molecular usando el sistema de rastreo molecular (Genomic Vision S.A., Paris, Francia) y Combicoverslips (20 mm x 20 mm, Genomic Vision S.A., Paris, Francia). Las superficies rastreadas se curaron durante 4 horas a 60 °C.

Analisis de senales fluorescentes

Para la visualizacion directa del ADN estirado, se montaron cubreobjetos con 20 pl de una mezcla de Block-Aid (Invitrogen, ref. B-10710) y yoduro YOYO-1 (Molecular Probes, codigo Y3601) (10.000:1 v/v) para la tincion de contraste de todas las moleculas estiradas. La generacion de imagenes se realizo con un microscopio de epifluorescencia invertido automatico, dotado de un objetivo de 40 aumentos (ImageXpress Micro, Molecular Devices, EE.UU.). Se midio la longitud de las fibras de ADN tenidas con YOYO-1 con un software interno GVlab v0.4.6 (Genomic Vision S. A., Pans, Francia).

Resultados

La enzima Fpg se dirige a una subfamilia espedfica de dano oxidativo que incluye 8 oxoguanina, 5-hidroxicitosina, 5-hidroxiuracilo, guanina de anillo abierto de imidazol unida a aflatoxina, N-2-aminofluoreno-C8-guanina de anillo abierto de imidazol y las formas de anillo abierto de 7-metilguanina. La enzima escinde la lesion reconocida y deja una muesca en la cadena correspondiente del ADN. Como resultado de ello, cuando se forman dos o mas lesiones muy cerca ("agrupadas" en 15-20 bases) en cadenas opuestas, el tratamiento enzimatico genera una rotura de doble cadena y convierte el fragmento original en dos fragmentos de ADN mas cortos. Se estimo la cantidad relativa de las lesiones "agrupadas" producidas por 4 dosis incrementales de H2O2 comparando las distribuciones del tamano molecular final de las muestras de ADN tras el tratamiento con Fpg. Incluso en ausencia de exposicion a agentes oxidantes potentes como H2O2, se espera encontrar una cantidad basal de lesiones oxidativas en la molecula de ADN, pues la oxidacion de bases tiene lugar de forma continua dentro de la celula debido a la presencia de radicales libres derivados de las actividades metabolicas. Para evaluar el efecto producido por las diferentes dosis de H2O2, la muestra de control se sometio igualmente, por tanto, al tratamiento con Fpg. Las distribuciones del tamano del ADN resultantes se presentan en la Figura 8(A). Los histogramas obtenidos muestran una clara dependencia gradual del perfil de tamano del ADN en la cantidad de H2O2 usada durante la exposicion genotoxica. A altas dosis de H2O2 (10 y 20 mM), la cantidad de dano agrupado presente en las moleculas es uniforme y las cadenas estiradas parecen mucho mas cortas que en la muestra de control. Para cuantificar mejor la DP y el aumento relativo de la cantidad de dano oxidativo, se ajustaron las distribuciones usando un modelo exponencial y = Ae'x/I y las constantes de

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desintegracion t comparadas en funcion de la dosis de H2O2. Como se representa mediante el grafico de la Figura 8(6), las constantes de desintegracion parecen reducirse linealmente con respecto a la cantidad de H2O2. La muestra de control no expuesta se excluye del ajuste lineal, y tiene una constante de desintegracion de 6,1 pm. Comparando los coeficientes de los exponenciales de ajuste, es posible detectar y cuantificar relativamente cantidades muy pequenas de dano agrupado producido por dosis bajas como H2O2 1 mM. El metodo de la invencion demuestra ser, por lo tanto, mucho mas sensible con respecto a las tecnicas disponibles. Por otra parte, el metodo descrito mantiene una alta precision en un intervalo muy amplio de dosis genotoxicas, pues los histogramas se construyen a partir de decenas de miles de mediciones a nivel de una sola molecula. Para lograr la cuantificacion absoluta de los danos, es suficiente aplicar un metodo de cuantificacion directa (espectroscopia de masas, cromatograffa de lfquidos etc.) a solo una condicion y luego extrapolar el resto con respecto a los parametros de ajuste.

