ES2588253T3

ES2588253T3 - Método de detección de oligonucleótidos

Info

Publication number: ES2588253T3
Application number: ES09783760.3T
Authority: ES
Inventors: Ingo Roehl; Markus Schuster; Stephan Seiffert
Original assignee: Axolabs GmbH
Current assignee: Axolabs GmbH
Priority date: 2008-10-15
Filing date: 2009-10-06
Publication date: 2016-10-31
Anticipated expiration: 2029-10-06
Also published as: EP3085794B1; ES2794401T3; DK2337860T3; US20180312909A1; EP3085794A1; US10711298B2; CA2739672A1; WO2010043512A1; EP2337860B1; JP2012505644A; US20110201006A1; CN102186993A; EP2337860A1; CA2739672C; DK3085794T3

Abstract

Método para detectar un oligonucleótido y sus metabolitos de oligonucleótido, en el que el oligonucleótido es un oligonucleótido de ARN seleccionado del grupo que consiste en ARN de interferencia cortos (ARNic) y microARN (miARN), que comprende las etapas de (a) seleccionar una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene dicho oligonucleótido de ARN, en el que la muestra es lisado tisular o plasma, (b) combinar dicha muestra biológica con una sonda de ácido nucleico peptídico (PNA) marcada fluorescentemente que es completamente complementaria a al menos 10 nucleótidos de dicho oligonucleótido de ARN formando de ese modo restos hibridados entre dicha secuencia de oligonucleótido de ARN y dicha sonda de PNA, (c) separar dichos restos hibridados de los restos no hibridados mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento de intercambio aniónico (HPLC) en condiciones en las que la sonda de PNA no hibridada se eluye en el volumen inicial, y (d) detectar cuantitativamente dichos restos hibridados mediante espectroscopía de fluorescencia.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de detection de oligonucleotidos Description

La presente invention se refiere a un nuevo metodo simplificado para la deteccion de un oligonucleotido y sus metabolitos de oligonucleotido, en el que el oligonucleotido es un oligonucleotido de ARN seleccionado del grupo de ARN de interferencia corto (ARNic) y microARN (miARN). Ademas, la presente invention se refiere a un metodo la deteccion simultanea de ambas hebras de un oligonucleotido bicatenario en una unica medicion, por ejemplo, para ARNic.

Se usan comunmente oligonucleotidos de secuencias conocidas en una amplia variedad de aplicaciones qulmicas y biologicas, y tambien han alcanzado alta importancia en el diagnostico y tratamiento de enfermedades. En particular, oligonucleotidos antisentido, ARN de interferencia corto (ARNic) y aptameros son herramientas farmacologicas y agentes terapeuticos prometedores. La deteccion cualitativa y cuantitativa de estos oligonucleotidos en muestras como celulas, tejido, sangre o plasma es un requisito previo para evaluar su uso terapeutico y para monitorizar su estabilidad in vivo.

En la bibliografla se mencionan diferentes metodos para la deteccion de oligonucleotidos y se dan a conocer en solicitudes de patente publicadas, por ejemplo, WO/2008/046645. La mayorla de los procedimientos establecidos para la deteccion cuantitativa y cualitativa de oligonucleotidos se basan en hibridacion con oligonucleotidos complementarios por medio de apareamiento de bases de Watson-Crick. Los acidos nucleicos peptldicos (PNA) son mimeticos de oligonucleotido en los que la estructura principal de azucar se reemplaza por una cadena pseudopeptldica de monomeros de N-aminoetilglicina. Se usan a menudo en metodos de deteccion de oligonucleotidos basados en sonda ya que se unen a secuencias de ADN o ARN complementarias con alta afinidad, especificidad y estabilidad (patente estadounidense 6.395.474). El documento WO/2008/046645 menciona el uso de sondas de pNa en un ensayo de deteccion de oligonucleotidos basado en RT-PCR. La patente estadounidense 6.045.995 describe la deteccion cualitativa y cuantitativa de oligonucleotidos mediante electroforesis en gel capilar. Rossi et al describen la identification de oligonucleotidos amplificados por PCR mediante sondas de PNA en cromatografla de llquidos de alto rendimiento de intercambio anionico (HPLC) (J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 25092516).

Sin embargo, la mayorla de los ensayos existentes para determinar oligonucleotidos en muestras biologicas no pueden detectar metabolitos o separar las senales de metabolitos de la senal generada por el oligonucleotido intacto. Por ejemplo, en metodos basados en PCR, se generan habitualmente senales del farmaco intacto solo o como la suma de diversos metabolitos junto con el farmaco intacto. La electroforesis en gel capilar con deteccion de fluorescencia conduce a una separation cuantitativa de oligonucleotido intacto de sus metabolitos, pero esta metodologla necesita etapas de extraction y desalacion durante la preparation de la muestra. Ademas, las recuperaciones de las moleculas de analito son variables y es necesario un patron interno para la normalization. Otra limitation importante de los metodos de deteccion de oligonucleotidos usados actualmente es que solo puede detectarse una de las dos hebras en una medicion, los que es particularmente desventajoso para la determination de duplex de oligonucleotidos (por ejemplo, ARNic).

Por tanto, serla de gran ventaja disponer de un metodo reproducible y rapido para la deteccion de oligonucleotidos en muestras que pueda analizar oligonucleotidos y sus metabolitos en una muestra. Ademas, en vista de la importancia creciente de ARNic y sus derivados en terapia y diagnosticos, existe la necesidad de un metodo reproducible y rapido que pueda detectar ambas hebras del oligonucleotido y sus metabolitos en una medicion. Se da a conocer un metodo para la deteccion cuantitativa de un oligonucleotido y sus metabolitos de oligonucleotido, que comprende las etapas de seleccionar una muestra que contiene o se sospecha que contiene dicho oligonucleotido, formar una mezcla de hibridacion poniendo en contacto la muestra con una sonda de acido nucleico peptldico (PNA) marcada fluorescentemente que es completamente complementaria a al menos 10 o mas nucleotidos de dicho oligonucleotido, separar los restos hibridados formados entre dicho oligonucleotido y dicha sonda de PNA de los restos no hibridados mediante cromatografla de llquidos de alto rendimiento de intercambio anionico (alEX-HPLC), y detectar cualitativa y/o cuantitativamente dichos restos hibridados mediante espectroscopla de fluorescencia. Una ventaja importante de la presente invention con respecto a otros metodos de deteccion de oligonucleotidos es la preparation sencilla de la muestra antes de la deteccion, por ejemplo, sin que se requieran procedimientos de limpieza, etapas de amplification o extraction. Por tanto, se evita cualquier variabilidad con respecto a la recuperation del analito. En realizaciones preferidas la muestra se trata con proteinasa K en un tampon que contiene SDS, seguido por precipitation del sDs con una disolucion de KCl saturada. De ese modo se evita eficazmente la degradation de los oligonucleotidos en la muestra.

