ES2590482T3 - Cepas y métodos para mejorar la salud y/o el rendimiento de los rumiantes - Google Patents

Abstract

Una cepa 8G-134 de Bacillus pumilus aislada, depositada como NRRL B-50174.

Description

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unidad de observación fue la botella, y los tratamientos se realizaron por cuadruplicado. Los tratamientos consistieron en control (con glucosa añadida pero sin DFM), Enterococcus faecium cepa 8G-1, Enterococcus faecium cepa 8G-73, y Bacillus pumilus cepa 8G-134. Las botellas se purgaron con CO2 y se taparon. Las botellas se mantuvieron en un baño de agua agitado a 39 °C y 140 rpm. Aproximadamente 10 minutos antes de la toma de muestras, las botellas fueron ventiladas brevemente para liberar gases producidos como subproducto de la fermentación. El fluido ruminal fue sacado de cada botella inicialmente y cada 6 horas hasta la marca de 36 horas. El pH del rumen y los ácidos grasos volátiles se midieron y se registraron. Se realizó el análisis estadístico usando el análisis de medidas repetidas para determinar los efectos de DFM a lo largo del tiempo o ANOVA de un solo factor para determinar si el tratamiento afecta a puntos específicos en el tiempo.

El foco de los experimentos ruminales in vitro era determinar si las cepas DFM candidatas, Enterococcus faecium cepa 8G-1, Enterococcus faecium cepa 8G-73, y Bacillus pumilus cepa 8G-134, podían influir positivamente en la fermentación ruminal en un entorno de exceso de energía. Se añadió exceso de glucosa a cada ruminal in vitro, para replicar la congestión del ganado con un hidrato de carbono fácilmente fermentable. Como se muestra en la Figura 3, la adición de cada una de las cepas candidatas aumentó significativamente la utilización de la glucosa a lo largo del tiempo (P = 0,0001). En comparación con el control (Figura 4), la influencia sobre la producción de ácido láctico a lo largo del tiempo también se vio afectada significativamente por la adición del DFM candidato al modelo in vitro provocado (P = 0,0025). En el momento puntual de 36 horas, había una producción de ácido láctico de 17% menos en el B. pumilus y 32% menos de acumulación de ácido láctico en los dos candidatos de Enterococcus.

El análisis de ácidos grasos volátiles se realizó a través de HPLC. Los VFA (volatile fatty acids) totales (acetato + propionato + butirato) se vieron afectados significativamente por la adición de los Enterococcus candidatos (P = 0,0279) (Figura 5). Los Enterococcus candidatos, 8G-1 y 8G-73, parecían hacer aumentar la cantidad de VFA de total producida a lo largo del tiempo. No hubo ningún efecto significativo en la producción total de VFA cuando se compara el candidato B. pumilus con el control.

Los resultados in vitro indicaronn que los DFMs candidatos 8G-1, 8G-73 y 8G-134 afectaron positivamente a la fermentación ruminal aumentando la utilización de glucosa sin el correspondiente aumento de la producción de ácido láctico en comparación con la del tratamiento testigo o de control. El exceso de glucosa en el rumen es fermentado típicamente de una manera rápida con la producción de ácido láctico. Es la acumulación de ácido láctico lo que impulsa una respuesta acidótica aguda. Utilizando la glucosa sin la producción concurrente de ácido láctico, los DFMs candidatos han demostrado el potencial para mejorar los efectos de la acidosis. El modelo ruminal in vitro sugiere que estas cepas pueden ser capaces de modular con éxito la energía ruminal en exceso en ganado alimentado con cantidades elevadas de hidratos de carbono fácilmente fermentables.

