ES2593002T3 - Receptor ZCYTOR17 de citocina - Google Patents

Abstract

Un polinucleotido aislado que codifica un polipeptido, en el que la secuencia de aminoacidos del polipeptido se selecciona del grupo de: (a) una secuencia de aminoacidos que comprende los restos de aminoacidos 1 (Met) a 732 (Val) como se muestra en la SEQ ID NO: 2; (b) una secuencia de aminoacidos que comprende los restos de aminoacidos 20 (Ala) a 732 (Val) como se muestra en la SEQ ID NO: 2; (c) una secuencia de aminoacidos que comprende los restos de aminoacidos 544 (Lys) a 732 (Val) como se muestra en la SEQ ID NO: 2; (d) una secuencia de aminoacidos que comprende los restos de aminoacidos 1 - 239 de la SEQ ID NO: 22; (e) una secuencia de aminoacidos que consiste en los restos de aminoacidos 20 (Ala) a 227 (Pro) como se muestra en la SEQ ID NO: 2; (f) una secuencia de aminoacidos que consiste en los restos de aminoacidos 1 (Met) a 649 (Ile) como se muestra en la SEQ ID NO: 46; y (g) una secuencia de aminoacidos que consiste en los restos de aminoacidos 1 - 324 de la SEQ ID NO: 18.

Description

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SEQ ID NO: 55 para indicar posiciones nucleotídicas degeneradas. La columna de “Resolución” son los nucleótidos

indicados mediante un código de letra. La columna “Complemento” indica el código para el nucleótido (o nucleótidos)

complementario. Por ejemplo, el código Y indica C o T, y su complemento R indica A o G, siendo A complementario

de T y G complementario de C.

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TABLA 1

Nucleótido Resolución Complemento Resolución AA T T CCG G GGC C TTA A R A|G Y C|T Y C|T R A|G M A|C K G|T K G|T M A|C S C|G S C|G W A|T W A|T H A|C|T D A|G|T B C|G|T V A|C|G V A|C|G B C|G|T D A|G|T H A|C|T N A|C|G|T N A|C|G|T

Los codones degenerados usados en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 55, que incluyen todos los 10 codones posibles para un aminoácido determinado, se exponen en la Tabla 2.

TABLA 2

Aminoácido Código de una letra Codones Codón Degenerado

Cys

C TGC TGT TGY

Ser

S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN

Thr

T ACA ACC ACG ACT ACN

Pro

P CCA CCC CCG CCT CCN

Ala

A GCA GCC GCG GCT GCN

Gly

G GGA GGC GGG GGT GGN

Asn

N AAC AAT AAY

Asp

D GAC GAT GAY

Glu

E GAA GAG GAR

Gln

Q CAA CAG CAR

His

H CAC CAT CAY

Arg

R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN

Lys

K AAA AAG AAR

Met

M ATG ATG

Ile

I ATA ATC ATT ATH

Leu

L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN

Val

V GTA GTC GTG GTT GTN

Phe

F TTC TTT TTY

Tyr

Y TACTAT TAY

Trp

W TGG TGG

Ter

. TAA TAG TGA TRR

Asn|Asp

B RAY

Glu|Gln

Z SAR

Cualquiera

X NNN

15 Un experto habitual en la técnica apreciará que, en la determinación de un codón degenerado, se introduce alguna ambigüedad representativa de todos los codones posibles que codifican cada aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado para la serina (WSN) puede, en algunas circunstancias, codificar la arginina (AGR), y el codón degenerado de la arginina (MGN) puede, en algunas circunstancias, codificar la serina (AGY). Existe una relación

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similar entre codones que codifican la fenilalanina y la leucina. Por tanto, algunos polinucleótidos incluidos por la secuencia degenerada pueden codificar secuencias de aminoácidos variantes, pero un experto habitual en la técnica puede identificar fácilmente dichas secuencias variantes por referencia a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 54; o SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 93. La funcionalidad de las secuencias

5 variantes puede ensayarse fácilmente como se describe en el presente documento.

Un experto habitual en la técnica también apreciará que especies diferentes pueden exhibir “uso de codón preferencial”. En general, véase, Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6: 31524, 1996; Wain-Hobson, et al, Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean y Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. Como se usa en el presente documento, la expresión “uso de codón preferencial” o “codones preferenciales” es una expresión de la técnica que se refiere a codones de traducción de proteínas que se usan más frecuentemente en células de una especie determinada, favoreciendo de este modo a uno o a algunos representantes de los posibles codones que codifican cada aminoácido (véase la Tabla 2). Por ejemplo, el aminoácido treonina (Thr) puede codificarse con ACA, ACC, ACG o 15 ACT, pero en células de mamífero ACC es el codón más habitualmente usado; en otras especies, por ejemplo, células de insectos, levaduras, virus o bacterias, los diferentes codones de Thr pueden ser preferenciales. Los codones preferenciales para una especie particular pueden introducirse en los polinucleótidos de la presente invención mediante diversos métodos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferenciales en ADN recombinante puede, por ejemplo, potenciar la producción de la proteína haciendo que la traducción de la proteína sea más eficiente en un tipo de célula o especie particular. Por lo tanto, la secuencias de codones degeneradas desveladas en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 55 sirven como moldes para optimizar la expresión de los polinucleótidos zcytor17 en diversos tipos de células y especies normalmente usadas en la técnica y desveladas en el presente documento. Las secuencias que contienen codones preferenciales pueden ensayarse y optimizarse con respecto a la expresión en diversas especies y ensayarse con respecto a la

25 funcionalidad como se desvela en el presente documento.

Los polinucleótidos aislados descritos en el presente documento hibridarán con regiones de tamaño similar de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 54; o SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 93; o con una secuencia complementaria a las mismas, en condiciones rigurosas. En general, se seleccionan condiciones rigurosas que son aproximadamente 5 ºC más bajas que el punto de fusión térmico (Tf) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la cual el 50 % de la secuencia diana se hibrida con una secuencia perfectamente coincidente. En la técnica se conocen numerosas ecuaciones para calcular la Tm y son específicas para el ADN, ARN e híbridos de ADN-ARN y secuencias sonda polinucleotídicas de longitud variable (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 35 segunda edición (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques. (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227 (1990)). Los programas informáticos de análisis de secuencias tales como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA), así como sitios en Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia determinada y calcular el punto de fusión térmico, Tf en función de criterios definidos por el usuario. Dichos programas también pueden analizar una secuencia determinada en condiciones definidas e identificar secuencias sonda adecuadas. Normalmente, la hibridación de secuencias polinucleotídicas más largas (por ejemplo, >50 pares de bases) se realiza a temperaturas de aproximadamente 20-25 ºC por debajo del punto de fusión térmico Tf calculado. Para sondas más cortas (por ejemplo, <50 pares de bases) la hibridación se realiza normalmente al Tf o a 5-10 ºC por 45 debajo. Esto permite la velocidad máxima de hibridación para híbridos de ADN-ADN y ADN-ARN. Pueden obtenerse grados más altos de rigurosidad a temperaturas más bajas con la adición de formamida que reduce el punto de fusión térmico Tf del híbrido aproximadamente 1 ºC por cada formamida al 1 % en la solución tampón. Las condiciones de hibridación rigurosas adecuadas son equivalentes a aproximadamente una incubación de 5 h a una noche a una temperatura de aproximadamente 42 ºC en una solución que comprende: formamida a aproximadamente 40-50 %, hasta aproximadamente 6X SSC, aproximadamente solución de Denhardt 5X, de cero hasta aproximadamente 10 % de sulfato de dextrano y aproximadamente 10-20 µg/ml de ADN transportador desnaturalizado disponible en el comercio. Generalmente, dichas condiciones rigurosas incluyen temperaturas de 20-70 º C y un tampón de hibridación que contiene hasta 6X SSC y formamida al 0-50 %; realizándose después de la hibridación filtros de lavado en hasta aproximadamente 2X SSC. Por ejemplo, una rigurosidad de lavado

55 adecuada es equivalente a de 0,1X SSC a 2X SSC, SDS al 0,1 %, a una temperatura de 55 ºC a 65 ºC. Pueden usarse diferentes grados de rigurosidad durante la hibridación y el lavado para conseguir una unión específica máxima con la secuencia diana. Normalmente, después de la hibridación, los lavados se realizan a grados crecientes de rigurosidad para retirar las sondas polinucleotídicas no hibridadas de los complejos hibridados. La hibridación y las condiciones de lavado rigurosas dependen de la longitud de la sonda, que se refleja en el Tf, en la hibridación y en las soluciones de lavado usadas, y que determina rutinariamente, de manera empírica, un experto en la técnica.

Como se ha indicado anteriormente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. En la técnica se conocen métodos para preparar ADN y ARN. En general, el ARN se aísla de un tejido o de una célula que 65 produce grandes cantidades de ARN de zcytor17. Dichos tejidos y células se identifican mediante transferencia de Northern (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201, 1980) e incluyen líneas celulares de PBL, bazo, timo,

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médula ósea, próstata, y de tejidos linfáticos, de leucemia eritrocítica humana, leucemia monocítica aguda, otras celulares linfoides y hematopoyéticas y similares. El ARN total puede prepararse usando extracción con isotiocianato de guanidinio seguido de aislamiento por centrifugación en un gradiente de CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979). El ARN poli (A)+ se prepara a partir de ARN total usando el método de Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad.

5 Sci. USA 69: 1408-12, 1972). El ADN complementario (ADNc) se prepara a partir de ARN poli (A)+ usando métodos conocidos. Como alternativa, el ADN genómico puede aislarse. Los polinucleótidos que codifican polipéptidos de zcytor17 se identifican después y se aíslan, por ejemplo, mediante hibridación o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis, Patente de Estados Unidos n.º 4.683.202).

Un clon de longitud completa que codifica zcytor17 puede obtenerse mediante procedimientos de clonación convencionales. Se prefieren clones de ADN complementario (ADNc), aunque en algunas aplicaciones (por ejemplo expresión en animales transgénicos) puede ser preferible usar un clon genómico, o modificar un clon de ADNc que incluya al menos un intrón genómico. Los métodos para la preparación de clones de ADNc y genómico son muy conocidos y se están dentro del nivel de capacidad habitual en la técnica, e incluyen el uso de la secuencia

15 desvelada en el presente documento, o partes de la misma, para la exploración o cebado de una biblioteca. Las bibliotecas de expresión pueden explorarse con anticuerpos contra zcytor17, con fragmentos del receptor o con otros compañeros de unión específicos.

