ES2588205T3 - Nuevos antibióticos de bacitracina - Google Patents

Nuevos antibióticos de bacitracina Download PDF

Info

Publication number
ES2588205T3
ES2588205T3 ES10765613.4T ES10765613T ES2588205T3 ES 2588205 T3 ES2588205 T3 ES 2588205T3 ES 10765613 T ES10765613 T ES 10765613T ES 2588205 T3 ES2588205 T3 ES 2588205T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
bacitracin
isoleucine
methylene
bacitracins
loss
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10765613.4T
Other languages
English (en)
Inventor
Martin MÅNSSON
Christine Senstad
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xellia Pharmaceuticals ApS
Original Assignee
Xellia Pharmaceuticals ApS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xellia Pharmaceuticals ApS filed Critical Xellia Pharmaceuticals ApS
Application granted granted Critical
Publication of ES2588205T3 publication Critical patent/ES2588205T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/03—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
    • C07K7/58—Bacitracins; Related peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Un compuesto representado por la Fórmula **Fórmula** en donde al menos uno de R1, R2 y R3 es -CH>=CH2, y en donde R1, R2 y R3 son independientemente -H, -CH3, o-CH>=CH2, y sales e hidratos de estos.

Description

Nuevos antibióticos de bacitracina
Campo de lainvención
La presente invención se refiere a nuevos compuestos con actividad antibiótica.
Antecedentes de la invención
Un grupo de antibióticos de péptidos estrechamente relacionados, producidos de forma natural por Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis se denominan Bacitracinas. Las Bacitracinas son generalmente activas contra muchas especies Gram positivas y unas pocas bacterias Gram negativas.
Se identificaron varias bacitracinas de las que la bacitracina A es de importancia primaria y es altamente activa (Biochemistry, vol. 39 núm. 14, 2000, páginas 4037-45 de Epperson y Ming). La Bacitracina A es un antibiótico dodecapéptidolactamo cíclico ramificado que se sintetiza a través del mecanismo thiotemplate de la síntesis del péptido no ribosomal (J. Am Chem Soc. vol. 128, 2006, páginas 10513-10520 deWagner y otros y Eur J Biochem, vol. 192 núm. 1, 1990, páginas 1-15 de Kleinkauf y von Döhren).
La estructura primaria de la Bacitracina A es NH2-L-Ile1-L-tiazolina2-L-Leu3-D-Glu4-L-Ile5-L-Lys6-D-Orn7-L-Ile8-D-Phe9-LHis10-D-Asp11-L-Asn12-COOH que se cicla entre el grupo ε-amino de L-Lys6 y el grupo R-carboxilo de L-Asn12 (J. Am Chem Soc. vol 128 páginas 10513-10520, 2006 deWagner y otros).
Ming y otros (Journal of Inorganic Biochemistry, vol. 91, 2002) describió las Bacitracinas como compuestos peptídicos con la fórmula siguiente:
en donde X es Ile o Val y Y es Ile o Val
Notoriamente, R1 y R3 son las porciones N-terminales de las Bacitracinas activas, mientras que R4 y R5 son las porciones N-terminales oxidadas de las Bacitracinas menosactivas. R2 es sin embargo un estereoisómero inactivo.
Técnica anterior
Ikai y otros sugirieron que la actividad delas Bacitracinas puede depender de la hidrofobicidad:
"La comparación de los MIC y las estructuras propuestas de los componentes menores sugieren que la ubicación de la valina afecta la actividad de cada componente en el siguiente orden decreciente: N-terminal, el anillo del péptido de sietemiembros, y la porción peptídica de la cadena lateral. Debido a que este orden se refiere al orden de elución de los componentes menores en la HPLC, la actividad puede depender de la hidrofobicidad del componente respectivo." (ver Journal of Antibiotics, vol. 48 núm. 3, 1995, páginas 233-242por Ikai y otros).
Wagner y otros sugirieron la incorporación de nuevos heterociclos en la Bacitracina A para superar las limitaciones existentes para la aplicación de la Bacitracina (Journal of the American Chemical Society, vol. 128 núm. 32, 2006, páginas 10513-10520).
El documento de patente WO97/47.313 A1 se refiere a los métodos para sintetizar polipéptidos de bacitracina y análogos y sus derivados.
Varios péptidos sintetizados demanera no ribosomal comprenden aminoácidosinusuales. Por ejemplo, la ciclosporina A comprende ácido 2(S)-amino-3(R)-hidroxi-4(R)-metilo-6(E)-octenoico que es crucial para la unión al receptor intracelular
para ciclofilina, y por lo tanto para su actividad inmunosupresora (Journal of Biological Chemistry, vol. 268 núm. 35, 1993 deOffenzeller y otros).
Varios aminoácidos no comunes se asemejan a la estructurade la isoleucina: 5
 El ácido 2-amino-5-metil-5-hexenoico, un nuevo análogo de la metionina, se aisló a partir de un caldo de fermentación de Streptomyces (Journal of Antibiotics vol. 32 núm. 11, páginas 1118-1124, 1979 de Takeuchi y otros).
10  La 4metilen-norleucina y el ácido 2-aminohept-6-enoico soncompuestos con lafórmula: C7H13NO2.
 La 4 metil-norleucina es un derivado de isoleucina que puede incorporarse en una proteína recombinante. (J Pharm Biomed Anal, vol 31. núm. 5, 2003, páginas 979-987 de Muramatsu y otros).
15  El ácido 2-amino-3-metil-4-pentenoico es un análogo de isoleucina insaturado que puede incorporarse en las proteínas (Chembiochem vol. 7 núm. 1, 2006, páginas 83-87de Mock y otros).
 Las norleucinas no saturadas de Amanita solitaria. Estudios químicos y farmacológicos describen un ácido 2Amino-Hex-5-enoico (Lloydia vol. 36 núm.2, 1973, páginas 69-73 de Chilton y otros). 20  Beta-metilnorleucina, un antimetabolito producido por Serratia marcescens (J Antibiot, vol. 34 núm. 10, 1981 páginas 1278-82 de Sugiura y otros)
El documento de patente WO93/08.822 A1 se refiere al tratamiento de la infección con sales de bacitracina de metales 25 divalentes.
Saberwal y Nagaraj, 1994, Biochimica et Biophysica Acta, 1197 (2), 109-131 proporciona una discusión de los péptidos antibacterianos y líticos celulares distintos de bacitracina, que actúan perturbando la función de barrera de las membranas: las facetas de sus características conformacionales, correlaciones estructura-función y capacidades que
30 perturbanlamembrana.
Resumen dela invención
En un aspecto, esta invención se refiere a nuevos compuestos de Bacitracina. Más específicamente, se refiere a nuevos 35 compuestos de Bacitracina que comprenden una cadena lateral de aminoácido hasta ahora desconocido.
En Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis, sin estar atado por la teoría, especulamos que esta cadena lateral es resultante de una modificación química en la Bacitracina o de la incorporación de un aminoácido natural hasta ahora desconocido.
40 El nombre sistemático de un compuesto de ácido α-amino que comprende la nueva cadena lateral es ácido 2-amino-3metil-5-hexenoico y su fórmulamolecular es C7H13NO2.
Proponemos y usamos el nombre 5-metilen-isoleucina para el ácido 2-amino-3-metil-5-hexenoico. En consecuencia, la 45 cadenalateraldela5-metilen-isoleucinatienelaestructura -CH(CH3)CH2CH=CH2
Por lo tanto, la invención se refiere a nuevos compuestos de Bacitracina con actividad antibacteriana que comprende al menos un residuo de 5-metilen-isoleucina. Tales bacitracinas comprenden al menos una cadena lateral de 5-metilenisoleucina. La cadena lateral de 5-metilen-isoleucina podría representarse:
La invención se refiere a compuestos de Bacitracina con actividad antibacteriana que comprenden una o más cadenas 60 laterales de 5-metilen-isoleucina.
Las Bacitracinas de conformidad conla invención comprenden al menos un residuo 5-metilen-isoleucina en la posición 1 y/o 5 y/u 8. Tales compuestos tienen la siguiente estructura:
en donde al menos uno de R1, R2 y R3 es -CH=CH2, y en donde R1, R2 y R3 son independientemente -H, -CH3, o -CH=CH2
La estructura anterior debe interpretarse como que cubre Bacitracina A si R1, R2 y R3 son todos -CH3.
En consecuencia, la Bacitracina A sería representada:
Proponemos y usamos el nombre Bacitracina J1 para las Bacitracinas de conformidad con la invención que comprenden un residuo de 5-metilen-isoleucina en la posición 5. Esta nomenclatura se basa en el orden de elución a partir de una columna C18.
45 Proponemos y usamos el nombre Bacitracina J2 para las Bacitracinas de conformidad con la invención que comprenden un residuo de 5-metilen-isoleucina en la posición 8. Esta nomenclatura se basa en el orden de elución a partir de una columna C18.
Proponemos y usamos el nombre Bacitracina J3 para las Bacitracinas de conformidad con la invención que comprenden un residuo de 5-metilen-isoleucina en la posición 1. Esta nomenclatura se basa en el orden de elución a partir de una columna C18.