Ejemplo 3

Prueba de DFM candidato en ganado alimentado con hidratos de carbono fácilmente fermentables – provocación de una acidosis aguda:

Materiales y métodos:

Ganado y asignaciones de corrales:

Se compraron veinte bueyes de carne mestizos en los establos de venta locales. El ganado fue alojado en las instalaciones de investigación durante un período de dos semanas antes de la iniciación del experimento para la observación de la morbidez o la mortalidad. El ganado se bloqueó aleatoriamente a través del tratamiento por el peso. Cinco cabezas de ganado fueron asignadas a un corral y los corrales se designaron a uno de cuatro tratamientos. Los tratamientos consistieron en 3 corrales recibiendo cada uno un DFM diferente como se detalla a continuación, no recibiendo DFM el cuarto corral (control). Las asignaciones de tratamiento se pueden ver en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2. Asignaciones de tratamiento por corral

ID del corral

DMF candidato (TX) Dosis mínima (UFC/cabeza/día) Identificación del rANR 16s

1

Ninguno 0 Ninguno (control)

2

8G-1 5 x 1010 Enterococcus spp.

3

8G-73 5 x 1010 Enterococcus spp.

4

8G-134 5 x 109 Bacillus pumilus

La ración de pienso diaria para todos los grupos de tratamiento antes de la provocación consistió en 62,5% de fibra celulósica y 30% de maíz quebrado y 7,5% de suplemento de proteínas (Tabla 3). El suplemento de proteínas contenía monensina (Rumensin®) administrada a razón de 375 mg/cabeza /día. El suplemento de proteínas también contenía fosfato de tilosina (Tylan®).

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Tabla 3. Composición de la ración de provocación

Ingrediente

% de la dieta

Dieta previa a la provocación

Heno de suelo 62,5

Maíz quebrado

30

Steakmaker ® K+ 45-25 R500 T 180*

7,5

Dieta de provocación

Maíz descamado al vapor 87,4

Pellas de alfalfa

5,1

Steakmaker ® K+ 45-25 R500 T 180*

7,5

*Ambas raciones contienen Rumensina y Tylan.

El ganado se alimentó con 15 libras (6,8 kg)/cabeza /día de la ración una vez por la mañana y tenía cualquier alimento restante empujado próximo al puntal de alimentación a última hora de la tarde. Catorce días antes del ayuno, los grupos de tratamiento fueron DFMs candidatos alimentados a las dosis designadas en la Tabla 2 anterior como top dressing en la ración diaria.

El Bacillus pumilus cepa 8G-134 se administró a un mínimo de 5 x 109 UFC/cabeza/día. Los Enterococcus candidatos 8G-1 y 8G-73 fueron administrados a razón de 5 x 1010 UFC/cabeza/día.

Preparación de DFM candidato:

Cepas de DFM candidatos, previamente seleccionadas para el ensayo de provocación, fueron Enterococcus spp. 8G-1 y 8G-73, y Bacillus pumilus cepa 8G-134. Las cepas se almacenaron a -80 °C. Cada cultivo se inoculó en tubos de caldo de 10 ml que contienen MRS (Man, Rogosa y Sharp) o TSB (caldo tríptico de soja). Los tubos de caldo se incubaron durante 24 horas a 32 °C y 37°C para los candidatos Bacillus y Enterococcus, respectivamente. Los cultivos se señalaron para el aislamiento en el medio de agar respectivo y se incubaron. Se recogió una colonia aislada en 10 ml de caldo y se dejó crecer hasta la fase semilogarítmica (18 a 24 h) y se transfirió a caldo fresco (10% vol/vol de transferencia). Los Enterococcus candidatos se cultivaron a 37°C en caldo MRS. El Bacillus se desarrolló en un incubador con agitación a 130 rpm a 32 °C en tubos de TSB horizontales. Para el crecimiento de Enterococcus, se transfirieron 2 ml a una botella de 250 ml que contiene 198 ml de caldo y se incubaron durante 18 horas.

Los 200 ml de cultivo se inocularon en una botella de 2 L que contenía 1,8 L de caldo y se dejó incubar durante 18 hr. Para los Bacillus candidatos, se transfirieron 5 ml a un matraz de 250 ml que contiene 50 ml de TSB y después se incubó a 32°C en un incubador con agitación a 130 rpm durante 24 horas. Los 50 ml se utilizaron para inocular un matraz de 1 litro conteniendo 600 ml y se dejó incubar durante otras 24 horas.