Los polinucleótidos de la presente invención también pueden sintetizarse usando sintetizadoras de ADN. Actualmente el método de elección es el método de la fosforamidita. Si se requiere sintetizar químicamente ADN bicatenario para una aplicación, tal como la síntesis de un gen o de un fragmento génico, entonces cada cadena complementaria se fabrica por separado. La producción de polinucleótidos cortos (de 60 a 80 pb) es técnicamente sencilla y puede realizarse sintetizando las cadenas complementarias y después hibridándolas. Sin embargo, para la producción de polinucleótidos más largos (>300 pb), normalmente se emplean estrategias especiales, porque la

25 eficacia de acoplamiento de cada ciclo durante la síntesis química de ADN es raramente del 100 %. Para superar este problema, los genes sintéticos (bicatenarios) se ensamblan en forma modular a partir de fragmentos monocatenarios que tienen una longitud de 20 a 100 nucleótidos.

Un modo alternativo para preparar un gen de longitud completa es sintetizar un conjunto específico de oligonucleótidos (de 40 a 100 nucleótidos) solapantes. Después de hibridar las regiones complementarias solapantes cortas (de 6 a 10 nucleótidos) 3’ y 5’, sigue habiendo huecos grandes, pero las regiones cortas de bases emparejadas son tanto suficientemente largas como suficientemente estables para mantener la estructura en conjunto. Los huecos se llenan y el ADN dúplex se completa mediante síntesis de ADN enzimática con la ADN polimerasa I de E. coli. Después de completar la síntesis enzimática, las muescas se sellan con ADN ligasa de T4.

35 Las construcciones bicatenarias se ligan secuencialmente entre sí para formar la secuencia génica completa que se verifica mediante análisis de secuencia de ADN. Véase Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology. Principles & Applications of Recombinant DNA. (ASM Press, Washington, D. C. 1994); Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323-56, 1984 y Climie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 633-7, 1990. Además, generalmente se añaden otras secuencias que contienen señales para el inicio y la terminación apropiados de la transcripción y la traducción.

La presente memoria descriptiva también describe polipéptidos y polinucleótidos homólogos de otras especies (ortólogos). Estas especies incluyen, pero sin limitación, especies de mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y de otros vertebrados e invertebrados. De particular interés son los polipéptidos de zcytor17 de otras especies de mamíferos, incluyendo polipéptidos de murino, porcino, ovino, bovino, canino, felino, equino y de otros 45 primates. Los ortólogos de zcytor17 humano pueden clonarse usando la información y las composiciones que proporciona la presente invención en combinación con técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un ADNc puede clonarse usando ARNm obtenido de un tipo de tejido o célula que exprese zcytor17 como se desvela en el presente documento. Fuentes adecuadas de ARNm pueden identificarse explorando transferencias de Northern con sondas diseñadas a partir de las secuencias desveladas en el presente documento. Después, se prepara una biblioteca de ARNm de un tejido positivo o de una línea celular positiva. Un ADNc que codifica zcytor17 puede después aislarse mediante diversos métodos, tal como mediante exploración con un ADNc humano, completo o parcial, o con un conjunto o más de sondas degeneradas basándose en las secuencias desveladas. Un ADNc puede también clonarse usando PCR (Mullis, citado anteriormente), usando cebadores diseñados a partir de la secuencia de zcytor17 humana representativa desvelada en el presente documento. En un método adicional, la biblioteca de

55 ADNc puede usarse para transformar o transfectar células hospedadoras, y la expresión del ADNc de interés puede detectarse con un anticuerpo contra el polipéptido de zcytor17. También pueden aplicarse técnicas similares para el aislamiento de clones genómicos.

Se ha identificado una secuencia de polinucleótidos para el ortólogo de ratón de zcytor17 humano y se muestra en la SEQ ID NO: 56 y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en la SEQ ID NO: 57. El análisis del polipéptido de zcytor17 de ratón codificado por la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 56 reveló una fase de lectura abierta que codificaba 662 aminoácidos (SEQ ID NO: 57) que comprendía un péptido señal secretor predicho de 45 restos de aminoácidos (resto 1 (Met) al resto 45 (Ala) de SEQ ID NO: 57), y un polipéptido maduro de 617 aminoácidos (resto 46 (Val) al resto 662 (Cys) de SEC ID NO: 57). Además, un resto de Met adicional, Met (28) 65 puede usarse como una metionina iniciadora; que comprende un segundo péptido señal secretor predicho de 18 restos de aminoácidos (resto 28 (Met) al resto 45 (Ala) de SEQ ID NO: 57) y el mismo polipéptido maduro de 617

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En resumen, FASTA caracteriza en primer lugar la similitud de secuencia identificando regiones compartidas por la secuencia a investigar (por ejemplo, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 93) y una secuencia de ensayo que tiene la densidad más alta de identidades (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si la ktup = 2), sin considerar sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos conservativas. Las 5 diez regiones con la densidad más alta de identidades se vuelven a puntuar después comparando la similitud de todos los aminoácidos emparejados usando una matriz de sustitución de aminoácidos, y los extremos de las regiones se “recortan” para incluir solo aquellos restos que contribuyan a la puntuación más alta. Si hay varias regiones con puntuaciones mayores que el valor “límite” (calculado mediante una fórmula predeterminada basándose en la longitud de la secuencia y en el valor de ktup), entonces las regiones iniciales recortadas se 10 examinan para determinar si las regiones pueden unirse para formar un alineamiento aproximado con huecos. Finalmente, las regiones de puntuación más alta de las dos secuencias de aminoácidos se alinean usando una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787 (1974)), que permite realizar inserciones y deleciones de aminoácidos. Los parámetros preferidos para el análisis FASTA son: ktup = 1, penalización por apertura de hueco = 10, penalización

15 por extensión de hueco = 1 y matriz de sustitución = BLOSUM62, con otros parámetros establecidos por defecto. Estos parámetros pueden introducirse en un programa FASTA modificando el archivo de la matriz de puntuación (“SMATRIX”), como se explica en el Anexo 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990).

FASTA también puede usarse para determinar la identidad de secuencia de moléculas de ácido nucleico usando una

20 proporción como se desvela anteriormente. Para efectuar comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor de ktup puede variar entre uno a seis, preferentemente de tres a seis, siendo tres el valor más preferente, con otros parámetros del programa FASTA establecidos por defecto.

La tabla BLOSUM62 (Tabla 3) es una matriz de sustitución de aminoácidos procedente de aproximadamente 2.000

25 alineamientos múltiples locales de segmentos de secuencias de proteínas, que representan regiones muy conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff and Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). Por consiguiente, las frecuencias de sustitución de BLOSUM62 pueden usarse para definir sustituciones de aminoácidos conservativas que pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible diseñar sustituciones de aminoácidos basándose exclusivamente en

30 propiedades químicas (como se analiza más adelante), la expresión “sustitución de aminoácidos conservativa” se refiere preferentemente a una sustitución representada por un valor BLOSUM62 mayor de -1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácidos es conservativa si la sustitución se caracteriza por un valor BLOSUM62 de 0, 1, 2 o 3. De acuerdo con este sistema, las sustituciones de aminoácidos conservativas preferidas se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 o 3), aunque las sustituciones de aminoácidos conservativas más

35 preferidas se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 o 3).

Los polipéptidos de zcytor17 variantes o polipéptidos de zcytor17 sustancialmente homólogos se caracterizan porque tienen una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferentemente de una naturaleza inferior, es decir, que las sustituciones de aminoácidos conservativas (véase la Tabla 4) y otras 40 sustituciones no afectan significativamente al plegamiento o a la actividad del polipéptido; pequeñas deleciones, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas extensiones amino o carboxilo terminales, tal como un resto de metionina amino-terminal, un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 restos,

o una etiqueta de afinidad. La presente memoria descriptiva describe por lo tanto polipéptidos que comprenden una secuencia que es al menos 80 %, preferentemente al menos 90 %, y más preferentemente 95 % o más idéntica a la

45 región correspondiente de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57 o SEQ ID NO: 93 excluyendo las secuencia de etiquetas, extensión, enlazadoras y similares. Los polipéptidos que comprenden etiquetas de afinidad pueden comprender adicionalmente un sitio de escisión proteolítica entre el polipéptido de zcytor17 y la etiqueta de afinidad. Los sitios adecuados incluyen sitios de escisión de trombina y sitios de escisión del factor Xa.

50 Tabla 4 Sustituciones de aminoácidos conservativas

Básicos: arginina lisina histidina

Ácidos: ácido glutámico ácido aspártico

Polares: glutamina arginina

Hidrófobos: leucina isoleucina valina

Aromáticos: fenilalanina triptófano tirosina

Pequeños: glicina

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alanina serina treonina metionina

La presente memoria descriptiva describe adicionalmente una variedad de otras fusiones de polipéptidos y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones de polipéptidos. Por ejemplo, un polipéptido de 5 zcytor17 puede prepararse como una fusión con una proteína dimerizante como se desvela en las Patentes de Estados Unidos n.º 5.155.027 y 5.567.584. Las proteínas dimerizantes preferidas en este aspecto incluyen dominios de región constante de inmunoglobulina. Las fusiones de inmunoglobulina-polipéptido de zcytor17 pueden expresarse en células modificadas genéticamente para producir una variedad de análogos de zcytor17 multiméricos. Dominios auxiliares pueden fusionarse con polipéptidos de zcytor17 para dirigirlos a células, tejidos o

10 macromoléculas (por ejemplo colágeno) específicos. Un polipéptido de zcytor17 puede fusionarse con dos o más fracciones, tal como una etiqueta de afinidad para la purificación y un dominio de direccionamiento. Las fusiones polipeptídicas también pueden comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre dominios. Véase, Tuan et al., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996.

15 Las proteínas de la presente invención también pueden comprender restos de aminoácidos de origen no natural. Los aminoácidos de origen no natural incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidín carboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. En

20 la técnica se conocen diversos métodos para incorporar en las proteínas restos de aminoácidos de origen no natural. Por ejemplo, puede emplearse un sistema in vitro en el que se supriman mutaciones sin sentido usando ARNt supresor químicamente aminoacetilado. En la técnica se conocen métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se realiza en un sistema acelular que comprende un extracto de S30 de E. coli y enzimas disponibles en el comercio y otros reactivos. Las

25 proteínas se purifican por cromatografía. Véase, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993; y Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993). En un segundo método, la traducción se realiza en ovocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y ARNt supresor aminoacilado químicamente (Turcatti et al, J. Biol Chem

271: 19991-8, 1996). En un tercer método, células de E. coli se cultivan en ausencia de un aminoácido natural que

30 va a reemplazarse (por ejemplo, fenilalanina), y en presencia del aminoácido (o aminoácidos) de origen no natural deseado (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido de origen no natural se incorpora en la proteína en lugar de su homólogo natural. Véase, Koide et al., Biochem. 33: 7470-7476, 1994. Los restos de aminoácidos de origen natural pueden transformarse en especies de origen no natural mediante modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con mutagénesis dirigida

35 a sitio para expandir adicionalmente el rango de sustituciones (Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).

Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos de origen no natural y aminoácidos no naturales puede sustituirse por restos de aminoácidoss de zcytor17.

40 Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida a sitio o la mutagénesis mediante alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-5, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4498-502, 1991). En la última técnica, se introducen mutaciones de una sola alanina en cada resto de la molécula y las moléculas mutantes

45 resultantes se someten a ensayo para determinar la actividad biológica (por ejemplo unión a ligando y traducción de señal) como se desvela más adelante para identificar restos de aminoácidoss que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996. También pueden determinarse sitios de interacción de tipo receptor-ligando, proteína-proteína u otra interacción biológica, mediante análisis físicos de estructura, determinados mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de

50 electrones o marcaje con fotoafinidad, junto con mutación de supuestos aminoácidos en sitios de contacto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Las identidades de los aminoácidos esenciales también pueden deducirse a partir de análisis de homologías con receptores relacionados.

55 La determinación de restos de aminoácidoss que están en regiones o dominios que son críticos para mantener la integridad estructural puede determinarse. En estas regiones pueden determinarse restos específicos que serán más

o menos tolerantes al cambio y mantendrán la estructura terciaria global de la molécula. Como métodos para analizar la estructura de las secuencias se incluyen, pero sin limitación, el alineamiento de secuencias múltiples con análisis informáticos y de alta identidad de nucleótidos o aminoácidos, usando programas informáticos disponibles

60 (por ejemplo, el visualizador Insight II® y herramientas de modelado de homología; MSI, San Diego, CA), propensiones de estructura secundaria, patrones binarios, empaquetamiento complementario e interacciones polares enterradas (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5: 372-376, 1995 y Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6:

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zcytor17 (soluble o inmovilizado). Además, los fragmentos funcionales también incluyen el péptido señal, el dominio de señalización intracelular y similar. Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, zcytor17 se caracteriza por una estructura de receptor de citocina de clase I. La presente memoria describe adicionalmente proteínas de fusión que incluyen: (a) moléculas polipeptídicas que comprenden un dominio extracelular, un dominio

5 de unión a citocina, o un dominio intracelular descrito en el presente documento; y (b) fragmentos funcionales que comprenden uno o más de estos dominios. La otra parte polipeptídica de la proteína de fusión la puede aportar otro receptor de citocina de clase I, por ejemplo, receptor de gpl30, LIF, IL-12, WSX-1, la subunidad β del receptor de IL2 y el receptor β común (es decir, subunidades beta del receptor de IL3, IL-5 y GM-CSF) o un péptido señal secretor no natural y/o no relacionado que facilita la secreción de la proteína de fusión.

10 Pueden realizarse análisis de deleción rutinarios de moléculas de ácido nucleico para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de zcytor17. Como una ilustración, moléculas de ADN que tienen la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 53 o fragmentos de las mismas, pueden digerirse con nucleasa Bal31 para obtener una serie de deleciones anidadas.

15 Estos fragmentos de ADN se insertan después en vectores de expresión en fases de lectura adecuadas y los polipéptidos expresados se aíslan y se ensayan con respecto a la actividad de zcytor17, o con respecto a la capacidad de unirse a anticuerpos anti-zcytor17 o ligandos de zcytor17. Una alternativa a la digestión con exonucleasa es usar mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para introducir deleciones o codones de terminación para la producción específica de un fragmento de zcytor17 deseado. Como alternativa, pueden sintetizarse

20 fragmentos particulares de un polinucleótido zcytor17 usando la reacción en cadena de la polimerasa.

Los expertos en la técnica conocen métodos convencionales para identificar dominios funcionales. Por ejemplo, estudios sobre el truncamiento en cualquiera o en ambos extremos de interferones se han resumido en Horisberger y Di Marco, Pharmac. Ther. 66: 507 (1995). Además, se han descrito técnicas convencionales para análisis funcional 25 de proteínas, por ejemplo, en Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240: 113 (1993); Content et al., “Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon”, en Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, “The EGF Receptor”, in Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton et al., (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:

30 25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995); y Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996).

Pueden realizarse y ensayarse sustituciones de aminoácidos múltiples usando métodos conocidos de mutagénesis y exploración tales como los desvelados por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53-57, 1988) o Bowie y Sauer 35 (Proc Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989). Resumiendo, estos autores desvelan métodos para la aleatorización simultánea de dos o más polipéptidos, seleccionando un polipéptido funcional y después secuenciando los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones admisibles en cada posición. Otros métodos que pueden usarse incluyen presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., Biochem.

30: 10832-10837, 1991; Ladner et al., Patente de Estados Unidos n.º 5.223.409; Huse, Publicación WIPO WO 40 92/062045) y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).

Pueden generarse variantes de las secuencias de ADN y polipeptídicas de zcytor17 desvelado a través de barajado de ADN como se desvela en Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1074751, 1994 y en la publicación WIPO WO 97/20078. En resumen, se generan ADN variantes mediante recombinación 45 homóloga in vitro por fragmentación al azar de un ADN parental seguido de reensamblaje usando PCR, dando como resultado mutaciones puntuales introducidas al azar. Esta técnica puede modificarse usando una familia de ADN parentales, tales como variantes alélicas o ADN de diferentes especies, para introducir variabilidad adicional en el proceso. La selección o exploración para la actividad deseada, seguido de iteraciones adicionales de mutagénesis y ensayo proporciona una “evolución” rápida de secuencias seleccionando mutaciones deseables al mismo tiempo

50 que se seleccionan simultáneamente contra cambios perjudiciales.

Los métodos de mutagénesis como se desvela en el presente documento pueden combinarse con métodos de exploración automáticos, de alto rendimiento, para detectar la actividad de polipéptidos del receptor zcytor17 clonado, mutagenizado en células hospedadoras. Los ensayos preferidos en este aspecto incluyen ensayos de 55 proliferación celular y ensayos de unión a ligando basados en biosensores, que se describen más adelante. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican receptores activos o partes de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión a ligando, dominios de señalización y similares) pueden recuperarse de las células hospedadoras y secuenciarse rápidamente usando equipos modernos. Estos métodos permiten determinar rápidamente la importancia de restos de aminoácidoss individuales en un polipéptido de interés y pueden aplicarse a polipéptidos de

60 estructura desconocida.

Además, las proteínas de la presente memoria descriptiva (o sus fragmentos polipeptídicos), pueden unirse a otras moléculas bioactivas, particularmente a receptores de citocina, para proporcionar moléculas multifuncionales. Por ejemplo, uno o más dominios del receptor soluble zcytor17 pueden unirse a otros receptores solubles de citocina

65 para potenciar sus propiedades biológicas o eficacia de producción.

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esté unida operativamente a otro polipéptido. La secuencia señal secretora contenida en los polipéptidos de fusión descritos en el presente documento está preferentemente fusionada en el extremo amino en un péptido adicional para dirigir al polipéptido adicional en la ruta secretora. Dichas construcciones tienen numerosas aplicaciones conocidas en la técnica. Por ejemplo, estas nuevas construcciones de fusión de secuencia de señal secretoras

5 pueden dirigir la secreción de un componente activo de una proteína normalmente no secretada. Dichas fusiones pueden usarse in vivo o in vitro para dirigir péptidos a través de la ruta secretora.

Las células de mamífero cultivadas son hospedadores adecuados en la presente invención. Los métodos para la introducción de ADN exógeno en células hospedadores de mamífero incluyen transfección mediada con fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham y Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982), transfección mediada con DEAE-dextrano (Ausubel et al., citado anteriormente), y transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15: 80, 1993, y vectores virales (Miller y Rosman, BioTechniques 7: 980-90, 1989; Wang y Finer, Nature Med. 2: 714-716, 1996). La producción de polipéptidos recombinantes en 15 células de mamífero cultivadas se desvela, por ejemplo, en Levinson et al, la Patente de Estados Unidos n.º 4.713.339; Hagen et al., Patente de Estados Unidos n.º 4.784.950; Palmiter et al., Patente de Estados Unidos n.º 4.579.821; y Ringold, Patente de Estados Unidos n.º 4.656.134. Las células de mamífero cultivadas adecuadas incluyen las líneas celulares COS-1 (ATCC n.º CRL 1650), COS-7 (ATCC n.º CRL 1651), BHK (ATCC n.º CRL 1632), BHK 570 (ATCC n.º CRL 10314), 293 (ATCC n.º CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) y de ovario de hámster chino (por ejemplo CHO-K1; ATCC n.º CCL 61). En la técnica se conocen líneas celulares adecuadas adicionales y se encuentran disponibles en depósitos públicos tales como la colección American de Cultivos Tipo, Rockville, Maryland. En general, se prefieren promotores de transcripción fuertes, tales como promotores de SV-40 o de citomegalovirus. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.º 4.956.288. Otros promotores adecuados incluyen los de los genes de la metalotioneína (Patente de Estados Unidos n.º 4.579.821 y

25 4.601.978) y el promotor tardío principal de adenovirus.

La selección de fármacos se usa generalmente para seleccionar células de mamífero cultivadas en las que se ha insertado ADN extraño. Dichas células reciben normalmente el nombre de “transfectantes”. Las células que se han cultivado en presencia de un agente selectivo y que pueden transferir el gen de interés a su ascendencia se denominan “transfectantes estables”. Un marcador de selección preferido es un gen que codifica resistencia al antibiótico neomicina. La selección se realiza en presencia de un fármaco de tipo neomicina, tal como G-418 o similar. También pueden usarse sistemas de selección para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso que recibe el nombre de “amplificación”. La amplificación se realiza cultivando transfectantes en presencia de un nivel bajo del agente selectivo y después aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar células

35 que produzcan niveles altos de los productos de los genes introducidos. Un marcador de selección amplificable preferido es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. Otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a higromicina, resistencia a fármacos múltiples, puromicina acetiltransferasa) también pueden usarse. Pueden usarse marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, tal como la proteína fluorescente verde, o proteínas de superficie celular tales como CD4, CD8, MHC de clase I, fosfatasa alcalina de placenta, para separar las células transfectadas de las no transfectadas mediante medios tales como tecnología de separación de células activadas por fluorescencia, FACS, o de separación con perlas magnéticas.

