ES2590036T3 - Método para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes en células precursoras neurales - Google Patents

Abstract

Un método de inducción de la diferenciación de una célula madre pluripotente en una célula precursora neural, que comprende cultivar la célula madre pluripotente en presencia de un inhibidor de BMP de molécula pequeña y un inhibidor de la familia TGFß de molécula pequeña, en el que el inhibidor de BMP de molécula pequeña es dorsomorfina o LDN-193189, en el que el inhibidor de la familia TGFß de molécula pequeña es SB431542 o A-83-01, en el que la concentración de LDN-193189 es superior a 50 nM.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para inducir la diferenciacion de celulas madre pluripotentes en celulas precursoras neurales Campo tecnico

La presente invention se refiere a un metodo para inducir la diferenciacion de celulas madre pluripotentes en celulas precursoras neurales.

Tambien se describen en el presente documento celulas precursoras neurales inducidas preparadas por el metodo anterior.

Tecnica anterior

Se ha informado de celulas que tienen pluripotencia, tales como celulas madre embrionarias (celulas ES) y celulas madre pluripotentes inducidas (celulas iPS), en las que las celulas iPS pueden obtenerse introduciendo un gen(es) especlfico(s) de celula no diferenciada en celulas somaticas de animales (documentos USP5.843.780 o WO 2007/069666). Por lo tanto, se ha prestado atencion a metodos terapeuticos que comprenden trasplantar celulas neurales, que se obtienen por diferenciacion de celulas madre pluripotentes, metodos que pueden servir de metodos alternativos para tratar enfermedades neurodegenerativas o lesiones nerviosas. Se han desarrollado los siguientes metodos como metodos para inducir la diferenciacion de celulas ES dentro de celulas neurales: (1) un metodo para inducir la diferenciacion produciendo la formation de cuerpos embrioides en medio libre de suero (metodo SFEB) (Watanabe K, et al. Nat Neurosci. 8: 288-96, 2005); (2) un metodo para inducir la diferenciacion cultivando celulas ES sobre celulas del estroma (metodo SDIA) (Kawasaki H, et al. Neuron. 28: 31-40, 2000); y (3) un metodo para anadir un farmaco sobre Matrigel y entonces cultivar (Chambers SM, et al. Nat Biotechnol. 27: 275-80, 2009).

Sin embargo, hay algunos problemas de que las celulas no diferenciadas siguen despues de la induction de la diferenciacion por estos metodos, y, por ejemplo, el uso de citocinas en estos metodos produce un coste muy alto. Por consiguiente, se han desarrollado muchos compuestos de molecula pequena como sustituciones de citocina (documento WO 2008/033408), pero sigue siendo desconocido que compuestos de molecula pequena inducen diferenciacion altamente eficiente dentro de las celulas neurales.

Sumario de la invencion

Es un objetivo de la presente invencion proporcionar un metodo altamente eficiente para inducir la diferenciacion de celulas madre pluripotentes en celulas precursoras neurales usando un compuesto de molecula pequena.

La presente invencion se caracteriza como sigue.

(1) Un metodo de induccion de la diferenciacion de una celula madre pluripotente dentro de una celula precursora neural, que comprende cultivar la celula madre pluripotente en presencia de un inhibidor de BMP de molecula pequena y un inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena, en el que el inhibidor de BMP de molecula pequena es dorsomorfina o LDN-193189, en el que el inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena es SB431542 o A-83- 01, en el que la concentration de LDN-193189 es superior a 50 nM.

(2) El metodo segun (1), en el que el cultivo se realiza con formacion de un cuerpo embrioide en condition sin suero.

(3) El metodo segun (1) o (2), en el que el cultivo se realiza sobre una placa de recubrimiento Matrigel™ sin usar celulas nodrizas.

(4) El metodo segun uno cualquiera de (1) a (3), en el que la celula madre pluripotente es una celula madre pluripotente inducida.

Segun el metodo anterior de la presente invencion, las celulas precursoras neurales inducidas pueden prepararse altamente eficientemente permitiendo que la combination de un inhibidor de BMP de molecula pequena y un inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena co-exista en un medio de induccion de la diferenciacion, en el que el inhibidor de BMP de molecula pequena es dorsomorfina o LDN-193189, en el que el inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena es SB431542 o A-83-01, en el que la concentracion de LDN-193189 es superior a 50 nM.

Breve description de los dibujos

La Fig. 1 muestra imagenes microscopicas de contraste de fase (a-c), imagenes de inmunotincion (d-f) obtenidas usando anticuerpo anti-nestina, imagenes de inmunotincion (g-i) obtenidas usando anticuerpo anti-Oct3/4, e imagenes de inmunotincion (j-1) obtenidas usando DAPI, en el dla 14 despues de la induccion de la diferenciacion.

La Fig. 2 muestra imagenes de inmunotincion obtenidas usando anticuerpo anti-Pax6 (verde) y anticuerpo anti- Nanog (rojo), e imagenes de inmunotincion obtenidas usando anticuerpo anti-PSA-NCAM (verde) y anticuerpo anti- SSEA3 (rojo), en el dla 14 despues de la induccion de la diferenciacion.

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La Fig. 3 muestra una imagen de inmunotincion obtenida usando anticuerpo anti-TH (tirosina hidroxilasa) (verde) y anticuerpo anti-TuJ1 (rojo) en el dia 21 despues de la induction de la diferenciacion.

La Fig. 4 muestra: A, numero total de colonias existentes por pocillo en el dia 14 despues de la induccion de la diferenciacion en todas las lineas celulares (KhES-1, KhES-2, KhES-3, G1, G4, B6 y B7: n = 4 para cada linea celular) (n = 28); y B, las relaciones (%) de colonias que contienen celulas neurales (positivas para nestina) con respecto a colonias que contienen celulas no diferenciadas (positivas para Oct3/4) existentes por pocillo en el dia 14 despues de la induccion de la diferenciacion en todas las lineas celulares (KhES-1, KhES-2, KhES-3, G1, G4, B6 y B7: n = 4 para cada linea celular) (n = 28). Cuando al menos una celula positiva podria confirmarse dentro de una colonia, tal colonia se conto como una colonia positiva.

La Fig. 5 muestra las relaciones de colonias que contienen celulas neurales (positivas para nestina) con respecto a colonias que contienen celulas no diferenciadas (positivas para Oct3/4) existentes por pocillo en el dia 14 despues de la induccion de la diferenciacion de cada linea celular ES (KhES-1(A), KhES-2(B) o KhES-3(C)).

La Fig. 6 muestra las relaciones de colonias que contienen celulas neurales (positivas para nestina) con respecto a colonias que contienen celulas no diferenciadas (positivas para Oct3/4) existentes por pocillo en el dia 14 despues de la induccion de la diferenciacion de cada linea celular iPS (G1 (A), g4 (B), B6 (C) o B7 (D)).

La Fig. 7 muestra niveles de expresion de ARNm en celulas ES no diferenciadas (KhES-1, KhES-2 y KhES-3) o celulas iPS (G1, G4, B6 y B7) como se mide por PCR en tiempo real con respecto a Nodal (A), BMP2 (B), BMP4 (C) y BMP7 (D).

La Fig. 8 es una grafica que muestra contenidos de celulas positivas para PSA-NCAM (verde) y positivas para SSEA4 (rojo) de cada linea celular en el dia 14 despues de la induccion de la diferenciacion solo sobre celulas PA6 sin usar dorsomorfina y SB431542.

La Fig. 9 muestra graficos de FACS que muestran distribuciones de celulas que expresan (o positivas para) SSEA4 (A y C) y celulas que expresan PSA-NCAM- (B y D) en grupos de control (A y B) preparadas induciendo la diferenciacion de KhES1 solo mediante el cultivo sobre celulas PA6 y en grupos (C y D) preparados induciendo la diferenciacion sobre celulas PA6 mediante la adicion de dorsomorfina y SB431542 al medio. Con respecto a los valores presentados en el presente documento, los superiores muestran las tasas (%) de celulas que expresan cada marcador en celulas derivadas de KhES1 (“en celulas diana”), y los inferiores muestran las tasas (%) de celulas que expresan cada marcador en todas las celulas existentes dentro de placas que contienen celulas derivadas de KhES1 y celulas PA6 (“en celulas totales”). La Fig. 9E es una grafica que muestra el numero de celulas derivadas de celulas ES (barras negras), celulas positivas para PSA-NCAM derivadas de celulas ES (barras blancas) y celulas positivas para SSEA4 (barras sombreadas) obtenidas por placa en el grupo de control (KhES1 cont) y en el grupo de induccion de la diferenciacion (KhES1+D&SB) para los que se usaron dorsomorfina y SB431542. El numero de celulas se calculo por las siguientes formulas.

