ES2595103T3 - Células Tr1, células madre mesenquimales y usos de estas - Google Patents

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ES2595103T3 ES08840358.9T ES08840358T ES2595103T3 ES 2595103 T3 ES2595103 T3 ES 2595103T3 ES 08840358 T ES08840358 T ES 08840358T ES 2595103 T3 ES2595103 T3 ES 2595103T3
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Abstract

Una composición que consiste en células Tr1 y células madre mesenquimales en combinación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para el uso como un medicamento.

Description

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DESCRIPCION
Celulas Tr1, celulas madre mesenquimales y usos de estas Campo de la invencion
Esta invencion se refiere a celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales. Mas particularmente, esta invencion se refiere a los usos de las celulas Tr1 y las celulas madre mesenquimales para tratar una respuesta mediada por celulas T, propia o no, que es excesiva, disfuncional o incontrolada, tales como las enfermedades autoinmunitarias o las enfermedades inflamatorias.
Antecedentes de la invencion
La funcion del sistema inmunologico es la eliminacion de celulas extranas que puedan contener patogenos, mientras se mantiene la falta de respuesta o tolerancia contra los autoantigenos. La tolerancia se manifiesta por el agotamiento de las celulas T autorreactivas o anergia, esta ultima se caracteriza por la supervivencia de las celulas T, pero con una menor capacidad de respuesta. Sin embargo, en varias circunstancias, el sistema inmunologico puede atacar constituyentes propios, lo que provoca las enfermedades autoinmunitarias. Se considera que las enfermedades autoinmunitarias se originan en la respuesta inmunologica anormal a autoantfgenos, debido a un cambio en la capacidad inmunogenica de los autoantfgenos o a la exposicion a antfgenos mimeticos con reactividad cruzada.
Es deseable mejorar los tratamientos actuales de las enfermedades autoinmunitarias u otras reacciones inmunologicas indeseables que usan agentes inmunosupresores generales, tales como compuestos anti-TNF, corticosteroides, azatioprina, o ciclosporina A. Estos tratamientos no son selectivos y no hacen distincion entre las respuestas inmunologicas normales y las anormales. Estos farmacos tienen a menudo efectos secundarios adversos, que incluyen la supresion general del sistema inmunologico con un alto riesgo de infeccion y neoplasia, asf como el desarrollo de enfermedades tales como la diabetes, la osteoporosis, la leucopenia y la hipertension. Se necesitan enfoques alternativos para el tratamiento de estas enfermedades para los pacientes que no pueden soportar, o que no responden a la terapia farmacologica no espedfica convencional. Estos enfoques alternativos se basan en la induccion de inmunosupresion y/o tolerancia inmunologica espedfica, dirigidas al «silenciamiento» de la respuesta patogena a los autoantfgenos, mientras se mantienen intactos los mecanismos de defensa del huesped.
Se han considerado enfoques alternativos que utilizan las MSC.
Las celulas madre mesenquimales (MSC) son celulas madre multipotentes que pueden diferenciarse facilmente en linajes que incluyen osteoblastos, miocitos, condrocitos y adipocitos. Las MSC expresan el antfgeno del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I sobre su superficie, pero tienen una expresion limitada de las moleculas de clase II y no expresan moleculas coestimuladoras B7 o CD40, lo que sugiere que estas celulas tienen una baja capacidad inmunogenica. Las MSC tambien inhiben las respuestas proliferativas de celulas T de una manera independiente del MHC. Estas propiedades inmunologicas de las mSc pueden mejorar su trasplante como injerto y limitar la capacidad del sistema inmunologico receptor de reconocer y rechazar las celulas alogenicas despues del trasplante.
La solicitud de patente num. US2002/044923 describe el uso de las MSC, que se han modificado para portar un antfgeno, para tratar o inhibir una respuesta inmunologica no deseada o anormal, tal como ocurre en las enfermedades autoinmunitarias. La presentacion del antfgeno a la celula T en ausencia de una senal coestimuladora induce un estado de una menor capacidad de respuesta, espedfico del antfgeno, o incluso falta de respuesta o anergia en la celula T en una estimulacion posterior de la celula T por el antfgeno.
