ES2590679T3 - Glicopolisialilación de proteínas diferentes a proteínas de coagulación de la sangre - Google Patents

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Abstract

Un método para conjugar ácido polisiálico (PSA) o un PSA modificado (mPSA) a una unidad estructural oxidada de una glicoproteína diferente a una proteína de coagulación de la sangre que comprende un grupo carbohidrato, que comprende poner en contacto la unidad estructural carbohidrato oxidada con el PSA o el mPSA bajo condiciones que permite la conjugación, en donde dicho PSA o mPSA contiene un grupo aminooxi y se forma un enlace oxima entre la unidad estructural carbohidrato oxidada y el grupo aminooxi sobre el PSA o el mPSA, en donde el PSA modificado es PSA que comprende una unidad estructural derivada de una unidad estructural de ácido N-acetilneuramínico terminal por oxidación o reducción.

Description

DESCRIPCION
Glicopolisialilacion de protelnas diferentes a protelnas de coagulacion de la sangre Campo de la invencion
La presente invencion se relaciona con materiales y metodos para conjugar acido polisialico, a glicoprotelnas que 5 contienen carbohidratos diferentes a protelnas de coagulacion de la sangre, y con los conjugados obtenidos.
Antecedentes de la invencion
La conjugation de farmacos polipeptldicos tales como la PEGilacion o polisialilacion los protege de la degradation en la circulation sangulneos y mejora as! sus perfiles farmacodinamicos y farmacocineticos (Harris and Chess, Nat Rev Drug Discov. 2003;2:214-21; S. Jain, D. Hreczuk-Hirst, P. Laing and G. Gregoriadis, Drug Delivery Systems and 10 Sciences, 4 (No 1): 3-9, 2004.). El proceso de PEGilacion une unidades repetitivas de etilenglicol (polietilen glicol (PEG)) a un farmaco polipeptldico. Las moleculas de PEG tienen un volumen hidrodinamico grande (5-10 veces el tamano de las protelnas globulares), son altamente solubles en agua e hidratadas, no toxicas, no inmunogenicas y se eliminan rapidamente del cuerpo. La PEGilacion de las moleculas puede llevar a resistencia incrementada de los farmacos a la degradacion enzimatica, vida media in vivo o incrementada, frecuencia de dosificacion reducida, 15 inmunogenicidad disminuida, estabilidad flsica y termica incrementada, solubilidad incrementada, estabilidad en llquido incrementada y agregacion reducida. Los primeros farmacos PEGilados fueron aprobados por la FDA al inicio de la decada de 1990. Desde entonces, la FDA ha aprobado varios farmacos PEGilados para administration oral, inyectable y topica.
Los acidos sialicos (tambien llamados acidos N-acetil neuramlnicos) y los acidos polisialicos se encuentran 20 ampliamente distribuidos en los tejidos animales y en un menor grado en otras especies que varlan desde plantas y hongos hasta levaduras y bacterias, principalmente en glicoprotelnas y gangliosidos.
La abreviatura “PSA” usada aqul se refiere al termino “acido polisialico”. De la misma manera el termino “mPSA” utilizado aqul se refiere al termino “acido polisialico modificado”.
Los PSAs consisten de pollmeros (generalmente homopollmeros) de acido N-acetilneuramlnico. El grupo amino 25 secundario porta normalmente un grupo acetilo, pero puede portar en su lugar un grupo glicolilo. Los sustituyentes posibles para los grupos hidroxilo incluye grupos acetilo, lactilo, etilo, sulfato y fosfato.
imagen1
Estructura del acido sialico (acido N-acetilneuramlnico)
30 Los PSAs y mPSAs comprenden en general pollmeros lineales que consisten esencialmente de unidades estructurales de acido N-acetilneuramlnico enlazadas por uniones 2,8- o 2,9-glicosldicas o combinaciones de estas (por ejemplo, alternando uniones 2,8- y 2,9-). En PSAs y mPSAs particularmente preferidos, los enlaces glicosldicos son a-2,8. Tales PSAs y mPSAs son derivados convenientemente de acidos colomlnicos, y se denominan aqul como “CAs” y mCAs”. Los PSAs y mPSAs tlpicos comprenden al menos 2, preferiblemente al menos 5, mas preferiblemente al 35 menos 10 y lo mas preferiblemente al menos 20 unidades estructurales de acido N-acetilneuramlnico. Asl, pueden comprender de 5 a 500 unidades estructurales de acido N-acetilneuramlnico, preferiblemente de 10 a 300 unidades estructurales de acido N-acetilneuramlnico. Los PSAs y CAs pueden ser pollmeros que comprenden diferentes unidades estructurales azucar. Pueden ser copollmeros. Los PSAs y CAs preferiblemente estan libres esencialmente de unidades estructurales azucar diferentes al acido N-acetilneuramlnico. Los PSAs y CAs comprenden 40 preferiblemente al menos 90%, mas preferiblemente al menos 95% y lo mas preferiblemente al menos 98% de unidades estructurales de acido N-acetilneuramlnico.
Cuando los PSAs y CAs comprenden unidades estructurales diferentes a acido N-acetilneuramlnico (como, por
ejemplo en mPSAs y mCAs) estan localizadas preferiblemente en uno o en ambos de los extremos de la cadena polimerica. Tales “otras” unidades estructurales pueden, por ejemplo, ser unidades estructurales derivadas de unidades estructurales de acido N-acetilneuramlnico terminales por oxidacion o reduccion.
Por ejemplo, la WO-A-0187922 describe tales mPSAs y mCAs en los cuales la unidad de acido N-acetilneuramlnico 5 terminal no reductora es convertida a un grupo aldehldo por reaccion con peryodato de sodio. Adicionalmente, la WO 2005/016974 describe tales mPSAs y mCAs en los cuales la unidad de acido N-acetilneuramlnico terminal reductora es sometida a reduccion para abrir reductivamente el anillo en la unidad de acido N-acetilneuramlnico terminal reductora, con lo cual se forma un grupo diol vecinal, seguido por oxidacion para convertir el grupo diol vecinal a un grupo aldehldo.
10 Las glicoprotelnas ricas en acido sialico se enlazan a la selectina en humanos y otros organismos. Juegan un papel importante en las infecciones por influenza humanas. Por ejemplo, el acido sialico puede ocultar antlgenos de la manosa sobre la superficie de las celulas huesped o bacterias de la lectina que se enlaza a la manosa. Esto evita la activacion del complemento. Los acidos sialicos tambien ocultan el penultimo residuo de galactosa evitando as! la eliminacion rapida de la glicoprotelna por el receptor de galactosa sobre las celulas parenquimales hepaticas.
15
Estructura del acido colominico (homopolimero del acido N-acetilneuraminico)
Los CAs son producidos, inter alia, por cepas particulares de Escherichia coli que poseen el antlgeno K1. Los Cas tienen muchas funciones fisiologicas. Son importantes como materia prima para farmacos y cosmeticos.
20 Estudios comparativos in vivo con aspariginasa polisialilada y no modificada revelaron que la polisialilacion incrementa la vida media de la enzima (Fernandes and Gregoriadis, Biochimica Biophysica Acta 1341: 26-34, 1997).
La preparacion de conjugados mediante la formation de un enlace covalente entre el pollmero soluble en agua y la protelna terapeutica puede llevarse a cabo mediante una variedad de metodos qulmicos. Una metodologla para acoplar PSA a las protelnas terapeuticas es la conjugation de los pollmeros a traves de las unidades estructurales 25 carbohidrato de la protelna. Los grupos hidroxilo (OH) vecinales de los carbohidratos en las protelnas pueden ser oxidados facilmente con peryodato de sodio (NaIO4) para formar grupos aldehldo activos (Rothfus and Smith, J Biol Chem 1963; 238:1402-10; van Lenten and Ashwell, J Biol Chem 1971;246:1889-94). Subsecuentemente, el pollmero puede ser acoplado a los grupos aldehldo del carbohidrato mediante el uso de reactivos que contienen, por ejemplo, un grupo hidrazida activo (Wilchek M and Bayer EA, Methods Enzymol 1987;138:429-42). Una tecnologla mas reciente 30 es el uso de reactivos que contienen grupos aminooxi que reaccionan con aldehldos para formar enlaces oxima (WO 96/40662, WO2008/025856).
Ejemplos adicionales que describen la conjugacion de un PSA a una protelna terapeutica estan descritos en la publication de los Estados Unidos No. 2009/0076237 la cual ensena la oxidacion de RFVIII y el acoplamiento subsecuente a PSA y otros pollmeros solubles en agua (por ejemplo, PEG, HES, dextrano) utilizando qulmica de 35 hidrazida; la WO 2008/025856 que ensena la oxidacion de diferentes factores de coagulation, por ejemplo rFIX, FVIII y FVIIa y el acoplamiento subsecuente a un pollmero, por ejemplo, PEG; la WO 2006/016168 que ensena la conjugacion de PSA que tiene un grupo N-hidroxisuccinimida a grupos amino de protelnas; la WO 2008/012540 que ensena la conjugacion de PSA oxidado al grupo amino N-terminal de protelnas.
Recientemente, se ha descrito un metodo mejorado que comprende oxidacion moderada con peryodato de acidos 40 sialicos para generar aldehldos seguida por reaccion con un reactivo que contiene el grupo aminooxi en la presencia de cantidades catallticas de anilina (Dirksen A and Dawson PE, Bioconjugate Chem. 2008;19,2543-8; and Zeng Y et al., Nature Methods 2009;6:207-9). Los catalizadores de anilina aceleran dramaticamente la ligacion de la oxima,
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permitiendo el uso de concentraciones muy bajas de reactivos.
Independientemente de los metodos disponibles para conjugar pollmeros solubles en agua a protelnas terapeuticas, se mantiene una necesidad por el desarrollo de materiales y metodos para conjugar pollmeros solubles en agua a compuestos que contienen carbohidratos diferentes a protelnas de coagulacion de la sangre que mejoren las propiedades farmacodinamicas y/o farmacocineticas de los compuestos a la vez que minimizan los costes asociados con los diversos reactivos.
Resumen de la invencion
La presente invencion provee materiales y metodos para conjugar un pollmero soluble en agua a un compuesto que contiene carbohidrato diferente a una protelna de coagulacion de la sangre que mejora las propiedades farmacodinamicas y/o farmacocineticas del compuesto a la vez que minimiza los costes asociados con los diversos reactivos.
Asl, la invencion provee un metodo para conjugar PSA o mPSA una unidad estructural de carbohidrato oxidado de una glicoprotelna diferente a una protelna de coagulacion de la sangre, que comprende poner en contacto la unidad estructural carbohidrato oxidada con el PSA o mPSA bajo condiciones que permiten la conjugacion, en donde dicho PSA o mPSA contiene un grupo aminooxi y se forma un enlace oxima entre la unidad estructural carbohidrato oxidada y el grupo aminooxi sobre el PSA o el mPSA, en donde el mPSA es PSA que comprende una unidad estructural derivada de una unidad estructural de acido N-acetilneuramlnico terminal por oxidacion o reduccion.
La unidad estructural carbohidrato puede ser oxidada utilizando una enzima oxidante especlfica para azucares (por ejemplo, galactosa o glucosa oxidasa) o por incubacion con un regulador que comprende un agente oxidante seleccionado de peryodato de sodio (NaIO4) tetraacetato de plomo (Pb(OAc)4 y perrutenato de potasio (KRuO4).
La unidad estructural carbohidrato puede ser oxidada en un residuo de acido sialico, manosa, galactosa o glucosa.
El pollmero soluble en agua usado en la invencion es PSA, mPSA, CA o mCA.
En ejemplos de referencia mas adelante, el pollmero soluble en agua es PEG o PEG ramificado.
En realizaciones particulares adicionales de la invencion ilustrada en los ejemplos mas adelante, el pollmero soluble en agua es acido polisialico (PSA) o un PSA modificado (mPSA). El PSA o el mPSA pueden tener un rango de peso molecular de 350 Da a 120,000 Da, 500 Da a 100,000 Da, 1000 Da a 80,000 Da, 1500 Da a 60,000 Da, 2,000 Da a 45,000 Da o 3,000 Da a 35,000 Da.