(Numero de celulas derivadas de celulas ES) = (Recuento de celulas total en la placa) - (Numero de celulas nodrizas en la placa)

(Numero de celulas positivas para PSA-NCAM derivadas de celulas ES) = (Recuento de celulas total en la placa) x (Tasa de celulas positivas para PSA-NCAM en todas las celulas que existen en la placa)

(Numero de celulas positivas para SSEA4 derivadas de celulas ES) = (Recuento de celulas total en la placa) x (Tasa de celulas positivas para SSEA4 en todas las celulas que existen en la placa)

Las Figs. 9F y 9G muestran ejemplos de distribucion caracteristica para las celulas PA6 y celulas derivadas de ES (F: celulas PA6 solas y G: celulas PA6 y KhES1 (cultivadas en ausencia de dorsomorfina y SB431542)).

La Fig. 10A es una grafica que muestra el porcentaje de celulas positivas para PSA-NCAM en el dia 14 despues de la induccion de la diferenciacion de celulas iPS (G4) formando un cuerpo embrioide a partir de las celulas iPS sin celulas nodrizas, seguido de cultivar las celulas en un medio complementado con dorsomorfina y SB431542. Aqui, la curva roja indica el resultado de un control negativo en el que ningun anticuerpo estaba presente y la curva azul indica el resultado de celulas tenidas con un anticuerpo anti-PSA-NCAM. Por tanto, la Fig. 10B es imagenes de inmunotincion para nestina (verde) y Pax6 (rojo) para las que se indujo la diferenciacion por el metodo anterior.

La Fig. 11 muestra imagenes microscopicas de contraste de fase en el dia 14 despues de la induccion de la diferenciacion de celulas iPS (G4) cultivando las celulas iPS sin celulas nodrizas por el metodo de Matrigel en un medio complementado con cada uno de los siguientes farmacos. En esta figura, “N” indica la adicion de Noggin, “S” indica la adicion de SB431542, “NS” indica la adicion de Noggin y SB431542, “C” indica la adicion de DMSO de control, “D” indica la adicion de dorsomorfina, “DS” indica la adicion de dorsomorfina y SB431542, “LDN” indica la adicion de LDN-193189, y “LDN+S” indica la adicion de LDN-193189 y SB431542.

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La Fig. 12 muestra el numero de celulas existentes por pocillo en el dla 14 despues de la adicion de cada uno de los siguientes farmacos y lo mismo antes de la adicion de cada farmaco. En esta figura, Dla 0 indica “antes de la adicion de un farmaco”, “Cont” indica un grupo de control al que se anadio DMSO, “N” indica un grupo al que se anadio Noggin, “NS” indica un grupo al que se anadieron Noggin y SB431542, “D” indica un grupo al que se anadio dorsomorfina, “S” indica un grupo al que se anadio SB431542, “DS” indica un grupo al que se anadieron dorsomorfina y SB431542, “L10S” indica un grupo al que se anadieron LDN-193189 y SB431542 10 nM, “L50S” indica un grupo al que se anadieron LDN-193189 y SB431542 50 nM, y “L100S” indica un grupo al que se anadieron LDN-193189 y SB431542 100 nM.

La Fig. 13 muestra imagenes de inmunotincion obtenidas usando anticuerpo anti-Pax6 (verde) y anticuerpo anti- Nanog (rojo) e imagenes de inmunotincion obtenidas usando DAPI (azul) en el dla 14 despues de inducir la diferenciacion de celulas iPS (G4) cultivando las celulas sin celulas nodrizas por el metodo de Matrigel. En la Fig. 13, “SB” indica SB431542 y “LDN” indica LDN-193189.

La Fig. 14 muestra imagenes microscopicas de contraste de fase (A) e imagenes de inmunotincion (B) obtenidas usando anticuerpo anti-nestina (verde) y DAPI (azul) en el dla 14 despues de la induccion de la diferenciacion. La diferenciacion se indujo co-cultivando una llnea de celulas ES (Kh-ES5) con celulas PA6 segun el metodo SDIA, luego cultivando las celulas en un medio complementado con LDN-193189 y SB431542 5-500 nM.

La Fig. 15 muestra imagenes de inmunotincion obtenidas usando DAPI (azul) y anticuerpo anti-nestina (verde) (A) o anticuerpo anti-Pax6 (verde) (B) en el dla 14 despues de la induccion de la diferenciacion co-cultivando llnea de celulas ES (Kh-ES1 o Kh-ES4) con celulas PA6 segun el metodo SDIA y luego cultivando las celulas en un medio complementado con LDN-193189 y SB431542 5-500 nM.

La Fig. 16 muestra el resultado de PCR cuantitativa con respecto a Nanog (A), Pax6 (B) y Sox1 (C) en las celulas diferenciadas inducidas cultivando celulas iPS humanas (404C2) con el metodo libre de nodrizas. El resultado muestra el valor logarltmico relativo para el valor de celulas sin tratar. “A” a “F” indica las siguientes condiciones: “A” es DFK5% antiguo que contiene dorsomorfina 2 pM y SB431542 10 pM; “B” es GMK8% antiguo que contiene LDN913189 100 nM y A-83-01 0,5 pM; “C” es DFK5% que contiene dorsomorfina 2 pM y SB431542 10 pM; “D” es GMK8% que contiene LDN913189 100 nM y A-83-01 0,5 pM; “E” es GMK8% que contiene LDN913189 100 nM y SB431542 10 pM; y “F” es GMK8% que contiene LDN913189 100 nM y A-83-01 0,5 pM + PD0325901 0,5 pM.

La Fig. 17 muestra graficos de FACS que muestran la utilizacion 2D de Oct3/4 (A), celulas que expresan PSA-NCAM

(B), celulas que expresan Tuj-1 (C) y la utilizacion 2D de SSEA1 y SSEA4 (D) con respecto a las celulas diferenciadas cultivando celulas iPS (404C2) usando el metodo libre de nodrizas bajo la condicion de GMK8% que contiene LDN913189 100 nM y A-83-01 0,5 pM.

Modos para llevar a cabo la invencion

La presente invencion se describira en detalle del siguiente modo.

La presente invencion se refiere a un metodo de induccion de la diferenciacion de una celula madre pluripotente en una celula precursora neural, que comprende cultivar la celula madre pluripotente, como se ha descrito anteriormente.

<Celulas madre pluripotentes>

Las celulas madre pluripotentes que pueden usarse en la presente invencion son celulas madre que tienen la pluripotencia que es una capacidad para diferenciar las celulas madre en todas las celulas derivadas del ectodermo, mesodermo y endodermo existentes en un cuerpo vivo, y la potencia de proliferacion. Ejemplos de tales celulas madre incluyen, pero no se limitan a, celulas madre embrionarias (ES), celulas madre embrionarias derivadas de clon de embrion (ntES: ES de transferencia nuclear) obtenidas mediante trasplante nuclear, celulas madre germinales de la llnea masculina (“celulas GS”), celulas germinativas embrionarias (“celulas EG”) y celulas madre pluripotentes inducidas (iPS). Las celulas madre pluripotentes preferibles son celulas ES, celulas ntES y celulas iPS.

(A) Celulas madre embrionarias

Las celulas ES son celulas madre que tienen pluripotencia y potencia de proliferacion basada en la auto-replicacion, que se establece a partir de masas de celulas internas de embriones tempranos (por ejemplo, blastocistos) de mamlferos tales como seres humanos y ratones.

Las celulas ES son celulas madre derivadas de embrion de las masas de celulas internas de los blastocistos que son embriones despues del estadio de morula en el estadio de 8 celulas del ovulo fecundado. Las celulas ES tienen concretamente, pluripotencia, que es la capacidad para diferenciar dentro de cualquier celula que compone un cuerpo adulto, y la existencia de potencia de proliferacion basada en la auto-replicacion. Las celulas ES fueron descubiertas en ratones en 1981 (M. J. Evans y M. H. Kaufman (1981), Nature 292: 154-156) y entonces las llneas

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de celulas ES se establecieron para primates tales como seres humanos y monos (J. A. Thomson et al. (1999), Science 282: 1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 7844-7848; J. A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55: 254-259; J. A. Thomson y V. S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38: 133-165).

Para referencia solo, las celulas ES pueden establecerse eliminando masas de celulas internas de blastocistos de ovulos fecundados de un animal diana, cultivando las masas de celulas internas sobre fibroblastos como celulas nodrizas. Por tanto, el mantenimiento de las celulas por subcultivo puede realizarse usando un medio complementado con una sustancia tal como un factor inhibidor de la leucemia (LIF) o un factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF). Metodos para el establecimiento y el mantenimiento de celulas ES humanas y de mono se describen en H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345: 926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103: 9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279; H. (Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99: 1580-1585, etc.

Como medio para la preparation de celulas ES se usa, por ejemplo, un medio DMEM/F-12 complementado con 2- mercaptoetanol 0,1 mM, aminoacidos no esenciales 0,1 mM, L-glutamato 2 mM, 20 % de KSR y 4 ng/ml de p-FGF. Las celulas ES humanas pueden mantenerse usando el medio bajo atmosfera humeda (5 % de CO2) a 37 °C. Por tanto, las celulas ES requieren subcultivo cada 4 a 5 dlas. En este momento, el subcultivo puede realizarse usando, por ejemplo, 0,25 % de tripsina y 0,1 mg/ml de colagenasa IV en PBS que contiene CaCl2 1 mM y 20 % de KSR.

