ES2589630T3 - OmCI modificado como inhibidor del complemento - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de OmCI que tiene actividad de unión de LTB4 reducida o carece de ella, en el que dicho polipéptido de OmCI comprende: (a) una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 que se ha modificado para eliminar o reducir la actividad de unión de LTB4; (b) una secuencia de aminoácidos de variante que tienen al menos el 60 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y que se ha modificado para eliminar o reducir la actividad de unión de LTB4; (c) una secuencia de aminoácidos de variante de SEQ ID NO: 2 que tiene al menos el 60 % de identidad con la secuencia de aminoácidos entre los restos de aminoácidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y que se ha modificado para eliminar o reducir la actividad de unión de LTB4; o (d) un fragmento de la secuencia de aminoácidos de (a), (b) o (c) que carece de actividad de unión de LTB4.

Description

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OmCI modificado como inhibidor del complemento

DESCRIPCION

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones novedosas utiles en el tratamiento de enfermedad y afecciones mediadas por el complemento y en particular a inhibidores del complemento especificos derivados de garrapata modificados y a su uso para el tratamiento de enfermedades y afecciones mediadas por el complemento.

Antecedentes de la invencion

El complemento es un sistema de defensa inmunitario innato importante. Participa en la proteccion del cuerpo de agentes extranos y en el proceso de inflamacion. Hay mas de 30 proteinas del suero y de la superficie celular que son conocidas por participar en la funcion y regulation del sistema del complemento.

Hay tres vias de activation del complemento: la via clasica; la via alternativa y la via de lectina. La via clasica se activa por complejos de IgM o IgG o hidratos de carbono. La via alternativa se activa por no auto-superficies y endotoxinas bacterianas. La via de lectina se activa por la union de lectina de union a manano (MBL) a manosa sobre la superficie de un patogeno. Las tres vias del complemento comprenden cascadas paralelas en las que formas similares de la C3-convertasa y una C5-convertasa se escinden y activan componentes C3 y C5 respectivamente, creando C3a y C3b y C5a y C5b.

Estos fragmentos del complemento activo son responsables de mediar en una amplia gama de efectos inmunitarios. C3a y C5a desencadenan la desgranulacion de mastocitos y aumentan la permeabilidad vascular y la contraction de musculo liso. C5a tambien actua de proteina quimiotactica y recluta a celulas inmunitarias. C3b opsoniza y aumenta la fagocitosis de patogenos. C5b es responsable de iniciar la formation del complejo de ataque a membrana (MAC).

La activacion de las tres vias del complemento se regula cuidadosamente bajo condiciones fisiologicas en individuos sanos. Debido a la funcion importante del complemento en el sistema inmunitario y las consecuencias de la activacion inapropiada del complemento, hay multiples mecanismos que actuan juntos para regular la activacion de la via del complemento. Los principales reguladores de las vias del complemento son las proteinas de control del complemento. Estas se expresan en el plasma a mayores concentraciones que los propios componentes del complemento. Algunas proteinas de control del complemento se expresan sobre la superficie de las propias celulas del cuerpo, previniendo asi que estas celulas sean inapropiadamente elegidas como diana por el complemento. Adicionalmente, muchos de los componentes del complemento activo, tales como C3a y C5a, tienen semividas muy cortas y, por lo tanto, solo son activos en el plasma durante cortos periodos despues de su activacion.

El fallo de los mecanismos de control que regulan la activacion del complemento puede producir dano a los propios tejidos del cuerpo. El fallo de los mecanismos de control del complemento participa en muchas afecciones patologicas y enfermedades. Las afecciones que se sabe que implican a una falta de control de las vias del complemento incluyen degeneration macular senil (AMD), enfermedad de Alzheimer, encefalomielitis alergica, alotrasplante, artritis de diversos tipos que incluye artritis reumatoide, asma, sindrome disneico del adulto, lesiones por quemadura, cancer, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, glomerulonefritis, anemia hemolitica, hemodialisis, angioedema hereditario, nefropatia membranosa idiopatica, restriction del crecimiento intrauterino (IUGR), lesiones por isquemia-reperfusion, enfermedad de las neuronas motoras, fallo multiorganico, esclerosis multiple, miastenia grave, infarto de miocardio, nefritis, penfigoide, derivation postcardiopulmonar, psoriasis, choque septico, aborto espontaneo, accidente cerebrovascular, lupus eritematoso sistemico, uveitis, sindrome de extravasation vascular y xenotrasplante.

Debido a la importancia de la cuidadosa regulacion de las vias del complemento, ha habido mucho interes en el desarrollo de inhibidores del complemento para su uso en la prevention o tratamiento de afecciones y enfermedades que se sabe que implican un fallo en regular el complemento. La investigation se ha centrado en el desarrollo de anticuerpos para componentes del complemento especificos, aptameros de ARN y moleculas que se dirigen a los receptores del complemento.

Los eicosanoides son una familia de mediadores de Kpidos biologicamente activos oxigenados que se derivan del araquidonato de acidos grasos de 20 carbonos (AA) e inducen numerosos efectos sobre los diversos tipos de celulas y organos. Los leucotrienos (LK) son una subfamilia de eicosanoides que tienen multiples efectos, que incluyen regulacion del tono vascular y permeabilidad de los capilares y las venulas, contraccion o relajacion de musculo (cisteinil LK), control del crecimiento y o diseminacion de celulas malignas (Schwartz et al., 2005; Aya, 2006), y activacion de leucocitos, en particular en afecciones autoinmunitarias e inflamatorias (LK, HETE) (Samuelsson, 1983; Kim et al., 2006).

El leucotrieno B4 (LTB4) es el eicosanoide quimiotactico y quimiocinetico mas poderoso descrito y promueve la adhesion de neutrofilos al endotelio vascular mediante la regulacion por incremento de integrinas (Hoover et al.,

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1984). Tambien es un secretagogo completo para los neutrofilos, induce su agregacion y aumenta la permeabilidad microvascular. LTB4 recluta y activa linfocitos citollticos espontaneos, monocitos y eosinofilos. Aumenta la formacion de radicales superoxido (Harrison y Murphy, 1995) y modula la expresion genica que incluye la produccion de varias citocinas proinflamatorias y mediadores que pueden aumentar y prolongar la inflamacion de tejido (Ford-Hutchinson, 1990; Showell et al., 1995). LTB4 tambien tiene funciones en la induccion y la gestion de respuestas inmunitarias adaptativas. Por ejemplo, la regulacion del trafico de celulas dendrlticas hacia ganglios linfaticos drenantes (Klaas et al., 2005; Del Prete et al., 2007), produccion de IL-13 por citocinas Th2 de linfocitos T de pulmon (Miyahara et al., 2006), reclutamiento de linfocitos T CD8+ efectores especlficos de antlgeno (Taube et al., 2006) y activacion y proliferacion de linfocitos B humanos (Yamaoka et al., 1989).

El documento WO2004/106369 describe un inhibidor del complemento (C) derivado de garrapata blanda (Ornithodoros moubata) OmCI que inhibe tanto las vlas clasicas como alternativas del complemento por la union directa al componente del complemento C5 (Nunn et al., 2005). OmCI se deriva de las glandulas salivales de artropodos hemotofagos. Ha demostrado potencial terapeutico (Hepburn et al., 2007). Se ha mostrado recientemente que OmCI se une a eicosanoides, en particular LK, especialmente LTB4.

Sumario de la invencion

Se ha mostrado ahora que OmCI puede modificarse para reducir o eliminar la actividad de union a leucotrieno/hidroxieicosanoide (LK/E). En particular, los presentes inventores han mostrado que modificar el polipeptido de OmCI en residuos especlficos reduce o elimina la actividad de union de LTB4. Por tanto, la presente invencion se refiere a polipeptidos de OmCI modificados que carecen de actividad de union de LTB4 y a polinucleotidos que codifican tales polipeptidos de OmCI modificados. En particular, la invencion se refiere a polipeptidos de OmCI que carecen de actividad de union de LTB4 debido a la modificacion de residuos especlficos dentro del bolsillo de union de OmCI y a polinucleotidos que codifican dichos polipeptidos. La invencion se refiere ademas a polipeptidos de OmCI que se unen a componentes del complemento y no a LTB4. Tales polipeptidos de OmCI modificados, o polinucleotidos que codifican tales polipeptidos de OmCI modificados, actuan de inhibidores del complemento y pueden usarse en la prevencion y el tratamiento de enfermedades y afecciones mediadas por el complemento, sin interferir con la funcion de LTB4.

Asl, segun un aspecto de la presente invencion, se proporciona un polipeptido de OmCI que carece de actividad de union de LTB4.

Segun una realizacion preferida de la presente invencion, el polipeptido de OmCI comprende:

(a) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 que se ha modificado para eliminar la actividad de union de LTB4;

(b) una secuencia de aminoacidos de variante que tienen al menos el 60 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 y que se ha modificado para eliminar la actividad de union de LTB4;

(c) una secuencia de aminoacidos de variante de SEQ ID NO: 2 que tiene al menos el 60 % de identidad con la secuencia de aminoacidos entre los restos de aminoacidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y que se ha modificado para eliminar la actividad de union de LTB4; o

(d) un fragmento de la secuencia de aminoacidos de (a), (b) o (c) que carece de actividad de union de LTB4. La invencion proporciona ademas polinucleotidos que codifican los polipeptidos de OmCI de la invencion.

La invencion proporciona ademas vectores que comprenden los polinucleotidos de la invencion.

La invencion proporciona ademas celulas huesped que comprenden los polinucleotidos o vectores de la invencion.

La invencion proporciona ademas composiciones farmaceuticas que comprenden un polipeptido de OmCI que carece de actividad de union de LTB4; un polinucleotido que codifica un polipeptido de OmCI que carece de actividad de union de LTB4; o un vector que comprende un polinucleotido que codifica un polipeptido de OmCI que carece de actividad de union de LTB4 y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

Descripcion de las figuras

Fig. 1: Detalle de la estructura cristalina de OmCI expresado bacteriano (bOmCI) unido a acido palmitoleico (centro de la figura).

Fig. 2: Inmunoensayo enzimatico (EIA) que muestra la union de 12(S)-HETE por 41,2 pg de bOmCI, pg/ml de 12(S)-HETE en disolucion tras 20 min de preincubacion de 12500 pg/ml de 12(S)-HEtE con o sin PbS, OmCI, RaHBP2.

Fig. 3: Espectros de absorcion de bOMCI y LTB4. (A) LTB4 en disolucion (llnea superior) antes de la adicion de OmCI, y re-medicion de la misma disolucion (llnea inferior) despues de la adicion, luego elimination del complejo de bOmCI:LTB4 por ultrafiltracion (B) complejo de bOmCI:LTB4 (llnea superior) y bOmCI (llnea inferior) solo despues de la concentration a 200 pl por ultrafiltracion.

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Fig. 4: Detalle de la estructura cristalina de bOmCI unido a LTB4 (centro de la figura). Se muestran atomos de oxlgeno en LTB4, en el grupo carboxi y grupos hidroxilo en C-5 y C-12. Estos grupos forman enlaces de hidrogeno (llneas de puntos) con aminoacidos en la cavidad de union (vease el texto del ejemplo 3).

Fig. 5: Analisis de cromatografla de gases de acidos grasos presentes en OmCI recombinante expresado en bacterias. La identidad del acido palmitoleico y elaldico se confirmo por espectrometrla de masas y comparacion con patrones de referencia.

Fig. 6: El OmCI mutante (yOmCI-F36W y yOmCI-G59W) con el bolsillo de union bloqueado por el gran aminoacido triptofano muestra significativamente menos union a LTB4 que yOmCI no mutante en un intervalo de concentraciones de protelna.