Proponemos y usamos el nombre Bacitracina K1 para las Bacitracinas de conformidad con la invención que comprenden los residuos 5-metilen-isoleucina en la posición 5 y 8. Esta nomenclatura se basa en el orden de elución
55 esperado a partir de una columna C18.
Proponemos y usamos el nombre Bacitracina K2 para las Bacitracinas de conformidad con la invención que comprenden los residuos 5-metilen-isoleucina en la posición 1 y 5. Esta nomenclatura se basa en el orden de elución a partir de una columna C18.
Proponemos y usamos el nombre Bacitracina K3 para las Bacitracinas de conformidad con la invención que comprenden los residuos 5-metilen-isoleucina en la posición 1 y 8. Esta nomenclatura se basa en el orden de elución esperado a partir de una columna C18.
65 Proponemos y usamos el nombre Bacitracina L para las Bacitracinas de conformidad con la invención que comprenden
los residuos 5-metilen-isoleucina en la posición 1, 5 y 8. Esta nomenclatura se basa en el orden de elución esperado a partir de una columna C18. La invención se define en las reivindicaciones de patente adjuntas. Descripción detallada dela invención
Definiciones: Las "Bacitracinas" son compuestos peptídicos que comprenden la siguiente estructura (con la numeración del residuo de aminoácido superíndice):
en donde X es
35 y en donde R es la cadena lateral del residuo de aminoácidos de isoleucina, valina o 5-metilen-isoleucina;
y en donde Y y Z son independientemente el residuo de aminoácido de isoleucina, valina o 5-metilen-isoleucina;
y en donde 45 Thz es un anillo de tiazolina
2' acoplado a X y 4' acoplado al carbono α en Leu;
y en donde
55 Leuesunresiduodeaminoácidodeleucina Glu es un residuo de aminoácido de glutamina Lys es un residuo de aminoácido de lisina que forma enlaces peptídicos con Y y Orn mientras que su ε-amina se acopla al grupo α-carboxilo de asparagina mediante un enlace peptídicoOrn que es un residuo de aminoácido deOrnitina. Phe es un residuo de aminoácido defenilalanina His es un residuo de aminoácido de histidina Asp es un residuo de aminoácido de ácido aspártico Asn es un residuo de aminoácido de asparagina que forma enlaces peptídicos con Asp mientras que su grupo αcarboxilo se acopla a la ε-amina delisinamediante un enlace peptídico;
65 Cuando se usa en esta solicitud; "Bacitracinas" pretende abarcar cualquier compuesto que tenga la estructura anterior sin tener en cuenta el método de producción. Por lo tanto, el término "Bacitracinas" incluye los compuestos antibióticos
que se producen de manera natural por Bacillus licheniformis pero además los compuestos (sintéticos) y compuestos semisintéticos producidos in vitro que tienen la estructura primaria anterior. "Bacitracinas" además pretende abarcar cualquier compuesto que tenga la estructura anterior sin tener en cuenta la carga que varía con el pH. "Bacitracinas" además pretende abarcar cualquier compuesto que tenga la estructura primaria anterior sin tener en cuenta la estereoquímica. "Bacitracinas" pretende abarcar además, las sales e hidratos de los compuestos que tengan la estructura primaria anterior.
"Bacitracinas que comprenden al menos un residuo de 5-metilen-isoleucina" pretende abarcar cualquier Bacitracina que comprende la estructura que se puede generar si un residuo(s) de isoleucina o valina se sustituye con el residuo(s) de 5-metilen-isoleucina en las posiciones 1 y/o 5 y/u 8.
"Bacitracinas que comprenden al menos un residuo de 5-metilen-isoleucina" pretende abarcar cualquier Bacitracina que comprende la estructura que se puede generar si un residuo(s) de isoleucina o valina se sustituye con el residuo(s) de 5-metilen-isoleucina en las posiciones 1 y/o 5 y/u 8.
"Bacitracinas que comprenden la cadena lateral de al menos un 5-metilen-Isoleucina" pretende abarcar "Bacitracinas que comprenden al menos un residuo de 5-metilen-isoleucina"
Cuando se oxida el grupo amino N-terminal y/o el anillo tiazolina de las Bacitracinas, se pierde una cantidad sustancial de actividad antibacteriana. Por ejemplo, el compuesto de baja actividad Bacitracina F, comprende una porción cetotiazol en lugar dela porción amino-tiazolina (J. Org. Chem, vol. 22, 1957, páginas 1345-1353 de Craig y otros).
Los aminoácidos en configuración D son comunes en péptidos bacterianos sintetizados por vía no-ribosomal y menos común en proteínas sintetizadas por vía ribosomal. Por ejemplo en las Bacitracinas sintetizadas por la vía no ribosomal, los residuos de aminoácidos en posición 4, 7, 9 y 11 están usualmente en configuración D (Glu, Orn, Phe y Asp).
La 5-metilen-isoleucina comprende dos átomos de carbono quirales que pueden estar independientemente en configuración R o S.
Un "residuo de aminoácido" es la unidad en un péptido que comprende -NH-CHR-COOH (residuo C-terminal) o NH2-CHR-CO-(residuo N-terminal) o -NH-CHR-CO-(residuo interno)
en donde R es -H en glicina, -CH3 en alanina, -OH en serina, -CH2SH en cisteína, -CH(CH3)CH2CH3 en isoleucina, -CH2CH(CH3)2 en leucina -CH(CH3)2 en valina etc.
Una "cadena lateral de aminoácido" es el grupo R de un "residuo de aminoácido". Por ejemplo, el grupo R es -CH(CH3)CH2CH=CH2 en 5-metilen-Isoleucina -CH(CH3)CH2CH3 en isoleucina, -CH2CH(CH3)2 en leucina -CH(CH3)2 en valina
"Actividad antibacteriana" es cualquier actividad que  inhibe el crecimiento, el metabolismo o la reproducción de bacterias, o  aumenta lamortalidad de las bacterias, o  reduce la patogenicidad de las bacterias.
La potencia es la actividad antibacteriana in vitro. Puede medirse y expresarse comoIU/mg.
Las "posiciones" de los residuos de aminoácidos en las Bacitracinas se numeran a partir del N-terminal que puede ser isoleucina, valina o 5-metilen-isoleucina en la posición 1 (el extremo izquierdo en todas las figuras muestran Bacitracinas en esta solicitud). De aquí que, Lys está en la posición número 6 y Asn está en la posición número 12.
En las Bacitracinas, la "posición 1" es especial, debido a que este residuo de aminoácido se incorpora parcialmente dentro del anillo Tiazolina. Por lo tanto, el residuo de aminoácido en la posición 1 en las Bacitracinas no comprende la unidad N-terminal usual:
pero comprende en su lugar:
acoplada a tiazolina o sus derivados oxidados.
Una "composición" es cualquier mezcla que comprendemásde dos compuestos diferentes. Por ejemplo, unamezcla de dos ingredientes farmacéuticos activos, o una mezcla de un ingrediente farmacéutico activo y uno o más excipientes farmacéuticos.
El término "componente" o "componentes" que se usa en esta solicitud se refieren a un compuesto específico en una composición. En consecuencia, "Componentes menores" son compuestos que se encuentran en cantidades relativamente pequeñas en una composición.
Una "composición" es por ejemplo cualquier composición adecuada para usar in vivo. Tales composiciones pueden por lo tanto administrarse de manera cutánea, de manera subcutánea, de manera intravenosa, de manera parenteral, de manera oral etc.
La invención se refiere a nuevos compuestos de Bacitracina que comprenden la cadena lateral de al menos un residuo de 5-metilen-isoleucina.
Más específicamente, la invención se refiere a nuevos compuestos de Bacitracina con actividad antibacteriana que comprenden al menos un residuo de 5-metilen-isoleucina.
Aún más específicamente, se refiere a nuevos compuestos de Bacitracina con una mejor actividad antibacteriana que comprenden al menos un residuo (s) de 5-metilen-isoleucinaen la posición 1 o 5 u 8.
Aún más específicamente, se refiere a nuevos compuestos de Bacitracina con actividad antibacteriana que comprenden un residuo de 5-metilen-isoleucina en la posición 1 o 5 u 8.
La invención además se refiere a nuevos compuestos de Bacitracina con actividad antibacteriana que comprenden dos residuos de 5-metilen-isoleucina en la posición 1 y 5.
La invención además se refiere a nuevos compuestos de Bacitracina con actividad antibacteriana que comprenden dos residuos de 5-metilen-isoleucina en la posición 1 y 8.
La invención además se refiere a nuevos compuestos de Bacitracina con actividad antibacteriana que comprenden dos residuos de 5-metilen-isoleucina en la posición 5 y 8.
La invención además se refiere a nuevos compuestos de Bacitracina con actividad antibacteriana que comprenden tres residuos de 5-metilen-isoleucina en la posición 1 y 5 y 8.
