ES2589655T3 - Método para producir proteínas en Pichia pastoris que carecen de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos frente a antígenos de célula hospedadora - Google Patents

Método para producir proteínas en Pichia pastoris que carecen de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos frente a antígenos de célula hospedadora Download PDF

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Huijuan Li
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Abstract

Un método para producir una glicoproteína recombinante en Pichia pastoris que carece de actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora, que comprende: (a) proporcionar una célula hospedadora recombinante de Pichia pastoris que no presente ninguna actividad de ß-manosiltransferasa 1, 2, 3 y 4 con respecto a un N-glicano u O-glicano, en donde los genes de ß- manosiltransferasa 1, 2 y 3 han experimentado deleción o interrupción, incluyendo la célula hospedadora una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína recombinante (b) cultivar la célula hospedadora en un medio en condiciones eficaces para expresar la glicoproteína recombinante; y (c) recuperar la glicoproteína recombinante del medio para producir la glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora.

Description

Método para producir proteínas en Pichia pastoris que carecen de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos frente a antígenos de célula hospedadora 5
Antecedentes de la invención
(1) Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para producir proteína y glicoproteínas en Pichia pastoris que carecen de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos formados frente a antígenos de célula hospedadora. En particular, la presente invención se refiere al uso de cepas de Pichia pastoris recombinantes que no presentan una actividad de β-manosiltransferasa 2 con respecto a un N-glicano u O-glicano y no presentan al menos una actividad seleccionada entre el grupo que consiste en actividad de β-manosiltransferasa 1, 3 y 4 con respecto a un N-glicano u
15 O-glicano. Estas cepas de Pichia pastoris recombinantes pueden producir proteínas y glicoproteínas que carecen de restos de β-manosa resistentes a α-manosidasa detectables en las mismas. La presente invención también se refiere a métodos para producir eritropoyetina humana bi-sialilada en Pichia pastoris que carece de actividad de unión cruzada a anticuerpos frente a antígenos de célula hospedadora.
(2) Descripción de la técnica relacionada
La capacidad de producir proteínas humanas recombinantes ha dado lugar a grandes avances en atención de la salud humana y sigue siendo un área activa de descubrimiento de fármacos. Muchas proteínas terapéuticas requieren la adición postraduccional de glicanos a restos de asparagina específicos (N-glicosilación) de la proteína
25 para asegurar la actividad de estructura-función adecuada y la posterior estabilidad en suero humano. Para uso terapéutico en seres humanos, las glicoproteínas requieren una N-glicosilación similar a la humana. Las líneas de células de mamíferos (por ejemplo, células CHO, células de retina humana) que puede imitar el procesamiento de glicoproteína similar a la humana tienen varios inconvenientes que incluyen títulos bajos de proteínas, tiempos de fermentación largos, productos heterogéneos y contención viral continuada. Por lo tanto, es deseable usar un sistema de expresión que no solamente produzca títulos elevados de proteína con tiempos de fermentación cortos, sino que también pueda producir glicoproteínas similares a las humanas.
Los hospedadores fúngicos tales como la levadura metilotrófica Pichia pastoris tienen claras ventajas para la expresión de proteína terapéutica, por ejemplo, no secretan cantidades elevadas de proteínas endógenas, están 35 disponibles promotores inducibles fuertes para la producción de proteínas heterólogas, se pueden cultivar en medios químicos definidos y sin el uso de sueros de animal y pueden producir títulos elevados de proteínas recombinantes (Cregg et al., FEMS Microbiol. Rev. 24: 45-66 (2000)). Sin embargo, las proteínas glicosiladas expresadas en P. pastoris por lo general contienen azúcares de manosa adicionales que dan como resultado glicanos de "alta manosa", así como grupos manosilfosfato que transmiten una carga negativa sobre las glicoproteínas. Las glicoproteínas con cualquiera de glicanos de alta manosa o mananos cargados presentan el riesgo de provocar una respuesta inmunológica no deseada en los seres humanos (Takeuchi, Trends in Glycosci. Glycotechnol. 9: S29-S35 (1997); Rosenfeld y Ballou, J. Biol. Chem. 249: 2319-2321 (1974)). Por consiguiente, es deseable producir glicoproteínas terapéuticas en células hospedadoras fúngicas en las que el patrón de glicosilación en la glicoproteína sea idéntico o similar a que se produce en glicoproteínas producidas en seres humanos y que no tengan β
45 manosilación detectable.
Como se pone en evidencia mediante la presencia de anticuerpos protectores en individuos no infectados, es probable que los mananos unidos en β sean inmunogénicos o que afecten de forma adversa al individuo al que se le administra una proteína o glicoproteína terapéutica que comprende mananos unidos en β. Además, los grupos de manosa expuestos en las proteínas terapéuticas se eliminan rápidamente por los receptores de manosa de las células de macrófago, lo que da como resultado una baja eficacia del fármaco. Por lo tanto, la presencia de restos de de manosa unidos en β en glicanos unidos a N u O de proteínas terapéuticas heterólogas expresadas en un hospedador fúngico, por ejemplo, P. pastoris, no es deseable debido a su potencial inmunógeno y su capacidad para unirse a factores de eliminación.
55 Se ha informado que las glicoproteínas preparadas en P. pastoris contienen restos de manosa unidos en β. En 2003, Trimble et al. (Glycobiol. 14: 265-274, Epub 23 de diciembre) informaron de la presencia de restos de manosa unidos en β-1,2 en la lipasa estimulada por sales biliares humana recombinante (hBSSL) expresada en P. pastoris. Los genes que codifican varias β-manosiltransferasas se han identificado en Pichia pastoris y Candida albicans (Véase el documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.465.577 y Mille et al., J. Biol Chem 283: 9724-9736 (2008)).
A la vista de lo mencionado anteriormente, hay una necesidad de proporcionar métodos para preparar proteínas o glicoproteínas terapéuticas recombinantes en levadura metilotrófica tal como Pichia pastoris que carezcan de epítopos que pudieran provocar una reacción adversa en un individuo al que se le administra la proteína o 65 glicoproteína terapéutica recombinante. Un método para determinar si una proteína o glicoproteína terapéutica recombinante proporciona un riesgo de provocar una reacción adversa cuando se administra a un individuo es poner
en contacto la proteína o glicoproteína terapéutica recombinante con un anticuerpo preparado frente a los antígenos totales de la célula hospedadora. Esto es de particular preocupación para las proteínas o glicoproteínas destinadas a la administración crónica. La falta de unión cruzada al anticuerpo indica que la proteína o glicoproteína terapéutica recombinante carece de actividad de unión cruzada detectable al anticuerpo y es poco probable que provoque una
5 reacción adversa cuando se administra a un individuo. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos para producir una proteína o glicoproteína terapéutica recombinante que carezca de actividad de unión cruzada detectable al anticuerpo y que sea poco probable que provoque una reacción adversa cuando se administra a un individuo.
Breve sumario de la invención
La invención se expone en las reivindicaciones.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una glicoproteína recombinante en Pichia pastoris que carece de actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de
15 célula hospedadora, que comprende:
(a)
proporcionar una célula hospedadora de Pichia pastoris recombinante que no presente ninguna actividad de β-manosiltransferasa 1, 2, 3 y 4 con respecto a un N-glicano u O-glicano, en la que los genes de βmanosiltransferasa 1, 2 y 3 han experimentado deleción o interrupción, en el que la célula hospedadora incluye una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína recombinante
(b)
cultivar la célula hospedadora en un medio en condiciones eficaces para expresar la glicoproteína recombinante; y
(c)
recuperar la glicoproteína recombinante del medio para producir la glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora.
25 En el presente documento se describe el método en el que la actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora se determina en un ELISA de sándwich.
En el presente documento se describe el método en el que la actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora se determina en una transferencia de Western.
En el presente documento se describe el método en el que la glicoproteína recombinante es una glicoproteína terapéutica.
35 En el presente documento se describe el método en el que la glicoproteína terapéutica se selecciona entre el grupo que consiste en eritropoyetina (EPO); citoquinas tales como interferón α, interferón β, interferón γ, e interferón ω; y factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF); GM-CSF; factores de coagulación tales como factor VIII, factor IX y proteína C humana; antitrombina III; trombina; cadena α de receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG, e IgM; inmunoadhesiones y otras proteínas de fusión de Fc tales como proteínas de fusión a receptor de TNF-Fc solubles; proteínas de fusión de RAGE-Fc; interleuquinas; uroquinasa; quimasa; e inhibidor de urea y tripsina; proteína de unión a IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor de liberación de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibitorio de precursor mieloide; osteoprotegerina; α-1-antitripsina; α-feto proteínas; DNasa II; kringle 3 de plasminógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión del TNF; hormona
45 folículoestimulante; antígeno 4 -Ig asociado a linfocitos T citotóxicos; activador transmembrana y modulador de calcio y ligando de ciclofilina; proteína 1 de tipo glucagón; y agonista de receptores de IL-2
En el presente documento se describe el método en el que la célula hospedadora está modificada por ingeniería genética para producir glicoproteínas que tengan N-glicanos similares a los humanos.
En el presente documento se describe el método en el que la célula hospedadora está modificada por ingeniería genética para producir glicoproteínas que tengan predominantemente un N-glicano seleccionado entre Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAC2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc(14)Man3GlcNAc2, Gal(14)GlcNAc(14)Man3GlcNAc2 y NANA(14)Gal(14)GlcNAc(1
55 4)Man3GlcNAc2.
En otro aspecto, se describe el método de la presente invención para producir una eritropoyetina humana madura en Pichia pastoris que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora, que comprende:
(a) proporcionar una célula hospedadora de Pichia pastoris recombinante modificada por ingeniería genética para producir N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y no presenta ninguna actividad de βmanosiltransferasa 1, 2, 3 y 4 con respecto a un N-glicano u O-glicano, en la que los genes de β
65 manosiltransferasa 1, 2 y 3 genes han experimentado deleción o interrupción, en el que la célula hospedadora incluye dos o más moléculas de ácido nucleico, cada una codificando una proteína de fusión que comprende una
eritropoyetina humana madura fusionada con un péptido señal que se dirige al RE y que se retira cuando la proteína de fusión está en el RE;
(b) cultivar la célula hospedadora en un medio en condiciones eficaces para expresar y procesar la primera y segunda proteínas de fusión; y
5 (c) recuperar la eritropoyetina humana madura del medio para producir la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora.
En el presente documento se describe el método en el que el péptido señal es un péptido señal αMATpre de S. cerevisiae o un péptido señal de lisozima de pollo.
En el presente documento se describe el método en el que al menos una molécula de ácido nucleico codifica una proteína de fusión en la que la eritropoyetina está fusionada con el péptido señal αMATpre de S. cerevisiae y al menos una molécula de ácido nucleico codifica una proteína de fusión en la que la eritropoyetina está fusionada con
15 el péptido señal αMATpre de S. cerevisiae o un péptido señal de lisozima de pollo.
En el presente documento se describe el método en el que los codones de la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácido nucleico que codifica la eritropoyetina están optimizados para su expresión en Pichia pastoris.
En el presente documento se describe el método en el que la actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora se determina en un ELISA de sándwich.
En el presente documento se describe el método en el que la actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora se determina en una transferencia de Western.
25 En el presente documento se describe el método en el que la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora del medio incluye una etapa de cromatografía de intercambio catiónico.
En el presente documento se describe el método en el que la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora del medio incluye una etapa de cromatografía con hidroxiapatita.
35 En el presente documento se describe el método en el que la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora del medio incluye una etapa de cromatografía de intercambio aniónico.
Definiciones
Como se usa en el presente documento, los términos "N-glicano" y "glicoforma" se usan indistintamente y se refieren a un oligosacárido unido a N, por ejemplo, uno que está unido por un enlace de asparagina-N-acetilglucosamina a
45 un resto de asparagina de un polipéptido. Las glicoproteínas unidas a N contienen un resto de N-acetilglucosamina unido al nitrógeno de la amida de un resto de asparagina en la proteína. Los azúcares predominantes encontrados en las glicoproteínas son glucosa, galactosa, manosa, fucosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácidos siálico (por ejemplo, ácido N-acetil-neuramínico (NANA)). El procesamiento de los grupos del azúcar se produce de forma cotranslacional en el lumen del RE y continúa de forma post-translacional en el aparato de Golgi para glicoproteínas unidas a N.
Los N-glicanos tienen un núcleo de pentasacárido común de Man3GlcNAc2 ("Man" se refiere a manosa; "Glc" se refiere a glucosa; y "NAc" se refiere a N-acetilo; GlcNAc se refiere a N-acetilglucosamina). Los N-glicanos se diferencian con respecto al número de ramificaciones (antenas) que comprenden azúcares periféricos (por ejemplo, 55 GlcNAc, galactosa, fucosa y ácido siálico) que se añaden a la estructura del núcleo de Man3GlcNAc2 ("Man3") que también se denomina el "núcleo de trimanosa", el "núcleo de pentasacárido" o el "núcleo de paucimanosa". Los Nglicanos se clasifican de acuerdo con sus componentes ramificados (por ejemplo, alta manosa, complejo o híbrido). Un N-glicano de tipo "alta manosa" tienen cinco o más restos de manosa. Por lo general un N-glicano de tipo "complejo" tiene al menos un GlcNAc unido a la rama de 1,3 manosa y al menos un GlcNAc unido a la rama de 1,6 manosa de un núcleo de "trimanosa". Los N-glicanos complejos también pueden tener restos de galactosa ("Gal") o N-acetilgalactosamina ("GalNAc") que se están modificados opcionalmente con ácido siálico o derivados (por ejemplo, "NANA" o "NeuAc", en el que "Neu" se refiere a ácido neuramínico y "Ac" se refiere a acetilo). Los Nglicanos complejos también pueden tener sustituciones intracadena que comprenden GlcNAc de "bisección" y fucosa de núcleo ("Fuc"). Los N-glicanos complejos también pueden tener múltiples antenas en el "núcleo de 65 trimanosa", denominados a menudo "glicanos antenarios múltiples". Un N-glicano "híbrido" tiene al menos un GlcNAc en el extremo de la rama de 1,3 manosa del núcleo de trimanosa y cero o más manosas en la rama 1,6
manosa del núcleo de trimanosa. Los diversos N-glicanos también se denominan "glicoformas".
Las abreviaturas usadas en el presente documento son de uso común en la técnica, véanse, por ejemplo, abreviaturas de azúcares, mencionadas anteriormente. Otras abreviaturas comunes incluyen "PNGasa", o 5 "glicanasa" o "glucosidasa" que todas se refieren al péptido N-glicosidasa F (EC 3.2.2.18).
La expresión "célula hospedadora recombinante" ("célula hospedadora de expresión", "sistema hospedador de expresión", "sistema de expresión" o simplemente "célula hospedadora"), como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una célula en la que se ha introducido un vector recombinante. Se debería entender que tales términos pretenden hacer referencia no solamente a la célula objeto en particular sino también a la progenie de una célula de este tipo. Dado que se pueden producir ciertas modificaciones en las generaciones con éxito debido a cualquier mutación por influencias ambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula precursora, pero también está incluidas dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora" como se usa en el presente documento. Una célula hospedadora recombinante puede ser una célula aislada o línea celular que crece en cultivo
15 o puede ser una célula que reside en un tejido u organismo vivo. Las células hospedadoras preferentes son levaduras y hongos.
Una célula hospedadora que "no presenta" una actividad enzimática se refiere a una célula hospedadora en la que la actividad enzimática se ha anulado o interrumpido. Por ejemplo, la actividad enzimática se puede anular o interrumpir por deleción o interrupción del gen que codifica la actividad enzimática (incluida deleción o interrupción de las secuencias reguladoras cadena arriba o cadena abajo que controlan la expresión del gen; la actividad enzimática se puede anular o interrumpir por mutación del gen que codifica la actividad enzimática para hacer que el gen que codifica la actividad enzimática no sea funcional; la actividad enzimática se puede anular o interrumpir mediante el uso de un inhibidor químico, peptídico o proteico de la actividad enzimática; la actividad enzimática se
25 puede anular o interrumpir mediante el uso de inhibidores de expresión basados en ácido nucleico tales como ADN y ARNsi antisentido; y, la actividad enzimática se puede anular o interrumpir mediante el uso de inhibidores de transcripción o inhibidores de la expresión o actividad de factores de regulación que controlan o regulan la expresión del gen que codifica la actividad enzimática.
Cuando se hace referencia a "porcentaje molar" de un glicano presente en una preparación de una glicoproteína, la expresión se refiere al porcentaje molar de un glicano en particular presente en la combinación de oligosacáridos unidos a N liberados cuando la preparación de proteína se trata con PNG’asa y a continuación se cuantifican mediante un método que no se ve afectado por la composición de la glicoforma, (por ejemplo, etiquetado de una combinación de glicano liberado por PNG’asa con una etiqueta fluorescente tal como 2-aminobenzamida y a
35 continuación se separan mediante cromatografía líquida de alto rendimiento o electroforesis de capilaridad y a continuación los glicanos se cuantifican mediante la intensidad de fluorescencia). Por ejemplo, un 50 por ciento en moles de NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAC2 se refiere a que un 50 por ciento de los glicanos liberados son NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAC2 y el 50 por ciento restante está formado por otros oligosacáridos unidos a N. En realizaciones, el porcentaje molar de un glicano en particular en una preparación de glicoproteína estará entre un 20 % y un 100 %, preferentemente por encima de un 25 %, 30 %, 35 %, 40 % o un 45 %, más preferentemente por encima de un 50 %, 55 %, 60 %, 65 % o un 70 % y lo más preferentemente por encima de un 75 %, 80 % 85 %, 90 % oun95 %.
Como se usa en el presente documento, se entenderá que el término "predominantemente" o variaciones tales como
45 "el predominante" o "que es predominante" hacen referencia a las especies de glicano que tiene el porcentaje molar más elevado (%) de N-glicanos totales después de haber tratado la glicoproteína con PNGasa y los glicanos liberados se analizan mediante espectroscopía de masas, por ejemplo, MALDI-TOF MS. En otras palabras, el término "predominantemente" se define como una entidad individual, de modo que una glicoforma específica, está presente en un porcentaje molar más elevado que cualquier otra entidad individual. Por ejemplo, si una composición consiste en la especie A en un 40 por ciento en moles, la especie B en un 35 por ciento en moles y la especie C en un 25 por ciento en moles, la composición comprende predominantemente la especie A.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de la eritropoyetina recombinante de la invención que da un aumento en el hematocrito que proporciona beneficios a un paciente. La cantidad variará de un 55 individuo a otro y dependerá de un número de factores, incluyendo la condición física general del paciente y la causa subyacente de la anemia. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de eritropoyetina de la presente invención para un paciente que padece una insuficiencia renal crónica puede estar en el intervalo de 20 a 300 unidades/kg o 0,5 ug/kg a 500 ug/kg basándose en la indicación terapéutica. El término "unidad" se refiere a unidades conocidas normalmente en la técnica para evaluar la actividad de las composiciones de eritropoyetina. Un miligramo de eritropoyetina pura es proximadamente equivalente a 150.000 unidades. Un programa de dosificación puede ser de aproximadamente tres veces a la semana a aproximadamente una vez cada cuatro o seis semanas. La programación real dependerá de una serie de factores que incluyen el tipo de eritropoyetina administrada a un paciente (EPO o EPO PEGilada) y la respuesta del paciente individual. Los intervalos de dosis más elevados por lo general no se usan en aplicaciones en anemia pero pueden ser útiles en otras aplicaciones terapéuticas. El medio
65 para conseguir y establecer una dosis apropiada de eritropoyetina para un paciente se conoce bien y se pone en práctica normalmente en la técnica.
Las variaciones en la cantidad dada y programa de dosificación de paciente a paciente se incluyen por referencia al término "aproximadamente" en conjunto con una cantidad o programa. La cantidad de eritropoyetina usada para terapia da una tasa aceptable de aumento de hematocrito y mantiene el hematocrito en un nivel beneficioso (por ejemplo, normalmente de al menos aproximadamente un 30 % y por lo general en un intervalo de un 30 % a un
5 36 %). Una cantidad terapéuticamente eficaz de las presentes composiciones la puede discernir fácilmente un experto en la materia usando materiales y procedimientos disponibles al público. Además, se puede administrar hierro al paciente para mantener un aumento de la eritropoyesis durante la terapia. La cantidad a administrar se puede determinar fácilmente con métodos usados normalmente por los expertos en la materia.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 AJ muestra la genealogía de la cepa YGLY3159de P. pastoris (Figura 1E) y las cepas YGLY7113 a YGLY7122 (Figura 1I) que comienzan a partir de la cepa NRRLY11430 de tipo silvestre (Figura 1A). La Figura 2 muestra un mapa del plásmido pGLY6. El plásmido pGLY6 ees un vector de integración que se
15 dirige al locus de URA5 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen de invertasa de o unidad transcripción (ScSUC2) de S. cerevisiae flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen URA5 de P. pastoris (PpURA5-5’) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen URA5 de P. pastoris (PpURA5-3’). La Figura 3 muestra un mapa del plásmido pGLY40. El plásmido pGLY40 es un vector de integración que se dirige al locus de OCH1 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) que a su vez está flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen OCH1 (PpOCH1-5’) y en el otro
25 lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen OCH1 (PpOCH1-3’). La Figura 4 muestra un mapa del plásmido pGLY43a. El plásmido pGLY43a es un vector de integración que se dirige al locus de BMT2 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen transportador (UDP-GlcNAc) o unidad de transcripción (KlGlcNAc Transp.) de UDP-N-acetilglucosamina de K. lactis adyacente a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción (PpURA5)de P. pastoris flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (repetición de lacZ). Los genes adyacentes están flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen BMT2 (PpPBS2-5’) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen
35 BMT2 (PpPBS2-3’). La Figura 5 muestra un mapa del plásmido pGLY48. El plásmido pGLY48 es un vector de integración que se dirige al locus de MNN4L1 y contiene un casete de expression que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el homólogo de ratón del marco de lectura abierto (ORF) del transportador de UDP-GlcNAc (Transp. de MmGlcNAc) unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris (Prom PpGAPDH) y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de CYC (ScCYC TT) de S. cerevisiae adyacente a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) y en el que los casetes de expresión juntos están flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
45 nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen MNN4L1 (PpMNN4L1-5’) de P. pastoris y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen MNN4L1 (PpMNN4L1-3’). La Figura 6 muestra un mapa del plásmido pGLY45. El plásmido pGLY45 es un vector de integración que se dirige a los loci PNO1/MNN4 y una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) que a su vez está flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen PNO1 (PpPNO1-5’) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen MNN4 (PpMNN4-3’).