Fig 7: Ensayo hemolltico de la via clasica que compara RaHBP2 (lipocalina de garrapata de control negativo que no inhibe el complemento) con OmCI recombinante no mutante y yOmCI-F36W mutante y yOmCI-G59W que no se unen a LTB4.

Fig 8: yOMCI-F36W mutante y yOMCI-G59W con el bolsillo de union bloqueado por el gran aminoacido triptofano (W) inhibieron la via clasica de activacion del complemento con igual potencia a OMCI no mutante. Fig. 9: Union de LTB4 radiomarcado por OMCI solo y en complejo con C5 humano es (a) saturable y (b) tiene cinetica de union similar. El panel (a) es representativo de tres experimentos y muestra datos sin procesar. El panel (b) es representativo de dos experimentos y muestra valores de c.p.m despues de la resta de las c.p.m de control negativo promedio (n = 16). Se muestran funciones de la llnea de regresion logarltmica: OMCI, y = 134,67Ln(x) + 521,6, R2 = 0,98; OMCI:hC5, y = 132,87Ln(x) + 479,2, R2 = 0,97.

Descripcion de las secuencias

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de polinucleotidos y de protelnas codificada de OmCI de O. moubata.

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoacidos de OmCI O. moubata.

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 19 a 168 mostrados en SEQ ID NO: 2 y es la secuencia de aminoacidos de OmCI sin las primeras secuencias de aminoacidos de la protelna de SEQ ID NO: 2, que es una secuencia senal.

SEQ ID NO: 4 y 5 son la secuencia de polinucleotidos y de protelnas codificada y la secuencia de protelnas, respectivamente, de OmCI, modificadas para cambiar Asn78 a Gln y Asn 102 a Gln, con un cambio de codon de AAT y AAC respectivamente a CAA, para la expresion en levadura para evitar hi perglicosilacion.

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de polinucleotidos y de protelnas codificada de OmCI-F36W mutante de O. moubata

SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoacidos OmCI-F36W mutante de O. moubata.

SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 19 a 168 mostrados en SEQ ID NO: 6 y es la secuencia de aminoacidos de OmCI-F36W mutante sin las primeras secuencias de aminoacidos de la protelna de SEQ ID NO: 6, que es una secuencia senal.

SEQ ID NO: 9 es la secuencia de polinucleotidos y de protelnas codificada de OMCI-G59W mutante de O. moubata SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoacidos OMCI-G59W mutante de O. moubata.

SEQ ID NO: 11 es la secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 19 a 168 mostrados en SEQ ID NO: 9 y es la secuencia de aminoacidos de OMCI-G59W mutante sin las primeras secuencias de aminoacidos de la protelna de SEQ ID NO: 9, que es una secuencia senal.

Asl, la presente invencion proporciona un polipeptido de OmCI que carece de actividad de union de LTB4 o un polinucleotido que codifica dicho polipeptido de OmCI. La actividad de union de LTB4 como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de OmCI no mutante para unirse a leucotrienos y hidroxieicosanoides que incluyen, pero no se limitan a, LTB4, isoleucotrienos B4 y cualquier derivado hidroxilado de los mismos, HETe, HPETE y EET. La protelna OmCI puede ser un inhibidor del complemento derivado de garrapata, aislado de la saliva de O. moubata o puede ser un equivalente funcional del mismo, que incluye homologos del mismo y fragmentos de cualquiera de ellos.

La protelna OmCI de la presente invencion es preferentemente OmCI de O. moubata. Esta protelna se aislo por primera vez de las glandulas salivales de la garrapata y se ha encontrado que inhibe las vlas clasicas y alternativas del complemento. La secuencia de aminoacidos para esta protelna se muestra en SEQ ID NO: 2. Un polipeptido segun la invencion puede incluir la secuencia completa mostrada en SEQ ID NO: 2, que se ha modificado para eliminar especlficamente la actividad de union de LTB4. Alternativamente, se proporciona el polipeptido que no incluye los primeros 18 aminoacidos de la secuencia de protelnas que forman una secuencia senal que se ha modificado para eliminar especlficamente la actividad de union de LTB4. Por consiguiente, un polipeptido segun la invencion puede ser aquel de SEQ ID NO: 3, que tiene los aminoacidos 19 a 168 de la secuencia de aminoacidos de

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SEQ ID NO: 2, adicionalmente modificados para eliminar la actividad de union de LTB4.

Segun la invencion se proporciona una variante, tal como un homologo, o fragmento de la proteina OmCI de O. moubata, que tambien carece de actividad de union de LTB4. Los homologos pueden incluir paralogos y ortologos de la secuencia de OmCI que se expone en SEQ ID NO: 2 o 3, que incluyen, por ejemplo, la secuencia de proteinas de OmCI de otras especies de garrapata que incluyen Rhipicephalus appendiculatus, R. sanguineus, R. bursa, A. americanum, A. cajennense, A. hebraeum, Boophilus microplus, B. annulatus, B. decoloratus, Dermacentor reticulatus, D. andersoni, D. marginatus, D. variabilis, Haemaphysalis inermis, Ha. leachii, Ha. punctata, Hyalomma anatolicum anatolicum, Hy. dromedarii, Hy. marginatum marginatum, Ixodes ricinus, I. persulcatus, I. scapularis, I. hexagonus, Argas persicus, A. reflexus, Ornithodoros erraticus, O. moubata moubata, O. m. porcinus y O. savignyi, que se han modificado para eliminar especificamente la actividad de union de LTB4. El termino "homologo" tambien pretende incluir la secuencia de proteinas de OmCI de especies de mosquito, que incluyen aquellas de los generos Culex, Anopheles y Aedes, particularmente Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti y Anopheles gambiae; especies de pulga, tales como Ctenocephalides felis (la pulga del gato); moscas de caballo; moscas de la arena; moscas negras; moscas tse-tse; piojos; acaros; sanguijuelas; y platelmintos.

En una realizacion, el polipeptido de OmCI comprende:

(a) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 que se ha modificado para eliminar la actividad de

union de LTB4;

(b) una secuencia de aminoacidos de variante que tienen al menos el 60 % de identidad con la secuencia

de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 que se ha modificado para eliminar la actividad de union de LTB4;

(c) una secuencia de aminoacidos de variante de SEQ ID NO: 2 que tiene al menos el 60 % de identidad

con la secuencia de aminoacidos entre los restos de aminoacidos 19 a 168 de SEQID NO: 2 y que se ha

modificado para eliminar la actividad de union de LTB4; o

(d) un fragmento de la secuencia de aminoacidos de (a), (b) o (c) que carece de actividad de union de LTB4.

Los polipeptidos de variante son aquellos para los que la secuencia de aminoacidos varia de aquellos en SEQ ID NO: 2 o 3, pero que retienen el mismo caracter esencial que los polipeptidos de OmCI de la invencion y que se han modificado para eliminar la actividad de union de LTB4.

Normalmente, los polipeptidos con mas de aproximadamente el 50 %, 55 %, 60 % o el 65 % de identidad, preferentemente al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % y particularmente preferentemente al menos el 95 %, al menos el 97 % o al menos el 99 % de identidad, con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 o 3, ademas de la una o mas modificaciones de eliminacion de la actividad de union de LTB4 en posiciones equivalentes a aquellas encontradas en los polipeptidos de OmCI modificados de la invencion, se consideran variantes de la proteina. Tales variantes pueden incluir variantes alelicas y la delecion, modificacion o adicion de aminoacidos individuales o grupos de aminoacidos dentro de la secuencia de proteinas, en tanto que el peptido mantenga la actividad de polipeptidos de OmCI de la invencion, y se modifiquen adicionalmente para eliminar la actividad de union de LTB4. La identidad de variantes de SEQ ID NO: 3 puede medirse con respecto a una region de al menos 50, al menos 100, al menos 130 o al menos 140 o mas aminoacidos contiguos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 3, o mas preferentemente con respecto a la longitud completa de SEQ ID NO: 3.

La identidad de aminoacidos puede calcularse usando cualquier algoritmo adecuado. Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular homologia (por ejemplo, usado en sus parametros por defecto) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, pag. 387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden usarse para calcular homologia o alinear secuencias (tal como identificar secuencias equivalentes o correspondientes (normalmente en sus parametros por defecto), por ejemplo, como se describe en Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al. (1990) J Mol Biol 215:403-10.

El software para realizar los analisis por BLAST esta publicamente disponible del Centro nacional para informacion biotecnologica (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero el par de secuencias de alta puntuacion (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de busqueda que tanto coinciden como satisfacen alguna puntuacion T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina el umbral de puntuacion de palabras vecinas (Altschul et al., arriba). Estas palabras comunes vecinas iniciales actuan de semillas para iniciar busquedas para encontrar HSP que las contienen. Las palabras comunes se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para poder aumentar en la medida de lo posible la puntuacion de alineamiento acumulado. Las extensiones para las palabras comunes en cada direction se detienen cuando: las puntuaciones de alineamiento acumuladas se encuentran fuera de la cantidad X de su maximo valor alcanzado; la puntuacion acumulada tiende a cero o por debajo, debido a la acumulacion de uno o mas alineamientos de residuos de puntuacion acumulada; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parametros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, los alineamientos de la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) (B) de 50, esperanza (E) de 10, M=5, N=4, y una comparacion de ambas cadenas.

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El algoritmo BLAST realiza un analisis estadlstico de la similitud entre dos secuencias; vease, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma minima (P(N)) que proporciona una indicacion de la probabilidad de que se produzca por casualidad una coincidencia entre dos secuencias de polinucleotidos. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma minima en la comparacion de la primera secuencia con la segunda secuencia es inferior a aproximadamente 1, preferentemente inferior a aproximadamente 0,1, mas preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y lo mas preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

Las secuencias de variante normalmente se diferencian por al menos 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o mas mutaciones (que pueden ser sustituciones, deleciones o inserciones de aminoacidos). Por ejemplo, pueden hacerse de 1 a 50, 2 a 40, 3 a 30 o 5 a 20 sustituciones de aminoacidos, deleciones o inserciones. Las sustituciones son preferentemente sustituciones conservativas, por ejemplo segun la Tabla 1. Los aminoacidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma linea en la tercera columna pueden estar sustituidos entre si.

Tabla 1: Propiedades de las diferentes cadenas laterales de aminoacidos

AL IF ATI CO

No-polar GAP

1 L V

Polar - descargado

CSTM

N Q

Polar - cargado

D E

K R

AROMATICO

HFWY

El fragmento del polipeptido de OmCI usado en la invention normalmente tiene al menos 50, por ejemplo al menos 80 o mas aminoacidos de longitud, hasta 90, 100, 120, 130 o 140 aminoacidos de longitud, en tanto que retenga la falta de actividad de union de LTB4 del polipeptido de OmCI modificado. En una realization preferida, el fragmento del polipeptido de OmCI retiene la actividad de inhibidor del complemento mostrada por OmCI de O. moubata.

Los polipeptidos de OmCI de la presente invencion, que incluyen polipeptidos de variante, tales como homologos, o fragmentos de los mismos, carecen de actividad de union de LTB4. La actividad de union de LTB4 puede eliminarse por la modification de la secuencia de aminoacidos del polipeptido de OmCI. La actividad de union de LTB4 tambien puede eliminarse por la modificacion de la secuencia de nucleotidos de un polinucleotido que codifica el polipeptido de OmCI de la invencion que produce una modificacion apropiada en el polipeptido de OmCI codificado.

