ES2587604T3 - Ensayos de ganancia y pérdida genómica multiplexados - Google Patents

Ensayos de ganancia y pérdida genómica multiplexados Download PDF

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Abstract

Un método de ensayo de una muestra de ADN, que comprende: proporcionar un primer conjunto de partículas codificadas que comprende partículas codificadas que tienen amplicones unidos, comprendido los amplicones secuencias de ácidos nucleicos derivados de cebador y secuencias de ácidos nucleicos aleatorias que representan juntas sustancialmente una primera secuencia de ADN de molde completa; hibridar los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra marcado de manera detectable; hibridar los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia marcado de manera detectable; detectar una primera señal que indica hibridación específica de los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra marcado de manera detectable y una segunda señal que indica hibridación específica de los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia marcado de manera detectable; y comparar la primera señal y la segunda señal para detectar diferencias entre la primera y segunda señal, siendo las diferencias de la primera y segunda señal indicativas de diferencias entre el ADN de muestra y el ADN de referencia, sometiendo así a ensayo la muestra de ADN.

Description

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de la presente divulgación. Cada conjunto de partículas codificadas tiene amplicones unidos que son el producto de una segunda reacción de amplificación, tal como se describe en el presente documento, y que juntos representan sustancialmente la secuencia de ADN genómico completa usada como molde en una primera reacción de amplificación, en el que un molde genómico diferente se representa por amplicones unidos a cada uno de los demás conjuntos de partículas codificadas.
Un reactivo de múltiplex según una realización específica de la presente divulgación incluye un primer conjunto de partículas codificadas que tiene amplicones unidos que representan juntos sustancialmente una secuencia de ADN de molde completa insertada en el primer cromosoma artificial bacteriano y un segundo conjunto de partículas codificadas que tiene amplicones unidos que representan juntos sustancialmente una secuencia de ADN de molde completa insertada en el segundo cromosoma artificial bacteriano.
Por ejemplo, un primer conjunto de partículas codificadas tiene amplicones unidos que incluyen secuencias de ácidos nucleicos idénticas a una porción de ADN del cromosoma 13 humano y un segundo conjunto de partículas codificadas tiene amplicones unidos que incluyen secuencias de ácidos nucleicos idénticas a una porción de ADN humano del cromosoma 18. El tercer o posterior conjunto de partículas codificadas tiene amplicones unidos que incluyen secuencias de ácidos nucleicos idénticas a ADN humano de otro cromosoma u otra región no solapada de un cromosoma.
Un reactivo de múltiplex descrito en el presente documento permite el ensayo simultáneo de múltiples dianas, tales como sitios genómicos múltiples, en un único ensayo.
Se genera un reactivo de múltiplex para someter a ensayo ADN genómico mezclando al menos un primer conjunto de partículas codificadas y un segundo conjunto de partículas codificadas.
La figura 2 ilustra una realización de la presente divulgación de un método de generación de un reactivo de múltiplex. Como se indica en la figura, cualquier número “m” de conjuntos de partículas codificadas puede incluirse en el reactivo de múltiplex. Así, por ejemplo, “m” puede ser al menos 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o 200 conjuntos diferentes de partículas codificadas. Un conjunto de partículas codificadas que tiene amplicones enlazados se combina con uno o más conjuntos adicionales de partículas codificadas que tienen amplicones enlazados para generar un reactivo de múltiplex para ensayo de ganancia y pérdida genómica en una muestra.
Métodos de ensayo
Un método de ensayo de ADN genómico incluye proporcionar partículas codificadas que tienen amplicones unidos que representan juntos sustancialmente un ácido nucleico genómico de molde completo. En realizaciones particulares de la presente divulgación se proporcionan partículas codificadas que tienen amplicones unidos que representan juntos más de una copia de un ácido nucleico genómico de molde sustancialmente completo.
Una muestra de ADN genómico que va a someterse a ensayo de ganancia y/o pérdida genómica se marca con una marca detectable. El ADN de referencia también se marca con una marca detectable para comparación con el ADN de muestra. El ADN de muestra y de referencia pueden marcarse con las mismas o diferentes marcas detectables dependiendo de la configuración de ensayo usada. Por ejemplo, el ADN de muestra y de referencia marcados con diferentes marcas detectables pueden usarse juntos en el mismo recipiente para la hibridación con amplicones unidos a partículas codificadas en realizaciones particulares de la presente divulgación. En otras realizaciones de la presente divulgación, el ADN de muestra y de referencia marcados con las mismas marcas detectables pueden usarse en recipientes separados para la hibridación con amplicones unidos a partículas.