55 La Figura 7 muestra un mapa del plásmido pGLY247. El plásmido pGLY247 es un vector de integración que se dirige al locus de MET16 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) que a su vez está flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen MET16 (PpMET16-5’) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen MET16 (PpMET16-3’). La Figura 8 muestra un mapa del plásmido pGLY248. El plásmido pGLY248 es un vector de integración que se dirige al locus de URA5 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen MET16 o unidad de transcripción (PpMET16) de P. pastoris flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que
65 comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen URA5 (PpURA5-5’) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la
posición 3’ del gen URA5 (PpURA5-3’). La Figura 9 muestra un mapa del plásmido pGLY582. El plásmido pGLY582 es un vector de integración que se dirige al locus de HIS1 y contiene en tándem cuatro casetes de expresión que codifican (1) la epimerasa de UDP-glucosa (ScGAL10) de S. cerevisiae, (2) el dominio catalítico de la galactosiltransferasa I (hGalT) humana fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder KRE2-s de S. cerevisiae (33), (3) el gen URA5 o unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) y (4) el transportador de UDP-galactosa (DmUGT) de D. melanogaster. Todos flanqueados por la región en la posición 5’ del gen HIS1 (PpHIS1-5’) y la región en la posición 3’ del gen HIS1 (PpHIS1-3’). PMA1 es el promotor PMA1 de
P. pastoris; PpPMA1 TT es la secuencia de terminación de PMA1 de P. pastoris; GAPDH es el promotor GADPH de P. pastoris y ScCYC TT es la secuencia de terminación de CYC de S. cerevisiae; Prom PpOCH1 es el promotor OCH1 de P. pastoris y PpALG12 TT es la secuencia de terminación de ALG12 de P. pastoris. La Figura 10 muestra un mapa del plásmido pGLY167b. El plásmido pGLY167b es un vector de integración que se dirige al locus de ARG1 y contiene en tándem tres casetes de expresión que codifican (1) el dominio catalítico de la manosidasa II de D. melanogaster (optimizado por codón) fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder MNN2 (CO-KD53) de S. cerevisiae, (2) el gen HIS1 o unidad de transcripción de P. pastoris y (3) el dominio catalítico de la N-acetilglucosamina (GlcNAc) transferasa II de rata (optimizado por codón) fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder MNN2 (CO-TC54) de S. cerevisiae. Todos flanqueados por la región en la posición 5’ del gen ARG1 (PpARG1-5’) y la región en la posición 3’ del gen ARG1 (PpARG1-3’). PpPMA1 prom es el promotor PMA1 de P. pastoris; PpPMA1 TT es la secuencia de terminación de PMA1 de P. pastoris; PpGAPDH es el promotor GADPH de P. pastoris; ScCYC TT es la secuencia de terminación de CYC de S. cerevisiae; Prom PpOCH1 es el promotor OCH1 de P. pastoris; y PpALG12 TT es la secuencia de terminación de ALG12 de P. pastoris. La Figura 11 muestra un mapa del plásmido pGLY1430. El plásmido pGLY1430 es un vector de integración de KINKO que se dirige al locus de ADE1 sin interrupción de la expresión del locus de y contiene en tándem cuatro casetes de expresión que codifican (1) el dominio catalítico de la GlcNAc transferasa I humana (optimizado por codón) fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder SEC12 (CO-NA10) de P. pastoris, (2) homólogo de ratón del transportador de UDP-GlcNAc (MmTr), (3) el dominio catalítico de la manosidasa IA de ratón (FB) fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder SEC12 (FB8) de S. cerevisiae y (4) el gen URA5 o unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ (lacZ). Todos flanqueados por la región en la posición 5’ del gen ADE1 y ORF (ADE1 5’ y ORF) y la región en la posición 3’ del gen ADE1 (PpADE1-3’). PpPMA1 prom es el promotor PMA1 de P. pastoris; PpPMA1 TT es la secuencia de terminación de PMA1 de P. pastoris; SEC4 es el promotor SEC4 de P. pastoris; OCH1 TT es la secuencia de terminación OCH1 de P. pastoris; ScCYC TT es la secuencia de terminación de CYC de S. cerevisiae; Prom PpOCH1 es el promotor OCH1 de P. pastoris; PpALG3 TT es la secuencia de terminación ALG3 de P. pastoris; y PpGAPDH es el promotor GADPH de P. pastoris. La Figura 12 muestra un mapa del plásmido pGFI165. El plásmido pGFI165 es un vector de integración de KINKO que se dirige al locus de PRO1 sin interrupción de la expresión del locus de y contiene casetes de expresión que codifican (1) el dominio catalítico de la α-1,2-manosidasa de T. reesei fusionado en el extremo Nterminal al péptido señal αMATpre (aMATTrMan) de S. cerevisiae para dirigir la proteína quimérica a la ruta secretoria y secreción desde la célula y (2) el gen URA5 o unidad de transcripción de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ). Todos flanqueados por la región en la posición 5’ del gen PRO1 y ORF (5’PRO1orf) y la región en la posición 3’ del gen PRO1 (3’PRO). ScCYC TT es la secuencia de terminación de CYC de S. cerevisiae; PpALG3 TT es la secuencia de terminación de ALG3 de P. pastoris; y PpGAPDH es el promotor GADPH de P. pastoris. La Figura 13 muestra un mapa del plásmido pGLY2088. El plásmido pGLY2088 es un vector de integración que se dirige al locus de TRP2 o al locus de AOX1 y contiene casetes de expresión que codifican (1) eritropoyetina (co-hEPO) humana madura optimizada por codón fusionada en el extremo N-terminal a un péptido señal αMATpre (alfa MF-pre) de S. cerevisiae para dirigir la proteína quimérica a la ruta secretoria y secreción desde la célula y (2) la proteína de resistencia a zeocina (ZeocinaR). Los casetes están flanqueados en un extremo con el promotor AOX1 (Prom de PpAOX1) de P. pastoris y en el otro extremo con el gen TRP2 o unidad de transcripción (PpTRP2) de P. pastoris. ScCYC TT es la secuencia de terminación de CYC de S. cerevisiae y ScTEF Prom es el promotor TEF1 de S. cerevisiae. La Figura 14 muestra un mapa del plásmido pGLY2456. El plásmido pGLY2456 es un vector de integración de KINKO que se dirige al locus de TRP2 sin interrupción de la expresión del locus de y contiene seis casetes de expresión que codifican (1) el transportador de CMP-ácido siálico de ratón optimizado por codón (Transp CO mCMP-Sia), (2) la UDP-GlcNAc 2-epimerasa/N-acetilmanosamina quinasa humana optimizada por codón (CO hGNE), (3) el gen ARG1 o unidad de transcripción de Pichia pastoris, (4) la CMP-ácido siálico sintasa humana optimizada por codón (CO hCMP-NANA S), (5) la N-acetilneuraminato-9-fosfato sintasa humana optimizada por codón (CO hSIAP S) y, (6) el dominio catalítico de a-2,6-sialiltransferasa de ratón optimizado por codón fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder KRE2 (comST6-33) de S. cerevisiae. Todos flanqueados por la región en la posición 5’ del gen TRP2 y ORF (PpTRP2 5’) y la región en la posición 3’ del gen TRP2 (PpTRP23’). PpPMA1 prom es el promotor PMA1 de P. pastoris; PpPMA1 TT es la secuencia de terminación de PMA1 de
P. pastoris; CYC TT es la secuencia de terminación de CYC de S. cerevisiae; PpTEF Prom es el promotor TEF1 de P. pastoris; PpTEF TT es la secuencia de terminación de TEF1 de P. pastoris; PpALG3 TT es la secuencia de terminación de ALG3 de P. pastoris; y pGAP es el promotor GAPDH de P. pastoris.
La Figura 15 muestra un mapa del plásmido pGLY3411 (pSH1092). El plásmido pGLY3411 (pSH1092) es un vector de integración que contiene el casete de expresión que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 5’ del gen BMT4 (PpPBS4 5’) de P. pastoris y en el otro lado con con la secuencia de nucleótidos en la posición 3’ del gen BMT4 (PpPBS4 3’) de P. pastoris. La Figura 16 muestra un mapa del plásmido pGLY3430 (pSH1115). El plásmido pGLY3430 (pSH1115) es un vector de integración que contiene un casete de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF de resistencia a Nourseotricina (NAT) unido de forma operativa al promotor TEF1 de Ashbya gossypii (PTEF) y la secuencia de terminación de TEF1 (TTEF) de Ashbya gossypii flanqueada en un lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 5’ del gen BMT1 (PBS1 5’) de P. pastoris y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 3’ del gen BMT1 (PBS1 3’) de P. pastoris. La Figura 17 muestra un mapa del plásmido pGLY4472 (pSH1186). El plásmido pGLY4472 (pSH1186) contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF del gen de fosfotransferasa de la higromicina B (Hyg) de E. coli unido de forma operativa al promotor TEF1 de Ashbya gossypii (pTEF) y la secuencia de terminación de TEF1 (TRFtt) de Ashbya gossypii flanqueada en un lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 5’ del gen BMT3 (PpPBS3 5’) de P. pastoris y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 3’ del gen BMT3 (PpPBS3 3’) de P. pastoris. La Figura 18 muestra un mapa del plásmido pGLY2057. El plásmido pGLY2057 es un vector de integración que se dirige al locus de ADE2 y contiene un casete de expresión que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ). El casete de expresión está flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen ADE2 (PpADE2-5’) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen ADE2 (PpADE2-3’). La Figura 19 muestra un mapa del plásmido pGLY2680. El plásmido pGLY2680 es un vector de integración que se puede dirigir al locus de TRP2 o AOX1 y contiene casetes de expresión que codifican (1) eritropoyetina (cohEPO) humana madura optimizada por codón fusionada en el extremo N-terminal a péptido señal de lisozima de pollo (Lisozima de pollo ss) y (2) el gen ADE2 de P. pastoris sin un promotor (PpADE2). Los casetes están flanqueados en un extremo con el promotor AOX1 (Prom de PpAOX1) de P. pastoris y en el otro extremo con el gen TRP2 o unidad de transcripción (PpTRP2) de P. pastoris. ScCYC TT es la secuencia de terminación de CYC de S. cerevisiae. La Figura 20 muestra un mapa del plásmido pGLY2713. El plásmido pGLY2713 es un vector de integración que contiene el ORF de PNO1 (ORF de PpPNO1) de P. pastoris adyacente al casete de expresión que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción (PpURA5) de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ (repetición de lacZ) y flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen PEP4 (PpPEP4 5’) de P. pastoris y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 3’ del gen PEP4 (PpPEP4 3’) de P. pastoris. La Figura 21 muestra un diagrama esquemático que ilustra el flujo del proceso de fermentación. La Figura 22 muestra que la rhEPO producida en la cepa YGLY3159tiene actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA. El panel de la parte izquierda muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie que muestra la posición de la rhEPO y el panel de la parte derecha muestra una transferencia de Western de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA de conejo (conejo purificado con SL rProA: 9161) a una dilución a 1:3.000. El anticuerpo anti-HCA unido se detectó usando anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución a 1:5.000 en PBS. La detección del anticuerpo secundario unido usó el sustrato 3,3 diaminobencidina (DAB). La Figura 23 muestra que la actividad de unión cruzada de la rhEPO producida en la cepa YGLY3159a anticuerpos anti-HCA no se detecta cuando la rhEPO se desglicosila usando PNAGasa F. El panel de la parte izquierda muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie que muestra la posición de las formas glicosilada y desglicosilada de rhEPO y el panel de la parte derecha muestra una transferencia de Western de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la Figura 22. La Figura 24 muestra que un anticuerpo recombinante (rhIgG) producido en P. pastoris de tipo silvestre y una cepa GS2.0 de P. pastoris glicomodificada por ingeniería en la que el gen BMT2 se ha interrumpido o sometido a deleción presentaba actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA. El panel de la parte izquierda muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie y el panel de la parte derecha muestra una transferencia de Western de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la Figura 22. GS 2.0 es una cepa de P. pastoris que produce glico proteínas que tienen predominantemente N-glicanos de Man5GlcNAc2. La cepa GS 2.0 mostrada producía rhIgG con aproximadamente un 5 % de N-glicanos de Man9GlcNAc2. WT es
P. pastoris de tipo silvestre. La Figura 25 compara la actividad de unión cruzada de rhEPO producida en la cepa YGLY3159 a otras proteínas glicosiladas que contienen patrones de glicosilación complejos pero que no se producían en P. pastoris para anticuerpo anti-HCA. El panel de la parte superior muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie que muestra la posición de las formas glicosilada y desglicosilada de rhEPO producidas en P. pastoris y de fetuína humana recombinante, asialofetuína (fetuína humana con restos de ácido siálico terminales retirados), albúmina de suero humano (HSA) y LEUKINE recombinante producidos en S. cerevisiae y el panel de la parte inferior muestra una transferencia de Western de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la Figura 22. Las combinaciones de S30S son rhEPO purificada mediante cromatografía de intercambio catiónico.
La Figura 26 muestra que la rhEPO producida en la cepa YGLY3159 y purificada mediante cromatografía de hidroxiapatita todavía tiene actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA. El panel de la parte izquierda muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie de las combinaciones 1, 2 y 3 de dilución mediante cromatografía que muestran la posición de la rhEPO (reducida o no reducida) y el panel de la parte derecha muestra una transferencia de Western de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la Figura 22. A continuación, en los paneles se muestran los resultados de un análisis de HPLC de N-glicanos en las combinaciones 1, 2 y 3. La Figura 27A muestra un cromatograma de purificación de rhEPO mediante cromatografía aniónica de Q SEPHAROSE FF producida en la cepa YGLY3159 a partir de la combinación 1 de hidroxiapatita. La Figura 27B muestra un ELISA de sándwich que muestra que la combinación de Q SEPHAROSE FF que contiene rhEPO a partir de la cromatografía aniónica de Q SEPHAROSE FF no tiene actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos anti-HCA mientras que el flujo continuo contenía actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA. El anticuerpo de captura era anticuerpo anti-hEPO y la actividad de unión cruzada se detectó con anticuerpo anti-HCA de conejo a una dilución de partida de 1:800 en PBS que a continuación se diluyó en serie a 1:1 en PBS a través de una fila de terminación con el 11º pocillo a una dilución de 1:819.200 (pocillo 12: control negativo). El anticuerpo anti-HCA unido se detectó usando anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (AP) a una dilución de 1:10.000 dilution en PBS. La detección del anticuerpo secundario unido usó fosfato de 4-Metilumbeliferilo (4-MUPS). La Figura 28 muestra que la rhEPO producida en las cepas YGLY6661 (∆bmt2, ∆bmt4 y ∆bmt1) e YGLY7013 (∆bmt2 y ∆bmt4) y capturada mediante cromatografía de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul) aún tiene actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA. El panel de la parte izquierda muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie de las combinaciones de Azul con (+) y sin (-) tratamiento con PNGasa F. El panel central muestra una transferencia de Western de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-hEPO conjugados con HRP a una dilución a 1:1.000 y DAB como el sustrato. El panel de la derecha muestra una transferencia de Western de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la Figura 22. La Figura 29 muestra que un ELISA de sándwich para detectar la actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA de rhEPO producidos en las cepas YGLY6661 (∆bmt2, ∆bmt4 y ∆bmt1) e YGLY7013 (∆bmt2 y ∆bmt4) y capturada mediante cromatografía de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul) aún tiene actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA. El ELISA se realizó como en la Figura 27B. La Figura 30 muestra ELISA de sándwich para detectar la actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA de rhEPO producidos en las cepas YGLY6661 (∆bmt2, ∆bmt4 y ∆bmt1) e YGLY7013 (∆bmt2 y ∆bmt4), capturados mediante cromatografía de Azul Sepaharose 6 FF y purificados mediante cromatografía de hidroxiapatita (combinación 1 de HA). La rhEPO en la combinación 1 de HA de la cepa YGLY6661 no tenía actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA detectable. Los ELISA se realizaron como en la Figura 27B. La Figura 31 muestra que la rhEPO producida en la cepa YGLY6661 (∆bmt2, ∆bmt4 y ∆bmt1) y capturada mediante cromatografía de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul) aún tiene actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA. El panel de la parte izquierda muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie de las combinaciones de Azul con (+) y sin (-) tratamiento con PNGasa F. El panel central muestra una transferencia de Western de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-hEPO conjugados con HRP a una dilución a 1:1.000 y DAB como el sustrato. El panel de la derecha muestra una transferencia de Western de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la Figura 22. La Figura 32A muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie de las combinaciones de captura de Azul Sepaharose 6 FF (combinaciones de Azul) preparado a partir de las cepas YGLY73617366 (todas ∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3) con (+) y sin (-) tratamiento con PNGasa F. Las cepas se cultivaron en fermentadores SixFors de 500 ml. La Figura 32B muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie de las combinaciones de captura de Azul Sepaharose 6 FF (combinaciones de Azul) preparadas a partir de las cepas YGLY73937398 (todas ∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3) con (+) y sin (-) tratamiento con PNGasa F. Las cepas se cultivaron en fermentadores SixFors de 500 ml. La Figura 33 muestra los resultados de ELISA de sándwich para detectar la actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA de rhEPO producidos en las cepas YGLY73617366 (todas ∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3) e YGLY73937398 (todas ∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3) y capturados mediante cromatografía de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul). Solamente la rhEPO en las combinaciones de Azul de la cepa YGLY7363 e YGLY7365 tenían actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos anti-HCA. Los ELISA se realizaron como en la Figura 27B. La Figura 34 muestra en forma de gráfico los resultados del análisis de HPLC de los N-glicanos en la rhEPO en las combinaciones de Azul preparadas a partir de las cepas YGLY73617366 e YGLY73937398 (todas ∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3). "Bi" se refiere a N-glicanos en donde ambas ramas del N-glicano biantenario están sialiladas. "Mono" se refiere a N-glicanos en donde solamente una rama del N-glicano biantenario están sialiladas. "Neutro" se refiere a N-glicanos que no están sialilados. La Figura 35A muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie de las combinaciones de cromatografía de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul) y purificación con hidroxiapatita (combinación de HA 1s) preparadas a partir de las cepas YGLY7362, YGLY7366, YGLY7396, e YGLY7398 (todas ∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3), e YGLY3159 (∆bmt2). La Figura 35B muestra una transferencia de Western de un gel de SDS-PAGE al 4-20 % de las combinaciones de cromatografía de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul) y purificación con hidroxiapatita
(combinación de HA 1s) preparadas a partir de las cepas YGLY7362, YGLY7366, YGLY7396, e YGLY7398 (todas ∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3), e YGLY3159 (∆bmt2) y sondeadas con anticuerpos anti-HCA como en la Figura 22. La Figura 36 muestra que la rhEPO producida en la cepa YGLY7398 (∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3) y
5 capturada mediante cromatografía de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul) y purificada mediante cromatografía de hidroxiapatita (combinación de HA 1s) no tenía actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA detectable. El panel de la parte izquierda muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie de la combinación de Azul y la combinación 1 de HA preparadas a partir de la cepa YGLY7398 en comparación con la rhEPO preparada a partir de la cepa YGLY3159. El panel central muestra una transferencia de Western de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la Figura 22. El panel central muestra una transferencia de Western de un gel similar sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la Figura 22 excepto porque los anticuerpos anti-HCA eran de otra preparación de anticuerpo (conejo policlonal de GiF::6316 a 1:2.000). La Figura 37 muestra los resultados de ELISA de sándwich para detectar la actividad de unión cruzada a
15 anticuerpos anti-HCA de la rhEPO producida en las cepas YGLY71137122 (∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3) y capturada mediante cromatografía de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul). La cepa YGLY7118 presentaba una actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA detectable muy baja. Ninguna de las otras cepas mostraba ninguna actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA detectable. Los ELISA se realizaron como en la Figura 27B. La Figura 38 muestra en forma de gráfico los resultados del análisis de HPLC de los N-glicanos en la rhEPO en las combinaciones de Azul preparadas a partir de las cepas YGLY71137122 (todas ∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3). "Bi" se refiere a N-glicanos en donde ambas ramas del N-glicano biantenario están sialiladas. "Mono" se refiere a N-glicanos en donde solamente una rama del N-glicano biantenario están sialiladas. "Neutro" se refiere a N-glicanos que no están sialilados.
25 La Figura 39A muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20 % teñido con Azul de Commassie de las combinaciones de cromatografía de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul) y purificación con hidroxiapatita (combinación de HA 1s) preparado a partir de las cepas YGLY7115, YGLY7117, YGLY7394, YGLY7395, e YGLY7120 (todas ∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3), e YGLY3159 (∆bmt2). La Figura 39B muestra una transferencia de Western de un gel de SDS-PAGE al 4-20 % de las combinaciones de cromatografía de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul) y purificación con hidroxiapatita (combinación de HA 1s) preparado a partir de las cepas YGLY7115, YGLY7117, YGLY7394, YGLY7395,e YGLY7120 (todas ∆mbt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3), e YGLY3159 (∆bmt2) y sondeado con anticuerpos anti-HCA como en la Figura 22. La Figura 40A muestra una traza de HPLC de los N-glicanos de la rhEPO producida en YGLY3159 (∆bmt2) y
35 purificada mediante cromatografía en columna de hidroxiapatita (es decir, análisis de la combinación 1 de HA). La Figura 40B muestra una traza de HPLC de los N-glicanos de la rhEPO producida YGLY7117 (∆bmt2, ∆bmt4, ∆bmt1 y ∆bmt3) y purificada mediante cromatografía en columna de hidroxiapatita (es decir, análisis de la combinación 1 de HA).
Descripción detallada
La presente invención proporciona métodos para producir proteínas y glicoproteínas en Pichia pastoris que carecen de unión cruzada detectable a anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora. Los antígenos de célula hospedadora también pueden incluir proteína de célula hospedadora residual y contaminantes de la pared
45 celular que pueden llevar a composiciones de proteína recombinante que pueden ser inmunogénicas y que pueden alterar la eficacia o seguridad terapéutica de una proteína terapéutica. Una composición que tiene reactividad cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora se refiere a que la composición contiene algún material de célula hospedadora contaminante, normalmente N-glicanos con restos de fosfomanosa o restos de β-manosa o similares. Las cepas de tipo silvestre de Pichia pastoris producirán glicoproteínas que tengan estas estructuras de N-glicano. Se podría esperar que las preparaciones de anticuerpo preparadas frente a proteínas de célula hospedadora totales incluyeran anticuerpos frente a estas estructuras. Las proteínas que no contienen Nglicanos, sin embargo, también podrían incluir material contaminante (proteínas o similares) que reaccionaran de forma cruzada con anticuerpos preparados frente a la la célula hospedadora.
55 Los métodos y las células hospedadoras permiten la producción de proteínas y glicoproteínas terapéuticas recombinantes con una reducción del riesgo de provocar una reacción adversa en un individuo al que se le administran las proteínas y glicoproteínas terapéuticas recombinantes en comparación con las mismas que se están produciendo en cepas no modificadas como se desvela en el presente documento. Una reacción adversa incluye provocar una respuesta inmunológica no deseada en el individuo o una unión no deseada o inapropiada a, congregación en, o interacción con un sitio en el individuo que en general influye de forma adversa en la salud del individuo. El riesgo de provocar una reacción adversa en un individuo al que se le está administrando la proteína o glicoproteína terapéutica es de preocupación en particular para proteínas o glicoproteínas destinadas a su administración al individuo de forma crónica (por ejemplo, terapias destinadas a su realización durante un periodo de tiempo prolongado). Las proteínas o glicoproteínas terapéuticas recombinantes producidas de acuerdo con los
65 métodos en el presente documento no tienen actividad de unión cruzada detectable anticuerpos frente a antígenos de célula hospedadora y por lo tanto, presentan una reducción del riesgo de provocar una reacción adversa en un
individuo al que se le administran las proteínas o glicoproteínas recombinantes. Los métodos y las células hospedadoras también son útiles para producir proteínas o glicoproteínas recombinantes que tengan un potencial más bajo unión a factores de eliminación.