El PSA o el mPSA pueden ser acido colomlnico o un acido colomlnico modificado.
En otra realizacion de la invencion, el PSA o el mPSA estan comprendidos desde aproximadamente 2-500 o 10-300 unidades de acido sialico. En aun otra realizacion, se provee el metodo antes mencionado en donde el agente oxidante es peryodato de sodio (NaIO4).
El metodo de la invencion puede comprender oxidar el pollmero soluble en agua para formar un grupo aldehldo sobre una unidad de acido sialico terminal del pollmero soluble en agua, y haciendo reaccionar el pollmero soluble en agua oxidado con un enlazante aminooxi.
En aun otra realizacion de la invencion, se provee el metodo antes mencionado en donde el pollmero soluble en agua es preparado haciendo reaccionar un enlazante aminooxi activado con pollmero soluble en agua oxidado en donde el enlazante es un enlazante homobifuncional o heterobifuncional. El enlazante homobifuncional puede tener la formula general NH2[OCH2CH2]nONH2, en donde n=1-50, preferiblemente 1-11, mas preferiblemente 1-6. El enlazante puede ser seleccionado especlficamente de:
Un enlazante 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina de la formula:
imagen3
y
un enlazante 3,6,9-trioxa-undecano-1,11-dioxamina de la formula:
imagen4
El PSA o el mPSA pueden ser oxidados por incubacion con un agente oxidante para formar un grupo aldehldo terminal en el extremo no reductor del PSA.
El metodo puede comprender oxidar el pollmero soluble en agua para formar un grupo aldehldo sobre una unidad 5 terminal del pollmero soluble en agua, por ejemplo, una unidad de acido sialico terminal del PSA o el mPSA, y haciendo reaccionar el pollmero soluble en agua oxidado con un enlazante aminooxi. En todavla otra realizacion, se provee un metodo antes mencionado en donde el enlazante aminooxi es 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina. En una realizacion relacionada, el agente oxidante es NaIO4.
En otra realizacion de la invencion, se provee el metodo antes mencionado en donde poner en contacto con la unidad 10 estructural de carbohidrato oxidado con el pollmero soluble en agua activado ocurre en un regulador que comprende un catalizador nucleofllico seleccionado del grupo consistente de anilina y derivados de anilina.
Un grupo hidrazida puede ser formado sobre el pollmero soluble en agua haciendo reaccionar el pollmero soluble en agua oxidado con un enlazante hidrazida. El enlazante hidrazida puede ser adecuadamente dihidrazida o hidrazina de acido adlpico.
15 En aun otra realizacion de la invencion, se provee un metodo antes mencionado que comprende adicionalmente la etapa de reducir un enlace oxima en la protelna conjugada, por ejemplo, incubando la protelna conjugada en un regulador que comprende un compuesto reductor seleccionado del grupo consistente de cianoborohidruro de sodio (NaCNBhb) y acido ascorbico (vitamina C). En una realizacion relacionada el compuesto reductor es cianoborohidruro de sodio (NaCNBhb).
20 En otra realizacion de la invencion, se provee una glicoprotelna conjugada producida por cualquier metodo antes mencionado. En todavla otra realizacion de la invencion, una glicoprotelna conjugada diferente a una protelna de coagulacion de la sangre comprende (a) la dicha glicoprotelna; y (b) al menos un aminooxi-PSA o -mPSA enlazado a la glicoprotelna de (a), en donde dicho aminooxi-PSA o -mPSA esta unido a la glicoprotelna a traves de una o mas unidades estructurales carbohidrato, en donde mPSA es PSA que comprende una unidad estructural derivada de una 25 unidad estructural de acido N-acetilneuramlnico terminal por oxidacion o reduccion.
Figuras
La figura 1 muestra la slntesis de enlazantes di-aminooxi solubles en agua 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina y 3,6,9- trioxa-undecano-1,11-dioxiamina.
La figura 2 muestra la preparacion de aminooxi-PSA.
30 Description detallada de la invencion
Las propiedades farmacologicas e inmunologicas de los compuestos que contienen carbohidratos, tales como glicoprotelnas diferentes a protelnas de coagulacion de la sangre pueden mejorarse mediante la modification qulmica y conjugation con pollmeros solubles en agua, en particular PEG o PSA o mPSA. Las propiedades de los conjugados resultantes en general fuertemente dependen de la estructura y el tamano del pollmero. Asl, los pollmeros con una 35 distribution de tamano definida y estrecha son preferidos usualmente. Los PSA y mPSA, usados en los ejemplos
especlficos, pueden ser purificados de manera tal que da como resultado una preparacion de PSA final con una distribucion de tamano estrecha.
Glicoprotelnas
Como se describen aqul, las glicoprotelnas diferentes a protelnas de coagulacion de la sangre que influyen, citoquinas, 40 tales como interleucinas, alfa, beta y gamma-interferones, factores estimuladores de colonias incluyendo factores estimuladores de colonias de granulocitos, factores de crecimiento de fibroblastos, factores de crecimiento derivados de plaquetas, protelna activadora de fosfolipasa (PUP), insulina, protelnas vegetales tales como lectinas y ricinas, factores de necrosis tumoral y alelos relacionados, formas solubles de receptores de factores de necrosis tumoral, receptores de interleucina y formas solubles de receptores de interleucinas, factores de crecimiento, factores de 45 crecimiento de tejidos, factores de crecimiento transformante, tales como TGFas o TGFps y factores de crecimiento epidermico, hormonas, somatomedinas, hormonas pigmentarias, factores de liberation hipotalamicos, activadores de plasminogeno en tejidos e inmunoglobulinas tales como IgG, IgE, IgM, IgA e IgD, anticuerpos monoclonales, eritropoyetina (EPO), factores sangulneos diferentes a protelnas de coagulacion de la sangre, galactosidasas, a- galactosidasas, p-galactosidasas, ADNasas, fetuina, fragmentos de los mismos, y cualquier protelna de fusion que 50 comprende cualquiera de las protelnas antes mencionadas o fragmentos de las mismas junto con glicoprotelnas
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terapeuticas en general son contemplados por la invencion. En una realizacion la glicoprotelna es EPO. En una realizacion adicional la glicoprotelna es una galactosidasa. En todavla una realizacion adicional la glicoprotelna es una ADNasa. En una realizacion aun adicional la glicoprotelna es fetuina. Finalmente, en una realizacion todavla aun adicional la glicoprotelna es un factor estimulador de colonias de granulocitos.
Tal como se utiliza aqul “derivado biologicamente activo” o “variante biologicamente activa” incluye cualquier derivado o variante de una molecula que tiene sustancialmente las mismas propiedades funcionales y/o biologicas de dicha molecula, tales como propiedades de enlazamiento, y/o la misma base estructural, tal como un esqueleto peptldico o una unidad polimerica basica.
Un “analogo”, “variante” o “derivado” es un compuesto sustancialmente similar en estructura y que tiene la misma actividad biologica, excepto en ciertos casos hasta un grado diferente, que una molecula de origen natural. Por ejemplo, un polipeptido variante se refiere a un polipeptido que comparte sustancialmente una estructura similar y tiene la misma actividad biologica que un polipeptido de referencia. Variantes o analogos difieren en la composicion de sus secuencias de aminoacidos en comparacion con el polipeptido de origen natural a partir del cual se deriva el analogo, con base en una o mas mutaciones que involucran (i) elimination de uno o mas residuos de aminoacidos en uno o mas terminales del polipeptido y/o una o mas regiones internas de la secuencia de polipeptidos de origen natural (por ejemplo, fragmentos), (ii) insertion o adicion de uno mas aminoacidos en uno o mas terminales (tlpicamente una “adicion” o “fusion”) del polipeptido y/o una o mas regiones internas (tlpicamente una “insercion”) de la secuencia de polipeptidos de origen natural o (iii) sustitucion de uno o mas aminoacidos por otros aminoacidos en la secuencia de polipeptidos de origen natural. A manera de ejemplo, un “derivado” se refiere a un polipeptido que comparte la misma o muy similar estructura que un polipeptido de referencia que ha sido modificado, por ejemplo, qulmicamente.
Polipeptidos variantes o analogos incluyen variantes de insercion, en donde uno mas residuos de aminoacidos son agregados a una secuencia de aminoacidos de una protelna de la invencion. Las inserciones pueden estar localizadas bien en cualquiera o ambos terminales de la protelna, y/o pueden estar posicionadas dentro de las regiones internas de la secuencia de aminoacidos de la protelna. Las variantes de insercion, con residuos adicionales en cualquiera o ambos terminales, incluyen, por ejemplo, protelnas de fusion y protelnas que incluyen etiquetas de aminoacidos u otros marcadores de aminoacidos. En un aspecto, la molecula de protelna opcionalmente contiene una Met N-terminal, especialmente cuando la molecula se expresa de manera recombinante en una celula bacteriana tal como E. coli.
En variantes de eliminacion, uno o mas residuos de aminoacidos en una protelna o polipeptido tal como se describen aqul son eliminados. Las eliminaciones pueden efectuarse en uno o ambos terminales de la protelna o polipeptido y/o con eliminacion de uno mas residuos dentro de la secuencia de aminoacidos de la protelna. Las variantes de eliminacion, por lo tanto, incluyen fragmentos de una protelna o secuencia de polipeptidos.
En variantes de sustitucion, uno o mas residuos de aminoacidos de una protelna o polipeptido son eliminados o reemplazados con residuos alternativos. En un aspecto, las sustituciones son conservadoras en su naturaleza y las sustituciones conservadoras de este tipo son bien conocidas en el arte. Alternativamente, la invencion abarca sustituciones que son no conservadoras. Sustituciones conservadoras de ejemplo se describen en Lehninger, [Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp 71-77] y se establecen inmediatamente a
continuation.
Sustituciones conservadoras
Caracterlsticas de la cadena lateral Aminoacido
No polar (hidrofoba):
A. Alifatica A L I V P
B. Aromatica F W
C. Que contiene azufre M
D. Delimitante G
Polar no cargada:
A. Hidroxilo S T Y
B. Amidas N Q
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C. Sulfhidrilo
C
D. Delimitante
G
Cargada positivamente (basica)
K R G
Cargada negativamente (acida)
D E
Alternativamente, sustituciones conservadoras de ejemplo son establecidas inmediatamente a continuacion. Sustituciones conservadoras II
siduo original
Sustitucion de ejemplo
Ala (A)
Val, Leu, Ile
Arg (R)
Lys, Gln, Asn
Asn (N)
Gln, His, Lys, Arg
Asp (D)
Glu
Cys (C)
Ser
Gln (Q)
Asn
Glu (E)
Asp
His (H)
Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I)
Leu, Val, Met, Ala, Phe.
Leu (L)
Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K)
Arg, Gln, Asn
Met (M)
Leu, Phe, Ile
Phe (F)
Leu, Val, Ile, Ala
Pro (P)
Gly
Ser (S)
Thr
Thr (T)
Ser
Trp (W)
Tyr
Tyr (Y)
Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V)
Ile, Leu, Met, Phe, Ala
Administration
En una realization un compuesto conjugado de la presente invention puede ser administrado por inyeccion, tal como inyeccion intravenosa, intramuscular o intraperitoneal. Las composiciones pueden ser utiles como agentes terapeuticos, diagnosticos y/o similares.
Para administrar composiciones que comprenden un compuesto conjugado de la presente invencion a humanos o animales de prueba, en un aspecto, las composiciones comprenden uno o mas vehlculos farmaceuticamente aceptables. Los terminos “farmaceuticamente” o “farmacologicamente aceptable” se refieren a entidades moleculares y composiciones que son estables, inhiben la degradation de protelnas tales como agregacion y productos de escision, y ademas no producen reacciones alergicas u otras adversas cuando se administran utilizando rutas bien conocidas en el arte, como se describe mas adelante. “Vehlculos farmaceuticamente aceptables” incluyen todos los solventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes de retardo isotonico y de absorcion y similares cllnicamente utiles, incluyendo aquellos agentes divulgados mas arriba.
Tal como se utiliza aqul, “cantidad efectiva” incluye una dosis adecuada para tratar un mamlfero que tiene un trastorno cllnicamente definido.