El término “marca detectable” se refiere a cualquier átomo o resto que pueda proporcionar una señal detectable y que pueda unirse a un ácido nucleico. Ejemplos de tales marcas detectables incluyen restos fluorescentes, restos quimioluminiscentes, restos bioluminiscentes, ligandos, partículas magnéticas, enzimas, sustratos enzimáticos, radioisótopos y cromóforos.
Puede usarse cualquiera de diversos métodos de marcado de ADN de muestra y de referencia en el ensayo, tal como traslación de muesca o marcado químico del ADN. Por ejemplo, una marca detectable puede introducirse por polimerización usando nucleótidos que incluyen al menos algunos nucleótidos modificados, tales como nucleótidos modificados para incluir biotina, digoxigenina, fluoresceína o cianina. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la marca detectable se introduce por cebado aleatorio y polimerización. Otros ejemplos incluyen traslación de muesca (Roche Applied Science, Indianapolis Ind.; Invitrogen, Carlsbad Calif.) y marcado químico (Kreatech ULS, Ámsterdam NL). El marcado detectable de ácidos nucleicos es muy conocido en la técnica y puede usarse cualquier método de marcado apropiado para marcar ADN genómico.
En otra realización más de la presente divulgación se evita el marcado covalente de ADN de muestra y de referencia individualmente con una marca detectable. Por ejemplo, las muestras de ADN genómico sin marcar se hibridan con los amplicones inmovilizados en las partículas codificadas. Las secuencias indicadoras premarcadas también se
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múltiples cámaras. Los recipientes de múltiples cámaras incluyen a título ilustrativo sustratos de múltiples depresiones tales como portaobjetos, chips de silicio o bandejas. En algunas realizaciones de la presente divulgación, cada muestra está dispuesta en un pocillo diferente de una placa de múltiples pocillos. Por ejemplo, una placa de múltiples pocillos puede ser una placa de ensayo de 96 pocillos, 384 pocillos o 1024 pocillos.
Adicionalmente se incluye la detección de una primera señal que indica la hibridación específica de las secuencias de ADN unidas con ADN genómico marcado de manera detectable de un sujeto individual y la detección de una segunda señal que indica la hibridación específica de las secuencias de ADN unidas con ADN genómico de referencia marcado de manera detectable.
Cualquier método apropiado, que incluye a título ilustrativo espectroscópico, óptico, fotoquímico, bioquímico, enzimático, eléctrico y/o inmunoquímico, se usa para detectar las marcas detectables del ADN de muestra y de referencia hibridados con amplicones enlazados a las partículas codificadas.
Las señales que son indicativas del grado de hibridación pueden detectarse, para cada partícula, evaluando la señal a partir de una o más marcas detectables. Las partículas se evalúan normalmente individualmente. Por ejemplo, las partículas pueden hacerse pasar a través de un citómetro de flujo. Citómetros de flujo a modo de ejemplo incluyen el citómetro de flujo Coulter Elite-ESP o el citómetro de flujo FACScan.TM. disponible de Beckman Coulter, Inc. (Fullerton Calif.) y el citómetro de flujo MOFLO.TM. disponible de Cytomation, Inc., Fort Collins, Colo. Además de citometría de flujo, puede usarse una centrífuga como instrumento para separar y clasificar las partículas. Un sistema adecuado es el descrito en la patente de EE. UU. n.º 5.926.387. Además de citometría de flujo y centrifugación puede usarse un aparato de electroforesis de flujo libre como instrumento para separar y clasificar las partículas. Un sistema adecuado es el descrito en la patente de EE. UU. n.º 4.310.408. Las partículas también pueden disponerse sobre una superficie y escanearse o someterse a obtención de imágenes.
Se detecta una primera señal que indica hibridación específica de las secuencias de ADN unidas a partículas codificadas con ADN genómico marcado de manera detectable de un sujeto individual. También se detecta una segunda señal que indica hibridación específica de las secuencias de ADN unidas a partículas codificadas con ADN genómico de referencia marcado de manera detectable.