Las celulas ES pueden seleccionarse generalmente por el metodo de PCR en tiempo real usando la expresion de un gen marcador (por ejemplo, fosfatasa alcalina, Oct-3/4 y Nanog) como indicador. En particular, las celulas ES humanas pueden seleccionarse usando la expresion de un gen marcador (por ejemplo, oCT-3/4, NANOG, o ECAD) como Indice (E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 443-452). Para referencia solo, llneas de celulas ES humanas, tales como KhES-1, KhES-2, KhES-3, KhES-4 y KhES-5, estan disponibles en el Institute for Frontier Medical Sciences, Universidad de Kioto (Kioto, Japon).

(B) Celulas madre de la llnea germinal masculina

Las celulas madre de la llnea germinal masculina son celulas madre pluripotentes derivadas de testlculo, que sirven de orlgenes para la espermatogenesis. Las celulas pueden inducirse para diferenciarse en diversas llneas de celulas como en el caso de celulas ES. Por ejemplo, las celulas son capaces de producir ratones quimericos cuando se trasplantan en blastocistos de raton (M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012). Las celulas son auto-replicables en un medio que contiene un factor neurotrofico derivado de la llnea de celulas de la glia (GDNF). Ademas, mediante la repetition de subcultivo de las celulas bajo condiciones de cultivo similares a aquellas para las celulas ES, pueden obtenerse celulas madre de la llnea germinal masculina (Masanori Takebayashi et al., (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (Suppl.), pp. 41-46, YODOSHA (Tokio, Japon)).

(C) Celulas germinativas embrionarias

Se establecen celulas germinativas embrionarias a partir de celulas germinativas primordiales en el periodo prenatal, que tienen pluripotencia similar a la de las celulas ES. Las celulas germinativas embrionarias pueden establecerse cultivando celulas germinativas primordiales en presencia de una sustancia tal como LIF, bFGF y un factor de celula madre (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550-551).

(D) Celulas madre pluripotentes inducidas

Pueden prepararse celulas madre pluripotentes inducidas (iPS) introduciendo un factor(es) de reprogramacion especlfico(s) en forma de ADN o protelna en celulas somaticas. Tales celulas iPS son celulas madre artificiales de celulas somaticas, que tienen propiedades casi equivalentes a aquellas de celulas ES, tales como pluripotencia y potencia de proliferation basada en la auto-replicacion (K. Takahashi y S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); publication internacional WO 2007/069666). Un factor de reprogramacion puede ser un gen que se expresa especlficamente en celulas ES o un gen o un producto genico del mismo que desempena una funcion importante en el mantenimiento de la no diferenciacion de celulas ES. Ejemplos de tales factores de reprogramacion incluyen, pero no estan particularmente limitados a, combinaciones de: OCT3/4, SOX2 y KLF4; OCT3/4, KLF4 y C-MYC; OCT3/4, SOX2, KLF4 y C-MYC; OCT3/4 y SOX2; OCT3/4, SOX2 y NANOG; OCT3/4, SOX2 y LIN28; y OCT3/4 y KLF4.

Estos factores en forma de protelna pueden introducirse en celulas somaticas por tecnicas tales como lipofeccion, union con un peptido permeable a la membrana celular y microinyeccion. Alternativamente, estos factores en forma de ADN tambien pueden introducirse en celulas somaticas por tecnicas tales como tecnicas usando vectores tales como un virus, un plasmido y un cromosoma artificial, lipofeccion, tecnicas usando liposomas y microinyeccion. Ejemplos de un vector viral incluyen un vector retroviral, un vector lentiviral (Cell, 126, pp. 663-676, 2006; Cell, 131, pp. 861-872, 2007; Science, 318, pp. 1917-1920, 2007), un vector adenoviral (Science, 322, 945-949, 2008) y un vector viral adeno-asociado, y un vector del virus de Sendai. Por tanto, ejemplos de un vector de cromosoma

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artificial incluyen vectores de un cromosoma artificial humano (HAC), de un cromosoma artificial de levadura (YAC) y de un cromosoma artificial bacteriano (BAC, PAC). Como plasmidos pueden usarse plasmidos para las celulas de mamlfero (Science, 322: 949-953, 2008). Un vector puede comprender secuencias reguladoras tales como un promotor, un potenciador, una secuencia de union al ribosoma, un terminador y un sitio de poliadenilacion, de manera que puedan expresarse los factores de reprogramacion nuclear. Un vector puede comprender ademas, si fuera necesario, una secuencia de marcador de seleccion tal como un gen de resistencia a farmaco (por ejemplo, gen de resistencia a kanamicina, gen de resistencia a ampicilina, o gen de resistencia a puromicina), un gen de timidina cinasa y un gen de toxina difterica, una secuencia de gen indicador tal como una protelna verde fluorescente (GFP), p-glucuronidasa (GUS), o FLAG. Por tanto, el vector puede tener secuencias LoxP, que se localizan en cada extremo de un gen que codifica un factor de reprogramacion o un gen que codifica un factor de reprogramacion que se une a un promotor despues de la introduccion en celulas somaticas, con el fin de suprimir el gen.

Para aumentar una eficiencia de induction tras la reprogramacion, ademas de los factores anteriores, pueden usarse inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC) [por ejemplo, inhibidores de molecula pequena tales como acido valproico (VPA) (Nat. Biotechnol., 26 (7): 795-797 (2008)), tricostatina A, butirato sodico, MC 1293 y M344; ARNip y ARNhp contra HDAC (por ejemplo, inhibidores de la expresion de acidos nucleicos tales como HDAC1 siRNA Smartpool™ (Millipore) y HusH 29mer shRNA Constructs contra HDAC1 (OriGene))], inhibidores de ADN metiltransferasa (por ejemplo, 5'-azacitidina) (Nat. Biotechnol., 26 (7): 795-797 (2008)), inhibidores de la histona metiltransferasa G9a [por ejemplo, inhibidores de molecula pequena tales como BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525528 (2008)) e inhibidores de la expresion de acidos nucleicos tales como ARNip y shRNA contra G9a (por ejemplo, ARNip de G9a (humano) (Santa Cruz Biotechnology))], agonistas de calcio de los canales L (por ejemplo, Bayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)), inhibidores de p53 (por ejemplo, ARNip y ARNhp contra p53 (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)), UTF1 (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)), serialization de Wnt (por ejemplo, Wnt3a soluble) (Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)), 2i/LIF (“2i” indica un senalizacion de protelna cinasa activada por mitogeno e inhibidor de la sintasa cinasa-3 de glucogeno, PloS Biology, 6 (10), 2237-2247 (2008)), miARN tal como miR-291-3p, miR-294 y miR-295 (R.L. Judson et al., Nat. Biotech., 27:459-461) (2009), inhibidores de ALK5 (por ejemplo, SB431542), y similares.

Ejemplos de un medio de cultivo para la induccion de celulas iPS incluyen (1) medio DMEM, DMEM/F12 o DME que contienen 10 %-15 % de FBS (estos medios pueden contener adicionalmente apropiadamente LIF, penicilina/estreptomicina, puromicina, L-glutamina, aminoacidos no esenciales, p-mercaptoetanol, y similares) y (2) un medio que contiene bFGF o SCF para el cultivo de celulas ES, tal como un medio para el cultivo de celulas ES de raton (por ejemplo, un medio TX-WES, Tromb-X) o un medio para el cultivo de celulas ES de primate (por ejemplo, un medio para el cultivo de celulas ES de primate (humano y mono), ReproCELL, Kioto, Japon).

Un ejemplo de metodos de cultivo es el siguiente. Se ponen en contacto celulas somaticas con factores de reprogramacion (ADN o protelna) sobre un medio DMEM o DMEM/F12 que contiene 10 % de FBS a 37 °C en presencia de 5 % de CO2 y entonces se cultivan durante aproximadamente 4 a 7 dlas. Posteriormente, las celulas se vuelven a sembrar sobre celulas nodrizas (por ejemplo, celulas STO o celulas SNL tratadas con mitomicina C). Aproximadamente 10 dlas despues del contacto entre las celulas somaticas y los factores de reprogramacion, las celulas se cultivan en un medio que contiene bFGF para el cultivo de celulas ES de primate. Aproximadamente 3045 dlas o mas despues del contacto, pueden formarse colonias similares a celulas iPS.

Alternativamente, pueden cultivarse celulas sobre celulas nodrizas (por ejemplo, celulas STO o celulas SNL tratadas con mitomicina C) a 37 °C en presencia de 5 % de CO2 en un medio DMEM que contiene 10 % de FBS (el medio puede contener adicionalmente opcionalmente LIF, penicilina/estreptomicina, puromicina, L-glutamina, aminoacidos no esenciales, p-mercaptoetanol, y similares.). Despues de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 dlas o mas, pueden formarse colonias similares a ES.