En el caso de eventos raros como la RDC (60-200 RDC por 2 Gy en genoma de 6.000 Mpb), el tamano de los fragmentos originales producidos por dosis bajas de radiacion (30-100 Mpb) es demasiado grande para su extraccion de forma intacta y medicion de forma fiable mediante tecnicas de calibrado. Por lo tanto, la PD original no se puede evaluar directamente. La manipulacion de moleculas de gran tamano provoca una fragmentacion complementaria no controlada (RDC de cizalla), que actua como ruido de fondo (no media de cero). Para poderse comparar los perfiles de las mediciones, se reduce la contribucion de esta fragmentacion no controlada mediante la superposicion de una controlada y reproducible, proporcionada por la accion de enzimas de restriccion seleccionadas (ER). El ADN es digerido por un conjunto de enzimas que producen fragmentos de ADN de 30 a 70 kpb de tamano. A partir de las presentes distribuciones convencionales del ADN genomico humano, los presentes inventores saben que su protocolo de extraccion produce al menos el 90 % de las moleculas superiores a 50 kpb. Los fragmentos reducidos hasta 50 kpb o menos tras la digestion con ER no se fragmentan de manera significativa durante la manipulacion. Por dar un ejemplo, si el material de partida es ADN genomico humano, se puede usar la enzima de restriccion Sma I para producir una poblacion de fragmentos en este intervalo. Como se ilustra en la Figura 9, para distinguir con exactitud las RDC de ER (RDC creadas por ER) de las Bio-RDC (RDC de deteccion, generadas en la celula por un agente genotoxico) y las RDC de cizalla (RDC generadas por cizalla durante la manipulacion), los presentes inventores asocian el marcaje de extremos espedficos de la RDC adhesiva generada por la ER. Por ejemplo, los extremos adhesivos de los fragmentos de ADN humano se pueden marcar con dATP fluorescente usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. Se anaden desoxinucleosidos trifosfato no marcados en caso de que se requiera su incorporacion. Opcionalmente, el marcador no incorporado se puede retirar por precipitacion con etanol. La combinacion de ADN de los fragmentos se estira sobre un sustrato y se descartan los fragmentos marcados en ambas extremidades de las mediciones del tamano. Las distribuciones de tamano se construyen a partir de las mediciones del resto de fragmentos, y se comparan con la muestra de referencia, no expuesta al agente genotoxico. A continuacion, se calcula la cantidad de Bio-RDC.

Referencias

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Modificaciones y otras realizaciones

Para los expertos en la materia, seran evidentes diversas modificaciones y variaciones de los metodos, de las composiciones y de los kits descritos segun el concepto de la invencion sin alejarse de la invencion reivindicada. Aunque la invencion se ha descrito en relacion con determinadas realizaciones preferidas, se ha de entender que la invencion segun lo reivindicado no pretende limitarse a dichas realizaciones espedficas.

Claims (9)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de deteccion de la presencia o de la ausencia de una o mas partes reparadas en uno o mas acidos nucleicos danados, en el que dicho dano se produjo en el acido nucleico de celulas, comprendiendo dicho metodo:

   (a) tratar una muestra que contiene celulas en cultivo antes de extraer el/los acido/s nucleico/s de dicha muestra mediante la adicion de un nucleotido o nucleosido detectable durante un tiempo y en condiciones suficientes para la interaccion con los acidos nucleicos, en el que dicho nucleotido o nucleosido detectable es incorporado por una o mas enzimas presentes dentro de dichas celulas vivas y capaces de escindir dicho dano del acido nucleico y reemplazarlo por dicho nucleotido o nucleosido detectable;

   (b) extraer uno o mas acidos nucleicos de dicha muestra y, opcionalmente, aclarar o lavar la muestra de acidos nucleicos extrafdos;

   (c) estirar el/los acido/s nucleico/s extrafdo/s;

   (d) detectar el nucleotido o el nucleosido detectable en el/los acido/s nucleico/s estirado/s; y

   (e) detectar la presencia de la/s parte/s reparada/s en el acido nucleico cuando dicho nucleotido o nucleosido detectable se detecta, y detectar la ausencia de una parte reparada en el/los acido/s nucleico/s cuando dicho nucleotido o nucleosido detectable no se detecta.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el/los acido/s nucleico/s extrafdo/s se estiran usando rastreo molecular.
3. 3. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el dano se repara en celulas vivas mediante el sistema de reparacion de escisiones de nucleotidos y en el que la sustancia es un nucleosido modificado qmmicamente o marcado, en particular, 5-etinil-2'-desoxi-uridina, y se incorpora a partes danadas del/de los acido/s nucleico/s a traves de la smtesis de ADN no programada.
4. 4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende ademas:

   (a) hibridar una o mas sondas espedficas de secuencias correspondientes a una o mas posiciones o regiones conocidas espedficas del acido nucleico y, opcionalmente,

   (b) medir la distancia o la distribucion espacial entre las sondas hibridadas y el nucleotido o el nucleosido detectable correspondiente a una o mas secuencias de acido nucleico reparadas.
5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra es una muestra de tejido, o una muestra de sangre, de lfquido cefalorraqmdeo, de lfquido sinovial o de linfa.
6. 6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha muestra se obtiene de un sujeto que tiene cancer o que ha sido sometido a tratamiento del cancer o que tiene una enfermedad infecciosa, enfermedad autoinmune o enfermedad o afeccion inflamatoria.
7. 7. Un metodo de diagnostico de una enfermedad, un trastorno o una afeccion en un sujeto, que comprende la deteccion de una o mas partes reparadas de acido/s nucleico/s extrafdo/s de una muestra de este sujeto mediante el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. 8. Un proceso de determinacion del efecto de un agente de ensayo en uno o mas acidos nucleicos en una celula, que comprende:

   poner en contacto la celula con dicho agente de ensayo durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dane el/los acido/s nucleico/s de la celula; y

   detectar una parte reparada del/de los acido/s nucleico/s de dicha celula mediante el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y, opcionalmente,

   detectar una o mas partes reparadas del/de los acido/s nucleico/s de celulas por lo demas identicas no expuestas a dicho agente de ensayo y comparar la/s parte/s reparada/s detectada/s con las de las celulas expuestas.
9. 9. El proceso de la reivindicacion 8, en el que dicho agente de ensayo es un compuesto genotoxico o una radiacion ionizante genotoxica.