Se tomó la densidad óptica (OD) del cultivo de 18 h de candidatos de Enterococcus antes de recolectar las células. La OD fue comparada con las curvas de crecimiento previas para determinar el valor de UFC/ml de cultivo. Las muestras se pusieron en placas para la enumeración y la huella genética. Se aseguró el control de calidad entre cada lote de fermentación mediante el análisis RAPD-PCR. Con un objetivo mínimo de 5,0e10 ufc/cabeza/día para candidatos de Enterococcus, se dispensó la cantidad calculada de cultivo en botellas de centrífuga Nalgen de 250 ml y se centrifugó a 4 °C durante 10 minutos a 4500 rpm. El objetivo mínimo para el candidato de Bacillus era 5,0e9 cfu/cabeza/día y un total de 100 ml del cultivo de Bacillus fue centrifugado de modo similar al Enterococcus. El sedimento se resuspendió en 30 ml de medio de crecimiento que contiene 10% de glicerol. Esta cantidad fue transferida a un tubo cónico de 50 ml. Las botellas de centrífuga se enjuagaron después con 10 ml de caldo y se transfirieron al mismo tubo cónico. Las muestras fueron etiquetadas con la cepa, la fecha en la que se recolectó el candidato, y el número de lote de fermentación. Se utilizaron recuentos de placa para determinar la UFC total en cada tubo. Los tubos se combinaron para suministrar recuentos de un mínimo de 5,0e10 ufc/cabeza/día para candidatos de Enterococcus y 5,0e9 ufc/cabeza/día para candidatos de Bacillus. Todos los tubos cónicos fueron congelados a -20 °C.

Dieta de provocación y fase de recogida de fluido ruminal:

Se obtuvieron muestras de fluido ruminal de los animales individuales a través de una intubación ruminal usando un tubo de recogida dotado de un filtro y unido a una fuente de vacío a través de un matraz de vacío. El pH se midió inmediatamente después de la adquisición del fluido ruminal y las muestras se congelaron para transportarlas a Agtech Products, Inc. para su análisis de VFA. Se recogieron muestras de todo el ganado en los tiempos de toma de muestra -12 h, +6 h, +10 h, +14 h, +18 h, +22 h, +30 h, +36 h y +48 h, representando el tiempo 0 h el inicio de la

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Periodo seco Periodo de lactancia

NFC

33,47 41,87

Grasa

3,82 4,15

Ca

0,31 0,87

P

0,29 0,34

Mg

0,54 0,42

K

1,72 1,33

NeL, mcal/kg

1,60 1,74

Recogida de muestras y datos:

Se recogieron muestras diarias y rechazos de TMR y se compusieron semanalmente, las composiciones semanales se combinaron mensualmente, y las muestras mensuales se analizaron en relación con la materia seca (MS), proteína cruda (CP), proteína unida a fibra detergente ácida (ADF-CP), proteína unida a fibra detergente neutra (NDF-CP), proteína soluble (SP), fibra detergente ácida (ADF), fibra detergente neutra (FDN), lignina, grasa, almidón, azúcar, ceniza, calcio (Ca), fósforo (P), magnesio (Mg) , potasio (K), azufre (S), sodio (Na), cloro (Cl), hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn), y cobre (Cu), por Cumberland Valley Analytical Services, Maugansville, MD.

Las vacas se ordeñaron dos veces al día, y el volumen de leche se registró electrónicamente en cada ordeño y las cantidades am-pm (de mañana y tarde) se sumaron para un total diario. Una vez a la semana las muestras de leche de ordeños de mañana (am) y tarde (pm) se juntaron para el análisis del contenido de grasa, proteínas, células somáticas, sólidos no grasos, y nitrógeno de urea en la leche (MUN) por el laboratorio lácteo Dairy One en State College, PA utilizando un Fossamatic 4000 (FOSS; Eden Prairie, MN).

Los animales estuvieron en estudio desde aproximadamente tres semanas antes del parto a través de 22 semanas después del parto. El peso del animal se estimó por el perímetro torácico en las semanas 1, 3, 7, 11, 15 y 18 después del parto. La condición corporal fue evaluada por dos observadores independientes al mismo tiempo que se tomó el peso corporal.