5 Los inventores han encontrado que las glicoproteínas en particular que se producen en algunas cepas de Pichia pastoris pueden tener N- u O-glicanos en las mismas en las que uno o más de los restos de manosa en las mismas están en una unión en β1,2. Las glicoproteínas destinadas para usos terapéuticos y que tienen uno o más restos de manosa unidos en β1,2 en las mismas proporcionan un riesgo de ser capaces de provocar una respuesta inmunológica no deseada en el individuo al que se le está administrando la glicoproteína. Estos restos de manosa unidos en β se pueden detectar usando anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora totales. Dado que no se puede predecir qué glicoproteínas terapéuticas tendrán N- u O-glicanos que comprenden uno o más restos de manosa unidos en β1,2 y si una glicoproteína terapéutica que tiene N-u O-glicanos que comprenden restos de manosa unidos en β1,2 en las mismas producirá una respuesta inmunológica no deseada en el individuo que recibe la glicoproteína, es deseable producir glicoproteínas terapéuticas en cepas de Pichia pastoris que se
15 hayan modificado por ingeniería genética para que carezcan de unión cruzada detectable a anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora. Tales cepas se pueden producir por una deleción o interrupción de las actividades de al menos tres de las cuatro β-manosiltransferasas (Bmtp) conocidas en la familia de genes de βmanosiltransferasa (BMT) de Pichia pastoris. Como se muestra en el presente documento, las cepas de Pichia pastoris que incluyen una deleción o interrupción de al menos tres de estos genes de BMT proporciona una cepa de Pichia pastoris que puede producir proteínas o glicoproteínas que carecen de unión cruzada detectable a anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora. Estas cepas son útiles para producir proteínas y glicoproteínas terapéuticas. Se ha demostrado que la presencia de estructuras de β-manosa en N-y/o O-glicanos provoca una respuesta inmunológica.
25 La identificación de los genes de β-manosiltransferasa en Pichia pastoris y Candida albicans se informó en el documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.465.577 y que en Mille et al., J. Biol. Chem. 283: 9724-9736 (2008), que desvelan que la β-manosilación se realizaba con una β-manosiltransferasa que se denominó AMR2 o BMT2 y que la interrupción o deleción del gen en Pichia pastoris daba como resultado una célula hospedadora recombinante que era capaz de producir glicoproteínas con reducción de la β-manosilación. El documento de patente también desvelaba tres homólogos del gen, BMT1, BMT3 y BMT4. Sin embargo, cuando se investiga la fuente de actividad y unión cruzada de algunas preparaciones de glicoproteína a anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora, los inventores descubrieron que la actividad de unión cruzada era una consecuencia de la βmanosilación residual persistente en algunas cepas de células hospedadoras de P. pastoris recombinantes en las que el gen BMT2 se había interrumpido o experimentado deleción. Por lo tanto, las glicoproteínas heterólogas
35 producidas en estas células hospedadoras recombinantes tienen N-glicanos que aún contienen restos de β-manosa. Estos restos de β-manosa eran detectables en ELISA y transferencias de Western de las glicoproteínas heterólogas obtenidas a partir de cultivos de estas células hospedadoras recombinantes sondeadas con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora (HCA). Los anticuerpos anti-HCA son anticuerpos policlonales dirigidos frente a cepas de Pichia pastoris de tipo silvestre o una cepa de NORF: una célula hospedadora recombinante que se construye de la misma manera que la célula hospedadora recombinante que produce la glicoproteína heteróloga excepto porque se ha omitido el marco de lectura abierto (ORF) que codifica la proteína heteróloga. Para glicoproteínas terapéuticas producidas en Pichia pastoris, estos restos de β-manosa residuales presentan el riesgo de provocar una respuesta inmunológica en algunos individuos que reciben la proteína terapéutica en un tratamiento para una enfermedad o trastorno. La presente invención proporciona un método para producir glicoproteínas en
45 Pichia pastoris que no contienen ninguna β-manosilación detectable y como tal no se unen de forma cruzada a anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora.
BMT1, BMT2 y BMT3 demuestran un alto grado de homología de secuencia es mientras que BMT4 es homólogo en una menor medida y se cree que es una protección de la alfa-manosiltransferasa. Sin embargo, parece que los cuatro miembros de la familia BMT están implicados en la síntesis de N-y/o O-glicanos que tienen estructuras de manosa unidas en β. Aunque una MALDI-TOF de N-glicanos de una proteína de ensayo producida en una cepa de Pichia pastoris en la que el gen BMT2 ha experimentado deleción podría fallar en la detección de la β-manosilación, los ensayos basados en anticuerpos sensibles en el presente documento eran capaces de detectar la βmanosilación en cepas de ∆bmt2. Por lo tanto, los métodos de detección basados en anticuerpo anti-HCA
55 enseñados en el presente documento presentaban que la deleción o interrupción también de los genes BMT1 y BMT3 y opcionalmente del gen BMT4 era necesaria para retirar todas las estructuras de β-manosa detectables. La deleción o interrupción de los genes que codifican las tres β-manosiltransferasas se puede conseguir mediante (1) supresión genética completa o parcial del gen (incluyendo las secuencias promotoras, marco de lectura abierto (ORF) y/o las secuencias terminadoras de la transcripción); (2) introducción de un desplazamiento en marco del ORF; (3) inactivación o regulación del promotor; (4) supresión genética del mensaje mediante el ARNsi o ARN antisentido; (5) o el uso de inhibidores químicos. El resultado es la producción de una célula hospedadora que es capaz de producir una glicoproteína que carece de actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA detectable.
Para ejemplificar los métodos para producir una glicoproteína que carezca de actividad de unión cruzada a
65 anticuerpos anti-HCA detectable, una cepa de Pichia pastoris, que se había modificado por ingeniería genética para que careciera de expresión o actividad de BMT2 y que fuera capaz de producir eritropoyetina humana madura
recombinante (EPO) con N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico, se modificó por ingeniería genética adicionalmente para que careciera de expresión de los genes BMT1 y/o BMT3 y/o BMT4. La cepa en la que solamente se había interrumpido la expresión del gen BMT2 produjo EPO humana madura recombinante con cierta actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA detectable. Se encontró que la actividad de unión cruzada
5 detectable se debía a la presencia de restos de manosa unidos en β en la molécula de EPO (véanse las Figuras 2227B, Ejemplo 6). Cuando los genes que codifican BMT1 y BMT4 se interrumpían o experimentaban deleción en la cepa, la EPO producida aún tenía actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA detectable (véanse las Figuras 2831). Sin embargo, cuando los genes BMT1, BMT2, BMT3 y BMT4 se interrumpían o experimentaban deleción, la mayoría de las cepas producían EPO humana recombinante glicosilada que carecía de actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA detectable y por lo tanto carecía de restos de β-manosa detectables (véanse las Figuras 33 y 35B por ejemplo).
Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para producir una proteína o glicoproteína recombinante que carezca de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos preparados frente a antígenos de 15 célula hospedadora que implica la construcción de células hospedadoras destinadas a su uso para producir la proteína recombinante para que no presente adicionalmente ninguna actividad en 1-4 de β-manosiltransferasa debida a deleción o interrupción de los genes 1, 2 y 3 de la β-manosiltransferasa. Otras combinaciones de deleciones se describen a continuación a modo de ilustración pero no constituyen la invención. A modo de ejemplo, se construye una célula hospedadora que no presenta actividad de β-manosiltransferasa 2 con respecto a un Nglicano u O-glicano. La célula hospedadora que carece de presentación de actividad de β-manosiltransferasa 2 se usa para producir la proteína o glicoproteína recombinante, que a continuación se evalúa mediante transferencia de Western o ELISA usando un anticuerpo que se ha preparado frente a una versión NORF de la cepa. Una cepa de NORF es una cepa que es la misma que la cepa hospedadora excepto porque carece del marco de lectura abierto que codifica la glicoproteína recombinante. Si la proteína o glicoproteína recombinante producida por la célula
25 hospedadora carece de unión detectable al anticuerpo preparado frente a antígenos de célula hospedadora, entonces la célula hospedadora es útil para producir la proteína o glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada a los anticuerpos frente a antígenos de célula hospedadora.
Sin embargo, si se detecta la actividad de unión cruzada detectable, entonces la célula hospedadora se manipula adicionalmente para que no presente actividad de β-manosiltransferasa 1, β-manosiltransferasa 3, o βmanosiltransferasa 4y con respecto a un N-glicano u O-glicano. Por ejemplo, la célula hospedadora que carece de actividad de β-manosiltransferasa 2 se manipula adicionalmente para que carezca de actividad de βmanosiltransferasa 1. La célula hospedadora se usa para producir la proteína o glicoproteína recombinante, que a continuación se evalúa mediante transferencia de Western o ELISA usando un anticuerpo que se ha preparado
35 frente a una versión NORF de la cepa. Si la proteína o glicoproteína recombinante producida por la célula hospedadora carece de unión detectable al anticuerpo preparado frente a antígenos de célula hospedadora, entonces la célula hospedadora es útil para producir la proteína o glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada a los anticuerpos frente a antígenos de célula hospedadora.
Sin embargo, si se detecta la actividad de unión cruzada detectable, entonces la célula hospedadora se manipula adicionalmente para que no presente actividad de β-manosiltransferasa 3 o actividad de β-manosiltransferasa 4. Por ejemplo, la célula hospedadora que carece de actividad de β-manosiltransferasa 2 y actividad de βmanosiltransferasa 1 se manipula adicionalmente para que carezca de actividad de β-manosiltransferasa 3 con respecto a un N-glicano u O-glicano. La célula hospedadora se usa para producir la proteína o glicoproteína
45 recombinante, que a continuación se evalúa mediante transferencia de Western o ELISA usando un anticuerpo que se ha preparado frente a una versión NORF de la cepa. Si la proteína o glicoproteína recombinante producida por la célula hospedadora carece de unión detectable al anticuerpo preparado frente a antígenos de célula hospedadora, entonces la célula hospedadora es útil para producir la proteína o glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada a los anticuerpos frente a antígenos de célula hospedadora.
Sin embargo, si se detecta la actividad de unión cruzada detectable, entonces la cepa se manipula adicionalmente para que no presente actividad de β-manosiltransferasa 4 con respecto a un N-glicano u O-glicano. La célula hospedadora se usa para producir la proteína o glicoproteína recombinante, que a continuación se evalúa mediante transferencia de Western o ELISA usando un anticuerpo que se ha preparado frente a una versión NORF de la cepa
55 para confirmar que la proteína o glicoproteína recombinante carece de unión detectable al anticuerpo preparado frente a antígenos de célula hospedadora.
A modo de un ejemplo adicional, se construye una célula hospedadora de Pichia pastoris en la que diversas combinaciones de genes de BMT se someten a deleción o se interrumpen. A modo de ejemplo, se construye una célula hospedadora de Pichia pastoris que tiene una interrupción o deleción del gen BMT2. La célula hospedadora ∆bmt2 se usa para producir la proteína o glicoproteína recombinante, que a continuación se evalúa mediante transferencia de Western o ELISA usando un anticuerpo que se ha preparado frente a una versión NORF de la cepa. Una cepa NORF es una cepa que es la misma que la cepa hospedadora excepto porque carece del marco de lectura abierto que codifica la glicoproteína recombinante. Si la proteína o glicoproteína recombinante producida por 65 la célula hospedadora ∆bmt2 carece de unión detectable al anticuerpo preparado frente a antígenos de célula hospedadora, entonces la deleción o interrupción de BMT2 es suficiente para permitir que la célula hospedadora
para produzca la proteína o glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada a los anticuerpos frente a antígenos de célula hospedadora.
Sin embargo, si se detecta la actividad de unión cruzada detectable, entonces la célula hospedadora se manipula
5 adicionalmente para que tenga una deleción de los genes BMT1, BMT3,o BMT4. Por ejemplo, la célula hospedadora que tiene una interrupción o deleción del gen BMT2 se manipula adicionalmente para que tenga una deleción o interrupción del gen BMT1. La célula hospedadora ∆bmt2 ∆bmt1 se usa para producir la proteína o glicoproteína recombinante, que a continuación se evalúa mediante transferencia de Western o ELISA usando un anticuerpo que se ha preparado frente a una versión NORF de la cepa. Si la proteína o glicoproteína recombinante producida por la célula hospedadora ∆bmt2 ∆bmt1 carece de unión detectable al anticuerpo preparado frente a antígenos de célula hospedadora, entonces las deleciones o interrupciones de BMT1 y BMT2 son suficientes para permitir que la célula hospedadora produzca la proteína o glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada a los anticuerpos frente a antígenos de célula hospedadora.
15 Sin embargo, si se detecta la actividad de unión cruzada detectable, entonces la célula hospedadora se manipula adicionalmente para que tenga una deleción de los genes BMT3 o BMT4. Por ejemplo, la célula hospedadora que tiene una interrupción o deleción del gen BMT1 y BMT2 se manipula adicionalmente para que tenga una deleción o interrupción del gen BMT3. La célula hospedadora ∆bmt2 ∆bmt1 ∆bmt3 se usa para producir la proteína o glicoproteína recombinante, que a continuación se evalúa mediante transferencia de Western o ELISA usando un anticuerpo que se ha preparado frente a una versión NORF de la célula hospedadora. Si la proteína o glicoproteína recombinante producida por la célula hospedadora ∆bmt2 ∆bmt1 ∆bmt3 carece de unión detectable al anticuerpo preparado frente a antígenos de célula hospedadora, entonces las deleciones e interrupciones de BMT1, BMT2 y BMT3 son suficientes para permitir que la célula hospedadora produzca la proteína o glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada a los anticuerpos frente a antígenos de célula hospedadora.
25 Sin embargo, si se detecta la actividad de unión cruzada detectable, entonces la célula hospedadora se manipula adicionalmente para que tenga una deleción del gen BMT4. The La célula hospedadora ∆bmt2 ∆bmt1 ∆bmt3 ∆bmt4 se usa para producir la proteína o glicoproteína recombinante, que a continuación se evalúa mediante transferencia de Western o ELISA usando un anticuerpo que se ha preparado frente a una versión NORF de la cepa para confirmar que la proteína o glicoproteína recombinante carece de unión detectable al anticuerpo preparado frente a antígenos de célula hospedadora.
La presente invención también proporciona una célula hospedadora de Pichia pastoris recombinante en la que el gen BMT2 y el gen BMT1 y el gen BMT3 han experimentado deleción o interrupción y que incluye una molécula de
35 ácido nucleico que codifica la proteína o glicoproteína recombinante. En otras realizaciones, el gen BMT2, el gen BMT1 y el gen BMT3 han experimentado deleción o interrupción. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula hospedadora de Pichia pastoris recombinante en la que el gen BMT1, el gen BMT2, el gen BMT3 y el gen BMT4 han experimentado deleción o interrupción y que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína o glicoproteína recombinante.
La presente invención también proporciona un método general para producir una proteína o glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos de antígeno anti-célula hospedadora que comprende proporcionar una célula hospedadora de Pichia pastoris recombinante en la que el gen BMT2 y el gen BMT1 y el gen BMT3 han experimentado deleción o interrupción y que incluye una molécula de ácido
45 nucleico que codifica la proteína o glicoproteína recombinante; cultivar la célula hospedadora en un medio en condiciones eficaces para expresar la proteína o glicoproteína recombinante; y recuperar la proteína o glicoproteína recombinante del medio para producir la proteína o glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora. En otras realizaciones, el gen BMT2, el gen BMT1 y el gen BMT3 han experimentado deleción o interrupción.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método general para producir una proteína o glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos de antígeno anticélula hospedadora que comprende proporcionar una célula hospedadora de Pichia pastoris recombinante en la que el gen BMT1, el gen BMT2, el gen BMT3 y el gen BMT4 han experimentado deleción o interrupción y que incluye 55 una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína o glicoproteína recombinante; cultivar la célula hospedadora en un medio en condiciones eficaces para expresar la proteína o glicoproteína recombinante; y recuperar la proteína
o glicoproteína recombinante del medio para producir la proteína o glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora.
La presente invención también proporciona una célula hospedadora de Pichia pastoris recombinante en la que el gen BMT2 y el gen BMT1 y el gen BMT3 han experimentado deleción o interrupción y que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína o glicoproteína recombinante. En otras realizaciones, el gen BMT2, el gen BMT1 y el gen BMT3 han experimentado deleción o interrupción. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula hospedadora de Pichia pastoris recombinante en la que el gen BMT1, el gen BMT2, el gen
65 BMT3 y el gen BMT4 han experimentado deleción o interrupción y que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína o glicoproteína recombinante.
En general, la proteína o glicoproteína recombinante es una glicoproteína terapéutica. Los ejemplos de glicoproteínas terapéuticas contempladas, incluyen, pero no se limitan a, eritropoyetina (EPO); citoquinas tales como interferón α, interferónβ, interferón γ, e interferón ω; y factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF); GM-CSF; factores de coagulación tales como factor VIII, factor IX y proteína C humana; antitrombina III; trombina;
5 cadena α de receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG, e IgM; inmunoadhesiones y otras proteínas de fusión de Fc tales como proteínas de fusión a receptor de TNF-Fc solubles; proteínas de fusión de RAGE-Fc; interleuquinas; uroquinasa; quimasa; e inhibidor de urea y tripsina; proteína de unión a IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor de liberación de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibitorio de precursor mieloide; osteoprotegerina; α-1-antitripsina; α-feto proteínas; DNasa II; kringle 3 de plasminógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión del TNF; hormona folículoestimulante; antígeno 4 - Ig asociado a linfocitos T citotóxicos; activador transmembrana y modulador de calcio y ligando de ciclofilina; proteína 1 de tipo glucagón; y agonista de receptores de IL-2.
15 En aspectos en particular de la invención, la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína o glicoproteína recombinante está optimizada por codón para aumentar la expresión de la proteína o glicoproteína recombinante en la célula hospedadora. Por ejemplo, como se muestra en los ejemplos, la molécula de ácido nucleico que codifica la forma madura humana de la eritropoyetina se optimizó con codón para aumento de la expresión de la eritropoyetina en una levadura metilotrófica tal como una cepa de Pichia pastoris que se había modificado ingeniería genética para producir una variante de eritropoyetina que comprendía N-glicanos biantenarios en donde la glicoforma predominante comprendía ambas antenas sialiladas de forma terminal.
Las células hospedadoras adecuadas incluyen cualquier célula hospedadora que incluya homólogos de los genes BMT1 , BMT2, BMT3 y/o BMT4 de Pichia pastoris. En la actualidad, los ejemplos de tales células hospedadoras 25 incluyen Candida albicans y la levadura metilotrófica Pichia pastoris. La descripción describe que la célula hospedadora es una levadura metilotrófica tal como Pichia pastoris y mutantes de la misma y variantes de la misma modificadas por ingeniería genética. La invención sin embargo se limita a Pichia pastoris. La levadura metilotrófica tal como Pichia pastoris se puede modificar genéticamente para que exprese glicoproteínas en las que el patrón de glicosilación es similar al humano o humanizado. De esta manera, se pueden producir composiciones de glicoproteína en las que la glicoforma deseada específica es predominante en la composición. Esto se puede conseguir mediante la eliminación de enzimas de glicosilación endógenas seleccionadas y/o mediante modificación por ingeniería genética de las célula hospedadoras y/o proporcionando enzimas exógenas para que imiten toda o parte de la ruta de glicosilación de mamífero como se describe en el documento US 2004/0018590. Si se desea, se puede realizar ingeniería genética adicional de la glicosilación, de modo que la glicoproteína se puede producir con o 35 sin fucosilación del núcleo. El uso de células eucariotas inferiores es adicionalmente ventajoso porque éstas células son capaces de producir composiciones de glicoproteína altamente homogéneas, de modo que la glicoforma predominante de la glicoproteína puede estar presente en un porcentaje molar superior a un treinta por ciento de la glicoproteína en la composición. La descripción describe que la glicoforma predominante puede estar presente en en un porcentaje molar superior a un cuarenta por ciento en moles, cincuenta por ciento en moles, sesenta por ciento en moles, setenta por ciento en moles y, lo más preferentemente, superior a un ochenta por ciento en moles de la glicoproteína presente en la composición. Esto se puede conseguir mediante la eliminación de enzimas de glicosilación endógenas y/o proporcionando enzimas exógenas como se describe en Gerngross et al., documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.029.872 y documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.449.308. Por ejemplo, una célula hospedadoras de seleccionar modificar por ingeniería para que esté suprimida en actividades de 1,6
45 manosil transferasa, que de otro modo podrían añadir restos de manosa en el N-glicano en una glicoproteína.
Por lo tanto, el control de la O-glicosilación puede ser útil para producir lipoproteínas en particular en las células hospedadoras desveladas en el presente documento con un rendimiento total mejor o con un rendimiento de la glicoproteína ensamblada de forma apropiada. Parece que la reducción o eliminación de la O-glicosilación tiene un efecto beneficioso en el ensamblaje y transporte de glicoproteínas tales como anticuerpos completos ya que atraviesan la ruta secretoria y son transportadas a la superficie celular. Por lo tanto, en células en las que la Oglicosilación está controlada, el rendimiento de las glicoproteínas ensambladas de forma apropiada tales como fragmentos de anticuerpo aumenta con respecto al rendimiento obtenido en las células hospedadoras en las que la O-glicosilación no está controlada.
55 Por lo tanto, los métodos desvelados el presente documento pueden usar cualquier célula hospedadora que se haya modificado genéticamente para producir glicoproteínas en las que el N-glicano predominante se selecciona entre el grupo que consiste en N-glicanos complejos, N-glicanos híbridos y N-glicanos de alta manosa en el que los Nglicanos complejos se seleccionan entre el grupo que consiste en Man3GlcNAc2, GlcNAC(14)Man3GlcNAc2, Gal(14)GlcNAc(14)Man3GlcNAc2 y NANA(14)Gal(14)Man3GlcNAc2; los N-glicanos híbridos se seleccionan entre el grupo que consiste en Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2 y NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2;y los N-glicanos de alta manosa se seleccionan entre el grupo que consiste en Man6GlcNAc2, Man7GlcNAC2, Man8GlcNAc2 y Man9GlcNAc2. Los ejemplos de estructuras de N-glicano incluyen, pero no se limitan a, Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GlcNAc3Man3GlcNAc2,
65 GlcNAc4Man3GlcNAC2, GalGlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc4Man3GlcNAc2, Gal3GlcNAc3Man3GlcNAC2, Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2, Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2,
NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANA3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2 y NANA4Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2.
