ES2594403T3 - Métodos de cultivo de especies bacterianas de la familia Anaplasmataceae - Google Patents

Abstract

Un método para cultivar en continuo Ehrlichia canis que comprende: i) obtener Ehrlichia canis; ii) obtener células de fibroblastos embrionarios felinos; iii) infectar las células de fibroblastos embrionarios felinos con dicha Ehrlichia canis; y iv) cultivar en continuo dichas células de fibroblastos embrionarios felinos en medio de cultivo celular embrionario felino en condiciones que conducen a la propagación de las células de fibroblastos embrionarios felinos, cultivando de este modo en continuo la Ehrlichia canis.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

antígeno o los antígenos usados en la vacuna. Los términos “protección” y “proteger” y similares, también significan que la vacuna puede usarse para “tratar” la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad que ya existe en un sujeto.

“Tratar” se refiere a invertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir un trastorno, una afección o una enfermedad a la que se aplica dicho término, o prevenir uno o más síntomas de dicho trastorno, afección o enfermedad. El tratamiento también se refiere a la aceleración de la recuperación de una infección por uno o más organismos Anaplasmataceae. “Tratamiento” se refiere al acto de “tratar”.

Por lo tanto, pueden usarse vacunas hechas de material cultivado de acuerdo con la presente invención para prevenir infección bacteriana de Anaplasmataceae en un mamífero objeto, proteger un mamífero objeto contra bacterias Anaplasmataceae y tratar la infección bacteriana de Anaplasmataceae en un mamífero objeto. Dicha prevención, protección o tratamiento puede incluir (sin limitación) reducir o eliminar el riesgo de infección por el organismo Anaplasmataceae patógeno, mejorar o aliviar los síntomas de una infección por dicho organismo Anaplasmataceae, reducción de la carga bacteriana de Anaplasmataceae, reducir la incidencia o duración de infecciones por Anaplasmataceae, reducir los niveles de proteína de suero de fase aguda de bacterias Anaplasmataceae, temperaturas rectales reducidas y/o aumento del consumo de alimentos y/o crecimiento, por ejemplo.

“Farmacéuticamente aceptable” como se usa en el presente documento se refiere a sustancias (por ejemplo, adyuvantes, inmunoestimulantes, vehículos, diluyentes, agentes emulsionantes o estabilizantes), que están dentro del alcance del criterio médico razonable, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de sujetos sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares indebidos, adecuado para una relación beneficio de frente a riesgo razonable, y eficaz para su uso pretendido. Las sustancias farmacéuticamente aceptables no interfieren con la eficacia del agente terapéutico y no son tóxicas para el sujeto al que se administran.

“Sujeto” o “mamífero objeto” se refiere a cualquier animal que tenga un sistema inmunitario, que incluye mamíferos tales como seres humanos, gatos, vacas, caballos, cerdos y perros.

El material cultivado de acuerdo con la presente invención también puede usarse en aplicaciones de diagnóstico para diagnosticar la presencia de enfermedades o dolencias provocadas por bacterias Anaplasmataceae. Los ejemplos no limitantes de dichas aplicaciones de diagnóstico incluyen uso de fracciones bacterianas, proteínas u otras biomoléculas en ensayo de unión a anticuerpo. Las fracciones bacterianas, proteínas u otras biomoléculas también pueden usarse para generar anticuerpos policlonales o monoclonales para dichos ensayos.

Cultivo de células hospedadoras

Se preparan en primer lugar células hospedadoras para cultivar organismos bacterianos de acuerdo con la presente invención antes de infectar con el organismo bacteriano deseado. Se siembra una muestra de una línea celular embrionaria felina aislada en medio para cultivo en suspensión o adherente. Como se usa en el presente documento, las condiciones de cultivo adherente son en las que una capa de células recubre superficies contenidas dentro de la vesícula en la que se cultivan las células. Las superficies pueden incluir la superficie interna de la vesícula en sí misma o superficies de vidrio o perlas poliméricas contenidas dentro de la vesícula para aumentar el área de superficie. También pueden usarse microvehículos para aumentar el área de superficie y cultivo de células hospedadoras. A diferencia del cultivo adherente, puede ser posible cultivar las células hospedadoras en suspensión, en la que las células hospedadoras no necesitan unirse a superficies dentro de la vesícula de cultivo.