Se tomaron muestras de sangre de la vena coccígea, se recolectó suero, se congeló y se analizó en relación con la glucosa, beta-hidroxi butirato (BHB), y ácidos grasos no esterificados (NEFA) en las semanas 2 y 8 después del parto. La glucosa y el BHB se analizaron usando un medidor Abbott Precision Xtra™ (Abbott Diabetes Care Inc., Alameda, CA). Se usó un kit de ensayo Randox (Cat. HN 1530, Randox Laboratories, Irlanda del Norte) para medir la concentración en suero de ácidos grasos no esterificados (NEFA) adaptado a un lector de placas de un ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELISA) a una longitud de onda de 550 nm para muestras múltiples. El kit Randox usa Acil CoA sintetasa y oxidasa para convertir NEFA en 2,3-trans-Enoil-CoA más peróxido; peróxido más de N-etil-N-(2-hidroxi 3-sulfopropil) m-tolueno conduce a un producto púrpura, que es el indicador de la concentración de NEFA en el suero.

Modelos estadísticos.

La producción de leche y el contenido, peso corporal y puntuación de la condición corporal se analizaron usando el procedimiento mixto en el software estadístico SAS. La vaca fue el sujeto repetido con la matriz de covarianza ajustada a la estructura de correlación de tipo 1. Las observaciones diarias de la leche fueron agregadas por semana después del parto. El modelo estadístico fue el siguiente:

Yi = ui + TRTj + Lactk + Semana1 + TRTj*Lactk + TRTj*Semana1 + TRTj*Lactk*Semana1 + ejklm

en donde

Yi = media de mínimos cuadrados de las variables dependientes de la producción;

ui = media global de las diversas variables de producción;

TRTj = j-ésimo efecto del tratamiento, 1, 2, 3;

Lactk = k-ésima lactancia, 1, 2+;

Semana1 = 1ª semana, 1. . . 22;

términos de interacción (TRTj*Lactk+TRTj*Semana1 + TRTj*Lactk*Semana1)

ejklm=error

Muestras mensuales de TMR y rechazos de alimento para cada tratamiento fueron ensayadas en cuanto a la diferencia usando el procedimiento de medias en SAS.

Las concentraciones en sangre de glucosa, BHB y NEFA se analizaron usando los modelos lineales generales en el software estadístico SAS. Las variables de clase eran vaca, semana y tratamiento. El tratamiento se anidó en la 5 vaca y fue el término de error para la prueba de significación del tratamiento. El tratamiento por interacción de semana se ensayó para la significación estadística utilizando el error residual.

Resultados:

La composición media de TMR para TMR secas y en lactancia se presenta en la Tabla 6 en el curso del estudio. La composición no fue diferente entre los grupos de tratamiento.

10 Tabla 6. Composición analizada de TMR para vacas secas y vacas en lactancia.

--

Tratamiento, base % Mat. seca

--

Item

1 2 3 SEM

--

TMR seca

N

3 3 3

CP

13,64 13,17 13,11 0,14

ADF

29,55 28,37 27,88 0,53

NDF

48,54 48,04 47,14 0,93

Lignina

3,64 3,52 3,58 0,09

Almidón

18,74 18,19 17,97 0,87

Azúcar

6,71 6,15 6,57 0,23

Ceniza

8,44 7,56 7,79 0,10

NFC

39,49 36,93 38,20 0,86

Ca

0,49 0,46 0,47 0,01

P

0,37 0,35 0,35 0,004

TMR lactante

N

9 9 9

CP, %

14,54 14,81 14,37 0,10

ADF, %

21,54 21,38 21,64 0,25

NDF, %

33,51 33,21 33,30 0,32

Lignina, %

3,27 3,27 3,26 0,06

Almidón, %

25,36 26,52 25,48 0,38

Azúcar, %

6,25 6,15 6,25 0,15

Grasa, %

3,89 3,65 3,62 0,04

Ceniza, %

8,73 8,67 8,60 0,09

NFC, %

41,22 42,02 41,44 0,34

Ca, %

0,95 0,97 0,96 0,005

--

Tratamiento, base % Mat. seca

--

Item

1 2 3 SEM

P, % 0,36 0,36 0,36 0,003

error estándar de la media (SEM) NFC, carbohidrato no de fibra NDF, fibra detergente neutra ADF, fibra detergente ácida Tratamiento 1 control; Tratamiento 2, Bacillus pumilus a 8G-134 5 x 109; Tratamiento 3, Bacillus pumilus