La sonda de PNA no hibridada en exceso se eluye en el volumen inicial de la HPLC y no se espera que la sonda produzca senales de interferencia durante la separation en gradiente. Por tanto, puede usarse un gran exceso de la sonda de PNA para controlar cineticamente el proceso de hibridacion sin establecer una etapa para extraer la sonda

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en exceso de la muestra. El uso de la sonda de PNA tambien elimina la fluorescencia de fondo completa de la matriz biologica, ya que se eluye con el volumen inicial de la aIEX-HPLC. Tambien las senales generadas a partir de la hibridacion no especlfica de la sonda de PNA con ARN procedente de la matriz biologica se eluye por separado en la etapa de lavado del gradiente de HPLC. Por tanto solo pueden detectarse senales especlficas del analito durante el gradiente de HPLC con alta selectividad. Por tanto, el sistema de alEX-HPLX funciona de manera muy robusta incluso si se carga con alto fondo biologico.

Debido a la estructura principal no cargada del PNA, muestra alta afinidad con la hebra de oligonucleotido correspondiente (sin repulsion electrostatica como para duplex de ADN/ADN, ADN/ARN y ARN/ARN) lo que conduce a una hibridacion controlada termodinamicamente incluso en presencia de una hebra de ARN competidora como en el caso de duplex de ARNic. Otra mejora importante de este metodo con respecto a otros metodos es la capacidad de detectar metabolitos y separar las senales de metabolitos de la senal generada por el oligonucleotido intacto. El mayor poder de separation para los metabolitos es otro resultado de la estructura principal no cargada de la sonda de PNA. La elucion depende fuertemente de la longitud del metabolito, cuanto mas corto es el metabolito, mas facilmente se eluye de la columna de HPLC dentro del gradiente. Ademas, puede separarse un oligonucleotido fosforilado en 5' de la secuencia identica no fosforilada de la misma longitud. Puesto que la fosforilacion en 5' se produce solo tras el suministro del ARNic a la celula, puede usarse esto para distinguir el ARNic extracelular del suministrado intracelularmente en tejidos. Entonces el ARNic fosforilado en 5' intracelular puede servir como marcador para la cantidad de farmaco activo en tejido en comparacion con la cantidad global de farmaco administrado al organo.

Sensibilidad y reproducibilidad del metodo de detection de oligonucleotidos descrito en el presente documento: Para una secuencia modelo (RD-1003) el llmite de cuantificacion inferior (LLOQ) en plasma es de aproximadamente 250 amol del oligonucleotido con el enfoque de calibration de reserva. El ensayo funciona con alta reproducibilidad (variation <5%).

Las principales ventajas de la presente invention con respecto a otros metodos de cuantificacion de oligonucleotidos basados en HPLC publicados son la preparation de la muestra rapida y sencilla, la falta de etapas de amplification antes de la deteccion, la alta sensibilidad y reproducibilidad, la robustez del ensayo, la capacidad de alto rendimiento y la capacidad de detectar ambas hebras del oligonucleotido y sus metabolitos en una medicion. Rossi et al describen la identification de oligonucleotidos en HPLC de intercambio anionico (J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 2509-2516). En contraposition a la presente invencion, son necesarias etapas de preparacion de la muestra adicionales y amplificacion de los oligonucleotidos mediante PCR antes de la deteccion. Ademas, es imposible una deteccion simultanea de ambas hebras, ya que el protocolo de hibridacion requiere la escision nucleolltica de una de las hebras.

La mayorla de los ensayos descritos anteriormente requieren curvas de calibracion individuales debido al fondo inespeclfico variable de diferentes tejidos o plasma. En cambio, las senales de fondo inespeclfico no interfieren con el ensayo de la presente invencion. Por tanto, en realizaciones preferidas de la invencion, pueden usarse curvas de calibracion generadas a partir de una serie de dilution en tampon para muestras de tejido y plasma.

En otro aspecto de la invencion se proporcionan metodos para la deteccion cuantitativa de ambas hebras de un duplex de oligonucleotido de ARNic en paralelo a partir de una muestra, que comprende las etapas de seleccionar una muestra que contiene o se sospecha que contiene dicho duplex de oligonucleotido de ARNic; formar una mezcla de hibridacion poniendo en contacto la muestra con una sonda de acido nucleico peptldico (PNA) marcada fluorescentemente que es completamente complementaria a al menos 10 o mas nucleotidos de la hebra sentido de dicho oligonucleotido, poner en contacto la mezcla de hibridacion con una segunda sonda de PNA marcada fluorescentemente, que es completamente complementaria a al menos 10 o mas nucleotidos de la hebra antisentido de dicho oligonucleotido, separar los restos hibridados formados entre dichas hebras de oligonucleotido y dichas sondas de PNA de los restos no hibridados mediante aIEX-HPLC, detectar cualitativa y/o cuantitativamente dichos restos hibridados mediante espectroscopla de fluorescencia. Este es el primer procedimiento que permite la deteccion de ambas hebras de un duplex de oligonucleotido de ARNic en paralelo a partir de una muestra.

En la realization mas preferida, se usan dos sondas de PNA marcadas fluorescentemente para la deteccion de duplex de oligonucleotido. Cada sonda se hibrida especlficamente con la hebra o bien sentido o bien antisentido del oligonucleotido. En una realizacion, se usa el mismo marcador de fluorescencia para la deteccion de ambas hebras. El duplex se disena de dos hebras con diferente longitud o las dos sondas se disenan de modo que la hibridacion conduzca a diferentes tiempos de retention de las dos hebras individuales en el analisis de aIEX-HPLC. En otra realizacion, se usan dos marcadores de fluorescencia diferentes para la deteccion de ambas hebras con dos detectores de fluorescencia en un sistema de HPLC.