El polipeptido de OmCI de la presente invencion puede modificarse para carecer de actividad de union de LTB4 por la mutation de residuos especificos dentro de la secuencia de aminoacidos de OmCI. En una realizacion, la mutation de restos de aminoacidos especificos es no conservativa, de forma que uno o mas restos de aminoacidos del polipeptido de OmCI no mutante estan sustituidos con un resto de aminoacido de diferente polaridad. Por ejemplo, segun la Tabla 1, los aminoacidos en diferentes bloques en la tercera columna pueden estar sustituidos entre si. En otra realizacion, el OmCI puede modificarse sustituyendo uno o mas restos de aminoacidos del polipeptido de OmCI no mutante por un resto de aminoacido que comprende una gran cadena lateral para aumentar la interferencia esterica para prevenir la union a LTB4.

En una realizacion, la actividad de union de LTB4 se elimina por la modificacion de aminoacidos dentro del bolsillo de union de LTB4 del polipeptido de OmCI. Los aminoacidos que probablemente van a requerirse particularmente para la union de LTB4 incluyen (con referencia a SEQ ID NO. 2): Phe36, Arg54, Leu57, Gly59, Val72, Met74, Phe76, Thr85, Trp87, Phe89, Glen 105, Arg107, His119, Asp121, Trp133. En otra realizacion al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 de estos aminoacidos estan mutados para eliminar la actividad de union de LTB4. En una realizacion preferida, al menos una mutacion dentro de OmCI esta seleccionada de Phe36Trp y Gly59Trp. En otra realizacion, el polipeptido de OmCI modificado comprende tanto las mutaciones Phe36Trp como Gly59Trp.

En otra realizacion, la actividad de union de LTB4 se elimina por la modificacion de aminoacidos fuera del bolsillo de union de LTB4, en el que la modificacion de dichos aminoacidos produce un cambio conformacional en el polipeptido de OmCI, dentro de o fuera del sitio de union de LTB4, produciendo la perdida de actividad de union de LTB4.

Los polipeptidos de variante de OmCI, tales como homologos, o fragmentos de los mismos de la presente invencion, tambien se modifican para carecer de actividad de union de LTB4. Tales variantes, ademas de las variaciones de secuencia tratadas anteriormente, se modifican adicionalmente en posiciones equivalentes a aquellas encontradas en los polipeptidos de OmCI modificados de la invencion. Los aminoacidos equivalentes a las posiciones especificadas en OmCI pueden determinarse alineando las secuencias de aminoacidos del bolsillo de union de LTB4 de OmCI y la variante e identificando los restos de aminoacidos correspondientes.

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Metodos para determinar si un polipeptido de OmCI modificado particular tiene actividad de union de LK/E reducida o carece de ella incluyen inmunoensayos enzimaticos, dispersion de la luz, espectrometrla de masas, resonancia de plasmones superficiales, absorcion UV, ensayos de union a radioligando o ligando fluorescentemente marcado y cristalografla. Tales metodos serlan conocidos para la persona experta en la materia. Ejemplos de metodos especlficos para determinar la union a LTB4 de polipeptidos de OmCI se encuentran en la seccion de ejemplos.

Normalmente, un polipeptido de OmCI modificado segun la presente invencion tiene actividad de union de LTB4 reducida, o carece de esta actividad. Normalmente, la afinidad de union para LTB4 se reduce al menos el 50 % en comparacion con OmCI no modificado, por ejemplo, se reduce al menos el 60 %,70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o el 99 % o se elimina.

Los polipeptidos de la invencion tambien pueden proporcionarse como una protelna de fusion que comprende un polipeptido de OmCI genetica o qulmicamente fusionado con otro peptido. El fin del otro peptido puede ser ayudar en la deteccion, expresion, separacion o purificacion de la protelna. Alternativamente, la protelna puede fusionarse con un peptido tal como un peptido Fc para aumentar la semivida en circulacion de la protelna. Ejemplos de otros componentes de fusion incluyen beta-galactosidasa, glutation-S-transferasa o luciferasa.

Los polipeptidos usados en la invencion pueden modificarse qulmicamente, por ejemplo, modificarse post- traduccionalmente. Por ejemplo, pueden glucosilarse, pegilarse, fosforilarse o comprender restos de aminoacidos modificados. Pueden modificarse mediante la adicion de restos de histidina para ayudar en su purificacion o mediante la adicion de una secuencia senal para promover la insercion dentro de la membrana celular. Tales polipeptidos modificados entran dentro del alcance del termino "polipeptido" usado en el presente documento.

Un polipeptido para su uso segun la invencion carece de actividad de union de LTB4. El OmCI no mutante tiene una tendencia a unirse a cualquier acido graso no clclico de entre 16 y 20 atomos de carbono de longitud. Ciertos acidos grasos, en particular LTB4, se unen mas fuertemente que otros. Otros acidos grasos a los que el polipeptido de la invencion puede unirse incluyen acido araquidonico, 12-epi LTB4, 20-hidroxi LTB4 y los hidroxieicosanoides que incluyen acido 12(S)-hidroxieicosatetraenoico (HETE) y acido 12(S)-hidroperoxieicosatetraenoico (HPETE). La presencia o ausencia de actividad de union de LTB4 o actividad de union a otros acidos grasos del polipeptido puede determinarse usando tecnicas tales como aquellas tratadas anteriormente. Un ensayo de union tal se ejemplifica en los ejemplos. En algunas realizaciones, puede ser preferible seleccionar un polipeptido que carece preferentemente de actividad de union por un acido graso especlfico, tal como LTB4. Tal falta preferencial de actividad de union puede determinarse por ensayos adecuados, por ejemplo, ensayos de competicion como se ejemplifica en los ejemplos.

Segun algunos aspectos de la invencion, preferentemente, un polipeptido para su uso segun la invencion retiene la actividad del inhibidor del complemento mostrada por OmCI de O. moubata. Preferentemente, el polipeptido inhibe tanto las vlas clasicas como alternativas de activacion del complemento. Por inhibir se indica que el efecto de las vlas alternativas y clasicas de activacion del complemento se reduce. La capacidad de una molecula para reducir el efecto de la via clasica del complemento y la via alternativa del complemento puede determinarse por ensayos hemollticos estandar conocidos en la tecnica, tales como aquellos descritos en Giclas et al. (1994) y en el documento WO2004/106369. Preferentemente, la presencia de un polipeptido inhibidor del complemento de la invencion reduce la lisis de globulos rojos en ensayos hemollticos estandar para las vlas clasicas y alternativas de activacion del complemento al menos el 20 % en comparacion con un ensayo estandar en ausencia de un polipeptido inhibidor del complemento, mas preferentemente al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % o el 80 %.

Preferentemente, el polipeptido inhibidor del complemento inhibe la escision de C5 por la C5 convertasa en la via clasica y la C5 convertasa en la via alternativa. La conversion de C5 a C5b por C5 convertasa se produce en tanto la via alternativa del complemento como la via clasica del complemento. La C5 convertasa en la via clasica es C4b3b2a y la C5 convertasa en la via alternativa es C3b2Bb. La inhibicion de la escision de C5 por ambas de estas C5 convertasas inhibe as! tanto las vlas clasicas como alternativas de activacion del complemento. La capacidad de una molecula para inhibir la escision de C5 por las C5 convertasas de las vlas clasicas y alternativas puede determinarse por ensayos in vitro estandar. Preferentemente, la presencia de un polipeptido inhibidor del complemento reduce la escision de C5 por las C5 convertasas de las vlas clasicas y alternativas al menos el 20 % en comparacion con un ensayo estandar en ausencia de un polipeptido inhibidor del complemento, mas preferentemente al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % o el 80 %. Preferentemente, la actividad del inhibidor del complemento de los polipeptidos de las invenciones inhibe la escision de C5 por las C5 convertasas de las vlas clasicas y alternativas de una variedad de especies de mamlfero.

Polipeptidos para su uso en la invencion pueden estar en una forma sustancialmente aislada. Se entendera que el polipeptido puede mezclarse con vehlculos o diluyentes que no interferiran con el fin previsto del polipeptido y todavla se consideraran como sustancialmente aislados. Un polipeptido para su uso en la invencion tambien puede estar en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprendera el polipeptido en una preparacion en la que mas del 50 %, por ejemplo mas del 80 %, 90 %, 95 % o 99 %, en peso del polipeptido en la preparacion es un polipeptido de la invencion.

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Tambien pueden prepararse polipeptidos para su uso en la invencion como fragmentos de tales polipeptidos aislados. Ademas, los polipeptidos de OmCI tambien pueden prepararse sinteticamente o por medios recombinantes. Por ejemplo, un polipeptido de OmCI recombinante puede producirse transfectando celulas de mamlfero, fungicas, bacterianas o de insecto en cultivo con un vector de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido operativamente ligado a secuencias de control adecuadas, cultivando las celulas, extrayendo y purificando el polipeptido de OmCI producido por las celulas.

La secuencia de aminoacidos de polipeptidos para su uso en la invencion puede modificarse para incluir aminoacidos que no existen de forma natural o para aumentar la estabilidad del compuesto. Cuando los polipeptidos se producen por medios sinteticos, tales aminoacidos pueden introducirse durante la produccion. Los polipeptidos tambien pueden modificarse siguiendo cualquier produccion sintetica o recombinante.

Los polipeptidos para su uso en la invencion tambien pueden producirse usando D-aminoacidos. En tales casos, los aminoacidos se enlazaran en la secuencia inversa en la orientacion C a N. Esto es convencional en la materia para producir tales polipeptidos.

Se conocen en la tecnica varias modificaciones de la cadena lateral y puede hacerse a las cadenas laterales de los polipeptidos de OmCI, a condicion de que los polipeptidos retengan la actividad de OmCI, pero carezcan de la actividad de union de LTB4.

Polinucleotidos

La presente invencion proporciona un polinucleotido que codifica un polipeptido de OmCI que carece de actividad de union de LTB4. En una realizacion, el polinucleotido de la presente invencion codifica la protelna OmCI de O. moubata. La secuencia de nucleotidos que codifica OmCI de O. moubata se muestra en SEQ ID NO: 1. Un polinucleotido segun la invencion puede incluir la secuencia completa mostrada en SEQ ID NO: 1 que se ha modificado para eliminar especlficamente la actividad de union de LTB4 del polipeptido codificado.

Segun la invencion se proporciona un polinucleotido que codifica una variante, tal como un homologo, o fragmento de la protelna OmCI de O. moubata, que tambien carece de actividad de union de LTB4. Pueden hacerse sustituciones degeneradas adicionales y/o pueden hacerse sustituciones que producirlan una sustitucion de aminoacidos conservativa cuando la secuencia modificada se tradujera, por ejemplo como se muestra en la Tabla 1 anterior. Tales variantes codificadas se tratan anteriormente y comprenden adicionalmente modificaciones en posiciones equivalentes a aquellas encontradas en los polipeptidos de OmCI modificados de la invencion.

Un polinucleotido de la invencion, que incluye polinucleotidos que codifican polipeptidos de variante, tales como homologos, o fragmentos, puede normalmente hibridarse con la secuencia codificante o el complemento de la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1 a un nivel significativamente por encima del fondo. La hibridacion de fondo puede producirse, por ejemplo, debido a otros ADN presentes en una biblioteca de ADN. El nivel de senal generado por la interaccion entre un polinucleotido de la invencion y la secuencia codificante o complemento de la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1 normalmente es al menos 10 veces, preferentemente al menos 100 veces, tan intenso como las interacciones entre otros polinucleotidos y la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1. La intensidad de la interaccion puede medirse, por ejemplo, por radiomarcado de la sonda, por ejemplo con 32P. Normalmente puede lograrse hibridacion selectiva usando condiciones de rigurosidad de media a alta. Sin embargo, tal hibridacion puede llevarse a cabo bajo cualquier condicion adecuada conocida en la tecnica (vease Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989). Por ejemplo, si se requiere rigurosidad alta, condiciones adecuadas incluyen de 0,1 a 0,2 x SSC a 60 °C a 65 °C. Si se requiere rigurosidad mas baja, condiciones adecuadas incluyen 2 x SSC a 60 °C.