a 8G-134 a 1 x 1010

Una vaca de control (Tratamiento 1) mostró una producción anómala de leche y sus datos se eliminaron del análisis de datos. El análisis de la producción de leche se repitió en 29 vacas. La producción de leche se vio influenciada significativamente por el tratamiento (Tabla 7, más abajo). Las vacas fueron alimentadas con Bacillus pumilus 8G134 a 5 x 109 UFC/cabeza/día (Tratamiento 2) y Bacillus pumilus 8G-134 a 1 x 1010 UFC/cabeza/día (Tratamiento 3).

5 Los Tratamientos 2 y 3 produjeron aproximadamente 2 kg más de leche que los tratamientos 1 (Tabla 7). Hubo una interacción significativa con la paridad o número de parto. Los aumentos de producción fueron significativos en vacas en segunda paridad en 5,2 kg, pero no hay diferencias significativas en la producción de leche en las vacas en primera paridad.

Tabla 7. Producción media de leche por mínimos cuadrados en vacas Holstein desde el parto a lo largo de 22 10 semanas posteriores al parto alimentadas con un aditivo microbiano.

---

Efecto

Tratamiento Lactancia Leche, kg/d sem Cambio en relación sem

kg/d

con el control

Tratamiento

1 33,12a 0,65 0,00

Tratamiento Tratamiento

0,66 0,60 0,61 2 3 35,38b 35,08b 0,60 0,61 2,30* 1,99*

Lactancia Lactancia Interacción

0,47 0,39 1,07 0,93 0,93 1 2 3 1 2 1 1 1 31,59a 36,84b 32,44a 31,70a 31,36a 0,47 0,39 1,07 0,93 0,93 -0,83 3,09* 0,00 -0,72 -1,07

0,74

1 2 33,80b 0,74 0,00

5

10

15

---

Efecto

Tratamiento Lactancia Leche, kg/d kg/d sem Cambio en relación con el control sem

2

2

39,06c 0,76 5,24*

0,76

3

2 38,79c 0,79 5,17*

0,79

Las medias difieren dentro del grupo con superíndice diferente, P < 0,05 El cambio de media con * difiere significativamente de 0. Tratamiento 1 control; Tratamiento 2, Bacillus pumilus 8G-134 a 5 x 109; Tratamiento 3, Bacillus pumilus 8G-134

a 1 x 1010

La grasa de leche y el rendimiento se presentan en la Tabla 8 que sigue. La grasa de la leche aumentó significativamente por los Tratamientos 2 y 3 por encima del control. Las respuestas del rendimiento siguieron el rendimiento de leche con el rendimiento de grasa aumentado en los grupos de tratamiento alimentados con Bacillus pumilus 8G-134. El ganado de Bacillus pumilus 8G-134 para el tratamiento 2 y 3 produjo un porcentaje de grasa significativamente más alto por encima del control con niveles 0,24% y 0,31% más altos, respectivamente (Tabla 8). Unido al aumento significativo de la producción de leche, el rendimiento de grasa diario para ambos tratamientos 2 y 3 proporcionó un aumento significativo en la producción diaria de grasa por encima de la del control (Tabla 8).

Tabla 8. Contenido de grasa en la leche por grupos de tratamiento.

---

Efecto

Tratamiento Lactancia Grasa, % sem Rendimiento de sem

grasa, kg/d

----

Tratamiento

1 2 3 3,57a 3,81b 3,88b 0,09 0,08 0,08 1,206a 1,351a 1,351b 0,042 0,039 0,039

Lactancia

1 2 3,76 3,78 0,06 0,05 1,159a 1,395b 0,030 0,025

Medias dentro de la columna con diferente superíndice difieren en P <0,05. Tratamiento 1 control; Tratamiento 2, Bacillus pumilus 8G-134 a 5 x 109; Tratamiento 3, Bacillus pumilus 8G-134 a 1 x 1010