Esto abre nuevas posibilidades no solo para la cuantificacion de muestras biologicas sino tambien para la caracterizacion CMC de duplex de oligonucleotidos, por ejemplo, para caracterizar directamente la razon de las dos hebras individuales en un duplex de ARNic como la razon de areas de pico para las hebras individuales. La intensidad de la senal depende solo de la senal de fluorescencia tras el procedimiento de hibridacion y es

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independiente de los coeficientes de extincion UV especlficos de las hebras individuales.

En una realization preferida, se anade una concentration conocida del oligonucleotido que debe detectarse a la muestra desconocida, y tambien se anade a la muestra de calibration y blanco. Este denominado enfoque de calibration de reserva mejora la sensibilidad del ensayo tal como se detalla en la section de ejemplos.

En otra realizacion preferida la muestra es plasma, en aun otra realizacion preferida la muestra es tejido.

En otra realizacion preferida, el metodo se usa para la detection cualitativa de ARNic y derivados. En aun otra realizacion el metodo puede usarse para la deteccion cualitativa del metabolismo in vivo de ARNic terapeutico o de diagnostico.

En una realizacion dicho ARNic se detecta a partir de cultivos celulares in vitro que se han transfectado con dicho ARNic

En una realizacion el metodo se usa para la deteccion cualitativa de microARN y derivados. Preferiblemente dichos microARN se detectan a partir de lisados tisulares.

En otra realizacion el metodo se describe para la deteccion cualitativa de aptameros. Preferiblemente, dichos aptameros son espiegelmeros con L-ribosa (L-ARN) o L-desoxirribosa (L-ADN). En una realizacion, dicho aptamero esta pegilado.

En aun otra realizacion el metodo puede usarse para distinguir el ARNic extracelular del suministrado intracelularmente en tejidos.

Se han descrito varios colorantes para marcar fluorescentemente oligonucleotidos. Los marcadores de fluorescencia preferidos incluyen Atto 610, Atto 425 y Atto 520, pero puede usarse en el metodo cualquier otro marcador de fluorescencia conocido por un experto en la tecnica.

Se describen kits adecuados para realizar un ensayo que detecta la presencia, la ausencia o el numero de una o dos hebras de un oligonucleotido y sus metabolitos en una muestra. Los kits comprenden una preparation de placa lista para usar que comprende una o mas sondas de PNA y todos los demas reactivos o composiciones necesarios para realizar el ensayo. El uso del kit simplifica el rendimiento del ensayo y mejora la reproducibilidad del ensayo. Los kits preferidos hacen uso de un sistema robotico completamente automatizado para la deteccion de oligonucleotidos, en donde se anaden todos los reactivos mediante un robot pipeteador. Por tanto la reproducibilidad del ensayo se mejora adicionalmente. Ademas, este sistema puede usarse para analisis de alto rendimiento de oligonucleotidos en diferentes muestras. En una realizacion preferida, los kits comprenden una preparacion de placa de 96 pocillos, en aun otra realizacion los kits comprenden una preparacion de placa de 384 pocillos.

Por conveniencia, a continuation se proporciona el significado de determinados terminos y frases usados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones. Si hay una aparente discrepancia entre el uso de un termino en otras partes de esta memoria descriptiva y su definition proporcionada en esta seccion, prevalecera la definition proporcionada en esta seccion.

El termino “oligonucleotido” tal como se usa en el presente documento se refiere a un oligomero o pollmero de o bien acido ribonucleico (ARN) o acido desoxirribonucleico (ADN), as! como a oligonucleotidos que no se producen de manera natural. Oligonucleotidos que no se producen de manera natural son oligomeros o pollmeros que contienen secuencias de nucleobases que no se producen en la naturaleza, o especies que contienen equivalentes funcionales de nucleobases, azucares o enlaces entre azucares que se producen de manera natural, como aptameros, espiegelmeros, acidos nucleicos peptldicos (PNA), acidos nucleicos de treosa (TNA), acidos nucleicos bloqueados (LNA) o acidos nucleicos de glicerol (GNA). Este termino incluye oligomeros que contienen las nucleobases de acido nucleico que se producen de manera natural, adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U), as! como oligomeros que contienen analogos de bases o nucleobases modificadas. Por tanto, el experto en la tecnica entiende que el termino “oligonucleotido” comprende pero no se limita a ARN, ADN y oligonucleotidos mixtos, oligonucleotidos antisentido, ARN de interferencia corto (ARNic), microARN (miARN), aptameros y tambien espiegelmeros.

Los oligonucleotidos pueden derivarse de una variedad de fuentes naturales tales como ADN y ARN virales, bacterianos y eucariotas. Otros oligonucleotidos pueden derivarse de fuentes sinteticas, e incluyen cualquiera de los multiples oligonucleotidos que estan fabricandose para su uso como reactivos de investigation, agentes de diagnostico o agentes terapeuticos posibles y definidos. El termino incluye oligomeros que comprenden un acido nucleico monocatenario o un acido nucleico bicatenario. Las dos hebras de un acido nucleico bicatenario se definen como “hebra sentido” y “hebra antisentido”.

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Tal como se usa en el presente documento, el termino “hebra que comprende una secuencia” se refiere a un oligonucleotido que comprende una cadena de nucleotidos que se describe mediante la secuencia a la que se hace referencia usando la nomenclatura de nucleotidos convencional. Sin embargo, tal como se detalla en el presente documento, una “hebra que comprende una secuencia” de este tipo tambien puede comprender modificaciones, como nucleotidos modificados. Tal como se usa en el presente documento, y a menos que se indique otra cosa, el termino “complementario”, cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleotidos en relacion con una segunda secuencia de nucleotidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleotido o polinucleotido que comprende la primera secuencia de nucleotidos para hibridarse y formar una estructura de duplex en determinadas condiciones con un oligonucleotido o polinucleotido que comprende la segunda secuencia de nucleotidos, tal como entendera el experto en la tecnica. Las secuencias “complementarias”, tal como se usa en el presente documento, pueden incluir tambien, o estar formadas completamente por pares de bases distintas de Watson-Crick y/o pares de bases formadas a partir de nucleotidos no naturales y modificados, siempre que se satisfagan los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridarse.