Se compara la primera señal y la segunda señal, dando información sobre el ADN genómico del sujeto individual en comparación con el ADN genómico de referencia.
En realizaciones particulares de la presente divulgación, una relación de las señales a partir de las marcas detectables del ADN de referencia y el ADN de muestra hibridados con los amplicones de uno o más conjuntos de partículas se usa para evaluar diferencias entre el ADN de muestra y de referencia, indicativas, por ejemplo, de ganancia y/o pérdida genómica. En ciertas realizaciones de la presente divulgación, el ADN de referencia y el ADN de muestra se hibridan con los amplicones de uno o más conjuntos de partículas en el mismo recipiente, tal como un pocillo de una placa de múltiples pocillos. Después de la hibridación, las dos marcas se analizan juntas, es decir, ambas marcas detectables se detectan en el material hibridado o el material hibridado se divide en dos (o más) porciones y cada porción se evalúa por separado para detectar las marcas detectables. Los resultados de la evaluación pueden usarse para proporcionar la relación de señales a partir de las dos marcas detectables. Este enfoque permite el uso de hibridación competitiva para normalizar cualquier variación entre ensayos: las muestras tanto de referencia como experimentales se someten a ensayo simultáneamente en el mismo recipiente mezcladas con las mismas partículas.
Opcionalmente, el ADN de referencia marcado de manera detectable y el ADN de muestra marcado de manera detectable se hibridan con uno o más conjuntos de partículas en recipientes diferentes, tales como diferentes pocillos de una placa de múltiples pocillos. Puede obtenerse una relación de las señales a partir de las dos marcas detectables para evaluar diferencias entre el ADN de muestra y el ADN de referencia. Si se utiliza este enfoque, una única muestra de referencia puede compartirse entre varias o muchas muestras experimentales. Para experimentos que implican múltiples muestras al día puede haber un ahorro en el coste de reactivos y trabajo, al evitarse el marcado de múltiples muestras duplicadas normales. También resulta innecesario manipular la muestra para obtener diferentes porciones para análisis separados. Cada muestra puede evaluarse solo una vez.
Las partículas codificadas se identifican por su información codificada de manera que se asocia la codificación de partículas con la primera señal y con la segunda señal en realizaciones particulares de la presente divulgación. Así, por ejemplo, la primera y segunda señal están asociadas a partículas codificadas de un primer conjunto de partículas codificadas que contiene ADN humano del cromosoma 13. Se comparan la primera señal y la segunda señal asociadas al primer conjunto de partículas codificadas, dando información sobre el ADN del cromosoma 13 del sujeto individual en comparación con el ADN del cromosoma 13 de referencia. De manera similar, la primera y segunda señal están asociadas con un segundo conjunto de partículas codificadas que contiene ADN humano del cromosoma 18. Se comparan la primera señal y la segunda señal asociadas al segundo conjunto de partículas codificadas, dando información sobre el ADN del cromosoma 18 del sujeto individual en comparación con el ADN del cromosoma 18 de referencia.
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El tampón de PCR 2, 28, incluyó Tris HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM y MgCl 5 mM. Los dNTP (Amersham Biosciences, Piscataway NJ) están a una concentración de 200 µM. La Taq polimerasa Platinum (Applied Biosystems) está a una concentración de 5 unidades/µl.
El cebador ligado a amina (Operon) tuvo la siguiente secuencia.
5'-GGAAACAGCCCGACTCGAG-3' SEC ID N.º 4
Los moldes en la reacción, 25, son los amplicones de COR, 24, de la ronda de PCR de COR previa, 20. La amplificación de segunda ronda, 25, se realiza en un ciclador térmico GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) según el siguiente perfil de temperatura/tiempo:
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Este segundo producto de PCR, 29, se purifica entonces usando un kit basado en perlas magnéticas, 9, (PCR Clean Beads, Agencourt Bioscience Corp., Beverley MA) según el protocolo del fabricante. Entonces, los amplicones purificados, 29, se resuspenden en 40 µl de agua y se guardan a -20 ºC hasta que se usen en la etapa de acoplamiento a perlas tal como se describe a continuación.