Las composiciones pueden ser administradas oralmente, por via topica, transdermica, parenteral, por aspersion para inhalation, por via vaginal, rectal o por inyeccion intracraneal. El termino parenteral tal como se utiliza aqul incluye inyecciones subcutaneas, intravenosas, intramusculares, inyeccion intracisternal o tecnicas de infusion. La administracion por inyeccion intravenosa, intradermica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y/o implantation quirurgica en un sitio particular se contempla tambien. Generalmente, las composiciones estan esencialmente libres de pirogenos, as! como otras impurezas que podrlan ser nocivas para el receptor.
Las administraciones individuales o multiples de las composiciones pueden llevarse a cabo con los niveles de dosis y patrones que son seleccionados por el medico tratante. Para la prevention o tratamiento de la enfermedad, la dosificacion apropiada dependera del tipo de enfermedad que va a ser tratada, tal como se describe mas arriba, la severidad y transcurso de la enfermedad, si el farmaco es administrado para propositos preventivos o terapeuticos,
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terapia previa, la historia cilnica del paciente y respuesta al farmaco, y la discrecion del medico tratante.
La presente invencion tambien se relaciona con una composicion farmaceutica que comprende una cantidad efectiva de un compuesto conjugado o protelna tal como se define aqul. La composicion farmaceutica puede comprender adicionalmente un vehlculo, diluyente, sal, regulador o excipiente farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica puede ser utilizada para tratar trastornos cllnicamente definidos. La composicion farmaceutica de la invencion puede ser una solucion o un producto liofilizado. Las soluciones de las composiciones farmaceuticas pueden ser sometidas a cualquier proceso de liofilizacion adecuado.
Como aspecto adicional, la invencion incluye kits que comprenden una composicion de la invencion empacada de una manera que facilita su uso para administration a sujetos. En una realization, tal kit incluye un compuesto o composicion descritos aqul (por ejemplo, una composicion que comprende una protelna conjugada), empacado en un contenedor tal como una botella o recipientes sellados, con una etiqueta fijada al contenedor o incluida dentro del paquete que describe el uso del compuesto o composicion en la practica del metodo. En una realizacion, el kit contiene un primer contenedor que tiene una composicion que comprende una protelna conjugada y un segundo contenedor que tiene una solucion para reconstitution fisiologicamente aceptable para la composicion en el primer contenedor. En un aspecto, el compuesto o composicion esta empacado en una forma de dosificacion unitaria. El kit puede incluir adicionalmente un dispositivo adecuado para administrar la composicion de acuerdo con una ruta especlfica de administracion. Preferiblemente, el kit contiene una etiqueta que describe el uso de la protelna terapeutica o composicion peptldica.
En una realizacion, el derivado retiene la actividad funcional completa de los compuestos terapeuticos originales, y provee una vida media extendida in vivo, en comparacion con compuestos terapeuticos originales. En otra realizacion, el derivado retiene al menos, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,
44. 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,
75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, o 150 por ciento (%) de actividad biologica con respecto al compuesto original.
Acido sialico y PSA
Tal como se utiliza aqul, “unidades estructurales de acido sialico” incluye monomeros o pollmeros de acido sialico (“polisacaridos”) los cuales son solubles en una solucion o suspension acuosa y tienen poco o ningun efecto negativo, tales como efectos laterales, en mamlferos por administracion del conjugado PSA-protelna en una cantidad
farmaceuticamente efectiva. El PSA y el mPSA son caracterizados, en un aspecto, por tener 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, o 500 de unidades de acido sialico. En ciertos aspectos, diferentes unidades de acido sialico se combinan en una cadena.
En una realizacion de la invencion, la portion de acido sialico del compuesto de PSA o mPSA es altamente hidrofllica, y en otras realizaciones el compuesto completo es altamente hidrofllico. La hidrofilicidad es conferida primariamente por los grupos carboxilo pendiente de las unidades de acido sialico, as! como los grupos hidroxilo. La unidad sacarido puede contener otros grupos funcionales, tales como grupos amina, hidroxilo o sulfato, o combinaciones de los mismos. Estos grupos pueden estar presentes en compuestos sacaridos de origen natural, o ser introducidos en compuestos polisacaridos derivados. El PSA y el mPSA usados en los metodos y conjugados de la invencion pueden ser caracterizados adicionalmente como se describe mas arriba en los Antecedentes de la Invencion.
El pollmero PSA de origen natural esta disponible como una preparation polidispersa que muestra una distribution de tamano amplio (por ejemplo, Sigma C-5762) y alta polidispersidad (PD). Debido a que los polisacaridos son producidos usualmente en bacterias que portan un riesgo inherente de copurificar endotoxinas, la purification de las cadenas polimericas largas de acido sialico puede elevar la probabilidad de un contenido de endotoxinas incrementado. Las moleculas de PSA cortas con 1-4 unidades de acido sialico tambien pueden ser preparadas sinteticamente (Kang SH et al., Chem Commun. 2000;227-8; Ress DK and Linhardt RJ, Current Organic Synthesis. 2004;1:31-46), minimizando as! el riesgo de altos niveles de endotoxinas. Sin embargo las preparaciones de PSA con una distribucion de tamano estrecha y baja polidispersidad, que tambien estan libres de endotoxinas, pueden ser manufacturadas ahora. Los compuestos polisacaridos de uso particular para la invencion son, en un aspecto, aquellos producidos por bacterias. Algunos de estos polisacaridos de origen natural son conocidos como glicollpidos. En una realizacion, los compuestos polisacaridos estan sustancialmente libres de unidades galactosa terminales.
En diversas realizaciones, el compuesto esta enlazado a o asociado con el compuesto PSA o mPSA en cantidades estequiometricas (por ejemplo, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:7, 1:8, 1:9, o 1:10, etc.). En diversas realizaciones, 16, 7-12 o 13-20 unidades de PSA y/o de mPSA estan enlazadas al compuesto. En todavla otras realizaciones, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas unidades de PSA y/o mPSA estan enlazadas al compuesto.
Opcionalmente, el compuesto es modificado para introducir sitios de glicosilacion (esto es, sitios diferentes a los sitios
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de glicosilacion originales). Tal modificacion puede ser lograda utilizando tecnicas de biologla molecular estandar conocidas en el arte. Ademas, el compuesto antes de la conjugacion a traves de una o mas unidades carbohidrato, puede ser glicosilado in vivo o in vitro.
Enlace aminooxi
En una realization de la invention, la reaction de la hidroxilamina o derivados de hidroxilamina con aldehldos (por ejemplo, sobre una unidad estructural carbohidrato despues de la oxidation con peryodato de sodio) para formar un grupo oxima se aplica a la preparation de conjugados del compuesto. Por ejemplo, una glicoprotelna es oxidada primero con un agente oxidante tal como peryodato de sodio (NaIO4) (Rothfus JA et Smith EL., J Biol Chem 1963, 238, 1402-10; y Van Lenten L y Ashwell G., J Biol Chem 1971,246, 1889-94). La oxidacion con peryodato de, por ejemplo, glicoprotelnas se basa en la reaccion clasica de Malaprade descrita en 1928, la oxidacion de dioles vecinales con peryodato para formar un grupo aldehldo activo (Malaprade L., Analytical application, Bull Soc Chim France, 1928, 43, 683-96). Ejemplos adicionales de tal agente oxidante son tetraacetato de plomo (Pb(OAc)4), acetato de manganeso (MnO(Ac)3), acetato de cobalto (Co(OAc)2), acetato de talio (TlOAc), sulfato de cerio (Ce(SO4)2) (US 4,367,309) o perrutenato de potasio (KRuO4) (Marko et al., J Am Chem Soc 1997,119, 12661-2). Por “agente oxidante” se entiende un compuesto oxidante moderado que es capaz de oxidar dioles vecinales en carbohidratos, generando por lo tanto grupos aldehldo activos bajo condiciones de reaccion fisiologica.
La segunda etapa es el acoplamiento del pollmero que contiene un grupo aminooxi a la unidad estructural carbohidrato oxidada para formar un enlace oxima. En una realizacion de la invencion, esta etapa puede ser llevada a cabo en la presencia de cantidades catallticas del catalizador nucleofllico anilina o derivados de anilina (Dirksen A et Dawson PE, Bioconjugate Chem. 2008; Zeng Y et al., Nature Methods 2009;6:207-9). El catalizador de anilina acelera dramaticamente el enlace de la oxima permitiendo el uso de concentraciones muy bajas de los reactivos. En otra realizacion de la invencion el enlace oxima es estabilizado por reduction con NaCNBH para formar un enlace alcoxiamina.
En una realizacion de la invencion, las etapas de reaccion para conjugar PSA o mPSA a una protelna se llevan a cabo separada y secuencialmente (esto es, materiales de partida (por ejemplo, protelna, pollmero, etc.), reactivos (por ejemplo agentes oxidantes, anilina, etc.) y productos de reaccion (por ejemplo, carbohidrato oxidado sobre una protelna, pollmero aminooxi activado) son separados entre etapas de reaccion individuales).
Information adicional sobre la tecnologla aminooxi puede encontrarse en las siguientes referencias: EP 1681303A1 (eritropoyetina HA-Silada); WO 2005/014024 (conjugados de un pollmero y una protelna enlazada por un grupo enlazante oxima); WO96/40662 (compuestos enlazantes que contienen aminooxi y su aplicacion y conjugado); WO 2008/025856 (protelnas modificadas); Peri F et al., Tetrahedron 1998, 54, 12269-78; Kubler-Kielb J and Pozsgay V., J Org Chem 2005, 70, 6987-90; Lees A et al., Vaccine 2006, 24(6), 716-29; y Heredia KL et al., Macromolecules 2007, 40(14), 4772-9.
Ventajas de la invencion incluyen alta recuperation de conjugado, alta retention de actividad de la glicoprotelna conjugada en comparacion con protelna no conjugada y alta eficiencia de conjugacion.
La invencion se ilustra ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Los Ejemplos 1-3, 9 y 11-20 ilustran realizaciones especlficas de la invencion. Los ejemplos 4-8, 10 y 21-25 se incluyen como ejemplos de referencia por su relevancia para la preparacion de conjugados correspondientes de la invencion.
Ejemplos
Ejemplo 1
Preparacion del enlazante homobifuncional NH2[OCH2CH2]2ONH2 El enlazante homobifuncional NH2[OCH2CH2]2ONH2
H9|\L ^ ^ -NHo
(3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina) que contiene dos grupos aminooxi activos fue sintetizada de acuerdo con Boturyn et al. (Tetrahedron 1997;53:5485-92) en una reaccion organica de dos etapas que emplea una slntesis de Gabriel modificada de aminas primarias. La primera etapa, una molecula de 2,2-clorodietileter se hizo reaccionar con dos moleculas de Endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida en dimetilformamida (DMF). El producto homobifuncional deseado fue preparado a partir del intermedio resultante por hidrazinolisis en etanol. Excepto donde se especifica otra cosa, este se denomina como el enlazante diaminooxi en los ejemplos a continuation.
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Ejemplo 2
Preparacion del enlazante homobifuncional NH2[OCH2CH2]4ONH2 El enlazante homobifuncional NH2[OCH2CH2]4ONH2
imagen5
(3,6,9-trioxa-undecano-1,11-dioxiamina) que contiene dos grupos aminooxi activos fue sintetizado de acuerdo con Boturyn et al. (Tetrahedron 1997;53:5485-92) en una reaccion organica de dos etapas empleando una slntesis de Gabriel modificada de aminas primarias. En la primera etapa una molecula de Bis-(2-(2-cloretoxi)-etil)-eter se hizo reaccionar con dos moleculas de Endo-Nhidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida en DMF. El producto homobifuncional deseado fue preparado a partir del intermedio resultante por hidrazinolisis en etanol.
Ejemplo 3
Preparacion de aminooxi-PSA
500 mg de PSA oxidado (PM=18.8 kD) obtenido del Serum Institute of India (Pune, India) fue disuelto en 8 ml de regulador de acetato de sodio 50 mM, pH 5.5. A continuacion, se agregaron 100 mg de 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina. Despues de agitar durante 2 horas a temperatura ambiente, se agregaron 44 mg de cianoborohidruro de sodio. Despues de agitar durante otras 4 horas a 4°C, la mezcla de reaccion fue cargada en un casete de dialisis Slide-A- Lyzer (Pierce, Rockford, IL) (membrana de 3.5 kD, celulosa regenerada) y se dializo contra PBS pH 7.2 durante 4 dlas. El producto fue congelado a -80°C. La preparacion del aminooxi-PSA de acuerdo con este procedimiento esta ilustrada en la figura 2.