La secuencia codificante de SEQ ID NO: 1 puede modificarse por sustituciones de nucleotidos, por ejemplo, de 1, 2 o 3 a 10, 25, 50 o 100 sustituciones, ademas de codificar una o mas modificaciones de eliminacion de actividad de union de LTB4 en posiciones equivalentes a aquellas encontradas en los polipeptidos de OmCI modificados de la invencion. El polinucleotido de SEQ ID NO: 1 puede modificarse alternativamente o adicionalmente por una o mas inserciones y/o deleciones y/o por una extension en cualquiera o ambos extremos. Tambien pueden incluirse secuencias adicionales tales como secuencias senal o secuencias que codifican otro peptido o protelna para ayudar en la deteccion, expresion, separation o purification de la protelna o que codifican un peptido tal como un peptido Fc para aumentar la semivida en circulation de la protelna. Ejemplos de otros componentes de fusion incluyen beta- galactosidasa, glutation-S-transferasa o luciferasa.

Una secuencia de nucleotidos que es capaz de hibridarse selectivamente con el complemento de la secuencia codificante de ADN de SEQ ID NO: 1 generalmente tendra, ademas de codificar una o mas de las modificaciones de eliminacion de actividad de union de LTB4 en posiciones equivalentes a aquellas encontradas en los polipeptidos de OmCI modificados de la invencion, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencias con la secuencia codificante de SEQ ID NO: 3 con respecto a una region de al menos 20, preferentemente al menos 30, por ejemplo al menos 40, al menos 60, al menos 100, al menos 200, al menos 420, o lo mas preferentemente con respecto a la longitud

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completa de SEQ ID NO: 1 o la longitud de SEQ ID NO: 1 que codifica un polipeptido que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1. La identidad de secuencias puede determinarse por cualquier metodo adecuado, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente.

Puede usarse cualquier combinacion de los grados anteriormente mencionados de identidad de secuencias y tamanos mlnimos para definir polinucleotidos de la invencion, prefiriendose las combinaciones mas rigurosas (es decir, mayor identidad de secuencias con respecto a longitudes mas largas). Asl, por ejemplo, un polinucleotido que tiene al menos el 90 % de identidad de secuencias con respecto a 60, preferentemente con respecto a 100 nucleotidos, forma un aspecto de la invencion, como un polinucleotido que tiene al menos el 95 % de identidad de secuencias con respecto a 420 nucleotidos.

Los fragmentos de polinucleotidos preferentemente tendran al menos 20, por ejemplo al menos 25, al menos 30 o al menos 50 nucleotidos de longitud. Normalmente seran de hasta 100, 150, 250 o 400 nucleotidos de longitud. Los fragmentos pueden ser mas largos de 400 nucleotidos de longitud, por ejemplo hasta algunos nucleotidos, tales como cinco, diez o quince nucleotidos, de corto de la secuencia codificante de SEQ ID NO: 1.

Los polinucleotidos de OmCI de la presente invencion, que incluyen los polinucleotidos que codifican polipeptidos de variante, tales como homologos, o fragmentos, codifican todos polipeptidos que tienen actividad de union de LTB4 reducida o carecen de ella. Tales variantes de polinucleotidos, ademas de las variaciones de secuencia tratadas anteriormente, se modifican adicionalmente en posiciones equivalentes a aquellas encontradas en los polipolinucleotidos de OmCI modificados de la invencion, de manera que codifican polipeptidos que carecen de actividad de union de LTB4. Los acidos nucleicos equivalentes a las posiciones especificadas en OmCI pueden determinarse alineando las secuencias de acidos nucleicos de OmCI modificado y la variante e identificando los restos de acidos nucleicos correspondientes.

La actividad de union de LTB4 puede eliminarse por la modificacion de la secuencia de nucleotidos de un polinucleotido que codifica el polipeptido de OmCI de la invencion que produce una modificacion apropiada en el polipeptido de OmCI codificado.

El polinucleotido de OmCI de la presente invencion puede modificarse para mutar residuos especlficos dentro de la secuencia de aminoacidos del polipeptido de OmCI codificado, produciendo la elimination de actividad de union de LTB4. En una realization pueden hacerse sustituciones no degeneradas en el polinucleotido de la invencion, que producirlan una sustitucion de aminoacidos no conservativa cuando la secuencia modificada se traduce, por ejemplo, como se muestra en la Tabla 1 anterior.

En una realizacion, la actividad de union de LTB4 se elimina por la modificacion del polinucleotido de la invencion para mutar aminoacidos dentro del bolsillo de union de LTB4 del polipeptido de OmCI codificado. Los aminoacidos que probablemente van a requerirse particularmente para la union de LTB4 incluyen (con referencia a SEQ ID NO. 2): Phe36, Arg 54, Leu57, Gly59, Val72, Met74, Phe76, Thr85, Trp87, Phe89, Gln105, Arg107, His119, Asp121, Trp133. En otra realizacion, el polinucleotido de la invencion se modifica de manera que el polipeptido de OmCI codificado mute al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 de estos aminoacidos para eliminar la actividad de union de LTB4. En una realizacion preferida, el polinucleotido de la invencion se modifica de manera que al menos una mutation dentro del polipeptido de OmCI codificado se seleccione de Phe36Trp y Gly59Trp.

Un polinucleotido de la invencion puede usarse para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion mediada por el complemento. Normalmente, el polinucleotido es ADN. Sin embargo, el polinucleotido puede ser un polinucleotido de ARN. El polinucleotido puede ser mono o bicatenario, y puede incluir dentro de el nucleotidos sinteticos o modificados.

Los polinucleotidos para su uso en la invencion pueden producirse recombinantemente, sinteticamente, o mediante cualquier medio disponible para aquellos expertos en la materia. Tambien pueden clonarse por tecnicas convencionales. Los polinucleotidos normalmente se proporcionan en forma aislada y/o purificada.

En general, se produciran polinucleotidos cortos por medios sinteticos, que implican una fabrication escalonada de la secuencia de acidos nucleicos deseada de un nucleotido cada vez. Las tecnicas para llevar a cabo esto usando tecnicas automatizadas estan facilmente disponibles en la materia.

Generalmente se produciran polinucleotidos mas largos usando medios recombinantes, por ejemplo, usando tecnicas de donation por PCR (reaction en cadena de la polimerasa). Esto implicara preparar un par de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15-30 nucleotidos) para una region del gen OmCI que se desea clonar, poniendo los cebadores en contacto con el ADN obtenido de una celula de artropodo que realiza una reaccion en cadena de la polimerasa en condiciones que provocan la amplification de la region deseada, aislando el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reaccion sobre un gel de agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores pueden disenarse para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restriction adecuados de manera que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonacion adecuado.

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Tales tecnicas pueden usarse para obtener toda o parte de la secuencia del gen OmCI descrita en el presente documento. Aunque en general las tecnicas mencionadas en el presente documento son muy conocidas en la tecnica, puede hacerse referencia en particular a Sambrook et al. (1989).

Los polinucleotidos de OmCI como se describen en el presente documento tienen utilidad en la produccion de los polipeptidos para su uso en la presente invencion, que pueden tener lugar in vitro, in vivo o ex vivo. Los polinucleotidos pueden usarse como agentes terapeuticos por derecho propio o pueden participar en la slntesis de protelnas recombinantes.

Los polinucleotidos para su uso en la invencion normalmente se incorporan en un vector recombinante replicable. El vector puede usarse para replicar el acido nucleico en una celula huesped compatible. Por tanto, pueden prepararse polinucleotidos para su uso en la invencion introduciendo un polinucleotido de OmCI en un vector replicable, introduciendo el vector dentro de una celula huesped compatible y cultivando la celula huesped en condiciones que provoquen la replicacion del vector. La celula huesped puede, por ejemplo, ser una celula de E. coli.

Preferentemente, el vector es un vector de expresion que comprende una secuencia de acidos nucleicos que codifica un polipeptido de OmCI. Tales vectores de expresion se construyen rutinariamente en la materia de la biologla molecular y pueden, por ejemplo, implicar el uso de ADN de plasmido e iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados, tales como, por ejemplo, senales de poliadenilacion, que pueden ser necesarias y que estan posicionadas en la orientacion correcta con el fin de permitir la expresion de protelnas. Las secuencias codificantes tambien pueden seleccionarse para proporcionar un uso de codon preferido adecuado para el organismo huesped que va a usarse. Otros vectores adecuados serlan evidentes para las personas expertas en la tecnica. A modo de ejemplo adicional a este respecto, los presentes inventores se refieren a Sambrook et al. (1989).

Preferentemente, un polinucleotido para su uso en la invencion en un vector esta operativamente ligado a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresion de la secuencia codificante por la celula huesped, es decir, el vector es un vector de expresion. El termino "operativamente ligado" se refiere a una yuxtaposicion en la que los componentes descritos estan en una relacion que les permite funcionar de su manera prevista. Una secuencia reguladora, tal como un promotor, "operativamente ligado" a una secuencia codificante esta posicionada de tal forma que la expresion de la secuencia codificante se logre en condiciones compatibles con la secuencia reguladora.

Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de plasmido, virus o fago provistos de un origen de replicacion, opcionalmente un promotor para la expresion de dicho polinucleotido y opcionalmente un regulador de un promotor. El vector normalmente esta adaptado para usarse in vivo.

Los promotores y otras senales de regulacion de la expresion pueden seleccionarse para ser compatibles con la celula huesped para la que se disena la expresion. Pueden usarse promotores de mamlfero, tales como promotores de p-actina. Se prefieren especialmente los promotores especlficos de tejido. Tambien pueden usarse promotores virales, por ejemplo, la repeticion terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV LTR), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), el promotor del SV40, el promotor IE del citomegalovirus humano (CMV), adenovirus, promotores del VHS (tales como los promotores IE del VHS) o promotores del VPH, particularmente la region reguladora aguas arriba del VPH (URR). Los promotores virales estan facilmente disponibles en la tecnica.

El vector puede incluir ademas secuencias que flanquean el polinucleotido que dan lugar a polinucleotidos que comprenden secuencias homologas a secuencias genomicas eucariotas, preferentemente secuencias genomicas de mamlfero. Esto permitira la introduction de los polinucleotidos de la invencion dentro del genoma de celulas eucariotas por recombination homologa. En particular, puede usarse un vector plasmldico que comprende el casete de expresion flanqueado por secuencias virales para preparar un vector viral adecuado para administrar los polinucleotidos de la invencion a una celula de mamlfero. Otros ejemplos de vectores virales adecuados incluyen vectores virales del herpes simple y retrovirus, que incluyen lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados y virus VPH. Tecnicas de transferencia genica que usan estos virus son conocidas para aquellos expertos en la materia. Pueden usarse vectores de retrovirus, por ejemplo, para integrar establemente el polinucleotido que da lugar al polinucleotido dentro del genoma del huesped. Por el contrario, los vectores de adenovirus defectuosos en la replicacion siguen siendo episomicos y, por lo tanto, permiten la expresion transitoria.