Los marcadores seleccionables de levadura que se pueden usar para construir las células hospedadoras
5 recombinantes incluyen marcadores de resistencia a fármaco y funciones genéticas que permiten que la célula hospedadora de levadura sintetice nutrientes celulares esenciales, por ejemplo aminoácidos. Los marcadores de resistencia a fármaco que se usan normalmente en levadura incluyen cloramfenicol, kanamicina, metotrexato, G418 (geneticina), Zeocina y similares. Las funciones genéticas que permiten que la célula hospedadora sintetice nutrientes celulares esenciales se usan con cepas de levadura disponibles que tienen mutaciones auxotróficas en la función genómica correspondiente. Los marcadores seleccionables de levadura comunes proporcionan funciones genéticas para sintetizar leucina (LEU2), triptófano (TRP1 y TRP2), prolina (PRO1), uracilo (URA3, URA5, URA6), histidina (HIS3), lisina (LYS2), adenina (ADE1 o ADE2) y similares. Otros marcadores seleccionables de levadura incluyen el gen ARR3 de S. cerevisiae, que confiere resistencia a arsenito a células de levadura que se cultivan en presencia de arsenito (Bobrowicz et al., Yeast, 13: 819-828 (1997); Wysocki et al., J. Biol. Chem. 272: 30061-30066
15 (1997)). Un número de sitios de integración adecuados incluyen los enumerados en el documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.479.389 e incluyen homólogos para loci conocidos para Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras u hongos. Los métodos para integrar vectores en levaduras se conocen bien (véase por ejemplo, documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.479.389, documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.514.253, Solicitud Publicada de Estados Unidos n.º 2009012400 y documento WO2009/085135). Los ejemplos de sitios de inserción incluyen, pero no se limitan a, genes ADE de Pichia; genes TRP de Pichia (incluyendo TRP1 a TRP2); genes MCA de Pichia; genes CYM de Pichia; genes PEP de Pichia; genes PRB de Pichia; y genes LEU de Pichia. Los genes ADE1 y ARG4 de Pichia se han descrito en Lin Cereghino et al., Gene 263: 159-169 (2001) y en el documento de Patente de Estados Unidos n.º 4.818.700, los genes HIS3 y TRP1 se han descrito en Cosano et al., Yeast 14: 861-867 (1998), HIS4 se ha descrito en GenBank con el n.º de Registro X56180.
25 También se describió un método para producir una eritropoyetina humana madura en levadura metilotrófica tal como Pichia pastoris que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora. El método comprende proporcionar una célula hospedadora de Pichia pastoris recombinante modificada por ingeniería genética para producir N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y en la que al menos los genes BMT1, BMT2 y BMT3 han experimentado deleción o interrupción y que incluye dos o más moléculas de ácido nucleico, cada una codificando una proteína de fusión que comprende una eritropoyetina humana madura EPO fusionada a un péptido señal se dirige al aparato del RE y que se retira cuando la proteína de fusión está en el RE de cultivo de la célula hospedadora en un medio en condiciones eficaces para expresar y procesar la primera y segunda proteínas de
35 fusión; y recuperar la eritropoyetina humana madura del medio para producir la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora.
En aspectos en particular, la molécula de ácido nucleico que codifica la eritropoyetina humana madura está optimizada por codón a la expresión óptima en la levadura metilotrófica tal como Pichia pastoris. Como se muestra en los ejemplos, la eritropoyetina humana madura está codificada como una proteína de fusión en la que la EPO está fusionada en el extremo N-terminal de la forma madura de la eritropoyetina par con el extremo C-terminal de un péptido señal y dirige la proteína de fusión a las ruta secretoria para procesamiento, incluyendo glicosilación. Los ejemplos de péptidos señal incluyen, pero no se limitan a, el péptido señal αMATpre de S. cerevisiae o un péptido
45 señal de lisozima de pollo. En lugar de las que se desvelan en el presente documento, se pueden usar otras secuencias señal, por ejemplo, el péptido señal de α-amilasa de Aspergillus niger y péptido señal de albúmina de suero humano (HSA). En una realización, una primera molécula de ácido nucleico codifica una proteína de fusión en la que la eritropoyetina madura está condensada con el péptido señal αMATpre de S. cerevisiae y la segunda molécula de ácido nucleico codifica una proteína de fusión en la que la eritropoyetina madura está condensada con el péptido señal αMATpre de S. cerevisiae un péptido señal de lisozima de pollo. El péptido señal se puede fusionar con la eritropoyetina humana madura mediante un péptido conector que puede contener uno o más sitios de escisión de proteasa.
La célula hospedadora está modificada con ingeniería genética para producir N-glicanos biantenarios terminados en 55 ácido siálico y en la que al menos los genes BMT1, BMT2 y e BMT3 han experimentado deleción o interrupción.
La detección de actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora se puede determinar en un ELISA de sándwich o en una transferencia de Western.
En aspectos adicionales, la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora incluye una etapa de cromatografía de intercambio catiónico y/o una etapa de cromatografía con hidroxiapatita y/o una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. En una realización, la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos 65 biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora comprende una etapa de cromatografía de intercambio catiónico seguido
de una etapa de cromatografía con hidroxiapatita. Opcionalmente, la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora incluye una etapa de cromatografiaron aniónica.
5 EJEMPLO 1
La cepa YGLY3159 de Pichia pastoris modificada por ingeniería genética es una cepa que produce eritropoyetina humana recombinante con N-glicanos sialilados (rhEPO). La construcción de la cepa se ha descrito en la Solicitud Publicada de Estados Unidos n.º 20080139470 y se ilustra de forma esquemática en la Figura 1. En resumen, la cepa se construyó como sigue a continuación.
La cepa YGLY3159 se construyó a partir de la cepa NRRLY 11430 de Pichia pastoris de tipo silvestre usando métodos descritos anteriormente (véase por ejemplo, documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.449.308;
15 documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.479.389; Solicitud Publicada de Estados Unidos n.º 20090124000; Solicitud de PCT Publicada n.º WO2009085135; Nett y Gerngross, Yeast 20: 1279 (2003); Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5022 (2003); Hamilton et al., Science 301: 1244 (2003)). Todos los plásmido se prepararon en un plásmido pUC19 usando procedimientos convencionales de biología molecular. Para secuencias de nucleótidos que se optimizaron para expresión en P. pastoris, las secuencias de nucleótidos nativas se analizaron con el software GENEOPTIMIZER (GeneArt, Regensburg, Alemania) y los resultados se usaron para generar secuencias de nucleótidos en las que los codones se optimizaron para expresión de P. pastoris. Las cepas de levadura se transformaron mediante electroporación (usando técnicas convencionales tal como lo recomienda el fabricante del electroporador BioRad).
25 El plásmido pGLY6 (Figura 2) es un vector de integración que se dirige al locus de URA5 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen de invertasa o unidad de transcripción de S. cerevisiae (ScSUC2; SEQ ID NO: 1) flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen URA5 de P. pastoris (SEQ ID NO: 59) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen URA5 de P. pastoris (SEQ ID NO: 60). El plásmido pGLY6 se linealizó y el plásmido linealizado se transformó en la cepa NRRLY 11430 de tipo silvestre para producir una serie de cepas en las que el gen ScSUC2 estaba insertado en el locus de URA5 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY13 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es auxotrófica para uracilo.
35 El plásmido pGLY40 (Figura 3) es un vector de integración que se dirige al locus de OCH1 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción de P. pastoris (SEQ ID NO: 61) flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ (SEQ ID NO: 62) que a su vez está flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen OCH1 (SEQ ID NO: 64) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen OCH1 (SEQ ID NO: 65). El plásmido pGLY40 se linealizó con SfiI y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY13 para producir una serie de cepas en las que el gen URA5 flanqueado por las repeticiones de lacZ se ha insertado en el locus de OCH1 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY23 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es prototrófica para URA5. Se hizo contraselección de la cepa YGLY23 en presencia de ácido 5-fluoroorótico (5
45 FOA) para producir una serie de cepas en las que el gen URA5 se ha perdido y solamente las repeticiones de lacZ permanecen en el locus de OCH1. Esto hace que la cepa sea auxotrófica para uracilo. La cepa YGLY43 se seleccionó.
El plásmido pGLY43a (Figura 4) es un vector de integración que se dirige al locus de BMT2 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen transportador de UDP-N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) o unidad de transcripción de K. lactis (KIMNN2-2, SEQ ID NO: 3) adyacente a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción de P. pastoris flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. Los genes adyacentes están flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen BMT2 (SEQ ID NO: 66) y en el otro
55 lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen BMT2 (SEQ ID NO: 67). El plásmido pGLY43a se linealizó con SfiI y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY43 para producir una serie de cepas en las que el gen KlMNN2-2 y el gen URA5 flanqueado por las repeticiones de lacZ se ha insertado en el locus de BMT2 mediante recombinación homóloga de doble cruce. El gen BMT2 se ha desvelado en Mille et al., J. Biol. Chem. 283: 9724-9736 (2008) tienen el documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.465.557. La cepa YGLY63 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es prototrófica para uracilo. Se hizo contraselección de la cepa YGLY63 en presencia de 5-FOA para producir cepas en las que el gen URA5 se ha perdido y solamente permanecen las repeticiones de lacZ. Esto hace que la cepa sea auxotrófica para uracilo. La cepa YGLY83 se seleccionó.
65 El plásmido pGLY48 (Figura 5) es un vector de integración que se dirige al locus de MNN4L1 y contiene un casete de expression que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el homólogo de ratón del marco de
lectura abierto (ORF) del transportador de UDP-GlcNAc (SEQ ID NO: 17) unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris (SEQ ID NO: 53) y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de terminación CYC de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 56) adyacentes a una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ y en el que los casetes de expresión juntos están flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen MNN4L1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 76) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen MNN4L1 (SEQ ID NO: 77). El plásmido pGLY48 se linealizó con SfiI y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY83 para producir una serie de cepas en las que el casete de expresión que codifica el transportador UDP-GlcNAc de ratón y el gen URA5 se ha insertado en el locus de MNN4L1 mediante recombinación homóloga de doble cruce. El gen MNN4L1 (también denominado MNN4B) se ha desvelado en el documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.259.007. La cepa YGLY103 se seleccionó a partir de las cepas producidas y a continuación se hizo contraselección en presencia de 5-FOA para producir una serie de cepas en las que el gen URA5 se ha perdido y solamente permanecen las
15 repeticiones de lacZ. La cepa YGLY123 se seleccionó.
El plásmido pGLY45 (Figura 6) es un vector de integración que se dirige a los loci PNO1/MNN4 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción de P. pastoris flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ que a su vez está flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen PNO1 (SEQ ID NO: 74) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen MNN4 (SEQ ID NO: 75). El plásmido pGLY45 se linealizó con SfiIy el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY123 para producir una serie de cepas en las que el gen URA5 flanqueado por las repeticiones de lacZ se ha insertado en los loci MNN4 mediante recombinación homóloga
25 de doble cruce. El gen PNO1 se ha desvelado en el documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.198.921 y el gen MNN4 (también denominado MNN4B) se ha desvelado en el documento de Patente de Estados Unidos n.º 7.259.007. La cepa YGLY143 se seleccionó a partir de las cepas producidas y a continuación se hizo contraselección en presencia de 5-FOA para producir una serie de cepas en las que el gen URA5 se ha perdido y solamente permanecen las repeticiones de lacZ. La cepa YGLY163 se seleccionó.
El plásmido pGLY247 (Figura 7) es un vector de integración que se dirige al locus de MET16 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción de P. pastoris flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ que a su vez está flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen
35 MET16 (SEQ ID NO: 84) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen MET16 (SEQ ID NO: 85). El plásmido pGLY247 se linealizó con SfiI y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY163 para producir una serie de cepas en las que el URA5 flanqueado por las repeticiones de lacZ se ha insertado en el locus de MET16 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY203 se seleccionó.
El plásmido pGLY248 (Figura 8) es un vector de integración que se dirige al locus de URA5 y contiene una molécula de ácido nucleico que comprende el gen de MET16 P. pastoris (SEQ ID NO: 86) flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen URA5 (SEQ ID NO: 59) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
45 nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen URA5 (SEQ ID NO: 60). El plásmido pGLY248 se linealizó y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY203 para producir una serie de cepas en las que el gen ScSUC2 insertado en el locus de URA5 se ha reemplazado por el gen MET16 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY243 se seleccionó y a continuación se hizo contraselección en presencia de 5-FOA para producir una serie de cepas en las que el gen URA5 insertado en el locus de MET16 se ha perdido y solamente permanecen las repeticiones de lacZ. La cepa YGLY243 se seleccionó.
El plásmido pGLY582 (Figura 9) es un vector de integración que se dirige al locus de HIS1 y contiene en tándem cuatro casetes de expresión que codifican (1) la epimerasa de UDP-glucosa (ScGAL10) de S. cerevisiae, (2) el dominio catalítico de la galactosiltransferasa I (hGalT) humana fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder 55 KRE2-s de S. cerevisiae (33) para dirigir la enzima quimérica al RE o aparato de Golgi, (3) el gen URA5 o unidad de transcripción de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ y (4) el transportador de UDP-galactosa (DmUGT) de D. melanogaster. El casete de expresión que codifica el ScGAL10 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF de ScGAL10 (SEQ ID NO: 21) unida de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 45) y unida de forma operativa en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 46). El casete de expresión que codifica la galactosiltransferasa I quimérica comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio catalítico hGalT optimizado por codón para expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 23) fusionado en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que codifica el líder 33 de KRE2-s (SEQ ID NO: 13), que está unido de forma operativa 65 en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la
transcripción CYC de S. cerevisiae. El casete de expresión de URA5 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción de P. pastoris flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. El casete de expresión que codifica el DMUGT comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF de DmUGT (SEQ ID NO: 19) unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a
5 una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor OCH1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 47) y unida de forma operativa en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción ALG12 de P. pastoris (SEQ ID NO: 48). Los cuatro casetes en tándem están flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen HIS1 (SEQ ID NO: 87) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen HIS1 (SEQ ID NO: 88). El plásmido pGLY582 se linealizó y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY243 para producir una serie de cepas en las que los cuatro casetes de expresión en tándem se han insertado en el locus de HIS1 mediante recombinación homóloga. La cepa YGLY58 se seleccionó y es auxotrófica para histidina y prototrófica para uridina.
15 El plásmido pGLY167b (Figura 10) es un vector de integración que se dirige al locus de ARG1 y contiene en tándem tres casetes de expresión que codifican (1) el dominio catalítico de la manosidasa II de D. melanogaster (KD) fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder MNN2 de S. cerevisiae (53) para dirigir la enzima quimérica al RE
o aparato de Golgi, (2) el gen HIS1 o unidad de transcripción de P. pastoris y (3) el dominio catalítico de la Nacetilglucosamina (GlcNAc) transferasa II de rata (TC) fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder MNN2 de
S. cerevisiae (54) para dirigir la enzima quimérica al RE o aparato de Golgi. El casete de expresión que codifica el KD53 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de la manosidasa II de D. melanogaster optimizado por codón para su expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 33) fusionada en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que codifica el líder 53 de MNN2 (SEQ ID NO: 5), que está unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor 25 GAPDH de P. pastoris y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El casete de expresión de HIS1 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen HIS1 o unidad de transcripción de P. pastoris (SEQ ID NO: 89). El casete de expresión que codifica el TC54 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de la NGlcNAc transferasa II de rata optimizado por codón para su expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 31) fusionado en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que codifica el líder 54 de MNN2 (SEQ ID NO: 7), que está unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastoris y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris. Los tres casetes en tándem están flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de
35 la región en la posición 5’ del gen ARG1 gene (SEQ ID NO: 79) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen ARG1 (SEQ ID NO: 80). El plásmido pGLY167b se linealizó con SfiI y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY58 para producir un número de cepas (en las que los tres cassettes de expresión en tándem se han insertado en el locus de ARG1 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY73 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es auxotrófica para arginina y prototrófica para uridina e histidina. A continuación se hizo contraselección de la cepa en presencia de 5-FOA para producir un número de cepas que ahora son auxotróficas para uridina. La cepa YGLY1272 se seleccionó.
El plásmido pGLY1430 (Figura 11) es un vector de integración de KINKO que se dirige al locus de ADE1 sin
45 interrupción de la expresión del locus y contiene en tándem cuatro casetes de expresión que codifican (1) el dominio catalítico de la GlcNAc transferasa I humana (NA) fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder SEC12 de P. pastoris (10) para dirigir la enzima quimérica al RE o aparato de Golgi, (2) homólogo de ratón del transportador de UDP-GlcNAc (MmTr), (3) el dominio catalítico de la manosidasa IA de ratón (FB) fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder SEC12 (FB8) de S. cerevisiae (8) para dirigir la enzima quimérica al RE o aparato de Golgi y (4) el gen URA5 o unidad de transcripción de P. pastoris. Los vectores de integración de KINKO (Con Supresión Genética con poca o Ninguna Supresión Genética) permiten la inserción de ADN heterólogo en un locus dirigido sin intervención de la expresión del gen en el locus dirigido y se han descrito en la Solicitud Publicada de Estados Unidos n.º 20090124000. El casete de expresión que codifica el NA10 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de la GlcNAc transferasa I humana optimizado por codón para su expresión en P.
55 pastoris (SEQ ID NO: 25) fusionado en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que codifica el líder 10 de SEC12 (SEQ ID NO: 11), que está unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastoris y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris. El casete de expresión que codifica MmTr comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el homólogo de ratón del ORF transportador de UDP-GlcNAc unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor SEC4 de P. pastoris (SEQ ID NO: 49) y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de terminación OCH1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 50). El casete de expresión que codifica el FB8 comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de la manosidasa IA de ratón (SEQ ID NO: 27) fusionado en el extremo en la posición 5’
65 a una molécula de ácido nucleico que codifica el líder 8 de SEC12-m (SEQ ID NO: 15), que está unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GADPH de P.
pastoris y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El casete de expresión de URA5 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción de P. pastoris flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. Los cuatro casetes en tándem están flanqueados en un lado 5 por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ y el ORF completo del gen ADE1 (SEQ ID NO: 82) seguido de una secuencia de terminación ALG3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 54) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen ADE1 (SEQ ID NO: 83). El plásmido pGLY1430 se linealizó con SfiI y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY1272 para producir una serie de cepas en las que los cuatro casetes de expresión en tándem se han insertado en el locus de ADE1 inmediatamente después del ORF de ADE1 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY1305 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es auxotrófica para arginina y ahora es prototrófica para uridina, histidina y adenina. A continuación se hizo contraselección de la cepa en presencia de 5-FOA para producir un número de cepas que ahora son auxotróficas para uridina. La cepa YGLY1461 se seleccionó y es capaz de formar glicoproteínas que tienen predominantemente
15 N-glicanos terminados en galactosa.
El plásmido pGFI165 (Figura 12) es un vector de integración de KINKO que se dirige al locus de PRO1 sin interrupción de la expresión del locus y contiene casetes de expresión que codifican (1) el dominio catalítico de la α1,2-manosidasa de T. reesei fusionado en el extremo N-terminal al péptido señal αMATpre (aMATTrMan) de S. cerevisiae para dirigir la proteína quimérica a la ruta secretoria y secreción desde la célula y (2) el gen URA5 o unidad de transcripción de P. pastoris. El casete de expresión que codifica el aMATTrMan comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de T. reesei (SEQ ID NO: 29) fusionado en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido señal αMATpre de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 9), que está unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que 25 comprende el promotor GAPDH de P. pastoris y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El casete de expresión de URA5 comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el gen URA5 o unidad de transcripción de P. pastoris flanqueado por moléculas de ácido nucleico que comprenden repeticiones de lacZ. Los dos casetes en tándem están flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ y el ORF completo del gen PRO1 (SEQ ID NO: 90) seguido de una secuencia de terminación ALG3 de P. pastoris y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen PRO1 (SEQ ID NO: 91). El plásmido pGFI165 se linealizó con SfiI y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY1461 para producir una serie de cepas en las que los dos casetes de expresión se han insertado en el locus de PRO1 inmediatamente después del ORF de
35 PRO1 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY1703 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es auxotrófica para arginina y prototrófica para uridina, histidina, adenina y prolina. Esta cepa es capaz de producir glicoproteínas que tienen O-glicosilación reducida (véase la Solicitud Publicada de Estados Unidos n.º 20090170159).
El plásmido pGLY2088 (Figura 13) es un vector de integración que se dirige al locus de TARP2 o al locus AOX1 y contiene casetes de expresión que codifican (1) eritropoyetina humana madura (EPO) fusionada en el extremo Nterminal a un péptido señal αMATpre de S. cerevisiae (alfa MF-pre) para dirigir la proteína quimérica a la ruta secretoria y secreción desde la célula y (2) la proteína de resistencia a zeocina (Sh ble o ZeocinaR). El casete de expresión que codifica la EPO comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la eritropoyetina EPO 45 humana madura optimizada por codón para su expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 92) fusionada en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido señal αMATpre de S. cerevisiae, que está unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor AOX1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 55) y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El casete de expresión de ZeocinaR comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF de Sh ble (SEQ ID NO: 58) que se une de forma operativa al extremo en la posición 5’ al promotor TEF1 de S. cerevisiae (SEQ ID NO: 57) y en el extremo en la posición 3’ a la secuencia de terminación de CYC de S. cerevisiae. Los dos casetes en tándem están flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende el gen TRP2 (SEQ ID NO: 78). El plásmido pGLY2088 se linealizó en el sitio PmeI y se transformó en la cepa YGLY1703
55 para producir una serie de cepas en las que los dos casetes de expresión se han insertado en el locus de AOX1 mediante recombinación homóloga de cruce individual incorporado, que da como resultado múltiples copias del casete de expresión de EPO insertado en el locus de AOX1 de sin interrumpir el locus de AOX1. La cepa YGLY2849 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es auxotrófica para arginina y ahora es prototrófica para uridina, histidina, adenina y prolina. La cepa contiene aproximadamente de tres a cuatro copias del casete de expresión de EPO tal como se determina mediante la medición de la intensidad de los datos de secuenciación del ADN aislado de la cepa. Durante el procesamiento de la EPO quimérica en el RE y en el aparato de Golgi, el péptido líder se retira. Por lo tanto, la rhEPO producida es la forma madura de la EPO.
El plásmido pGLY2456 (Figura 14) es un vector de integración de KINKO que se dirige al locus de TARP2 sin
65 interrupción de la expresión del locus y contiene seis casetes de expresión que codifican (1) el transportador de CMP-ácido siálico de ratón (Transp de mCMP-Sia), (2) la UDP-GlcNAc 2-epimerasa/N-acetilmanosamina quinasa
humana (hGNE), (3) el gen ARG1 o unidad de transcripción de Pichia pastoris, (4) la CMP-ácido siálico sintasa humana (hCMP-NANA), (5) la N-acetilneuraminato-9-fosfato sintasa humana (hSIAP S), (6) el dominio catalítico de a-2,6-sialiltransferasa de ratón (mST6) fusionado en el extremo N-terminal al péptido líder KRE2 de S. cerevisiae
(33) para dirigir la enzima quimérica al RE o aparato de Golgi y el gen ARG1 o unidad de transcripción de P.