El método de acoplamiento a perlas codificadas, 32, para inmovilizar el producto de amplicón, 29, como ADN de sonda sobre la superficie de perlas codificadas se realiza sobre perlas carboxi Luminex, 30 (Luminex, Austin TX) a una escala de 50 µl de la concentración de perlas estándar, dando aproximadamente 650 000 perlas. Las perlas están hechas de poliestireno, aproximadamente 5,6 µm de diámetro, y codificadas con cantidades controladas de dos o tres colorantes fluorescentes para facilitar que su ID de perla se detecte en un instrumento de lectura del citómetro de flujo especialmente construido. Se transfieren 50 µl de perlas en suspensión, 30, todas de una ID de perlas o región, del tubo Luminex en el que se suministran a un tubo Eppendorf de 1,5 ml para el acoplamiento, 32, usándose agitación con vórtex y sonicación para garantizar la suspensión. Entonces, las perlas se centrifugan a 12 000 rpm durante 3 minutos y el sobrenadante del tampón de perlas se elimina sin alterar el sedimento de perlas. Se añaden 25 µl de tampón MES a cada tubo de perlas, seguido de agitación con vórtex y sonicación. Por separado, se añaden entonces 10 µg de amplicones de PCR 2, 29, de cada BAC a un segundo conjunto de tubos de centrífuga de 1,5 ml, y el ADN en cada tubo se seca entonces completamente en un SpeedVac (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Entonces se transfiere una suspensión de perlas a cada tubo de ADN, se agita con vórtex y se sónica durante 5 segundos cada uno para mezclar, manteniendo un seguimiento cuidadoso de la ID de perlas (región) asociada a cada BAC.
A continuación se añaden 1,5 µl de EDC disuelto recientemente, 31, (clorhidrato de 1-etil-3-[dimetilaminopropil]carbodiimida, Pierce, Rockford IL) a 10 mg/ml a cada tubo, se agitan con vórtex inmediatamente y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad (para preservar la codificación fluorescente de las perlas Luminex). Se realiza remezcla en el minuto 15. La adición, incubación y remezcla de EDC se repite entonces una segunda vez.
Entonces se añaden 500 µl de tampón TNT (Tris 0,1 M a pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,02 % de Tween 20) a cada tubo y se agitan con vórtex. Entonces, los tubos se centrifugan en una microcentrífuga durante 4 minutos a 12 000 rpm para conducir las perlas al fondo y el sobrenadante se elimina cuidadosamente. A continuación se añaden 500 µl de 0,1 % de SDS y las perlas se centrifugan de nuevo durante 4 minutos a 12 000 rpm y el sobrenadante se elimina cuidadosamente. Finalmente, se añaden 50 µl de 1x tampón TE (Tris 10 mM a pH 7,5, EDTA 1 mM) a cada tubo y se agitan con vórtex.
El conjunto de perlas, 33, con sondas de amplicón inmovilizadas, 29, puede incluirse como componente de un conjunto de perlas de múltiplex para su uso en los ensayos de ADN genómico.
Ejemplo 2
Preparación de un reactivo de conjunto de perlas codificadas de múltiplex para ensayo de ADN
La figura 2 es un diagrama de flujo que ilustra la mezcla de m conjuntos de perlas codificadas diferentes, cada uno con su ADN de sonda de amplicón de BAC inmovilizado respectivo, entre sí para preparar un conjunto de perlas codificadas multiplexadas.
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rpm de agitación a 50 ºC durante 20 minutos. Entonces, el contenido de cada pocillo se transfiere a una placa de filtración HT de 0,46 µm de Millipore (Millipore, Billerica MA). Entonces, el líquido se elimina de cada pocillo por vacío usando un colector de vacío MSVMHTS00 de Millipore. A continuación se añaden 100 µl de tampón de lavado b (2X SSC, 0,1 % de detergente Igepal) a cada pocillo, seguido de otra incubación con agitación a 50 ºC de 20 minutos y aspiración a vacío. Entonces se añaden 100 µl de tampón de lavado c (0,2X SSC) a cada pocillo y se repite la incubación con agitación a 50 ºC de 20 minutos, seguido de aspiración por vacío.
