ES2589306T3 - Métodos para sintetizar un elemento estructural de amatoxinas y amatoxinas - Google Patents

Métodos para sintetizar un elemento estructural de amatoxinas y amatoxinas Download PDF

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Abstract

Método para la síntesis de g,d-dihidroxiisoleucina 1 o de un sintón para el compuesto 1, que comprende la etapa de metilar el compuesto 3 o 3* con yoduro de metilo en presencia de bis(trimetilsilil)amida de litio (LHMDS)

Description

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DESCRIPCION
Metodos para sintetizar un elemento estructural de amatoxinas y amatoxinas Campo de la invencion
La invencion se refiere a metodos novedosos para sintetizar un sinton para y,8-dihidroxiisoleucina 1 (n.° CAS 5539994-5] como elemento estructural para la sintesis de amatoxinas, y para metodos novedosos para sintetizar amatoxinas usando tal elemento estructural.
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Antecedentes de la invencion
Las amatoxinas son peptidos ciclicos compuestos por 8 aminoacidos, que se encuentran en hongos de Amanita phalloides (vease la figura 1). Las amatoxinas inhiben especificamente la ARN-polimerasa II dependiente de ADN de celulas de mamiferos y, de ese modo, tambien la transcripcion y biosintesis de proteinas de las celulas afectadas. La inhibicion de la transcripcion en una celula provoca la detencion del crecimiento y la proliferacion. Aunque estan unidos de manera no covalente, el complejo entre amanitina y ARN-polimerasa II es muy fuerte (Kd = 3 nM). La disociacion de la amanitina a partir de la enzima es un proceso muy lento, haciendo, por tanto, improbable la recuperacion de una celula afectada. Cuando la inhibicion de la transcripcion dura demasiado, la celula experimental muerte celular programada (apoptosis).
El uso de amatoxinas como restos citotoxicos para terapia tumoral ya se habia explorado en 1981 acoplando un anticuerpo anti-Thy-1.2 a a-amanitina usando un ligador unido al anillo de indol de Trp (aminoacido 4; vease la figura 1) mediante diazotacion (Davis & Preston, Science 1981, 213, 1385-1388). Davis y Preston identificaron el sitio de union como la posicion 7’. Morris y Venton demostraron tambien que la sustitucion en la posicion 7’ da como resultado un derivado, que mantiene la actividad citotoxica (Morris & Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 1983, 21 419-430).
La solicitud de patente EP 1859811 A1 (publicada el 28 de noviembre de 2007) describe conjugados, en los que el atomo de C y del aminoacido 1 de amatoxina de p-amanitina se acoplo directamente, es decir, sin una estructura de ligador, a albumina o a anticuerpo monoclonal HEA125, OKT3 o PA-1. Ademas, se mostro el efecto inhibidor de estos conjugados sobre la proliferacion de celulas de cancer de mama (MCF-7), celulas de linfoma de Burkitt (Raji) y celulas de linfoma T (Jurkat). Se sugirio el uso de ligadores, incluyendo ligadores que comprenden elementos tales como amida, ester, eter, tioeter, disulfuro, urea, tiourea, restos de hidrocarburos y similares, pero realmente no se mostraron tales constructos, y no se proporcionaron mas detalles, tales como sitios de union en las amatoxinas.
Las solicitudes de patente WO 2010/115629 y WO 2010/115630 (ambas publicadas el 14 de octubre de 2010) describen conjugados, donde los anticuerpos, tales como anticuerpos anti-EpCAM tales como el anticuerpo humanizado huHEA125, se acoplan a amatoxinas mediante (i) el atomo de C y del aminoacido 1 de amatoxina, (ii) el atomo de C en 6’ del aminoacido 4 de amatoxina, o (iii) mediante el atomo de C 8 del aminoacido 3 de amatoxina, en cada caso o bien directamente o bien mediante un ligador entre el anticuerpo y las amatoxinas. Los ligadores sugeridos comprenden elementos tales como amida, ester, eter, tioeter, disulfuro, urea, tiourea, restos de hidrocarburos y similares. Ademas, se mostraron los efectos inhibidores de estos conjugados sobre la proliferacion de celulas de cancer de mama (linea celular MCF-7), carcinoma pancreatico (linea celular Capan-1), cancer de colon (linea celular Colo205) y colangiocarcinoma (linea celular OZ).
Las amatoxinas pueden aislarse a partir de cuerpos fructiferos de hongos de Amanita phalloides recogidos, o a partir de cultivos puros (Zhang P, Chen Z, Hu J, Wei B, Zhang Z, y Hu W, Production and characterization of Amanitin toxins from a pure culture of Amanita exitialis, FEMS Microbiol Lett. 15 de nov. de 2005; 252(2):223-8. Pub. elec. 15 de sept. de 2005). Sin embargo, las cantidades de amatoxinas que pueden obtenerse son mas bien bajas (en el intervalo de aproximadamente 0,3-3 mg/g de materia seca a partir de cuerpos fructiferos naturales, y aproximadamente el 10% de los mismos a partir de cultivo puro) y la flexibilidad para modificar adicionalmente las variantes de amatoxinas que se producen de manera natural esta limitada (veanse las referencias comentadas en los parrafos [003]-[005] y las referencias citadas en los mismos).
Alternativamente, las amatoxinas pueden obtenerse a partir de fermentacion usando un basidiomiceto (Muraoka S, y Shinozawa T., Effective production of amanitins by two-step cultivation of the basidiomycete, Galerina fasciculata
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GF-060, J Biosci Bioeng. 2000; 89(1 ):73-6; el rendimiento notificado fue aproximadamente 5 mg/l de cultivo) o A. fissa (Guo XW, Wang GL, y Gong Jh, Culture conditions and analysis of amanitins on Amanita spissa, Wei Sheng Wu Xue Bao. Jun. de 2006; 46(3):373-8; el rendimiento notificado fue aproximadamente 30 pg/l de cultivo). De nuevo, los rendimientos son bajos y la flexibilidad para modificar adicionalmente las variantes de amatoxinas que se producen de manera natural esta tambien limitada.
Finalmente, se han preparado amatoxinas por sfntesis parcial o completa (por ejemplo, Zanotti G, Mohringer C, y Wieland T., Synthesis of analogues of amaninamide, an amatoxin from the white Amanita virosa mushroom, Int J Pept Protein Res. Oct. de 1987; 30(4):450-9; Zanotti G, Wieland T, Benedetti E, Di Blasio B, Pavone V, y Pedone C., Structure-toxicity relationships in the amatoxin series. Synthesis of S-deoxy[gamma(R)-hydroxy-Ile3]-amaninamide, its crystal and molecular structure and inhibitory efficiency, Int J Pept Protein Res. Sept. de 1989; 34(3):222-8; Zanotti G, Petersen G, y Wieland T., Structure-toxicity relationships in the amatoxin series. Structural variations of side chain 3 and inhibition of RNA polimerase II, Int J Pept Protein Res. Dic.de 1992; 40(6):551-8).