La solicitud de patente num. WO2005/093044 (Pittenger y otros) describe como las MSC pueden emplearse en el tratamiento de enfermedades, afecciones y trastornos que implican el sistema inmunologico. Pittenger y otros creen que 1/ las MSC pueden estimular las celulas dendnticas (DC) para producir interferon-beta (IFN-p), que promueve la supresion de tumores y la inmunidad contra una infeccion viral, y 2/ las MSC pueden suprimir enfermedades autoinmunitarias al provocar la liberacion de interleucina-10 (IL-10) a partir de celulas T reguladoras (celulas Treg) y/o DC. Sin embargo, todos los experimentos que se muestran en los ejemplos se realizan in vitro y Pittenger y otros no demuestran en esta solicitud de patente que la inyeccion de mSc puede tratar eficazmente las enfermedades, afecciones y trastornos que implican al sistema inmunologico.
La solicitud de patente num. US2002/085996 se refiere al uso de las MSC para prevenir, reducir o tratar el rechazo de trasplantes y/o la reaccion de injerto contra huesped, pero no se refiere a las afecciones autoinmunitarias.
Di Nicola y otros (Blood, 2002) describen que las celulas estromales de la medula osea inhiben la proliferacion de linfocitos T en reacciones linfocitarias mixtas (MLRs).
Se han considerado otros enfoques alternativos que utilizan las celulas T reguladoras.
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Actualmente se han identificado varios subconjuntos de celulas T reguladoras (Treg) con distintos fenotipos y mecanismos de accion distintos. Estas incluyen las celulas Treg CD4+ CD25+, que inhiben las respuestas inmunologicas a traves del contacto celula a celula, las celulas Th3 que secretan principalmente TGF-p, y las celulas Tr1 que secretan altos niveles de IL-10 y niveles bajos a moderados de TGF-p. Estas celulas Tr1 producen IL-10, IL-5 e IFN-y, con o sin TGF-p, pero con poco o nada de IL-2 o IL-4, y proliferan poco despues de una activacion mediada por TCR policlonal.
Las solicitudes de patentes nums. US2007/009497 y WO2006/090291 describen el uso de celulas Treg CD4+ CD25+ para el tratamiento de afecciones autoinmunitarias e inflamatorias.
La patente num. US6281012 describe el uso de celulas T supresoras para reducir o inhibir el rechazo del trasplante por el huesped. Estas celulas T supresoras se definen como celulas T que se han sensibilizado en una reaccion linfocitaria mixta por la exposicion a un aloantigeno, y posteriormente se han cultivado con celulas madre mesenquimales. Por tanto, estas celulas T supresoras comprenden celulas Tr1 alogenicas.
A traves de la solicitud de patente num. WO2006/018674, los solicitantes describen el uso de celulas Tr1 para el tratamiento de la aterosclerosis. Los solicitantes observaron, ademas, en un modelo de raton de la enfermedad de Crohn, en donde las celulas proinflamatorias se dirigen contra bacterias comensales de la flora digestiva, que la administracion a los ratones de celulas Tr1 dirigidas contra un antfgeno suministrado en la alimentacion permite la prevencion de la inflamacion cronica del colon.
Los solicitantes pretenden ahora proporcionar un nuevo tratamiento alternativo para mejorar los tratamientos actuales de las enfermedades autoinmunitarias o de otras reacciones inmunologicas indeseables. Este nuevo tratamiento todavfa se basa en la induccion de inmunosupresion y/o tolerancia inmunologica espedfica, dirigidas al «silenciamiento» de la respuesta patogena al autoantfgeno, mientras se mantienen intactos los mecanismos de defensa del huesped. Este nuevo tratamiento se basa en el uso de una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. Los solicitantes descubrieron, sorprendentemente, que el tratamiento con una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables produce mejores resultados que el tratamiento solo con MSC o celulas Tr1. Sin desear estar ligados a una teona, los solicitantes creen que esta composicion puede inducir una tolerancia inmunologica espedfica del antfgeno en un sujeto para tratar una respuesta inmunologica mediada por celulas T, propia o no, que es excesiva, disfuncional o incontrolada, a traves de diferentes vfas, tales como:
1/ inhibicion de las respuestas proliferativas de celulas T por las MSC de una manera independiente del antfgeno,
2/ inhibicion de las respuestas proliferativas de celulas T e induccion de tolerancia de las celulas T por la IL-10 secretada por las celulas Tr1,
3/ induccion in vivo de las celulas Tr1 por las MSC.
Breve descripcion de la invencion
La presente invencion se refiere, por lo tanto, a una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso como un medicamento.
La presente invencion se refiere, ademas, a una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso como una composicion farmaceutica.
En una modalidad de la invencion, las composiciones para el uso de acuerdo con la invencion comprenden, ademas, el antfgeno para el que las celulas Tr1 son espedficas.
En una modalidad de la invencion, las celulas Tr1 son espedficas para un antfgeno tolerado normalmente en un sujeto sano.