Las Bacitracinas que comprenden al menos un residuo 5-metilen-isoleucina en las posiciones 1, 5 u 8 se pueden usar para inhibir el crecimiento bacteriano no deseado tanto in vitro como in vivo. Estos compuestos pueden por lo tanto, tener efecto terapéutico si se administran a un animal o un humano con una infección bacteriana.
Cuando 5-metilen-isoleucina se incorpora en las bacitracinas en la posición 1, 5 u 8, la cadena lateral de aminoácido resultante es insaturada y comprende 5 átomos de carbono. Las cadenas laterales de los residuos deisoleucina y valina comprenden 4 o 3 átomos de carbono, respectivamente. El orden de elución a partir de una columna C18 es Bacitracina A, Bacitracina J1, Bacitracina J2 y Bacitracina J3 (ver Cromatogramas de la Figura 1). Por lo tanto, es razonable que la sustitución de una cadena lateral de isoleucina con la cadena lateral 5-metilen-isoleucina resulta en Bacitracinas más hidrofóbicas.
Los compuestos preferidos de esta invención son Bacitracina J1-3 producida de forma natural por Bacillus licheniformis; por ejemplo Bacitracina J1, Bacitracina J2 y Bacitracina J3 como se visualiza en la Figura 8A-8C.
Los compuestos preferidos de esta invención son Bacitracinas J1-3 con la misma estereoquímica que el producto de la fermentación natural, Bacitracina A.
Los compuestos preferidos de esta invención son las Bacitracinas J1-3, Bacitracinas K1-3 o Bacitracina L con residuos de aminoácidos en la posición 4, 7, 9 y 11 están en la configuración D (Glu, Orn, Phe y Asp).
Abreviaturas: Mil = 5-Metilen-Isoleucina Thz = Thiazolina Ala = Alanina Arg = Arginina Asn= Asparagina Asp = Ácido Aspártico Cys = Cisteína Gln =Glutamina Glu =Glutamato Phe = Fenilalanina Gly =Glicina His = Histidina Ile = Isoleucina Lys = Lisina Leu = Leucina Met = Metionina Pro = Prolina Ser = Serina Thr = Treonina Trp = Triptófano Tyr = Tirosina Val = Valina LC-MS = cromatografíalíquida-espectrometría demasa NMR = Resonancia Magnética Nuclear V = volumen M = Molar
La producción de las Bacitracinas descrita en esta solicitud, puede hacerse por síntesis en fase sólida como se describe en J Org Chem, vol. 61 núm. 12, 1996, páginas 3983-3986 de Lee y otros).
El documento de patente WO 199.747.313 describe la síntesis de péptidos de Bacitracina que podrían usarse para producir las nuevas Bacitracinas de esta invención.
Alternativamente, las nuevas bacitracinas pueden producirse a partir de las cepas de Bacillus licheniformis que producen Bacitracina y obtenerse por purificación.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A muestra un cromatograma UV a 254 nm de un lote comercial de Xellia (BANN 211412) obtenido usando una columna YMC-Pack Pro C18 (5 µm, 250 x 2,0 mm) a 30 °C. La fasemóvil consistió demetanol/acetonitrilo/0,1 M de acetato de amonio pH 6,0/agua 58:5:10:27, v/v/v/v. Las condiciones isocráticas se usaron a la velocidad de flujo de 0,2 ml/min. El volumen de inyección fue 10 µl. Excepto para Bacitracina A, se marcan tres componentes menores
denominados Bacitracina J1, Bacitracina J2 y Bacitracina J3, todos con peso molecular de 12 Da más que Bacitracina
A.
La Figura 1Bmuestra el cromatograma MS TIC correspondiente con denominaciones como en la Figura 1A.
La Figura 2A muestra la estructura de Bacitracina A, donde las asignaciones de los iones del fragmento se hacen para los iones característicos en el espectro iónico del producto más abajo. La Figura 2B muestra el espectro (MS/MS) iónico del producto de Bacitracina A, donde el ion precursor en m/z 712,0 ([M+2H]2+) se aisló y fragmentó.
La Figura 3A muestra la estructura de la parte cíclica de Bacitracina A, donde las asignaciones de los iones del fragmento se hacen para los iones característicos en el espectroiónico del producto de segunda generaciónmás abajo. La Figura 3B muestra el espectro (MS3) iónico del producto de segunda generación de Bacitracina A, donde los iones precursores consecutivos fueron m/z 712,0 ([M+2H]2+) y m/z 869,6 ([M+H]+).
La Figura 4A muestra la estructura de Bacitracina J1, donde las asignaciones de iones del fragmento se hacen para los iones característicos en el espectroiónico del productomás abajo. La Figura 4B muestra el espectro (MS/MS) iónico del producto de Bacitracina J1, donde el ion precursor en m/z 718,0 ([M+2H]2+) se aisló y fragmentó.
La Figura 5A muestra la estructura de Bacitracina J2, donde las asignaciones de iones del fragmento se hacen para los iones característicos en el espectroiónico del productomás abajo. La Figura 5B muestra el espectro (MS/MS) iónico del producto de la Bacitracina J2, donde el ion precursor en m/z 718,0 ([M+2H]2+) se aisló y fragmentó.
La Figura 6A muestra la estructura de la parte cíclica de la Bacitracina J2, donde las asignaciones de iones del fragmento se hacen para los iones característicos en el espectroiónico del producto de segunda generaciónmás abajo. La Figura 6B muestra el espectro (MS3) iónico del producto de segunda generación de Bacitracina J2, donde los iones precursores consecutivos fueron mlz 718,0 ([M+2H]2+) y mlz 881,6 ([M+H]+).
La Figura 7A muestra la estructura de Bacitracina J3, donde las asignaciones de iones del fragmento se hacen para los iones característicos en el espectroiónico del productomás abajo. La Figura 7B muestra el espectro (MS/MS) iónico del producto de Bacitracina J3, donde el ion precursor en m/z 718,0 ([M+2H]2+) se aisló y fragmentó.
La Figura 8A muestra la estructura de Bacitracina con un residuo 5-metilen-isoleucina en la posición 5 (= Bacitracina J1) La Figura 8B muestra la estructura de Bacitracina con un residuo 5-metilen-isoleucina en la posición 8 (= Bacitracina J2) La Figura 8C muestra la estructura de Bacitracina con un residuo 5-metilen-isoleucina en la posición 1 (= Bacitracina J3) La Figura 8D muestra la estructura de Bacitracina con residuos 5-metilen-isoleucina en las posiciones 5 y 8 (= Bacitracina K1) La Figura 8E muestra la estructura de Bacitracina con residuos 5-metilen-isoleucina en las posiciones 1 y 5 (= Bacitracina K2) La Figura 8F muestra la estructura de Bacitracina con residuos 5-metilen-isoleucina en las posiciones 1 y 8 (= Bacitracina K3) La Figura 8G muestra la estructura de Bacitracina con residuos 5-metilen-isoleucina en las posiciones 1 y 5 (= Bacitracina L)
La invención se define por las reivindicaciones y no por los siguientes ejemplos ilustrativos
EJEMPLOS
Experimento 1: LC-MSn
Las muestras usadas fueron lotes comerciales de Axellia Pharmaceuticals. Las muestras se disolvieron en agua a la concentración de 2mg/ml y después se filtraron a través de filtros de 0,45 µm (VWR) antes del análisis LC-MSn.
El sistema HPLC Surveyor consistió en una bomba cuaternaria, desgasificador, automuestreador termostatizado (ajustado a 5 °C) y un compartimento termostatizado de columnas (ajustado a 30 °C) y un detector de haz de diodos (ajustado a 254 nm). Las condiciones de HPLC fueron las mismas como se describe en Govaerts y otros (Rapid Communications in Mass Spectrometry, vol. 17, núm. 12, páginas 1366-1379). Una columna YMC-Pack Pro C18 (5 µm, 250 x 2.0 mm) se usó. La fase móvil consistió de metanol/acetonitrilo/0,1 M de acetato de amonio pH 6,0/agua 58:5:10:27, v/v/v/v. La solución de acetato de amonio 0,1 M se ajustó a pH 6,0 mediante la adición de ácido acético 0,1
M. Las condiciones isocráticas se usaron a la velocidad de flujo de 0,2 ml/min. El volumen de inyección fue de 10 µl. Un
espectrómetro de masas de trampa de iones LXQ lineal (Thermo Fisher) equipado con una interface ESI se conectó al sistema de HPLC. La optimización se realizó en el ion molecular protonado doblemente ([M+2H]2+) de Bacitracina A. Se establecieron los parámetros ESI como sigue: gas de impulsión 35 (unidades arbitrarias), gas auxiliar 10 (unidades arbitrarias), voltaje de pulverización 5,0 kV, temperatura del capilar 320 °C, voltaje capilar 9,0 V, voltaje de la lente tubular 95 V. Los parámetros MS se establecieron como sigue: Lente RF compensado -4,25 V, lente 0 voltaje -3,0 V, multipolo 0 compensado -4,5 V, lente 1 voltaje -8,0 V, voltaje de la lente de entrada -56 V, multipolo 1 compensado -9,5 V, RF multipolo amplitud 400 V, lente frontal voltaje -6,5 V. Los análisis LC-MS/MS-y LC-MS3 se realizaron con anchuras de aislamiento 3 y energías de colisión 16%.
Resultados
Los cromatogramas UV y MS de un lote típico (BANN 211412) de Axellia Pharmaceuticals semuestran en la Figura 1A-