Aunque el uso de rutas completamente sinteticas para dar amatoxinas puede ofrecer el suministro de cantidades mas grandes de amatoxinas requeridas para usos terapeuticos y puede ofrecer la construccion de una variedad de variantes de amatoxinas novedosas usando materiales de partida adecuados como elementos estructu rales, no se ha notificado hasta la fecha un enfoque completamente sinteticos para dar las amatoxinas mas relevantes, a- amanitina y p-amanitina, asf como amanina y amaninamida. Esto puede atribuirse, al menos en parte, al hecho de que un elemento estructural esencial, y,5-dihidroxiisoleucina 1 o un sinton para la misma, no estaba aun disponible hasta la fecha como diastereomero puro.
Objeto de la invencion
Por tanto, habfa una alta necesidad en la tecnica anterior de obtener y,5-dihidroxiisoleucina 1 o un sinton para la misma, como elemento estructural para la sfntesis de amatoxinas, y de identificar un metodo para la produccion de 1, o de un sinton para la misma. Ademas, habfa una alta necesidad en la tecnica anterior de identificar un metodo alternativo para sintetizar amatoxinas.
Sumario de la invencion
La presente invencion se basa en la observacion inesperada de que y,5-dihidroxiisoleucina 1 o un sinton para la misma, pueden obtenerse en un procedimiento de multiples etapas, en el que la metilacion regioselectiva de un derivado de acido aspartico protegido apropiadamente es la etapa clave.
Por tanto, en un aspecto la presente invencion se refiere a un metodo para la sfntesis de y,5-dihidroxiisoleucina 1 o de un sinton para el compuesto 1, que comprende la etapa de metilacion del compuesto 3, en particular con yoduro de metilo en presencia de bis(trimetilsilil)amida de litio (LHMDS).
imagen2
En un aspecto alternativo, la presente invencion se refiere a un metodo para la sfntesis de y,5-dihidroxiisoleucina 1 o de un sinton para el compuesto 1, que comprende la etapa de metilar el compuesto 3* (que tiene un segundo grupo de protection de bencilo en el atomo de nitrogeno en vez del grupo fenilfluorenilo en el compuesto 3), en particular con yoduro de metilo en presencia de bis(trimetilsilil)amida de litio (LHMDS).
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En un segundo aspecto, la presente invencion se refiere al compuesto 6.
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En un tercer aspecto, la presente invencion se refiere a un kit que comprende el compuesto 6, y al menos un reactivo adicional para la sintesis de amatoxinas o precursores de las mismas.
En aun otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para sintetizar una amatoxina o molecula precursora para la misma, que comprende la etapa de acoplar el compuesto 6 a hidroxiprolina, haciendo reaccionar en particular el compuesto 6 con una resina precargada con hidroxiprolina (PS) L.
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Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra las formulas estructurales de diferentes amatoxinas. Los numeros en negrita (1 a 8) designan la numeracion convencional de los ocho aminoacidos que forman la amatoxina. Tambien se muestran las designaciones convencionales de los atomos en los aminoacidos 1, 3 y 4 (letras griegas a a y, letras griegas a a 8, y numeros de 1’ a 7’, respectivamente).
La figura 2 muestra los espectros de 1H- y 13C-RMN, que muestran una razon diastereomerica de 70:30 del compuesto 6.
La figura 3 muestra un esquema de sintesis general de la sintesis de amatoxinas.
Descripcion detallada de la invencion
Antes de que la presente invencion se describa en detalle a continuacion, debe entenderse que esta invencion no se limita a la metodologia particular, protocolos y reactivos descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. Tambien debe entenderse que la terminologia usada en el presente documento es con el fin de describir unicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invencion que se limitara unicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comunmente un experto habitual en la tecnica.
Preferiblemente, los terminos usados en el presente documento se definen tal como se describe en “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kolbl, H. edicion. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza).
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra
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cosa, la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, se entendera que implican la inclusion de un numero entero, composicion o etapa determinado o grupo de numero enteros o etapas, mientras que cualquier numero entero, composicion o etapa adicional o grupo de numero enteros, composiciones o etapas pueden estar tambien presentes opcionalmente, incluyendo realizaciones, donde ningun numero entero adicional, composicion o etapa o grupo de numero enteros, composiciones o etapas estan presentes. En tales ultimas realizaciones, el termino “que comprende” se usa simultaneamente con “que consiste en”.
Varios documentos se citan a lo largo del texto de esta memoria descriptiva. Cada uno de los documentos citados en el presente documento (incluyendo todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones cientificas, especificaciones del fabricante, instrucciones, presentaciones de secuencias de numero de registro de GenBank etc.), tanto anteriormente como a continuacion, se incorporan por el presente documento como referencia en su totalidad en la medida de lo posible segun la ley de patentes respectiva. Nada en el presente documento ha de interpretarse como una admision de que la invencion no tiene derecho a preceder a tal divulgacion en virtud de invencion anterior.
La presente invencion se describira ahora adicionalmente. En los siguientes pasajes se definen en mas detalle diferentes aspectos de la invencion. Cada aspecto asi definido puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a no ser que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier caracteristica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra caracteristica o caracteristicas indicadas como preferidas o ventajosas.
Por tanto, en un aspecto la presente invencion se refiere a un metodo para la sintesis de y,8-dihidroxiisoleucina 1 o de un sinton para el compuesto 1, que comprende la etapa de metilar el compuesto 3, en particular con yoduro de metilo en presencia de bis(trimetilsilil)amida de litio (LHMDS).
imagen6
En un aspecto alternativo, la presente invencion se refiere a un metodo para la sintesis de y,8-dihidroxiisoleucina 1 o de un sinton para el compuesto 1, que comprende la etapa de metilar el compuesto 3* (que tiene un segundo grupo de proteccion de bencilo en el atomo de nitrogeno en vez del grupo fenilfluorenilo en el compuesto 3), en particular con yoduro de metilo en presencia de bis(trimetilsilil)amida de litio (LHMDS).
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En el contexto de la presente invencion, el termino “sinton” se refiere a un compuesto que es, o puede usarse como, un equivalente sintetico para un compuesto de interes particular en una reaccion quimica. Esta definicion incluye compuestos en los que un resto del compuesto de interes que seria labil o reactivo en las condiciones que van a usarse en dicha reaccion quimica esta protegido o enmascarado por un grupo de proteccion apropiado que puede escindirse tras dicha reaccion quimica.
En una realizacion particular, la reaccion se realiza a una temperatura de entre aproximadamente -10°C y aproximadamente -80°C en un eter durante entre aproximadamente 12 y aproximadamente 20 horas, en particular durante aproximadamente 16 horas. En una realizacion particular, la reaccion se realiza a -20°C y en tetrahidrofurano como disolvente. En realizaciones particulares, se obtiene una pureza diastereomerica mayor de 30:1, en particular mayor de 40:1, en particular de aproximadamente 50:1.