5 pastoris. El casete de expresión que codifica el transportador de CMP-ácido siálico de ratón comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF del Transp de mCMP Sia optimizado por codón para su expresión en
P. pastoris (SEQ ID NO: 35), que está unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastoris y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris. El casete de expresión que codifica la UDP-GlcNAc 2-epimerasa/N-acetilmanosamina quinasa humana comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF de hGNE optimizado por codón para su expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 37), que está unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GAPDH de P. pastoris y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El casete de expresión que 15 codifica el gen ARG1 de P. pastoris comprende (SEQ ID NO: 81). El casete de expresión que codifica la CMP-ácido siálico sintasa humana comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF de hCMP-NANA S optimizado por codón para su expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 39), que está unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor GPDAH de P. pastoris y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción CYC de S. cerevisiae. El casete de expresión que codifica la N-acetilneuraminato-9-fosfato sintasa humana comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF de hSIAP S optimizado por codón para su expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 41), que está unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor PMA1 de P. pastoris y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción PMA1 de P. pastoris. El 25 casete de expresión que codifica la a-2,6-sialiltransferasa de ratón quimérica comprende una molécula de ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de mST6 optimizado por codón para su expresión en P. pastoris (SEQ ID NO: 43) fusionado en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido señal KRE2 de S. cerevisiae, que está unido de forma operativa en el extremo en la posición 5’ a una molécula de ácido nucleico que comprende el promotor TEF de P. pastoris (SEQ ID NO: 51) y en el extremo en la posición 3’ a una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de terminación de la transcripción de TEF de P. pastoris (SEQ ID NO: 52). Los seis casetes en tándem están flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 5’ del gen ORF que codifica Trp2p que termina en el codón de parada (SEQ ID NO: 98) seguido de una secuencia de terminación ALG3 de P. pastoris y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’
35 del gen TRP2 (SEQ ID NO: 99). El plásmido pGLY2456 se linealizó con SfiI y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY2849 para producir una serie de cepas en las que los seis casetes de expresión se han insertado en el locus de TARP2 inmediatamente después del ORF de TARP2 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY3159 se seleccionó a partir de las cepas producidas y ahora es prototrófica para uridina, histidina, adenina, prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a Zeocina y contiene aproximadamente de tres a cuatro copias del casete de expresión de EPO. La cepa producía rhEPO; sin embargo, usando los métodos en el Ejemplo 5, la rhEPO tenía reactividad cruzada de unión a anticuerpos preparados frente a HCA (véase el Ejemplo 6).
Aunque los diversos casetes de expresión se integraron en loci en particular del genoma de Pichia pastoris en los ejemplos en el presente documento, se entiende que la operación de la invención es independiente de los loci
45 usados para integración. Los loci distintos de los desvelados en el presente documento se pueden usar para integración de los casetes de expresión. Los sitios de integración adecuados incluyen los enumerados en la Solicitud Publicada de Estados Unidos n.º 20070072262 e incluyen homólogos para loci conocidos de Saccharomyces cerevisiae y otras levaduras u hongos.
EJEMPLO 2
La cepa YGLY3159 en el Ejemplo 1 se modificó por ingeniería genética adicionalmente para interrumpir los genes BMT1, BMT3 y BMT4 como sigue a continuación.
55 Se hizo contraselección de la cepa YGLY3159 en presencia de 5-FOA para producir la cepa YGLY3225, que ahora es auxotrófica para uridina.
El plásmido pGLY3411 (pSH1092) (Figura 15) es un vector de integración que contiene el casete de expresión que comprende el gen URA5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 5’ del gen BMT4 (PpPBS4 5’) de P. pastoris (SEQ ID NO: 72) y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 3’ del gen BMT4 de P. pastoris (SEQ ID NO: 73). El plásmido pGLY3411 se linealizó y el plásmido linealizado se transformó en YGLY3159 para producir una serie de cepas en las que el casete de expresión de URA5 se ha insertado en el locus de BMT4 de mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY4439 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es prototrófica para uracilo, adenina, histidina,
65 prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a Zeocina y contiene aproximadamente de tres a cuatro copias del casete de expresión de rhEPO. La cepa tiene una interrupción o deleción de los genes BMT2 y BMT4.
El plásmido pGLY3430 (pSH1115) (Figura 16) es un vector de integración que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF de resistencia a Nourseotricina (NATR) (originalmente de pAG25 de ERO-SCARF, Scientific Research and Development GmbH, Daimlerstrasse 13a, D-61352 Bad Homburg, Alemania, véase Goldstein et al., Yeast 15: 1541 (1999)), ORF (SEQ ID NO: 102) unido de forma operativa al promotor TEF1 de 5 Ashbya gossypii (SEQ ID NO: 105) y secuencias de terminación de TEF1 de Ashbya gossypii (SEQ ID NO: 106) flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 5’ del gen BMT1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 68) y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 3’ del gen BMT1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 69). El plásmido pGLY3430 se linealizó y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY4439 para producir una serie de cepas en las que el casete de expresión de NATR se ha insertado en el locus de BMT1 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY6661 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es prototrófica para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a Zeocina y Nourseotricina y contiene aproximadamente de tres a cuatro copias del casete de expresión de EPO. La cepa tiene una interrupción o deleción de los genes BMT1, BMT2 y BMT4. La cepa YGLY7013 también se seleccionó; sin embargo, esta cepa presentaba solamente una interrupción parcial del gen BMT1. Estafeta se diseñó
15 como con una interrupción o deleción de los genes BMT1, BMT2 y BMT4.
El plásmido pGLY4472 (pSH1186) (Figura 17) es un vector de integración que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el gen de higromicina B fosfotransferasa de E. coli (HygR) ORF (SEQ ID NO: 103) unido de forma operativa al promotor TEF1 de Ashbya gossypii (SEQ ID NO: 105) y secuencias de terminación de TEF1 de Ashbya gossypii (SEQ ID NO: 106) flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 5’ del gen BMT3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 70) y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 3’ del gen BMT3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 71). El plásmido pGLY3430 se linealizó y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY6661 para producir una serie de cepas en las que el casete de expresión de HygR se ha insertado en el locus de BMT3 mediante recombinación homóloga de doble cruce. Las cepas YGLY7361 a YGLY7366 y las 25 cepas YGLY7393 a YGLY7398 se seleccionaron a partir de las cepas producidas y son prototróficas para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepas son resistentes a Zeocina, Nourseotricina, e Higromicina y contienen aproximadamente de tres a cuatro copias del casete de expresión de EPO. La cepas tienen interrupciones
o deleciones de los genes BMT1, BMT2, BMT3 y BMT4 y producen rhEPO que carece de unión de reactividad cruzada a anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora (HCA).
EJEMPLO 3
La cepa YGLY3159 en el Ejemplo 1 se modificó por ingeniería genética adicionalmente para producir cepas en las que los genes BMT1, BMT3 y BMT4 se han interrumpido o experimentado deleción y para incluir varias copias de un
35 casete de expresión que codifica EPO humana madura fusionada con el péptido líder de lisozima de pollo. En resumen, la construcción de estas cepas a partir de YGLY3159 se muestra en la Figura 1 y se describe brevemente como sigue a continuación.
Se hizo contraselección de la cepa YGLY3159 en presencia de 5-FOA para producir la cepa YGLY3225, que ahora es auxotrófica para uridina.
El plásmido pGLY2057 (Figura 18) es un vector de integración que se dirige al locus de ADE2 y contiene an casete de expresión que codifica el gen URA5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ. El casete de expresión está flanqueado en un lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la
45 región en la posición 5’ del gen ADE2 (SEQ ID NO: 100) y en el otro lado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la región en la posición 3’ del gen ADE2 (SEQ ID NO: 101). El plásmido pGLY2057 se linealizó con SfiI y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY3225 para producir una serie de cepas en las que el casete de URA5 se ha insertado en el locus de ADE2 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY3229 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es auxotrófica para adenina y prototrófica para uridina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a Zeocina y contiene aproximadamente de tres a cuatro copias del casete de expresión de EPO.
El plásmido pGLY2680 (Figura 19) es un vector de integración que se puede dirigir al locus de TRP2 o AOX1 y contiene casetes de expresión que codifican (1) una EPO quimérica que comprende la eritropoyetina madura 55 humana (EPO) fusionada en el extremo N-terminal con un péptido señal de lisozima de pollo para dirigir la proteína quimérica a la ruta secretoria y secreción desde la célula y (2) el gen ADE2 de P. pastoris sin un promotor. El gen ADE2 se transcribe escasamente desde un promotor críptico. Por lo tanto, la selección de cepas de levadura ade2∆ transformarlas con el vector en medio no complementado con adenina requiere múltiples copias del rector a integrar en el genoma para hacer que sea prototrófico recombinante para adenina. Dado que el vector incluye adicionalmente el casete de expresión de EPO, la levadura recombinante también incluirá múltiples copias del casete de EPO integradas en el genoma. Este vector y método se ha descrito en la Solicitud de PCT Publicada WO2009085135. La secuencia de ADN que codifica el péptido señal de lisozima de pollo se muestra en la SEQ ID NO: 94, el ORF optimizado por codón que codifica la EPO madura humana se muestra en la SEQ ID NO: 92 y el gen ADE2 de P. pastoris sin su promotor pero incluyendo sus secuencias de terminación se muestra en la SEQ ID 65 NO: 96. La EPO quimérica está unida de forma operativa al promotor de AOX1 y secuencias de terminación CYC de
S. cerevisiae. Los dos casetes en tándem están flanqueados en un lado por una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que comprende el gen TRP2.
El plásmido pGLY2680 se linealizó en el sitio PmeI y se transformó en YGLY3229 para producir una serie de cepas en las que los dos casetes de expresión se han insertado en el locus de AOX1 mediante recombinación homóloga 5 de cruce individual incorporado, que da como resultado múltiples copias del casete de expresión de EPO insertado en el locus de AOX1 sin interrumpir el locus de AOX1. La cepa YGLY4209 se seleccionó a partir de las cepas producidas. En esta cepa hay aproximadamente 5-7 copias del casete de expresión de EPO tal como se determina mediante la medición de la intensidad de los datos de secuenciación del ADN aislado de la cepa insertado en el locus. La cepa es prototrófica para adenina, uridina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa contiene en total
10 de aproximadamente ocho a once copias de casetes de expresión de EPO. Durante el procesamiento de la EPO quimérica en el RE y en el aparato de Golgi, el péptido líder se retira. Por lo tanto, la rhEPO producida es la forma madura de la EPO.
Se hizo contraselección de la cepa YGLY4209 en presencia de 5’-FOA para producir un número de cepas que eran 15 auxotróficas para uracilo. A partir de los transformantes producidos, la cepa YGLY4244 se seleccionó.
El plásmido pGLY2713 (Figura 20), un vector de integración que se dirige al gen PEP4 de P. pastoris (SEQ ID NO: 104), contiene el ORF de PNO1 de P. pastoris adyacente al casete de expresión que comprende el gen URA5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ y flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos de la 20 región en la posición 5’ del gen PEP4 de P. pastoris y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 3’ del gen PEP4 de P. pastoris. El plásmido pGLY2713 se linealizó con SfiI y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY4244 para producir una serie de cepas en las que el ORF de PNO1 y el casete de expresión de URA5 se han insertado en el locus de PEP4 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY5053 se seleccionó a partir de las cepas producidas y se hizo contraselección en presencia de 5-FOA para producir una
25 serie de cepas en las que el URA5 se ha perdido del genoma. La cepa YGLY5597 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es prototrófica para adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a Zeocina y contiene de aproximadamente ocho a once copias del casete de expresión de rhEPO.
El plásmido pGLY3411 (pSH1092) (Figura 15) es un vector de integración que contiene el casete de expresión que
30 comprende el gen URA5 de P. pastoris flanqueado por repeticiones de lacZ flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 5’ del gen BMT4 (PpPBS4 5’) de P. pastoris (SEQ ID NO: 72) y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 3’ del gen BMT4 de P. pastoris (SEQ ID NO: 73). El plásmido pGLY3411 se linealizó y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY5597 para producir una serie de cepas en las que el casete de expresión de URA5 se ha insertado en el locus de BMT4 mediante recombinación homóloga de doble
35 cruce. La cepa YGLY5618 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es prototrófica para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepa es resistente a Zeocina y Nourseotricina y contiene de aproximadamente ocho a once copias del casete de expresión de rhEPO. La cepa tiene interrupciones de los genes BMT2 y BMT4.
40 El plásmido pGLY3430 (pSH1115) (Figura 16) es un vector de integración que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF de resistencia a Nourseotricina (NATR) (originalmente de pAG25 de ERO-SCARF, Scientific Research and Development GmbH, Daimlerstrasse 13a, D-61352 Bad Homburg, Alemania, véase Goldstein et al., Yeast 15: 1541 (1999)) ORF (SEQ ID NO: 102) unido de forma operativa al promotor TEF1 de Ashbya gossypii y secuencias de terminación de TEF1 de Ashbya gossypii flanqueado en un lado con la secuencia
45 de nucleótidos en la posición 5’ del gen BMT1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 68) y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 3’ del gen BMT1 de P. pastoris (SEQ ID NO: 69). El plásmido pGLY3430 se linealizó y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY5618 para producir una serie de cepas en las que el casete de expresión de NATR se ha insertado en el locus de BMT1 mediante recombinación homóloga de doble cruce. La cepa YGLY7110 se seleccionó a partir de las cepas producidas y es prototrófica para uracilo, adenina, histidina, prolina,
50 arginina y triptófano. La cepa es resistente a Zeocina y Nourseotricina y contiene de aproximadamente ocho a once copias del casete de expresión de rhEPO. La cepa tiene interrupciones de los genes BMT1, BMT2 y BMT4.
El plásmido pGLY4472 (pSH1186) (Figura 17) es un vector de integración que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el ORF del gen de higromicina B fosfotransferasa de E. coli (HygR) (SEQ ID NO: 103) unido de 55 forma operativa al promotor TEF1 de Ashbya gossypii y secuencias de terminación de TEF1 de Ashbya gossypii flanqueado en un lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 5’ del gen BMT3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 70) y en el otro lado con la secuencia de nucleótidos en la posición 3’ del gen BMT3 de P. pastoris (SEQ ID NO: 71). El plásmido pGLY3430 se linealizó y el plásmido linealizado se transformó en la cepa YGLY7110 para producir una serie de cepas en las que el casete de expresión de HygR se ha insertado en el locus de BMT3
60 mediante recombinación homóloga de doble cruce. Las cepas YGLY7113 a YGLY7122 se seleccionaron a partir de las cepas producidas y son prototróficas para uracilo, adenina, histidina, prolina, arginina y triptófano. La cepas son resistentes a Zeocina, Nourseotricina, e Higromicina y contienen de aproximadamente ocho a once copias del casete de expresión de EPO. La cepas tienen interrupciones de los genes BMT1, BMT2, BMT3 y BMT4 y producen rhEPO que carece de unión de reactividad cruzada detectable a anticuerpos preparados frente a HCA.
EJEMPLO 4
Varias de las cepas de los Ejemplos 1 a 3 se usaron para producir rhEPO como se describe a continuación y se muestran esquemáticamente en la Figura 21. En resumen, la producción comienza mediante inoculación de
5 matraces de agitación que contienen medios de cultivo con células del banco de células de trabajo y evoluciona a través de una serie de inoculaciones, incurvaciones y transferencias de los cultivos en expansión en recipientes de tamaño creciente hasta que hay suficiente biomasa disponible para inocular el biorreactor de producción. El glicerol es la fuente primaria de carbono durante la fase discontinua, a continuación el crecimiento del cultivo se mantiene a través de alimentación de glicerol y sales. Cuando el glicerol se agota, las células se inducen para que expresen la proteína rhEPO mediante intercambio a una alimentación de metanol. Los inhibidores se añaden a inducción para minimizar la O-glicosilación (por ejemplo, PMTi 3, Ácido 5-[[3-(1-feniletoxi)-4-(2-feniletoxi)]fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo3-tiazolidinaacético, (véase la Solicitud de PCT Publicada n.º WO 2007061631)) y para minimizar la proteólisis. Los inhibidores de la proteólisis se añaden de nuevo al final de la fase para minimizar la proteólisis. El cultivo se enfría a aproximadamente 4 ºC y se cosecha.
15 El cultivo de las cepas a escala de laboratorio se realizó en en fermentadores SixFors de 500 ml y de 3 l usando en general los siguientes procedimientos. Se realizan Identificaciones Sistemáticas en Biorreactor (SIXFORS) en recipientes de 0,5 l (sistema de multifermentación Sixfors, ATR Biotech Laurel, MD) en las condiciones siguientes: pH a 6,5, 24 ºC, 0,3 SLPM y una velocidad inicial del agitador de 550 rpm con aun volumen de trabajo inicial de 350 ml (330 ml de medio BMGY y 20 ml de inóculo). El software del multifermentador IRIS (ATR Biotech Laurel, MD) se usa para aumentar de forma lineal la velocidad del agitador de 550 rpm a 1200 rpm durante 10 horas, una hora después de la inoculación. Los cultivos de semilla (200 ml de BMGY en un matraz de 1 l con tabique deflector) se inoculan directamente de placas de agar. Los Matraces de semilla se incubaron durante 72 horas a 24 ºC para alcanzar densidades ópticas (DO600) entre 95 y 100. Los fermentadores se inoculan con cultivos en matraz en fase
25 estacionaria de 200 ml que se concentraron hasta 20 ml mediante centrifugación. La fase discontinua terminó al finalizar la fermentación inicial de carga de glicerol (18-24 h) y va seguida de una segunda fase discontinua que comienza mediante la adición de 17 ml de solución de alimentación de glicerol (50 % [p/p] de glicerol, 5 mg/l de Biotina, 12,5 ml/l de sales de PMTi (65 g/l de FeSO4.7H2O, 20 g/l de ZnCl2, 9g/l de H2SO4, 6 g/l de CuSO4.5H2O, 5 g/l de H2SO4, 3 g/l de MnSO4.7H2O, 500 mg/l de CoCl2·6H2O, 200 mg/l de NaMoO4·2H2O, 200 mg/l de biotina, 80 mg/l de NaI, 20 mg/l de H3BO4)). Después de finalizar la segunda fase discontinua, tal como señalizar con una adición en oxígeno disuelto, la fase de inducción comienza por alimentación de una solución de alimentación de metanol (100 % de MeOH, 5 mg/l de biotina, 12,5 ml/l de PMTi) a 0,6 queg/h durante 32-40 horas. El cultivo se cosecha mediante centrifugación.
35 Los cultivos en biorreactor (3 l) se realizan en biorreactores de vidrio de 3 l (Applikon, Foster City, CA) y 15 l (Applikon, Foster City, CA) y un autoclave de acero inoxidable de 40 l (Applikon, Foster City, CA) en lugar del biorreactor. Los cultivos de semilla se preparan por inoculación de medios BMGY directamente con viales de reserva congelados a una proporción volumétrica de un 1 %. Los matraces de semilla se incuban a 24 ºC durante 48 horas para obtener una densidad óptica (DO600) de 20 ± 5 para asegurar que las células están creciendo de manera exponencial después de la transferencia. El medio de cultivo contenía 40 g de glicerol, 18,2 g de sorbitol, 2,3 g de K2HPO4, 11,9 g de KH2PO4, 10 g de extracto de levadura (BD, Franklin Lakes, NJ), 20 g de peptona (BD, Franklin Lakes, NJ), 4 x 103 g de biotina y 13,4 g de Base Nitrogenada de Levadura (BD, Franklin Lakes, NJ) por litro. El biorreactor se inocula con una proporción volumétrica de un 10 % de semilla con respecto al medio inicial. Los cultivos se realizan en modo semicontinuo en las condiciones siguientes: temperatura ajustada a 24 ± 0,5 ºC, pH
45 controlado a 6,5 ± 0,1 con NH4OH, el oxígeno disuelto se mantuvo a 1,7 ± 0,1 mg/l con una tasa de agitación en cascada en la adición de O2. El caudal de aire se mantiene a 0,7 wm. Después de agotar la carga inicial de glicerol (40 g/l), una solución de glicerol al 50 % que contiene 12,5 ml/l de sales de PTM1 se alimenta de forma exponencial a un 50 % de la tasa de crecimiento máximo durante ocho horas hasta que se consiguen 250 g/l de peso celular húmedo. La inducción comienza después de una fase de privación de 30 minutos cuando el metanol se alimento de forma exponencial para mantener una tasa de crecimiento específico de 0,01 h1. Cuando se alcanza una tasa de absorción de oxígeno de 150 mM/l/h, la tasa de alimentación de metanol se mantiene constante para evitar la limitación de oxígeno. El cultivo se cosecha mediante centrifugación.
Después del aclarado por centrifugación y microfiltración, el filtrado se concentra 10X mediante ultrafiltración y la
55 proteína rhEPO se purifica a través de una secuencia de dos etapas de cromatografía usando una afinidad por colorante azul e hidroxiapatita.
El aclarado principal se realiza por centrifugación. El de cultivo de células completas se transfiere en frascos de centrifugación de 1000 ml y se centrifuga a 4 ºC durante 15 minutos a 13.000 x g. Una etapa de ultrafiltración se puede usar para fermentadores más grandes (de 10 l a 40 l y más grandes). Esta etapa se puede realizar usando láminas planas de Sartorious con un tamaño de poro de 10 K hasta una concentración de cinco veces.
Una etapa de captura se realiza usando Cromatografía de Flujo Rápido de Azul SEPHAROSE 6 (Pseudo-Afinidad). Una columna de de Flujo Rápido (FF) de Azul SEPHAROSE 6 (GE Healthcare) se equilibra con MOPS 50 mM, 65 pH 7,0. El sobrenadante del cultivo se ajusta a NaCl 100 mM y se pasa a través de un filtro sin salida (Whatman, Polycap TC) antes de cargarlo a la columna. El tiempo de permanencia se mantiene durante aproximadamente 10
minutos con un lavado con 3 volúmenes de columna (CV) después de la carga. La elución es la etapa de elución de 4 CV con NaCl 1 M en MOPS 50 mM, pH 7,0. La EPO eluye al NaCl 1 M.
Una etapa intermedia se realiza usando cromatografía de hidroxiapatita (HA). Una hidroxiapatita de cerámica Macro
5 prep de Tipo I de 40 µm (Bio-Rad) se usa después de la etapa de captura. Esta columna se equilibra con solución de equilibrio: MOPS 50 mM, pH 7,0 que contiene NaCl 1 M y CaCl2 10 mM. Se añade CaCl2 aproximadamente 10 mM a la rhEPO combinada de la columna de azul antes de la carga. El lavado de la columna se realiza con 3 CV de solución de equilibrio seguido de etapa de elución de 10 CV a fosfato Na 12,5 mM en MPOS, pH 7,0 para proporcionar la combinación 1 de HA que contiene la rhEPO.
Una etapa de cromatografía de intercambio catiónico se puede usar para purificar adicionalmente la rhEPO. La muestra combinada después de la etapa de cromatografía de hidroxiapatita (por ejemplo, combinación 1 de HA) se dializa frente a acetato Na 50 mM, pH 5,0 durante una noche a 4 ºC y una columna Source 30S o columna de intercambio catiónico Poros (GE Healthcare) se equilibra con el mismo tampón. La muestra dializada se aplica a la
15 columna y un gradiente lineal de 10 CV de NaCl de 0 a 750 mM se aplica con rhEPO eluyendo con NaCl entre 350 mM y 500 mM para proporcionar la rhEPO.
El extremo N terminal de la molécula de rhEPO purificada se puede conjugar con polietilenglicol lineal de 40 kDa (PEG) a través de aminación reductora (PEGilación). El PEG activado se añade a la muestra de rhEPO (conc. a aproximadamente 1 mg/ml) en tampón de acetato sódico 50 mM a pH 5,2 a una proporción de proteína:PEG de
1:10. La reacción se realiza a temperatura ambiente en condiciones reductoras mediante la adición de cianoborohidruro sódico 10 mM a la mezcla de reacción con agitación durante una noche. La reacción se detiene mediante la adición de Tris 10 mM, pH 6,0.
25 El producto de rhEPO mono-PEGilado se purifica usando una etapa de cromatografía de intercambio catiónico antes de diafiltración en el tampón de formulación final (fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 120 mM, Polisorbato 20 al 0,005 % (p/v), pH 7,0).