Ejemplo 4
Acoplamiento de aminooxi-PSA a rFIX y purificacion del conjugado
A 12.6 mg de rFIX, disueltos en 6.3 ml de regulador de acetato de sodio 50 mM, pH 6.0, se agregaron 289 pl de una solucion acuosa de peryodato de sodio (10 mM). La mezcla fue agitada en la oscuridad durante 4 horas a 4°C y fue detenida durante 15 minutos a temperatura ambiente mediante la adicion de 6.5 pl de glicerol 1M. Los contaminantes de peso molecular bajo fueron eliminados por ultrafiltracion/diafiltracion (UF/DF) empleando concentradores Vivaspin (Sartorius, Goettingen, Alemania) (membrana de 30 kD, celulosa regenerada). A continuacion, se agregaron 43 mg de aminooxi-PSA al retenido en UF/DF y la mezcla fue agitada durante 18 horas a 4°C. El reactivo PSA en exceso fue eliminado por cromatografla de interaccion hidrofoba (HIC). La conductividad de la mezcla de reaccion enfriada fue elevada hasta 180 mS/cm y cargada sobre una columna HIC HiTrap Butil FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) de 5 ml (1.6 x 2.5 cm), preequilibrada con HEPES 50 Mm, cloruro de sodio 3M, cloruro de calcio 6.7 mM, Tween 80 al 0.01%, pH 6.9. El conjugado fue eluido con 2.4 volumenes de columna (CV) con HEPES 50 Mm, cloruro de calcio 6.7 mM, Tween 80 al 0.005%, pH 7.4 a una rata de flujo de 5 ml/minuto. La preparacion fue caracterizada anallticamente midiendo la protelna total (BCA) y la actividad cromogenica FIX. Para el conjugado PSA-rFIX se determino una actividad especlfica de 80.2 IU/mg de protelna (56.4% en comparacion con el rFIX nativo). Los resultados se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1
item
BCA [mg/ml] FIX:Crom [IU/ml] Actividad especlfica [IU FIX: Crom/mg BCA Actividad especlfica [%]
rFIX
8.58 1221 142.3 100
PSA-rFIX
1.15 92.2 80.2 56.4
Ejemplo 5
Acoplamiento de aminooxi-PSA a rFIX en la presencia de anilina como catalizador nucleofllico
A 3.0 mg de rFIX, disuelto en 1.4 ml de regulador de acetato de sodio 50 mM, pH 6.0, se agregaron 14.1 pl de una solucion acuosa de peryodato de sodio (10 mM). La mezcla fue agitada en la oscuridad durante 1 hora a 4°C y se
detuvo durante 15 minutos a temperatura ambiente mediante la adicion de 1.5 pi de glicerol 1M. Los contaminantes de bajo peso molecular fueron eliminados por medio de cromatografla de exclusion por tamano (SEC) empleando columnas desalinizadoras PD-10 (GE Healthcare, Fairfield, CT). Se mezclaron 1.2 mg de rFIX oxidado, disueltos en 1.33 ml de regulador de acetato de sodio 50 mM, pH 6.0 con 70 pl de anilina (solucion de reserva acuosa 200 mM) y 5 se agito durante 45 minutos a temperatura ambiente. A continuacion se agregaron 4.0 mg de aminooxi-PSA y la mezcla fue agitada durante 2 horas a temperatura ambiente y otras 16 horas a 4°C. Las muestras fueron extraldas durante 1 hora, despues de 2 horas y al final de la reaccion despues de 18 horas. A continuacion, se elimino el exceso de reactivo PSA y el rFIX libre por medio de HIC. La conductividad de la mezcla de reaccion enfriada fue elevada a 180 mS/cm y fue cargada sobre una columna HIC HiTrap Butil FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) de 5 ml (1.6 x 2.5 cm), 10 preequilibrada con HEPES 50 mM, cloruro de sodio 3M, cloruro de calcio 6.7 mM, Tween 80 al 0.01%, pH 6.9. El conjugado fue eluido con un gradiente lineal a HEPES 50 Mm, cloruro de calcio 6.7 mM, Tween 80 al 0.005%, pH 7.4 en 20 CV con una rata de flujo de 5 ml/minuto.
Ejemplo 6
Acoplamiento de aminooxi-PSA a rFIX y reduccion con NaCNBH3
15 A 10.5 mg de rFIX, disueltos en 5.25 ml de regulador de acetato de sodio 50 mM, pH 6.0, se agregaron 53 pl de una solucion acuosa de peryodato de sodio (10 mM). La mezcla fue agitada en la oscuridad durante 1 hora a 4°C y se detuvo durante 15 minutos a temperatura ambiente mediante la adicion de 5.3 pl de glicerol 1M. Los contaminantes de bajo peso molecular fueron eliminados por medio de UF/DF empleando concentrados Vivaspin (Sartorius, Goettingen, Alemania) (membrana de 30 kD, celulosa regenerada). A continuacion, se agregaron 35.9 mg de 20 aminooxi-PSA al retenido por UF/DF y la mezcla fue agitada durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego se agregaron 53 pl de solucion acuosa de cianoborohidruro de sodio (5M) y la reaccion se dejo proceder durante otras 16 horas. Luego el exceso de reactivo de PSA fue retirado por medio de HIC. La conductividad de la mezcla de reaccion enfriada fue elevada a 180 mS/cm y cargada sobre una columna HiTrap Butil FF HIC (GE Healthcare, Fairfield, CT) de 5 ml (1.6 x 2.5 cm), preequilibrada con HEPES 50 mM, cloruro de sodio 3M, cloruro de calcio 6.7 mM, 25 Tween 80 al 0.01%, pH 6.9. El conjugado fue eluido con 2.4 CV con HEPES 50 mM, cloruro de calcio 6.7 mM, Tween 80 al 0.005%, pH 7.4 a una rata de 5 ml/minuto.
Ejemplo 7
Acoplamiento de aminooxi-PSA (enlazante: NH2[OCH2CH2]4ONH2) a rFIX y purificacion del conjugado
A 5.6 mg de rFIX, disueltos en 2.8 ml de regulador de acetato de sodio 50 mM, pH 6.0, se agregaron 102 pl de una 30 solucion acuosa de peryodato de sodio (10 mM). La mezcla fue agitada en la oscuridad durante 1 hora a 4°C y detenida durante 15 minutos a temperatura ambiente mediante la adicion de 2.9 pl de glicerol 1M. Los contaminantes de bajo peso molecular fueron eliminados por medio de UF/DF empleando concentradores Vivaspin (Sartorius, Goettingen, Alemania) (membrana de 30 kD, celulosa regenerada). Luego se agregaron 19 mg de aminooxi-PSA al retenido por UF/DF y la mezcla fue agitada durante 18 horas a 4°C. El exceso de reactivo PSA fue eliminado por medio de HIC. La 35 conductividad de la mezcla de reaccion enfriada fue elevada a 180 mS/cm y se cargo sobre una columna HiTrap Butil FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) de 5 ml (1.6 x 2.5 cm), se preequilibro con HEPES 50 Mm, cloruro de sodio 3M, cloruro de calcio 6.7, Tween 80 al 0.01%, pH 6.9. El conjugado fue eluido con 2.4 CV con HEPES 50 Mm, cloruro de calcio 6.7 mM, Tween 80 al 0.005%, pH 7.4 a una rata de flujo de 5 ml/minuto.
Ejemplo 8
40 Acoplamiento de aminooxi-PSA a rFVIII
A 11 mg de rFVIII, disueltos en 11 ml de regulador Hepes pH 6 (Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 150 mM, Tween al 0.01%) se agregaron 57 pl de peryodato de sodio 10 mM. La mezcla fue agitada en la oscuridad durante 30 minutos a 4°C y detenida durante 30 minutos a 4°C mediante la adicion de 107 pl de una solucion acuosa de glicerol 1M. Luego se agregaron 19.8 mg de aminooxi-PSA (18.8 kD) y la mezcla se agito durante la noche a 4°C. Se incremento la fuerza 45 ionica agregando un regulador que contenla acetato de amonio 8M (acetato de amonio 8M, Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 350 mM, Tween 80 al 0.01%, pH 6.9) para obtener una concentration final de acetato de amonio de 2.5 M. A continuacion, la mezcla de reaccion fue cargada sobre una columna HiTrap Butil FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) la cual fue equilibrada con el regulador de equilibrio (acetato de amonio 2.5 M, Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 350 mM, Tween 80 al 0.01%, pH 6.9). El producto fue eluido con regulador de elucion (Hepes 50 mM, CaCl2 5 mM, Tween 50 80 al 0.01%, pH 7.4), y el eluido fue concentrado por filtration centrlfuga utilizando dispositivos Vivaspin (Sartorius,
Goettingen, Alemania) con 30,000 MWCO.
Ejemplo 9
Preparation del enlazante homobifuncional NH2[OCH2CH2]6ONH2
El enlazante homobifuncional NH2[OCH2CH2]6ONH2
imagen6
(3,6,9,12,15-penatoxa-heptadecano-1,17-dioxiamina) que contenia dos grupos aminooxi activos fue sintetizada de acuerdo con Boturyn et al. (Tetrahedron 1997;53:5485-92) en una reaccion organica de dos etapas empleando una 5 sintesis de Gabriel modificada de aminas primarias. En la primera etapa se hizo reaccionar una molecula de dicloruro de hexaetilen glicol con dos moleculas de Endo-N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboximida en DMF. El producto homobifuncional deseado fue preparado a partir del intermedio resultante por hidrazinolisis en etanol.
Ejemplo 10
Polisialilacion de rFIX empleando un sistema de enlazante maleimido/aminooxi 10 A. Preparacion del reactivo de modificacion
Se prepara un reactivo de aminooxi-PSA mediante el uso de un sistema enlazador maleimido/aminooxi (Toyokuni et al., Bioconjugate Chem 2003; 14, 1253-9). PSA-SH (20 kD) que contiene un grupo terminal SH- usando un procedimiento de dos etapas: a) Preparacion de PSA-NH2 por aminacion reductiva de PSA oxidado con NH4Cl de acuerdo con la WO05016973A1 y b) introduccion de un grupo sulfhidrilo por reaccion del grupo amino primario terminal 15 con 2-iminotiolano (reactivo de Traut/Pierce, Rockford, IL) como se describe en US7645860. El PSA-SH es acoplado al grupo maleimido del enlazante a pH 7.5 en regulador de PBS utilizando un exceso molar de 10 veces del enlazante y una concentration de PSA-SH de 50 mg/ml. La mezcla de reaccion se incuba durante 2 horas bajo agitation suave a temperatura ambiente. Cuando el reactivo de enlazamiento en exceso es eliminado y el aminooxi-PSA es intercambiado por regulador hacia un regulador de oxidation (fosfato de sodio 50 mM, pH 6.0) por filtration. El 20 regulador es intercambiado 25 veces empleando una membrana de celulosa regenerada Pellicon xL5 kD (Millipore, Billerica, MA).
B. Modificacion del rFIX despues de la oxidacion previa con NaIO4
El rFIX es oxidado en regulador de fosfato de sodio 50 mM, pH 6.0 empleando 100 pM de peryodato de sodio en el regulador. La mezcla fue agitada en la oscuridad durante 1 hora a 4°C y detenida durante 15 minutos a temperatura 25 ambiente mediante la adicion de glicerol hasta una concentracion final de 5 mM. Los contaminantes de bajo peso molecular fueron eliminados por medio de cromatografia de exclusion por tamano (SEC) empleando columnas desalinizadoras PD-10 (GE Healthcare, Fairfield, CT). El rFIX oxidado fue tratado entonces con anilina para obtener una concentracion final de 10 mM y se mezclo con el reactivo de aminooxi-PSA para alcanzar un exceso molar de 5 veces de PSA. La mezcla de reaccion fue incubada durante 2 horas bajo agitacion suave en la oscuridad a temperatura 30 ambiente.