En el contexto de la presente invencion, el termino “aproximadamente” significa entre el 90% y el 110% de un valor o
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intervalo dado.
En una realizacion particular, el metodo comprende ademas una o mas de las siguientes etapas para sintetizar el compuesto 3:
(a) reaccion de ester monometilico de acido L-aspartico A con 2-metilpropeno para crear el compuesto B;
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(b) reaccion de B con benzaldehido para crear el compuesto C;
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(c) reaccion de C con bromuro de fenilfluoreno para crear el compuesto 3.
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En una realizacion del aspecto alternativo, el metodo comprende ademas una o mas de las siguientes etapas para sintetizar el compuesto 3*:
(a) reaccion de ester monometilico de acido L-aspartico A con 2-metilpropeno para crear el compuesto B;
(b) reaccion de B con benzaldehido para crear el compuesto C;
(c) reaccion de C con bromuro de bencilo para crear el compuesto 3*.
En una realizacion particular, el metodo comprende ademas una o mas de las siguientes etapas:
(a) reduccion del compuesto 2, en particular con hidruro de diisobutilaluminio (DiBAI-H) para crear el compuesto D;
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(b) oxidacion del compuesto de hidroxilo D, en particular usando una oxidacion de Swern, para crear el compuesto E;
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(c) conversion de E, en particular en condiciones de una reaccion de Wittig, para crear el compuesto 4;
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(d) conversion de 4, en particular en condiciones de una oxidacion de Sharpless, para crear el compuesto F;
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(e) conversion de F, en particular en condiciones de esterificacion cataliticas, para crear el compuesto 5;
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(f) desproteccion de N de 5, en particular usando hidrogenacion catalizada por paladio, para crear el compuesto 6.
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En una realizacion particular del aspecto alternativo, el metodo comprende ademas una o mas de las siguientes etapas:
(a) reduccion del compuesto 2*, en particular con hidruro de diisobutilaluminio (DiBAI-H) para crear el compuesto D* (que tiene un segundo grupo de proteccion de bencilo en el atomo de nitrogeno en vez del grupo fenilfluorenilo en el compuesto D);
(b) oxidacion del compuesto de hidroxilo D*, en particular usando una oxidacion de Swern, para crear el compuesto E* (que tiene un segundo grupo de proteccion de bencilo en el atomo de nitrogeno en vez del grupo fenilfluorenilo en el compuesto E);
(c) conversion de E*, en particular en condiciones de una reaccion de Wittig, para crear el compuesto 4* (que tiene un segundo grupo de proteccion de bencilo en el atomo de nitrogeno en vez del grupo fenilfluorenilo en el compuesto 4);
(d) conversion de 4*, en particular en condiciones de una oxidacion de Sharpless, para crear el compuesto F* (que tiene un segundo grupo de proteccion de bencilo en el atomo de nitrogeno en vez del grupo fenilfluorenilo en el compuesto F);
(e) conversion de F*, en particular en condiciones de esterificacion cataliticas, para crear el compuesto 5* (que tiene un segundo grupo de proteccion de bencilo en el atomo de nitrogeno en vez del grupo fenilfluorenilo en el compuesto 5); y
(f) desproteccion de N de 5*, en particular usando hidrogenacion catalizada por paladio, para crear el compuesto 6.
En una realizacion particular, el metodo comprende ademas la etapa de aislar y purificar el compuesto 6. En una realizacion particular, el compuesto 6 se purifica como clorhidrato usando precipitacion y/o purificacion cromatografica.
En un segundo aspecto, la presente invencion se refiere al compuesto 6.
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En una realizacion particular, el compuesto 6 tiene una pureza mayor del 90%, en particular mayor del 95%.
En el contexto de la presente invencion, el termino “pureza” se refiere a la cantidad total del compuesto 6 y de sus diaestereoisomeros que estan presentes. Una pureza mayor del 90%, por ejemplo, significa que en 1 g de una composicion que comprende el compuesto 6, hay mas del 90%, es decir mas de 900 mg, del compuesto 6 y/o sus estereoisomeros. La parte restante, es decir las impurezas, puede incluir material de partida sin reaccionar y otros reactivos, disolventes, productos de escision y/o productos secundarios.
En una realizacion particular, una composicion que comprende el compuesto 6 con una pureza mayor del 90% comprende mas de 100 mg del compuesto 6.
En una realizacion particular, el compuesto 6 tiene una pureza diastereomerica mayor de 70:30.
En el contexto de la presente invencion, el termino “pureza diastereomerica” se refiere a la razon de la cantidad de compuesto 6 que esta presente en una composicion que comprende el compuesto 6 con respecto a las cantidades de sus diaestereoisomeros que estan presentes en dicha composicion. Una pureza diastereomerica mayor de 70:30, por ejemplo, significa que mas del 70% de la cantidad total de dihidroxiisoleucinas protegidas en una composicion que comprende el compuesto 6 y de sus diastereomeros es el compuesto 6, mientras que la cantidad total de todos los diaestereoisomeros del compuesto 6 es correspondientemente menor del 30%.
En una realizacion particular, una composicion que comprende el compuesto 6 con una pureza diastereomerica mayor de 70:30 comprende mas de 100 mg del compuesto 6.
En un tercer aspecto, la presente invencion se refiere a un kit que comprende el compuesto 6, en particular un kit que comprende al menos 100 mg del compuesto 6, y al menos un reactivo adicional para la sintesis de amatoxinas o precursores de las mismas.
En realizaciones particulares, el compuesto 6 en el kit tiene una pureza mayor del 90%, en particular mayor del 95%, y/o una pureza diastereomerica mayor de 70:30.
En realizaciones particulares, dicho al menos un reactivo adicional se selecciona de la lista de:
(i) una resina, en particular una resina seleccionada del grupo de: una resina de Merrifield; una resina de amida de Rink; y una resina de THP;
(ii) una hidroxiprolina protegida, en particular O-alil-hidroxiprolina protegida con fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) (FmocHypOAll);
(iii) una asparagina protegida, en particular N-tritil-asparagina protegida con Fmoc (Fmoc(N-Tri)AsnOH);
(iv) un dipeptido Cys-Trp protegido, en particular dipeptido Cys-Trp protegido con Fmoc con grupos de proteccion de -SH y -OH (FmocCys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-alil))]OH);
(v) una glicina protegida, en particular glicina protegida con Fmoc (FmocGly);
(vi) una isoleucina protegida, en particular isoleucina protegida con Fmoc (Fmoclle);
(vii) un reactivo de acoplamiento peptidico, en particular un reactivo de acoplamiento peptidico seleccionado del grupo de: tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio (TBTU); hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio (PyBOP); y hexafluorofosfato de o-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’- tetrametiluronio (HATU); y
(viii) una amina terciaria, en particular N,N-diisopropiletilamina (DiPEA).