B. El cromatograma UV es muy similar al cromatograma correspondiente de este lote usando el Ph.Eur incompatible LC-MS. Método HPLC. Excepto para Bacitracina A, se marcan en la Figura 1 tres componentes menores denominados Bacitracina J1, Bacitracina J2 y Bacitracina J3, todos con peso molecular de 12 Da más que Bacitracina A. La elucidación estructural de estos tres componentes se describirá en esta solicitud y su estructura dará la razón fundamental de sus denominaciones.
Bacitracina A
El ion molecular doblemente protonado ([M+2H]2+, m/z 712,0) se aisló y fragmentó y el espectro (MS/MS) iónico del producto resultante se muestra en la Figura 2B. El espectro contiene un conjunto completo de iones y" con m/z 1337,7/669,82+ (pérdida de Ile), mlz 1224,7/613,12+ (pérdida de IleThz), mlz1111,7 (pérdida de IleThzLeu), mlz 982,6/492,22+ (pérdida de IleThzLeuGlu) y m/z 869,6 (pérdida de IleThzLeuGluIle). Estas asignaciones de fragmentos se visualizan en la Figura 2A. Además de los iones b con mlz 554,5 (IleThzLeuGluIle) y mlz 441,3 (IleThzLeuGlu), los iones fragmentados que resultan de de escisiones de dobles enlaces pueden observarse en mlz 227,1 (ThzLeu), mlz356,1 (ThzLeuGlu) y en m/z 469,2 (ThzLeuGluIle).
La secuenciación dela parte cíclica de Bacitracina A se realizó además, mediante el aislamiento y fragmentación del ión fragmentado de la parte del anillo en m/z 869,6 con un experimento MS3 (712,0→869,6), ver la Figura 3B. La apertura del anillo preferencial entreOrn eIleresulta en dos series de iones de fragmentos quese muestran en la Figura 3A. Una serie comprende los iones del producto en m/z 756,5 (pérdida de Ile), mlz 609,4 (pérdida de IlePhe), mlz 472,4 (pérdida de IlePheHis) y enm/z 357,4 (pérdida de IlePheHisAsp). En la otra serie, se encuentran iones del producto en mlz 755,6 (pérdida de Orn), m/z 627,4 (pérdida de OrnLys), m/z 513,4 (pérdida de OrnLysAsn) y en m/z 398,4 (pérdida de OrnLysAsnAsp). Todos estos fragmentos de iones confirman por lo tanto la secuencia bien establecida de Bacitracina A y presenta una posibilidad para dilucidar la secuencia de análogos de Bacitracina desconocidos por comparaciones del patrón defragmentación.
Bacitracina J1
Usando la misma metodología que para Bacitracina A, podría determinarse la ubicación de una modificación responsable de la diferencia +12 Da de Bacitracina A. El ion molecular doblemente protonado ([M+2H]2+,m/z 718,0) se aisló y fragmentó y el espectro (MS/MS) iónico del producto resultante se muestra en la Figura 4B. El espectro contiene un conjunto completo de iones y" con m/z 1349,7/675,82+ (pérdida de Ile), m/z 1236,7/619,12+ (pérdida de IleThz), m/z 1123,7 (pérdida de IleThzLeu), m/z 994,6/498,12+ (pérdida de IleThzLeuGlu) y m/z 869,6 (pérdida de IleThzLeuGluMil). Estas asignaciones de fragmentos se visualizan en la Figura 4A. Además de los iones b con mlz 566,4 (IleThzLeuGluMil) y m/z 441,3 (IleThzLeuGlu), los iones fragmentados que resultan de escisiones de dobles enlaces se pueden observar en m/z227,1 (ThzLeu), m/z 356,1 (ThzLeuGlu) y en m/z 481,2 (ThzLeuGluMil).
Un experimento de LC-MS3 (718,0→869,6) dio lugar a iones fragmentados característicos similares a los del experimento correspondiente en la parte cíclica de Bacitracina A. Todos los iones fragmentados son por lo tanto, compatibles con un residuo que pesa 12 Da más que la Ile en la posición 5 en este componente, mientras que el resto de la secuencia parece que es idéntica ala Bacitracina A:s.
Bacitracina J2
Con el empleo de la misma metodología que para la Bacitracina A, se puede determinar la ubicación de una modificación responsable de la diferencia de +12 Da de Bacitracina A. El ión molecular doblemente protonado ([M+2H]2+,m/z 718,.0) se aisló y fragmentó y el espectro iónico producto resultante (MS/MS) semuestra en la Figura 5B. El espectro contiene un conjunto completo de iones y" con m/z 1349,7/675,82+ (pérdida de Ile), m/z 1236,7/619,22+(pérdida de IleThz), m/z 1123,7 (pérdida de IleThzLeu), m/z 994,6/498,12+ (pérdida de IleThzLeuGlu) and m/z 881,6 (pérdida de IleThzLeuGluIle). Estas asignaciones de fragmentos se visualizan en la Figura 5A. Además de los iones b con m/z 554,4 (IleThzLeuGluIle) y m/z 441,3 (IleThzLeuGlu), los iones fragmentados que resultan de escisiones de dobles enlaces pueden observarse en m/z227,1 (ThzLeu), m/z 356,1 (ThzLeuGlu) y en m/z 469,2 (ThzLeuGluIle). A partir de estos fragmentos se espera que la modificación de +12 Da de Bacitracina A se ubique en la porción del anillo de la molécula.
La secuenciación de la parte ciclíca de Bacitracina J2 se realizó además, mediante el aislamiento y fragmentación del ión fragmentado de la parte del anillo en m/z 881,6 con un experimento MS3 (718,0→881,6), ver Figura 6B. La apertura preferencial del anillo entre Orn e Ile resulta en dos series de iones fragmentados que se muestran en la Figura 6A. Una serie comprende los iones productos en m/z 756,4 (pérdida de Mil), m/z 609,5 (pérdida de MilPhe), m/z 472,4 (pérdida de MilPheHis) y en m/z 357,4 (pérdida de MilPheHisAsp). En la otra serie, se encuentran los iones productos en m/z 767,4 (pérdida de Orn), m/z 639,4 (pérdida de OrnLys), m/z 525,4 (pérdida de OrnLysAsn) y en m/z 410,4 (pérdida de OrnLysAsnAsp). Todos estos iones de fragmentos por lo tanto, son compatibles con un residuo que pesa 12 Da más que Ile en la posición 8 en este componente, mientras que el resto de la secuencia parece que es idéntica a la Bacitracina A.
Bacitracina J3
Con el empleo dela mismametodología quepara la Bacitracina A, puede determinarsela ubicación deuna modificación responsable de la diferencia de +12 Da de Bacitracina A. El ión molecular doblemente protonado ([M+2H]2+,m/z 718,0) se aisló y fragmentó y el espectro iónico producto resultante (MS/MS) se muestra en la Figura 7B. El espectro contiene un conjunto completo de iones y" con m/z 1337,8/669,82+ (pérdida de Mil), m/z 1224,8/613,22+(pérdida de (MilThz), m/z 1111,7 (pérdida de MilThzLeu), m/z 982,6/492,22+ (pérdida de MilThzLeuGlu) y m/z 869,6 (pérdida de MilThzLeuGluIle). Estas asignaciones de fragmento se visualizan en la Figura 7A. Además de los iones b con m/z 566,4 (MilThzLeuGluIle) y m/z 453,4 (MilThzLeuGlu), los iones fragmentados que resultan de escisiones de dobles enlaces se pueden observar en m/z227,1 (ThzLeu), m/z 356,1 (ThzLeuGlu) y en m/z 469,2 (ThzLeuGluIle).
Un experimento de LC-MS3 (718,0→869,6) dio lugar a iones fragmentados característicos similares a los del experimento correspondiente en la parte cíclica de Bacitracina A. Todos los iones fragmentados son por lo tanto, compatibles con un residuo que pesa 12 Da más que la Ile en la posición 1 en este componente, mientras que el resto de la secuencia parece que es idéntica ala Bacitracina A:s.
Experimento 2: Aislamiento delos componentes
Para esclarecer las estructuras de los tres componentes con espectroscopía de NMR, deben prepararse las muestras enriquecidas. Idealmente, cada uno de los tres componentes se debe aislar con aproximadamente 90% de pureza para obtener espectros de NMR "limpios", libre de las señales de interferencia de otros componentes. El aislamiento se hizo en dos etapas. En la primera etapa, se usó una columna LiChroprep RP-18 (25-40 µm, 35 x 5 cm) para eliminar los componentes que eluyen antes y después de los tres componentes. La fase móvil consistió en metanol/acetonitrilo/0,03 M de formiato de amonio pH 6,0 3,5:31,5:65, v/v /v. De esta manera, se obtuvo el material purificado con una pureza total de aproximadamente 25% para los tres componentes. En la segunda etapa, se usó una columna YMC-Pack ODS-A (5 µm, 250 x 10 mm) para separar los tres componentes entre sí. La fasemóvil consistió demetanol/acetonitrilo/0,025 M de acetato de amonio pH 6,0 58:5:37, v/v/v. El resultado final de esta etapa 2 de purificación fueron 4 muestras (denominadas muestras B, B', C y C'), donde las muestras B y B' fueron similares y contuvieron principalmente Bacitracina J1 y Bacitracina A, y donde las muestras C y C' fueron similares y contuvieron principalmente Bacitracina J2 y Bacitracina J3 (Tabla 1).