Entonces se añaden 100 µl de 1X disolución PhycoLink SA, el indicador de estreptavidina-ficoeritrina, 64, a cada pocillo. Esta solución indicadora se prepara a partir de 2 µl de 500X PhycoLink SA PJ 13S (Prozyme, San Leandro CA) mezclados en 1 ml de diluyente indicador, siendo el diluyente 1X PBS, 0,1 % de BSA y 0,05 % de Tween 20. Esta solución indicadora se incuba con los conjuntos de perlas de múltiplex durante 30 minutos a 25 ºC y 1050 rpm en la estufa de incubación con agitación. Después de la incubación, la solución se aspira de los pocillos de la placa de filtración usando el colector de vacío como en las etapas de lavado previas.
Entonces, las perlas se lavan dos veces, 67, con tampón de lavado d, 66, que es 1X SBF con 0,01 % de Tween 20. Se añaden 100 µl a cada pocillo de la placa de filtración, entonces el líquido se aspira por vacío a través de los filtros en los fondos de los pocillos de las placas. Se añaden 100 µl una segunda vez y se incuban en la estufa de incubación con agitación durante 2 minutos a 25 ºC a 1050 rpm. Este segundo lavado no se aspira, sino que se usa para suspender las perlas para la lectura.
Entonces, los cuatro conjuntos de perlas en el ejemplo, 68 -71, están listos para ser leídos, 72, en un sistema Luminex 200 (Luminex Corporation, Austin TX). Las señales e ID de perlas de las perlas en cada pocillo se leen en secuencia, y se registra la mediana de la intensidad de fluorescencia de las 50 primeras perlas de cada ID de perlas (región de perla) para cada pocillo o muestra, y se emite en un archivo de datos, 73. No hay pruebas de conexión de perlas; el lector Luminex se configura para analizar 50 perlas de cada región y no se registran fallos.
La figura 4 es un diagrama esquemático de una microplaca estándar de SBS de 96 pocillos, 80, que muestra localizaciones de ejemplo de referencias duplicadas y muestras duplicadas para realizar el ensayo sobre 46 muestras en paralelo. Las hibridaciones duplicadas de cada muestra marcada pueden usarse para asegurar la generación de datos en caso de fallo de sellado de pocillo que produzca la evaporación de los reactivos de un pocillo individual. Si el duplicado no está afectado, todavía se generan datos de esa muestra. Usando esta microplaca y enfoque de perlas codificadas, un único técnico de laboratorio puede someter a ensayo, por ejemplo, 46 muestras y 2 referencias a la vez, todas por duplicado, marcando en un primer día, hibridando durante la noche, y lavando y leyendo el segundo día. El ensayo puede realizarse alternativamente sin duplicados o con más de dos replicaciones. Se muestran duplicados de dos referencias, 81 y 82, y duplicados de muestras, y un ejemplo de ello se indica en 83.
La figura 5 es un ejemplo de datos generados usando una muestra de ADN de Coriell que tiene una trisomía en el cromosoma 13, sexo masculino. Los números 1 a 55 mostrados en la parte inferior de la figura 5 se enumeran en la figura 9.
Estos datos se calculan a partir de la mediana de los valores de fluorescencia para cada región de perlas producida por el lector Luminex. Los valores promedios de las perlas de control negativo 29, 54 y 56 se restan de todas las demás señales (véase la figura 9). Entonces, las señales de los nueve clones autosómicos se prorratean con las señales de clones correspondientes de los ADN de referencia masculino y femenino. Se calcula un factor de normalización de forma que cuando el factor se aplique a todas las señales de clones autosómicos conduzca la relación autosómica a un valor de uno. Este factor de normalización se aplica entonces a todas las señales para la muestra.
Las relaciones resultantes se representan y se muestran en la figura 5. Obsérvese que las relaciones para los clones del cromosoma 13 están todas en el intervalo de 1,3 a 1,6, mientras que los clones para los cromosomas 18 y 21, así como los demás clones autosómicos, están, excepto uno, todos por debajo de 1,2. La trisomía en el cromosoma 13 es fácilmente evidente. Por tanto, la representación de la relación de la muestra en comparación con la referencia masculina (puntos de datos en cuadrado) es efectivamente plana a través del cromosoma sexual X e Y. Esta es la respuesta esperada de una muestra masculina. La representación de la muestra en comparación con la referencia femenina (puntos de datos en diamante) se desplaza hacia abajo para X y hacia arriba para Y, también como se espera para una muestra masculina.