El experto en la materia está en general familiarizado con las variedades de medios de cultivo que pueden usarse para cultivar las células hospedadoras. El medio de cultivo de células hospedadoras puede derivar de animales. Como alternativa, el medio de cultivo de células hospedadoras puede ser vegetal o basado en levadura y puede ser sin proteínas animales. El medio de cultivo puede derivar de extractos de soja o de otras plantas ricas en proteínas o productos alimenticios vegetales ricos en proteínas incluyendo, por ejemplo, legumbres. Los ejemplos no limitantes de medios específicos útiles para cultivar células hospedadoras incluyen Medio Esencial Mínimo de Eagle (MEM), Medio Esencial Mínimo de Glasgow, RPMI1640, OptiMEM, AIM V.

El medio de cultivo puede contener o complementarse con suero bovino fetal (FBS), solución de triptosa, solución de hidrolizado de lactoalbúmina, Lglutamina, bicarbonato sódico; hidrolizado de lactalbúmina, Polimixina B, piruvato sódico, glucosa, sulfato de magnesio.

El medio de cultivo nuevo puede renovarse o reponerse a las células hospedadoras antes o después de infección o exposición de las células hospedadoras a las bacterias Anaplasmataceae.

Las células pueden cultivarse a 3638 ºC durante 29 días a CO2 al 5 %.

7 5

15

25

35

45

55

65

Infección de las células hospedadoras

Las células hospedadoras pueden exponerse a o infectarse con organismos bacterianos de la familia Anaplasmataceae poniendo las células hospedadoras en contacto con otras células eucariotas que se sabe que están infectadas con los organismos bacterianos. El experto en la materia está familiarizado con la determinación de si dichas otras células eucariotas de un mamífero, por ejemplo, están infectadas con dichos organismos bacterianos. Las células de mamífero infectadas pueden derivar de cualquier tejido, incluyendo el bazo, hígado, páncreas, pulmones, corazón u otro tejido muscular, cerebro, vesícula biliar, sangre, riñones, ganglios linfáticos o estómago. Las células de mamífero infectadas pueden prepararse a partir de un extracto tisular mediante homogeneización en mezclador en una solución isotónica apropiada. El homogeneizado puede después usarse para inocular (es decir, infectar) un cultivo de células hospedadoras, aplicado como una capa sobre las células hospedadoras o sencillamente puesto en contacto con ellas.

Como alternativa, las células hospedadoras pueden exponerse a o infectarse con organismos bacterianos aislados de la familia Anaplasmataceae. El experto en la materia está familiarizado con técnicas para aislar dichos organismos bacterianos, o puede obtener reservas de organismos bacterianos aislados de un almacén biológico.

El medio de cultivo usado para preparar células hospedadoras antes de contacto con bacterias Anaplasmataceae puede ser el mismo que el medio usado para propagar las células hospedadoras después de dicho contacto. Las células hospedadoras expuestas a bacterias Anaplasmataceae (o infectadas) pueden cultivarse durante hasta 95 días, hasta 35 días o durante hasta 5 a 10 días, para conseguir un título de ≥1x104 DICT50 (Dosis Infecciosa de Cultivo Tisular), y después el cultivo puede recogerse y procesarse.

Recogida

Las células hospedadoras infectadas por bacterias Anaplasmataceae pueden recogerse recolectando los fluidos y/o las células de cultivo celular tisular. Las células hospedadoras pueden recogerse del medio (y las vesículas de cultivo) con las células bacterianas Anaplasmataceae contenidas con las paredes de las células hospedadoras. Como alternativa, durante la recogida la concentración de las bacterias Anaplasmataceae puede enriquecerse por técnicas que mejoran la liberación de las células bacterianas infecciosas del sustrato de cultivo, por ejemplo sonicación, congelación y descongelación, calentamiento o lisis enzimática química o selectiva de las células hospedadoras eucariotas. Una recogida enriquecida de bacterias Anaplasmataceae puede incluir material que esté libre de células hospedadoras o material de células hospedadoras. Como alternativa, una recogida enriquecida de bacterias Anaplasmataceae puede incluir material que contiene células hospedadoras o material de células hospedadoras.