Como hospedadores también pueden usarse otras células eucariotas superiores, entre las que se incluyen células vegetales, células de insecto y células de ave. El uso de Agrobacterium rhizogenes como un vector para expresar 45 genes en células vegetales se ha revisado en Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. La transformación de células de insecto y la producción de polipéptidos exógenos en su interior se desvela en Guarino et al, Patente de Estados Unidos n.º 5.162.222 y publicación WIPO WO 94/06463. Las células de insecto pueden infectarse con baculovirus recombinante, normalmente procedente del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV). Véase, King, L. A. y Possee, R. D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O’Reilly, D. R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nueva York, Oxford University Press., 1994; y, Richardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Un segundo método de preparación de baculovirus de zcytor17 recombinante utiliza un sistema basado en transposones descrito por Luckow (Luckow, VA, et al, J Virol 67: 4566-79, 1993). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se comercializa en el kit Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, 55 MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, pFastBac1™ (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para transportar el ADN que codifica el polipéptido de zcytor17 en un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un gran plásmido denominado “bácmido”. Véase, Hill-Perkins, M. S. y Possee, R. D., J Gen Virol 71: 9716, 1990; Bonning, A. C. et al, J Gen Virol 75: 1551-6, 1994; y, Chazenbalk, GD, y Rapoport, B., J Biol Chem 270: 1543-9, 1995. Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en fase con ADN que codifica una etiqueta epitópica en el extremo C o N del polipéptido de zcytor17 expresado, por ejemplo, una etiqueta epitópica Glu-Glu (Grussenmeyer, T. et al, Proc Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985). Usando una técnica conocida en la materia, un vector de transferencia que contiene zcytor17 se transforma en E. Coli, y se explora para bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo de baculovirus recombinante. El ADN del bácmido que contiene el genoma de baculovirus recombinante se aísla, usando técnicas habituales, y se usa para transfectar células de

65 Spodoptera frugiperda, por ejemplo, células Sf9. El virus recombinante que expresa zcytor17 se produce posteriormente. Con los métodos normalmente usados en la técnica se preparan reservas de virus recombinantes.

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Los virus recombinantes se usan para infectar células hospedadoras, normalmente una línea celular procedente del gusano cogollero, Spodoptera frugiperda. Véase, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D. C., 1994. Otra línea celular adecuada es la línea celular High FiveO™ (Invitrogen) procedente de Trichoplusia ni (Patente de Estados Unidos n.º 5.300.435). Para

5 cultivar y mantener las células se usan medios aséricos disponibles en el comercio. Son medios adecuados Sf900 II™ (Life Technologies) o ESF 921™ (Sistemas de Expresión) para las células Sf9; y ExcellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO™ (Life Technologies) para las células de T. ni. Generalmente se usan procedimientos descritos en manuales de laboratorio disponibles (King, L. A. y Possee, R.D., ibid.; O'Reilly, D. R. et al., Ibid.; Richardson, C. D., ibid.). La purificación posterior del polipéptido de zcytor17 del sobrenadante puede realizarse usando métodos descritos en el presente documento.

En la presente invención, también pueden usarse células fúngicas, incluyendo células de levadura. Como especies de levadura de particular interés en este aspecto se incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Pichia methanolica. Se desvelan métodos para la transformación de S. cerevisiae con ADN exógeno y para la producción 15 de polipéptidos recombinantes a partir del mismo, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos n.º 4.599.311 de Kawasaki; Kawasaki et al, Patente de Estados Unidos n.º 4.931.373; Brake, Patente de Estados Unidos n.º 4.870.008; Welch et al, patente de Estados Unidos n.º 5.037.743.; y Murray et al., Patente de Estados Unidos n.º

4.845.075. Las células transformadas se seleccionan por fenotipo determinado por el marcador de selección, normalmente resistencia a fármacos o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina). Un sistema de vector preferido para su uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vector POT1 desvelado por Kawasaki et al. (Patente de Estados Unidos n.º 4.931.373), que permite seleccionar células transformadas por crecimiento en medios que contienen glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para su uso en levaduras incluyen los de los genes de enzimas glucolíticas (véase, por ejemplo, Kawasaki, Patente de Estados Unidos n.º 4.599.311; Kingsman et al, Patente de Estados Unidos n.º 4.615.974; y Bitter, Patente de

25 Estados Unidos n.º 4.977.092) y genes de la alcohol deshidrogenasa. Véanse también las Patentes de Estados Unidos n.º 4.990.446.; 5.063.154; 5.139.936 y 4.661.454. En la técnica se conocen sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa. Véanse, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, 1986 y Cregg, Patente de Estados Unidos n.º 4.882.279. Las células de Aspergillus pueden utilizarse de acuerdo con los métodos de McKnight et al., Patente de Estados Unidos n.º 4.935.349. En Sumino et al., Patente de Estados Unidos n.º 5.162.228 se desvelan métodos para la transformación de Acremonium chrysogenum. En Lambowitz, Patente de Estados Unidos n.º 4.486.533, se desvelan métodos para la transformación de Neurospora.

35 En las publicaciones WIPO WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, WO 98/02565 se desvela el uso de Pichia methanolica como hospedador para la producción de proteínas recombinantes. Las moléculas de ADN para su uso en la transformación de P. methanolica se prepararan habitualmente como plásmidos circulares, bicatenarios, que preferentemente, se linealizan antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, se prefiere que el promotor y el terminador en el plásmido sean de un gen de P. methanolica, tal como un gen de utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen los de los genes de la dihidroxiacetona sintasa (DHAS), de la formato deshidrogenasa (FMD) y de la catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma del hospedador, se prefiere tener todo el segmento de expresión del plásmido flanqueado en ambos extremos por secuencias de ADN del hospedador. Un marcador de selección preferido para su uso en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica, que codifica la fosforribosil-5-aminoimidazol

45 carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), que permite que las células hospedadoras ade2 crezcan en ausencia de adenina. Para procesos industriales a gran escala, donde es deseable minimizar el uso de metanol, se prefiere el uso de células hospedadoras en las que los dos genes de utilización de metanol (AUG1 y AUG2) se delecionan. Para la producción de proteínas secretadas, se prefieren células hospedadoras deficientes en genes de proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). La electroporación se usa para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés en células de P. methanolica. Se prefiere transformar células de P. methanolica mediante electroporación usando un campo eléctrico impulsado, exponencialmente debilitante que tiene una fuerza de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferentemente de aproximadamente 3,75 kV/cm, y una constante de tiempo (t) de 1 a 40 milisegundos, más preferentemente de aproximadamente 20 milisegundos.

55 Las células hospedadoras procariotas, incluyendo cepas de las bacterias Escherichia coli, Bacillus y de otros géneros, también son células hospedadoras útiles en la presente invención. En la materia se conocen técnicas para transformar estos hospedadores y expresar secuencias de ADN extraño clonadas en su interior (véase, por ejemplo, Sambrook et al., mencionado anteriormente). Cuando un polipéptido de zcytor17 se expresa en bacterias, tal como en E. coli, el polipéptido puede retenerse en el citoplasma, normalmente como gránulos insolubles, o puede dirigirse al espacio periplasmático mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan y los gránulos se recuperan y se desnaturalizan usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede después replegarse y dimerizarse diluyendo el desnaturalizante, tal como mediante diálisis frente a una solución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido de diálisis frente a una solución salina tamponada. En el último caso, el polipéptido puede recuperarse del espacio periplasmático en una

65 forma soluble y funcional alterando las células (por ejemplo, mediante ultrasonido o choque osmótico) para liberar el contenido del espacio periplasmático y recuperar la proteína, evitando de este modo tener que efectuar la

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o polipéptidos receptores pueden ser indicativos de afecciones patológicas, incluyendo cáncer. Los polipéptidos receptores solubles pueden contribuir a procesos patológicos y pueden ser un marcador indirecto de una enfermedad subyacente. Por ejemplo, niveles elevados de receptor IL-2 soluble en suero humano se han asociado con una amplia variedad de afecciones inflamatorias y neoplásicas, tales como infarto de miocardio, asma, miastenia

5 grave, artritis reumatoide, leucemia de linfocitos T aguda, linfomas de linfocitos B, leucemia linfocítica crónica, cáncer de colon, cáncer de mama y cáncer de ovario (Heaney et al., Blood 87: 847-857, 1996). De manera similar, zcytor17 está elevado en monocitos activados, y por tanto zcytor17 y/o sus receptores solubles pueden asociarse con, o servir como marcador, para afecciones inflamatorias y neoplásicas asociadas con ello.

Un polipéptido de unión a ligando de un receptor zcytor17, o “receptor soluble”, puede prepararse usando un ADN trucando que codifica el dominio de unión a citocina de zcytor17 (aproximadamente del resto 20 (Ala) al resto 227 (Pro) del receptor humano de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 46; aproximadamente del resto 33 (Ala) al resto 240 (Pro) del receptor humano de SEQ ID NO: 54) o el dominio extracelular (aproximadamente del resto 20 (Ala) al resto 519 (Glu) de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 46; aproximadamente del resto 33 (Ala) al resto 532 (Glu) de SEQ ID NO: 54) 15 o la región correspondiente de un receptor no humano, por ejemplo, tal como las regiones correspondientes descritas en el presente documento para la SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 93. Se prefiere que el dominio extracelular se prepare en una forma sustancialmente libre de segmentos polipeptídicos transmembrana e intracelular. Además, los fragmentos polipeptídicos de unión a ligando dentro del dominio de unión de citocina de zcytor17 descrito anteriormente, también pueden servir como receptores solubles de zcytor17 para los usos descritos en el presente documento. Para dirigir la exportación de un polipéptido receptor de la célula hospedadora, el ADN receptor se liga a un segundo segmento de ADN que codifica un péptido secretor, tal como un péptido secretor t-PA o un péptido secretor zcytor17. Para facilitar la purificación del polipéptido receptor secretado, una extensión C terminal, tal como una etiqueta de polihistidina, un péptido de etiqueta Glu-Glu, sustancia P, péptido Flag™ (Hopp et al, Bio/Technology

6: 1204-1210, 1988; disponible en Eastman Kodak Co., New Haven, CT) u otro polipéptido o proteína para el cual 25 está disponible un anticuerpo u otro agente de unión específico, puede fusionarse al polipéptido receptor.

En una estrategia alternativa, un dominio extracelular receptor puede expresarse como una fusión con regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina, normalmente un fragmento Fc (por ejemplo, Fc4), que contiene dos dominios de región constante y que carece de la región variable. Dichas fusiones se secretan normalmente como moléculas multiméricas en las que las partes Fc se unen entre sí por enlaces disulfuro y dos polipéptidos receptores se disponen muy próximos entre sí. Las fusiones de este tipo pueden usarse para purificar por afinidad el ligando afín de la solución, como una herramienta de ensayo in vitro, para bloquear señales in vitro ajustando específicamente el ligando, y como antagonistas in vivo administrándolas por vía parenteral para unirse al ligando en circulación y eliminándolo de la misma. Para purificar el ligando, una quimera de zcytor17-Ig se añade a una muestra

35 que contiene el ligando (por ejemplo medio de cultivo celular acondicionado o extractos tisulares) en condiciones que faciliten la unión del receptor con el ligando (normalmente a una temperatura, pH y fuerza iónica, casi fisiológicas). El complejo quimera-ligando se separa después de la mezcla usando la proteína A, que se inmoviliza en un soporte sólido (por ejemplo, perlas de resina insolubles). Después, el ligando se eluye usando técnicas químicas convencionales, tal como con un gradiente de sal o de pH. Como alternativa, la propia quimera puede unirse a un soporte sólido, realizándose la unión y la elución como se ha indicado anteriormente. Las fracciones recogidas pueden volver a fraccionarse hasta alcanzar el nivel de pureza deseado.