La figura 6 es un ejemplo de datos generados usando una muestra de ADN de Coriell que tiene una trisomía en el cromosoma 18, sexo masculino. Los datos se generan y se representan como se describe para la figura 5.
La figura 7 es un ejemplo de datos generados usando una muestra de ADN de Coriell que tiene una trisomía en el cromosoma 21, sexo femenino. Los datos se generan y se representan como se describe para la figura 5.
La figura 8 es un ejemplo de datos generados usando una muestra de ADN de Coriell que tiene una amplificación de 5 copias del cromosoma X. Los datos se generan y se representan como se describe para la figura 5.
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La figura 9 es una tabla que muestra los clones de BAC que tienen insertos de ADN genómico humano usados para generar amplicones en los ensayos de ejemplo, su cromosoma y localizaciones de citobandas, la secuencia de los oligonucleótidos de control negativo y la ID de perlas (región de perlas Luminex) para el conjunto de perlas en el que se inmoviliza cada sonda de amplicón. Los puntos representados secuencialmente numerados sobre el eje x en las figuras 5-8 están asociados con BAC enumerados de arriba abajo en la figura 9. Los puntos representados secuencialmente numerados en el eje x en las figuras 5-8 están asociados con BAC enumerados de arriba abajo en la figura 9. BAC RP11-186J16 se inmoviliza en dos regiones de perlas diferentes (42 y 86).
Para un control negativo se selecciona un oligonucleótido que no tiene homología de secuencias con el genoma humano. Los oligonucleótidos de control negativo específicos usados son
5' GTCACATGCGATGGATCGAGCTC 3' SEC ID N.º 5 5'CTTTATCATCGTTCCCACCTTAA 3' SEC ID N.º 6 5'GCACGGACGAGGCCGGTATGTT 3' SEC ID N.º 7
Las señales generadas por las tres regiones de perlas 29, 54 y 56 que tienen unidos oligonucleótidos de control negativo se promedian y se restan de todas las demás señales de perlas antes de calcular las relaciones.
1. Un método de ensayo de una muestra de ADN, que comprende:
proporcionar un primer conjunto de partículas codificadas que comprende partículas codificadas que tienen amplicones unidos, comprendido los amplicones secuencias de ácidos nucleicos aleatorias que representan juntas sustancialmente una primera secuencia de ADN de molde completa;
hibridar los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra marcado de manera detectable;
hibridar los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia marcado de manera detectable;
detectar una primera señal que indica hibridación específica de los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra marcado de manera detectable y una segunda señal que indica hibridación específica de los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia marcado de manera detectable; y
comparar la primera señal y la segunda señal para detectar diferencias entre la primera y segunda señal, siendo las diferencias de la primera y segunda señal indicativas de diferencias entre el ADN de muestra y el ADN de referencia, sometiendo así a ensayo la muestra de ADN.
2.
El método del punto 1, en el que los amplicones tienen una longitud en el intervalo de aproximadamente 500 1200 nucleótidos, ambos incluidos.
3.
El método del punto 1, en el que el ADN de muestra marcado de manera detectable es ADN marcado de manera detectable obtenido de un sujeto individual.
4.
El método del punto 3, en el que el ADN de muestra marcado de manera detectable es ADN genómico marcado de manera detectable obtenido de un sujeto individual.
5.
El método del punto 1, en el que el ADN de muestra marcado de manera detectable es ADN humano.
6.