En aun otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para sintetizar una amatoxina, o molecula
precursora de la misma, que comprende la etapa de (a) acoplar el compuesto 6 a hidroxiprolina, haciendo reaccionar en particular el compuesto 6 con una resina precargada con hidroxiprolina, en particular acoplando el compuesto 6 al extremo terminal C libre de FmocHypOH inmovilizado sobre una resina L, por ejemplo, una resina de tetrahidropiranilo (THP).
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En realizaciones particulares, los aminoacidos restantes se acoplan entonces mediante una estrategia de sintesis N- terminal. En tales realizaciones particulares, el metodo de la presente invencion comprende adicionalmente una o 10 mas de las siguientes etapas:
(b) desproteccion de N con Fmoc iterativa y acoplamiento de G con Fmoc-(N-Tri)Asn OH; FmocCys(S-2-((o- N02Ph)SO2Trp-O-alil))]OH, Fmoc-Gly OH, Fmoc-lle Oh, Fmoc-Gly OH para crear el compuesto H:
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(d) desproteccion de N con 2-nitro-arilsulfonamida y separacion de I de la resina para crear el compuesto J:
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En aun otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para sintetizar una amatoxina, o molecula 10 precursora para la misma, en disolucion.
En determinadas realizaciones, tal metodo comprende una o mas de las siguientes etapas:
(a) acoplamiento del compuesto 6 con hidroxiprolina, haciendo reaccionar en particular el compuesto 6 con una 15 hidroxiprolina, acoplando en particular el compuesto 6 al extremo terminal C libre de Fmoc (OtBu) HypOH;
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(b) desproteccion de N con Fmoc iterativa y acoplamiento de M con Fmoc-(N-Tri)Asn OH; Fmoc-(S-Tri)Cys OH, 20 Fmoc-Gly OH, Fmoc-lle OH, Fmoc-Gly OH y N-Boc-HPI OH para crear el compuesto N;
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(c) desproteccion acida de grupos de proteccion de N y S-tritilo, O-terc-butilo y N-tercbutiloxicarbonilo y cierre de anillo in situ mediante una reaccion de Savige-Fontana (Savige & Fontana, Int J Pept Protein Res. 15 (1980) 102-12) produciendo el compuesto J.
En aun otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para sintetizar una amatoxina, o molecula precursora para la misma, en disolucion, que comprende la etapa acoplar el compuesto 6 a hidroxiprolina, haciendo reaccionar en particular el compuesto 6 con una hidroxiprolina, acoplando en particular el compuesto 6 al extremo terminal C libre de Fmoc (OtBu) HypOH.
En realizaciones particulares, la amatoxina es una amatoxina con un resto de dihidroxiisoleucina como aminoacido 3 (vease la figura 1).
En el contexto de la presente invencion, el termino “amatoxina” incluye todos los peptidos ciclicos compuestos por 8 aminoacidos tal como se aislaron a partir del genero Amanita y descritos en Wieland, T. y Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. Dic. de 1978; 5(3):185-260), y ademas incluye todos los derivados quimicos de los mismos; ademas todos los analogos semisinteticos de los mismos; ademas todos los analogos sinteticos de los mismos construidos a partir de elementos estructurales segun la estructura madre de los compuestos naturales (ciclicos, 8 aminoacidos), ademas todos los analogos sinteticos o semisinteticos que contienen aminoacidos no hidroxilados en vez de los aminoacidos hidroxilados, ademas todos los analogos sinteticos o semisinteticos, en los que el resto de sulfoxido de tioeter se reemplaza por un sulfuro, una sulfona o por atomos diferentes de azufre, por ejemplo, un atomo de carbono como un carba-analogo de amanitina, en cada caso en el que cualquier derivado o analogo de este tipo es funcionalmente activo inhibiendo ARN-polimerasa II de mamiferos.
Funcionalmente, las amatoxinas se definen como peptidos o depsipeptidos que inhiben ARN-polimerasa II de mamiferos. Amatoxinas preferidas son aquellas con un grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxilico, un grupo amino, un grupo hidroxilo, un tiol o un grupo de captura de tiol) que pueden hacerse reaccionar con moleculas de ligador o restos de union a la diana tal como se definieron anteriormente. Amatoxinas que son en particular adecuadas para los conjugados de la presente invencion son a-amanitina, p-amanitina, y-amanitina, e-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina y acido amanulinico tal como se muestra en la figura 1 asi como sales, derivados quimicos, analogos semisinteticos y analogos sinteticos de los mismos. Amatoxinas en particular preferidas para su uso en la presente invencion son a-amanitina, p-amanitina y amaninamida.
Tal como se usa en el presente documento, un “derivado quimico” (o abreviado: un “derivado”) de un compuesto se refiere a especies que tienen una estructura quimica que es similar a la del compuesto, pero que contiene al menos un grupo quimico que no esta presente en el compuesto y/o deficiente en al menos un grupo quimico que esta presente en el compuesto. El compuesto con el que se compara el derivado se conoce como compuesto “original”. Normalmente, un “derivado” puede producirse a partir del compuesto original en una o mas etapas de reaccion quimica.
Ejemplos
A continuacion, la invencion se explica en mas detalle mediante ejemplos no limitativos:
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Ejemplo 1
Reaccion de Mannich usando aldehido propionico y N-PMP glioxalimina
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Una de las caracteristicas estructurales clave de 1 es la conformacion 2S,3R del grupo metilo y amino. Un acceso facil para la construccion de los estereocentros adyacentes es la reaccion de Mannich. Sin embargo, ambos estereocentros producen una reaccion de tipo anti-Mannich con alto control diastereomerico y enantiomerico. Esta premisa se describe mediante el uso de un organocatalizador designado descrito facilmente en J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 1040-1041. Sin embargo, fallaron diferentes enfoques para eliminar el grupo PMP y dieron mezclas de reaccion, de modo que este enfoque se descarto finalmente. Se conoce en la bibliografia que la eliminacion puede ser bastante tediosa e insatisfactoria, aunque el grupo PMP es necesario para la reaccion.
Ejemplo 2
Alquilacion de derivado de acido aspartico
2.1 Introduccion
Un enfoque alternativo para sintetizar un sinton de y,8-dihidroxiisoleucina con estereoconfiguracion correcta (2S,3R,4R) comenzo con derivado 3 de acido aspartico. Se han descrito enfoques similares en la bibliografia (vease Yoshida et al., A large scale production of (3S,4S)-3-(tert-Butoxycarbonyl)amino-4-methylpyrrolidine and its analogs from L-Aspartic acid, Chem Pharm Bull (1996), 44, 1128 - 1131; Wolf y Rapoport, Conformationally constrained Peptides. Chirospecific Synthesis of 4-AlkylSubstituted g-Lactam-Bridged Dipeptides from L-Aspartic acid’, J Org Chem (1989), 54, 3164-3173). Resulto que es extremadamente importante (i) usar una combinacion de o bien (ia) un grupo bencilo y un grupo fenilfluorenilo, o bien (ib) dos grupos bencilo, para proteger el grupo amino libre, y (ii) usar hexametildisilazano de litio (LHMDS) en vez de la sal de potasio correspondiente. Hexametildisilazano de potasio (KHMDS) condujo a la configuracion contraria.