Esto incluye el apareamiento de bases del oligonucleotido o polinucleotido que comprende la primera secuencia de nucleotidos con el oligonucleotido o polinucleotido que comprende la segunda secuencia de nucleotidos a lo largo de toda la longitud de la secuencia de nucleotidos primera y segunda. Tales secuencias pueden considerarse “completamente complementarias” entre si en el presente documento.

El termino “restos hibridados” se refiere a cualquier oligonucleotido o cualquiera de sus metabolitos que se hibridan con las sondas de PNA mientras que “restos no hibridados” se refiere a cualquier oligonucleotido o cualquiera de sus metabolitos que no se hibridan con la sonda de PNA. El termino “ARNic” se refiere a una molecula de ARN bicatenaria que puede bloquear la expresion genica en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia de ARN (iARN).

Por tanto el termino “ARNic terapeutico” se refiere a una molecula de ARN bicatenaria usada como compuesto para tratar, prevenir o gestionar trastornos y enfermedades de un sujeto bloqueando la expresion de genes relacionados con trastornos o enfermedades especlficos. Preferiblemente, tal sujeto es un mamlfero, lo mas preferiblemente un paciente humano.

El termino “metabolito de oligonucleotido” incluye oligonucleotidos de los cuales se delecionan 1 o mas nucleotidos del extremo 3' y/o 5'. El termino “metabolito de oligonucleotido” incluye ademas cualquier oligonucleotido modificado de manera natural o de manera sintetica, por ejemplo, oligonucleotidos que comprenden extremos 3' o 5' fosforilados.

Tambien se reivindican los metodos tal como se describieron anteriormente en el presente documento, especialmente con referencia a los ejemplos a continuacion. Los siguientes ejemplos, referencias, listas de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar el entendimiento de la presente invencion, cuyo alcance verdadero se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 muestra un cromatograma para la deteccion de una hebra del ARNic,

la figura 2 muestra un analisis simultaneo de ambas hebras usando dos sondas de PNA con el mismo colorante,

la figura 3 muestra curvas de calibracion para el analisis simultaneo de ambas hebras usando dos sondas de PNA con el mismo colorante,

la figura 4 muestra el analisis simultaneo de ambas hebras usando dos sondas de PNA con diferentes marcadores de fluorescencia, deteccion con dos detectores de fluorescencia,

la figura 5 muestra la separacion de metabolitos de farmaco,

la figura 6 muestra un cromatograma para la deteccion de miARN,

la figura 7 muestra un cromatograma para deteccion de espiegelmero en tejido pulmonar,

la figura 8 muestra cambio del tiempo de retencion mediante secuencias de hebra as alargadas en 3',

la figura 9 muestra el aumento en la sensibilidad mediante una carga tisular superior.

Ejemplos

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Ejemplo 1: Deteccion de ARNic para GFP mediante HPLC de sonda de PNA

Esta seccion de materiales y metodos describe el procedimiento de ensayo para determinar un GFP-ARNic a partir de muestras biologicas. Adicionalmente este procedimiento tambien puede usarse con pequenas variaciones para todos los demas oligonucleotidos que pueden formar pares de bases de Watson-crick. El procedimiento permite la determinacion de solo una hebra en el caso de oligonucleotidos mono y bicatenarios y la cuantificacion de ambas hebras en paralelo a partir de oligonucleotidos bicatenarios, por ejemplo, ARNic. El colorante-sonda es una hebra de PNA (acido nucleico peptldico) marcada fluorescentemente que es completamente complementaria a al menos 10 o mas nucleotidos del oligonucleotido que debe cuantificarse (complementaria se define como apareamiento perfecto de bases de Watson-Crick).

Se envlan muestras de plasma, suero o tejido en hielo seco y se almacenan a -80°C hasta que se usan. Antes del analisis se descongelan las muestras de plasma en hielo y se procesan mediante un tratamiento con proteinasa K en disolucion de lisis celular y tisular Epicentre a 65°C durante 25 min. Para el tratamiento con proteinasa K se mezclan 30 ml de plasma con 30 ml de disolucion de lisis celular y tisular Epicentre, 4 ml de disolucion de proteinasa K y 36 ml de H2O hasta un volumen final de 100 ml.

Se pulverizan muestras de tejido en estado congelado y se suspendieron hasta 100 mg de polvo congelado en 1 ml de disolucion de lisis celular y tisular Epicentre, se trataron con una varilla ultrasonica y se lisaron posteriormente con un tratamiento con proteinasa K a 65°C. Todas las muestras tratadas con proteinasa K se diluyen adicionalmente con disolucion de lisis celular y tisular Epicentre empleada anteriormente en la etapa de preparacion de la muestra de HPLC.

Tras el tratamiento con proteinasa K, se anaden 20 ml de una disolucion de KCl 3 M a 200 l de las muestras de plasma o tejido para precipitar el SDS. Posteriormente, se centrifugan las muestras durante 15 min y se usa adicionalmente el sobrenadante para la determinacion de ARNic.

Para la hibridacion, se mezclan 100 ml del sobrenadante diluido que contiene entre 0,5 y 250 fmol de ARNic, en placas de PCR de 96 pocillos, con 5 ml de una disolucion de sonda de PNA-Atto610 1 pM que selecciona como diana la hebra antisentido. Se anade tampon de hibridacion hasta un volumen final de 200 ml (hasta 190 ml si la hebra sentido del duplex de ARNic tambien debe detectarse). Se sella la placa y se incuba a 95°C durante 15 min en un instrumento de PCR.

La temperatura del instrumento de PCR se reduce hasta 50°C. Si debe detectarse la hebra sentido del duplex de ARNic, se anaden 10 ml de una sonda de PNA-Atto425 1 mM (o de la sonda de PNA-Atto610) que selecciona como diana la hebra sentido a cada pocillo para un volumen final de 200 ml. Tras agitar durante 15 min adicionales a 50°C, se enfrla hasta temperatura ambiente y se ponen las muestras en el inyector automatico de HPLC.

Se generan curvas de calibracion a partir de una serie de dilucion de ARNic en condiciones identicas. En la figura 3 se proporciona un cromatograma representativo de la curva de calibracion usada en el analisis de ambas hebras de un oligonucleotido.