Adicionalmente, pueden usarse receptores zcytor17 solubles como un “drenaje de ligando”, es decir, antagonistas, para unir el ligando in vivo o in vitro en aplicaciones terapéuticas u otras aplicaciones en las que no se desea la

45 presencia de ligando. Por ejemplo, en cánceres que están expresando una gran cantidad de ligando zcytor17 bioactivo, pueden usarse receptores solubles zcytor17 como un antagonista directo del ligando in vivo, y pueden ayudar a reducir la progresión y síntomas asociados con la enfermedad. Adicionalmente, el receptor soluble zcytor17 puede usarse para retrasar la progresión de cánceres que sobreexpresan receptores zcytor17, uniendo el ligando in vivo, lo que podría, de otra manera, potenciar la proliferación de esos cánceres. Aplicaciones similares in vitro para un receptor soluble zcytor17 pueden usarse, por ejemplo, como una selección negativa para seleccionar líneas celulares que crecen en ausencia de ligando zcytor17.

Además, el receptor soluble zcytor17 puede usarse in vivo o en aplicaciones de diagnóstico para detectar cánceres que expresan el ligando zcytor17 in vivo o en muestras de tejido. Por ejemplo, el receptor soluble zcytor17 puede

55 conjugarse con un radiomarcador o con un marcador fluorescente, como se describe en el presente documento, y usarse para detectar la presencia del ligando en una muestra de tejido usando un ensayo de unión de tipo ligandoreceptor in vitro, o un ensayo de formación de imágenes fluorescentes. Además, podría administrarse in vivo un receptor soluble zcytor17 radiomarcado para detectar tumores sólidos que expresan ligandos a través de un método de formación de radioimágenes conocido en la técnica.

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos de la presente invención, como se indica en las reivindicaciones, tienen particular uso en el grupo de monocitos/macrófagos del sistema inmunitario. Por ejemplo, el interferón gamma (IFNγ) es un fuerte activador de fagocitos mononucleares. El aumento en la expresión de zcytor17 después de la activación de células THP-1 (ATCC n.º TIB-202) con interferón gamma sugiere que este receptor está implicado en 65 la activación de monocitos. Los monocitos son células incompletamente diferenciadas que migran a diversos tejidos en donde maduran y se convierte en macrófagos. Los macrófagos desempeñan una función esencial en la respuesta

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inmunitaria presentando el antígeno a linfocitos y desempeñando una función de soporte como células accesorias a linfocitos secretando numerosas citocinas. Los macrófagos pueden internalizar moléculas extracelulares y después de la activación tienen una capacidad aumentada para destruir microorganismos intracelulares y células tumorales. Los macrófagos activados también están implicados en la estimulación de inflamación aguda o local. Además, se ha

5 mostrado que la función de monocitos-macrófagos es anómala en diversas patologías. Véase, por ejemplo, Johnston, RB, New Eng. J. Med. 318: 747-752, 1998.

Un experto en la técnica reconocería que los agonistas de zcytor17 son útiles. Por ejemplo, se ha descrito migración reducida de monocitos en poblaciones con una predisposición a infección, tal como en recién nacidos, pacientes que 10 reciben corticosteroides u otra terapia inmunosupresora y pacientes con diabetes mellitus, quemaduras o SIDA. Los agonistas para zcytor17, tales como anticuerpos contra zcytor17 y compañeros de unión, así como el ligando natural, podrían dar como resultado un aumento en la capacidad de los monocitos para migrar y posiblemente prevenir la infección en estas poblaciones. También hay un defecto profundo de destrucción fagocítica mediante fagocitos mononucleares de pacientes con enfermedad granulomatosa crónica. Esto produce la formación de 15 abscesos subcutáneos así como abscesos en el hígado, pulmones, bazo y ganglios linfáticos. Un agonista de zcytor17 tal como anticuerpos contra zcytor17 y compañeros de unión, así como el ligando natural, podrían corregir

o mejorar este efecto fagocítico. Además, se ha comunicado citotoxicidad de monocitos defectuosa en pacientes con cáncer y síndrome de Wiskott-Aldrich (eccema, trombocitopenia e infecciones recurrentes). La activación de monocitos mediante agonistas de zcytor17 tales como anticuerpos contra zcytor17 y compañeros de unión, así como

20 el ligando natural, podrían ayudar en el tratamiento de estas afecciones. El sistema monocito-macrófago está notablemente implicado en diversas enfermedades de almacenamiento de lípidos (esfingolipidosis) tal como la enfermedad de Gaucher. La resistencia a infección puede mejorarse debido a un defecto en la función de macrófagos, que podría tratarse con agonistas contra zcytor17 tales como anticuerpos contra zcytor17 y compañeros de unión, así como el ligando natural.

25 Adicionalmente, un experto en la técnica reconocería que los antagonistas de zcytor17 son útiles. Por ejemplo, en lesiones ateroscleróticas, una de las primeras anomalías es la localización de monocitos/macrófagos en células endoteliales. Estas lesiones podrían prevenirse con el uso de antagonistas contra zcytor17. Los anticuerpos contra zcytor17 y compañeros de unión también pueden usarse como antagonistas contra el ligando natural de zcytor17.

30 Adicionalmente, la leucemia monoblástica está asociada con diversas anomalías clínicas que reflejan la liberación de los productos biológicos de los macrófagos, cuyos ejemplos incluyen altos niveles de lisozima en el suero y orina y fiebre alta. Adicionalmente, dichas leucemias presentan un aumento anómalo de células monocíticas. Estos efectos podrían prevenirse posiblemente con antagonistas contra zcytor17, tal como se describe en el presente documento. Adicionalmente, los anticuerpos contra zcytor17 y compañeros de unión pueden conjugarse con moléculas tales

35 como restos tóxicos y citocinas, como se describe en el presente documento para dirigir la destrucción de células monocíticas de leucemia.

Usando métodos conocidos en la técnica, y desvelados en el presente documento, un experto podría evaluar fácilmente la actividad de agonistas y antagonistas de zcytor17 en las patologías desveladas en el presente 40 documento, inflamación, cáncer o infección así como otras patologías que implican células monocíticas. Además, como zcytor17 se expresa de una manera específica de monocito, y estas enfermedades implican anomalías en células monocíticas, tales como proliferación, función, localización y activación celular, los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden usarse como agentes de diagnóstico para detectar dichas anomalías de células monocíticas e indicar la presencia de enfermedad. Dichos métodos implican tomar una 45 muestra biológica de un paciente, tal como sangre, saliva, o una biopsia y compararla con una muestra de control normal. Pueden usarse métodos histológicos, citológicos, de citometría de flujo, bioquímicos u otros para determinar los niveles relativos o la localización de zcytor17, o de células que expresan zcytor17, es decir, monocitos, en la muestra del paciente en comparación con el control normal. Un cambio en el nivel (aumento o disminución) de la expresión de zcytor17, o un cambio en el número o localización de monocitos (por ejemplo, un aumento o infiltración

50 de células monocíticas en tejidos en los que no están normalmente presentes) en comparación con un control, sería indicativo de enfermedad. Dichos métodos de diagnóstico también pueden incluir el uso de etiquetas radiométricas, fluorescentes y colorimétricas unidas a los polinucleótidos, polipéptidos o anticuerpos de la presente invención. Dichos métodos son muy conocidos en la técnica y se desvelan en el presente documento.

55 Las secuencias de aminoácidos que tienen actividad de Zcytor17 pueden usarse para modular el sistema inmunitario uniéndose al ligando de Zcytor17, y por lo tanto, impidiendo la unión del ligando de Zcytor17 con el receptor Zcytor17 endógeno. Los antagonistas de Zcytor17, tales como anticuerpos contra Zcytor17, también pueden usarse para modular el sistema inmunitario inhibiendo la unión del Zcytor17 del ligando de Zcytor17 con el receptor Zcytor17 endógeno. Por consiguiente, la presente memoria descriptiva describe el uso de proteínas, polipéptidos y péptidos

60 que tienen actividad de Zcytor17 (tales como polipéptidos de Zcytor17, análogos de Zcytor17 (por ejemplo anticuerpos contra Zcytor17 antiidiotipo), y proteínas de fusión de Zcytor17) a un sujeto que carece de una cantidad adecuada de este polipéptido, o que produce un exceso de ligando de Zcytor17. Los antagonistas de Zcytor17 (por ejemplo anticuerpos contra Zcytor17) también pueden usarse para tratar a un sujeto que produce un exceso de ligando de Zcytor17 o de Zcytor17. Los sujetos adecuados incluyen mamíferos tales como seres humanos.

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autoinmunitarias tales como IDDM, esclerosis múltiple (MS), lupus eritematoso sistémico (SLE), miastenia grave, artritis reumatoide e IBD para prevenir o inhibir la señalización en células inmunitarias ( por ejemplo, linfocitos, monocitos, leucocitos) mediante zcytor17 (Hughes C et al, J. Immunol 153: 3319-3325, 1994). Como alternativa, también pueden usarse anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales (mAb) contra receptores que 5 comprenden zcytor17, como un antagonista para agotar células inmunitarias no deseadas para tratar enfermedades autoinmunitarias. El asma, la alergia y otras enfermedades atópicas pueden tratarse con un mAb contra, por ejemplo, receptores solubles zcytor17 o heterodímeros zcytor17/CRF2-4, para inhibir la respuesta inmunitaria o para agotar células ofensivas. El bloqueo o la inhibición de la señalización mediante zcytor17, usando los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención, como se indica en las reivindicaciones, también pueden beneficiar a enfermedades de las células del páncreas, del riñón, de la pituitaria y neuronales. La IDDM, NIDDM, pancreatitis y el carcinoma pancreático pueden beneficiarse. Zcytor17 puede servir como una diana para carcinoterapia con mAb, donde un mAb antagonizante inhibe el crecimiento del cáncer y se dirige a la destrucción mediada por el sistema inmunitario (Holliger P y Hoogen-boom, H: Nature Biotech. 16: 10151016, 1998). Los mAb contra monómeros, homodímeros, heterodímeros y multímeros de zcytor17 soluble también