2.2 Sintesis del compuesto 2
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Se cargo un matraz de fondo redondo de tres bocas con barra agitadora magnetica, embudo de goteo y termometro de temperatura baja con 16,3 mmol, 8,7 g del compuesto 3 (vease el ejemplo 3), disuelto en 150 ml de tetrahidrofurano seco y se enfrio hasta -20°C. Se anadieron gota a gota 40 ml de una disolucion 1,0 M en hexano de hexametildisilazida de litio en el plazo de 15 minutos. La reaccion se mantuvo a -20°C durante 2 horas antes de enfriarse hasta -80°C. Finalmente se anadieron 12,2 ml, 19,6 mmol, 1,2 eq. de yoduro de metilo. Se permitio que la reaccion se calentara lentamente y se mantuvo durante 4 horas adicionales a -20°C. La reaccion se extinguio finalmente por adicion de 10 ml de metanol, se permitio que se enfriara hasta temperatura ambiente y se vertio en 150 ml agua. Se extrajo la fase acuosa con t-butil metil eter, se seco sobre MgSO4 y se concentro a vacio. Producto en bruto: 9,0 g. La 1H-RMN del producto en bruto revelo una pureza diastereoselectiva mejor que 5:1. Rendimiento
7,2 g, 81%.
Se purifico el producto en bruto mediante cromatografia ultrarrapida, 330 g de silice, gradiente desde el 0% hasta el 50% de n-hexano/t-butil metil eter. 1H-RMN: d 0,72 (d, 3 H, J = 5,6 Hz), 1,03 (s, 9 H), 2,64 (dt, 1 H, J = 5,6, 8,4 Hz), 3,55 (s, 3 H), 3,85 (d, 1 H, J = 8,4 Hz), 4,31 (d, 1 H, J = 11,2 Hz), 4,65 (d, 1 H, J = 11,2 Hz), 7,15-7,94 (m, 18 H).
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2.3 Sintesis del compuesto 2*
De manera analoga al ejemplo 2.2, el compuesto 2* puede sintetizarse a partir de 3*. Ejemplo 3
Sintesis del compuesto 3
3.1 Introduccion
Se sintetizo el compuesto 3 segun el protocolo descrito por Dunn et al. (Dunn et al., Stereoselective synthesis of 2,3- diaminoacids. 2,3-Diamino-4-phenylbutanoic acid, J. Org. Chem. 55 (1990) 5017-25.
3.2 Sintesis del compuesto B
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Se colocaron en un cilindro de vidrio de fondo redondo con un tapon de rosca y barra agitadora 25 g, 136 mmol de clorhidrato de 4-metil-L-aspartato. Se suspendio el monoester A en 100 ml de dioxano/tetrahidrofurano (1:1, v/v) y 25 ml de acido sulfurico y se enfrio hasta -30°C (criostato). Se condenso 2-metilpropeno, 200 g, 3,56 mol. Se cerro el cilindro y se permitio que se calentara hasta temperatura ambiente. Se vertio la mezcla de reaccion en 1000 ml de disolucion de bicarbonato de sodio saturada y se extrajo con acetato de etilo (5 veces 400 ml). Se seco la fase organica combinada sobre MgSO4 y se concentro a vacio. Rendimiento: 17,88 g, 64,6%.
3.3 Sintesis del compuesto C
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Se cargo un matraz de fondo redondo con termometro y barra agitadora con 17,9 g, 87,9 mmol de B, se disolvieron en 500 ml de metanol y 150 ml de acido acetico. Se anadieron gota a gota 16,0 ml, 158 mmol de benzaldehido. Se mantuvo la reaccion a temperatura ambiente durante 2 horas y finalmente se enfrio hasta 0°C. Se anadieron 10,0 g, 159 mmol de cianoborohidruro de sodio en el plazo de 45 min y se agito durante 15 min adicionales a 0°C. La mezcla de reaccion se vertio finalmente en 1000 ml de bicarbonato de sodio y se agito durante 10 minutos. Tras la extraccion con diclorometano (5 veces 250 ml), se secaron las fases organicas combinadas sobre MgSO4 y se concentraron a vacio. Producto en bruto: 35 g. Rendimiento 14,3 g, 55,4%.
Purificacion cromatografica ultrarrapida, 330 g de SiO2, gradiente del 0 al 50% de n-hexano/acetato de etilo. 1H- RMN: d 1,42 (s, 9 H), 2,29 (s, 1 H), 2,62 (t, 2 H, J = 9,2 Hz), 2,50 (t, 1 H, J = 8 Hz), 3,62 (s, 3 H), 3,67 (d, 1 H, 17,6 Hz), 3,83 (d, 1 H, J = 17,2 Hz), 7,19 - 7,30 (m, 5 H).
3.4 Sintesis del compuesto 3
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Se cargo un matraz de fondo redondo con barra agitadora con 21,3 g, 51,6 mmol de C, en 500 ml de acetonitrilo. Se anadieron 25,0 g, 77,8 mmol de 9-bromo-9-fenilfluoreno, 20,0 g, 60,3 mmol de nitrato de plomo, 31,7 g, 149,3 mmol de K3PO4. Se mantuvo la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 2,0 h. Tras la finalizacion, se diluyo la reaccion con 500 ml de diclorometano, se seco sobre Na2SO4 y se filtro sobre Celite. Se concentro el producto a vacio. Rendimiento: 16,2 g, 41,7%.
Purificacion cromatografica ultrarrapida, 330 g de SiO2, gradiente del 0 al 50% de n-hexano/t-butil metil eter. 1H- RMN: d 1,14 (s, 9 H), 1,92 (dd, 1 H, J = 2,8, 16 Hz), 2,54 (dd, 1 H, 10,8, 15,8 Hz), 3,40 (s, 3 H), 3,86 (d, 1 H, J = 13,6 Hz), 4,21 (d, 1 H, J = 14 Hz), 7,17 - 7,83 (m, 18 H).
Ejemplo 4
Sintesis del compuesto 6
4.1 Sintesis del compuesto D
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Se cargo un matraz de fondo redondo equipado con barra agitadora, termometro y embudo de goteo con 16,4 g, 29,9 mmol de 2, se disolvio en 150 ml de tetrahidrofurano seco y se enfrio hasta -30°C. Se anadio una disolucion de hidruro de diisobutilaluminio 1,0 M (150 ml) bajo una atmosfera inerte (argon) en el plazo de 1,0 horas y se agito durante 16 horas adicionales. Se hidrolizo la reaccion con Na2SO4 decahidratado y se permitio que se calentara hasta temperatura ambiente. Se separo el precipitado por filtracion y se lavo a fondo con t-butil metil eter. Se concentro la fase organica a vacio. Rendimiento: 14,3 g, 92%.