Enfermedades y afecciones

OmCI no mutante es conocido por unirse a tanto moleculas del complemento como de LK/E tales como LTB4. Los presentes inventores han encontrado que OmCI puede modificarse para eliminar especlficamente la actividad de union de LTB4. Los presentes inventores han identificado residuos especlficos dentro del bolsillo de union de OmCI que pueden mutarse para eliminar la actividad de union de LTB4, pero no tienen efecto sobre la capacidad de OmCI para unirse a componentes del complemento. LTB4 es el eicosanoide quimiotactico y quimiocinetico mas poderoso descrito y promueve la adhesion de neutrofilos al endotelio vascular mediante la regulacion por incremento de integrinas. LTB4 induce la agregacion de neutrofilos y mediante una variedad de procesos desempena una funcion

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en la inflamacion.

Asl, la eliminacion especlfica de actividad de union de LTB4 proporciona la oportunidad de usar tales polipeptidos y polinucleotidos de OmCI modificados que codifican tales polipeptidos de OmCI modificados para tratar enfermedades y afecciones mediadas por el complemento, sin interferir con la funcion de leucotrienos y eicosanoides en el sistema inmunitario.

Es deseable el tratamiento de afeccion (afecciones) patologica(s) en las que se inhibe la activacion del complemento, pero LTB4 u otros acidos grasos que se unirlan por OmCI no mutante se representan cuando:

a) una enfermedad o afeccion esta mediada por el complemento y LTB4 no tiene funcion; o

b) una enfermedad o afeccion esta mediada por el complemento y si LTB4, o los neutrofilos que recluta, tienen una funcion beneficiosa en vez de agravar la enfermedad o afeccion. Un ejemplo de un trastorno especlfico tal que puede tratarse segun la presente invencion es el tratamiento de cancer en el que se ha mostrado recientemente que el bloqueo del receptor de C5a altera el crecimiento tumoral en un modelo animal, pero en el que los neutrofilos presentan actividad antitumoral mediante su reclutamiento a sitios de inflamacion.

c) un paciente, tal como un individuo inmunosuprimido, se beneficiarla de inhibir un mecanismo de defensa inmunitario (es decir, complemento) en vez de dos (complemento y LTB4). Un ejemplo de un trastorno especlfico tal que puede tratarse segun la presente invencion es el tratamiento de cancer en el que el paciente recibe quimioterapia y asl tiene una respuesta migratoria de neutrofilos suprimida, haciendolos susceptibles a infecciones bacterianas. Aqul, la presencia de LTB4 reduce el riesgo de infecciones secundarias.

Ejemplos de trastornos especlficos que pueden tratarse segun la presente invencion incluyen degeneracion macular senil (AMD), enfermedad de Alzheimer, encefalomielitis alergica, alotrasplante, artritis de diversos tipos que incluyen artritis reumatoide, asma, slndrome disneico del adulto, lesiones por quemadura, cancer, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, glomerulonefritis, anemia hemolltica, hemodialisis, angioedema hereditario, nefropatla membranosa idiopatica, restriccion del crecimiento intrauterino (IUGR), lesiones por isquemia-reperfusion, enfermedad de las neuronas motoras, fallo multiorganico, esclerosis multiple, miastenia grave, infarto de miocardio, nefritis, penfigoide, derivacion postcardiopulmonar, psoriasis, choque septico, aborto espontaneo, accidente cerebrovascular, lupus eritematoso sistemico, uveitis, sindrome de extravasacion vascular y xenotrasplante.

En una realizacion preferida, los trastornos especificos que pueden tratarse segun la presente invencion incluyen degeneracion macular senil (AMD), enfermedad de Alzheimer, encefalomielitis alergica, alotrasplante, sindrome disneico del adulto, lesiones por quemadura, cancer, dermatomiositis, glomerulonefritis, anemia hemolltica, hemodialisis, angioedema hereditario, nefropatia membranosa idiopatica, restriccion del crecimiento intrauterino (IUGR), lesiones por isquemia-reperfusion, enfermedad de las neuronas motoras, fallo multiorganico, miastenia grave, penfigoide, derivacion postcardiopulmonar, choque septico, aborto espontaneo, sindrome de extravasacion vascular y xenotrasplante.

Terapia y profilaxis

En el presente documento se desvela el uso de polipeptidos y polinucleotidos de OmCI para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion mediada por el complemento. El tratamiento puede ser terapeutico o profilactico.

El polipeptido o polinucleotido de OmCI puede administrarse a un individuo con el fin de prevenir la aparicion de uno o mas sintomas de la enfermedad o afeccion. En esta realizacion, el sujeto puede ser asintomatico. El sujeto puede tener una predisposicion genetica a la enfermedad. Una cantidad profilacticamente eficaz del polipeptido o polinucleotido se administra a un individuo tal. Una cantidad profilacticamente eficaz es una cantidad que previene la aparicion de uno o mas sintomas de una enfermedad o afeccion.

Una cantidad terapeuticamente eficaz del polipeptido o polinucleotido de OmCI es una cantidad eficaz para mejorar uno o mas sintomas de una enfermedad o afeccion. Preferentemente, el individuo que va a tratarse es humano.

El polipeptido o polinucleotido de OmCI puede administrarse al sujeto por cualquier medio adecuado. El polipeptido o polinucleotido puede administrarse por vias enteral o parenteral tales como via oral, bucal, anal, pulmonar, intravenosa, intrarterial, intramuscular, intraperitoneal, intrarticular, topica u otras vias de administracion apropiadas.

El polipeptido o polinucleotido de OmCI puede administrarse al sujeto de tal forma que dirija la terapia a un sitio particular.

La formulacion de cualquiera de los polipeptidos y polinucleotidos mencionados en el presente documento dependera de factores tales como la naturaleza del polipeptido o polinucleotido y la afeccion que va a tratarse. El polipeptido o polinucleotido puede administrarse en una variedad de formas de dosificacion. Pueden administrarse por via oral (por ejemplo como comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas o aceitosas,

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polvos dispersables o granulos), por via parenteral, subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, transdermica, topica o por tecnicas de infusion. El polipeptido o polinucleotido tambien puede administrarse como supositorios. Un medico sera capaz de determinar la via de administracion requerida para cada paciente particular.

Normalmente, el polipeptido o polinucleotido se formula para su uso con un vehlculo o diluyente farmaceuticamente aceptable y esto puede llevarse a cabo usando metodos rutinarios en la tecnica farmaceutica. El vehlculo farmaceutico o diluyente puede ser, por ejemplo, una disolucion isotonica. Por ejemplo, formas orales solidas pueden contener, junto con el compuesto activo, diluyentes, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, celulosa, almidon de malz o almidon de patata; lubricantes, por ejemplo, sllice, talco, acido estearico, estearato de magnesio o de calcio, y/o polietilenglicoles; aglutinantes; por ejemplo, almidones, gomas arabigas, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o polivinilpirrolidona; agentes disgregantes, por ejemplo, almidon, acido alglnico, alginatos o glicolato sodico de almidon; mezclas efervescentes; tintas; edulcorantes; agentes humectantes, tales como lecitina, polisorbatos, laurilsulfatos; y, en general, sustancias no toxicas y farmacologicamente inactivas usadas en formulaciones farmaceuticas. Tales preparaciones farmaceuticas pueden fabricarse de manera conocida, por ejemplo, por medio de procesos de mezcla, granulacion, formacion de comprimidos, recubrimiento con azucar o de recubrimiento con pellcula.

Dispersiones llquidas para administracion por via oral pueden ser jarabes, emulsiones y suspensiones. Los jarabes pueden contener como vehlculos, por ejemplo, sacarosa o sacarosa con glicerina y/o manitol y/o sorbitol.

Las suspensiones y emulsiones pueden contener como vehlculo, por ejemplo, una goma natural, agar, alginato de sodio, pectina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa o poli(alcohol vinllico). Las suspensiones o disoluciones para inyecciones intramusculares pueden contener, junto con el compuesto activo, un vehlculo farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, agua esteril, aceite de oliva, oleato de etilo, glicoles, por ejemplo propilenglicol, y si se desea, una cantidad adecuada de clorhidrato de lidocalna.

Las disoluciones para intravenosa o infusiones pueden contener como vehlculo, por ejemplo, agua esteril o preferentemente pueden estar en forma de soluciones salinas isotonicas acuosas esteriles.

Para supositorios, aglutinantes y vehlculos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o trigliceridos; tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo del 0,5 % al 10 %, preferentemente 1 % al 2 %.

Las formulaciones orales incluyen tales excipientes normalmente empleados como, por ejemplo, calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones toman la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, plldoras, capsulas, formulaciones de liberacion sostenida o polvos y contienen 10 % al 95 % de principio activo, preferentemente 25 % al 70 %. Si la composicion farmaceutica se liofiliza, el material liofilizado puede reconstituirse antes de la administracion, por ejemplo, una suspension. La reconstitucion se efectua preferentemente en tampon.

Pueden proporcionarse capsulas, comprimidos y plldoras para administracion por via oral a un paciente con un recubrimiento enterico que comprende, por ejemplo, Eudragit "S", Eudragit "L", acetato de celulosa, acetato-ftalato de celulosa o hidroxipropilmetilcelulosa.

Tambien pueden usarse composiciones farmaceuticas adecuadas para la administracion por inyeccion sin aguja, por ejemplo, por via transdermica. Las composiciones segun la invention pueden presentarse en todas las formas de dosificacion normalmente usadas para administracion topica, en particular en forma de disoluciones acuosas, acuosas-alcoholicas o aceitosas, de dispersiones de la locion o tipo de suero, de geles anhidros o lipofilos, de emulsiones de consistencia llquida o semi-solida del tipo leche, obtenidas dispersando una fase grasa en una fase acuosa (O/VV) o viceversa (VV/O), o de suspensiones o emulsiones de consistencia semi-solida blanda del tipo de crema o gel, o alternativamente de microemulsiones, de microcapsulas, de micropartlculas o de dispersiones vesiculares con el tipo ionico y/o no ionico. Estas composiciones se preparan segun metodos convencionales.

Tambien pueden usarse para el cuero cabelludo en forma de disoluciones acuosas, alcoholicas o acuosas- alcoholicas, o en forma de cremas, geles, emulsiones o espumas, o alternativamente en forma de composiciones en aerosol que tambien contienen un agente propulsor a presion.

Las cantidades de los diferentes constituyentes de las composiciones segun la invencion son aquellas tradicionalmente usadas en los campos en cuestion.

Se administra una cantidad terapeuticamente eficaz del polipeptido o polinucleotido. La dosis puede determinarse segun diversos parametros, especialmente segun el polipeptido o polinucleotido usado; la edad, peso y afeccion del paciente que va a tratarse; la via de administracion; y la pauta requerida. Otra vez, un medico sera capaz de determinar la via de administracion requerida y dosificacion para cualquier paciente particular. Una dosis diaria tlpica es de aproximadamente 0,001 a 50 mg por kg, preferentemente de aproximadamente 0,01 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, segun la actividad del polipeptido, la edad, peso y afecciones del sujeto que van a tratarse, el tipo y

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gravedad de la enfermedad y la frecuencia y via de administracion. Preferentemente, los niveles de dosificacion diaria son de 0,5 mg a 2 g. Pueden usarse dosificaciones mas bajas para administracion topica.