Ademas, tambien pueden cultivarse celulas bajo condiciones hipoxicas en las que la concentration de oxlgeno es 5 %-10 % para aumentar la eficiencia de la induccion de celulas iPS (documento WO 2010/013845).

Durante el cultivo anterior, se realiza intercambio de medio con medio fresco una vez al dla a partir del dla 2 despues del inicio del cultivo. Ademas, el numero de celulas somaticas que va a usarse para la reprogramacion nuclear no esta limitado, pero oscila de aproximadamente 5 x 103 a aproximadamente 5 x 106 celulas por placa de cultivo (100 cm2).

Cuando un gen tal como un gen de resistencia a farmaco se usa como gen marcador, las celulas que expresan el gen marcador pueden seleccionarse cultivando celulas en un medio (un medio de seleccion) que contiene el farmaco relevante. Cuando un gen marcador es un gen de protelna fluorescente, las celulas que expresan el gen marcador pueden detectarse mediante observation bajo microscopla de fluorescencia. Cuando un gen marcador es un gen de enzima luminiscente, las celulas que expresan el gen marcador pueden detectarse mediante la adicion de un sustrato luminiscente. Cuando un gen marcador es un gen de enzima, las celulas que expresan el gen marcador pueden detectarse mediante la adicion de un sustrato cromogenico.

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El termino “celula somatica”, como se usa en el presente documento, se refiere a todas las celulas de animales que excluyen celulas de la linea germinal tales como ovulos, ovocitos y espermatocitos, celulas totipotentes y celulas ES (preferentemente, celulas de mamiferos que incluyen seres humanos). Ejemplos de celulas somaticas incluyen, pero no se limitan a, celulas somaticas de fetos, celulas somaticas de neonatos, y celulas somaticas sanas o patogenas maduras. Ejemplos de las mismas tambien incluyen celulas cultivadas primarias, celulas de pases y celulas de lineas celulares establecidas. Ejemplos de las mismas incluyen adicionalmente celulas madre de tejido y celulas precursoras de tejido. Ejemplos especificos de celulas somaticas incluyen, pero no se limitan a, (1) celulas madre de tejido (celulas madre somaticas) tales como celulas madre neurales, celulas madre hematopoyeticas, celulas madre mesenquimatosas y celulas madre de pulpa dental, (2) celulas precursoras de tejido, y (3) celulas diferenciadas tales como linfocitos, celulas epiteliales, celulas endoteliales, celulas de musculo, fibroblastos (por ejemplo, celulas de la piel), celulas pilosas, hepatocitos, celulas de la mucosa gastrica, enterocitos, esplenocitos, celulas pancreaticas (por ejemplo, celulas exocrinas pancreaticas), celulas cerebrales, neumocitos, celulas renales y celulas de la piel.

(E) Celulas ES derivadas de clon de embrion obtenidas por trasplante nuclear

Para referencia solo, celulas ES de transferencia nuclear (nt) son celulas ES derivadas de clon de embrion preparadas por tecnicas de trasplante nuclear, que tienen casi las mismas propiedades que aquellas de celulas ES derivadas de ovulos fecundados (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292: 740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72: 932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450: 497-502). Especificamente, las celulas eS establecidas a partir de las masas de celulas internas de un blastocisto derivado de clon de embrion obtenidas por sustitucion del nucleo de un ovulo no fecundado con el nucleo de una celula somatica son celulas ntES (ES de transferencia nuclear). Para la preparacion de celulas ntES se usan la tecnica de trasplante nuclear (J. B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16: 642-646) y la tecnica de preparacion de celulas ES (vease anteriormente) en combinacion (Kiyoka Wakayama et al., (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (Suppl.), pp. 47-52). Mediante el trasplante nuclear, el nucleo de una celula somatica se inyecta dentro de un ovulo no fecundado de mamifero enucleado, seguido de varias horas de cultivo, de manera que pueda realizarse la reprogramacion.

<Inhibidor de BMP de molecula pequena>

Un inhibidor de BMP de molecula pequena es un inhibidor de molecula pequena que participa en la inhibicion de la senalizacion de BMP que esta mediada por la union de BMP (proteina morfogenetica osea) al receptor de BMP (tipo I o tipo II), pero se diferencia de un inhibidor de proteina tal como Noggin, cordina, folistatina, o similares, que es un inhibidor natural. Como se usa en el presente documento, el termino “molecula pequena” significa una molecula organica o inorganica y este termino no incluye macromoleculas grandes, tales como proteinas grandes (por ejemplo, proteinas con pesos moleculares superiores a 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, o 10.000), acidos nucleicos grandes (por ejemplo, acidos nucleicos con pesos moleculares de mas de 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000 o 10.000), o polisacaridos grandes (por ejemplo, polisacaridos con pesos moleculares de mas de 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000 o 10.000). Este inhibidor debe tener efectos de induction de la diferenciacion de celulas madre pluripotentes en celulas precursoras neurales. Ejemplos de un inhibidor de BMP de molecula pequena que tiene tales propiedades incluye un compuesto que inhibe BMP2, BMP4, BMP6 o BMP7 capaz de activar un factor de transcription SMAD1, SMAD5 o SMAD8, tal como dorsomorfina (es decir, 6-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)fenil]-3-piridin-4-il-pirazolo[1,5-a]pirimidina) y un derivado de la misma (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4: 33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE (
www.plozone.org), 3(8): e2904). La dorsomorfina esta comercialmente disponible, por ejemplo, de Sigma-Aldrich. La dorsomorfina tiene actividad biologica para inhibir la senalizacion de BMP anterior inhibiendo la union de BMP a un receptor de BMP. Ademas de ellos, ejemplos de un inhibidor de cinasas de receptor tipo I de BMP incluyen LDN- 193189 (es decir, 4-(6-(4-(piperazin-1-il)fenil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)quinolina) y un derivado del mismo (Yu PB et al. Nat Med, 14: 1363-9, 2008). LDN-193189 esta comercialmente disponible de, por ejemplo, Stemgent.

<Inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena>

Segun la presente invention, la eficiencia de induccion de la diferenciacion de celulas madre pluripotentes en celulas precursoras neurales puede mejorarse significativamente combinando el inhibidor de BMP de molecula pequena con un inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena (factor de crecimiento transformante P), en el que el inhibidor de BMP de molecula pequena es dorsomorfina o LDN-193189, en el que el inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena es SB431542 o A-83-01, en el que la concentration de LDN-193189 es superior a 50 nM.

El termino “inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena”, como se usa en el presente documento, se refiere a un inhibidor de molecula pequena que interfiere con la senalizacion de la familia TGFp.

Los miembros de la familia TGFp regulan el proceso celular y el proceso de desarrollo tal como la mitosis, diferenciacion celular, formation de patrones embrionarios y organogenesis. Por ejemplo, la senalizacion de TGFp se lleva a cabo mediante un complejo de receptor heteromerico de receptor de serina-treonina cinasa tipo I y tipo II. Este complejo activa el proceso de senalizacion de Smad aguas abajo. Especificamente, cuando TGFp se une al complejo de receptor, el receptor de TGFp-tipo II fosforila el receptor de TGFp-tipo I y entonces el receptor de TGFp- tipo I fosforila Smad mediado por receptor (R-Smad), de manera que se inicia la respuesta aguas abajo. R-Smad

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activado y Smad4 forman un complejo multimerico, de manera que R-Smad activado se transfiere al nucleo y entonces se induce la regulacion transcripcional de un gen diana.

Cuando se inhibe tal senalizacion de la familia TGFp, se induce la diferenciacion de celulas madre pluripotentes en celulas precursoras neurales. Ademas, cuando se inhibe la senalizacion de BMP anterior, ademas de esta inhibicion, no solo la tasa de induccion de celulas precursoras neurales disminuye, sino que tambien la tasa residual de celulas no diferenciadas (es decir, celulas madre pluripotentes) disminuye mas, asl, aumenta la tasa de conversion en celulas precursoras neurales.

<Celulas nodrizas>

En la presente invencion, las celulas nodrizas no son siempre requeridas, pero las celulas nodrizas pueden estar presentes. Ejemplos de celulas nodrizas incluyen fibroblastos embrionarios y celulas del estroma. Ejemplos de fibroblastos embrionarios incluyen celulas MEF (fibroblastos embrionarios de raton), STO celulas (llnea celular de fibroblastos embrionarios de raton) y SNL (subclones de celulas STO; por ejemplo, celulas SNL 76/7). Por tanto, ejemplos de celulas del estroma incluyen celulas PA6 (llnea celular del estroma de raton (RIKEN BRC Cell Bank (Japon)), celulas MS-5 (Exp Hematol. 17: 145-53 (1989)) y celulas OP9 (Science. 265: 1098-1101 (1994)). El metodo SDIA comprende cocultivar celulas ES con celulas del estroma, y particularmente con celulas PA6, para realizar la diferenciacion casi selectiva en celulas precursoras neurales. Segun la presente invencion, incluso en ausencia de celulas nodrizas, la diferenciacion selectiva en celulas precursoras neurales puede inducirse haciendo la combinacion anterior del inhibidor de BMP de molecula pequena y el inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena, presente en un medio de induccion de la diferenciacion. El uso de celulas nodrizas, ademas de tales condiciones de cultivo, puede mejorar adicionalmente la eficiencia de diferenciacion en celulas precursoras neurales.