En una modalidad preferida de la invencion, dicho antfgeno tolerado normalmente en un sujeto sano es un alergeno, un autoantfgeno, un antfgeno de alimentos o un antfgeno microbiano. Preferentemente, dicho alergeno se selecciona del grupo que comprende polen, acaros del polvo domestico, alergenos de felinos o roedores, humedades, dicho autoantfgeno se selecciona del grupo que comprende insulina, protemas de la mielina, protemas de choque termico, desmoglemas, protemas articulares, fragmentos, variantes y mezclas de estos, dicho antfgeno de alimentos se selecciona del grupo que comprende ovoalbumina, casema, protema de soja, gliadina, fragmentos, variantes y mezclas de estos y dicho antfgeno microbiano se selecciona del grupo que comprende Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae y protemas de las bacterias comensales.
En otra modalidad de la invencion, dichas celulas Tr1 y MSC son autologas.
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En otra modalidad de la invencion, las celulas Tr1 y MSC se envasan por separado para administrate secuencialmente o simultaneamente.
La presente invencion se refiere, ademas, a una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad alergica o una enfermedad inflamatoria. En una modalidad preferida, dicha enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que comprende enfermedad de Wegener, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, esclerosis multiple y diabetes resistente a la insulina.
En una modalidad preferida, dicha enfermedad alergica se selecciona del grupo que comprende asma, rinitis, urticaria, dermatitis atopica; enfermedades fibroticas y alergia a los alimentos.
En una modalidad preferida, dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que comprende artritis reumatoide, esclerosis multiple, enfermedad de Crohn, enfermedad de injerto contra huesped y enfermedad de huesped contra injerto.
En una modalidad de la invencion, dichas celulas Tr1 y dichas MSC se administran simultaneamente o secuencialmente.
Otro objetivo de la invencion es una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales para el uso en la promocion de la regeneracion de tejidos.
Otro objetivo de la invencion es una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales para el uso en el tratamiento de la fibrosis.
Otro objetivo de la invencion es una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales para el uso en la promocion de la angiogenesis.
Descripcion detallada de la invencion
Definicion
El termino "celulas T reguladoras" o "T supresoras" como se usa en la presente descripcion se refiere a una poblacion de celulas T que inhibe o impide la activacion, o en otra modalidad, la funcion efectora y la proliferacion, de otro linfocito T.
El termino "celulas Tr1" como se usa en la presente descripcion se refiere a las celulas que tienen el siguiente fenotipo en reposo CD4+CD25-FoxP3- y son capaces de secretar altos niveles de IL-10 y niveles bajos a moderados de TGF-p despues de la activacion. Las celulas Tr1 se caracterizan, en parte, por su unico perfil de citocinas: producen altos niveles de IL-10, niveles significativos de TGF-p y niveles intermedios de IFN-y, pero poco o nada de IL-4 o IL-2. La produccion de citocinas se evalua tfpicamente en cultivos de celulas despues de la activacion con activadores policlonales de linfocitos T tales como anticuerpos anti-CD3+ anti-CD28 o interleucina-2, PMA + ionomicina.
Alternativamente, la produccion de citocinas se evalua en cultivos de celulas despues de la activacion con el antfgeno espedfico de celulas T, presentado por celulas presentadoras de antfgenos. Los altos niveles de IL-10 corresponden con al menos aproximadamente 500 pg/ml, tfpicamente mayor de aproximadamente 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 000 pg/ml o mas. Los niveles significativos de TGF-p corresponden con al menos aproximadamente 100 pg/ml, tfpicamente mayor de aproximadamente 200, 300, 400, 600, 800, o 1000 pg/ml o mas. Los niveles intermedios de IFN-y corresponden a concentraciones comprendidas entre 0 pg/ml y al menos 400 pg/ml, tfpicamente mayor de aproximadamente 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, o 2000 pg/ml o mas. Poco o nada de IL-4 o IL-2 corresponde con menos de aproximadamente 500 pg/ml, preferentemente menos de aproximadamente 250, 100, 75, o 50 pg/ml, o menos.