Las secuencias de nucleotidos de OmCI modificadas descritas anteriormente y los vectores de expresion que contienen tales secuencias tambien pueden usarse como formulaciones farmaceuticas como se explica resumidamente anteriormente. Preferentemente, el acido nucleico, tal como ARN o ADN, en particular ADN, se proporciona en forma de un vector de expresion, que puede expresarse en las celulas del individuo que va a tratarse. Las formulaciones pueden comprender secuencias de nucleotidos desnudas o estar en combinacion con llpidos cationicos, pollmeros o sistemas que eligen diana. Las formulaciones pueden administrarse por cualquier tecnica disponible. Por ejemplo, el acido nucleico puede introducirse por inyeccion con aguja, preferentemente por via intradermica, por via subcutanea o por via intramuscular. Alternativamente, el acido nucleico puede administrarse directamente a traves de la piel usando un dispositivo de administracion de acidos nucleicos tal como administracion genica mediada por partlcula. El acido nucleico puede administrarse apicalmente a la piel, o a las superficies de la mucosa, por ejemplo, por administracion intranasal, oral, intravaginal o intra-rectal.

La captacion de las construcciones de acidos nucleicos puede potenciarse por varias tecnicas de transfeccion conocidas, por ejemplo, aquellas que incluyen el uso de agentes de transfeccion. Ejemplos de estos agentes incluyen agentes cationicos, por ejemplo, fosfato de calcio y DEAE-dextrano y lipofectantes, por ejemplo, lipofectam y transfectam. La dosificacion del acido nucleico que va a administrarse puede alterarse. Normalmente, el acido nucleico se administra en el intervalo de 1 pg a 1 mg, preferentemente a 1 pg a 1 pg de acido nucleico para la administracion genica mediada por partlcula y 10 pg a 1 mg para otras vlas.

Ejemplos

Ejemplo 1: OmCI no mutante se une a 12(S)-HETE (acido 12(S)-hidroxieicosatetraenoico) en un ELISA competitivo

Antecedentes:

Se une OmCI a acidos grasos (Figura 1). La espectroscopla de masas muestra que el acido ricinoleico (C1sH34O3) y el acido palmitoleico (C16H30O2) son las formas predominantes encontradas en OmCI expresado en P. methanolica y E. coli, respectivamente. Sin embargo, es mas probable que los ligandos fisiologicos verdaderos sean uno o mas de los muchos eicosanoides derivados de la membrana de celulas huesped que median en inflamacion, estres oxidativo y senalizacion celular.

Estan disponibles inmunoensayos enzimaticos competitivos (EIA) de Assay Designs Inc. para la cuantificacion de varios eicosanoides. Un kit de EIA tal usa un anticuerpo policlonal para 12(S)-HETE para unir 12(S)-HETE marcado con fosfatasa alcalina y competir con 12(S)-HETE no marcado en la muestra o patrones de concentracion conocida. Despues de la incubacion simultanea a temperatura ambiente y la captura del anticuerpo sobre la placa, se lava el exceso de reactivos, se anade el sustrato y la reaccion se mide por lector de microplacas. Cuanto mayor sea la concentracion de 12(S)-HETE en la muestra o patron, menor sera la lectura de absorbancia, debido a que el acido graso no marcado compite por la union con la molecula de fosfatasa alcalina marcada.

Los presentes inventores supusieron que OmCI competirla por la union con los anticuerpos especlficos para eicosanoide usados en los inmunoensayos. Se eligio el acido 12(S)-hidroxieicosatetraenoico (12(S)-HETE) para probar esta idea ya que es (quizas) el eicosanoide con las caracterlsticas fisicoqulmicas mas similares al acido ricinoleico (que, a partir de los datos cristalograficos de los presentes inventores, se predice que se une mas fuertemente que el acido palmitoleico). Entre otros efectos, se ha mostrado que 12(S)-HETE es quimiotactico y quimiocinetico para los leucocitos polimorfonucleares y celulas de musculo liso vasculares.

Metodos:

El kit de EIA de 12(S)-HETE era de Assay Designs (Cat. No. 900-050). Las disoluciones madre de OmCI usadas se expresaron tanto en levadura (yOmCI) como bacteria (bOmCI). Ambas disoluciones madre fueron >98 % puras, 8,3 mg/ml en solucion salina tamponada con fosfato a pH 7,2 (PBS). La protelna de union a histamina de garrapata de control negativo RaHBP2, que tambien es una lipocalina (Paesen et al., 1999), se expreso en bacterias y tambien fue >98 % pura, 8,3 mg/ml en PBS. Se diluyo patron de 12(S)-HETE a 50000, 12500, 3125, 781, 195 pg/ml en el tampon de ensayo suministrado con el kit. Se mezclaron 100 pl de las disoluciones de 12500, 3125 y 0 pg/ml con <9 pl de solucion salina tamponada con fosfato a pH 7,2 (PBS) o disoluciones de OmCI o RaHBP2 en PBS. Las mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, luego se usaron en el inmunoensayo de 12(S)- HETE segun las instrucciones del fabricante. Las lecturas de absorbancia de las muestras tratadas se compararon con una curva patron para estimar la concentracion de 12(S)-HETE disponible en disolucion para la union por el anticuerpo policlonal anti-12(S)-HETE.

Resultados:

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bOmCI, pero no RaHBP2, disminuye la cantidad de 12(S)-HETE disponible en disolucion para la union a anticuerpo, que sugiere que bOmCI se une directamente a 12(S)-HETE (Fig. 2). PBS y ambas de las preparaciones de protelnas purificadas bOmCI y RaHBP2 parecen contener algo (< 1000 pg/ml) de 12(S)-HETE. Se usaron metodos similares para mostrar que OmCI se une a LTB4 (datos no mostrados).

Discusion:

Estos resultados iniciales con la protelna bacterianamente expresada sugieren que OmCI puede unirse a acidos grasos que son mas largos (C20) y tienen un mayor numero de enlaces insaturados (cuatro) que cualquier acido palmitoleico (C16 y 1 doble enlace) o ricinoleico (C18 y 1 doble enlace). Ademas, 12(S)-HETE no tiene un doble enlace en C9 - C10 que se predijo que era importante para la union a ligando. Los resultados tambien sugieren que el acido palmitoleico puede ser desplazado del bolsillo de union de bOmCI por 12(S)-HETE. Aunque se necesita precaucion con esta suposicion, ya que OmCI se uso en gran exceso molar (~1000 - 4000 veces) y es posible que una proporcion de bOmCI purificado no esta ocupada por ningun ligando.

Ejemplo 2: La union de LTB4 por OmCI no mutante es evidente por absorbancia

Antecedentes:

Los leucotrienos tienen espectros de absorcion de UV fuertes caracterlsticos debido a sus sistemas de dobles enlaces conjugados (el cromoforo de trieno). En medio acuoso, LTB4 tiene un pico absorbancia a 271 nm y 'hombros' a 262 nm y 282,5 nm. La absorbancia pico de la protelna es a 280 nm. OmCI unido a LTB4 debe presentar elevada absorbancia de UV a aproximadamente 280 nm, en comparacion con la protelna por si misma, y los hombros caracterlsticos de LTB4 10 nm a cualquier lado del pico absorbancia.

Metodo:

Se incubo bOmCI (4,5 mg) con 1,8 ml de LTB4 (50 ng/pl de disolucion madre en etanol puro, Biomol International) en 39 ml de PBS a temperatura ambiente con agitacion durante 10 minutos. Esta mezcla esta en una relacion molar 1:1 entre OmCI y LTB4. La mezcla se concentro a 200 pl en el dispositivo de ultrafiltracion de 5 kDa de corte Vivaspin (Sartorious). El concentrado se lavo con otros 30 ml de PBS y se concentro a 200 pl. En paralelo, se incubo la misma cantidad (4,5 mg) de bOmCI con 1,8 ml de etanol ultrapuro en 39 ml de PBS, luego se concentro y se lavo como se ha descrito anteriormente. El volumen final de las protelnas concentradas fue 200 pl. Se examinaron los espectros de absorcion de UV de las protelnas usando un espectrofotometro ND-1000 de Nanodrop.

Resultados:

Los espectros obtenidos se muestran en la Fig. 3. LTB4 solo tiene los picos de absorbancia caracterlsticos esperados en solucion salina tamponada con fosfato a pH 7,4 con picos a 271, 261 y 281 nm (Fig. 3A). Los espectros de absorcion de bOmCI se incubaron con LTB4, se lavaron ampliamente para eliminar LTB4 residual, tienen hombros indicativos de union de LTB4 y la absorbancia pico es significativamente superior a bOmCI incubado con etanol puro (Fig. 3B). Esto indica que bOmCI se une selectivamente a LTB4 y lo elimina de la disolucion. De hecho, no es detectable LTB4 en el flujo a traves de la etapa de ultrafiltracion inicial (Fig 3A) que indica que (dentro de los llmites de detection) todo el LTB4 anadido a la mezcla inicial fue unido por bOmCI.

Se observaron cambios significativos en los espectros de UV de LTB4 unido por bOmCI. El maximo de UV presento un desplazamiento batocromico de + 6 nm (al rojo) a 277, 267 y 287 nm (Fig. 3A y B). El desplazamiento esta lo mas probablemente producido por las interacciones de dispersion entre el leucotrieno conjugado y los aminoacidos de bOmCI. Esto esta de acuerdo con el cromoforo de trieno que esta completamente englobado por la protelna. Interacciones similares produciran hipocromismo de la absorcion de UV por el cromoforo de trieno. Esto no se midio directamente, pero es notable que la absorcion pico esperada del LTB4 de entrada concentrado a 200 pl (volumen final de protelna concentrada) serla 55,8 (calculo 41,32 ml/0,2 ml x 0,27 10 mm de absorbancia) mientras que la absorcion pico total de LTB4 unido a bOmCI fue aproximadamente 35,07 (calculo absorcion a 10 mm pico de bOmCI:LTB4 menos absorcion pico de bOmCI, es decir, 61,19 - 26,12). Suponiendo perdidas de protelna mlnimas, el calculo implica hipocromismo.

Ejemplo 3: Los datos estructurales cristalograficos muestran LTB4 en el bolsillo de union de bOmCI mutante. Metodo:

Se preparo la protelna pOmCI cargada con LTB4 como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 2), luego se concentro a 25 mg/ml, el tampon se intercambio a Tris-HCl a pH 7, NaCl 30 mM y se uso para hacer crecer los cristales. Se recogio un conjunto de datos de difraccion de un cristal monocllnico P21 de OmCI:LTB4 (a=41,76 A b=112,81 A c=62,40 A p=101,89°, 4 copias/unidad asimetrica) en julio de 2008 en BM14@ESRF. Los datos se han procesado a resolution de 2,0 A, la estructura se determino inicialmente por sustitucion molecular y el modelo de OmCI:LTB4 se construyo y refino a R=20,7 Rlibre=23,7, rmsdenlaces=0,005, rmsdangulos=0,9.