Inactivación

El experto en la materia está familiarizado en general con las técnicas por las que las células hospedadoras o bacterianas pueden destruirse o inactivarse. Dichas técnicas incluyen medios físicos, químicos y biológicos. Los ejemplos no limitantes de técnicas de inactivación incluyen sonicación, técnicas de congelacióndescongelación, presión, tratamiento con calor, productos químicos o enzimas. Los ejemplos no limitantes de agentes de inactivación química incluyen tratamiento con etilenimina binaria (BEI), formalina (solución de formaldehído), betapropiolactona, mertiolato, gluteraldehído, dodecil sulfato sódico o similares, o una mezcla de los mismos. Las células hospedadoras pueden también inactivarse por calor o psoraleno en presencia de luz ultravioleta. Estos agentes de inactivación químicos o medios de inactivación físicos también pueden usarse para inactivar las células bacterianas Anaplasmataceae después de haberse extraído o separado de las células hospedadoras.

Formulación

Las células hospedadoras infectadas, inactivadas o células bacterianas Anaplasmataceae enriquecidas pueden actuar como el antígeno y pueden formularse como una suspensión líquida o pueden liofilizarse para su uso en la preparación de una vacuna contra enfermedades provocadas por organismos de Anaplasmataceae. El material cultivado de acuerdo con la presente invención puede formularse con cualquier adyuvante, inmunoestimulante, vehículo, diluyente, agente emulsionante o estabilizante farmacéuticamente aceptable, de los que se analizan posteriormente ejemplos no limitantes. El experto en la materia, sin embargo, reconocería que pueden usarse otros adyuvantes, inmunoestimulantes, vehículos, diluyentes, agentes emulsionantes o agentes estabilizantes en la formulación de vacunas basándose en el material cultivado de acuerdo con la presente invención.

Adyuvantes e inmunoestimulantes

Un adyuvante en general es una sustancia que refuerza la respuesta inmunitaria de la diana de una manera no específica. Se conocen en la técnica muchos adyuvantes diferentes. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes que pueden usarse en la formulación de una vacuna hecha de material cultivado de acuerdo con la presente invención incluyen sales de aluminio (por ejemplo, alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, óxido de aluminio), colesterol, adyuvantes de monofosforil lípido A, anfígeno, tocofenoles, monofosfenil lípido A, dipéptido muramílico,

8

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

células/ml por matraz llevando el homogeneizado hasta una dilución final 1:10 a 1:100. Después de 1824 horas de incubación a 37 ºC con CO2 5 %, el medio de cultivo se reemplazó con 30 ml de Medio de Cultivo FEF nuevo. Después de 57 días de incubación, la monocapa celular se tripsinizó y se resuspendió en 510 ml de Medio de Cultivo FEF nuevo. Después se inocularon cinco ml de esta suspensión en cada uno de dos matraces de cultivo celular de 175 cm2 que contenían 50 ml de Medio de Cultivo FEF. Las células se incubaron después durante 710 días a 37 ºC con CO2 5 %. Para mantener la viabilidad, los cultivos requirieron “suministro”, que se consiguió reemplazando el 50 % del medio de cultivo gastado con Medio de Cultivo FEF nuevo. Después de 1014 días más de incubación a 37 ºC con CO2 5 %, las células se tripsinizaron y se resuspendieron como se ha descrito anteriormente. Para mantener la propagación continua, se pasaron de 1 a 2 ml de suspensión de células FEF infectadas a células FEF no infectadas y se incubó a 37 ºC con CO2 5 %. Los cultivos infectados se pasaron de 7 a 13 veces usando tiempos de incubación que variaban de 4 a 14 días. La presencia de E. canis en las células FEF cultivadas se confirmó mediante el uso de IFA y PCR como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 3: Cultivo de E. canis en una población homogénea de células FCWF4

3.1. Propagación de células FCWF4 no infectadas (ATCC n.º CRL2787)

Un vial congelado de células de feto completo de Felis catus4 (FCWF4) no infectadas (ATCC n.º CRL2787) se descongeló, se clarificó y se usó para inocular un matraz de cultivo celular de 75 cm2 que contenía Medio de Cultivo FCWF, y se incubó a 37 ºC con CO2 5 %. El Medio de Cultivo FCWF consiste en EMEM (Medio Esencial Mínimo de Eagle con solución salina equilibrada de Earle y Lglutamina 2 mM), piruvato sódico 1,0 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, bicarbonato sódico 1,5 g/litro y FBS 10 %. Después de 45 días de incubación, la monocapa confluente al 9095 % se trató con tripsina 0,25 % y se dividió a una relación de 1:4 a 1:6.