Tabla 1: Secuencias de sondas de PNA usadas para la deteccion de un ARNic que selecciona como diana GFP

Coniunto de sondas de ARNic para GFP

Seq.Id. No. 1: 5'-Atto425-(OO)-TC TGC TGC TTC ATG-3' Sentido

Seq.Id. No. 2: 5'-Atto610-(OO)-TC TGC TGC TTC ATG-3' Sentido

Seq.Id. No. 3: 5'-Atto610-(OO)-ACA TGA AGC AGC ACG-3' Antisentido

Analisis de HPLC con deteccion de fluorescencia del duplex de sonda/hebra antisentido

Se inyectan 100 ml de cada muestra hibridada (1/2) en el sistema de HPLC conectado a un detector de fluorescencia Dionex RF2000. Para la deteccion de ambas hebras de ARNic con los dos colorantes de fluorescencia diferentes, se usa un segundo detector de fluorescencia Dionex RF2000 conectado en una fila tras el primer detector. Se realiza la cromatografla a 50°C en condiciones nativas con NaClO4 como sal de eluyente en una columna Dionex DNA Pac PA100.

En la figura 1 se muestra un cromatograma tlpico para la deteccion de una hebra, en la figura 2 se proporciona un cromatograma tlpico para el analisis simultaneo de ambas hebras usando dos sondas de PNA con el mismo colorante. En la figura 3 se proporciona un cromatograma representativo de la curva de calibracion usada en el analisis de ambas hebras de un oligonucleotido. En la figura 4 se muestra un cromatograma tlpico del analisis simultaneo de ambas hebras usando dos sondas de PNA con diferentes marcadores de fluorescencia y su deteccion con dos detectores de fluorescencia.

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Condiciones de HPLC

Columna: Dionex DNAPac PA100 (columna analltica de 4x250 mm)

Temp.: 50°C

Flujo: 1 ml/min

Inyeccion: 100 ul

Deteccion: Excitacion: 612 nm; emision: 642 nm (primer detector), excitacion: 436 nm; emision: 484 nm (segundo

detector si es necesario)

Tabla 2: Tabla de gradiente de HPLC

Tiempo: % de A % de B

-1,00 min: 91 9

1,00 min: 91 9

9,0 min: 80 20

9,5 min: 0 100

12,5 min: 0 100

13,0 min: 91 9

16,0 min: 91 9

Se determinan las concentraciones del ARNic para GFP en muestras de plasma y tejido usando HPLC de intercambio ionico para separar los analitos y cuantificar el area bajo el pico con deteccion de fluorescencia. En las condiciones de IEX-HPLC nativa usadas, los compuestos de la matriz de interferencia as! como el exceso de las sondas marcadas con fluorescencia se eluyen en el volumen inicial de la columna. No se producen cambios de senales no especlficas a partir de la hibridacion de las sondas marcadas con fluorescencia con ARN/ADN de la matriz a tiempos de retencion superiores, lo que permite una buena resolution de la senal con poco fondo que eluye conjuntamente. Las senales especlficas generadas por los duplex que consisten en sondas marcadas con fluorescencia y la hebra de ARNic intacta correspondiente eluye normalmente entre 5 y 7 min.

La cuantificacion se realiza basandose en una curva de calibration externa generada a partir de una serie de dilution de ARNic patron (desde 0,5 hasta 250 fmol de ARNic) que se hibrida y se analiza tal como se describio anteriormente. El intervalo lineal de este ensayo es de desde 0,5 hasta 250 fmol de ARNic en la columna con un LLOQ de ~0,6 ng de ARNic en 1 ml de plasma y ~5 ng de ARNic en tejido.

Reactivos

• Disolucion madre de ARNic para GFP patron 50 pM (prep. internamente)

• Tampon de hibridacion: TRIS-Cl 50 mM; ACN al 10% (prep. internamente)

• Proteinasa K (20 mg/ml): Peqlab n.° 04-1075; lote: 11024

• Tampon de lisis: Disolucion de lisis celular y tisular Epicentre (n.° MTC096H)

• Agua MilliQ: 18,2 MW

• Sondas de PNA: vease la tabla 1

• KCl: Disolucion 3 M en H2O (prep. internamente)

• Sistema de HPLC A para la deteccion de fluorescencia:

• Eluyente A de HPLC: TRIS-HCl 25 mM; EDTA 1 mM; ACN al 50%; pH=8

• Eluyente B de HPLC: NaClO4 800 mM en A Material:

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• Varilla ultrasonica, Bandelin Sonoplus (Berlin), HD 2070 MS72 con UW 2070

• Tubos Eppendorf de 1,5 ml

• Placa de PCR Eppendorf twin.tec 96 (n.° 951020389)

• Gradiente Eppendorf Mastercycler

• Ultra Clear cap-Stripes, Peqlab (n.1 82-0866-A)

• HPLC Dionex Ultimate3000: Rejilla de disolvente Bomba doble Ultimate 3000

Inyector automatico Ultimate 3000

Horno de columna Ultimate 3000 con valvula de cambio de 10 orificios Detector UV VWD 3000 Detector de fluorescencia RF2000

Alternativamente, se usaron las siguientes condiciones de HPLC para la deteccion de oligonucleotidos, especialmente para la deteccion de miARN y ARNic:

• Columna: Dionex DNA Pac PA100 (250 x 4mm)

• Temperatura: 50°C

• Eluyente A: Fosfato de sodio 10 mM; NaCl 100 mM; ACN al 5%

• Eluyente B: Fosfato de sodio 10 mM; NaCl 1 M; ACN al 5%

• Eluyente C: ACN al 90%

Tabla 3: Tabla de gradiente de HPLC - protocolo alternativo (condiciones convencionales para la deteccion de

miARN y ARNic)

Tiempo [min]: Flujo [ml/min] Eluyente A [%] Eluyente B [%] Eluyente C [%]

0,00: 1,00 40 20 37

1,00
1,00: 40 20 37

10,00: 1,00 8 55 37

10,50: 1,00 0 90 10

13,50: 1,00 0 90 10

14,00: 1,00 40 20 37

17,00: 1,00 40 20 37

Ejemplo 2: Preparacion de placa de 96 pocillos automatizada

Esta seccion describe un nuevo protocolo de preparacion de la muestra que hace uso de placas de microtitulacion. En el mismo, se reducen las etapas de manipulacion manual hasta un mlnimo para mejorar la reproducibilidad del ensayo. Todos los componentes de la mezcla incluyendo el tampon de hibridacion, el colorante-sonda y la adicion conocida de ARNic se anaden mediante un robot pipeteador a una placa de 96 pocillos. Tambien la precipitacion con SDS anterior de las muestras puede realizarse en un sistema basado en placa de microtitulacion.