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Resultados:

La Figura 4 muestra una representacion de esferas y palillos de LTB4 en el bolsillo de union de bOMCI. Los siguientes residuos estan directamente implicados en la union a LTB4:

• Arg54, Thr85, Trp87: estos residuos unen con hidrogeno la cabeza (grupo carboxi) de LTB4; modificaciones de estos residuos pueden manipularse para unir ligandos que se diferencian en la qulmica del grupo de cabeza

• El cuerpo hidrofobo de LTB4 pone en contacto las cadenas laterales hidrofobas del bolsillo: Phe36, Tyr43, Pro61, Leu70, Val72, Phe76, Leu57, Met74, Arg107, Phe89, Trp133, Trp87, Gly59

• Arg107 y Gln105 reconocen -OH en el carbono 5 (C5) de LTB4

• His119 y Asp121 reconocen -OH en el carbono 12 (C12) de LTB4

El acido ricinoleico carece del grupo -OH en el carbono 5, solo tiene un unico doble enlace entre C9 y C10 y es dos

atomos de carbono mas corto que LTB4. Las principales diferencias estructurales entre OMCI unido al acido

ricinoleico unido en comparacion con LTB4 estan en la region del bucle 132-142 que es necesaria para la inhibicion de C5 (Mans y Ribeiro, 2008). Las diferencias pueden resumirse del siguiente modo:

• Giro de las cadenas laterales de Glu141 y His164 (estos cambios en His164 y Glu141 estan relacionados mediante dos enlaces de hidrogeno de las cadenas laterales de Arg47 y Arg148); como resultado de estos giros de las cadenas laterales, se pierde el puente salino de His164:Asp136 y el bucle 132-142 se retrae mediante un giro de la cadena lateral de His 117, que une hidrogeno a G139, y perdida del agua de enlace. Este cambio conformacional inducido por la union de LTB4 puede tener un efecto de la union cinetica de OmCI a C5, pero los presentes inventores no tienen presentemente ninguna evidencia directa de esto.

• La segunda region que muestra una reorganizacion menor es 155-159. No existe contacto directo entre la region inhibidora de C5 132-142 y el bolsillo. La estructura de bucle de 132-142 es la misma en las cuatro copias en la unidad asimetrica a pesar de que este bucle esta en tres entornos de empaquetamiento cristalino diferentes a traves de las 4 copias: as! es posible que las diferencias con relacion a la estructura del acido ricinoleico sean debidas a la sutil propagacion de la estructura de ligando a bucle mediante una capa intermedia de pequenos cambios.

Ejemplo 4: Acidos grasos presentes en OmCI recombinante expresado en bacterias Antecedentes:

Se sabe que el acido ricinoleico (47 %), el ester metllico del acido palmltico (21 %) y el ester metllico del acido estearico (11 %) son los acidos grasos predominantes unidos por OmCI recombinante expresado en levadura. Tambien se ha mostrado recientemente que OmCI puede unirse al acido 12(S)-hidroxieicosatetraenoico (HETE) y lo mas fuertemente a LTB4. Se sabe que los homologos de OmCI se unen a acido araquidonico. Los presentes inventores han mostrado que OmCI expresado en bacterias todavla se une a otros acidos grasos.

Metodo:

Se evaporo el extracto de protelna OMCI en bruto (CHCh, 130 pl) a sequedad a temperatura ambiente con una ligera corriente de nitrogeno. Se anadieron algunas gotas de una disolucion eterea de diazometano para convertir el acido libre en el ester metllico. Despues de 10 min, el disolvente y el exceso de diazometano se eliminaron por una corriente de nitrogeno y la muestra se recogio en diclorometano (50 pl). Despues de concentracion adicional a 10 pl, la muestra se uso directamente para el analisis de CG-EM. El acido graso de referencia se convirtio asimismo en el ester metllico por diazometano antes del analisis de CG-EM en un TraceEM (ThermoFinnigan, D-63329 Egelsbach, Alemania) equipado con capilar de sllice fusionada Alltech EC5 (D-82008 Unterhaching, Alemania) (15 m x 0,25 mm, 0,25 pm) usando He a 1,5 ml min-1 como gas portador. Se inyectaron muestras (1 pl) en el modo sin fraccionamiento (1 min) y se separaron bajo condiciones programadas empezando a 60 °C (1 min), seguido de calentamiento con 10 °C min-1 a 180 °C, y con 4 °C min-1 a 280 °C mantenido durante 2 min. Se midieron espectros de barrido completo en modo de impacto electronico (EI) a 70 eV, con una temperatura de la fuente de 200 °C, llnea de transferencia a 280 °C, y una corriente de emision de 250 pA. El instrumento opero entre m/z 50 y m/z 540 a 2 barridos s-1. La presencia de esteres metllicos del acido palmitoleico y elaldico se confirmo comparando con muestras autenticas.

Resultados:

Para la identification del acido graso asociado a protelna, la muestra esterificada se analizo por cromatografla de gases (Fig. 5) y espectroscopla de masas (no mostrado). El principal componente (64 %) parece ser el isomero cis del acido palmitoleico (C16:1 cis). Hay un componente minoritario (7,6 %) de un acido graso monoinsaturado C17:1 con tanto isomeros cis como trans presentes. Los compuestos finales son C18:1 prevaleciendo el isomero trans. El acido oleico (C18:1 cis) es un compuesto minoritario (2,7 %). El principal componente C18:1 es probablemente

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elaldico, sin embargo, el tiempo de retention no fue perfectamente identico a la referencia, mientras que si fue el acido oleico. Lo que los presentes inventores llamaron acido elaldico puede realmente ser acido vaccenico (C18:1 trans pero con el doble enlace en C11 en lugar de C9 en acido elaldico u oleico). La aparicion de trans-acidos grasos es coherente del origen bacteriano de OMCI. Los acidos saturados no son de la muestra, sino que ya estaban presentes en el reactivo de sililacion (C16:0 y C18:0) y no se incluyeron en la cuantificacion.

Discusion:

Puede unirse OmCI a una variedad de acidos grasos entre 16 y 20 carbonos de longitud que varlan en numero y position de sus enlaces insaturados y grupos hidroxilo. Esta presente una variedad de acidos grasos en OmCI recombinantemente expresado. La identidad de los acidos grasos presente en la cavidad de union depende de su concentration en la disolucion de protelna y la especificidad de union por cada acido graso.

Ejemplo 5: La mutagenesis dirigida al sitio de residuos especfficos dentro del bolsillo de union de OmCI destruye la union de LTB4.

Antecedentes

LTB4 esta encerrado por OmCI dentro de un bolsillo de union. El bolsillo puede bloquearse, y prevenirse la union de LTB4, usando mutagenesis dirigida al sitio para insertar un gran residuo, tal como triptofano, en lugar de uno mas pequeno presente en la protelna natural. La union de LTB4 a OmCI puede medirse mediante una variedad de tecnicas que incluyen inmunoensayos enzimaticos competitivos (EIA) disponibles para la cuantificacion de eicosanoides. En el ensayo, OmCI compite por la union con los anticuerpos especlficos para LTB4 usados en el EIA.

Metodo:

Se uso mutagenesis dirigida al sitio por PCR para cambiar la fenilalanina 36 por el triptofano (yOmCI-F36W) y, por separado, la glicina 59 por triptofano (yOmCI-G59W). Las protelnas mutantes se expresaron en levadura (Pichia methanolica), se purificaron a homogeneidad (>95 % pura) y las concentraciones se determinaron por absorcion. La union de los mutantes a LTB4 se comparo con el mutante usando kits de EIA de Assay Design Inc (vease el Ejemplo 1).

Resultados:

Como se muestra en la Fig. 6, yOmCI-F36W y yOmCI-G59W mostraron significativamente menos union a LTB4 que yOmCI no mutante. El modelado indica que las mutaciones bloquean el bolsillo de union. Es probable que estos mutantes prevengan la union de todos los acidos grasos y no solo LTB4.

Discusion:

La capacidad de OmCI para unirse a moleculas de LK/E tales como LTB4 puede reducirse o eliminarse mutando residuos claves dentro del bolsillo de union de OmCI. Este sitio de union es distinto al sitio de union del complemento de OmCI. Por tanto, eliminando especlficamente la actividad de union de LK/E, los polipeptidos de OmCI modificados pueden usarse para dirigir enfermedades mediadas por el complemento y condiciones sin interferir con la action de LK/E.

Ejemplo 6: Mutantes dirigidos al sitio de OmCI, que son incapaces de unirse a LTB4, pueden inhibir el complemento

Antecedentes

Podrla prevenirse la mutation de los residuos que previenen la union de LTB4 yOmCI-F36W y yOmCI-G59W que actuan como inhibidores del complemento. Los presentes inventores, por tanto, compararon la inhibition de la via clasica del complemento por OmCI no mutante y los mutantes yOmCI-F36W y yOmCI-G59W.

Metodo:

Globulos sangulneos de oveja fueron de los Servicios de cultivo de tejido. Se obtuvo hemolisina de Sigma. Los sueros de cobaya fueron de animales en casa. Se lavaron cinco ml de sangre de oveja fresca en disolucion de Alsever (1:1 vol/vol) una vez en 50 ml de gelatina veronal barbital-EDTA (GVB-EDTA) y tres veces en 50 ml de tampon GvB2+ (tampon GVB con Mg2+ y Ca2+). La sangre se diluyo a una concentracion de 1 x 109 celulas ml-1. Los eritrocitos se sensibilizaron usando hemolisina de conejo, se valoraron como se describio (Coligan, 1994). Los ensayos se llevaron a cabo en un volumen total de 100 pl usando 100 pl de 1:320 de suero de cobaya diluido en GVB2+ como fuente de complemento y 50 pl de 2x108 eritrocitos sensibilizados (EA) segun protocolos convencionales (Giclas, 1994). Se anadieron cinco microgramos de las protelnas recombinantes OmCI o PBS (5 pl) finalmente, y las reacciones se incubaron con agitation (500 rpm) a 37 °C. Despues de 30 min, las celulas completas

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se centrifugaron a 12000 x g durante 5 segundos y la hemolisis se midio espectrofotometricamente a 412 nm (Coligan, 1994). Todos los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.

Resultados:

Como se muestra en la Fig. 7, yOmCI-F36W y yOmCI-G59W inhibieron la via clasica de activacion del complemento tan potentemente como OmCI no mutante a la concentracion (5 microgramos por reaccion) usada.

En otro experimento, se sensibilizaron globulos rojos de oveja usando hemolisina de conejo (Sigma), se lavaron en tampon GVB (tampon GVB con Mg y Ca ) y se ajustaron a 1 x 10 celulas ml' . Los ensayos se llevaron a cabo en un volumen total de 100 pl usando 50 pl de 1:320 de suero de cobaya diluido en GVB2+ como fuente de complemento y 50 pl de 2x108 celulas de eritrocito activado (EA) ml-1. Se anadieron cinco microlitros de OMCI no mutante o mutante recombinante o protelna de control RaHBP2 diluida en PBS finalmente, y las reacciones se incubaron a 37 °C durante 30 min. Las celulas completas se centrifugaron entonces a 12000 x g durante 5 segundos y la hemolisis se midio espectrofotometricamente a 412 nm. El porcentaje de lisis de las muestras se calculo usando el valor de absorbancia para el 100 % de la lisis celular causada anadiendo agua en lugar de tampon GVB2+ a los EA.

Resultados:

La Fig. 8 muestra que no hay diferencia en la inhibicion de la via clasica de activacion del complemento por OMCI no mutante y OMCI que es incapaz de unirse a LTB4. Esto sugiere que la union de LTB4 no tiene efecto sobre la union de OMCI a C5.

Discusion:

La capacidad de las dos formas mutantes de OmCI (yOmCI-F36W y yOmCI-G59W) para inhibir el complemento implica que la union del acido graso no es necesaria para OmCI para inhibir el complemento. Esto esta soportado por los datos estructurales cristalograficos que muestran solo cambios mlnimos en la estructura externa de OmCI, que media en la interaccion con C5, cuando se une a LTB4 o un ligando no fisiologico tal como acido palmitoleico (vease el Ejemplo 3).

Ejemplo 7: OMCI solo y OMCI unido a C5 humana presentan la misma cinetica de union para LTB4 Antecedentes

La union de LTB4 puede alterarse cuando OMCI se une a C5. Esto podrla producirse mediante impedimento esterico, o mediante cambios en la entalpla y/o conformation. La posibilidad se evaluo comparando la union cinetica de LTB4 radiomarcado a OMCI y OMCI en complejo con C5 humana (hC5).