El producto final se diluye hasta una concentración adecuada para su carga y se filtra de forma estéril en el envase de almacenamiento de la sustancia farmacológica. La rhEPO PEGilada se puede almacenar a 2-8 ºC hasta su carga, momento en el que se carga de forma aséptica en viales de vidrio que a continuación se cierran herméticamente con un tapón de caucho y protección de aluminio.
Se conocen y se pueden usar formulaciones comerciales de proteínas. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a,
35 ARANESP®: solución de Polisorbato: Cada 1 ml contiene 0,05 mg de polisorbato 80 y se formula a pH 6,2 ± 0,2 con 2,12 mg de fosfato sódico monohidratado monobásico, 0,66 mg de fosfato sódico dibásico anhidro y 8,18 mg de cloruro sódico en agua para inyección, USP (para 1 ml). Solución de albúmina: Cada 1 ml contiene 2,5 mg de albúmina (humana) y se formula a pH 6,0 ± 0,3 con 2,23 mg de fosfato sódico monohidratado monobásico, 0,53 mg de fosfato sódico dibásico anhidro y 8,18 mg de cloruro sódico en agua para inyección, USP (hasta 1 ml). EPOGEN® se formula como un líquido incoloro, estéril en una solución isotónica tamponada con cloruro sódico/citrato sódico o una solución tamponada de cloruro sódico/fosfato sódico para administración intravenosa (IV) o subcutánea (SC). Vial sin Conservantes, de Una Sola dosis: Cada 1 ml de solución contiene 2000, 3000, 4000 o
10.000 Unidades de Epoetina alfa, 2,5 mg de Albúmina (Humana), 5,8 mg de citrato sódico, 5,8 mg de cloruro sódico
y 0,06 mg de ácido cítrico en agua para inyección, USP (pH 6,9 ± 0,3). Esta formulación no contiene conservantes. 45 Los viales conservados contienen un 1 % de alcohol bencílico.
EJEMPLO 5
Los métodos usados para analizar la presencia o ausencia de antígeno de célula hospedadora (HCA) incluían análisis de transferencia de Western y ensayo de inmunoabsorción unida a enzima de sándwich (ELISA).
El anticuerpo de antígeno de célula hospedadora (HCA) se preparó en conejos usando el sobrenadante de cultivos de la cepa NORF. La cepa NORF es genéticamente la misma que YGLY3159 excepto porque carece del ORF que codifica la EPO madura humana. El sobrenadante de fermentación de la cepa NORF preparado en adyuvante
55 completo de Freund se inyectó en conejos, que a continuación se estimularon tres veces con sobrenadante de fermentación preparado en adyuvante incompleto de Freund. Después de 45 días, se extrajo sangre de los conejos y los anticuerpos policlonales para HCA se prepararon usando métodos convencionales, por ejemplo, 9161 F072208-S de IgG policlonal de conejo, que era Proteína A de SLr purificada y suero de conejo policlonal GiF2::suero de conejo completo 6316. El anticuerpo GIF2 no era la proteína A purificada.
Las transferencias de Western para detectar de HCA de P. pastoris se realizaron como sigue a continuación. Las muestras que contenían rhEPO PEGilada o no PEGilada purificada se redujeron en tampón de carga de muestra, del que a continuación se aplicó 1 µl a los pocillos de geles de poliacrilamida SDS Tris-HCl al 4-20 % (SDS-PAGE al 4-20 %) (Bio RAD) y se sometió a electroforesis a 150 V durante aproximadamente 60 minutos. Las proteínas 65 resueltas se electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa a 100 V durante aproximadamente 60 minutos. Después de la transferencia, las membranas se bloquearon durante una hora con solución de bloqueo al 1 % (Roche
Diagnostics). Después del bloqueo, las membranas se sondearon con el anticuerpo policlonal anti-HCA de conejo (anticuerpo primario) diluido a 1:3000. A continuación, las membranas se lavaron y la detección del anticuerpo anti-HCA de conejo se realizó con el anticuerpo secundario, IgG de cabra-anti-conejo (H+L) (Pierce n.º 31460, Lote n.º H51015156), conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP), a una dilución de 1:5000. Después de lavar las
5 membranas, la detección del anticuerpo secundario unido se realizó usando 3,3’ Diaminobencidina (DAB). Para detectar la proteína EPO, el anticuerpo primario era anticuerpo conjugado con EPO (B-4) HRP usado a una dilución de 1:1000 (SC5290 Lote n.º A0507, Santa Cruz Biotechnology). No se usó un anticuerpo secundario. De forma rutinaria, las muestras de EPO se sometieron a electroforesis en paralelo con muestras de rhEPO que se habían desglicosilado con tratamiento con PNGasaF. La desglicosilación se realizó con muestras de 50 ul a las que se añadió 1 µl de enzima PNGasaF a 500 unidades/ul. Después de incubación a 37 ºC durante dos horas, las muestras se redujeron en tampón de carga de muestra y se retiraron alícuotas de 1 µl y se aplicaron a los geles de SDS como se ha mencionado anteriormente.
Los ELISA de sándwich para detectar HCA de P. pastoris se realizaron como sigue a continuación. Los pocillos de
15 placas para ELISA de 96 pocillos se revistieron con 1 µg/pocillo de anticuerpo monoclonal anti-hEPO de ratón. A continuación, los pocillos se bloquearon durante 30 minutos con solución salina tamponada con fosfato (PBS). A los pocillos se añadieron aproximadamente 100 µl de muestras que contenían rhEPO no PEGilada purificada concentrada a aproximadamente 200 ng/ml. La detección primaria usó el anticuerpo policlonal anti-HCA de conejo a una dilución de partida de 1:800 en PBS que a continuación se diluyó en serie a 1:1 en PBS a través a de la fila de terminación con el 11º pocillo a una dilución de 1:819.200. El 12º pocillo sirvió como un control negativo. El patrón para el ELISA fue rhEPO purificada de YGLY3159. Después de 60 minutos, los pocillos se lavaron con PBS tres veces. La detección del anticuerpo anti-HCA de conejo usó anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (AP) a una dilución de 1:10.000 en PBS. Después de 60 minutos, los pocillos se lavaron tres veces con PBS y la detección del anticuerpo secundario unido usó fosfato de 4-Metilumbeliferilo (4-MUPS). Las placas para ELISA
25 se leyeron usando un lector de microplacas de múltiple detección Tecan Genios a una longitud de onda de excitación de 340 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.
EJEMPLO 6
Este ejemplo muestra que YGLY3159 produce rhEPO con actividad de unión cruzada (CBA) con anticuerpo anti-HCA y que la actividad de unión cruzada se debía a la presencia de restos de β-1,2-manosa (resistente a α-1,2manosidasa) en al menos una parte de los N-glicanos en la rhEPO incluso cuando la rhEPO se había producido en la cepa en la que el gen BMT2 de la β-1,2-manosiltransferasa había experimentado deleción o interrupción.
35 La rhEPO se recuperó con una separación cromatográfica de tres etapas del sobrenadante de fermentación de producción de P. pastoris modificada por glico-ingeniería. La cepa YGLY3159 presentaba una pureza de proteínas de aproximadamente un 95 % tal como se determina con SDS-PAGE, RP-HPLC y SEC-HPLC. La rhEPO mono-PEGilada se separó mediante una etapa de cromatografía de intercambio catiónico a partir de sus conjugados hiper y no PEGilados con una pureza de aproximadamente un 96 % tal como se determina con gel de SDS-PAGE. Sin embargo, el anticuerpo frente a HCA de la cepa YGLY3159 detectaba una glicoproteína en las preparaciones de rhEPO producidas a partir de la cepa que comigraba con rhEPO en las transferencias de Western. La Figura 22 muestra que el anticuerpo anti-HCA identificaba una proteína que comigra con rhEPO en geles SDS-PAGE al 420 %. La retirada de ácido siálico de rhEPO no anulaba la actividad de unión cruzada; sin embargo, la retirada de todo el N-glicano de la rhEPO usando PNGasa F producía una forma desglicosilada de rhEPO que no era detectable
45 en las transferencias de Western sondeadas con anticuerpo anti-HCA. Esto se muestra en la Figura 23 que muestra que solamente la forma desglicosilada de rHEPO carecía de actividad de unión cruzada con el anticuerpo anti-HCA.
Para determinar si la actividad de unión cruzada era específica de rhEPO o se podía identificar en preparaciones de glicoproteína de otras cepas de P. pastoris recombinantes, se aislaron unas glicoproteínas producidas en otras cepas, se resolvieron con geles de SDS-PAGE al 4-20 % y los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. En el caso de un anticuerpo completo humano recombinante (rhIgG) producido en una P. pastoris recombinante, la actividad de unión cruzada se detectó en preparaciones de proteínas producidas en P. pastoris de tipo silvestre (hipermanosilada a partir de la región tanto N como O-glicosilada) y en una cepa GS2.0 recombinante que produce predominantemente N-glicanos de Man5GlcNAc2 pero que también contenía N-glicanos de Man9GlcNAc2 detectables
55 que eran resistentes a la α-1,2-manosidasa (Figura 24, flecha). Sin embargo, las preparaciones de rhIgG de P. pastoris de tipo silvestre contenían actividad de unión cruzada con un peso molecular aparente superior al de rhIgG lo que sugiere que las preparaciones contenían contaminación con glicoproteínas de célula hospedadora. La actividad de unión cruzada no se eliminó mediante digestión con PNGasa F (rodeado con un círculo en la Figura 24).
La Figura 25 muestra que la rhEPO glicosilada producida en YGLY3159 tenía actividad de unión cruzada al anticuerpo anti-HCA pero que El panel de la parte superior muestra rpo anti-HCA. Las fetuínas son glicoproteínas de sangre altamente glicosiladas que se forman en el hígado y se secretan en el torrente sanguíneo. Pertenecen a un gran grupo de proteínas de unión que median el transporte y la disponibilidad de una gran diversidad de sustancias 65 de carga en el torrente sanguíneo. El ejemplo representativo mejor conocido de estas proteínas vehículo es la albúmina de suero, la proteína más abundante en el plasma sanguíneo de animales adultos. La fetuína es más
abundante en la sangre fetal, de ahí el nombre de "fetuína" (del latín, feto). El suero bovino fetal contiene más fetuína que la albúmina mientras que el suero de adulto contiene más albúmina que fetuína. Las asialofetuínas son fetuínas en las que el ácido siálico terminal de los N- y O-glicanos se retira por hidrólisis suave o tratamiento con neuraminidasa. En la actualidad, no hay informes de manosas unidas en β en S cerevisiae. La HSA no es una
5 proteína glicosilada.
Los datos a escala de laboratorio Lab demostraban que la purificación en la etapa intermedia de cromatografía de rhEPO de la combinación de captura de Azul SEPHAROSE 6 FF usando una resina de 40 µm de tipo I de hidroxiapatita (HA) puede separar rhEPO que tiene una actividad de unión cruzada casi indetectable (combinación 1 10 de HA) de rhEPO que presentaba N-glicanos de tipo alta manosa (combinaciones 2 y 3 de HA). La combinación 1 de HA contenía aproximadamente un 90,40 % de N-glicanos bisialilados (la forma de N-glicano deseada) y menos de un 3,5 % de N-glicanos neutros. Por el contrario, la elución en gradiente lineal de de fosfato sódico de 0 a 100 mM mostraba que las últimas fracciones de elución (combinaciones 2 y 3 de HA) contenían N-glicanos de tipo alta manosa y aumentaban la actividad de unión cruzada a anticuerpo anti-HCA en transferencias de Western. Thesto se
15 puede observar en el análisis de N-glicano por HPLC y transferencias de Western de geles de SDS-PAGE al 4-20 % mostrados en la Figura 26.
También se sometió a ensayo la cromatografía en columna usando las resinas aniónicas Q SEPHAROSE FF o Source 30Q. Las combinaciones 1-3 de HA se combinaron y se dializaron frente a acetato de Na 50 mM, pH 5,0 20 durante una noche a 4 ºC. La muestra dializada se aplicó a la columna y se aplicó un gradiente lineal de 10 CV de NaCl de 0 a 750 mM con rhEPO eluyendo con NaCl entre 350 y 500 mM para proporcionar la rhEPO. La Figura 27A muestra un ejemplo de una purificación con Q SEPHAROSE FF de rhEPO. Los datos mostraban que todos los glicanos de tipo alta manosa (Man6,7,8,9, > 9, en su mayoría resistente a α 1,2 manosidasa) que muestran una actividad de unión cruzada correspondiente más elevada no se unían a las resinas de intercambio aniónico cuando
25 el material unido y sin unir se analizaba en un ELISA de sándwich (Figura 27B). La Tabla 1 muestra los resultados del análisis de HPLC del contenido de N-glicano de la rhEPO en la fracción unida (combinación 1 de Q SEPHAROSE FF) y la fracción de flujo continuo(Flujo Continuo de Q SEPHAROSE FF). La Tabla 2 muestra el contenido de N-glicano de los N-glicanos neutros mostrados en la Tabla 1.
Tabla 1
Q Sepharose FF Análisis por HPLC de Purificación de NGlicano de rhEPO
Muestra
% Neutro % Mono Sialilado % Bi Sialilado
Entrada (combinaciones de HA)
11,04 13,66 75,30
Combinación de 1 Q SEPHAROSE FF
3,01 6,47 90,52
Flujo Continuo de Q SEPHAROSE FF
26,71 21,19 52,10
Tabla 2
Q Sepharose FF Purificación de rhEPO % de Perfil de NGlicano Neutro
Muestra
% G2 % Man5 % Man68 % Man9
Entrada (combinaciones de HA)
3,1 2,8 2,4 2,74
Combinación de 1 Q SEPHAROSE FF
3,01 ND ND ND
Flujo Continuo de Q SEPHAROSE FF
4,2 8,0 3,9 10,61
ND - no detectado G2 - estructura de N-glicano es Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2
Las figuras y las tablas muestran que la rhEPO con actividad de unión cruzada indetectable a anticuerpos anti-HCA y buena calidad de proteína y glicano por lo tanto se puede unir/eluir de resinas de intercambio aniónico. Estos datos también sugieren que la familia de genes fúngicos implicados en la biosíntesis de oligomanósidos unidos en β-1,2
35 (BMT1, BMT2, BMT3, BMT4) era responsable de las impurezas de unión cruzada de bajo nivel en las preparaciones de rhEPO.
Por lo tanto, cuando se visualizan como un conjunto, los resultados sugieren que la actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA no era específica para rhEPO pero se debía a N-glicanos resistentes a α-1,2-manosidasa en
las glicoproteínas. YGLY3159 se había generado por supresión genética de cinco genes de glicosilación endógenos y por introducción de 15 genes heterólogos. YGLY3159 es la cepa de supresión genética de bmt2∆. Los estudios de espectroscopía de RMN sugieren que las cepas con supresión genética de bmt2∆ pueden producir glicoproteínas con cantidades variables de residual N-glicanos de β-1,2-manosa. Dado que YGLY3159 es bmt2∆, se postuló que
5 BMT1 y BMT3 eran responsables del bajo nivel residual de transferencia de β-1,2-manosa en los N-glicanos de núcleo.
Aunque una combinación de etapas de cromatografía para purificar la rhEPO puede producir preparaciones de rhEPO libres de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos anti-HCA, en particular podría ser deseable 10 modificar genéticamente las cepas hospedadoras de P. pastoris para reducir o eliminar la actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos anti-HCA en las cepas. Esto reduce al mínimo el riesgo de posible contaminación de las preparaciones de rhEPO con actividad de unión cruzada debido a la variabilidad durante la purificación. Además, dado que cada etapa de purificación puede dar como resultado una pérdida de rhEPO, las cepas de P. pastoris modificadas genéticamente pueden reducir el número de etapas de purificación y por lo tanto reducir la cantidad de
15 rhEPO perdida durante las etapas eliminadas. Por lo tanto, se hizo una deleción o interrupción en serie de la expresión de los cuatro genes BMT para identificar cepas que no produjeran actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos anti-HCA.
EJEMPLO 7
20 Para reducir la presencia de N-glicanos de tipo manosa unidos en β a niveles indetectables, los genes BMT1 y BMT4 se interrumpieron y la rhEPO se analizó para la presencia de N-glicanos resistentes a α-1,2-manosidasa.
Las cepas YGLY6661 e YGLY7013 se construyeron como se describe en el Ejemplo 2 y se analizaron para la
25 presencia de N-glicanos resistentes a α-1,2-manosidasa usando anticuerpos anti-HCA. La cepa YGLY7013 era bmt2∆ y bmt4∆ y la cepa YGLY6661 era bmt2∆, bmt4∆ y bmt1∆. La rhEPO producida a partir de las cepas se sometieron a cromatografía de Azul SEPHAROSE 6 FF y las alícuotas de la combinación de captura con Azul SEPHAROSE 6 FF se trataron con PNGasa F vel non. Las alícuotas tratadas y sin tratar se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE, los geles se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y las membranas se
30 sondearon con anticuerpo anti-EPO o anticuerpos anti-HCA. La Figura 28 muestra que, en transferencias de Western de geles de SDS-PAGE al 4-20 % de alícuotas de combinaciones de captura de Azul SEPHAROSE 6 FF que producían rhEPO en cualquier cepa, aún producían N-glicanos resistentes a α-1,2-manosidasa que reaccionaban de forma cruzada con anticuerpos anti-HCA. La Tablas 3 y 4 muestran la distribución de especies de N-glicano en rhEPO en combinaciones de captura de Azul Sepaharose 6 FF tanto de cultivos de fermentación como
35 de SixFors. Como se muestra en las tablas, ambas cepas producían una cantidad sustancial de N-glicanos neutros de los cuales,1 parte de la resistencia a la digestión de α1,2-mannosidasa in vitro.
Tabla 3
Semana 44 - rhEPO - Combinación de Captura de Azul SEPHAROSE 6 FF - Fermentación
Combinaciones
% BiSialilado % Mono Sialilado % Neutro % Neutro
% G2
% M5 % M6-M8 % M9+
F074411
52,98 34,08 12,94 1,7 2,63 3,65 4,96
(YGLY6661)
F074411 (YGLY6661) α1,2 Manosidasa
53,42 34,32 12,26 1,9 5,05 3,4 1,91
F074410 (YGLY7013)
25,10 47,00 27,90 12,99 2,22 5,67 7,02
F074410 (YGLY7013) α1,2 Manosidasa
26,34 49,03 26,34 13,14 5,39 4,68 1,42
G2 - N-glicanos de Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 M6-M8 - N-glicanos de Man6GlcNAc2 a Man8GlcNAc2 M9+ - N-glicanos de Man9GlcNAc2 y de mayor tamaño
Tabla 4
Semana 41 - rhEPO - Combinación de Captura de Azul SEPHAROSE 6 FF - SixFors
Combinaciones
% BiSialilado % Mono Sialilado % Neutro % Neutro
% G2
% M5 % M6-M8 % M9 % M9+
X074128 (YGLY6661)
43,49 39,24 17,27 1,7 7,8 6,69 0,45 0,63
X074128 (YGLY6661) α1,2 Manosidasa
42,52 39,26 18,22 1,2 11,84 5,02 0,1 0,06
X074131 (YGLY7013)
66,90 18,83 14,27 1,84 8,36 2,82 0,66 0,59
X074131 (YGLY7013) α1,2 Manosidasa
64,81 19,70 15,49 1,06 13,1 0,77 0,56 0
G2 - N-glicanos de Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 M6-M8 - N-glicanos de Man6GlcNAc2 a MangGlcNAc2 M9 - N-glicanos de Man9GlcNAc2 M9+ - N-glicanos de Man9GlcNAc2 y de tamaño superior
Un ELISA de sándwich de rhEPO en las combinaciones de captura de Azul SEPHAROSE 6 FF preparadas a partir de ambas cepas en comparación con YGLY3159 mostraba que ambas cepas tenían actividad de unión cruzada a anticuerpo anti-HCA (Figura 29). La purificación adicional de la rhEPO mediante cromatografía de hidroxiapatita 5 (HA) y el análisis de las muestras mediante ELISA de sándwich mostraba que la combinación 1 de HA que contenía rhEPO producida a partir de YGLY6661 (bmt2∆, bmt4∆ y bmt1∆) parecía carecer de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpo anti-HCA pero que la rhEPO producida en YGLY7013 (bmt2∆ y bmt4∆) todavía tenía actividad de unión cruzada detectable a anticuerpo anti-HCA (Figura 30). Los resultados sugerían que la deleción de los genes BMT2 y BMT1 no era suficiente para retirar toda la actividad de unión cruzada detectable. Los resultados 10 también muestran que la cromatografía de hidroxiapatita puede eliminar la actividad de unión cruzada detectable en la combinación 1 de HA. La Figura 31 es una transferencia de Western de geles de SDS-PAGE al 4-20 % que muestran que rhEPO en otra combinación de captura de Azul SEPHAROSE 6 FF preparada a partir de la cepa YGLY6661 continuaba teniendo actividad de unión cruzada a anticuerpo anti-HCA y que la actividad y unión cruzada aún se podría hacer indetectable mediante desglicosilación de la rhEPO. El resultado indicaba que para producir
15 rhEPO que no tenía actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA detectable, era necesario que la expresión del gen BMT3 se anulara mediante interrupción o deleción.
EJEMPLO 8
20 Para conseguir de forma más eficaz la eliminación de los glicanos de tipo manosa unidos en β detectable, se interrumpieron los cuatro genes BMT implicados en la ruta de manosiltransferasa. Las cepas YGLY73617366 e YGLY73937398 (Ejemplo 2) se evaluaron para su capacidad para producir rhEPO carente de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpo anti-HCA.
25 Diversas cepas de YGLY73617366 e YGLY73937398 en las que se interrumpieron los cuatro genes BMT implicados en la ruta de β-manosiltransferasa se cultivaron en fermentadores SixFors de 500 ml y a continuación se procesaron para rhEPO a través de combinaciones de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul). Las alícuotas de las combinaciones de Azul se analizaron por SDS-PAGE al 4-20 %. La Figura 32 muestra geles de SDS-PAGE al 4-20 % teñidos con azul de Commassie de las combinaciones de Azul de las diversas cepas con y sin
30 tratamiento con PNGasa F. Los geles muestran que todas de las cuatro cepas sometidas a ensayo producían rhEPO glicosilada. Varias de las cepas se evaluaron para actividad de unión cruzada a anticuerpo anti-HCA mediante ELISA de sándwich. La Figura 33 muestra que la mayoría de las cepas carecían de actividad de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpo anti-HCA. Sin embargo, las cepas YGLY7363 e YGLY7365 tenían actividad de unión cruzada detectable a anticuerpo anti-HCA. La reconfirmación de YGLY7365 por PCR indicaba que esta cepa
35 no tenía una supresión genética completa del gen BMT3, lo que explica la unión relativamente elevada observada con el anticuerpo anti-HCA presente en el ELISA (Figura 33). El análisis de N-glicano por HPLC de las cepas YGLY73617366 se muestra en la Tabla 5 y las cepas YGLY73937398 se muestran en la Tabla 6. Los datos en las tablas se presentan gráficamente en la Figura 34.