El método del punto 1, que comprende además:
proporcionar un segundo conjunto de partículas codificadas que comprende partículas codificadas que tienen amplicones unidos, comprendido los amplicones secuencias de ácidos nucleicos aleatorias que representan juntas sustancialmente una segunda secuencia de ADN de molde completa;
hibridar los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra marcado de manera detectable;
hibridar los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia marcado de manera detectable;
detectar una primera señal que indica hibridación específica de los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra marcado de manera detectable y una segunda señal que indica hibridación específica de los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia marcado de manera detectable; y
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65
a) realizar una primera reacción de amplificación usando un molde de ADN y cebadores de oligonucleótidos de primera reacción, comprendiendo cada uno de la pluralidad de cebadores de primera reacción una secuencia de ADN redundante no específica variable y una secuencia de ADN constante contigua, para dar un primer producto de reacción que comprende primeros amplicones, en el que cada primer amplicón individual comprende una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria del molde de ADN y una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN constante de los cebadores de primera reacción;
b) realizar una segunda reacción de amplificación usando al menos una porción de los primeros amplicones como ADN de molde y cebadores de oligonucleótidos de segunda reacción, comprendiendo los cebadores de oligonucleótidos de segunda reacción la secuencia de ADN constante de los cebadores de primera reacción, para dar un segundo producto de reacción que comprende segundos amplicones, en el que cada segundo amplicón individual comprende una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria del molde de ADN y una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN constante de los cebadores de primera reacción;
c) enlazar los segundos amplicones a una primera pluralidad de partículas codificadas, dando un conjunto de partículas codificadas para someter a ensayo ADN.
15.
El método de preparación de un reactivo para someter a ensayo ADN del punto 14, en el que los cebadores de oligonucleótidos de segunda reacción comprenden además un grupo funcional para la reacción con una partícula codificada.
16.
El método de preparación de un reactivo para someter a ensayo ADN del punto 14, que comprende además repetir a) -c) usando un segundo molde de ADN y enlazar los segundos amplicones así obtenidos a una segunda pluralidad de partículas codificadas diferentes de manera detectable de la primera pluralidad de partículas codificadas, dando un segundo conjunto de partículas codificadas para someter a ensayo ADN.
17.
El método de preparación de un reactivo para someter a ensayo ADN del punto 16, que comprende además mezclar el primer conjunto de partículas codificadas y el segundo conjunto de partículas codificadas.
18.
El método de preparación de un reactivo para someter a ensayo ADN del punto 16, que comprende además repetir a) -c) usando un tercer o posterior molde de ADN y enlazar los terceros o posteriores amplicones así producidos a una tercera o posterior pluralidad de partículas codificadas, cada una de la tercera o posterior pluralidad de partículas codificadas diferente de manera detectable de cada una de las otras pluralidades de partículas codificadas, dando un tercer o posterior conjunto de partículas codificadas para someter a ensayo ADN.
19.
El método de preparación de un reactivo para someter a ensayo ADN del punto 18, que comprende además mezclar el primer conjunto de partículas codificadas, el segundo conjunto de partículas codificadas, el tercer conjunto de partículas codificadas y/o el posterior conjunto de partículas codificadas.
20.
Un reactivo para someter a ensayo ADN, que comprende:
una pluralidad de partículas codificadas que tienen amplicones unidos amplificados a partir de una secuencia de ADN de molde, cada amplicón unido individual comprende una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria de la secuencia de ADN de molde, en el que los amplicones representan juntos sustancialmente el ADN de molde completo y en el que la secuencia de ácidos nucleicos idéntica a una porción aleatoria de la secuencia de ADN de molde de cada amplicón individual es más corta que el ADN de molde completo.
21.
El reactivo del punto 20, en el que la secuencia de ADN de molde completa tiene una longitud en el intervalo de aproximadamente 20 -300 kilobases, ambos incluidos, y cada amplicón unido individual comprende una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria de la secuencia de ADN de molde que tiene una longitud en el intervalo de aproximadamente 500 -1200 nucleótidos, ambos incluidos.
22.
Un reactivo de múltiplex para someter a ensayo ADN, que comprende:
una mezcla de dos o más pluralidades de partículas codificadas de forma que las partículas de cada pluralidad de partículas sean distinguibles de manera detectable de las partículas de cada una de las otras pluralidades de partículas, teniendo las partículas codificadas amplicones unidos amplificados a partir de una secuencia de ADN de molde, teniendo cada pluralidad de partículas codificadas amplicones unidos amplificados a partir de una secuencia de ADN de molde diferente en comparación con cada una de las otras pluralidades de partículas codificadas, comprendiendo cada amplicón unido individual una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria de la secuencia de ADN de molde.
23.
Un kit para someter a ensayo ADN, que comprende:
una mezcla de dos o más pluralidades de partículas codificadas de forma que las partículas de cada pluralidad de partículas sean distinguibles de manera detectable de las partículas de cada una de las otras pluralidades de

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