Metodo:

Se incubaron OMCI bacteriano purificado recombinante y hC5 (Calbiochem) a una relation molar 1:2 en PBS a TA durante 10 minutos para formar el complejo de OMCI:hC5. La formation del complejo se confirmo por desplazamiento en gel de poliacrilamida nativo (datos no mostrados). Se diluyeron sucesivamente cantidades iguales de OMCI:hC5 o OmCi solo en 75 pl de PBS antes de anadir 75 pl de PbS que contenla ~ 24000 c.p.m de [5,6,8,9,11,12,14,15-3H(n)]-LTB4 (Perkin Elmer, NEN Biotech, Lote 358QQ56; actividad total 5 pCi o 185 kBq; actividad especlfica 190 Ci/mmol). Tras la incubation (3 h, TA), las muestras se centrifugaron a 8000 g durante 2 minutos y la radiactividad restante en disolucion se midio en un contador de centelleo llquido Wallac 1217 Rackbeta despues de transferir 20 pl del sobrenadante a 4 ml de mezcla de centelleo de valor Beckman Ready. Se usaron PBS solo y diluciones sucesivas de RaHBP2 y hC5 en PBS como controles negativos.

Resultados:

La Fig. Qa muestra que OMCI y OMCI:hC5 muestran union saturable a 3H-LTB4, mientras que PBS (no mostrado), RaHBP2 y hC5 no. El ensayo usado aqul en realidad mide la capacidad de OMCI para unirse a LTB4 y mantenerlo en disolucion. No mas del 20 % del LTB4 marcado siguio en disolucion en las muestras de control negativo, mientras que mas del 50 % siguio en disolucion a las mayores concentraciones de OMCI (Fig. Qa). Las constantes de asociacion y de disociacion no pueden derivarse con exactitud usando estos datos, sin embargo, la comparacion de la pendiente de las funciones de regresion logarltmica para concentraciones equivalentes de OMCI y OMCI:hC5 indican que la union cinetica entre LTB4 y OMCI no se altera por union a C5 (Fig. Qb). Estos datos estan de acuerdo con el uso de caras opuestas de OMCI para la union a C5 y la entrada de LTB4 a la cavidad de union de lipocalina.

Referencias

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5

10

15

20

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Natural Environment Research Council

<120> TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES Y AFECCIONES MEDIADAS POR EL COMPLEMENTO

<130> N.107303A

<150> PCT/GB2009/000311 <151 > 2009-02-05

<150> GB 0906779.4 <151 > 2009-04-20

<160> 11

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1 <211> 525 <212> ADN

<213> Ornithodoros moubata

<220>

<221> CDS <222> (13)..(519)

<220>

<221> sig_peptido <222> (13)..(66)

<400> 1

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30

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155

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Arg

Asn Gin Met Tyr Pro Hi s Leu Lys Asp Cys

150 165

<210>2 <211> 168 <212> PRT

<213> Ornithodoros moubata <220>

<223> Secuencia de la protelna incluyendo peptido senal en los residuos 1 to 18 <400> 2

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Met

Leu Val Leu Val Thr Leu lie Phe Ser Phe Ser Ala Asn He Ala

1

5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65

70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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145

150 155 160

Met

Tyr Pro His Leu Lys Asp Cys

165

<210>3 <211> 150 <212> PRT

<213> Ornithodoros moubata <220>

<223> Secuencia de la protelna que carece de peptido senal N terminal de <400> 3

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Asp

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1

5 10 15

Ala

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Ala

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Ala

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10 75 80

Thr

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35 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Cys

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130 135 140

Pro

His Leu Lys Asp Cys

H5 150

<210>4 <211> 525 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<221> CDS <222> (13)..(519)

<220>

<221> sig_peptide <222> (13)..(66)

<220>

<223> Secuencia de SEQ ID NO:1 alterada por mutagenesis dirigida al sitio para prevenir la hiperglicosilacion de peptido codificado. Los codones en las posiciones 244-246 y 316-318 son replazados con caa.

<400> 4

5

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50 55 60

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65 70 75

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160 165

<210>5 <211> 168 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Peptido secuencia codificada por SEQ ID NO: 4. Mutagenesis dirigida al sitio de la SEQ ID NO: 4 resultados en Gln en lugar de Asn en las posiciones 78 y 102 en comparacion con la SEQ ID NO: 2 para evitar hiperglicosilacion <400> 5

5

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Met

Leu Val Leu Val Thr Leu lie Phe Ser Phe Ser Ala Asn lie Ala

1

5 10 15

Tyr

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20 25 30

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35 40 4 S

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65

70 75 00

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115 120 125

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150 155 160

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Tyr Pro His Leu Lys Asp Cys

165

<210>6 <211> 525 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> CDS <222> (13)..(519)

<220>

<221> sig_peptide <222> (13)..(66)

<220>

<223> Omithodoros moubata mutante OMCI-F36W: secuencia de la SEQ ID NO: 1 alterado por mutagenesis dirigida al sitiopara cambiar la fenilalanina (F) 36 de triptofano (W) para evitar los codones de union de acidos grasos en las posiciones 118-120 estan sustituido con TGG.

<400> 6

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130 165

<210>7 <211> 168 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Ornithodoros moubata mutant OmCI-F36W secuencia de protein incluyendo senasl de residues de peptido de 1 a 18

<400>7

Met Leu Val Leu Val Thr Leu lie Phe Ser Phe Ser Ala Asn He Ala IS 10 IS

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<210>8 <211> 150 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Ornithodoros moubata OMCI mutacion OmCI-F36W secuencia de la protelna que carece de peptido senal N

terminal

<400> 8

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<210>9 <211> 525 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<221> CDS <222> (13)..(519)

<220>

<221> sig_peptido <222> (13)..(66)

<220>

<223> Ornithodoros moubata mutacion OmCI-G59W: secuencia de SEQ ID NO:1 alterado por mutagenesis dirigida al sitiopara cambiar la glicina (F) 59 de triptofano (W) para evitar que el acido graso Los codones de union en las posiciones 187-189 se sustituyen con TGG.

<400> 9

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115 120 125

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160 165

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337

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483

525

<210> 10 <211>168 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Omithodoros moubata OMCI mutacion OmCI-G59W Secuencia de protein incluyendo senal de residuo de peptido 1 a 18

<400> 10

Met; Leu V*X Leg Val Thr Leu lie 1 5

Tyr Ala Asp Ser Glu Ser Asp Cys 20 ’ '

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10 15

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55

60

65

Thr Asp Pro Lys Ala Arg Asp Cys 50 55

Lys Gin Asp Asn Thr Leu Pro Val 65 70

Asp Trp Ala Ser The Asp Trp Thr 05

Thr Ala Thr Leu Gly Asn Leu Thr 100

Ser Gin Ser His His Cys His Val 115 120

Asp Tyr Glu Met Trp Met Leu Asp 130 135

Glu Cys Cys Arg Gin Lys Leu Glu 145 150

Leu Lys Trp Glu Pro Ala Gly Glu 60

Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr 75 00

Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val 50 95

Gin Asn Arg Glu Val Val Tyr Asp 105 110

Asp Lys Val Glu Lys Glu Val Pro 125

Ala Gly Gly Leu Glu Val Glu Val 140

Glu Leu Ala Ser Gly Arg Asn Gin

155 160

Met Tyr Pro His Leu Lys Asp Cys 165

<210> 11 <211> 150 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Ornithodoros moubata OMCI mutacion OmCI-G59W Falta de secuencia de proteina N de senal terminal de peptido.

<400> 11

Asp Ser Glu Ser Asp Cys Thr Gly Ser Glu Pro Val Asp Ala Phe Gin 15 10 15

Ala Phe Ser Glu Gly Lys Glu Ala Tyr Val Leu Val Arg Ser Thr Asp 20 25 30

Pro Lys Ala Arg Asp Cys Leu Lys Trp Glu Pro Ala Gly Glu Lys Gin 35 40 45

Asp Asn Thr Leu Pro Val Met Met Thr Phe Lys Asn Gly Thr Asp Trp ' 50 55 60 '

Ala Ser Thr Asp Trp Thr Phe Thr Leu Asp Gly Ala Lys Val Thr Ala 65 70 75 30

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un polipeptido de OmCI que tiene actividad de union de LTB4 reducida o carece de ella, en el que dicho polipeptido de OmCI comprende:

   (a) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 que se ha modificado para eliminar o reducir la actividad de union de LTB4;

   (b) una secuencia de aminoacidos de variante que tienen al menos el 60 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 y que se ha modificado para eliminar o reducir la actividad de union de LTB4;

   (c) una secuencia de aminoacidos de variante de SEQ ID NO: 2 que tiene al menos el 60 % de identidad con la secuencia de aminoacidos entre los restos de aminoacidos 19 a 168 de SEQ ID NO: 2 y que se ha modificado para eliminar o reducir la actividad de union de LTB4; o

   (d) un fragmento de la secuencia de aminoacidos de (a), (b) o (c) que carece de actividad de union de LTB4.
2. 2. El polipeptido de la reivindicacion 1, en el que se han mutado uno o mas de los restos de aminoacidos dentro de la cavidad de union de dicho polipeptido de OmCI.
3. 3. El polipeptido de la reivindicacion 2, en el que uno o mas de los restos de aminoacidos que van a mutarse estan seleccionados de Phe36, Arg54, Leu57, Gly59, Val72, Met74, Phe76, Trp87, Phe89, Gln105, Arg107, His119, Asp121 y Trp133, en el que la numeration de aminoacidos es con referencia a SEQ ID NO: 2.
4. 4. El polipeptido de la reivindicacion 2 o 3, en el que al menos una mutation de aminoacido esta seleccionada de Phe36Trp y Gly59Trp.
5. 5. Un polipeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que carece de actividad de union de LTB4.
6. 6. Un polinucleotido que codifica el polipeptido de OmCI de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
7. 7. Un vector que comprende un polinucleotido segun la reivindicacion 6.
8. 8. Una celula huesped que comprende un polinucleotido segun la reivindicacion 6 o un vector segun la reivindicacion 7.
9. 9. Una composition farmaceutica que comprende:

   (a) un polipeptido de OmCI segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;

   (b) un polinucleotido segun la reivindicacion 6; o

   (c) un vector segun la reivindicacion 7;

   y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

   Fie* 1

   imagen1

   fit. 2

   imagen2

   imagen3

   125Q0pflfmL liSOOfigymL l25DDpgfnriL IZSQOpsAtiL OmClsolo RaMBPJsolo 12(S)-HETE 12(SJ-HETE + t2(S}-HErE + 12<S)-HETE + sola PSS OmCl R&NEJP2

   imagen4

   imagen5

   imagen6

   9J4E3

   016:1 CIS 64,0% ackia palrmitaleicn *££

   a Cm!

   017:1 trans 7.6% '35

   C18;1 as 27% acido oleico

   C18:1 tens 25.6 % acida eladico

   g

   5

   o

   o

   O

   imagen7

   imagen8

   Fig.S

   imagen9

   Microgramos de proteinas

   imagen10

   Fig. 9

   1900

   OWCI

   170D

   EV131

   A hC&

   1500

   -0“ OMC!:hC5

   c 1300

   u 1100 -

   900

   7QG

   100

   10000
10. 0.0001 0.01

    nM Proteirsa

    1200

    □MCI

    O OMCI:hC5

    moo -

    400 -

    200

    0 01

    nMOMCI