15 pueden ser útiles para tratar neuropatías tales como glomeruloesclerosis, neuropatía membranosa, amiloidosis (que, entre otros tejidos, también afecta a los del riñón), arteriosclerosis renal, glomerulonefritis de diversos orígenes, enfermedades fibroproliferativas del riñón, así como disfunción renal asociada con SLE, IDDM, diabetes de tipo II (NIDDM), tumores renales y otras enfermedades. 3) Agonizar o iniciar la señalización mediante receptores zcytor17 en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tales como IDDM, MS, SLE, miastenia grave, artritis reumatoide e IBD. Los anticuerpos monoclonales contra zcytor17, contra heterodímero y multímero pueden señalizar linfocitos u otras células inmunitarias para diferenciar, alterar la proliferación o cambiar la producción de citocinas o proteínas de la superficie celular que mejoran la autoinmunidad. Específicamente, la modulación de una respuesta de linfocitos T auxiliares contra un patrón alternativo de secreción de citocina puede desviar una respuesta autoinmunitaria para

25 mejorar la enfermedad (Smith JA et al, J. Immunol 160: 4841 a 4849, 1998). De manera similar, los anticuerpos monoclonales agonistas contra zcytor17, contra heterodímero y multímero, pueden usarse para señalizar, agotar y desviar células inmunitarias implicadas en asma, alergia y enfermedad atópica. La señalización mediante zcytor17 también puede beneficiar a enfermedades de las células del páncreas, del riñón, de la pituitaria y neuronales. La IDDM, NIDDM, pancreatitis y carcinoma pancreático pueden beneficiarse. Zcytor17 puede servir como una diana para carcinoterapia pancreática con MAb, donde una señalización de mAb inhibe el crecimiento del cáncer y dirige la destrucción mediada por el sistema inmunitario (Tutt, AL et al, J Immunol 161: 3175-3185, 1998). De manera similar, leucemias específicas de linfocitos T, linfomas y carcinoma pueden tratarse con anticuerpos monoclonales de la presente invención, tales como los indicados en las reivindicaciones.

35 Los polipéptidos de zcytor17 solubles monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos descritos en el presente documento pueden usarse para neutralizar/bloquear la actividad del ligando de zcytor17 en el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria, enfermedad atópica, NIDDM, pancreatitis y disfunción renal como se describe anteriormente. Una forma soluble de zcytor17 puede usarse para promover una respuesta de anticuerpos mediada por linfocitos T y/o promover la producción de IL-4 u otras citocinas mediante linfocitos u otras células inmunitarias.

Los polipéptidos receptores que comprenden zcytor17 soluble de la presente invención, como se indica en las reivindicaciones, son útiles como antagonistas de su ligando natural. Dichos efectos antagonistas pueden realizarse por neutralización directa o unión de su ligando natural. Además de los usos antagonistas, los polipéptidos receptores solubles de la presente invención, como se indica en las reivindicaciones, pueden unirse al ligando

45 zcytor17 y actuar como proteínas transportadoras para el ligando, para transportar el ligando a diferentes tejidos, órganos y células en el organismo. Como tales, los polipéptidos receptores solubles de la presente invención, como se indica en las reivindicaciones, pueden fusionarse o acoplarse a moléculas, polipéptidos o restos químicos que dirigen el complejo receptor soluble-ligando a un sitio específico, tal como a un tejido, a una célula inmunitaria específica, a monocitos o a un tumor. Por ejemplo, en infección aguda o en algunos cánceres, el beneficio puede resultar de la inducción de la inflamación y de proteínas de respuesta de fase aguda local. Por tanto, los polipéptidos receptores solubles de la presente invención, como se indica en las reivindicaciones, pueden usarse para dirigir específicamente la acción de un ligando proinflamatorio. Véase, Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993; y Fernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9: 497-513,2000.

55 Además, los polipéptidos receptores solubles de la presente invención, como se indica en las reivindicaciones, pueden usarse para estabilizar el ligando de zcytor17, para aumentar la biodisponibilidad, la longevidad terapéutica y/o eficacia del ligando estabilizando el ligando de la degradación o eliminación, o direccionando el ligando a un sitio de acción dentro del organismo. Por ejemplo, el complejo IL-6/IL-6R soluble de origen natural, estabiliza IL-6 y puede señalizar a través del receptor de gp130. Véase, Cosman, D. citado anteriormente, y Fernandez-Botran, R. citado anteriormente. Además, Zcytor17 puede combinarse con un ligando afín, tal como con su ligando para que comprenda un complejo ligando/receptor soluble. Dichos complejos pueden usarse para estimular respuestas de células que presentan una subunidad receptora acompañante. La especificidad celular de complejos zcytor17/ligando puede diferenciarse de la observada para el ligando administrado en solitario. Adicionalmente los complejos pueden tener propiedades farmacocinéticas distintas tales como las que afectan a la semivida,

65 dosis/respuesta y especificidad de órgano o tejido. Los complejos Zcytor17/ ligando pueden tener por tanto actividad agonista para potenciar una respuesta inmunitaria o estimular células mesangiales o para estimular células

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Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención a una pureza de ≥ 80 %, más preferentemente a una pureza de ≥ 90 %, incluso más preferentemente a una pureza de ≥ 95 %, y particularmente se prefiere un estado puro desde el punto de vista farmacéutico, con una pureza mayor de 99,9 %, con respecto a macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libre de agentes infecciosos y pirogénicos.

5 Preferentemente, un polipéptido purificado carece sustancialmente de otros polipéptidos, particularmente de otros polipéptidos de origen animal.

Los polipéptidos de zcytor17 recombinantes (o polipéptidos de zcytor17 quiméricos o de fusión) expresados, pueden purificarse usando fraccionamiento y/o métodos y medios de purificación convencionales. La precipitación con sulfato de amonio y ácido o la extracción caotrópica pueden usarse para el fraccionamiento de muestras. Las etapas de purificación a modo de ejemploes pueden incluir hidroxiapatita, exclusión por tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices de especialidad, y similares. Se prefieren derivados de PEI, DEAE, QAE y Q. Los medios cromatográficos a modo de ejemploes incluyen los medios derivatizados con grupos 15 fenilo, butilo u octilo, tales como Fenil-Sefarosa FF (Pharmacia), Toyopearl butilo 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octil-Sefarosa (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa reticuladas, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y similares que son insolubles en las condiciones en las que se van a usar. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permiten la unión de proteínas mediante grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos de hidratos de carbono. Los ejemplos de química de acoplamiento incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida, y derivados carboxilo y amino para químicas de acoplamiento con carbodiimida. Estos y otros medios sólidos se conocen bien y se usan ampliamente en la técnica, y se encuentran disponibles en

25 proveedores comerciales. En la técnica se conocen bien métodos para la unión de polipéptidos receptores a medios de soporte. La selección de un método particular es una cuestión de diseño rutinario y viene determinada, en parte, por las propiedades del soporte seleccionado. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988.

Los polipéptidos de la presente invención, como se indica en las reivindicaciones, pueden aislarse aprovechando sus propiedades bioquímicas, estructurales y biológicas. Por ejemplo, puede usarse cromatografía de adsorción por iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar proteínas ricas en histidina, incluyendo aquellas que comprenden etiquetas de polihistidina. En resumen, en primer lugar se carga un gel con iones metálicos divalentes para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán

35 en esta matriz con diferentes afinidades, dependiendo del ion metálico que se use, y se eluirán mediante elución competitiva, disminuyendo el pH, o uso de fuertes agentes quelantes. Otros métodos de purificación incluyen purificación de proteínas glucosiladas por cromatografía de afinidad con lectina y cromatografía de intercambio iónico (Methods in Enzymol., Vol. 182, “Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, págs. 529-39). En realizaciones adicionales de la invención, para facilitar la purificación, puede construirse una fusión del polipéptido de interés y una etiqueta de afinidad (por ejemplo, proteína de unión a maltosa, un dominio de inmunoglobulina).

Además, usando los métodos descritos en la técnica, se construyen polipéptidos de fusión, o proteínas zcytor17 híbridas, usando regiones o dominios del zcytor17 de la invención en combinación con los de otras proteínas de la

45 familia de receptores de citocina humana, o proteínas heterólogas (Sambrook et al., citado anteriormente, Altschul et al., citado anteriormente, Picard, Cur. Opin. Biology. 5:511-5, 1994, y referencias en su interior). Estos métodos permiten determinar la importancia biológica de dominios o regiones más grandes en un polipéptido de interés. Dichos híbridos pueden alterar cinéticas de reacción, unión, restringir o ampliar la especificidad del sustrato, o alterar la localización tisular y celular de un polipéptido, y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.

Pueden prepararse polipéptidos o proteínas de fusión mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica preparando cada componente de la proteína de fusión y conjugándolo químicamente. Como alternativa, puede generarse un polinucleótido que codifique uno o más componentes de la proteína de fusión en la fase de lectura apropiada, usando técnicas conocidas y expresarse mediante los métodos descritos en el presente documento. Por

55 ejemplo, parte de un dominio, o todo un dominio, que confiere una función biológica puede intercambiarse entre el zcytor17 de la presente invención con uno o más dominios funcionalmente equivalentes de otro miembro de la familia de citocinas. Dichos dominios incluyen, pero sin limitación, la secuencia señal secretora, el dominio extracelular, el dominio de unión a citocina, el dominio de fibronectina de tipo III, el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular, los sitios Box I y Box II, como se desvela en el presente documento. Sería de esperar que dichas proteínas de fusión tuviesen un perfil funcional biológico que fuese igual o similar al de los polipéptidos de la presente invención u otras proteínas de familias conocidas, dependiendo de la fusión que se construya. Además, dichas proteínas de fusión pueden exhibir otras propiedades como se desvela en el presente documento.