Con este procedimiento es posible preparar placas de 96 pocillos en reserva para un oligonucleotido definido, en el que solo tiene que anadirse la disolucion de la muestra. Por consiguiente, esta preparacion lista para usar funciona como un kit y puede usarse para un analisis de alto rendimiento rapido de muestras que contienen o se sospecha que contienen oligonucleotidos definidos.

Preparacion de la placa

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30

En una placa de microtitulacion de 96 pocillos, los pocillos forman una cuadrlcuia rectangular de 8 filas (marcadas A a H) y 12 columnas (marcadas 1 a 12). Para una preparacion de placa de 96 pocillos automatizada, se prepara manualmente una mezcla maestra segun la tabla 4 y se anaden 100 ml a cada pocillo de la placa mediante un robot pipeteador. A los pocillos en la fila 1-10, se les anaden 50 ml de agua. La fila 1-9 sirve para el analisis de muestras, la fila 10 sirve como control para la adicion conocida de 1 fmol y las filas 1-12 para las curvas de calibracion. A los pocillos 11-12, se les anaden 50 ml de medio y 50 ml de una dilucion de ARNic. Las diluciones de ARNic se preparan mediante el robot pipeteador partiendo de una disolucion de ARNic 100 nM y se enumeran a continuacion. Esta placa de 96 pocillos se denomina adicionalmente “placa preparada”.

Tabla 4: Mezcla maestra para la preparacion de la placa

Sustancia: Por vial Mezcla maestra (=x500)

Agua: 31 ml 15500 ml

Sonda de PNA 1 pmol/pl: 5 ml 2500 ml

Adicion conocida de ARNic 1 fmol: 0,5 fmol/pl: 4 ml 2000 ml

Acetonitrilo: 20 ml 10000 ml

Tris 1 M pH 8,0: 40 ml 20000 ml

Diluciones de ARNic para las curvas de calibracion 20 nM (500 fmol)

10 nM (250 fmol)

4 nM (100 fmol)

2 nM (50 fmol)

1 nM (25 fmol)

0,4 nM (10 fmol)

0,2 nM (5 fmol)

0,1 nM (2,5 fmol)

0,02 nM (0,5 fmol)

0,01 nM (0,25 fmol)

Adicion de muestras a placa preparada / etapa de precipitation con SDS

Se pipetean allcuotas de 100 ml a los pocillos en las filas (A-H) de las columnas 1 a 9 de una placa de microtitulacion de 96 pocillos previamente enfriada, y a estos pocillos se les anaden 10 ml de KCl 3 M mediante un robot pipeteador. Tras 15 minutos de centrifugation a 3800 U/min y 4°C, se transfieren 50 ml del sobrenadante mediante el robot pipeteador a las columnas acordes de una placa preparada.

Para el control, se precipita medio o tampon de lisis con KCl 3 M y 50 ml del sobrenadante anadido a la columna 10 - 12 de la placa preparada. Se inyectan 100 ml de cada pocillo en alEX-HPLC.

Ejemplo 3: Separacion de metabolitos de farmaco

Para la separacion de diferentes metabolitos de farmaco, se analizaron metabolitos del extremo 3' (3' n-2, 3' n-4, 3' n-5, 3' n-6) y del extremo 5' (5' n-1, 5'n-2, 5'n-3) purificados de la hebra as de ARNic para GFP, de los cuales se delecionaron de 1 a 6 nucleotidos del extremo 3' o 5', respectivamente, segun el procedimiento de ensayo descrito en el ejemplo 1. Se facilitan los metabolitos en la tabla 5, en la figura 5 se proporciona un cromatograma tlpico para la separacion de metabolitos.

5

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30

35

Tabla 5: Metabolitos representatives de ARNic para GFP

ARNic para GFP

Sentido

Nombre: Secuencia Seq.Id

ARNic para GFP-hebra s: 5'-CCACAUGAAGCAGCACGACUU-3' 4

Antisentido

Nombre: Secuencia Seq.Id

ARNic para GFP-hebra as: 5'-AAGUCGUGCUGCUUCAUGUGGUC-3' 5

ARNic para GFP-hebra as-5'-(n-1): 5'-AGUCGUGCUGCUUCAUGUGGUC-3' 6

ARNic para GFP-hebra as-5'-(n-2): 5'-GUCGUGCUGCUUCAUGUGGUC-3' 7

ARNic para GFP-hebra as-5'-(n-3): 5'-UCGUGCUGCUUCAUGUGGUC-3' 8

ARNic para GFP-hebra as-3'-(n-2): 5'-AAGUCGUGCUGCUUCAUGUGG-3' 9

ARNic para GFP-hebra as-3'-(n-4): 5'-AAGUCGUGCUGCUUCAUGU-3' 10

ARNic para GFP-hebra as-3'-(n-5): 5'-AAGUCGUGCUGCUUCAUG-3' 11

ARNic para GFP-hebra as-3'-(n-6): 5'-AAGUCGUGCUGCUUCAU-3' 12

Ejemplo 4: Deteccion de miARN

Se uso el ensayo en condiciones convencionales para evaluar la posibilidad de detectar miARN a partir de lisados tisulares. Como ejemplo, se detecto el miARN-122 especlfico de hlgado de raton a partir de lisado tisular de raton (control positivo), yeyuno (control negativo) y a partir de lisado con adiciones conocidas con hebras de miARN-122 generadas de manera sintetica (Lagos-Quintana, et al. Current Biology, Vol. 12, 735-739.). A partir de la bibliografla se sabe que en el hlgado de los ratones se expresan tres tipos diferentes de secuencias de miARN-122:

miARN-122a: 5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3' (Seq. ID. No. 13)

miARN-122b: 5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU-3' (Seq. ID. No. 14)

miARN-122c: 5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGA-3' (Seq. ID. No. 15)

Se sintetizaron todos los patrones sinteticos como secuencia de 5'-OH y de 5'-fosfato. Puesto que las tres especies mostraban pequenas variaciones en el extremo 3', se diseno la sonda de PNA de modo que coincidiera completamente con las tres secuencias de miARN-122, comenzando en la tercera base del extremo 5' del miARN- 122 con 17 bases de longitud:

Sonda de PNA: 5'-Atto425-OO-AACACCATTGTCACACT-3' (Seq. ID. No. 16)

Se realizo la HPLC con las condiciones que se describieron en el protocolo alternativo detallado en el ejemplo 1 y mostrado en la tabla 3. Los perfiles de HPLC generados a partir de lisado de pulmon de raton (tejido negativo para miARN122) con adiciones conocidas con miARN-122 generado de manera sintetica mostraron tres picos separados. El tiempo de retention de este pico coincide completamente con las senales que se encontraron en lisados de hlgado (1 mg de hlgado inyectado). La cuantificacion del area de pico total y el calculo de la concentration de miARN-122 total en el hlgado condujo a aproximadamente ~35 ng/g. El control negativo de miARN-122 de muestras de yeyuno o tejido pulmonar no mostro senal para miARN-122 tal como se esperaba (figura 6).