Sin embargo, si es asl, cuando el trasplante de celulas precursoras neurales, o celulas neurales o de la glia que se diferencian de las mismas, en un mamlfero tal como un ser humano se tiene en consideracion, huelga decir que el uso de celulas que son heterogeneas para los donantes debe evitarse a un grado tan grande como sea posible.

<Induccion de la diferenciacion de celulas precursoras neurales>

(A) Medio de diferenciacion

Puede prepararse medio usado para cultivar celulas de animales como medio basal. Ejemplos de tal medio basal incluyen medio IMDM, medio 199, medio esencial mlnimo de Eagle (EMEM), medio aMEM, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio Ham's F12, medio RPMI 1640, medio de Fischer, Glasgow MEM, y mezclas de los mismos. El medio puede contener suero o puede estar libre de suero.

El medio puede contener adicionalmente, si fuera necesario, uno o mas sustitutos del suero, tales como albumina, transferrina, sustitucion de suero Knockout (KSR) (sustituto del suero para FBS tras el cultivo de celulas ES), acido graso, insulina, un precursor de colageno, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, 3'-tiolglicerol, suplemento de B27 y suplemento de N2, ademas de una o mas sustancias tales como llpidos, aminoacidos, aminoacidos no esenciales, vitaminas, factores de crecimiento, citocinas, antibioticos, antioxidantes, piruvato, un agente de tamponamiento y sales inorganicas.

El medio tambien puede contener el inhibidor de BMP de molecula pequena anterior y/u opcionalmente el inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena anterior. El medio puede contener adicionalmente un sobrenadante de cultivo de las celulas nodrizas anteriores. El medio puede adicionalmente cualquiera de los inhibidores de ERK (cinasa regulada por la senal extracelular).

Un ejemplo del medio de diferenciacion es medio mixto DMEM/Ham's F12 que contiene 5 % de sustitucion de suero Knockout (KSR), L-glutamina 2 mM, aminoacidos no esenciales y 2-mercaptoetanol 1 pM (2-ME) o MEM de Glasgow que contiene 8 % de KSR, piruvato de 2ME 1 pM y aminoacidos no esenciales, como se describe en los ejemplos mostrados mas adelante.

(B) Metodo de induccion de la diferenciacion

Segun la presente invencion, tras la induccion de la diferenciacion de celulas pluripotentes tales como celulas ES o celulas iPS en celulas precursoras neurales, tales celulas se preparan y luego se cultivan usando los metodos descritos en los documentos anteriores. Cuando las celulas ES humanas o celulas iPS humanas se cultivan, preferentemente puede usarse un medio para las celulas ES de primate (ReproCELL (Kioto, Japon)).

La induccion de la diferenciacion de celulas madre pluripotentes en celulas precursoras neurales puede realizarse en tanto presencia como ausencia de celulas nodrizas usando los medios de diferenciacion anteriormente descritos. Cuando las celulas nodrizas estan presentes, como tales celulas, pueden usarse los MEF anteriormente ejemplificados (fibroblastos embrionarios de raton), celulas STO (llnea celular de fibroblastos embrionarios de raton), celulas PA6 (llnea celular del estroma de raton (RIKEN BRC Cell Bank (Japon)), celulas SNL (subclones de celulas

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STO; por ejemplo, celulas SNL 76/7), y similares. Para celulas nodrizas, el tratamiento con mitomicina C se realiza generalmente para detener la proliferacion celular.

Inmediatamente antes e inmediatamente despues de la induccion de la diferenciacion, preferentemente, se anade un inhibidor de ROCK (cinasa de bobina en espiral asociada a p160-Rho) a un medio que contiene celulas madre pluripotentes cultivadas. El inhibidor de ROCK es una sustancia que presenta efectos muy fuertes de supresion de la muerte celular tras la dispersion de las celulas. Por ejemplo, Y-27632, fasudil (HA-1077), o similares, se conocen como un inhibidor de ROCK tal (K. Watanabe et al., Nat. Biotech., 25: 681-686 (2007)). La concentracion de un inhibidor oscila de, pero no se limita a, aproximadamente 50 nM a aproximadamente 10 pM por placa de cultivo.

La densidad de celulas madre pluripotentes en un medio oscila preferentemente de aproximadamente 5,0 x 104 a aproximadamente 1,0 x 107 celulas, pero puede encontrarse fuera de tal intervalo.

Ejemplos de cultivo incluyen cultivo tridimensional bajo condiciones no de adhesion, tales como cultivo en suspension (por ejemplo, cultivo en dispersion y cultivo de agregacion-suspension), cultivo bidimensional bajo condiciones de adhesion, tales como cultivo en placa, y cultivos continuamente combinados que constituyen un cultivo tridimensional y luego un cultivo bidimensional. Cuando la diferenciacion se induce en presencia de celulas nodrizas, puede emplearse cultivo bidimensional. Por otra parte, en ausencia de celulas nodrizas, puede emplearse cultivo tridimensional.

En el caso de una estufa de incubacion de celulas adhesivas, con el fin de mejorar las propiedades de adhesion con celulas, la superficie de la estufa de incubacion puede recubrirse con una sustancia de soporte de celulas, tal como colageno, gelatina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, laminina, fibronectina o Matrigel™ (Becton, Dickinson and Company).

En el cultivo en dispersion, las celulas madre pluripotentes se cultivan en un estado suspenso en un medio llquido. Por tanto, las masas de celulas madre pluripotentes (o cuerpos embrioides) se forman por el cultivo de agregacion- suspension. Posteriormente, puede inducirse la diferenciacion de las masas de celulas (o cuerpos embrioides) en celulas de interes. Para el cultivo de agregacion-suspension puede usarse, por ejemplo, el metodo del cultivo de cuerpos embrioides (Keller et al., Curr. Opin. Cell Biol. 7, 862-869 (1995)) o el metodo SFEB (por ejemplo, Watanabe et al., Nature Neuroscience 8, 288-296 (2005); documento WO 2005/123902). El metodo preferible es el cultivo de cuerpos embrioides en un medio sin suero como el metodo SFEB.

En el cultivo de adhesion puede usarse, por ejemplo, el metodo de Matrigel (Chambers SM, et al. Nat Biotechnol. 27: 485, 2009) o el metodo SDIA (Kawasaki H, et al. Neuron. 28:31-40, 2000 o Kawasaki H, et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 99: 1580-5, 2002).

Con respecto a las condiciones de cultivo, pueden usarse los medios anteriormente mencionados y la temperatura para el cultivo no se limita a los siguientes ejemplos, pero oscila de aproximadamente 30 °C a 40 °C, preferentemente aproximadamente 37 °C. El cultivo se realiza bajo una atmosfera de aire que contiene CO2, en la que la concentracion de CO2 oscila preferentemente de aproximadamente el 2 % al 5 %. El tiempo para el cultivo o el programa para el cultivo oscilan, por ejemplo, de 7 dlas a 21 dlas, mas preferentemente 14 dlas bajo induccion de las condiciones de diferenciacion.

Con respecto a los metodos y condiciones especlficos para la induccion de la diferenciacion, veanse los ejemplos facilitados mas adelante.

<Celulas precursoras neurales inducidas>

En el presente documento se describen celulas precursoras neurales inducidas preparadas por el metodo de induccion de la diferenciacion como se ha descrito anteriormente.

Ejemplos de celulas precursoras neurales que pueden obtenerse por el metodo de la presente invencion incluyen celulas precursoras de todas las celulas neurales, tales como celulas neurales en el sistema nervioso central, celulas neurales en el sistema nervioso periferico, neuronas motoras, celulas neurales en el sistema de organos sensoriales, y celulas neurales en el nervio autonomo.

Las celulas precursoras neurales pueden identificarse usando marcadores de expresion tales como, por ejemplo, marcadores de expresion para el neuroectodermo primitivo o celulas madre neurales (por ejemplo, una molecula de adhesion a celula neural (NCAM), NCAM polisialilado, A2B5 (expresado en celulas neurales de fetos o neonatos), protelnas de filamentos intermedios (nestina, vimentina, o similares), y un factor de transcripcion (Pax-6), marcadores neuronales de dopamina (por ejemplo, tirosina hidroxilasa (TH)), y marcadores neurales (por ejemplo, TuJ1).

Despues de la preparacion, las celulas precursoras neurales pueden trasplantarse directamente en un cuerpo vivo o pueden diferenciarse completamente o parcialmente dentro de celulas neurales o celulas de la glia (incluyendo astrocitos y oligodendrocitos) y entonces trasplantarse en un cuerpo vivo.