LC-MSn se realizó en todas las muestras para verificar que se aislaron los componentes correctos. La pureza de las muestras B y C fue mucho menor que lo que generalmente se piensa que es necesario para el esclarecimiento completo de la NMR. Sin embargo, como el otro componente principal en la muestra B fue Bacitracina A, se decidió intentar una investigación de NMR sin purificación adicional. Mediante la realización de la primera investigación de NMR de una muestra con contenido enriquecido de Bacitracina A (denominada muestra A, anteriormente preparada), se esperaba que, además de servir como compuesto de referencia, las señales de Bacitracina A pueden ser omitidas de los espectros de la muestra B. Como la muestra C contenía una mezcla de Bacitracina J2 y Bacitracina J3, no puede esperarse por anticipadola elucidación estructural completa debido a un alto grado de señales superpuestas.
Sin embargo, como se esperaban que las modificaciones en estos componentes fueran las mismas que en Bacitracina J1 (delos ensayos LC-MSn, ver Experimento 1), todavía se especuló quelos experimentos de NMR en combinación con los resultados de LC-MSn, darían suficiente evidencia estructural.
Tabla 1. Las proporciones (área-% a 254 nm) de los componentes de Bacitracina A, Bacitracina J1, Bacitracina J2 y Bacitracina J3 en lasmuestras A, B, B', C y C'.
Muestra
Bacitracina A área-% Bacitracina J1 área-% Bacitracina J2 área-% Bacitracina J3 área-%
A
93 -- -- ---
B
20 63 -- ---
B'
12 54 4 2
C
4 2 54 20
C'
-- 3 52 20
Experimento 3: Determinación delamasa exacta
Las muestras A, B' y C se analizaron mediante la determinación de la masa exacta (ver Tabla 2). La diferencia de peso molecular entre Bacitracina J1/Bacitracina A fue de 11,9998. Las diferencias de peso molecular entre ambos Bacitracina J2/Bacitracina A y Bacitracina J3/Bacitracina A fueron 12,0000, respectivamente. Esto dio una evidencia adiconal de que los componentes de Bacitracina J1, Bacitracina J2 y Bacitracina J3 tuvieron composiciones elementales que constan de un átomo de carbono (masa exacta 12,0000) más que la Bacitracina A.
Tabla 2. Masa exacta obtenida por determinaciones exactas demasa en las muestras A, B' y C.
Muestra
Bacitracina A Masa exacta Bacitracina J1 Masa exacta Bacitracina J2 y Bacitracina J3 Masa exacta
A
1421,7560
B'
1433,7558
C
1433,7560
Experimento 4: NMR
35 Los espectros de RMN se registraron en soluciones 10 mM de las muestras A, B y C en 95% de tampón fosfato pH 6,5 / 5% de D2O a 303 K. Se obtuvieron los experimentos en un espectrómetro Bruker 600 MHz utilizando secuencias de pulso estándar para los experimentos de correlación de desplazamiento químico de protones homonuclear bidimensional (DQF-COSY, TOCSY, NOESY), correlación heteronuclear1H-13C (HSQC, HMBC) y correlación heteronuclear 1H-15N (HSQC). Se usaron tiempos de mezcla de 20 ms y 60 ms para los experimentos de TOCSY y tiemposde100ms,200ms,400msy600msdemezclaseusaronenlosexperimentosNOESY. ParalamuestraC,se obtuvo un experimento DEPT (135). Los desplazamientos químicos se informan en p.p.m., usando ácido 2,2-dimetil-2silapentano-5-sulfónico(0,5mM) como referencia interna.
45 Resultados
Muestra A (Bacitracina A)
Identificación de los sistemas de giro de aminoácidos se realizaron mediante los experimentos de correlación de desplazamiento químico (DQF-COSY y TOCSY) de 2D1H-1H correlación de desplazamiento químico heteronuclear (HSQC)de 1H-13Cy 1H-15Nenelmododetectado 1HylosdatosseresumenenlaTabla3.Losdatosdedesplazamiento químico son consistentes con la presencia de residuos de Ile, Thz, Leu, Glu, Ile, Lys, Orn, Ile, Phe, His, Asp y Asn, tanto de las comparaciones de los datos de desplazamiento químico de 1H en Kobayashi y otros. (1992) (ver Tabla 3) como las estadísticas de desplazamiento químico que se encuentran en la base de datos BMRB (ver Tabla 3).
55 La secuencia de los residuos de aminoácidos se estableció a partir de los experimentos de correlación 2D 1H-1H (NOESY, Tabla 4) y 1H-13C (HMBC, Tabla 5). El acoplamiento dipolar (a través del espacio, NOESY) y acoplamiento escalar de largo alcance(HMBC) estuvieron de acuerdo conla secuencia bien establecida de Bacitracina A:
Tabla 3. Desplazamientos químicos 1H, 13C y 15N para Bacitracina A (en la muestra A) y Bacitracina J1 (en la muestra B). Los datos se registraron en 95% de tampón fosfato pH 6,5 / 5% D2O a 303 K. Los desplazamientos químicos se informaron en p.p.m., usando ácido 2,2-Dimetil-2-silapentano-5-sulfónico (0,5mM) como referencia interna.
Residuo
Nombre atómico a Desplazamiento de Bacitracina A observado Desplazamiento de Bacitracina J1 observado Desplazamiento de Bacitracina A de la publicación b Estadística del desplazamiento químico c
Ile1
H - - - 8.28
HA 4,30 4,31 4,35 4,18
HB 2,08 2,09 2,09 1,79
HG12 1,50 1,50 1,50 1,27
HG13 1,28 1,28 1,31 1,21
HG2 1,05 1,06 1,07 0,78
HD1 0,95 0,96 0,97 0,68
C 175,2 175,1 - 175,89
CA 60,2 60,2 - 61,63
CB 39,7 39,6 - 38,61
CG1 26,6 26,7 - 27,74
CG2 17,0 16,9 - 17,54
CD1 13,6 13,6 - 13,46
N - - - 121,51
Thz2
H - - -
HA 5,25 5,24 5,28
HB2 3,79 3,79 3,79
HB3 3,60 3,61 3,59
HG - -
C 175,6 175,5 -
CA 79,9 79,9 -
CB 38,6 38,6 -
N - -
Leu3
H 8,19 8,20 8,16 8,22
HA 4,44 4,44 4,52 4,31
HB2 1,69 1,70 1,61 1,62
HB3 1,60 1,60 1,61 1,54
HG 1,58 1,59 1,71 1,51
HD1 0,92 0,92 0,94 0,76
HD2 0,86 0,88 0,89 0,74
C 177,5 177,6 - 177,01
CA 55,4 55,5 - 55,66
CB 42,9 42,8 - 42,29
CG 27,1 27,0 - 26,80
CD1 24,8 24,9 - 24,68
CD2 23,5 23,5 - 24,10
N 124,1 124,2 - 121,85
Glu4
H 8,82 8,84 8,67 8,33
HA 4,26 4,26 4,43 4,25
HB2 2,06 2,08 2,16 2,03
HB3 1,94 1,94 2,01 2,00
HG2 2,27 2,28 2,46 2,28
HG3 2,27 2,28 2,46 2,26
C 176,7 176,5 - 176,93
CA 57,1 56,9 - 57,36
CB 30,1 30,1 - 30,00
CG 36,2 36,1 - 36,09
CD 183,8 183,6 - 182,57
N 121,4 121,4 - 120,68
Ile5
H 8,16 - 8,07 8,28
HA 4,12 - 4,16 4,18
HB 1,82 - 1,65 1,79
HG12 1,37 - 1,39 1,27
HG13 1,12 - 1,14 1,21
HG2 0,82 - 0,85 0,78
HD1 0,81 - 0,83 0,68
C 176,0 - - 175,89
CA 61,2 - - 61,63
CB 38,5 - - 38,61
CG1 27,1 - - 27,74
CG2 17,4 - - 17,54
CD1 12,9 - - 13,46
N 120,2 - - 121,51
Lys6
H 8,31 8,33 8,29 8,19
HA 4,26 4,27 4,31 4,26
HB2 1,81 1,81 1,82 1,78
HB3 1,71 1,70 1,82 1,75
HG2 1,38 1,39 1,34 1,37
HG3 1,29 1,29 1,33 1,36
HD2 1,51 1,51 1,52 1,61
HD3 1,51 1,51 1,52 1,60
HE2 3,21 3,21 3,28 2,92
HE3 3,21 3,21 3,20 2,91
HZ 8,04 8,04 7,83 7,42
C 175,7 176,4 - 176,68
CA 56,9 56,8 - 56,97
CB 33,1 33,2 - 32,78
CG 24,6 24,7 - 24,93
CD 29,8 29,8 - 28,96
CE 41,5 41,6 - 41,91
N 121,0 121,1 - 121,07
Orn7
H 8,18 8,23 8,11 -
HA 4,44 4,44 4,48 -
HB2 1,87 1,87 1,70 -
HB3 1,78 1,77 1,70 -
HG2 1,67 1,68 1,86 -
HG3 1,67 1,68 1,77 -
HD2 3,01 3,01 3,04 -
HD3 3,01 3,01 3,04 -
HE - - 7,58 -
C 175,7 175,7 - -
CA 55,4 55,5 - -
CB 31,3 31,2 - -
CG 26,1 26,1 - -
CD 41,9 41,8 - -
N 119,9 120,0 - -
NE - - - -
Ile8
H 8,31 8,32 8,17 8,28
HA 4,10 4,09 4,17 4,18
HB 1,70 1,69 1,72 1,79
HG12 1,20 1,21 1,22 1,27
HG13 0,96 0,97 0,99 1,21
HG2 0,56 0,56 0,60 0,78
HD1 0,75 0,75 0,76 0,68
C 176,1 176,1 - 175,89
CA 61,2 61,3 - 61,63
CB 38,5 38,5 - 38,61
CG1 27,1 27,0 - 27,74
CG2 17,1 17,1 - 17,54
CD1 13,0 13,0 - 13,46
N 124,7 125,0 - 121,51
Phe9
H 8,62 8,65 8,55 8,36
HA 4,64 4,64 4,65 4,62
HB2 3,15 3,16 3,19 3,00
HB3 2,86 2,86 2,90 2,95
HD1 7,22 7,23 7,22 7,06
HD2 7,22 7,23 7,22 7,06
HE1 7,33 7,34 7,31 7,09
HE2 7,33 7,34 7,31 7,08
HZ 7,28 7,28 7,26 7,01
C 175,3 175,3 - 175,48
CA 57,8 57,8 - 58,13
CB 39,9 39,9 - 39,93
CG 139,0 139,0 - 138,26
CD1 131,8 131,8 - 131,54
CD2 131,8 131,8 - 131,60
CE1 131,5 131,5 - 130,67
CE2 131,5 131,5 - 130,76
CZ 129,9 129,9 - 129,23
N 125,0 125,1 - 120,51
His10
H 8,54 8,55 8,59 8,23
HA 4,81 4,82 4,82 4,61
HB2 3,20 3,22 3,30 3,11
HB3 2,96 2,97 3,03 3,05
HD1 - - - 8,85
HD2 6,97 6,99 8,55 7,03
HE1 8,45 8,55 7,03 7,98
HE2 - - - 9,82
C 174,0 173,8 - 175,28
CA 55,2 55,1 - 56,49
CB 30,6 30,3 - 30,19
CG 131,4 131,0 - 131,49
CD2 120,3 120,2 - 120,46
CE1 137,0 136,6 - 137,53
N 119,8 119,6 - 119,56
ND1 - - - 195,69
NE2 - - - 182,33
Asp11
H 8,66 8,69 8,75 8,31
HA 4.64 4,65 4,73 4,60
HB2 2,66 2,68 2,87 2,72
HB3 2,61 2,61 2,79 2,67
C 175,8 175,7 - 176,44
CA 54,5 54,4 - 54,68
CB 41,7 41,6 - 40,87
CG 180,0 180,0 - 179,27
N 121,5 121,4 - 120,69
Asn12
H 8,66 8,66 8,61 8,35
HA 4,64 4,64 4,70 4,67
HB2 2,81 2,82 2,91 2,81
HB3 2,73 2,74 2,83 2,76
HD21 7,63 7,63 7,59 7,35
HD22 6,97 6,97 7,12 7,14
C 174,9 174,9 - 175,31
CA 53,8 53,8 - 53,55
CB 39,2 39,2 - 38,68
CG 177,3 177,3 - 176,77
N 119,0 118,9 - 118,97
ND2 113,3 113,3 - 112,79
Mil5
H - 8,19 - -
HA - 4,11 - -
HB - 1,98 - -
HG12 - 2,10 - -
HG13 - 1,90 - -
HG2 - 0,82 - -
HD - 5,72 - -
HE1 - 5,06 - -
HE2 - 5,06 - -
C - 175,7 - -
CA - 60,8 - -
CB - 36,7 - -
CG1 - 38,8 - -
CG2 - 17,9 - -
CD - 138,2 - -
CE - 120,1 - -
N - 119,9 - -
a. Nomenclatura de acuerdo con recomendaciones de la IUPAC para la presentación de estructuras por NMR de
proteínas y ácidos nucleicos. 65 b. Kobayashi y otros (1992) FEBS Lett. 2, 105-09.