Ejemplo 5: Deteccion de espiegelmero-ADN (L-ADN) con y sin pegilacion

Los espiegelmeros son moleculas de aptamero con estructura principal de azucar de L-ribosa (L-ARN) o L- desoxirribosa (L-ADN) no natural que no muestran interaction de pares de bases de Watson-Crick con los D- oligonucleotidos naturales. Puesto que el PNA es un mimetico no quiral de oligonucleotidos con propiedades de pares de bases de Watson-Crick, se esperaba que las sondas de PNA tambien pudiesen usarse para detectar esta especie de oligonucleotido no natural. Para aumentar la semivida de circulation de espiegelmeros o aptameros, estas moleculas se pegilan a menudo con PEG de 40 kDa ramificado, que dificulta habitualmente el analisis de estas moleculas complejas. Como prueba de concepto para la deteccion de esta clase de moleculas terapeuticamente interesantes, se sintetizaron una version pegilada y una no pegilada de la siguiente secuencia de L-ADN con el ensayo descrito en el presente documento tras la administration orotraqueal en ratones:

Espiegelmero sin PEG:

(NH2C6)-CCAGCCACCTACTCCACCAGTGCCAGGACTGCTTGAGGGT (Seq. ID. No. 17)

Espiegelmero con PEG:

PEG(40kDa)-(NHC6)-CAGCCACCTACTCCACCAGTGCCAGGACTGCTTGAGGGT (Seq. ID. No. 18)

Se uso la siguiente sonda de PNA de 17 meros para la hibridacion y deteccion del espiegelmero a partir de muestras de plasma, pulmon, hlgado y rinon:

5'-Atto425-00-GTCCTGGCACTGGTGGA-3' (Seq. ID. No. 19)

5 Se ajustaron las condiciones de gradiente a las secuencias de oligonucleotido mas largas en comparacion con las hebras de ARNic para eluir el duplex de espiegelmero-PNA dentro del gradiente del metodo de HPLC.

Se aplicaron las siguientes condiciones de HPLC:

• Columna: Dionex DNA Pac PA100 (250 x 4mm)

• Temperatura: 50°C

10 • Eluyente A: Fosfato de sodio; NaCl 100 mM; CAN al 5%

• Eluyente B: Fosfato de sodio 10 mM; NaCl 1 M; ACN al 5%

• Eluyente C: ACN al 90%.

Tabla 6: Condiciones de gradiente de HPLC para espiegelmero pegilado

Tiempo [mini: Flujo [ml/mini Eluyente A [%1 Eluyente B [%1 Eluyente C [%1

0,00: 1,00 40 20 40

1,00
1,00: 40 20 40

10,00: 1,00 5 55 40

10,50: 1,00 0 60 40

13,50: 1,00 0 60 40

14,00: 1,00 40 20 40

17,00: 1,00 40 20 40

Tabla 7: Condiciones de gradiente de HPLC para espiegelmero

Tiempo [mini: Flujo [ml/mini Eluyente A [%1 Eluyente B [%1 Eluyente C [%1

0,00: 1,00 35 25 40

1,00
1,00: 35 25 40

10,00: 1,00 0 60 40

10,50: 1,00 0 60 40

13,50: 1,00 0 60 40

14,00: 1,00 35 25 40

17,00: 1,00 35 25 40

15 La sensibilidad del metodo estaba un poco comprometida para el espiegelmero pegilado debido a un ensanchamiento del pico inducido por la polidispersidad del resto de PEG de 40 kDa. El llmite de deteccion inferior aumento hasta ~ 1 fmol de L-ADN en la columna. No se sometio a prueba la resolucion de impurezas mas cortas, pero se esperaba que fuese inferior en comparacion con las hebras de miARN o ARNic mas cortas.

Se realizo la preparacion de las muestras segun el protocolo convencional. Los espiegelmeros pudieron detectarse 20 facilmente mediante este procedimiento a partir de plasma y todo el tejido sometido a prueba, como picos individuales nltidos sin casi interferencia de fondo biologico tal como se muestra en la figura 7.

Ejemplo 6: Deteccion de ARNic a partir de experimentos de transfeccion in vitro

La deteccion de ARNic no marcado a partir de experimentos de cultivo celular in vitro estaba limitada por el hecho de la alta sensibilidad necesaria y por tanto, solo fueron satisfactorios enfoques con una etapa de amplification como 25 PCR para moleculas no modificadas.

La sensibilidad del ensayo de PNA-HPLC estaba en el intervalo para medir ARNic a partir de experimentos de cultivo celular. Se uso un ARNic de 19 pares de bases con una proyeccion de 2 nt en el extremo 3' de ambas hebras para la transfeccion de hepatocitos primarios a una concentration de ARNic de 30 nM. Se transfectaron diversas

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versiones de este duplex con secuencias identicas, que diferlan solo en su extremo 5' de la hebra antisentido. Tras la transfeccion, se lavaron las celulas con PBS y luego se lisaron mediante un tratamiento con proteinasa K con una concentracion de ~ 2500 celulas por ul de lisado.

Se uso el lisado de cultivo celular para el procedimiento del ensayo de PNA-HPLC y se inyectaron ~ 50000 celulas por tanda de HPLC en la columna tras la hibridacion con la sonda de PNA de hebra antisentido complementaria. En estas condiciones de ensayo, la hebra as intacta y tambien la especie fosforilada en 5' de la hebra antisentido pudieron detectarse hasta aproximadamente 8000 copias de ARNic por celula (datos no mostrados).