Purificacion cromatografica ultrarrapida, 330 g de SiO2, gradiente del 0 al 50% de n-hexano/acetato de etilo. 1H- RMN: d 0,45 (d, 3 H, J = 6,8 Hz), 1,02 (s, 9 H), 3,09 (d, 1 H, J = 10,8 Hz), 3,34 (dq, 1 H, J = 7,2 Hz, J = 14,8 Hz), 4,00 (d, 2 H, J = 10,8 Hz), 4,36 (d, 1 H, 13,6 Hz), 4,73 (d, 1 H, J = 13,6 Hz), 7,20 - 7,76 (m, 18 H).
4.2 Sintesis del compuesto E
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Se cargo un matraz de fondo redondo equipado con barra agitadora, termometro, embudo de goteo y entrada de argon con 3,28 ml, 35,5 mmol de cloruro de oxalilo en diclorometano y se enfrio hasta -80°C. Se anadieron lentamente 5,47 ml, 71,1 mmol de dimetilsulfoxido seco diluido con 20 ml de diclorometano. Se anadieron 13,67 g, 25,9 mmol de compuesto D disuelto en 30 ml de diclorometano, a lo largo de un periodo de 15 minutos. Tras 15 min adicionales a -80°C, se anadio trietilamina y se permitio que la reaccion se calentara hasta temperatura ambiente. Se separaron ambas fases y se extrajo la acuosa con diclorometano (4 veces 150 ml). Se secaron las fases organicas combinadas sobre MgSO4, y se concentraron a vacio. Producto en bruto: 16,9 g. El producto en bruto se convirtio directamente en la olefina.
4.3 Sintesis del compuesto 4
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Se cargo un matraz de fondo redondo con barra agitadora, termometro y entrada de argon con 2,32 g, 57,9 mmol de hidruro de sodio suspendido en 120 ml de dimetilsulfoxido. Se calento la suspension hasta 50°C durante 30 minutos y se enfrio hasta temperatura ambiente. Entonces se anadio bromuro de metiltrifenilfosfonio solido y se agito durante 15 minutos. Se anadio el producto en bruto E, disuelto en 20 ml de dimetilsulfoxido, y se agito durante 16 horas adicionales. Tras hidrolisis (300 ml de agua), extraccion con acetato de etilo (4 veces 150 ml), lavado a fondo de la fase organica combinada con agua (3 veces 150 ml) y salmuera, se seco la disolucion con MgSO4 y se concentro a vacio. Rendimiento: 13,3 g, 99,2% (2 etapas).
Purificacion cromatografica ultrarrapida, 330 g de SiO2 gradiente del 0 al 80% de n-hexano/acetato de etilo. 1H-RMN: d 0,51 (d, 3 H, J = 1,6 Hz), 1,05 (s, 9 H), 2,14 (hept, 1 H, J = 0,8 Hz), 3,15 (d, 1 H, 10,8 Hz), 4,30 (d, 1 H, J = 14 Hz), 4,49 (dd, 1 H, J = 1,2, 17,6 Hz), 4,57 (d, 1 H, 13,6 Hz), 5,03 (d, 1 H, J = 0,8, 10,8 Hz), 5,95 (m, 1 H), 7,26 - 7,60 (m, 18 H).
4.4 Sintesis del compuesto F
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Se cargo un matraz de fondo redondo con 100 g de mezcla AD (beta, fuente comercial) y se disolvio en 60 ml de t-
butanol/agua (1:1, v/v). Se anadieron en una porcion 3,75 g, 7,3 mmol del compuesto 5 disuelto en 17 ml de dioxano. Se agito la reaccion a temperatura ambiente durante 4 dias hasta la finalizacion de la reaccion. Se extinguio la reaccion por adicion de Na2SO3 y se extrajo con acetato de etilo (4 veces 50 ml), se lavo con Nl-UCl saturado y salmuera, se seco sobre MgSO4 y se concentro a vacio. Rendimiento: 1,19 g, 29%.
5
Purificacion cromatografica ultrarrapida, 330 g de SiO2, gradiente del 0 al 80% de diclorometano/t-butil metil eter. 1H- RMN: d 0,38 (D, 3 H, J = 6,8 Hz), 1,03 (s, 9 H), 1,84 (s + m, 2 H, J = 8,8 Hz), 3,24 (dd, 1 H, J = 4,8, 11,4 Hz), 3,38 (d, 2 H, J = 10,9 Hz), 3,76 (m, 1 H), 4,40 (d, 1 H, J = 13,3 Hz), 4,95 (d, 1 H, J = 13,3 Hz), 5,55 (s, 1 H), 7,26 - 7,91 (m, 18 H).
10
4.4 Sintesis del compuesto 5
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15 Se cargo un matraz de fondo redondo con una barra agitadora magnetica con 2,1 g, 3,64 mmol de F, disuelto en 75 ml de diclorometano. Se anadieron 5,0 ml, 52,3 mmol de anhidrido de acido acetico en exceso y cantidades cataliticas de dimetilaminopiridina. Se permitio que la reaccion se agitara a temperatura ambiente durante la noche. Rendimiento: 1,83 g, 81%.
20 Purificacion cromatografica ultrarrapida, 330 g de SiO2 gradiente del 0 al 20% de hexano/t-butil metil eter. 1H-RMN: d 0,49 (d, 3 H, J = 7,2 Hz), 1,05 (s, 9 H), 1,74 (m, 1 H, J = 2,90 Hz), 1,88 (s, 3 H), 2,11 (s, 3 H), 3,18 (d, 1 H, J = 10,5 Hz), 3,60 (dd, 1 H, J = 2,3, 12,2 Hz), 4,32 (d, 1 H, J = 13,9 Hz), 4,74 (d, 1 H, J = 13,9 Hz), 5,98 (dd, 1 H, J = 2,4, 84 Hz), 7,10 - 7,73 (m, 18 H).
25 4.4 Sintesis del compuesto 6
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Se cargo un matraz de fondo redondo equipado con una entrada de argon y colector de vacio con 2,0 g, 3,1 mmol 30 de 5 disuelto en 50 ml de acido clorhidrico 0,1 M en etanol y 200 mg de paladio al 10% sobre carbon. Tras purgar el matraz con hidrogeno, se permitio que la reaccion se agitara durante 16 horas a temperatura ambiente. Se purgo el matraz con argon, se filtro y se concentro el filtrado a vacio. Se trato el aceite transparente con n-hexano (3 veces) para eliminar el fenilfluoreno. Se obtuvo una sal de clorhidrato de 6 como un solido blanco. Rendimiento: 0,92 g, 98%.