c. Base de datos de BMRB: Las estadísticas calculadas para los desplazamientos químicos seleccionados. http://www.bmrb.wisc.edu/ref_info/statsel.htm
Tabla 4. Datos de protones NOE para Bacitracina A (en la muestra A) y Bacitracina J1 (en la muestra B). Las mediciones se realizaron a partir de experimentos NOESY.
Protón de la cadena principal amida
Protón observado
Intraresiduo NOE
Interresiduo NOE
Leu3
HA HA de Thz2
Glu4
HA HA de Leu3
Ile5
HA HA de Glu4
Lys6
HA HA de Ile5
Orn7
HA HA de Lys6
Ile8
HA HA de Orn7
Phe9
HA HA de Ile8
His10
HA HA de Phe9
Asp11
HA HA de His10
Asn12
HA HA de Asp11
Lys6 a
HE2/HE3 HA de Asn12
Mil5 b
HA HA de Glu4
Lys6 b
HA HA de Mil5
a.
Protón de la cadena lateral amida.
b.
Datos NOE que ocurren sólo para Bacitracina J1.
Tabla 5. Las conectividades inter-e intraresiduo 2JH,C de los carbonos carbonilos de Bacitracina A (en la muestra A) y 35 BacitracinaJ1(enlamuestraB).LasmedidasfueronhechasdeexperimentosHMBC.
Carbono de carbonilo
Intraresiduo de protones Interresiduo de protones
Ile1 a
HA HA de Thz2
Thz2
HA H de Leu3
Leu3
HA H de Glu4
Glu4
HA H de Ile5
Ile5
HA H de Lys6
Lys6
HA H de Orn7
Orn7
HA H de Ile8
Ile8
HA H de Phe9
Phe9
HA H de His10
His10
HA H de Asp11
Asp11
HA H de Asn12
Asn12
HA HZ de Lys6
Glu4 b
HA H de Mil5
Mil5 b
HA H de Lys6
a.
Carbono de carbonilo condensado en el anillo de 2-tiazolina.
b.
Datos HMBC que ocurren sólo para Bacitracina J1.
Muestra B (Bacitracina J1) 18
La identificación de los sistemas de giro de los aminoácidos se realizaron mediante experimentos de desplazamiento químico 2D1H-1H (DQF-COSY y TOCSY) y correlación de desplazamiento químico heteronuclear 1H-(DQF-COSY y TOCSY)13C y 1H-15N (HSQC) en el modo detectado 1H y los datos se resumen en la Tabla 3. Los datos de desplazamiento químico para los residuos de Ile, Thz, Leu, Glu, Lys, Orn, Ile, Phe, His, Asp y Asn son casi idénticos a los datos correspondientes para Bacitracina A, lo que indica que los mismos residuos se encuentran sin modificar en el principal componente de la muestra B. Notablemente, el sistema de giro correspondiente a Ile5 en Bacitracina A fue significativamente más débil en esta muestra en comparación con la muestra A (recordar que la muestra B contenía aproximadamente 20% de Bacitracina A).
Además de estas señales, un sistema de giro acoplado 3JH,Hse encontró con resonancias en δ 8.19 (protones de la cadena principal amida), 5,72, 5,06, 4,11, 2,10, 1,98, 1,90 y 0,82. Cruzamiento de picos HSQC en δ 5,72/138,2, δ 5,06/120,1, δ 4,11/60,8, δ 2,10/38,8, δ 1,90/38,8, δ 1,98/36,7 y en δ 0,82/17,9 indicó al menos seis grupos CHx.
Cruzamiento de picos COSY en δ 8,19/4,11, δ 4,11/1,98, δ 1,98/0,82 y cruzamiento de picos HMBC en δ 8,19/60,8, δ 4,11/175,7, δ 4,11/36,7, δ 4,11/17,9, δ 0,82/60,8 y en δ 0,82/36,7 evidenció el siguiente elemento NHCH(CO)CHCH3, que se apoyó además con las correlaciones NOE esperadas.
Cruzamiento de picos COSY en δ 2,10/1,90 y cruzamiento de picos HMBC en δ 4,11/38,8, δ 0,82/38,8, δ 1,90/36,7 y en δ 1,90/17,9 evidenció el siguiente elemento NHCH(CO)CH(CH3)CH2, que se apoyó además con las correlaciones NOE esperadas.
Cruzamiento de picos COSY en δ 5,72/2,10, δ 5,72/1,90, δ 5,72/5,06 y cruzamiento de picos HMBC en δ 5,72/38,8, δ 1,90/138,2, δ 5,06/38,8 y en δ 1,90/120,1 evidenció el siguiente nuevo elemento -NHCH(CO)CH(CH3)CH2CH=CH2, que se apoyó además con las correlaciones NOE esperadas. Todos los datos de desplazamiento químico de este aminoácido análogoinusual a Ile son similares alos datos predichos generados por ChemDraw (datos no mostrados).
La secuencia de los residuos de aminoácidos se estableció a partir de los eperimentos de correlación 2D 1H-1H (NOESY, Tabla 4) y 1H-13C (HMBC, Tabla 5). Se encontró que la secuencia de aminoácidos fue la misma que en Bacitracina A, donde el análogo Ile inusual (denominado 5-metilen-Isoleucina) sustituye a Ile en la posición 5. Los datos NMR están por lo tanto, de acuerdo con los resultados de LC-MSn y la determinación de la masa exacta, donde todos los datos indican la presencia del siguiente análogo de Bacitracina A en lamuestra A:
Estructura 2. Bacitracina J1
Muestra C (Bacitracina J2 y Bacitracina J3)
Los datos de NMR evidenciaron la presencia de dos residuos del mismo análogo Ile inusual que estuvo presente en la muestra B (ver la Tabla 6). Además de los experimentos 2D que se adquirieron para las muestras A y B, un experimento DEPT(135) se llevó a cabo también en la muestra C (Tabla 6). Este experimento verificó además la estructura de los dos aminoácidos análogos inusuales e idénticos a Ile en la muestra C. Uno de estos análogos Ile se situó en el extremo N-terminal (como se indica por su falta visible de protones de la cadena principal amida), y fue correspondientemente denotado 5-metilen-Isoleucina1. El otro análogo Ile se encuentra en la posición 8, como se evidenció mediante las correlaciones NOESY y HMBC, y por lo tanto, se denota 5-metilen-Isoleucina8. Los datos de NMR están, por lo tanto, de
acuerdo con los resultados de LC-MSn la determinación de la masa exacta. Todos los datos indican la presencia de dos análogos de bacitracina A en la muestra C, donde el el análogo Ile inusual reemplaza a Ile en la posición 8 en un análogo de Bacitracina A, y donde el análogo Ile inusual reemplaza a Ile en la posición 1 en el segundo análogo de Bacitracina A:
Estructura 3. Bacitracina J2
Estructura 4. Bacitracina J3
Tabla 6. Desplazamientos químicos 1H, 13C y 15N y datos DEPT(135) para la Bacitracina J2 y Bacitracina J3 (en la 55 muestra C). Los datos registrados en 95% de tampón fosfato pH 6,5 / 5% D2O a 303 K. Los desplazamientos químicos se informan en p.p.m., usando ácido 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfónico (0,5mM) como referencia intena.
Residuo
Nombre atómico a Desplazamiento de Bacitracina J2 observado Desplazamiento de Bacitracina J3 observa Señal DEPT(135) Asignación DEPT(135)
Mil8
H 8,26
HA 4,12
HB 1,87
HG12 1,99
HG13 1,77
HG2 0,56
HD 5,67
HE1 5,03
HE2 5,03
C 175,8 - C
CA 60,8 Positivo CH
CB 36,8 Positivo CH
CG1 38,8 Negativo CH2
CG2 17,7 Positivo CH3
CD 138,6 Positivo CH
CE 119,7 Negativo CH2
N 124,5
Mil1
H -
HA 4,33
HB 2,27
HG12 2,26
HG13 2,07
HG2 1,06
HD 5,82
HE1 5,16
HE2 5,16
C 174,7 - C
CA 59,6 Positivo CH
CB 37,9 Positivo CH
CG1 38,2 Negativo CH2
CG2 17,2 Positivo CH3
CD 138,2 Positivo CH
CE 120,4 Negativo CH2
N -
a. Nomenclatura de acuerdo con las recomendaciones de la IUPAC para la presentación de estructuras de NMR de proteínas y ácidos nucleicos.
Experimento 5: Potencia
La actividad antibacteriana de las muestras A, B' y C' (ver la Tabla 1) se midió. La actividad antibacteriana específica (que se enumera en la presente como IU/mg), denominada frecuentemente potencia, se midió mediante la comparación 65 de la actividad antibacteriana de la muestra desconocida con respecto a las muestras conocidas (estándar). Específicamente, un estándar de bacitracina de zinc se disolvió y se diluyó a 2,0, 1,0, y 0,5 UI de bacitracina/ml en 0,07
M de tampón fosfato pH 6,0. Estas tres soluciones estándar se añadieron a placas de agar inoculadas con el organismo deprueba, Micrococcus luteus. Lasmuestras desconocidas sedisolvieron, diluyeron y añadieron a lamisma placa como los estándares. Después de 16-24 horas a 32-37 C, semidieron las zonas de inhibición y las muestras desconocidas se compararon con los estándares. Los resultados (informados como IU/mg) de cada muestra se enumeran en la Tabla 7.
Tabla 7 Potencia (actividad antibacteriana específica, UI/mg) de las muestras aisladas. Organismo Prueba: Micrococcus luteus.
Muestra
Potencia (IU/mg)
A
72
B'
53
C'
60
La muestra A contenía, como se enumeró en la Tabla 1, 93% (medido con HPLC a 254 nm) de Bacitracina A (y no Bacitracina J1, J2 o J3). La actividad antibacteriana específica de Bacitracina A se puede calcular después a 77,4 IU/mg. Esta es más baja que la anteriormente informada. Las posibles explicaciones pueden ser agua o contenido de
20 sales, así como los posibles efectos antagonistas de los componentes menores. Como las muestras B' y C' contienen mezclas de diversas Bacitracinas, no es posible informar una actividad antimicrobiana exacta específica (UI/mg) de las Bacitracinas J1, J2 o J3. Sin embargo, los datos disponibles indican fuertemente que las potencias de Bacitracina J1, J2 y J3 son similares o superiores a la de Bacitracina A. También, las muestras B' y C' pueden contener agua, sal y/o componentes que tienen efectos sinérgicos o antagónicos.