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<Uso en el cribado de un agente terapeutico para enfermedad neurologica>

Las celulas precursoras neurales inducidas descritas en el presente documento tambien pueden usarse para cribar compuestos para tratar enfermedades neurologicas (por ejemplo, compuestos farmaceuticos, disolventes, moleculas pequenas, peptidos, o polinucleotidos). Por ejemplo, un compuesto farmaceutico candidato solo o el mismo combinado con otro farmaco se anaden a celulas precursoras neurales inducidas o celulas neurales mas maduras que las celulas precursoras, y entonces puede realizarse la evaluacion basandose en cambios morfologicos o funcionales de las celulas. La evaluacion puede realizarse midiendo una cantidad de dopamina producida a partir de las celulas como un ejemplo de un cambio funcional. Aqul, las celulas precursoras neurales inducidas son: preferentemente celulas que presentan un fenotipo similar al de una enfermedad neurologica que va a tratarse; y particularmente preferentemente celulas madre pluripotentes inducidas preparadas a partir de celulas somaticas afectadas por enfermedades neurologicas, o celulas precursoras neurales inducidas preparadas induciendo la diferenciacion de celulas ntES en las que se han trasplantado los nucleos de celulas somaticas afectadas por la enfermedad.

<Aplicacion a medicina regenerativa>

Las celulas precursoras neurales inducidas descritas en el presente documento pueden usarse eficazmente en el campo de la medicina regenerativa para la normalizacion de un tejido del sistema nervioso danado. Por tanto, las celulas precursoras neurales inducidas pueden usarse como celulas para tratar enfermedades asociadas a danos de cualquier celula en el sistema nervioso.

Ejemplos de tales enfermedades incluyen enfermedad cerebral isquemica (por ejemplo, accidente cerebrovascular), traumatismos cerebrales, lesiones espinales, enfermedades neurologicas motoras, enfermedades neurodegenerativas, retinitis pigmentosa, degeneracion macular senil, sordera parcial del oldo interno, esclerosis multiple, esclerosis lateral amiotrofica, degeneracion espinocerebelosa, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, epilepsia y esquizofrenia.

Por tanto, cuando las celulas se usan para terapia, la pureza de las celulas debe aumentarse deseablemente. Ejemplos de tal purificacion incluyen un metodo para la selection de celulas de interes, por ejemplo, citometrla de flujo, y un tratamiento de celulas en un medio que contiene un agente antineoplasico. La citometrla de flujo se realiza aplicando partlculas de celula en un flujo de llquido muy delgado a una tasa alta, irradiando con un haz de laser, y luego midiendo la luz tal como la fluorescencia (cuando las celulas estan marcadas fluorescentes de antemano) o luz dispersada emitida de las partlculas. Cuando se proporciona un citometro, las celulas de interes pueden seleccionarse y separarse. Las celulas pueden estar marcadas fluorescentes usando un anticuerpo (marcado fluorescente) especlfico para las celulas precursoras neurales, tales como un anticuerpo anti-nestina. Por tanto, mediante el tratamiento en un medio que contiene un agente antineoplasico, las celulas no diferenciadas pueden eliminarse. Ejemplos de tal agente antineoplasico incluyen mitomicina C, 5-fluorouracilo, adriamicina y metotrexato.

Las celulas precursoras neurales pueden trasplantarse dentro de sitios de enfermedades por una tecnica descrita en la naturaleza, por ejemplo, Neuroscience, 2, 1137 (1999) o N Engl J Med.; 344: 710-9 (200l).

Ejemplos

La presente invention se describira mas adelante en mas detalle con referencia a los siguientes ejemplos, aunque el alcance tecnico de la presente invencion no esta limitado a estos.

Metodos

Celulas y cultivo

Se proporcionaron celulas ES humanas (KhES-1, KhES-2 y KhES-3) del Institute for Frontier Medical Sciences, Universidad de Kioto, y entonces se cultivaron por el metodo conocido (Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345: 926-32, 2006) (metodos usando celulas KhES se muestran para referencia solo). Las celulas iPS humanas (G1, G4, B6 y B7) se proporcionaron por el Dr. Yamanaka de la Universidad de Kioto y luego se cultivaron por el metodo conocido (Takahashi K, et al. Cell. 131: 861-72, 2007 y Nakagawa M, et al. Nat Biotechnol. 26: 101-6, 2008). Se sembraron celulas PA6 (RIKEN BRC Cell Bank) sobre una placa recubierta con gelatina y a continuation se cultivaron usando MEM alfa que contenla 10 % de FBS. Tras la induction de la diferenciacion, las celulas se cultivaron durante al menos un dla, se confirmo que eran confluentes, y a continuacion se usaron como celulas nodrizas. Se establecieron celulas iPS humanas (404C2) introduciendo factores de reprogramacion (OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28 y ARNhp para p53) dentro de fibroblasto humano usando un vector que contenla EBNA-1 y oriP (documentos US61/232.402 y US61/307.306), luego se cultivaron por el mismo metodo de otras celulas iPS humanas.

Induccion de la diferenciacion en celulas precursoras neurales (en presencia de celulas nodrizas: metodo SDIA)

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Se cultivaron celulas ES o celulas iPS usando celulas STO como celulas nodrizas. Un dla antes del inicio de la induction de la diferenciacion, se anadio inhibidor de ROCK 10 |jM (Y276352) en un medio. Se anadio solution de disociacion de CTK (0,25 % de tripsina, 1 mg/ml de colagenasa y KsR 20 %, y CaCl2 1 mM) a 500 jl /10 cm de placa, seguido de 3 a 5 minutos de incubation a 37 °C. La placa se golpeo suavemente para eliminar las celulas nodrizas. Despues de lavar una vez con PBS, la solucion de disociacion de CTK se anadio otra vez, seguido de 1015 minutos de incubacion a 37 °C. Las celulas ES o celulas iPS desprendidas de la placa se suspendieron en 5 ml de medio de diferenciacion (DMEM/Ham's F12 que contiene 5 % de sustitucion de suero Knockout (KSR), L- glutamina 2 mM, aminoacidos no esenciales y 2-mercaptoetanol 1 jM (2-ME)). Despues de la centrifugation, los sobrenadantes se eliminaron. Otra vez, las celulas se suspendieron en 1 ml del medio de diferenciacion y entonces se separaron entre si pipeteando, para producir agregados pequenos (10-20 celulas/grumo).

Los agregados pequenos obtenidos se sembraron sobre placas que tenlan PA6 como celulas nodrizas a concentraciones que oscilaban de 2500 a 5000 celulas/cm2. Como medio, se uso un medio de diferenciacion que contenla dorsomorfina 2 jM (Sigma) y/o SB431542 10 jM (Sigma) y/o 300 ng/ml de Noggin (HZ-1026: HumanZyme) o 2 jl/pocillo de DMSO. Se anadio Y276352 10 jM solo en el cultivo inicial. El intercambio de medio no se realizo hasta el dla 7, y entonces se realizo una vez cada 3 a 4 dlas.

Induccion de la diferenciacion en celulas precursoras neurales (en ausencia de celulas nodrizas: metodo SFEBq)

Por el metodo anterior, celulas ES o celulas iPS, de las que se hablan eliminado celulas nodrizas, se incubaron durante 5 minutos a 37 °C usando 1 ml de Accumax (TM) para la separation. Despues de lavar, el numero de celulas se conto. Las celulas se suspendieron en el medio de diferenciacion anterior y a continuation se sembraron sobre una placa de 96 pocillos de baja adhesion (placa de recubrimiento Lipidure: NOF Corporation) a 9000 celulas/pocillo. Para el cultivo, se uso un medio de diferenciacion que contenla dorsomorfina 2 jM y SB431542 10 jM y se anadio Y276352 50 nM solo en el cultivo inicial. No se realizo intercambio del medio hasta el dla 7, y entonces se realizo una vez cada 3 dlas.

Induccion de la diferenciacion en celulas neurales usando cada farmaco (metodo de Matrigel)

Se separaron las celulas iPS (G4) por 20 minutos de tratamiento con Accutase, se lavaron con un medio de celulas ES humanas, y entonces se dejaron sobre una placa de recubrimiento de gelatina durante 1 hora con un medio que contenla inhibidor de ROCK (Y276352), de manera que se eliminaron las celulas nodrizas. Posteriormente, las celulas ES o celulas iPS (18000 celulas/cm2) se sembraron sobre una placa de recubrimiento Matrigel (BD) y a continuacion se cultivaron durante 3 dlas usando un medio acondicionado MEF complementado con bFGF y un inhibidor de ROCK (Y276352), de manera que las celulas alcanzaron la confluencia (se elimino Y276352 en termino medio).