El log de las puntuaciones del recuento de células somáticas (LogSCC) lineales fueron diferentes por tratamiento y lactancia. Los tratamientos con Bacillus pumilus 8G-134 (Tratamientos 2 y 3) tenían puntuación log lineal significativamente más baja que las vacas de control (Tabla 9, más abajo). Las vacas de los tratamientos 2 y 3 tenían LogSCC de 4,97 y 4,96, respectivamente, en comparación con los de las vacas de control a 5,92. Las vacas de paridad dos tenían una puntuación lineal log significativamente más alta que las vacas de primera lactancia. Los recuentos de células somáticas se asocian a la infección, así como al estado inmunológico y la salud de la vaca lechera en lactación. Además el aumento de SCC es indicativo de respuestas inflamatorias a la infección. Las disminuciones en SCC demostradas aquí pueden indicar que las vacas alimentadas con el Bacillus pumilus 8G-134 son inmunológicamente mejores para manipular la provocación infecciosa durante la lactancia y mantener la salud de la ubre y de la vaca.

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----------Grupo de tratamiento ----------

----

Item

1 sem 2 sem 3 sem

BHB, mg/dl 0,21

0,92 0,21 0,86 0,21 1,39

0,21

1,17 0,21 0,89 0,21 0,91

NEFA, ueq/ml 0,05

0,41 0,05 0,23 0,05 0,28

0,05

0,07 0,05 0,10 0,05 0,07

BHB = beta-hidroxi butirato

Tratamiento 1 control; Tratamiento 2, Bacillus pumilus a 8G-134 5 x 109; Tratamiento 3, Bacillus pumilus 8G-134 a 1 x 1010 DMI previsto: (0,372 * FCM + 0,0968 * BWT (kg)^0,75) * (1 – exp(-0,192 * (semana+3,67)))

Las diferencias de DMI y los valores de producción podrían sugerir que las vacas en los tratamientos 2 y 3 podrían haber movilizado más tejido corporal que las vacas de control para producir más leche y haber comido menos de lo esperado. Sin embargo, los valores de NEFA, glucosa y BHB en suero sugieren que estas vacas estaban en un estado de energía similar al de las vacas de control (Tabla 10, más arriba). Además, el peso corporal y BCS fueron similares para los grupos de Bacillus en relación con el grupo de control (Tabla 11, más abajo). Esto sugiere que no movilizaron más tejido corporal para producir el volumen de leche adicional, indicando la eficiencia de conversión del alimento en los Tratamientos 2 y 3 de alimentación de las vacas, al margen de la dosis.

Tabla 11. Peso corporal medio de mínimos cuadrados (libras (kg)) y puntuación de la condición corporal por grupos de tratamiento. La puntuación de la condición corporal es la puntuación media de dos observadores.

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Efecto

Tratamiento Lactancia Peso sem BCS sem

libras (kg)

----

Tratamiento

1 2 3 1343,10 (609,7) 1324,60 (601,1) 1388,02 (630,2) 28,49 (12,93) 27,54 (12,50) 27,73 (12,59) 2,92 3,13 3,06 0,03 0,03 0,03

Lactancia Lactancia Tratamiento interacción lactancia

x 1 2 1223,31 (550,7) 1476,62 (670,1) 21,87 (9,93) 19,94 (8,14) 3,04 3,01 0,02 0,02

1 2 3

1 1 1 1170,78 (531,2) 1242,64 (563,9) 1208,50 (548,4) 27,72 (12,58) 25,26 (11,47) 24,00 (10,90) 3,06 3,17 2,94 0,05 0,05 0,05

1 2 3

2 2 2 1486,02 (674,6) 1406,42 (638,3) 1547,85 (702,7) 19,33 (8,78) 19,96 (9,06) 20,79 (9,44) 2,78 3,10 3,16 0,04 0,04 0,04

Peso en libras (kg)

BCS = puntuación de la condición corporal, escala 1 a 5 en 0,25 puntos; 1 = animal emaciado, 2 = delgado, 3 = medio, 4 = gordo, 5 = obeso

Tratamiento 1 control; Tratamiento 2, Bacillus pumilus a 8G-134 5 x 109; Tratamiento 3, Bacillus pumilus 8G134 a 1 x1010

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Claims (1)

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