Claims (12)

  1. Reivindicaciones
    1. Un compuesto representado por la Fórmula
    25 en donde al menos uno de R1, R2 y R3 es -CH=CH2, y
    en donde R1, R2 y R3 son independientemente -H, -CH3, o -CH=CH2, y 30 sales e hidratos de estos.
  2. 2. Uncompuestodeacuerdoconlareivindicación1,endondeunodeR1,R2yR3es-CH3.
  3. 3. Uncompuestodeacuerdoconlareivindicación1,endondedosdeR1,R2yR3son-CH3. 35
  4. 4.
    Uncompuestodeacuerdoconlareivindicación1,endondeR1es-CH=CH2.
  5. 5.
    Uncompuestodeacuerdoconlareivindicación1,endondeR2es-CH=CH2.
    40 6. Uncompuestodeacuerdoconlareivindicación1,endondeR3es-CH=CH2.
  6. 7. Uncompuestodeacuerdoconlareivindicación1,endondeR1yR2son-CH=CH2.
  7. 8.
    Uncompuestodeacuerdoconlareivindicación1,endondeR2yR3son-CH=CH2. 45
  8. 9. Uncompuestodeacuerdoconlareivindicación1,endondeR1yR3son-CH=CH2.
  9. 10.
    Uncompuestodeacuerdoconlareivindicación1,endondeunodeR1,R2yR3son-CH=CH2. 50 11. Una composición que comprende el compuesto de la reivindicación 1.
  10. 12. Unacomposiciónfarmacéuticaquecomprendeelcompuestodelareivindicación1.
  11. 13. El uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para la preparación del medicamento para el 55 tratamientodelasinfeccionesbacterianas.
  12. 14. Método para la producción de compuestos de acuerdo con la reivindicación 1 mediante la sustitución de isoleucina o valina con 5-metilen-isoleucina durantela síntesis in vitro de Bacitracina.
    Figura 2B
    Figura 3B
    Figura 4B
    Figura 5B
    Figura 6B
    Figura 7B
ES10765613.4T 2009-10-28 2010-09-30 Nuevos antibióticos de bacitracina Active ES2588205T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25551709P 2009-10-28 2009-10-28
US255517P 2009-10-28
PCT/EP2010/064523 WO2011051073A1 (en) 2009-10-28 2010-09-30 New bacitracin antibiotics