A continuacion, las celulas se cultivaron durante 5 dlas en un medio de diferenciacion (DMEM/F12, 20 % de sustitucion de suero Knockout (Gibco) y 2-mercaptoetanol 0,1 mM) que contenla SB431542 10 jM, dorsomorfina 2 jM, 300 ng/ml de Noggin, LDN-193189 1 nM-100 nM (STEMGENT04-0019) o DMSO (control), o una combination de los mismos. Sin adicion de SB431542 en el dla 5, las celulas se cultivaron continuamente en un medio de diferenciacion complementado con dorsomorfina, Noggin, LDN-193189 o DMSO. En este momento, la proportion de medio N2 (el medio preparado anadiendo un suplemento de N2 a DMEM/F12) aumento a intervalos de dos dlas hasta el 25 %, 50 %, y luego el 75 % sin cambiar las concentraciones de otros farmacos.

Induccion de la diferenciacion en celulas neurales mediante la adicion de LDN-193189 y SB431542 (metodo SDIA)

Un dla antes del inicio de la induccion de la diferenciacion, se anadio la solucion de disociacion CTK (0,25 % de tripsina, 1 mg/ml de colagenasa y KSR 20 %, y CaCh 1 mM) a celulas ES (KhES-1, KhES-4 y KhES-5), las colonias se disociaron. Las celulas ES desprendidas de la placa se sometieron a elimination de MEF sobre recubrimiento de gelatina, suspenso en un medio de diferenciacion (DMEM/Ham's F12 que contiene 5 % de sustitucion de suero Knockout (KSR), L-glutamina 2 mM, aminoacidos no esenciales y 2-mercaptoetanol 1 jM (2-ME)) durante 1 hora, y a continuacion se separaron pipeteando para producir pequenos agregados (10-20 celulas/coagulo). Los pequenos agregados obtenidos se sembraron sobre PA6 a una concentration que oscilaba de 2500 a 5000 celulas/cm2. En el dla 4 de cultivo, el medio se intercambio con un medio de diferenciacion complementado con SB431542 10 jM y LDN-193189 5-1.000 nM. Tres dlas despues, el medio se intercambio con un medio de diferenciacion sin SB431542 y LDN-193189. A partir de aqul, los intercambios de medio con un medio de diferenciacion tal sin SB431542 y LDN- 193189 se realizaron a intervalos de 2 a 3 dlas.

Investigation de la combinacion de agentes de induccion de la diferenciacion en las condiciones del metodo SFEBq

Un dla antes del inicio de la induccion de la diferenciacion de celulas iPS humanas (404C2), se anadio inhibidor de ROCK 10 jM (Y276352) en un medio. Se anadio solucion de disociacion CTK (0,25 % de tripsina, 1 mg/ml de colagenasa y KSR 20 % y CaCl2 1 mM) a 500 jl /10 cm de placa, seguido de 3 a 5 minutos de incubacion a 37 °C. La placa se golpeo suavemente para eliminar celulas nodrizas. Despues de lavar una vez con PBS, la disociacion se realizo con 5 minutos de incubacion a 37 °C con 1 ml de Accumax™. Despues de lavar, el numero de celulas se

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conto. Las celulas se suspendieron en el medio de diferenciacion anterior y a continuacion se sembraron sobre una placa de 96 pocillos de baja adhesion (placa de recubrimiento Lipidure: NOF Corporation) a 9000 celulas/pocillo. Despues de cultivarse las celulas con medio que consistla en las 6 siguientes combinaciones durante 4 dlas, entonces el medio se cambio al medio de diferenciacion anterior (DMEM/Ham's F12 que contenla 5 % de sustitucion de suero Knockout (KSR), L-glutamina 2 mM, aminoacidos no esenciales y 2-mercaptoetanol 1 pM (2-ME)). Las celulas diferenciadas se evaluaron con marcador no diferenciado (Nanog) y marcador diferenciado neural (Pax6 y Sox1).

A : DFK5% antiguo + dorsomorfina 2 pM + SB431542 10 pM B : GMK8% antiguo + LDN913189 100 nM + A-83-01 0,5 pM C : DFK5% + dorsomorfina 2 pM + SB431542 10 pM D : GMK8% + LDN913189 100 nM + A-83-01 0,5 pM E : GMK8% + LDN913189 100 nM + SB431542 10 pM F : GMK8% + LDN913189 100 nM + A-83-01 0,5 pM + PD0325901 0,5 pM

en las que

i) “antiguo” significa 20 dlas de pase despues de la preparacion.

ii) GMK8% significa el medio que consiste en MEM de Glasgow (Invitrogen), 8 % de KSR, 2ME 1 pM, piruvato y aminoacidos no esenciales.

iii) A-83-01 se compro de Sigma-Aldrich Inc., y PD0325901 se compro de Wako, Japon.

Inmunotincion

En el dla 14 despues de la induccion de la diferenciacion, las celulas se fijaron con 4 % de PFA durante 30 minutos a 4 °C y a continuacion se inmunotineron en PBS con cada anticuerpo enumerado en la Tabla 1.

Tabla 1: Lista de anticuerpos

Antlgeno

Modelo numero Empresa de ventas Relacion de dilucion

Nestina

MAB5326 Chemicon 1:500

Oct3/4

SC9081 SantaCruz 1:500

Pax6

PRB-278P-100 Covance 1:200

Nanog

AF1997 R&D Systems 1:200

PSA-NCAM

- Chemicon 1:100

SSEA3

- Chemicon 1:100

FACS

Las celulas se incubaron usando Accumax (TM) durante 20 minutos a 37 °C para la separacion y a continuacion se analizaron usando FACS Aria2. Para el analisis, las celulas se tineron con un anticuerpo PSA-NCAM o anticuerpo conjugado SSEA-4-PE o anticuerpo Oct3/4 o anticuerpo SSEA-1 o anticuerpo Tuj1 y las celulas muertas se eliminaron usando tincion con 7AAD como indicador o el kit de tincion de celulas muertas fijables Red dye Live/dead (Invitrogen).

PCR en tiempo real

Se recogio ARN usando RNeasy Plus Mini (QIAGEN) de celulas ES o celulas iPS de las que se hablan eliminado las celulas nodrizas por el metodo anterior y a continuacion se analizaron por un sistema Thermal Cycler Dice Real Time TP800 (TaKaRa) usando SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa).

Estadlstica

Con el uso de GraphPad Prism 5 (software GraphPad), el analisis se realizo (n = 4) por ANOVA unilateral, a posteriori (prueba de comparaciones multiples de Dunnett).

Ejemplo 1

Se cultivaron celulas iPS (G4) durante 14 dlas usando celulas PA6 como celulas nodrizas bajo tres condiciones: grupo de adicion de dorsomorfina (grupo D); grupo de adicion de SB431542 (grupo S); y grupo de adicion de dorsomorfina y SB431542 (grupo D+S). Asl, se realizo la induccion de la diferenciacion. Como resultado, en el grupo D, se confirmaron las colonias positivas para tanto nestina como Oct3/4. En el grupo S, se confirmaron poblaciones de celulas agregadas en grupos de celulas extendidos de forma plana. Las poblaciones de celulas agregadas fueron positivas para nestina. Sin embargo, en el grupo D+S, se encontro que casi todas las colonias eran positivas para

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nestina y casi no se observaron colonias positivas para Oct3/4 (Fig. 1). Se realizo inmunotincion usando el otro marcador sin diferenciacion, Nanog o SSEA3, y un marcador neural, Pax6 o PSA-NCAM. Como resultado, se confirmo similarmente lo siguiente: en el grupo D, coexistieron celulas no diferenciadas y celulas precursoras neurales; en el grupo S, celulas precursoras neurales aparecieron en las poblaciones de celulas agregadas; y en el grupo D y S, las celulas se diferenciaron casi completamente en celulas precursoras neurales (Fig. 2). A continuacion, el grupo D+S se sometio a 21 dlas de induccion de la diferenciacion, de manera que se confirmaron las celulas positivas para un marcador de neuronas de dopamina, TH (tirosina hidroxilasa) y un marcador nervioso, TuJ1 (Fig. 3). Como se ha descrito anteriormente, se confirmo que la diferenciacion de celulas iPS dentro de celulas neurales podrla inducirse eficientemente cultivando celulas iPS usando celulas PA6 como celulas nodrizas en condiciones en las que se hablan anadido dorsomorfina y SB431542.

A continuacion, celulas ES (KhES-1, KhES-2 y KhES-3) y otras celulas iPS (G1, B6 y B7) se sometieron a induccion de la diferenciacion por un metodo similar. La Fig. 4 muestra el sumario de resultados para 7 tipos (KhES-1, KhES-2, KhES-3, G1, G4, B6 y B7) de llneas celulares. Se confirmo que el numero de colonias de un grupo al que se habla anadido o bien dorsomorfina o SB431542 o ambos o al que ambos se hablan anadido era significativamente superior al numero de colonias de un grupo de control o un grupo al que se habla anadido Noggin (protelna antagonista de BMP) (Fig. 4A). Por tanto, se confirmo que los farmacos anteriores tenlan efectos de contribuir a la supervivencia de celulas pluripotentes (celulas ES y celulas iPS) tras la induccion de la diferenciacion. Mientras tanto, se confirmo en la induccion de la diferenciacion dentro de colonias que contienen celulas neurales que SB431542 fue eficaz en la eliminacion de celulas no diferenciadas (Fig. 4B). Por tanto, la eficiencia de produccion de colonias que contienen celulas neurales fue significativamente mayor con la combinacion de dorsomorfina y SB431542 que con la combinacion de Noggin y SB431542.