Tabla 5
Semana 46a - SixFors - cepas ∆bmt1-4 - combinaciones de Azul
Combinaciones
% BiSialilado % Mono Si lil d % N % Neutro
% G2
% M5 % M6-M8 % M9+
X074613 (YGLY7361)
22,10 47,83 30,07 13,85 2,53 6,77 6,92
X074613 (YGLY7361) α1,2 Manosidasa
21,55 48,18 30,27 13,68 4,53 5,47 6,59
X074614 (YGLY7362)
67,36 24,69 7,95 0,6 4,36 2,8 0,19
X074614 (YGLY7362) α1,2 Manosidasa
66,21 25,25 8,54 1,1 6,7 0,68 0,06
*X074615 (YGLY7363)
49,40 39,17 11,43 0,8 4,42 5,91 0,3
X074615 (YGLY7363) α1,2 Manosidasa
48,52 39,20 12,28 0,4 7,2 4,68 ND
X074616 (YGLY7366)
55,99 33,85 10,16 0,8 3,73 4,94 0,69
X074616 (YGLY7366) α1,2 Manosidasa
55,44 34,24 10,32 1,9 7,2 1,02 0,2
*X074617 (YGLY7365)
43,22 42,10 14,68 5,37 5,88 3,03 0,4
X074617 (YGLY7365) α1,2 Manosidasa
42,70 42,40 14,90 4,5 8,4 2,0 ND
X074618 (YGLY7364)
48,18 38,44 13,38 0,7 6,56 5,76 0,36
X074618 (YGLY7364) α1,2 Manosidasa
47,52 39,75 12,73 0,4 6,74 5,09 0,5
G2 - N-glicanos de Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 M6-M8 - N-glicanos de Man6GlcNAc2 a MangGlcNAc2 M9+ - N-glicanos de Man9GlcNAc2 y de tamaño superior
*Presentaban actividad de unión cruzada anticuerpo anti-HCA
Tabla 6
Semana 46a - SixFors - cepas ∆bmt1-4 - combinaciones de Azul
Combinaciones
% BiSialilado % Mono Si lil d % N % Neutro
% G2
% M5 % M6-M8 % M9 % Híb
X074637 (YGLY7393)
51,04 35,45 13,51 2,3 6,4 1,41 1,2 2,2
X074637 (YGLY7393) α1,2 Manosidasa
50,33 35,44 14,23 2,5 9,14 ND ND 2,54
X074638 (YGLY7394)
63,56 25,65 10,79 1,1 6,6 1,9 0,4 0,79
X074638 (YGLY7396) α1,2 Manosidasa
62,88 25,75 11,37 1,2 8,96 ND ND 1,21
X074639 (YGLY7395)
56,05 31,43 12,52 1,9 5,1 2,2 1,9 1,4
X074639 (YGLY7395) α1,2 Manosidasa
56,27 31,81 11,92 1,9 8,43 ND ND 1,59
X074640 (YGLY7396)
50,42 36,71 12,87 3,2 6,7 1,27 0,3 1,4
X074640 (YGLY7396) α1,2 Manosidasa
49,94 36,86 13,20 3,2 8,12 ND ND 1,88
X074641 (YGLY7397)
49,32 36,07 14,61 2,6 7,0 2,4 0,5 2,11
X074641 (YGLY7398) α1,2 Manosidasa
48,72 35,86 15,42 2,7 10,24 ND ND 2,48
X074642 (YGLY7398)
65,74 22,61 11,65 0,8 7,7 1,97 0,43 3,71
X074642 (YGLY7398)
64,99 22,87 12,14 1,0 10,02 ND ND 1,12
α1,2 Manosidasa
G2 - N-glicanos de Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 M6-M8 - N-glicanos de Man6GlcNAc2 a Man8GlcNAc2 M9 - N-glicanos de Man9GlcNAc2 M9+ - N-glicanos de Man9GlcNAc2 y de tamaño superior Híb - N-glicanos híbridos
Las cepas YGLY7362, 7366, 7396 y 7398 se cultivaron en fermentadores de 3 l y se procesaron a través de cromatografía de Azul Sepaharose 6 FF seguido de cromatografía de hidroxiapatita (HA). Las alícuotas tanto de las combinaciones de Azul como de las combinaciones de HA se redujeron y se analizaron por SDS-PAGE al 4-20 %. 5 Las combinaciones correspondientes para YGLY3159 se incluyeron como controles positivos. La Figura 35A muestra un SDS-PAGE al 4-20 % teñido con azul de Commassie que muestra que tanto las combinaciones de Azul (mitad izquierda del gel) como las combinaciones de HA (mitad derecha del gel) producían rhEPO. La Figura 35B muestra una transferencia de Western de las mismas muestras sondeadas con anticuerpos anti-HCA. Ninguna de las cepas sometidas a ensayo presentaba actividad alguna de unión cruzada detectable a anticuerpos anti-HCA en
10 cualquiera de la combinación de Azul o la combinación 1 de HA.
La Figura 36 analiza la combinación de Azul y la combinación 1 de HA para rhEPO aislada de cultivos de SixFors de 500 ml de YGLY7398 para la actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA. El panel que se encuentra en la parte más a la derecha muestra una transferencia de Western sondeada con otra preparación de anti-HCA: conejo
15 policlonal GiF2::6316. Este anticuerpo producía los mismos resultados que los producidos usando el anticuerpo F072208-S, que se había usado para producir los ELISA y las transferencias de Western que se muestran en el presente documento. El anticuerpo 6316 muestra que la actividad de unión cruzada no es específica de anticuerpo.
Estos resultados muestran que la deleción o la interrupción de los cuatro genes BMT puede dar como resultado
20 cepas que no producen la actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos anti-HCA en cualquiera de la rhEPO después de en la etapa de captura preliminar de Azul SEPHAROSE 6 FF o la etapa intermedia de hidroxiapatita usando hidroxiapatita 40 µM de Tipo I. Estas cepas minimizan el riesgo de que se produzcan preparaciones de rhEPO que contengan actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA. Esto permite la producción de rhEPO con menos riesgo de inducción de una respuesta inmunológica adversa en el individuo que recibe la rhEPO.
25 EJEMPLO 9
Una comparación de la farmacocinética de la rhEPO producida en las cepas producidas en el Ejemplo 2 con los cuatro genes BMT interrumpidos o con deleción y PEGilados se comparó con la rhEPO PEGilada producida a partir 30 de la cepa YGLY3159. La comparación mostraba que la EPO PEGilada presentaba una reducción de la semivida in vivo y menor potencia in vivo (Véanse las Tablas 7 y 8). La rhEPO producida en las cepas producidas en el Ejemplo 2 sin actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos anti-HCA tenía una farmacocinética por lo general similar a la de EPOGEN y no la farmacocinética más elevada de ARANESP. Se encontró que la farmacocinética reducida era una función de la cantidad de N-glicanos biantenarios bisialilados. Los niveles más elevados de N-glicano
35 biantenarios bisialilados en la rhEPO se correlacionaron con una farmacocinética más elevada. Estos resultados son coherentes con los datos publicados que muestran que la semivida más larga se correlaciona con un contenido más elevado de ácido siálico en la eritropoyetina humana recombinante producida en células CHO (Egrie et al., Exp. Hematol. 31: 290-299 (2003)).
Tabla 7
PK de rhEPO de YGLY3159 (CBA) a YGLY7398 (sin CBA)
YGLY3159
YGLY7398
T1/2 (h)
20,9 ± 2 13 ± 2
CBA – actividad de unión cruzada
Tabla 8
Fuente de rhEPO
Potencia Relativa (Producción de Reticulocitos) Intervalo de Confianza de un 95 %
YGLY3159 a YGLY7398
0,82 (0,68, 1,00)
EJEMPLO 10
5 Para conseguir de forma eficaz la eliminación de glicanos de tipo manosa unidos en β detectable y producir una cepa que produzca rhEPO con una farmacocinética más elevada, las cepas YGLY71137122 descritas en el Ejemplo 3 se prepararon y se evaluaron por su capacidad para producir rhEPO carente de actividad de unión cruzada detectable a anticuerpo anti-HCA. Estas cepas se modificaron para que también expresaron EPO madura humana como una proteína de fusión fusionada a la secuencia líder de lisozima de pollo. Por lo tanto, estas cepas
10 expresan tanto EPO madura humana fusionada con el péptido señal αMATpre de S. cerevisiae como la EPO madura humana como una proteína de fusión fusionada a la secuencia líder de lisozima de pollo.
Diversas cepas YGLY7113YGLY7122 en las que los cuatro genes BMT implicados en la ruta de βmanosiltransferasa se interrumpieron y se expresaron cultivados en fermentadores SixFors de 500 ml y a 15 continuación se procesaron para rhEPO a través de combinaciones de Azul SEPHAROSE 6 FF (combinaciones de Azul). Las alícuotas de las combinaciones de Azul para varias cepas se analizaron por ELISA de sándwich usando anticuerpos anti-HCA. La Figura 37 muestra que YGLY7118 presentaba una actividad de unión cruzada a anticuerpo anti-HCA muy baja pero las demás cepas no presentaban actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos anti-HCA. El análisis de N-glicano por HPLC de las cepas YGLY71137117 se muestra en la Tabla 9 y
20 las cepas YGLY71187122 se muestra en la Tabla 10. Las tablas se presentan gráficamente en la Figura 38.
Tabla 9
Semana 48 - SixFors - cepas ∆bmt1-4 - combinaciones de Azul
Combinaciones
% Bi-Sialilado % Mono Sialilado % Neutro % Neutro
% G2
% M5 % M6-M8 % M9 % Híb
X074814 (YGLY7113)
70,23 9,97 19,80 0,2 9,2 6,85 2,05 1,5
X074814 (YGLY7113) α1,2 Manosidasa
68,96 10,56 20,48 0,3 18,4 ND ND 1,78
X074815 (YGLY7115)
62,61 14,01 23,38 0,5 7,15 10,37 3,96 1,4
X074815 (YGLY7115) α1,2 Manosidasa
61,77 13,95 24,28 0,1 22,22 ND ND 1,96
X074816 (YGLY7114)
67,64 8,22 24,14 0,2 4,2 11,41 6,33 2,0
X074816 (YGLY7114) α1,2 Manosidasa
65,92 8,32 25,76 0,2 23,35 ND ND 2,21
X074817 (YGLY7116)
66,46 8,06 25,48 4,73 5,38 6,94 7,23 1,2
X074817 (YGLY7116) α1,2 Manosidasa
65,54 8,69 25,77 0,5 23,8 ND ND 1,47
X074818 (YGLY7117)
70,06 11,09 18,85 0,6 8,59 6,0 2,21 1,45
X074818 (YGLY7117) α1,2 Manosidasa
68,67 11,42 19,91 0,4 17,5 ND ND 2,01
G2 - N-glicanos de Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 M6-M8 - N-glicanos de Man6GlcNAc2 a Man8GlcNAc2 M9 - N-glicanos de Man9GlcNAc2 M9+ - N-glicanos de Man9GlcNAc2 y de tamaño superior Híb - N-glicanos híbridos
Tabla 10
Semana 48 - SixFors – cepas de ∆bmt1-4 – combinaciones de Azul
Combinaciones
% Bi-Si lil d % Mono Si lil d % Neutro % Neutro
% G2
% M5 % M6-M8 % M9 % Híb
X074819 (YGLY7119)
58,12 27,10 14,78 0,7 6,83 4,98 1,17 1,1
X074819 (YGLY7119) α1,2 Manosidasa
57,03 26,87 16,10 0,45 14,55 ND ND 1,1
X074820 (YGLY7120)
73,60 10,84 15,56 0,89 8,6 3,75 1,64 0,68
X074820 (YGLY7120) α1,2 Manosidasa
72,43 11,13 16,44 0,7 15,63 ND ND 0,11
X074821 (YGLY7121)
59,41 19,85 20,74 0,8 3,04 10,7 5,55 0,65
X074821 (YGLY7121) α1,2 Manosidasa
58,39 20,00 21,6 0,4 20,17 ND ND 1,04
X074822 (YGLY7122)
57,43 24,16 18,41 1,37 10,89 4,95 0,4 0,8
X074822 (YGLY7122) α1,2 Manosidasa
55,77 24,44 19,79 1,8 17,28 ND ND 0,71
X074824 (YGLY7118)
55,56 21,47 22,97 0,33 2,98 11,85 6,59 1,22
X074824 (YGLY7118) α1,2 Manosidasa
54,68 21,67 23,65 0,4 22,5 ND ND 0,75
G2 - N-glicanos de Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 M6-M8 - N-glicanos de Man6GlcNAc2 a Man8GlcNAc2 M9 - N-glicanos de Man9GlcNAc2 M9+ - N-glicanos de Man9GlcNAc2 y de tamaño superior Híb - N-glicanos híbridos
Las cepas YGLY7115, 7117 y 7120 se cultivaron en fermentadores de 3 l y se procesaron a través de Azul SEPHAROSE 6 FF cromatografía seguido de cromatografía de hidroxiapatita (HA). Las alícuotas tanto de las 5 combinaciones de Azul como de las combinaciones de HA se redujeron y se analizaron por SDS-PAGE al 4-20 %. Las combinaciones correspondientes para YGLY3159 se incluyeron como controles positivos. Las combinaciones correspondientes para YGLY7395 se incluyeron como controles negativos. La Figura 39A muestra un SDS-PAGE al 4-20 % teñido con azul de Commassie que muestra que tanto las combinaciones de Azul (mitad izquierda del gel) como las combinaciones de HA (mitad derecha del gel) que producen rhEPO. La Figura 39B muestra una
10 transferencia de Western de las mismas muestras sondeadas con anticuerpos anti-HCA. Ninguna de las cepas sometidas a ensayo presentaba actividad alguna de unión cruzada detectable a anticuerpos anti-HCA en cualquiera de la combinación de Azul o la combinación 1 de HA.
Estos resultados también muestran que la deleción o la interrupción de los cuatro genes BMT puede dar como 15 resultado cepas que no producen la actividad de unión cruzada detectable a anticuerpos anti-HCA en cualquiera de
la rhEPO después de la etapa preliminar de captura de Azul SEPHAROSE 6 FF o la etapa intermedia de hidroxiapatita usando hidroxiapatita 40 µM de Tipo I. Estas cepas minimizan el riesgo de que se realicen preparaciones de rhEPO que contengan actividad de unión cruzada a anticuerpos anti-HCA. Esto permite la producción de rhEPO con menos riesgo de inducción de una respuesta inmunológica adversa en el individuo que
5 recibe la rhEPO.
EJEMPLO 11
Las combinaciones de azul que contienen rhEPO producida por YGLY7117 se sometieron adicionalmente a
10 cromatografía en columna de hidroxiapatita y la rhEPO en las combinaciones de HA se analizaron para contenido de sialilación. La Figura 40A y la Figura 40B muestran trazas por HPLC de los N-glicanos de la rhEPO producida en YGLY3159 en comparación con los N-glicanos de la rhEPO producida en YGLY7117, respectivamente. Las figuras también muestran que la columna de hidroxiapatita retiraba contaminantes adicionales; por lo tanto, en este análisis, el contenido de sialilación de la rhEPO producida por YGLY7117 era de aproximadamente un 99 % (los N-glicanos
15 neutros eran aproximadamente un 1 %) de los que aproximadamente un 89 % era A2 o bisialilado y aproximadamente un 10 % era A1 o monosialilado.
El análisis de sialilación de rhEPO producido en YGLY7117 después de la PEGilación de acuerdo con el proceso en el Ejemplo 3 era similar a la cantidad de sialilación antes de la PEGilación; sin embargo, la cantidad de sialilación 20 puede variar hasta un punto limitado dependiendo por ejemplo, de qué modificaciones se realizaron para las condiciones de crecimiento, por ejemplo, composiciones del medio, tasa de alimentación, etc (Véase la Tabla 11). Por lo tanto, los métodos en el presente documento producen composiciones de rhEPO que tienen una sialilación de A2 de al menos aproximadamente un 75 % o una sialilación de A2 entre aproximadamente un 75 % y un 89 %. Por lo tanto, el contenido de ácido siálico total es al menos de 4,5 moles de ácido siálico por mol de rhEPO, de forma
25 más específica, de aproximadamente 4,6 a 5,7 moles de ácido siálico por mol de rhEPO.
Tabla 11
BPP (2000 l) (n = 3)
FPP (800 l) (n = 2) Avecia (15 l) (n = 2) Avecia (100 l) (n = 1)
Pureza por SDS PAGE (relacionada con EPO) (≥ 95, 0 %)
99,5 ± 0,4 % 99,4 ± 0,0 % 99,4 ± 0,1 % 99,4 %
Integridad por SDS PAGE (Mono-PEG) (≥ 80,0 %)
96,8 ± 0,7 % 96,0 ± 2,2 % 95,2 ± 2,0 % 97,7 %
Ácido siálico total (≥ 4,5 mol de SA / mol de proteína)
5,0-5,7 4,6-4,7 5,1-5,2 5,2
Glicano unido a N por CE (70-85 % de A2)
75,2-80,2 % 74,2-77,8 % 80,9-88,7 % 83,9 %
A2 - bi-sialilado CE - electroforesis por capilaridad SA - ácido siálico BPP- Planta Piloto Biológica FPP -Planta Piloto de Fermentación
Una comparación de la farmacocinética de la rhEPO producida en la cepa YGLY7117 producida en el Ejemplo 3 con los cuatro genes BMT interrumpidos o sometidos a deleción y PEGilados se comparó con la rhEPO PEGilada
30 producida a partir de la cepa YGLY3159. La comparación mostraba que la rhEPO PEGilada producida en la cepa YGLY7117 presentaba una semivida in vivo y potencia in vivo similares a las de YGLY3159 y ARANESP (Véanse las Tablas 12 y 13).
Tabla 12
PK de rhEPO de YGLY3159 (CBA) a YGLY7117 (sin CBA)
YGLY3159
YGLY7117
T1/2 (h)
20,9 ± 2 20,6 ± 4
CBA - actividad de unión cruzada
Tabla 13
Fuente de rhEPO
Potencia Relativa (Producción de Reticulocitos) Intervalo de Confianza de un 95 %
YGLY3159 a YGLY7117
0,94 (0,77, 1,14)
SECUENCIAS
Las secuencias que se usaron para producir algunas de las cepas desveladas en los Ejemplos 1-11 se proporcionan en la Tabla 14.
Tabla 14
SEQ
Descripción Secuencia
ID
NO:
1
gen de invertasa
de S. cerevisiae
(ScSUC2)
2
invertasa de
S. cerevisiae
(ScSUC2)
3
gen transportador de
UDP-GlcNAc de K.
lactis (KIMNN2-2)
4
transportador de UDP-GlcNAc de K. lactis (KIMNN2-2)
5
ADN codifica líder de Mnn2 (53)
6
líder de Mnn2 (53)
7
ADN codifica líder de Mnn2 (54) Los últimos 9 nucleótidos son el conector que contiene el sitio de restricción de AscI)
8
líder de Mnn2 (54)
9
ADN codifica secuencia pre señal del Factor de Acoplamiento a S. cerevisiae
10
secuencia pre señal del Factor de Acoplamiento a S. cerevisiae
11
ADN codifica Pp SEC12 (10) Los últimos 9 nucleótidos son el conector que contiene el sitio de restricción de AscI usado para fusión a proteínas de interés.
12
Pp SEC12 (10)
13
ADN codifica
ScMnt1 (Kre2) (33)
14
ScMnt1 (Kre2) (33)
15
ADN codifica ScSEC12 (8) Los últimos 9 nucleótidos son el conector que contiene el sitio de restricción de AscI usado para fusión a proteínas de interés
16
ScSEC12 (8)
17
ADN codifica transportador de MmSLC35 A3 UDP- GlcNAc
18
transportador de MmSLC35 A3 UDP- GlcNAc
19
ADN codifica DmUGT
20
DmUGT
21
ADN codifica
ScGAL10
22
ScGa110
23
hGalT optimizado por codón (XB)
24
domicilio catalítico de hGalT I (XB)
25
ADN codifica dominio catalítico de GnTI humano (NA) Optimizado por codón
26
dominio catalítico de
GnT I humano (NA)
27
ADN codifica dominio
catalítico de Mm ManI
(FB)
28
dominio catalítico de
Mm ManI (FB)
31
ADN codifica Rat
GnT II (TC)
Optimizado por codón
32
Rat GnTII (TC)
33
ADN codifica ManII
de Drosophila melanogaster optimizado por codón (KD)
34
dominio catalítico de
ManII de Drosophila
melanogaster (KD)
35
Transportador de CMP-ácido siálico de
ratón (MmCST) Optimizado por codón
36
transportador de
CMP-ácido siálico de
ratón (MmCST)
37
2-epimerasa/ N- acetilmanosamina
quinasa Humana (HsGNE) de UDP-GlcNAc optimizada por codón
38
2-epimerasa/ Nacetilmanosamina
quinasa UDP-GlcNAc Humana (HsGNE)
39
CMP-ácido siálico sintasa Humana (HsCSS) optimizada por codón
40
CMP-ácido siálico sintasa Humana (HsCSS)
41
N-acetilneuraminato- 9-fosfato sintasa Humana (HsSPS) optimizada por codón
42
N-acetilneuraminato- 9-fosfato sintasa Humana (HsSPS)
43
dominio catalítico de alfa-2,6-sialil transferasa de ratón (MmmST6 ) optimizado por codón
44
dominio catalítico de alfa-2,6-sialil transferasa de ratón (MmmST6 )
45
Secuencia del promotor de PpPMA1:
46
Secuencia del terminador de PpPMA1:
47
Secuencia del promotor de PpOCH1:
48
Secuencia del terminador de PpALG12:
49
Secuencia del promotor de PpSEC4:
50
Secuencia del terminador de PpOCH1:
51
Secuencia del promotor de PpTEF1
52
Secuencia del terminador de PpTEF1:
53
Secuencia del promotor de PpGAPDH:
54
Secuencia del terminador de PpALG3:
55
Secuencia del promotor de PpAOX 1 y locus de integración:
56
Secuencia del
terminador de ScCYC1:
57
Secuencia del promotor de ScTEF1:
58
Secuencia del ORF Sh ble (marcador de resistencia a Zeocina):
59
Secuencia de la Región en la posición 5’ usada para supresión genética de PpURA5:
60
Secuencia de la Región en la posición 3’ usada para supresión genética de PpURA5:
61
Secuencia del
marcador auxotrófico
de PpURA5:
62
Secuencia de la parte
del gen Ec lacZ
que se usó para
la construcción del
PpURA5 blaster
(marcador auxotrófico
reciclable)
63
Secuencia de
aminoácidos de
PpURA5
64
Secuencia de la
Región en la posición 5’ usada para supresión genética de PpOCH1:
66
Secuencia de la
Región en la posición 5’ usada para supresión genética de PpBMT2:
67
Secuencia de la
Región en la posición 3’ usada para supresión genética de PpBMT2:
68
Secuencia de la
Región en la posición 5’ usada para supresión genética de BMT1
69
Secuencia de la
Región en la posición 3’ usada para supresión genética de BMT1
70
Secuencia de la Región en la posición 5’ usada para supresión genética de BMT3
71
Secuencia de la Región en la posición 3’ usada para supresión genética de BMT3
72
Secuencia de la Región en la posición 5’ usada para supresión genética de BMT4
73
Secuencia de la Región en la posición 3’
usada para supresión
genética de BMT4
74
Secuencia de la
Región en la posición 5’ usada para supresión genética de PpPNO1 y PpMNN4:
75
Secuencia de la
Región en la posición 3’ usada para supresión genética de PpPNO1 y PpMNN4:
77
Secuencia de la
Región en la posición 3’ usada para supresión genética de PpMNN4L 1:
78
Secuencia del locus
de integración del gen
PpTRP2:
80
Secuencia de la
Región en la posición 3’ usada para supresión genética de PpARG1:
81
Secuencia del
marcador auxotrófico
de PpARG1:
83
Secuencia de la
Región en la posición 3’ que se usó para adición genética en el locus de PpADE1:
84
MET16 5’
85
MET16 3’
86
Secuencia del
marcador auxotrófico
de PpMET16:
87
Secuencia de la
Región en la posición 5’ usada para supresión genética de PpHIS1:
88
Secuencia de la
Región en la posición 3’ usada para supresión genética de PpHIS1:
90
Secuencia de la
Región en la posición 5’ que se usó para adición genética en el locus de PpPRO1:
91
Secuencia de la
Región en la posición 3’ que se usó para adición genética en el
locus de APPRO1:
92
ADN de hEPO truncado (optimizado por codón)
93
Proteína hEPO truncada
94
ADN señal de lisosoma de pollo (CLSP)
95
péptido señal de
lisosoma de pollo (CLSP)
96
Secuencia del gen PpAde2 sin su promotor pero incluyendo sus secuencias de
terminación
97
PpADE2
98
Pp TRP2: 5’ y ORF
99
región en la posición
3’ de PpTRP2
100
región en la posición
5’ de Pp ADE2
101
región en la posición
3’ de Pp ADE2
102
ORF de NATR
103
ORF de HygR
región de PpPEP4
(incluyendo fragmento de supresión genética cadena arriba, promotor, marco de lectura abierto y fragmento de supresión genética cadena abajo)
105
Promotor de TEF1 de
Ashbya gossypii
106
Secuencia de
terminación de TEF1
de Ashbya gossypi
Listado de secuencias
<110> Bobrowicz, Piotr Gomathinayagam, Sujatha Hamilton, Stephen Li, Huijuan Setheraman, Natarajan Stadheim, Terrance A. Wildt, Stephan
<120> MÉTODO PARA PRODUCIR PROTEÍNAS EN PICHIA PASTORIS QUE CARECEN DE ACTIVIDAD DE UNIÓN CRUZADA DETECTABLE A ANTICUERPOS FRENTE A ANTÍGENOS DE CÉLULA HOSPEDADORA
<130> GFIMIS00002
<150> 61/252,312
<151> 16102009
<160> 106
<170> FastSEQ for Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 3029
<212> ADN
<213> Saccharomyces cerevisiae
<220>
<221> CDS
<222> (909)...(2504)
<223> Codifica invertasa
<400> 1
<210> 2
<211> 532
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 2
<210> 3
<211> 2159 5 <212> ADN
<213> K. lactis
<220>
<221> CDS 10 <222> (1024)...(2007)
<223> Codifica transportador de UDPGlcNAc (KIMNN22)
<400> 3
<210> 4
<211> 328
<212> PRT
<400> 4
10 <210> 5
<211> 108
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Codifica líder de Mnn2 (53)
<400> 5
atgctgctta ccaaaaggtt ttcaaagctg ttcaagctga cgttcatagt tttgatattg tgcgggctgt tcgtcattac aaacaaatac atggatgaga acacgtcg
60 108
5
<210> 6 <211> 36 <212> PRT <213> Secuencia artificial
10
<220> <223> líder de Mnn2 (53)
<400> 6
15 <210> 7
<211> 300
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Codifica líder de Mnn2 (54). Los últimos 9 nucleótidos son el conector que contiene el sitio de restricción de AscI)
<400> 7
<210> 8
<211> 100 30 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> líder de Mnn2 (54).