65 Para intercambiar los dominios equivalentes entre el polipéptido de zcytor17 y los polipéptidos con los que se fusionan pueden usarse técnicas de clonación y de biológica molecular convencionales. Generalmente, un segmento

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GenBank AQ002781). En general, en la técnica se conocen métodos de diagnóstico usados en análisis de ligamiento genético, para detectar una anomalía o aberración genética en un paciente. La mayoría de los métodos de diagnóstico comprenden las etapas de (a) obtener una muestra genética de un paciente posiblemente enfermo, de un paciente enfermo o de un posible portador no enfermo de un alelo de enfermedad recesiva; (b) producir un 5 primer producto de reacción incubando la muestra genética con una sonda polinucleotídica de zcytor17, donde el polinucleótido se hibridará con la secuencia de polinucleótidos complementaria, tal como en análisis RFPL o incubando la muestra genética con cebadores en sentido y antisentido en una reacción PCR en condiciones de reacción de PCR apropiadas; (iii) visualizar el primer producto de reacción mediante electroforesis en gel y/u otro método conocido, tal como visualizando el primer producto de reacción con una sonda polinucleotídica de zcytor17 donde el polinucleótido se hibridará con la secuencia de polinucleótidos complementara de la primera reacción; y (iv) comparar el primer producto de reacción visualizado con un segundo producto de reacción de control de una muestra genética de un paciente de tipo silvestre. Una diferencia entre primer producto de reacción y el producto de reacción de control es indicativa de una anomalía genética en el paciente enfermo o posiblemente enfermo, o de la presencia de un fenotipo portador recesivo heterocigoto para un paciente no enfermo, o de la presencia de un 15 defecto genético en un tumor de un paciente enfermo, o de la presencia de una anomalía genética en un feto o en un embrión antes de la implantación. Por ejemplo, una diferencia en el patrón de fragmentos de restricción, en la longitud de los productos de la PCR, en la longitud de secuencias repetitivas en el locus genético de zcytor17, y similares, son indicativas de una anomalía genética, aberración genética, o diferencia alélica en comparación con el control de tipo silvestre normal. Los controles pueden ser de miembros de la familia no afectados, o de individuos no relacionados, dependiendo del ensayo y de la disponibilidad de las muestras. Las muestras genéticas para su uso en la presente divulgación incluyen ADN genómico, ARNm y ADNc aislados de cualquier tejido o de otra muestra biológica de un paciente, tal como, pero sin limitación, sangre, saliva, semen, células embrionarias, fluido amniótico y similar. La sonda o cebador polinucleotídico puede ser ARN o ADN, y comprenderá una parte de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 53, el complemento de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 53 o un ARN

25 equivalente de las mismas. Dichos métodos de muestra de análisis de ligamiento genético con fenotipos de enfermedades humanas son muy conocidos en la técnica. Por referencia a métodos basados en PCR en diagnósticos véase, en líneas generales, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek y Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998), y Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)).

Las mutaciones asociadas con el locus de zcytor17 pueden detectarse usando moléculas de ácido nucleico de la presente invención empleando métodos convencionales para análisis de mutación directa, tales como análisis de 35 polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, técnicas de PCR que emplean análisis de repetición en tándem corta, análisis de sistemas de mutación refractarios a la amplificación, detección de polimorfismo de conformación de cadena simple, métodos de escisión de RNasa, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante, análisis de emparejamiento erróneo asistidos con fluorescencia y otras técnicas de análisis genético conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108:255 (1995), Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnostics (Human Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren y col, (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli y col, (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), y Richards y Ward, "Molecular Diagnostic Testing," in Principles of

45 Molecular Medicine, págs. 83-88 (Humana Press, Inc. 1998)). Los análisis directos de un gen de zcytor17 para una mutación pueden realizarse usando ADN genómico del sujeto. Los métodos para la amplificación de ADN genómico, obtenido, por ejemplo, de linfocitos de sangre periférica son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Dracopoli y col, (eds.), Current Protocols in Human Genetics, en las págs. 7.1.6 a 7.1.7 (John Wiley & Sons 1998)).

También pueden generarse ratones modificados genéticamente para expresar el gen de zcytor17, denominados “ratones transgénicos”, y ratones que exhiben una ausencia completa de la función génica de zcytor17, denominados “ratones genosuprimidos (knockout)” (Snouwaert y col, Science 257:1083, 1992; Lowell y col, Nature 366:740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244: 1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. y col, Annu Rev Genet. 20: 46555 499, 1986). Por ejemplo, pueden usarse ratones transgénicos que sobreexpresen zcytor17, de manera ubícua o bajo un promotor específico de tejido o restringido a tejido, para averiguar si la sobreexpresión causa un fenotipo. Por ejemplo, la sobreexpresión de un polipéptido de zcytor17 de tipo silvestre, fragmento polipeptídico o un mutante de los mismos puede alterar procesos celulares normales, dando como resultado un fenotipo que identifica un tejido en el que la expresión de zcytor17 es funcionalmente relevante y puede indicar una diana terapéutica para zcytor17, sus agonistas o antagonistas. Por ejemplo, un ratón transgénico preferido para modificar genéticamente es uno que expresa un fenotipo “negativo dominante”, tal como uno que sobreexpresa el polipéptido de zcytor17 que comprende un dominio de unión a citocina extracelular con el dominio transmembrana unido (aproximadamente los aminoácidos 20) (ala) a 543 (Leu) de la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 46; o 33 (ala) a 556 (Leu) de la SEQ ID NO: 54). Otro ratón transgénico preferido es uno que sobreexpresa receptores solubles de zcytor17, tales como los desvelados en el 65 presente documento. Además, dicha sobreexpresión puede dar como resultado un fenotipo que muestra similitud con enfermedades humanas. De manera similar, pueden usarse ratones zcytor17 genosuprimidos para determinar si

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varias bandas débiles. Se observó un transcrito de aproximadamente 9 kb en la tráquea, músculo esquelético y timo; se observó un transcrito de aproximadamente 2 kb en células PBL, HPV, U937 y THP-1; y se observó un transcrito de aproximadamente 1,2 kb en la placenta, médula ósea y tiroides y en células HPV y U937. En todos los tejidos indicados anteriormente, la intensidad de la señal fue débil. Esto apareció que era una pequeña expresión en la

5 mayoría de los tejidos normales, lo que sugiere que la expresión de zcytor17 puede ser dependiente de la activación de las células o de los tejidos en los que se expresa.

Se realizó también análisis Northern usando la línea celular de cáncer humano MTN™ (Clontech). Las condiciones de PCR y exploración son como se ha descrito anteriormente. Una fuerte señal en una línea de cáncer sugiere que

10 la expresión de zcytor17 puede expresarse en células activadas y/o puede indicar una patología cancerosa. Además, usando métodos conocidos en la técnica, las transferencias Northern y análisis PCR de células linfocíticas activadas también pueden mostrar si zcytor17 se expresa en células inmunitarias activadas.

B. Distribución tisular en paneles tisulares usando PCR

15 Se identificó un panel de ADNc de tejidos humanos para la expresión de zcytor17 usando PCR. El panel se realizó internamente y contenía 94 muestras de ADNc y de ADNc Marathon de diversos tejidos y líneas celulares humanos normales y cancerosos como se muestra en la Tabla 5 más adelante. Los ADNc provenían de bibliotecas de uso interno o de ADNc Marathon de preparaciones de ARN internas, ARN de Clontech o ARN de Invitrogen. Los ADNc

20 Marathon se prepararon usando el kit Marathon-Ready™ (Clontech, Palo Alto, CA) y el CC se ensayó con cebadores de clatrina ZC21195 (SEQ ID NO: 49) y ZC21196 (SEQ ID NO: 50) y después se diluyeron basándose en la intensidad de la banda de clatrina. Para asegurar la calidad de las muestras de los paneles, se ejecutaron tres ensayos para el control de calidad (CC): (1) para evaluar la calidad de ARN usado para las bibliotecas, los ADNc internos se ensayaron para determinar el tamaño promedio del inserto por PCR con oligovectores que eran

25 específicos para las secuencias del vector para una biblioteca de ADNc individual; (2) la estandarización de la concentración del ADNc en las muestras del panel se realizó usando métodos de PCR convencionales para amplificar el ADNc de longitud completa de la alfa tubulina o de G3PDH usando un oligovector 5’ ZC14,063 (SEQ ID NO: 25) y un oligocebador 3’ específico de alfa tubulina ZC17,574 (SEQ ID NO: 26) o un oligocebador 3’ específico de G3PDH ZC17,600 (SEQ ID NO: 27); y (3) una muestra se envió a secuenciación para verificar una posible

30 contaminación por ADN mitocondrial o ribosómico. El panel se configuró en un formato de 96 pocillos que incluyó una muestra de control positivo de ADN genómico humano (Clontech, Palo Alto, CA). Cada pocillo contenía aproximadamente 0,2-100 pg/µl de ADNc. Las reacciones PCR se configuraron usando los oligos ZC26,358 (SEQ ID NO: 28) y ZC26,359 (SEQ ID NO: 29), TaKaRa Ex Taq™ (TAKARA Shuzo Co LTD, Biomedicals Group, Japón) y colorante Rediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). La amplificación se realizó de la siguiente manera: 1

35 ciclo a 94 ºC durante 2 minutos, 35 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 66,3 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 30 segundos, seguido de 1 ciclo a 72 ºC durante 5 minutos. Aproximadamente 10 µl del producto de reacción de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa estándar usando un gel de agarosa al 4 %. El tamaño del fragmento de ADN predicho corregido se observó en ganglio linfático, próstata, tiroides, HPV (epitelio de próstata), HPVS (epitelio de próstata, seleccionado) tumor de pulmón, reacciones de tumor de útero, junto con la

40 reacción de ADN genómico. Uno de los cebadores puede hibridarse con el genómico o con el receptor soluble de forma corta zcytor17 (SEQ ID NO: 21), lo que sugiere que el patrón de expresión observado puede ser el de esta forma alternativa de zcytor17.

El fragmento de ADN para tejido de próstata (2 muestras), HPV (epitelio de próstata), HPVS (epitelio de próstata,

45 seleccionado) y genómico se escindieron y purificaron usando un kit extracción con gel (Qiagen, Chatsworth, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos se confirmaron por secuenciación para mostrar que en realidad eran de zcytor17.

Tabla 5

Tejido/línea celular

n.º de muestras Tejido/línea celular n.º de muestras

Glándula adrenal

1 Médula ósea 3

Vejiga

1 Cerebro fetal 3

Médula ósea

1 Islotes 2

Cerebro

1 Próstata 3

Cuello uterino

1 RPMI n.º 1788 (ATCC n.º CCL-156) 2

Colon

1 Testículo 4

Cerebro fetal

1 Tiroides 2

Corazón fetal

1 WI38 (ATCC n.º CCL-75 2

Riñón fetal

1 ARIP (ATCC n.º CRL-1674 - rata) 1

Hígado fetal

1 HaCat - queratinocitos humanos 1

Pulmón fetal

1 HPV (ATCC n.º CRL-2221) 1

Músculo fetal

1 Glándula adrenal 1

Piel fetal

1 Próstata SM 2

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Corazón

2 CD3+ PBMC seleccionadas estimuladas con PMA + iodomicina 1

K562 (ATCC n.º CCL-243)

1 HPVS (ATCC n.º CRL-2221) – seleccionadas 1

Riñón

1 Corazón 1

Hígado

1 Pituitaria 1

Pulmón

1 Placenta 2

Ganglio linfático

1 Glándula salival 1

Melanoma

1 HL60 (ATCC n.º CCL-240) 3

Páncreas

1 Plaquetas 1

Pituitaria

1 HBL-100 1

Placenta

1 renal mesangial 1

Próstata

1 Linfocitos T 1

Recto

1 Neutrófilos 1

Glándula salival

1 MPC 1

Músculo esquelético

1 Hut-102 (ATCC n.º TIB-162) 1

Intestino delgado

1 Endotelial 1

Médula espinal

1 HepG2 (ATCC n.º HB-8065) 1

Bazo

1 Fibroblastos 1

Estómago

1 E. Histo 1

Testículo

2

Timo

1

Tiroides

1

Traquea

1

Útero

1

Tumor esofágico

1

Tumor gástrico

1

Tumor renal

1

Tumor hepático

1

Tumor pulmonar

1

Tumor de ovario

1

Tumor rectal

1

Tumor de útero

1

B. Análisis de expresión de zcytoR17 mediante PCR y transferencia de Northern

La anotación de los tipos de células y de las condiciones de crecimiento que afectan a la expresión del receptor es 5 un medio útil de aclarar su función y predecir una fuente de ligando. Para esta finalidad se examinó una amplia variedad de tipos de tejido y células por PCR. Se usó la polimerasa termoestable Advantage II™ (Clontech, La Jolla, CA) con los cebadores oligonucleotídicos ZC29,180 (SEQ ID NO: 73) y ZC29,179 (SEQ ID NO: 74) y 1-10ng de los diversos moldes de ADNc indicados a continuación para 30 ciclos de amplificación de (94 ºC, 30 s; 66 ºC, 20 s; 68 ºC, 1 min. 30 s). Después de esto, el 20 % de cada reacción se procesó sobre geles de agarosa al 0,8 %, 10 TAE/bromuro de etidio y se visualizó con luz UV. Después, las muestras se puntuaron basándose en la intensidad de banda. Véase la siguiente Tabla 6.