Ejemplo 7: Uso de patrones internos para la normalizacion (exactitud superior)

Para aumentar adicionalmente la exactitud del metodo, especialmente cuando se usa en un experimento de GxP, puede ser necesario implementar un patron interno para la normalizacion. Como prueba de concepto, se alargo una hebra de ARN de 21 meros con de 3 hasta 8 nucleotidos desoxi-T en su extremo 3'. Estos patrones de normalizacion, junto con la especie de 21 meros y su especie fosforilada en 5', se utilizaron como adiciones conocidas en el plasma y luego se analizaron en condiciones de HPLC y ensayo convencionales (vease el ejemplo 1, especialmente el protocolo alternativo para HPLC y la tabla 3) para detectar ARNic.

Todos los patrones alargados eluidos se resolvieron completamente hasta la llnea base a partir del 21 mero as! como a partir del 21 mero fosforilado en 5' con tiempos de retention superiores. Se observaron algunas interferencias de picos con la secuencia alargada con 3 nucleotidos dT y el 21 mero fosforilado en 5', as! como algunas impurezas de slntesis de la hebra alargada eluida conjuntamente con el 21 mero fosforilado en 5'.

El ejemplo mostrado en el presente documento es una superposition de cromatogramas de muestras que contienen la hebra as y la hebra fosforilada en 5' mezcladas con la hebra as alargada en 3' con 3, 4 y 5 nucleotidos de desoxitimidina en su extremo 5' (vease la figura 8). Se usaron las siguientes secuencias para los cromatogramas de ejemplo (las letras en mayuscula representan nucleotidos de ARN, las letras en minuscula “c”, “g”, “a” y “u” representan nucleotidos modificados con O-metilo en 2', “s” representa fosforotioato y “dT” desoxitimidina):

hebra as: 5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3' (Seq. ID. No. 20)

hebra as - 5'-PO4: 5'-pUCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3' (Seq. ID. No. 21)

hebra as - (dT)n: 5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTdT - (dT)n-3' con n = 3, 4, 5 (Seq. ID. No. 22, Seq. ID. No. 23, Seq. ID. No. 24)

Sonda de PNA: 5'-Atto425-OO-CTT ACG CTG AGT ACT TC-3' (Seq. ID. No. 25)

Tabla 8: Resolucion de picos calculada segun la USP

Secuencia: Tiempo de retencion [min] Resolucion frente a 5'-PO4 (USP)

hebra as: 6,23 1,70

hebra as -5'-PO4: 6,54 -

hebra as +3x 3'-dT: 6,68 < 1

hebra as +4x 3'-dT: 6,88 2,25

hebra as +5x 3'-dT: 7,04 2,75

Con este experimento tambien se demostro que en condiciones de ensayo de ARNic y miARN convencionales puede lograrse una resolution hasta la llnea base para oligonucleotidos de hasta 29 meros, que difieren solo en un nucleotido de longitud.

Ejemplo 8: Aumento de la sensibilidad del ensayo en tejidos

La sensibilidad del ensayo tal como se describio anteriormente estaba restringida a ~2 ng de ARNic por g de tejido. Esta limitation venla dada por el hecho de que la cantidad maxima de tejido cargado en la columna era de 2-3 mg por inyeccion, ya que el ruido de la llnea base aumentaba a cargas de tejido superiores. El cambio del colorante Atto610 al colorante Atto425 permite cargas en la columna mucho mas altas de hasta 11 mg sin perdida de sensibilidad de la senal y potencia de resolucion cromatografica. La cantidad absoluta de ARNic en el LOD es todavla de 250 amol de oligonucleotido en la columna. Esto conduce a un llmite de detection inferior con respecto a la concentracion tisular de ARNic de ~ 400 pg/g (figura 9).

En la tabla 9 a continuation se muestra una comparacion entre dos tandas cromatograficas de la misma muestra de tejido, aunque dos preparaciones de tejido separadas. En el cromatograma superior se cargaron 3 mg de hlgado en

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Metodo para detectar un oligonucleotido y sus metabolitos de oligonucleotido, en el que el oligonucleotido es un oligonucleotido de ARN seleccionado del grupo que consiste en ARN de interferencia cortos (ARNic) y microARN (miARN), que comprende las etapas de

(a) seleccionar una muestra biologica que contiene o se sospecha que contiene dicho oligonucleotido de ARN, en el que la muestra es lisado tisular o plasma,

(b) combinar dicha muestra biologica con una sonda de acido nucleico peptldico (PNA) marcada fluorescentemente que es completamente complementaria a al menos 10 nucleotidos de dicho oligonucleotido de ARN formando de ese modo restos hibridados entre dicha secuencia de oligonucleotido de ARN y dicha sonda de PNA,

(c) separar dichos restos hibridados de los restos no hibridados mediante cromatografla de llquidos de alto rendimiento de intercambio anionico (HPLC) en condiciones en las que la sonda de PNA no hibridada se eluye en el volumen inicial, y

(d) detectar cuantitativamente dichos restos hibridados mediante espectroscopla de fluorescencia.
2. Metodo segun la reivindicacion 1 para detectar ambas hebras de un duplex de oligonucleotido de ARNic en paralelo a partir de una muestra, en el que dicha muestra se pone en contacto con una sonda de PNA marcada fluorescentemente complementaria completamente a al menos 10 nucleotidos de la hebra sentido de dicho oligonucleotido de ARN y una sonda de PNA marcada fluorescentemente complementaria completamente a al menos 10 nucleotidos de la hebra antisentido de dicho oligonucleotido de ARN en la etapa (b) y luego se realizan las etapas (c) a (d), en el que (i) las dos sondas de PNA se disenan de manera que la hibridacion conduce a diferentes tiempos de retencion de las dos hebras individuales, o (ii) se usan dos marcadores de fluorescencia diferentes.
3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, para el analisis cuantitativo del metabolismo in vivo de ARNic terapeutico y sus derivados.
4. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, para el analisis cuantitativo de ARNic extracelular y suministrado intracelularmente.
5. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que se anade a la muestra una concentracion conocida del oligonucleotido de ARN que debe detectarse.
6. Metodo segun las reivindicaciones 1 a 5, en el que la sonda de PNA se marca con Atto 610, Atto 425 o Atto 520.