Se observaron tendencias similares para llneas celulares individuales (celulas ES (Fig. 5) y celulas iPS (Fig. 6)). Estos resultados tambien pueden entenderse a partir del resultado de que la expresion de protelnas diana para los farmacos anteriores (TGF/Activin/Nodal: SB431542; BMP: dorsomorfina) permanecio casi igual para cada llnea celular (Fig. 7).

Con respecto al resultado anterior, la eficiencia de induccion en celulas precursoras neurales se determino basandose en el numero de colonias, cada una de las cuales contuvo al menos una celula positivas para un gen marcador. Esto es inapropiado para la comparacion de la eficiencia de induccion en una celula completa. Por lo tanto, para la observacion de la induccion de la diferenciacion basandose en la unidad de celula, pero no basandose en la unidad de colonia, se realizo analisis de FACS. Segun el metodo de actividad de induccion derivada de celulas del estroma convencional (metodo SDIA) (Kawasaki H, et al. Neuron. 28: 31-40, 2000 o Kawasaki H, et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 99: 1580-5, 2002), la diferenciacion se indujo sin usar dorsomorfina o SB431542, pero usando celulas PA6 como celulas nodrizas. En el dla 14 despues de la induccion de la diferenciacion, las celulas se analizaron por FACS (Fig. 8). Este metodo puede producir algunas llneas celulares para las que se observan celulas positivas para SSEA4 (un marcador de no diferenciacion). Por consiguiente, el metodo no es un metodo de induccion fiable debido a las diferencias en la resistencia a la diferenciacion entre llneas celulares. A continuacion, la diferenciacion de celulas ES (KhES1) se indujo por un metodo que implicaba la adicion de dorsomorfina y SB431542. El numero de celulas positivas para PSA-NCAM fue 3 o mas veces superior al numero de las mismas en un grupo de control al que no se habla anadido nada, y se encontro que el numero de celulas positivas para SSEA4 se reducla (Fig. 9). Por tanto, se confirmo que la diferenciacion altamente eficiente en celulas precursoras neurales es posible por el metodo de uso de dorsomorfina y SB431542.

Ejemplo 2

Se sometieron celulas iPS (G4) a la formacion de un cuerpo embrioide bajo condiciones de baja adhesion, y se anadieron dorsomorfina y SB431542 a las celulas, diferenciandose as! las celulas en las celulas precursoras neurales. Como resultado, en el dla 14 despues de la induccion de la diferenciacion, casi el 99,6 % de las celulas fueron positivas para PSA-NCAM (Fig. 10A). Por tanto, como resultado de la inmunotincion, las celulas sometidas a induccion de la diferenciacion fueron positivas para nestina y Pax6, los marcadores neurales del estadio temprano (Fig. 10B). Como se ha descrito anteriormente, se confirmo que, usando el metodo de induccion de la diferenciacion en ausencia de celulas nodrizas, fue posible usar diferenciacion altamente eficiente en celulas precursoras neurales usando dorsomorfina y SB431542.

Ejemplo 3

Induccion de la diferenciacion en celulas precursoras neurales usando cada farmaco (metodo de Matrigel)

Se cultivaron celulas iPS (G4) durante 14 dlas por el metodo de Matrigel bajo las siguientes condiciones: DMSO solo (control) (grupo C); Noggin solo (grupo N); Noggin + SB431542 (grupo NS); dorsomorfina sola (grupo D); SB431542 solo (grupo S); dorsomorfina + SB431542 (grupo DS); LDN-193189 (1 nM) (grupo L1); LDN-193189 (5 nM) (grupo L5); LDN-193189 (10 nM) (grupo L10); LDN-193189 (5 nM) + SB431542 (grupo L5S); LDN-193189 (10 nM) + SB431542 (grupo L10S); LDN-193189 (50 nM) + SB431542 (grupo L50S); y LDN-193189 (100 nM) + SB431542 (grupo L100S). Las Fig. 11 y Fig. 12 muestran los resultados.

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Despues de la induction de la diferenciacion, se confirmo que hubo un gran numero de celulas viables en el grupo NS, el grupo DS, el grupo L50S y el grupo L100S como resultado de observar visualmente celulas y determinar el numero de celulas en el dla 14.

Posteriormente, tanto si fue como no posible la diferenciacion en celulas precursoras neurales, se confirmo basandose en la expresion del marcador de celulas neurales PAX6 y el marcador de no diferenciacion Nanog (Fig. 13). Como resultado, el numero de celulas positivas para PAX6 y negativas para Nanog fue alto en el grupo L100S. Asl, se confirmo que la induccion de la diferenciacion en celulas precursoras neurales bajo las condiciones anteriormente mencionadas era relativamente satisfactoria.

Ejemplo 4

Determination de una concentration optima de LDN-193189 para la diferenciacion en celulas precursoras neurales (metodo SDIA)

Se sometieron celulas ES humanas (KhES-1, KhES-4 y KhES-5) a induccion de la diferenciacion realizada por un metodo de actividad de induccion derivada de celulas del estroma (metodo SDIA) usando LDN-193189 a una concentracion que oscilaba de 5 nM a 1000 nM, con el fin de determinar una concentracion optima de LDN-193189.

La Fig. 14 muestra imagenes de tincion obtenidas usando anticuerpo anti-nestina en el dla 14 despues de la induccion de la diferenciacion. La diferenciacion de celulas Kh-ES5 se indujo anadiendo SB431542 y LDN-193189 (a varias concentraciones) a las celulas, para inducir su diferenciacion en celulas precursoras neurales. Por tanto, se confirmo que la diferenciacion de celulas KhES-5 en celulas precursoras neurales se indujo relativamente satisfactoriamente cuando la concentracion de LDN-193189 fue 50 nM o superior (grupo L50S, grupo L100S y grupo L500nMS). Por tanto, no se observo que el efecto aumentara cuando la concentracion de LDN-193189 fue superior a 50 nM.

A continuation, la llnea celular KhES-1 y la llnea celular KhES-4 se sometieron a induccion de la diferenciacion anadiendo LDN-193189 y SB431542. Asl se confirmo que las celulas positivas para nestina fueron relativamente satisfactorias cuando la concentracion de LDN-193189 oscilo de 25 nM a 75 nM (Fig. 15A). Similarmente, las celulas se tineron con el marcador neural Pax6. Se confirmo que las celulas se tineron con el mayor grado cuando la concentracion de LDN-193189 fue 20 nM (Fig. 15B).

Ejemplo 5

Las celulas neurales que indujeron eficiencia con 6 combinaciones de farmacos se mostraron en la Fig. 16. Cada combination de farmacos no fue diferente entre si, pero bajo la condition de DFK5% pre-establecido que contiene dorsomorfina y SB431542, la induccion neural de la diferenciacion es un efecto mas bajo que los otros. Por otra parte, la condicion de GMK8% que contuvo LDN913189 y A-83-01 tuvo mayor probabilidad de supervivencia que la de la condicion de DFK5% que contuvo dorsomorfina y SB431542.

Los diversos tipos de genes marcadores (Oct3/4, PSA-NCAM, Tuj-1, SSEA1 y SSEA4) de celulas diferenciadas cultivadas en la condicion de GMK8% que contuvo LDN913189 y A-83-01 se analizaron con citometro de flujo (Fig. 17). Los genes marcadores no diferenciados (Oct3/4 y SSEA4) disminuyeron y aumentaron los marcadores de genes neurales (PSA-NCAM, Tuj-1 y SSEA1). Para este resultado, la condicion de cultivo se indujo a diferenciacion neural eficaz.

Aplicabilidad industrial

Segun la presente invention, es posible producir eficientemente celulas precursoras neurales a partir de celulas madre pluripotentes tales como celulas ES o celulas iPS, mientras que se disminuye una tasa de supervivencia de celulas no diferenciadas. Las celulas precursoras neurales pueden usarse en el campo de la medicina regenerativa prevista para tratar enfermedades del sistema nervioso.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de induccion de la diferenciacion de una celula madre pluripotente en una celula precursora neural, que comprende cultivar la celula madre pluripotente en presencia de un inhibidor de BMP de molecula pequena y un

   5 inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena, en el que el inhibidor de BMP de molecula pequena es dorsomorfina o LDN-193189, en el que el inhibidor de la familia TGFp de molecula pequena es SB431542 o A-83-01, en el que la concentracion de LDN-193189 es superior a 50 nM.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el cultivo se realiza con formacion de un cuerpo embrioide en 10 condicion sin suero.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el cultivo se realiza sobre una placa de recubrimiento Matrigel™ sin usar celulas nodrizas.

   15 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la celula madre pluripotente es una celula

   madre pluripotente inducida.