Tabla 6

Células y Condiciones

Puntuación 0-5

Hel estimulada con PMA

0

U937

3

MCF-7

0

HuH7

1

Folículo humano

0

HT-29

0

HEPG2

0

HepG2 estimulada con IL6

0

Endotelial dérmica humana

0

Endotelial venosa humana

0

CD4+ humana

0

BEWO

0

CD19+ humana

1

PBMC humanas estimuladas con PHA, PMA, ionomicina, IL2, IL4, TNFα, durante 24 horas

0

48

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imagen35

mostrado en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 21 o región correspondiente de SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 56. Las condiciones de reacción preferidas fueron las siguientes: 95 ºC durante 1 min; 35 ciclos a 95 ºC durante 1 min, 45 ºC durante 1 min, 72 ºC durante 2 min; seguido de 72 ºC a 10 min; después una inmersión a 10 ºC. El producto PCR se procesó en una agarosa de punto de fusión bajo al 1 % (Boerhinger

5 Mannheim, Indianapolis, IN) y el fragmento del receptor zcytor17 se aisló usando el kit de extracción en gel Qiaquick™ (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los dominios intracelular y transmembrana de MPL se aislaron de un plásmido que contenía el ADNc del receptor de MPL (plásmido PHZ1/MPL) (Ejemplo 5) usando PCR con cebadores que abarcaban el extremo 3’ del dominio extracelular de zcytor17 y el extremo 5’ de los dominios intracelular y transmembrana de MPL y ZC17,206 (SEQ ID NO: 33). Las condiciones de reacción preferidas se realizaron como se ha indicado anteriormente. El producto PCR se procesó en una agarosa de punto de fusión bajo al 1 % (Boerhinger Mannheim) y el fragmento MPL de aproximadamente 450 pb se aisló usando el kit de extracción en gel Qiaquick (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

15 Cada uno de los fragmentos aislados descritos anteriormente se mezcló a una proporción volumétrica de 1:1 y se usó en una reacción PCR usando el cebador 5’ usado para amplificar el dominio extracelular de zcytor17 y ZC17,206 (SEQ NO: 33) para crear una quimera Zcytor17-mpl. Las condiciones de reacción preferidas fueron las siguientes: 95 ºC durante 1 min; 35 ciclos a 95 ºC durante 1 min, 55 ºC durante 1 min, 72 ºC durante 2 min; seguido de 72 ºC a 10 min; después una inmersión a 10 ºC. El producto de PCR completo se procesó en una agarosa de punto de fusión bajo al 1 % (Boehringer Mannheim) y se aisló un fragmento de quimera Zcytor17-mpl de aproximadamente 1,2 kb usando el kit de extracción en gel Qiaquick (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de quimera Zcytor17-mpl se sometió a digestión, por ejemplo, con EcoRI (BRL) y XbaI (Boerhinger Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante. La digestión completa se procesó en una agarosa de bajo punto de fusión

25 al 1 % (Boehringer Mannheim) y la quimera Zcytor17-mpl escindida se aisló usando el kit de extracción en gel Qiaquick™ (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La quimera Zcytor17-mpl escindida resultante se insertó en un vector de expresión como se describe más adelante.

El vector de expresión receptor pZP-5Z se sometió a digestión con EcoRI (BRL) y HindIII (BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante, y se purificó en gel como se ha descrito anteriormente. Este fragmento de vector se combinó con la quimera Zcytor17-mpl escindida con EcoRI y XbaI aislada anterior y un fragmento enlazador XbaI/HindIII en una reacción de ligamiento. El ligamiento se ejecutó usando ligasa T4 (BRL), a 15 ºC durante una noche. Una muestra del ligamiento se sometió a electroporación en células de E. coli electrocompetentes DH10B ElectroMAX™ (25uF, 200 Ω, 2,3 V). Los transformantes se sembraron en placas de LB + ampicilina y se exploraron

35 colonias sencillas por PCR para verificar que la quimera Zcytor17-mpl usando un cebador de dominio extracelular de zcytor17 y ZC 17,206 (SEQ ID NO: 25) usando las condiciones PCR descritas anteriormente. La confirmación de la secuencia de la quimera Zcytor17-mpl se realizó mediante análisis de secuencia.

Ejemplo 8

Construcción del vector de expresión que expresa zcytor17 de longitud completa: pZp7pX/zcytor17 A. Clonación del ADNc de zcytor17 de longitud completa para la expresión:

Para obtener un ADNc de longitud completa, los productos PCR 5’ y 3’ se aislaron y unieron usando un sitio PstI

45 interno. Los cebadores de la PCR se diseñaron usando la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 53 y para la clonación incluyen los sitios de restricción BamHI y XhoI.

Se generó un producto PCR 5’ usando como molde una biblioteca de ADNc WI-38 y los oligonucleótidos ZC 29,359 (SEQ ID NO: 62) y ZC 27,899 (SEQ ID NO: 63) como cebadores. WI-38 es una biblioteca de ADNc de uso interno generada a partir de una línea celular de pulmón embrionario humano (ATCC CRL-2221). Esta reacción PCR 5’ se ejecutó de la siguiente manera: 30 ciclos a 94 ºC durante 1 minuto, 65 ºC durante 1 minuto, 72 ºC durante 2 minutos, y después a 72 ºC durante 7 minutos; inmersión a 10 ºC. La reacción PCR usó aproximadamente 3 µg de plásmido preparado a partir de la biblioteca de ADNc, 20 pmoles de cada oligonucleótido y cinco unidades de ADN polimerasa PWO (Roche). Aproximadamente el 90 % del producto PCR 5’ se precipitó en etanol, se sometió a digestión con

55 BamHI y PstI y se purificó en gel sobre gel de agarosa al 1,0 %. La banda de aproximadamente 600 pb se escindió y se usó para el ligamiento con el vector de clonación pUC18 que se sometió a digestión con BamHI y PstI. Los transformantes resultantes se secuenciaron para confirmar la secuencia de ADNc de zcytor17. Para uno de estos transformantes, el ADN plasmídico se preparó y se sometió a digestión con BamHI y PstI. La banda resultante de aproximadamente 600 pb se purificó en gel y se usó para un ligamiento a continuación para formar un ADNc de longitud completa.

Se generó un producto PCR 3’ usando como molde una biblioteca de ADNc de uso interno de testículo humano y los oligonucleótidos ZC 27,895 (SEC ID NO: 64) y ZC 29,122 (SEC ID Nº: 65) como cebadores. Esta reacción PCR 3’ se ejecutó de la siguiente manera: 30 ciclos a 94 ºC durante 45 segundos, 65 ºC durante 45 segundos, 72 ºC durante 2 65 minutos, después 72 ºC durante 7 minutos; inmersión a 10 ºC. Toda la reacción PCR 3’ se purificó en gel sobre un gel de agarosa al 1,0 % y la banda principal de 1500 pb se escindió. Esta banda se clonó en el vector PCR Blunt II

52

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segundos; 35 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 56 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 30 segundos, seguido de 1 ciclo a 72 ºC durante 5 minutos. Aproximadamente 10 µl del producto de reacción de la PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa convencional usando un gel de agarosa al 4 %. El tamaño del fragmento de ADN predicho correcto se observó en el cerebro, en células CD90+, células dendríticas, embrionarias, MEWt n.º 5 2, línea celular de próstata Tuvak, glándula salival, piel y testículo.

El fragmento de ADN de piel y testículo se separó y purificó usando un kit de extracción en gel (Qiagen, Chatsworth, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fragmentos se confirmaron por secuenciación para demostrar que eran realmente de zcytor17 de ratón. 10 Tabla 7

Tejido/línea celular

n.º de muestras Tejido/línea celular n.º de muestras

229

1

7F2

1

Adipocitos-Amplificado

1

aTC1.9

1

Cerebro

4

CCC4

1

CD90+ Amplificado

1

OC10B

1

Células dendríticas

1

Células embrionarias

1

Corazón

2

Riñón

3

Hígado

2

Pulmón

2

MEWt n.º 2

1

P388D1

1

Páncreas

1

Placenta

2

Línea Celular de Próstata Jakotay

1

Línea Celular de Próstata Nelix

1

Línea Celular de Próstata Paris

1

Línea Celular de Próstata Torres

1

Línea Celular de Próstata Tuvak

1

Glándula Salival

2

Músculo Esquelético

1

Piel

2

Intestino Delgado

1

Músculo Liso

2

Bazo

2

Estómago

1

Testículo

3

Timo

1

Ejemplo 23

15 Expresión de zcytor17 en diversos tejidos usando PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR)

A. Cebadores y sondas para RT-PCR cuantitativa

La RT-PCR cuantitativa en tiempo real usando el Sistema de Detección ABI PRISM 7700 Sequence (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) se había descrito anteriormente (Véase, Heid, C.A. et al, Genome Research 6: 20 986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al, Genome Research 6: 995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al, Endocrinology

139: 4756-4764, 1998. Este método incorpora el uso de una sonda específica de genes que contiene colorantes fluorescentes tanto indicadores como inactivadores. Cuando la sonda está intacta la emisión de colorante indicador no se presenta debido a la estrecha proximidad del colorante inactivador. Durante la extensión por PCR usando cebadores directos e inversos específicos de genes adicionales, la sonda se escinde por actividad nucleasa 5’ de la

63

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Claims (1)

1. imagen1

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   imagen3