C. Purification de los conjugados
El exceso de reactivo de PSA y el rFIX libre son eliminados por medio de HIC. La conductividad de la mezcla de reaccion es elevada hasta 180 mS/cm y cargada sobre una columna llena con 48 ml de Butil-Sepharosa FF (GE Healthcare, Fairfield, CT) preequilibrada con Hepes 50 mM, cloruro de sodio 3M, cloruro de calcio 6.7 mM, Tween 80 35 al 0.01%, pH 6.9. Subsecuentemente el conjugado es eluido con un gradiente lineal de regulador de elusion al 60% (Hepes 50 mM, cloruro de calcio 6.7 mM, pH 7.4) en 40 CV. Finalmente las fracciones que contenian PSA-rFIX fueron recolectadas y sometidas a UF/DF mediante el uso de una membrana 30 kD hecha de celulosa regenerada (Millipore). La preparacion es caracterizada analiticamente midiendo la proteina total (BCA) y la actividad cromogenica de FIX. Para los conjugados de PSA-rFIX preparados con ambas variantes se determino una actividad especifica de >50% en 40 comparacion con el rFIX nativo.
Ejemplo 11
Preparacion del reactivo aminooxi-PSA
Se preparo un reactivo aminooxi-PSA de acuerdo con el Ejemplo 3. El producto final fue diafiltrado contra regulador pH 7.2 (Hepes 50 mM) utilizando una membrana de 5 kD (celulosa regenerada, Millipore), congelado a -80°C y
45 liofilizado. Despues de la liofilizacion el reactivo fue disuelto en el volumen apropiado de agua y utilizado para preparar
los conjugados de PSA-proteina a traves de modificacion con carbohidratos.
Ejemplo 12
Slntesis detallada del reactivo de aminooxi-PSA
Se sintetizo la 3-oxa-pentano-1,5 dioxiamina de acuerdo con Botyryn et al (Tetrahedron 1997; 53:5485-92) en una slntesis organica de dos etapas como se delinea en el Ejemplo 1.
Etapa 1:
5 A una solucion de Endo-N-hidroxi-5-norboneno-2,3-dicarboxiimida (59.0 g; 1.00 eq) en 700 ml de N,N- dimetilformamida anhidra, se agregaron K2CO3 anhidro (45.51 g; 1.00 eq) y 2,2-diclorodietileter (15.84 ml; 0.41 eq). La mezcla de reaccion fue agitada durante 22 horas a 50°C. La mezcla fue evaporada hasta sequedad bajo presion reducida. El residuo fue suspendido en 2 L de diclorometano y se extrajo dos veces con solucion acuosa saturada de NaCl (1 L cada una). La capa de diclorometano fue secada sobre Na2SO4 y luego evaporada hasta sequedad bajo 10 presion reducida y secada en alto vaclo para dar 64.5 g de 3-oxapentano-1,5dioxi-endo-2’,3’- dicarboxidiimidanorborneno en forma de un solido blanco amarillento (intermediario 1):
Etapa 2:
A una solucion del intermediario 1 (64.25 g; 1.00 eq) en 800 ml de etanol anhidro, se agregaron 31.0 ml de hidrato de hidracina (4.26 eq). La mezcla de reaccion fue sometida a reflujo entonces durante 2 horas. La mezcla fue concentrada 15 a la mitad del volumen de partida evaporando el solvente bajo presion reducida. El precipitado que aparecio fue retirado por filtracion. La capa de etanol remanente fue evaporada hasta sequedad bajo presion reducida. El residuo que contenla el producto crudo 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina fue secado al vaclo para producir 46.3 g. El producto crudo fue purificado adicionalmente mediante cromatografla de columna (silica gel 60; elusion isocratica con mezcla diclorometano/metanol, 9+1) para producir 11.7 g del producto final puro 3-oxapentano-1,5-dioxiamina.
20 Ejemplo 13
Preparacion del polimero de aminooxi-PSA
Se disolvieron 1.3 g del acido colominico oxidado (23 kDa) en 18 ml de acetato de sodio 50 mM pH 5.5±0.02. Se disolvio un exceso molar de 20 veces de 1,11-diamino-3,6,9-trioxaundecano (tambien denominado como 3,6,9-trioxa- undecano-1,1-dioxiamina) en una cantidad minima de acetato de sodio 50 mM (pH 5.5±0.02) y se agrego a la solucion 25 de PSA. La concentracion final de acido colominico fue de 62.5 mg/ml. Esta mezcla de reaccion fue incubada durante 2±0.1 horas a 22±1.0°C sobre un mezclador suave (22 oscilaciones por minuto). Despues de esto, se agregaron 0.65 ml de solucion de NaCNBH3 160 mg/ml a la mezcla de reaccion anterior de tal manera que se logro la concentracion final de 5.00 mg/ml. Esta fue incubada durante 3.0±0.20 horas a 4.0±1.0°C sobre un agitador (22 oscilaciones por minuto) en un contenedor hermetico al aire libre de endotoxina con espacio de cabeza suficiente para mezclar. Para 30 la purificacion, la muestra fue diluida con trietanolamina 2 mM, pH 8.0±0.02 para hacer una concentracion final de acido colominico de 20 mg/ml. La mezcla de reaccion fue desalada para eliminar el exceso de 1,11-diamino-3,6,9- trioxaundecano, NaCNBH3 y subproductos de la reaccion. Esto fue seguido por la desalinizacion sobre una columna Sephadex G25 utilizando regulador de trietanolamina 20 mM (pH 8.0±0.02). El pH de la muestra desalinizada fue ajustada a pH 7.8-8.0 y fue ultrafiltrado/diafiltrado con TEA 20 mM pH 8.0 una vez y trietanolamina (TEA) 2 mM pH 8.0 35 dos veces. La muestra fue liofilizada y almacenada a -80°C.
Alternativamente, se hizo purificacion en presencia de elevada concentracion de sal durante las etapas de desalinizacion y ultrafiltracion/diafiltracion (UF/DF). Tambien se utilizo cromatografla de intercambio anionico en concentracion alta de sal para obtener aminooxi-PSA altamente puro. Por analogla, se sintetizaron diferentes pesos moleculares de aminooxi-PSA.
40 Ejemplo 14
Acoplamiento de diaminooxi (3,6,9-trioxa-undecano-1,11-dioxiamina)-PSA a p-galactosidasa
Para la oxidacion de la p-galactosidasa (p-Gal), se utilizaron diferentes concentraciones de NaIO4 (variando desde 0.157 mM a 2 mM). Se oxidaron 0.5 mg de p-Gal bajo pH acido de 5.75 a 4°C durante 30 minutos en la oscuridad. La oxidacion fue detenida agregando NaHSO3 hasta una concentracion final de 5 mM. La reaccion de conjugacion fue 45 llevada a cabo usando el p-Gal oxidado con polimero de diaminooxi PSA (22 kDa). La concentracion final del polimero en la mezcla de reaccion fue de 1.25 mM mientras que la concentracion de p-Gal variaba desde 0.125 mg/ml a 0.76 mg/ml. Todas las reacciones se hicieron a pH 5.75. Se agrego el cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion a una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La reaccion fue llevada a cabo a 4°C y se recolectaron muestras en intervalos de tiempo de 1, 2 y 24 horas. Los conjugados fueron caracterizados utilizando SDS PAGE e 50 inmunotransferencia western. Un desplazamiento en la banda fue observado para el conjugado en SDS PAGE y este tambien fue confirmado por inmunoprecipitacion western.
Con base en las mejores condiciones de reaccion, se oxidaron 1.9 mg de p-Gal con 1.5 mM de NaIO4 durante 30 minutos a 4°C y luego la oxidacion fue detenida usando NaHSO3 hasta una concentracion final de 5 mM. La reaccion de conjugacion fue llevada a cabo utilizando la p-Gal oxidado con el pollmero de diaminooxi PSA. Las concentraciones finales de pollmero y protelna en la mezcla de reaccion fueron 1.25 mM y 0.76 mg/ml respectivamente. El pH final de 5 la mezcla de reaccion estuvo alrededor de 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion hasta una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La reaccion fue llevada a cabo a 4°C durante 2 horas. Se caracterizaron los conjugados purificados y no purificados utilizando SDS PAGE e inmunoprecipitacion western. Un desplazamiento en la banda fue visto para el conjugado en SDS PAGE y esto fue confirmado por inmunoprecipitacion western utilizando anticuerpo anti-PSA. La actividad in vitro de los conjugados de PSA-p-Gal fueron comparable a la protelna 10 nativa utilizando AII en uno (kit de ensayo 3Ga1) Pierce). Se observo menos de 50% de actividad en conjugados comparables hechos utilizando qulmica de enlazamiento de aldehldos. Adicionalmente, el proceso global fue escalado hasta 3 veces.
Ejemplo 15
Acoplamiento de diaminooxi-PSA a fetuina
15 La fetuina fue oxidada con NaIO4 10 mM durante 60 minutos a 4°C en la oscuridad y la oxidacion fue detenida agregando NaHSO3 hasta una concentracion final de 10 mM. La reaccion de conjugacion fue llevada a cabo utilizando la fetuina oxidada con el pollmero diaminooxi PSA (23 kDa). La concentracion final del pollmero en la mezcla de reaccion fue de 2.5 mM a pH 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion hasta una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La concentracion final de protelna en la reaccion fue de 0.714 mg/ml y la 20 reaccion fue llevada a cabo a 4°C durante 2 horas. Estos conjugados fueron caracterizados utilizando SDS PAGE e inmunoprecipitacion western. Un desplazamiento en la banda fue observado para los conjugados en SDS PAGE y esto tambien fue confirmado por inmunoprecipitacion western.
Para una reaccion a escala superior, se oxidaron 5 mg de fetuina con NaIO4 10 mM durante 60 minutos a 4°C en la oscuridad y luego la oxidacion fue detenida agregando NaHSO3 hasta una concentracion final de 10 mM. La reaccion 25 de conjugacion fue llevada a cabo utilizando la fetuina oxidada con el pollmero diaminooxi PSA (23 kDa). La concentracion final de pollmero en la mezcla de reaccion fue 2.5 mM a pH de 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion hasta una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La reaccion fue llevada a cabo a 4°C y se recolecto muestra despues de 2 horas. Los conjugados purificados y no purificados fueron caracterizados utilizando SDS PAGE e inmunoprecipitacion western. Un desplazamiento en la banda fue observado para el conjugado 30 SDS PAGE y esto tambien fue confirmado por la inmunoprecipitacion western.
Ejemplo 16
Acoplamiento de diaminooxi-PSA a fetuina con anilina que actua como un catalizador nucleofllico
Se oxidaron 0.2 mg de fetuina con NaIO4 10 mM durante 30 minutos a 4°C en la oscuridad y luego la oxidacion fue detenida agregando NaHSO3 hasta una concentracion final de 5 mM. La reaccion de conjugacion fue llevada a cabo 35 utilizando la fetuina oxidada con pollmero de diaminooxi PSA (23 kDa). La concentracion final de pollmero en la mezcla de reaccion fue 1.25 mM. El pH final de la mezcla de reaccion fue de 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion a una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La concentracion de protelna final en la reaccion fue de 0.125 mg/ml. Se agregaron entonces 84.21 pl de solucion de anilina 200 mM a los 1.6 ml de la mezcla de reaccion. La reaccion fue llevada a cabo a 4°C durante la noche.
40 Ejemplo 17
Acoplamiento de diaminooxi-PSA a eritropoyetina (EPO)
Se oxidaron 0.2 mg de EPO con NaIO4 10 mM durante 30 minutos a 4°C. La oxidacion fue detenida agregando NaHSO3 hasta una concentracion final de 5 mM. La reaccion de conjugacion fue llevada a cabo utilizando el EPO oxidado con pollmero de diaminooxi de 23 kDa) La concentracion final de pollmero en la mezcla de reaccion fue 1.25 45 mM. La concentracion final de EPO en la mezcla de reaccion fue de 0.125 mg/ml. El pH final de la mezcla de reaccion estaba alrededor de 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion hasta una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La reaccion fue llevada a cabo a 4°C durante 24 horas. El conjugado no purificado fue caracterizado utilizando SDS PAGE. Se observo un desplazamiento en la banda para el conjugado en SDS PAGE.