<400> 8
<210> 9
<211> 57
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica secuencia pre señal del Factor de Acoplamiento a S. cerevisiae
<400> 9 atgagattcc catccatctt cactgctgtt ttgttcgctg cttcttctgc tttggct 57
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia pre señal del Factor de Acoplamiento a S. cerevisiae
<400> 10
<210> 11
<211> 99
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica Pp SEC12 (10)
<400> 11
<210> 12
<211> 33
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Pp SEC12 (10)
<400> 12
<210> 13
<211> 183
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica ScMnt1 (Kre2) (33)
15 <400> 13
<210> 14
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ScMnt1 (Kre2) (33)
<400> 14
<210> 15 30 <211> 318
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 35 <223> Codifica ScSEC12 (8)
<400> 15 <210> 16
<211> 106 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ScSEC12 (8)
<400> 16
<210> 17 15 <211> 981
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220> 20 <221> CDS
<222> (1)...(978)
<223> codifica transportador de UDPGlcNAc de MmSLC35A3
<400> 17
<210> 18
<211> 326
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 18
<210> 19
<211> 1074
<212> ADN 5 <213> Drosophila melanogaster
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1071) 10 <223> Codifica DmUGT
<400> 19
<210> 20
<211> 357
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 20
<210> 21
<211> 2100 5 <212> ADN
<213> Saccharomyces cerevisiea
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)...(2097)
<223> Codifica ScGAL10
<400> 21
<210> 22
<211> 699
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiea
<400> 22
<210> 23
<211> 1068
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica dominio catalítico de hGalT optimizado por codón (XB)
<400> 23
<210> 24
<211> 355
<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio catalítico de hGalT (XB)
20 <400> 24 <210> 25
<211> 1224
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica dominio catalítico de GnTI humano Optimizado por codón (NA)
10 <400> 25 <210> 26
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio catalítico de GnTI humano (NA)
<400> 26 <210> 27
<211> 1407 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica dominio catalítico de Mm ManI (FB)
<400> 27
5
<210> 28
<211> 468
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<223> dominio catalítico de Mm ManI (FB)
<400> 28
15
<210> 29
<211> 1494
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica dominio catalítico de Tr ManI
10 <400> 29
<210> 30
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio catalítico de Tr ManI
<400> 30
<210> 31
<211> 1068 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> codifica GnT II (TC) de Rata Optimizado por codón
<400> 31
15 <210> 32
<211> 355
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> GnT II (TC) de Rata Optimizado por codón
<400> 32
<210> 33
<211> 3105 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica ManII de Drosophila melanogaster optimizado por codón (KD)
<400> 33 <210> 34
<211> 1034 5 <212> PRT 
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ManII de Drosophila melanogaster optimizado por codón (KD)
<400> 34
<210> 35
<211> 1014
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica transportador de CMPácido siálico de Ratón (MmCST) Optimizado por codón
<400> 35
<210> 36
<211> 336
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> transportador de CMPácido siálico de Ratón (MmCST) Optimizado por codón
<400> 36
<210> 37
<211> 2172 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Codifica UDPGlcNAc 2epimerasa/Nacetilmanosamina quinasa Humana (HsGNE) optimizada 10 por codón
<400> 37
<210> 38
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
UDPGlcNAc 2epimerasa/Nacetilmanosamina quinasa Humana (HsGNE) optimizada por 10 codón
<400> 38
<210> 39
<211> 1308 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica CMPácido siálico sintasa Humana (HsCSS) Optimizada por codón
<400> 39
<210> 40
<211> 434
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> CMPácido siálico sintasa Humana (HsCSS) Optimizada por codón
<400> 40
<210> 41
<211> 1080 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica Nacetilneuraminato9fosfato sintasa Humana (HsSPS) Optimizada por codón
<400> 41
<210> 42
<211> 359
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Nacetilneuraminato9fosfato sintasa Humana (HsSPS) Optimizada por codón
<400> 42
<210> 43
<211> 1092 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica dominio catalítico de alfa2,6sialil transferasa de Ratón (MmmST6) Optimizado por 10 codón
<400> 43 <210> 44
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Dominio catalítico de alfa2,6sialil transferasa de Ratón (MmmST6) Optimizado por codón
<400> 44 <210> 45
<211> 1037 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> promotor de PpPMA1
<400> 45 <210> 46
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> terminador de PpPMA1
<400> 46
<210> 47 15 <211> 798
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> promotor de PpOCH1
<400> 47 <210> 48
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> terminador de PpALG12
<400> 48
15 <210> 49
<211> 435
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> promotor de PpSEC4
<400> 49
<210> 50
<211> 404
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> terminador de PpOCH1
<400> 50
<210> 51
<211> 600 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> promotor de PpTEF1
<400> 51
20 <210> 52
<211> 301
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> terminador de PpTEF1
<400> 52
<210> 53
<211> 486
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> promotor de PpGAPDH
<400> 53
<210> 54
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> terminador de PpALG3
<400> 54
20 <210> 55
<211> 934
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> promotor de PpAOX1 y locus de integración
<400> 55
<210> 56
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> terminador de ScCYC1
<400> 56
15 <210> 57
<211> 427
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> promotor de ScTEF1
<400> 57
<210> 58
<211> 375
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica ORF de Sh ble (marcador de resistencia a Zeocina):
<400> 58
<210> 59
<211> 898 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 5’ de PpURA5
<400> 59
20 <210> 60
<211> 1060
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Región en la posición 3’ de PpURA5
<400> 60
<210> 61
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica marcador auxotrófico de PpURA5
<400> 61
15 <210> 62
<211> 709
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Parte del gen Ec lacZ
<400> 62
<210> 63
<211> 222
<212> PRT
<213> Pichia pastoris
<400> 63
<210> 64
<211> 2875
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 5’ de PpOCH1
<400> 64
<210> 65
<211> 997
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 3’ de PpOCH1
<400> 65
5 <210> 66
<211> 870
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> Región en la posición 5’ de PpBMT2
<400> 66
<210> 67
<211> 1733
<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 3’ de PpBMT2
25 <400> 67 <210> 68
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 5’ de PpBMT1
<400> 68
15 <210> 69
<211> 692
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Región en la posición 3’ de PpBMT1
<400> 69
<210> 70
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 5’ de PpBMT3
<400> 70
15 <210> 71
<211> 378
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Región en la posición 3’ de PpBMT3
<400> 71
<210> 72
<211> 1043
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 5’ de PpBMT4
<400> 72
<210> 73
<211> 695
<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 3’ de PpBMT4
20 <400> 73
<210> 74 25 <211> 937
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 30 <223> Región en la posición 5’ de PpPNO1 y PpMNN4
<400> 74
5 <210> 75
<211> 1906
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> Región en la posición 3’ de PpPNO1 y PpMNN4
<400> 75
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> Región en la posición 5’ de PpMNN4L1
<400> 76 <210> 77
<211> 1231 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 3’ de PpMNN4L1
<400> 77
15 <210> 78
<211> 1815
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> locus de integración del gen PpTRP2
<400> 78
<210> 79
<211> 1373 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 5’ de PpARG1
<400> 79 <210> 80
<211> 1470 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 3’ de PpARG1
<400> 80 <210> 81
<211> 1854 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> marcador auxotrófico de PpARG1
<400> 81 <210> 82
<211> 1250 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 5’ de PpADE1
<400> 82 <210> 83
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 3’ de PpADE1
<400> 83
15 <210> 84
<211> 909
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Región en la posición 5’ de MET16
<400> 84
<210> 85
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 3’ de MET16
<400> 85
15 <210> 86
<211> 1796
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> marcador auxotrófico de PpMET16
<400> 86
<210> 87
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 5’ de PpHIS1
<400> 87
15 <210> 88
<211> 1841
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Región en la posición 3’ de PpHIS1
<400> 88
<210> 89
<211> 1729
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> marcador auxotrófico de PpHIS1
15 <400> 89 <210> 90
<211> 1231 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 5’ de PpPRO1
<400> 90 <210> 91
<211> 1425 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Región en la posición 3’ de PpPRO1
<400> 91
<210> 92
<211> 501
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Codifica ADN de hEPO Truncada (Optimizado por codón)
<400> 92
10
<210> 93
<211> 165
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
15
<220>
<223> hEPO Truncada
<400> 93
20
<210> 94
<211> 78
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> codifica péptido señal de lisozima de pollo (CLSP)
<400> 94
<210> 95
<211> 26 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> péptido señal de lisozima de pollo (CLSP)
<400> 95
20 <210> 96
<211> 1892
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Codifica PpAde2
<400> 96
<210> 97
<211> 563
<212> PRT
<213> Pichia pastoris
<400> 97
<210> 98
<211> 1302 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Pp TRP2: 5’ y ORF
<400> 98 <210> 99
<211> 1085 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Pp TRP2: 3’
<400> 99
<210> 100
<211> 1007
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región en la posición 5’ de Pp ADE2
<400> 100
<210> 101 10 <211> 1676
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> región en la posición 3’ de Pp ADE2 3’
<400> 101 <210> 102
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ORF de NATR
<400> 102
15 <210> 103
<211> 1029
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> ORF de HygR
<400> 103
5 <210> 104
<211> 2957
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> región de PpPEP4
<400> 104
<210> 105
<211> 388
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> no 
<400> 105
<210> 106
<211> 247 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia de terminación de TEF1 de Ashbya gossypii
<400> 106

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para producir una glicoproteína recombinante en Pichia pastoris que carece de actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora, que comprende:
    (a)
    proporcionar una célula hospedadora recombinante de Pichia pastoris que no presente ninguna actividad de β-manosiltransferasa 1, 2, 3 y 4 con respecto a un N-glicano u O-glicano, en donde los genes de βmanosiltransferasa 1, 2 y 3 han experimentado deleción o interrupción, incluyendo la célula hospedadora una molécula de ácido nucleico que codifica la glicoproteína recombinante
    (b)
    cultivar la célula hospedadora en un medio en condiciones eficaces para expresar la glicoproteína recombinante; y
    (c)
    recuperar la glicoproteína recombinante del medio para producir la glicoproteína recombinante que carece de actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en el que la actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora se determina en un ELISA de tipo sándwich.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1, en el que la actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora se determina en una transferencia de Western.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 1, en el que la glicoproteína recombinante es una glicoproteína terapéutica.
  5. 5.
    El método de la reivindicación 4, en el que la glicoproteína terapéutica se selecciona entre el grupo que consiste en eritropoyetina (EPO); citoquinas tales como interferón α, interferón β, interferón γ e interferón ω; y factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF); GM-CSF; factores de coagulación tales como factor VIII, factor IX y proteína C humana; antitrombina III; trombina; cadena α de receptor de IgE soluble; inmunoglobulinas tales como IgG, fragmentos de IgG, fusiones de IgG e IgM; inmunoadhesiones y otras proteínas de fusión de Fc tales como proteínas de fusión a receptor de TNF-Fc solubles; proteínas de fusión de RAGE-Fc; interleuquinas; uroquinasa; quimasa; e inhibidor de urea y tripsina; proteína de unión a IGF; factor de crecimiento epidérmico; factor de liberación de hormona de crecimiento; proteína de fusión de anexina V; angiostatina; factor 2 de crecimiento endotelial vascular; factor 1 inhibitorio de precursor mieloide; osteoprotegerina; α-1-antitripsina; α-feto proteínas; DNasa II; kringle 3 de plasminógeno humano; glucocerebrosidasa; proteína 1 de unión del TNF; hormona folículoestimulante; antígeno 4 -Ig asociado a linfocitos T citotóxicos; activador transmembrana y modulador de calcio y ligando de ciclofilina; proteína 1 de tipo glucagón; y agonista de receptores de IL-2.
  6. 6.
    El método de la reivindicación 1, en el que la célula hospedadora está modificada por ingeniería genética para producir glicoproteínas que tengan N-glicanos similares a los humanos.
  7. 7.
    El método de la reivindicación 1, en el que la célula hospedadora está modificada por ingeniería genética para producir glicoproteínas que tengan predominantemente un N-glicano seleccionado entre Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAC2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc(14)Man3GlcNAc2, Gal(14)GlcNAc(14)Man3GlcNAc2 y NANA(14)Gal(14)GlcNAc(14)Man3GlcNAc2.
  8. 8.
    El método de la reivindicación 1 para producir una eritropoyetina humana madura en Pichia pastoris que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad detectable de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora, que comprende:
    (a)
    proporcionar una célula hospedadora recombinante de Pichia pastoris modificada por ingeniería genética para producir N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no presenta ninguna actividad de βmanosiltransferasa 1, 2, 3 y 4 con respecto a un N-glicano u O-glicano, en donde los genes de βmanosiltransferasa 1, 2 y 3 genes han experimentado deleción o interrupción, incluyendo la célula hospedadora dos o más moléculas de ácido nucleico, cada una codificando una proteína de fusión que comprende una eritropoyetina humana madura fusionada con un péptido señal que se dirige al RE y que se retira cuando la proteína de fusión está en el RE;
    (b)
    cultivar la célula hospedadora en un medio en condiciones eficaces para expresar y procesar las proteinas primera y segunda de fusión; y
    (c)
    recuperar la eritropoyetina humana madura del medio para producir la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora.
  9. 9.
    El método de la reivindicación 8, en el que el péptido señal es un péptido señal αMATpre de S. cerevisiae o un péptido señal de lisozima de pollo.
  10. 10.
    El método de la reivindicación 8, en el que al menos una molécula de ácido nucleico codifica una proteína de fusión en donde la eritropoyetina está fusionada con el péptido señal αMATpre de S. cerevisiae y al menos una molécula de ácido nucleico codifica una proteína de fusión, estando la eritropoyetina fusionada con el péptido señal
    αMATpre de S. cerevisiae o un péptido señal de lisozima de pollo.
  11. 11.
    El método de la reivindicación 8, en el que los codones de la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácido nucleico que codifica la eritropoyetina están optimizados para su expresión en Pichia pastoris.
  12. 12.
    El método de la reivindicación 8, en el que la actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora se determina en un ELISA de tipo sándwich.
  13. 13.
    El método de la reivindicación 8, en el que la actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora se determina en una transferencia de Western.
  14. 14.
    El método de la reivindicación 8, en el que la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora del medio, incluye una etapa de cromatografía de intercambio catiónico.
  15. 15.
    El método de la reivindicación 8, en el que la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora del medio, incluye una etapa de cromatografía de hidroxiapatita.
  16. 16.
    El método de la reivindicación 8, en el que la recuperación de la eritropoyetina humana madura que comprende predominantemente N-glicanos biantenarios terminados en ácido siálico y que no tiene actividad de unión cruzada detectable con anticuerpos preparados frente a antígenos de célula hospedadora del medio incluye una etapa de cromatografía de intercambio aniónico.
    SDSPAGE anticuerpo AntiHCAB
    anticuerpo AntihEPO anticuerpo AntiHCA
    anticuerpo AntihEPO anticuerpo AntiHCA
    anticuerpo AntiHCA anticuerpo AntiHCA
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012154329A1 (en) * 2011-04-01 2012-11-15 Ls9, Inc. Methods and compositions for improved production of fatty acids and derivatives thereof
RU2645252C2 (ru) 2012-01-05 2018-02-19 Глюкос Финланд Ой Клетка нитчатых грибов с дефицитом протеаз и способы ее применения
EP2852610B1 (en) 2012-05-23 2018-07-11 Glykos Finland Oy Production of fucosylated glycoproteins
US9708387B2 (en) * 2012-09-11 2017-07-18 Centre For Bioseparation Technology-Vit Methods for producing recombinant factor VIII chains from non-filamentous fungi, their functional reconstitution and applications thereof
US9707276B2 (en) 2012-12-03 2017-07-18 Merck Sharp & Dohme Corp. O-glycosylated carboxy terminal portion (CTP) peptide-based insulin and insulin analogues
US9944689B2 (en) 2013-03-07 2018-04-17 The General Hospital Corporation Human CTLA4 mutants and use thereof
WO2015001049A1 (en) 2013-07-04 2015-01-08 Novartis Ag O-mannosyltransferase deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
SG11201600115SA (en) 2013-07-10 2016-02-26 Novartis Ag Multiple proteases deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
SG11201700446XA (en) 2014-07-21 2017-02-27 Glykos Finland Oy Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
US10329323B2 (en) 2014-07-25 2019-06-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Method for purifying antibodies using PBS
CN104946675A (zh) * 2015-07-02 2015-09-30 江苏敖众生物科技有限公司 一种鸡蛋清溶菌酶基因(rjm)的克隆及其酵母表达方法
CN106957362B (zh) * 2016-01-12 2021-06-18 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法及其应用
JP2021534763A (ja) * 2018-08-21 2021-12-16 クララ フーズ カンパニー 微生物におけるタンパク質のグリコシル化の修飾
EP3927731A4 (en) 2019-02-19 2022-12-28 The Regents of the University of Colorado, a body corporate BISPECIFIC IMMUNOTOXINS FOR TARGETING HUMAN CD25S-CCR4+ TUMORS AND REGULATORY T-CELLS
CN110684771A (zh) * 2019-10-30 2020-01-14 福建师范大学 一种不受甘油和葡萄糖抑制的可诱导启动子及利用该启动子构建的毕赤酵母表达载体
CN113549560B (zh) * 2020-04-24 2024-02-13 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种用于糖蛋白制备的工程化酵母构建方法及其菌株
CN113754739B (zh) * 2020-06-03 2024-07-05 上海君实生物医药科技股份有限公司 一种冠状病毒s蛋白rbd糖蛋白的制备方法及其应用
CN113621041A (zh) * 2021-09-26 2021-11-09 江南大学 一种截短的马铃薯糖蛋白Patatin及其制备方法
CN115873733B (zh) * 2022-07-20 2024-06-25 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种高产溶菌酶的毕赤酵母菌株及其应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US181041A (en) * 1876-08-15 Improvement in cultivators
US4818700A (en) 1985-10-25 1989-04-04 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof
EP1283265B1 (en) 2000-05-17 2009-08-05 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Process for producing protein with reduction of mannose phosphate in the sugar chain and glycoprotein produced thereby
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7863020B2 (en) 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
US8697394B2 (en) * 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
ES2252261T3 (es) 2000-06-28 2006-05-16 Glycofi, Inc. Metodos para producir glicoproteinas modificadas.
US20080124763A1 (en) 2001-04-24 2008-05-29 Erwin Sablon Constructs and methods for expression of recombinant proteins in methylotrophic yeast cells
AU2002335181B2 (en) 2001-10-04 2007-04-05 Sapporo Breweries Limited Method of selecting barley variety, barley beta-amylase gene and process for producing malt alcoholic drink
US7514253B2 (en) 2003-05-16 2009-04-07 Glycofi, Inc. URA5 gene and methods for stable genetic integration in yeast
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
CA2551484C (en) 2003-12-24 2015-03-31 Glycofi, Inc. Methods for eliminating mannosylphosphorylation of glycans in the production of glycoproteins
US7479389B2 (en) 2004-03-02 2009-01-20 Glycofi, Inc. ARG1, ARG2, ARG3, HIS1, HIS2, HIS5, HIS6 genes and methods for stable genetic integration
CN101084233B (zh) * 2004-04-29 2012-08-15 格利科菲公司 用于在糖蛋白产生中减少或消除α-甘露糖苷酶抗性聚糖的方法
DE102004027816A1 (de) 2004-06-08 2006-01-05 Bioceuticals Arzneimittel Ag Verfahren zur Reinigung von Erythropoietin
US7004906B1 (en) 2004-07-26 2006-02-28 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Contrast agent imaging with agent specific ultrasound detection
US8206949B2 (en) * 2005-11-15 2012-06-26 Glycofi, Inc. Production of glycoproteins with reduced O-glycosylation
US20090181041A1 (en) 2006-01-23 2009-07-16 Jan Holgersson Production of proteins carrying oligomannose or human-like glycans in yeast and methods of use thereof
US7851438B2 (en) 2006-05-19 2010-12-14 GlycoFi, Incorporated Erythropoietin compositions
CA2651456A1 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Glycofi, Inc. Recombinant vectors
CN101903531B (zh) 2007-12-19 2013-09-18 格利科菲公司 用于蛋白质生产的酵母菌株

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