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2588205T3 true ES2588205T3 (es) 2016-10-31

Family

ID=43417043

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10765613.4T Active ES2588205T3 (es) 2009-10-28 2010-09-30 Nuevos antibióticos de bacitracina

Country Status (21)

Country Link
US (1) US8410044B2 (es)
EP (1) EP2493493B1 (es)
JP (1) JP5763082B2 (es)
KR (1) KR20120097379A (es)
CN (1) CN102596218B (es)
AU (1) AU2010311762B2 (es)
BR (1) BR112012009943A2 (es)
CA (1) CA2774590A1 (es)
CY (1) CY1118233T1 (es)
DK (1) DK2493493T3 (es)
ES (1) ES2588205T3 (es)
HR (1) HRP20161020T1 (es)
HU (1) HUE029412T2 (es)
IL (1) IL219183A (es)
IN (1) IN2012DN01971A (es)
LT (1) LT2493493T (es)
PL (1) PL2493493T3 (es)
PT (1) PT2493493T (es)
RU (1) RU2536588C2 (es)
SI (1) SI2493493T1 (es)
WO (1) WO2011051073A1 (es)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120093310A (ko) * 2009-10-28 2012-08-22 셀리아 파마슈티칼즈 에이피에스 2-아미노-3-메틸-헥스-5-에노산 및 바시트라신과 같은 펩티드의 생산에서의 이의 용도
CN109444318B (zh) * 2018-12-03 2021-04-27 上海市食品药品检验研究院 一种用于分析杆菌肽组分的高效液相色谱方法
CN111057131A (zh) * 2019-12-13 2020-04-24 上海市食品药品检验所 一种杆菌肽及其组分的分析方法
CN111678996A (zh) * 2020-04-26 2020-09-18 上海市食品药品检验所 杆菌肽氧化组分及其分析方法和双键磺酸化半胱氨酸氧化组分的碎裂模式

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5300491A (en) 1991-10-31 1994-04-05 Apothekernes Laboratorium A.S. Treatment of protozoal infection
WO1997047313A1 (en) 1996-06-10 1997-12-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Total synthesis of bacitracin polypetides

Also Published As

Publication number Publication date
JP5763082B2 (ja) 2015-08-12
IN2012DN01971A (es) 2015-08-21
PL2493493T3 (pl) 2017-01-31
US8410044B2 (en) 2013-04-02
CN102596218B (zh) 2014-10-22
EP2493493B1 (en) 2016-07-06
DK2493493T3 (en) 2016-09-05
KR20120097379A (ko) 2012-09-03
HRP20161020T1 (hr) 2016-10-21
CY1118233T1 (el) 2017-06-28
HUE029412T2 (en) 2017-02-28
AU2010311762A1 (en) 2012-03-29
RU2536588C2 (ru) 2014-12-27
PT2493493T (pt) 2016-08-31
WO2011051073A1 (en) 2011-05-05
US20120202737A1 (en) 2012-08-09
AU2010311762B2 (en) 2015-09-24
CN102596218A (zh) 2012-07-18
IL219183A (en) 2015-04-30
BR112012009943A2 (pt) 2019-09-24
LT2493493T (lt) 2016-09-26
EP2493493A1 (en) 2012-09-05
JP2013509367A (ja) 2013-03-14
IL219183A0 (en) 2012-06-28
SI2493493T1 (sl) 2016-10-28
CA2774590A1 (en) 2011-05-05
RU2012120614A (ru) 2013-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115785124B (zh) Kras g12d抑制剂及其用途
RU2603345C2 (ru) Циклопептидное соединение высокой чистоты, а также способ его получения и его применение
US8575094B2 (en) Use of type-B lantibiotic-based compounds having antimicrobial activity
CN104918951B (zh) 多粘菌素、组合物、制备方法和使用方法
KR20110011704A (ko) 카스포펀진 불순물 ａ를 함유하지 않는 카스포펀진
US20250122153A1 (en) Protease Inhibitors as Antivirals
WO2018006063A1 (en) Compositions and methods for the treatment of bacterial infections
WO2017218922A2 (en) Compositions and methods for the treatment of bacterial infections
AU2010311762B2 (en) New Bacitracin antibiotics
EP3111948A1 (en) New bicyclic lipopeptide, preparation and use as antimicrobial agent
CN111187202A (zh) Nmda拮抗剂前药
US9919021B2 (en) Brain permeant peptidomimetic beta-secretase 1 inhibitors for the treatment or prophylaxis of neurological disorders or conditions
US7285619B2 (en) Echinocandin derivatives, their method of preparation and their application as anti-fungal agents
WO2016130969A1 (en) Silstatin compounds
IL322471A (en) Oxydiofungin analogs and methods of production and use
KR20230048130A (ko) 시클릭 케메린-9 유도체
US20160318892A1 (en) Prodrug compounds
WO2025106608A2 (en) Antiviral structurally stapled influenza peptides and uses thereof
HK40089336A (zh) 环状趋化素-9衍生物