3.2. Preparación de población homogénea de células FCWF4 infectadas por E. canis

Antes de la infección con E. canis, las células FCWF4 no infectadas se sembraron en un matraz de 175 cm2 a 6x106 por matraz y se incubaron durante 1824 h. Se usó homogeneizado de bazo infectado por E. canis para infectar células FCWF4 como se ha descrito para células FEF excepto que se usó el Medio de Cultivo FCWF en lugar del Medio de Cultivo FEF. La presencia de E. canis en las células FCWF4 cultivadas se confirmó mediante el uso de IFA y PCR como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 4: Cultivo de E. muris en una población homogénea de células FEA

4.1 Propagación de células embrionarias felinas FEA no infectadas

Un vial de células embrionarias felinas FEA no infectadas congeladas se descongeló, se clarificó y se usó para inocular un matraz de 75 cm2 que contenía Medio de Cultivo FEA, y se incubó a 37 ºC con CO2 5 %. El Medio de Cultivo FEA consiste en MEM de Dulbecco, Lglutamina 2 mM, piruvato sódico 1,0 mM y FBS 10 %. Después de 7 días de incubación, la monocapa confluente se trató con tripsina 0,25 % y se pasó a una relación de división de 1:2.

4.2 Preparación de población homogénea de células embrionarias felinas FEA infectadas por E. muris

Se propagaron células DH82 no infectadas como se ha descrito anteriormente, y se infectaron con E. muris usando células DH82 infectadas por E. muris (n.º de referencia de ATCC VR1411 – cepa Asuke). El protocolo para la preparación de materiales e infección esencialmente siguió el protocolo como se ha descrito anteriormente para células DH82 infectadas por E. canis, excepto que las células DH82 infectadas por E. muris sustituyeron las células DH82 infectadas por E. canis. Los ratones se infectaron por vía intraperitoneal con 0,5 ml de células DH82 infectadas por E. muris.

Los ratones se identificaron positivamente como infectados con E. muris mediante PCR de ADN de bazo y de sangre. El ADN se purificó a partir de muestras sanguíneas y tisulares usando un Mini Kit de ADN QIAamp de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó PCR en un termociclador robótico RoboCycler® (Stratagene) usando reacciones de 25 µl que consistían en 2,5 µl de tampón de reacción 10X (Genscript), 0,2 µl de dNTP 100 mM (Invitrogen), 1 µl de cebador oligonucleotídico 1 10 µM (5’ AGA ACG AAC GCT GGC GGC AAG C3”) y cebador oligonucleotídico 2 (5’ CGT ATT ACC GCG GCT GCT GGC A3’), y 0,2 µl de Taq polimerasa (Genscript) en un protocolo de termociclación consistente en una etapa de desnaturalización preliminar de 94 ºC durante 5 min, seguida de 35 ciclos de 94 ºC durante 1 min, 60 ºC durante 1 min, y 72 ºC durante 1 min, seguido de una etapa de elongación final de 72 ºC durante 10 minutos.

Se prepararon homogeneizados en medio de cultivo nuevo a partir de muestras de bazo obtenidas de ratones infectados por E. muris y se usaron en células embrionarias felinas FEA. Se inoculó un ml del homogeneizado de bazo de ratón infectado por E. muris en células embrionarias felinas FEA no infectadas en un matraz de cultivo celular de 25 cm2 que contenía una monocapa de células embrionarias felinas FEA de 24 h (a ∼ 80% de confluencia) y 8 ml de medio de cultivo FEA a una dilución de homogeneizado final de 1:9. Después de 524 horas

13

imagen10

imagen11

Claims (1)

1. imagen1