Ejemplo 18
50 Acoplamiento de diaminooxi-PSA a EPO con anilina que actua como catalizador nucleofllico
Se oxidaron 0.2 mg de EPO con NaIO4 10 mM durante 30 minutos a 4°C. La oxidacion fue detenida agregando
NaHSO3 hasta una concentracion final de 5 mM. La reaccion de conjugacion fue llevada a cabo utilizando el EPO oxidado con el polimero de diaminooxi PSA (22 kDa) La concentracion final de polimero en la mezcla de reaccion fue 1.25 mM. El pH final de la mezcla de reaccion estuvo alrededor de 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion hasta una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La concentracion de proteina final en la reaccion 5 fue de 0.125 mg/ml. Se agregaron entonces 84.21 pl de la solucion de anilina 200 mM a los 1.6 ml de la mezcla de reaccion. La reaccion fue llevada a cabo a 4°C durante la noche. Los conjugados fueron caracterizados usando SDS PAGE. Se observo un desplazamiento en la banda en los conjugados. No se observo efecto adverso de la anilina sobre la actividad de los conjugados.
Ejemplo 19
10 Acoplamiento de diaminooxi-PSA a ADNasa
Para la glicopolisialilacion de ADNasa, se utilizo ADNasa de pancreas bovino para la reaccion de conjugacion. Esta fuente de ADNasa fue suministrada como un polvo liofilizado, el cual fue almacenado a -20°C. Antes de la reaccion, el polvo liofilizado fue disuelto en regulador de acetato de sodio (pH 5.75). El polimero usado para la glicopolisialilacion tenia un peso en el rango de 10 kDa a 22 kDa. Para la oxidacion de la unidad estructural glicon de la ADNasa, se 15 utilizo NaIO4, como agente oxidante hasta una concentracion final de 1 mM. La ADNasa fue oxidada al pH acido de 5.75 a 4°C durante 30 minutos. La oxidacion fue detenida agregando NaHSO3 hasta una concentracion final de 2 mM. Despues de que se completo la oxidacion, la reaccion de conjugacion fue llevada cabo mediante la adicion de polimero de diaminooxi PSA hasta una concentracion final de 1.25 mM. Se agrego NaCNBH3 a la mezcla de reaccion hasta una concentracion final de 50 mM o 3.17 mg/ml y la polisialilacion de la ADNasa fue llevada a cabo a 4.0±1.0°C durante 20 al menos 2 horas. La reaccion fue detenida con exceso molar de 25 de Tris con respecto al polimero. Los conjugados fueron caracterizados usando SDS PAGE e inmunoprecipitacion western. Un desplazamiento en la banda fue visto para el conjugado en SDS PAGE y se obtuvo resultado positivo a partir de inmunoprecipitacion western. La acidez fue medida como 95% (en comparacion con menos del 50% observada en conjugados comparables hechos utilizando la quimica de enlazantes aldehido).
25 Ejemplo 20
Acoplamiento de diaminooxi (enlazante 3 oxa-pentano-1,5-dioxiamina)-PSA a p-galactosidasa
Para la oxidacion de la p-galactosidasa, se utilizo NaIO4 a una concentracion de 2 mM. Se oxidaron 3 mg de p- galactosidasa a pH acido de 5.75 a 4°C durante 30 minutos y luego la oxidacion fue detenida agregando NaHSO3 hasta una concentracion final de 2 mM. La reaccion de conjugacion fue llevada a cabo utilizando la p-galactosidasa 30 oxidada con el polimero de diaminooxi PSA (23 kDa). La concentracion final de polimero en la mezcla de reaccion fue de 1.5 mM. La concentracion final de p-galactosidasa en la mezcla de reaccion fue 0.867 mg/ml. El pH final de la mezcla de reaccion fue alrededor de 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion hasta una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La reaccion se llevo a cabo a 4°C durante 2 horas. Los conjugados fueron caracterizados utilizando SDS PAGE e inmunoprecipitacion western. Se observo un desplazamiento en la banda para 35 el conjugado en SDS PAGE y se obtuvo resultado positivo a partir de inmunoprecipitacion western.
Ejemplo de referencia 21
Preparacion de hidrazida-acido colominico
Se utilizo el siguiente protocolo para preparar un PSA-hidrazida (acido colominico-hidrazida) utilizando hidrazida de acido adipico. Se utilizaron metodos analogos para hacer otras PSA-hidrazidas.
40 1. Se disuelve 1 g de acido colominico activado en ~10 ml de acetato de sodio 20 mM pH 5.5±0.02. La concentracion
final de acido colominico deberia ser 62.5 mg/ml.
2. Se disuelve un exceso molar 25 veces (con respecto al acido colominico oxidado “CAO”) de acido adipico de dihidrazida (PM=174.2 g) en una cantidad minima de acetato de sodio 20 mM (pH 5.5±0.02) y se agrega a la solucion del punto 1.
45 3. Cantidad de acido adipico dihidrazida para ser anadida
= Peso de CAO en gramos x 25 x PM de acido adipico dihidrazida en g PM de CAO en Daltons = 1x25x174.2 15 x 102 3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
= 0.290 g
4. Despues de agregar la solucion de acido adlpico de hidrazida, completa el volumen de acido colomlnico con acetato de sodio hasta una concentration final de 62.5 mg/ml. Por lo tanto el volumen total de la reaction es 16 ml.
5. Incubar la mezcla de reaccion durante 2±0.1 horas a 22.0±1.0°C sobre un agitador (22 oscilaciones por minuto).
6. Preparar solucion concentrada de NaCNBH (165 mg/ml) y agregar 0.5 ml a la solucion del punto 1 de tal manera que la concentracion final de este se hace 5.0 mg/ml en la mezcla de reaccion final. Incubar la mezcla de reaccion durante 3.0±0.20 horas a 4.0±1.0°C sobre el agitador (22 oscilaciones por minuto).
7. Mantener la mezcla de reaccion en un contenedor hermetico al aire libre de endotoxina con 50 ml en exceso de espacio de cabeza para una mezcla apropiada (deberla haber espacio suficiente de tal manera que la mezcla de reaccion no toque la tapa del contenedor).
8. Despues de 3 horas de reaccion a 4°C, diluir la mezcla con trietanolamina 2 mM (completar el volumen hasta 50 ml), a pH 8.0±0.02 para llevar la concentracion final de acido colomlnico a 20 mg/ml.
9. Desalinizar la mezcla de reaccion para eliminar el exceso de acido adlpico y dihidrazida, NaCNBH3, etc., no tratados del pollmero. Esto puede hacerse mediante GPC (utilizando una matriz de medio XK 50 Sephadex G-25; <1.8 mg de matriz CA/ml; altura del lecho 35 cm; volumen de columna=687 ml) observando a UV 224 nm y conductividad. La desalinizacion se lleva a cabo con regulador de trietanolamina 20 mM (pH=8.0<0.02).
10. Despues de desalinizar, el acido colomlnico hidrazida es sometido a un ciclo de ultrafiltracion, un ciclo de diafiltracion utilizando TEA 20 mM, pH 8.0±0.02 y al menos 3 ciclos de diafiltracion utilizando TEA 2 mM, pH 8.0±0.02. Esto puede hacerse utilizando casetes Vivaflow de 3 kDa.
11. Ajustar el pH de la muestra desalinizada a pH 7.8-8.0. Opcionalmente, liofilizar la muestra y mantenerla consecutivamente durante un secado secundario para eliminar exceso de humedad.
Ejemplo de referencia 22
Acoplamiento de hidrazida-PSA a eritropoyetina
Para la oxidation de la eritropoyetina (EPO), se utilizo NaIO4 a una concentracion de 10 mM. Se oxido EPO (1 mg) a pH 5.75 a 4°C durante 30 minutos y luego la oxidacion fue detenida agregando NaHSO3 hasta una concentracion final de 5 mM. La reaccion de conjugation fue llevada a cabo usando el EPO oxidado con pollmero de hidrazida-PSA. El peso molecular de la hidrazida-PSA utilizada para la conjugacion fue de 24.34 kDa. La concentracion final de hidrazida- PSA en la mezcla de reaccion fue de 1.25 mM. La concentracion final de EPO en la mezcla de reaccion fue de 0.125 mg/ml. El pH final de la mezcla de reaccion estuvo alrededor de 5.75. Se agrega cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion hasta una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La reaccion se llevo a cabo a 4°C durante 24 horas. Los conjugados fueron caracterizados utilizando SDS PAGE e inmunoprecipitacion western. Se observo un desplazamiento en la banda para el conjugado en SDS PAGE y se obtuvo un resultado positivo de la inmunoprecipitacion western.
Ejemplo de referencia 23
Acoplamiento de hidrazida-PSA a p-galactosidasa
Se oxido p-galactosidasa (0.5 a 4.5 mg) con 0.625 ml 2 mM de NaIO4 durante 30 minutos a 4°C. La oxidacion fue detenida mediante la adicion de NaHSO3 hasta una concentracion final de 5 mM. La reaccion de conjugacion fue llevada a cabo usando la p-galactosidasa oxidada con hidrazida-PSA que variaba desde 24.34 kDa hasta 27.9 kDa. La concentracion final de hidrazida-PSA en la mezcla de reaccion fue de 1.25 mM. La concentracion final de p- galactosidasa en la mezcla de reaccion estuvo en un rango desde 0.125 mg/ml hasta 0.76 mg/ml. El pH final de la mezcla de reaccion deberla estar alrededor de 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion a una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La reaccion fue llevada a cabo a 4°C y las muestras fueron recolectadas a 1,2 y 24 horas. El conjugado purificado y no purificado fue caracterizado utilizando SDS PAGE e inmunoprecipitacion western. Se observo un desplazamiento en la banda para el conjugado en SDS PAGE y se obtuvo un resultado positivo de la inmunoprecipitacion western. La actividad fue medida como 84%. Se observo menos de 50% de actividad en conjugados comparables hechos utilizando qulmica de enlazante aldehldo.
Ejemplo de referencia 24
Acoplamiento de hidrazida-PSA a fetuina
Se oxido fetuina (0.25 mg) con NaIO4 (5 o 10 mM) durante 30 o 60 minutos a 4°C. La oxidacion fue detenida agregando NaHSO3 hasta una concentracion final de 5 o 10 mM segun sea apropiado para coincidir con la concentracion de NaIO4 usada para la oxidacion. Las reacciones de conjugacion fueron llevadas a cabo utilizando la fetuina oxidada 5 con el pollmero de acido adlpico dihidrazida-PSA. La concentracion final del pollmero en la mezcla de reaccion estuvo entre 1.25 y 2.5 mM. El pH final de la mezcla de reaccion estuvo alrededor de 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion a una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La reaccion se llevo a cabo a 4°C durante 1 hora a 4 horas. Los conjugados fueron caracterizados utilizando SDS PAGE e inmunoprecipitacion western. Se observo un desplazamiento en la banda para el conjugado en SDS PAGE para cada conjunto de condiciones de 10 reaccion y se obtuvo un resultado positivo de la inmunoprecipitacion western.
Se llevo a cabo una reaccion escalada para 5 mg de fetuina seguida por purificacion del conjugado resultante. Se oxidaron 5 mg de fetuina con NaIO4 10 mM durante 60 minutos a 4°C y luego se detuvo la oxidacion agregando NaHSO3 hasta una concentracion final de 10 mM. La reaccion de conjugacion fue llevada a cabo utilizando la fetuina oxidada con el pollmero de acido adlpico dihidrazida-PSA. La concentracion final de pollmero en la mezcla de reaccion 15 fue 2.5 mM. El pH final de la mezcla de reaccion estuvo alrededor de 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion a una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La reaccion se llevo a cabo a 4°C y se recolectaron muestras a las 2 horas. El conjugado purificado y no purificado fue caracterizado utilizando SDS PAGE e inmunoprecipitacion western. Se observo un desplazamiento en la banda para el conjugado en SDS PAGE y se obtuvo un resultado positivo de la inmunoprecipitacion western.