Purificacion ,mediante precipitacion o cromatografia. 1H-RMN: (isomero principal) d 1,16 (d, 3 H, J = 6,8 Hz), 1,47 (S, 9 H), 2,06 (s, 3 H), 2,09 (s, 3 H), 2,78 (m, 1 H, J = 7,7 Hz), 4,04 (dd, 1 H, J = 3,9, 12,5 Hz), 4,15 (s, 1 H), 4,52 (dd, 2 H, J = 2,08, 12,6 Hz), 5,02 (m, 2 H), 8,86 (s, 2 H). 13C-RMN: (isomero principal) d 11,5, 20,8, 21,7, 35,0, 53,9, 62,4,
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72,2, 84,9, 166,2, 169,9, 170,7. Ejemplo 5
Sintesis de a-amatoxina
5.1 Sintesis del compuesto G
Se cargo un tubo de reaccion de polipropileno de recipiente abierto equipado con una frita y valvula de drenaje con
0. 5.g, 0,5 mmol de tetrahidropiranil-poliestireno FmocHypOH y se permitio que se hinchara en 3,0 ml de dimetilformamida durante 20 minutos. Tras la eliminacion del disolvente a traves de la valvula de drenaje, se cargo el recipiente de reaccion con 179 mg, 0,6 mmol de 6, disuelto en 1,5 ml de dimetilformamida, 1,5 ml de una disolucion de hidroxibenzotiazol 1 mM en dimetilformamida, 1,5 ml de una disolucion de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1- iloxi)tripirrolidinfosfonio 1 mM en dimetilformamida y 259 ^l de diisopropiletilamina. Tras la homogeneizacion con una barra de vidrio se calento la reaccion asistida por microondas hasta 70°C durante 4,0 minutos y se lavo finalmente con dimetilformamida (3 veces) y diclorometano (2 veces).
Se escindio una alicuota, aproximadamente 20 mg del polimero, con acido trifluoroacetico/agua/trietilsilano (8:2:10; v/v/v) para analisis por espectroscopia de masas. EM: 582,92; [M-tBu+H]+; Fmoc-Hyp-bis(O-acetil)dihidroxi-Ile-OtBu
5.2 Sintesis del compuesto H
Se desprotegio entonces el compuesto G con Fmoc de manera iterativa y se acoplo con los 6 aminoacidos restantes tal como sigue:
Desproteccion de N con Fmoc:
Se trato dos veces la resina con 4,5 ml de una disolucion de piperidina al 20% en dimetilformamida y se calento hasta 70°C durante 3 minutos asistida por microondas. Entonces se lavo la resina con dimetilformamida (3 veces).
Acoplamiento de aminoacidos:
Se hizo reaccionar con exito un peptido unido a resina desprotegido en 1,5 ml de dimetilformamida con aminoacidos (vease la lista) disueltos en 1,5 ml de dimetilformamida, 1,5 ml de una disolucion de hidroxibenzotiazol 1 mM en dimetilformamida, 1,5 ml de una disolucion de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinfosfonio 1 mM en dimetilformamida y 259 ^l de diisopropiletilamina. Tras la homogeneizacion con una barra de vidrio se calento la reaccion asistida por microondas hasta 70°C durante 4,0 minutos y se lavo finalmente con dimetilformamida (3 veces) y diclorometano (2 veces).
Se escindio una alicuota, aproximadamente 20 mg del polimero, con acido trifluoroacetico/agua/trietilsilano (8:2:10; v/v/v) para analisis por espectroscopia de masas.
Aminoacidos que van a acoplarse:
1. Fmoc-(N-Tri)Asn OH
2. Fmoc-Cys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-alil))]OH
3. Fmoc-Gly OH
4. Fmoc-Ile OH
5. Fmoc-Gly OH
EM: 1227,14; [M-tBu+H]+; 1283,00; [M+H]+; FmocCys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-alil))]-Asn-Hyp-bis(O-acetil)dihidroxi- Ile-OtBu.
EM: 1453,98; [M-tBu+H]+; [M+H]+; FmocGly-Ile-Gly-Cys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-alil))]-Asn-Hyp-bis(O-
acetil)dihidroxi-Ile-OtBu
5.3 Sintesis del compuesto I; cierre del anillo B
Se desprotegio con exito la resina H con alilo y Fmoc antes de la ciclacion del anillo B:
Desproteccion de O-alilo
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Se agito la resina durante la noche a temperatura ambiente con 874 mg, 5,6 mmol de acido N,N-dimetilbarbiturico, 258 mg, 0,224 mmol de Pd(PPh3)4 en diclorometano. Se lavo la resina tras 16 horas con diclorometano; dimetilformamida; acetonitrilo; y t-butil metil eter.
Desproteccion de N con Fmoc:
Se trato dos veces la resina con 4,5 ml de una disolucion de piperidina al 20% en dimetilformamida y se calento hasta 70°C durante 3 minutos asistida por microondas. Entonces se lavo la resina con dimetilformamida (3 veces).
Formacion del anillo B
Se hizo reaccionar un peptido unido a resina desprotegido en 3,0 ml dimetilformamida con 1,5 ml de una disolucion de hidroxibenzotiazol 1 mM en dimetilformamida, 1,5 ml de una disolucion de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1- iloxi)tripirrolidinfosfonio 1 mM en dimetilformamida y 259 pl de diisopropiletilamina. Tras la homogeneizacion con una barra de vidrio se calento la reaccion asistida por microondas hasta 70°C durante 4,0 minutos y se lavo finalmente con dimetilformamida (3 veces) y diclorometano (2 veces).
Se escindio una alicuota, aproximadamente 20 mg del polimero, con acido trifluoroacetico/agua/trietilsilano (8:2:10; v/v/v) para analisis por espectroscopia de masas. EM: 1174,08; [M-tBu+H]+; 1229,96; [M+H]+; [Gly-Ile-Gly-Cys(S-2- ((o-NO2Ph)SO2Trp))]anillo-Asn-Hyp-bis(O-acetil)dihidroxi-Ile-OtBu
5.4 Desproteccion de N con 2-NO?-fenilsulfonilo y separacion de la resina, compuesto J
Se desprotegio la resina I con 2-NO2-fenilsulfonilo y se escindio finalmente a partir de la resina.
Desproteccion de N con 2-NO2-fenilsulfonilo:
Se trato repetidamente (3 veces) la resina con 500 pl de mercaptoetanol y 500 pl de diazabicicloundeceno en 4 ml de dimetilformamida durante 2 horas. Entonces se lavo la resina intensamente con dimetilfomamida, diclorometano, acetonitrilo y t-butil metil eter.
Separacion de la resina:
Se trato entonces la resina con 6 ml de acido trifluoroacetico/agua/trietilsilano (8:2:10; v/v/v) a temperatura ambiente durante la noche y se concentro a vacio la proteina en bruto.