20 Ejemplo de referencia 25
Acoplamiento de hidrazida-PSA a ADNasa
La ADNasa se oxido con NaIO4 a una concentracion final que variaba de 0.2 mM a 2 mM durante 30 minutos a 4°C. La reaccion de oxidacion fue detenida agregando NaHSO3 a una concentracion final de entre 2 y 5 mM dependiendo de la concentracion de NaIO4 usada para la oxidacion. La glicopolisialilacion de la ADNasa oxidada fue llevada a cabo 25 mediante la adicion de pollmero de hidrazida-PSA a una concentracion final de 1.25 mM a la ADNasa oxidada. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion a una concentracion final de 50 mM o 3.17 mg/ml y la glicopolisialilacion de la ADNasa se llevo a cabo a 4.0°C durante un perlodo de tiempo que variaba de 1 hora a 2 horas. Las reacciones fueron detenidas con un exceso molar de 25 veces de Tris con respecto al pollmero. Los conjugados fueron caracterizados usando SDS PAGE e inmunoprecipitacion western. Se observo un desplazamiento 30 en la banda para los conjugados en SDS PAGE y se obtuvo un resultado positivo de la inmunoprecipitacion western. La actividad fue medida como 49%.
Ejemplo de referencia 26
PEGilacion de p-galactosidasa utilizando enlazante aminooxi (3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina)
Se oxido p-galactosidasa (1 mg) con NaIO4 1.5 mg durante 30 minutos a 4°C. La oxidacion fue detenida agregando 35 NaHSO3 hasta una concentracion final de 1.5 mM.
La reaccion de conjugacion fue llevada a cabo usando la p-galactosidasa oxidada con pollmero diaminooxi-PEG (20 kDa). La concentracion final del pollmero en la mezcla de reaccion fue de 1.25 mM. La concentracion final de p- galactosidasa en la mezcla de reaccion fue de 1 mg/ml. El pH final de la mezcla de reaccion deberla estar alrededor de 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio a la mezcla de reaccion a una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. 40 La reaccion fue llevada a cabo a 4°C durante 2 horas. El conjugado no purificado fue caracterizado utilizando SDS PAGE y se observo un desplazamiento en la banda para el conjugado en SDS PAGE. La actividad fue medida como 59%.
Ejemplo de referencia 27
PEGilacion de eritropoyetina utilizando enlazante aminooxi
45 Se oxido eritropoyetina (EPO; 0.2 mg) con NaIO4 5 o 10 mM en acetato de sodio 50 mM a pH 5.75 durante 45 minutos a 4°C y luego la oxidacion fue detenida agregando NaHSO3 a una concentracion final de 5 o 10 mM (para coincidir con la concentracion de NaIO4 usada para la oxidacion). La reaccion de conjugacion fue llevada a cabo usando la EPO oxidada con el pollmero de diaminooxi-PEG (20 kDa). La concentracion final de pollmero en la mezcla de reaccion fue 1.5 mM. El pH final de la mezcla de reaccion deberla estar alrededor de 5.75. Se agrego cianoborohidruro de sodio 50 a la mezcla de reaccion a una concentracion de 50 mM o 3.17 mg/ml. La concentracion final de protelna en la reaccion fue de 0.4 mg/ml. La reaccion de conjugacion fue llevada a cabo durante la noche a 4°C.
La invencion provee as! conjugados de compuestos diferentes a protelnas de coagulacion de la sangre con pollmeros solubles en agua, en particular PSA y mPSA.

Claims (12)

  1. Reivindicaciones
    1. Un metodo para conjugar acido polisialico (PSA) o un PSA modificado (mPSA) a una unidad estructural oxidada de una glicoprotelna diferente a una protelna de coagulacion de la sangre que comprende un grupo carbohidrato, que comprende poner en contacto la unidad estructural carbohidrato oxidada con el pSa o el mPSA bajo condiciones que
    5 permite la conjugacion, en donde dicho PSA o mPSA contiene un grupo aminooxi y se forma un enlace oxima entre la unidad estructural carbohidrato oxidada y el grupo aminooxi sobre el PSA o el mPSA, en donde el PSA modificado es PSA que comprende una unidad estructural derivada de una unidad estructural de acido N-acetilneuramlnico terminal por oxidacion o reduccion.
  2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 en donde el PSA o el mPSA es acido colomlnico o acido colomlnico 10 modificado.
  3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o reivindicacion 2 en donde el PSA o mPSA comprende 2-500 unidades de acido sialico.
  4. 4. El metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion previa en donde la glicoprotelna es seleccionada de citoquinas tales como interleucinas, alfa, beta y gamma interferones, factores estimuladores de colonias que incluyen factores
    15 estimuladores de colonias de granulocitos, factores de crecimiento de fibroblastos, factores de crecimiento derivados de plaquetas, protelna activadora de fosfolipasa (PUP), insulina, protelnas vegetales tales como lectinas y ricinas, factores de necrosis tumoral y alelos relacionados, formas solubles de receptores de factor de necrosis tumoral, receptores de interleucina y formas solubles de receptores de interleucina, factores de crecimiento, factores de crecimiento de tejidos, factores de crecimiento transformantes tales como TGFas o TGFps y factores de crecimiento 20 epidermico, hormonas, somatomedinas, hormonas pigmentarias, factores de liberacion hipotalamica, hormonas antidiureticas, prolactina, gonadotropina corionica, hormona estimulante de follculo, hormona estimulante de tiroides, activador de plasminogeno en tejidos, inmunoglobulinas tales como IgG, IgE, IgM, IgA e IgD, anticuerpos monoclonales, eritropoyetina (EPO), factores sangulneos diferentes a protelnas de coagulacion de la sangre, galactosidasas, a-galactosidasas, p-galactosidasas, ADNasas, fetuina, fragmentos de las mismas y protelnas de 25 fusion que comprenden cualquiera de las protelnas mencionadas anteriormente o fragmentos de las mismas.
  5. 5. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde la glicoprotelna es seleccionada de factores de necrosis tumoral y alelos relacionados, formas solubles de receptores de factor de necrosis tumoral, inmunoglobulinas tales como las IgG, IgE, IgM, IgA e IgD, anticuerpos monoclonales, eritropoyetina (EPO), ADNasas, fetuina, fragmentos de las mismas y protelnas de fusion que comprenden cualquiera de las protelnas antes mencionadas o
    30 fragmentos de las mismas.
  6. 6. El metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion previa que, comprende oxidar la unidad estructural carbohidrato incubando la glicoprotelna con peryodato de sodio (NaIO4).
  7. 7. El metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion previa que comprende oxidar el PSA o el mPSA para formar un grupo aldehldo sobre una unidad terminal del PSA o el mPSA, y haciendo reaccionar el PSA o el mPSA oxidado con
    35 un enlazante aminooxi.
  8. 8. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 7 que comprende oxidar el PSA o el mPSA usando NaIO4.
  9. 9. El metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion previa que comprende poner en contacto la unidad estructural carbohidrato oxidada con PSA o mPSA en un regulador que comprende un catalizador nucleofllico seleccionado de anilina y derivados de anilina.
    40 10. El metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion previa en donde el grupo aminooxi es formado haciendo
    reaccionar PSA o mPSA oxidado con un enlazante aminooxi, y el enlazante aminooxi es 3-oxa-pentano-1,5-dioxiamina o 3,6,9-trioxa-undecano-1,11-dioxiamina.
  10. 11. El metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion previa que comprende adicionalmente reducir un enlace oxima en la glicoprotelna conjugada por incubacion en la presencia de un compuesto reductor.
    45 12. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 11 en donde el compuesto reductor es cianoborohidruro de sodio
    (NaCNBFb) o acido ascorbico (vitamina C):
  11. 13. Una glicoprotelna conjugada obtenible por el metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion previa.
  12. 14. Una glicoprotelna conjugada diferente a protelna de coagulacion de la sangre que comprende:
    (a) la glicoprotelna; y
    (b) al menos un aminooxi-PSA o aminooxi-mPSA enlazado a la glicoprotelna de (a), en donde dicho aminooxi-PSA o aminooxi-mPSA esta unido a la glicoprotelna a traves de una o mas unidades estructurales carbohidrato, en donde el mPSA es PSA que comprende una unidad estructural derivada de una unidad estructural de acido N-acetilneuramlnico
    5 terminal por oxidacion o reduccion.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2670618C (en) 2006-12-15 2016-10-04 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
CN102497884A (zh) 2009-07-27 2012-06-13 巴克斯特国际公司 凝血蛋白缀合物
CN106110311A (zh) 2009-07-27 2016-11-16 百深公司 凝血蛋白缀合物
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
KR101912335B1 (ko) 2009-07-27 2018-10-26 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 비혈액 응고 단백질의 글리코폴리시알화
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
DK2598172T3 (da) * 2010-07-30 2019-07-01 Baxalta GmbH Nukleofile katalysatorer til oximforbindelse
AU2015275284C1 (en) * 2010-07-30 2018-04-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
WO2012159084A1 (en) 2011-05-18 2012-11-22 Baxter International, Inc. Modification-dependent activity assays
EP3808378A1 (en) * 2011-05-27 2021-04-21 Baxalta GmbH Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
AU2013204754C1 (en) * 2012-05-16 2018-10-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Nucleophilic Catalysts for Oxime Linkage
EP2906247A1 (en) 2012-10-15 2015-08-19 Novo Nordisk Health Care AG Factor vii conjugates
CZ2014150A3 (cs) * 2014-03-11 2015-05-20 Contipro Biotech S.R.O. Konjugáty oligomeru kyseliny hyaluronové nebo její soli, způsob jejich přípravy a použití
AU2015242657B2 (en) * 2014-03-31 2020-05-21 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglobulin Fc fragment linkage
EA201892249A1 (ru) 2016-04-04 2019-05-31 Шайр Хьюман Дженетик Терапиз, Инк. Конъюгированный ингибитор c1-эстеразы и пути его применения
JOP20190245A1 (ar) 2017-04-20 2019-10-15 Novartis Ag أنظمة توصيل إطلاق مستدام تتضمن روابط بلا أثر لنقطة الربط
JP2022523301A (ja) 2019-01-23 2022-04-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド アンジオポエチン様７（ａｎｇｐｔｌ７）阻害剤による眼疾患の治療
US11845989B2 (en) 2019-01-23 2023-12-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of ophthalmic conditions with angiopoietin-like 7 (ANGPTL7) inhibitors
CN112129946A (zh) * 2020-08-16 2020-12-25 陆修委 无糖链型惰性蛋白封闭剂的制备方法及应用
WO2022182768A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of inflammation with glucocorticoids and angiopoietin-like 7 (angptl7) inhibitors

Family Cites Families (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS54113492A (en) 1978-02-24 1979-09-05 Sanyo Chem Ind Ltd Preparation of glucoprotein derivative
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4970300A (en) 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
US5250421A (en) 1986-01-03 1993-10-05 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C-type proteins
US5198349A (en) 1986-01-03 1993-03-30 Genetics Institute, Inc. Method for producing factor VIII:C and analogs
JPH0387173A (ja) 1987-09-10 1991-04-11 Teijin Ltd ヒト活性化天然型ファクター８ｃの製造方法及びそれに用いる形質転換体
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5153265A (en) 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4966999A (en) 1988-06-07 1990-10-30 Cytogen Corporation Radiohalogenated compounds for site specific labeling
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
SE466754B (sv) 1990-09-13 1992-03-30 Berol Nobel Ab Saett att kovalent binda biopolymerer till hydrofila ytor
US5492821A (en) 1990-11-14 1996-02-20 Cargill, Inc. Stabilized polyacrylic saccharide protein conjugates
WO1992016555A1 (en) * 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
GB9112212D0 (en) 1991-06-06 1991-07-24 Gregoriadis Gregory Pharmaceutical compositions
US6037452A (en) * 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
DE69329795T2 (de) 1992-10-02 2001-07-05 Genetics Institute, Inc. Zusammensetzung, welche den koagulationsfaktor viii beinhaltet; verfahren zu deren herstellung und die benutzung eines oberflächenaktiven stoffes als stabilisator
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
NO934477L (no) * 1992-12-09 1994-06-10 Ortho Pharma Corp PEG hydrazon- og PEG oksim-bindingdannende reagenser og proteinderivater derav
US5298643A (en) * 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
AU6029594A (en) * 1993-01-15 1994-08-15 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
SE516173C2 (sv) * 1993-02-16 2001-11-26 Ericsson Telefon Ab L M Anordning för telekommunikation
WO1994028024A1 (en) * 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
US5621039A (en) 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
WO1996041813A2 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Offord Robin E Functionalized polymers for site-specific attachment
WO1996040662A2 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Cellpro, Incorporated Aminooxy-containing linker compounds and their application in conjugates
AU6255096A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The Pegylated modified proteins
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
EP0981548A4 (en) 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc GLYCOSYLATABLE SINGLE CHAIN ANTIGEN-BINDING PROTEINS, MANUFACTURE AND USE THEREOF
US6183738B1 (en) 1997-05-12 2001-02-06 Phoenix Pharamacologics, Inc. Modified arginine deiminase
EP1717248A1 (en) 1997-06-04 2006-11-02 Oxford Biomedica (UK) Limited Tumor targeted vector
WO2001082943A2 (en) 2000-05-03 2001-11-08 Novo Nordisk A/S Subcutaneous administration of coagulation factor vii
ES2252876T5 (es) 1997-12-03 2014-04-03 Roche Diagnostics Gmbh Proceso para preparar polipéptidos con glicolización adecuada
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US6552167B1 (en) 1998-08-28 2003-04-22 Gryphon Therapeutics, Inc. Polyamide chains of precise length
DK1656952T3 (da) 1998-10-16 2014-01-20 Biogen Idec Inc Polyalkylenglycolkonjugater af interferon beta-1A og anvendelser deraf
DE19852729A1 (de) 1998-11-16 2000-05-18 Werner Reutter Rekombinante Glycoproteine, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Arzneimittel und ihre Verwendung
EP2921180B1 (en) 1999-02-22 2019-08-14 University of Connecticut Albumin-free factor VIII formulations
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
CN1309423C (zh) 1999-11-12 2007-04-11 马克西根控股公司 干扰素γ偶联物
DE60138364D1 (de) 2000-02-11 2009-05-28 Bayer Healthcare Llc Gerinnungsfaktor vii oder viia konjugate
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
DE60143292D1 (de) 2000-05-03 2010-12-02 Novo Nordisk Healthcare Ag Varianten des menschlichen Koagulationsfaktors VII
AU2001258536A1 (en) 2000-05-16 2001-11-26 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of proteins in aqueous solution
CN1434726A (zh) 2000-06-08 2003-08-06 拉卓拉药物公司 包含高分子量聚环氧乙烷的多价平台分子
US6423826B1 (en) 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US7118737B2 (en) 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
AU8755001A (en) 2000-09-13 2002-03-26 Novo Nordisk As Human coagulation factor vii variants
EP1325127B1 (en) 2000-10-02 2009-03-11 Novo Nordisk Health Care AG Method for the production of vitamin k-dependent proteins
US7001994B2 (en) 2001-01-18 2006-02-21 Genzyme Corporation Methods for introducing mannose 6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins
MXPA03008590A (es) 2001-03-22 2003-12-08 Novo Nordisk Healthcare Ag Derivados del factor vii de coagulacion.
US6913915B2 (en) 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
US7265085B2 (en) 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7795210B2 (en) 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
EP2042196B1 (en) 2001-10-10 2016-07-13 ratiopharm GmbH Remodelling and glycoconjugation of Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF)
AU2002352524B2 (en) 2001-11-07 2007-10-04 Nektar Therapeutics Branched polymers and their conjugates
JP2005535280A (ja) 2001-11-28 2005-11-24 ネオーズ テクノロジーズ， インコーポレイテッド エンドグリカナーゼを用いる糖タンパク質のリモデリング
JP2005510229A (ja) 2001-11-28 2005-04-21 ネオーズ テクノロジーズ， インコーポレイテッド アミダーゼを用いる糖タンパク質のリモデリング
RU2362807C2 (ru) 2002-06-21 2009-07-27 Ново Нордиск Хелт Кэр Аг Конъюгат полипептида фактора vii, способ его получения, его применение и содержащая его фармацевтическая композиция
US7087229B2 (en) 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
US7122189B2 (en) 2002-08-13 2006-10-17 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
EP1400533A1 (en) 2002-09-11 2004-03-24 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
BR0314106A (pt) 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Polipeptìdeos hasilados, especialmente eritropoietina hasilada
EP1681303B1 (en) 2002-09-11 2013-09-04 Fresenius Kabi Deutschland GmbH HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin
US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
EP1578841B2 (en) 2002-12-31 2016-10-12 Nektar Therapeutics AL, Corporation Maleamic acid polymer derivatives and their bioconjugates
WO2004060965A2 (en) 2002-12-31 2004-07-22 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
WO2004075923A2 (en) * 2003-02-26 2004-09-10 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor viii moiety conjugates
CA2521784C (en) 2003-04-08 2012-03-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Reversible pegylated drugs
EP1654004A2 (en) * 2003-08-08 2006-05-10 Novo Nordisk A/S Synthesis and application of new structural well defined branched polymers as conjugating agents for peptides
WO2005014655A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
EP1653991A2 (en) * 2003-08-08 2006-05-10 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of a polymer and a protein linked by an oxime linking group
CN1863549A (zh) * 2003-08-08 2006-11-15 费森尤斯卡比德国有限公司 通过肟连接基团进行连接的聚合物和蛋白质的缀合物
JP2007501870A (ja) * 2003-08-08 2007-02-01 フレゼニウス・カビ・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ヒドロキシアルキルデンプンとｇ−ｃｓｆの複合体
JP2007501888A (ja) * 2003-08-12 2007-02-01 リポクセン テクノロジーズ リミテッド ポリシアル酸誘導体
WO2005016974A1 (en) 2003-08-12 2005-02-24 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
AU2004296860B2 (en) 2003-12-03 2010-04-22 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
WO2005056608A1 (en) * 2003-12-04 2005-06-23 University Of Utah Research Foundation Modified macromolecules and methods of making and using thereof
US7338933B2 (en) 2004-01-08 2008-03-04 Neose Technologies, Inc. O-linked glycosylation of peptides
WO2006020372A2 (en) 2004-07-23 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Enzymatic modification of glycopeptides
JP2008507990A (ja) 2004-08-02 2008-03-21 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト Ｆｖｉｉの抱合体
CN101039965A (zh) * 2004-08-12 2007-09-19 利普生技术有限公司 唾液酸衍生物
US8652334B2 (en) 2004-08-12 2014-02-18 Lipoxen Technologies Limited Fractionation of charged polysaccharide
WO2006016168A2 (en) 2004-08-12 2006-02-16 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives
KR101468345B1 (ko) 2004-11-12 2014-12-03 바이엘 헬스케어 엘엘씨 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
CA2591852A1 (en) 2004-12-27 2006-07-06 Baxter International Inc. Polymer-von willebrand factor-conjugates
JP2008526864A (ja) 2005-01-06 2008-07-24 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 糖断片を用いる糖結合
CN101160326B (zh) 2005-02-23 2013-04-10 利普生技术有限公司 用于蛋白质衍生和缀合的活化的唾液酸衍生物
EP1891231A4 (en) 2005-05-25 2011-06-22 Novo Nordisk As GLYCOPEGYLATED FACTOR IX
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
WO2007022784A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 Maxygen Holdings Ltd. Liquid factor vii composition
BRPI0620316A2 (pt) 2005-12-21 2011-11-08 Wyeth Corp formulações de proteìnas com viscosidades reduzida e seus usos
CA2647314A1 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
EP2089052A4 (en) 2006-05-24 2011-02-16 Peg Biosciences POLYETHYLENE GLYCOL-BASED LINK COMPOUNDS AND BIOLOGICALLY ACTIVE CONJUGATES BASED ON SAID COMPOUNDS
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
WO2008035373A2 (en) 2006-07-13 2008-03-27 Serum Institute Of India Ltd Highly pure polysialic acid and process for preperation thereof
WO2008012528A1 (en) 2006-07-25 2008-01-31 Lipoxen Technologies Limited N-terminal polysialylation
WO2008025856A2 (en) * 2006-09-01 2008-03-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified glycoproteins
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
CA2670618C (en) 2006-12-15 2016-10-04 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
EP2099475B1 (en) 2007-01-03 2016-08-24 Novo Nordisk Health Care AG Subcutaneous administration of coagulation factor viia-related polypeptides
SI2457920T1 (en) * 2007-01-18 2018-02-28 Genzyme Corporation Oligosaccharides containing the amino acid group and their conjugates
WO2008119815A1 (en) 2007-04-02 2008-10-09 Novo Nordisk A/S Subcutaneous administration of coagulation factor ix
EP2162535A4 (en) * 2007-06-04 2011-02-23 Novo Nordisk As O-linked glycosylation using N-acetylglucosamine transferases
JP5622569B2 (ja) 2007-06-26 2014-11-12 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 加水分解性ポリマーｆｍｏｃ−リンカー
EP2173759A4 (en) 2007-07-03 2014-01-29 Childrens Hosp & Res Ct Oak OLIGOSIAL INSERTS, PROCESS FOR THEIR PREPARATION AND ITS IMMUNOLOGICAL USE
KR20100090684A (ko) 2007-10-09 2010-08-16 폴리테릭스 리미티드 신규한 접합 단백질 및 펩티드
CA2711503A1 (en) 2008-01-08 2009-07-16 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
KR101582841B1 (ko) 2008-02-27 2016-01-11 노보 노르디스크 에이/에스 콘쥬게이트된 인자 ｖｉｉｉ 분자
WO2009130602A2 (en) 2008-04-24 2009-10-29 Celtic Pharma Peg Ltd. Factor ix conjugates with extended half-lives
CN102065899A (zh) 2008-05-23 2011-05-18 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 含有高浓度的芳香族防腐剂的peg-官能化的丝氨酸蛋白酶的制剂
WO2009141433A1 (en) 2008-05-23 2009-11-26 Novo Nordisk Health Care Ag Low viscosity compositions comprising a pegylated gla-domain containing protein
CA2726942A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Bayer Healthcare Llc Fviii muteins for treatment of von willebrand disease
EP2374481B1 (en) 2008-07-21 2015-11-04 Polytherics Limited Novel reagents and method for conjugating biological molecules
CA2740793A1 (en) 2008-11-03 2010-06-03 Haiyan Jiang Method for the treatment of hemophilia
WO2010083536A1 (en) 2009-01-19 2010-07-22 Bayer Healthcare Llc Protein conjugate having an endopeptidase-cleavable bioprotective moiety
EP2398822B1 (en) 2009-02-19 2013-01-02 Novo Nordisk A/S Modification of factor viii
US9005598B2 (en) 2009-03-04 2015-04-14 Polytherics Limited Conjugated proteins and peptides
US20100330033A1 (en) 2009-04-16 2010-12-30 Nian Wu Protein-carrier conjugates
GB0908393D0 (en) 2009-05-15 2009-06-24 Almac Sciences Scotland Ltd Labelling method
CN102497884A (zh) 2009-07-27 2012-06-13 巴克斯特国际公司 凝血蛋白缀合物
KR101912335B1 (ko) 2009-07-27 2018-10-26 리폭센 테크놀로지즈 리미티드 비혈액 응고 단백질의 글리코폴리시알화
EP2461821A4 (en) 2009-07-31 2013-07-03 Bayer Healthcare Llc MODIFIED POLYPEPTIDES OF FACTOR IX AND USES THEREOF
DE102009028526A1 (de) 2009-08-13 2011-02-24 Leibniz-Institut Für Polymerforschung Dresden E.V. Verfahren zur Modifikation und Funktionalisierung von Sacchariden
EP2480578A4 (en) 2009-09-25 2013-04-17 Vybion Inc MODIFICATION OF POLYPEPTIDE
WO2011064247A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Novo Nordisk Health Care Ag Method of purifying pegylated proteins
US20130040888A1 (en) 2010-02-16 2013-02-14 Novo Nordisk A/S Factor VIII Molecules With Reduced VWF Binding
GB201007357D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIII
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
WO2012068134A1 (en) 2010-11-15 2012-05-24 Biogen Idec Inc. Enrichment and concentration of select product isoforms by overloaded bind and elute chromatography
CN103796670A (zh) 2011-07-08 2014-05-14 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 因子viii嵌合和杂合多肽及其使用方法

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