EM: 989,18; [M-tBu+H]+; [Gly-Ile-Gly-Cys(S-2-(Trp))]anillo-Asn-Hyp-bis(O-acetil)dihidroxi-Ile-OtBu
5.5 Sintesis del compuesto K; formacion del anillo A
Se disolvio el producto en bruto J en un matraz de reaccion con barra agitadora en 25 ml de dimetilformamida. A la disolucion se le anadieron 85 pl, 2,5 mmol de diisopropiletilamina y 135 ml, 2,5 mmol de difenilfosfacida. Se permitio que la mezcla de reaccion se agitara durante la noche a temperatura ambiente. La disolucion se concentro finalmente a vacio, se disolvio en 0,5 ml de metanol y se purifico. Rendimiento: 4,9 mg.
Se purifico la mezcla de reaccion en bruto mediante cromatografia en columna preparativa. EM: 858,94; [M+H]+ Ejemplo 6
Sintesis del compuesto 3*
De manera analoga al ejemplo 3.4, puede sintetizarse el compuesto 3* a partir del compuesto C usando bromuro de bencilo en vez de 9-bromo-9-fenilfluoreno para la proteccion de N.
Ejemplo 7
Sintesis alternativa del compuesto 6
De manera analoga al ejemplo 4, puede sintetizarse el compuesto 6 a partir del compuesto 2* mediante los compuestos intermedios D*, E*, 4*, F* y 5* (teniendo cada uno un segundo grupo de proteccion de bencilo en el atomo de nitrogeno en vez del grupo fenilfluorenilo en el compuesto correspondiente D, E, 4, F y 5, respectivamente).

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Metodo para la sintesis de Y,8-dihidroxiisoleucina 1 o de un sinton para el compuesto 1, que comprende la etapa de metilar el compuesto 3 o 3* con yoduro de metilo en presencia de bis(trimetilsilil)amida de litio (LHMDS)
    imagen1
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la reaccion se realiza a una temperatura de entre aproximadamente - 10°C y aproximadamente -802C en un eter durante entre aproximadamente 12 y aproximadamente 20 horas.
  3. 3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende ademas una o mas de las siguientes etapas:
    (a) reaccion de ester monometilico de acido L-aspartico A con 2-metilpropeno para crear el compuesto B;
    imagen2
    imagen3
    (c) reaccion de C con bromuro de fenilfluorenilo para crear el compuesto 3, o con bromuro de bencilo para crear el compuesto 3*
    imagen4
  4. 4. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende ademas una o mas de las siguientes etapas:
    (a) reduccion del compuesto 2 o compuesto 2*, en particular con hidruro de diisobutilaluminio para crear el
    5
    10
    15
    compuesto D o D*, respectivamente;
    imagen5
    (b) oxidacion del compuesto de hidroxilo D o D*, en particular usando una oxidacion de Swern, para crear el compuesto E o E*, respectivamente;
    imagen6
    (c) conversion de E o E*, en particular en condiciones de una reaccion de Wittig, para crear el compuesto 4 o 4*, respectivamente;
    imagen7
    (d) conversion de 4 o 4*, en particular en condiciones de una oxidacion de Sharpless, para crear el compuesto F o F*, respectivamente;
    imagen8
    (e) conversion de F o F*, en particular en condiciones de esterificacion cataliticas, para crear el compuesto 5 o 5*, respectivamente;
    5
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    15
    20
    25
    30
    imagen9
    y
    (f) desproteccion de N de 5 o 5*, en particular usando hidrogenacion catalizada por paladio, para crear el compuesto 6
    imagen10
  5. 5. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas la etapa de aislar y purificar el compuesto 6, en particular en el que el compuesto 6 se purifica como clorhidrato usando precipitacion y/o purificacion cromatografica.
  6. 6. Compuesto de estructura 6:
    imagen11
  7. 7. Compuesto segun la reivindicacion 6, en el que el compuesto tiene una pureza mayor del 90%, en particular mayor del 95%.
  8. 8. Compuesto segun la reivindicacion 6, en el que el compuesto 6 tiene una pureza diastereomerica mayor de 70:30.
  9. 9. Kit que comprende el compuesto 6, en particular que comprende al menos 100 mg del compuesto 6, y uno o mas reactivos adicionales para la sfntesis de amatoxinas o precursores de las mismas.
  10. 10. Kit segun la reivindicacion 9, en el que dichos uno o mas reactivos adicionales se seleccionan de la lista de:
    (i) una resina, en particular una resina seleccionada del grupo de: una resina de Merrifield; una resina de amida de Rink; y una resina de THP;
    (ii) una hidroxiprolina protegida, en particular O-alil-hidroxiprolina protegida con fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) (FmocHypOAll);
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    (iii) una asparagina protegida, en particular N-tritil-asparagina protegida con Fmoc (Fmoc(N-Tri)AsnOH);
    (iv) un dipeptido Cys-Trp protegido, en particular dipeptido Cys-Trp protegido con Fmoc con grupos de proteccion de -SH y -OH (FmocCys(S-2-((o-NO2Ph)SO2Trp-O-alil))]OH);
    (v) una glicina protegida, en particular glicina protegida con Fmoc (FmocGly);
    (vi) una isoleucina protegida, en particular isoleucina protegida con Fmoc (Fmoclle);
    (vii) un reactivo de acoplamiento peptfdico, en particular un reactivo de acoplamiento peptfdico seleccionado del grupo de: tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU); hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -il-oxitripirrolidinofosfonio (PyBOP); y hexafluorofosfato de o-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametiluronio (HATU); y
    (viii) una amina terciaria, en particular N,N-diisopropiletilamina (DiPEA).
  11. 11. Metodo para sintetizar una amatoxina, o molecula precursora para la misma, que comprende la etapa de (a) acoplar el compuesto 6 a hidroxiprolina, haciendo reaccionar en particular el compuesto 6 con una resina precargada con hidroxiprolina, acoplando en particular el compuesto 6 al extremo terminal C libre de FmocHypOH inmovilizado sobre una resina L, en particular una resina de tetrahidropiranilo (THP)
    imagen12
  12. 12. Metodo segun la reivindicacion 11, en el que los aminoacidos restantes se acoplan entonces mediante una estrategia de sfntesis N-terminal.
  13. 13. Metodo segun la reivindicacion 12, que comprende adicionalmente una o mas de las siguientes etapas:
    (b) desproteccion de N con Fmoc iterativa y acoplamiento de G con Fmoc-(N-Tri)Asn OH; FmocCys(S-2-((o- NO2Ph)SO2Trp-O-alil))]OH, Fmoc-Gly OH, Fmoc-Ile Oh, Fmoc-Gly OH para crear el compuesto H:
    imagen13
    (c) desproteccion de O-alilo y N con Fmoc de H seguido por ciclacion para crear el compuesto I (cierre del anillo B):
    imagen14
    5
    10
    (d) desproteccion de N con 2-nitro-arilsulfonamida y separacion de I de la resina para crear el compuesto J:
    imagen15
    imagen16
  14. 14. Metodo segun la reivindicacion 11, en el que la amatoxina es una amatoxina con un resto de dihidroxiisoleucina como aminoacido 3.
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