El termino "antfgeno" como se usa en la presente descripcion, se refiere a una protema, o peptido, asociado con una enfermedad particular para la cual las celulas de esta invencion se utilizan para modular, o para el uso en cualquiera de los metodos de esta invencion. En una modalidad, el termino "antfgeno" puede referirse a una molecula de origen sintetico, o una molecula de origen natural, que comparte homologfa de secuencia con un antfgeno de interes, u homologfa estructural con un antfgeno de interes, o una combinacion de estos. En una modalidad, el antfgeno puede ser un mimetopo. El termino "espedfico de antfgeno" como se usa en la presente descripcion se refiere a una propiedad de la poblacion de celulas de manera que el suministro de un antfgeno particular, o un fragmento de este antfgeno, resulta en una modalidad en la proliferacion de celulas T reguladoras espedficas cuando el antfgeno se presenta en el contexto del MHC. En otra modalidad, el suministro del antfgeno o fragmento de este, da como resultado la produccion de IL-10 por las celulas T reguladoras. En una modalidad, la poblacion de celulas T reguladoras expresa un receptor de
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celulas T monoclonal. En otra modalidad, la poblacion de celulas T reguladoras expresa receptores de celulas T policlonales.
El termino "autoantigeno" como se usa en la presente descripcion se refiere a un antfgeno que se expresa normalmente en el cuerpo del sujeto. En una modalidad, un autoantigeno se refiere a un antfgeno, que cuando se expresa en un cuerpo, puede resultar en la formacion de celulas T autorreactivas. En una modalidad, el autoantfgeno se expresa en un organo que es el objetivo de una enfermedad autoinmunitaria. En una modalidad, el autoantigeno se expresa en el pancreas, tiroides, tejido conectivo, rinon, pulmon, Idgado, sistema digestivo o sistema nervioso. En otra modalidad, el autoantigeno se expresa en las celulas p pancreaticas.
El termino "antigeno tolerado normalmente en un sujeto sano" se refiere a todas las moleculas o entidades propias o no, que no inducen una respuesta proinflamatoria en sujetos sanos.
Estos antigenos tolerados pueden ser autoantigenos, antigenos ingeridos, antigenos inhalados, antigenos de la flora bacteriana o antigenos de contacto.
El termino "sujeto" como se usa en la presente descripcion, se refiere a un mairnfero, en particular a un ser humano.
El termino "cantidad eficaz" como se usa en la presente descripcion se refiere a una cantidad suficiente para producir un resultado clmico beneficioso o deseado (por ejemplo, una mejona en la afeccion clmica).
El termino "tratamiento" o "tratar" como se usa en la presente descripcion se refiere generalmente a una intervencion clmica en un intento por alterar el curso natural del individuo o la celula que se trata, y puede realizarse como profilaxis o durante el curso de una patologfa clmica. Los efectos deseables incluyen, pero no se limitan a, prevenir la aparicion o recurrencia de la enfermedad, aliviar los smtomas, suprimir, disminuir o inhibir las consecuencias patologicas directas o indirectas de la enfermedad, prevenir las metastasis, reducir la tasa de progresion de la enfermedad, mejorar o paliar el estado de la enfermedad, y provocar la remision o mejona del pronostico.
El termino "enfermedad autoinmunitaria" como se usa en la presente descripcion se refiere a una respuesta inmunologica dirigida contra un autoantigeno.
El termino "afeccion inflamatoria" o "trastorno inflamatorio" como se usa en la presente descripcion se refiere a cualquier trastorno que, en una modalidad, es provocado por una "respuesta inflamatoria" denominada ademas, en otra modalidad, como "inflamacion" o, en otra modalidad, cuyos smtomas incluyen la inflamacion. A modo de ejemplo, un trastorno inflamatorio provocado por la inflamacion puede ser un choque septico, y un trastorno inflamatorio cuyos smtomas incluyen la inflamacion puede ser la artritis reumatoide.
El termino "respuesta alergica" como se usa en la presente descripcion, se refiere a un ataque del sistema inmunologico contra un antfgeno generalmente inofensivo, inocuo, o un alergeno. Las alergias pueden incluir en una modalidad, pero no se limitan a, fiebre del heno, asma, eccema atopico, asf como alergias al roble venenoso y la hiedra venenosa, los acaros del polvo domestico, el veneno de abeja, las nueces, los mariscos, la penicilina u otros medicamentos, o cualquier otro compuesto o compuestos que inducen una respuesta alergica.
La presente invencion
La presente invencion se refiere a una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales (MSC) en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso como un medicamento o como una composicion farmaceutica.
En una modalidad de la invencion, las MSC pueden obtenerse mediante la cosecha de un tejido que contiene MSC y el aislamiento y la expansion de dichas MSC.
Las MSC obtenidas pueden ser una poblacion homogenea o pueden ser una poblacion de celulas mixtas enriquecida en MSC. Las MSC homogeneas pueden obtenerse mediante el cultivo de celulas adherentes del periostio o de la medula, o de una fraccion del estroma vascular del tejido adiposo y las MSC pueden identificarse por marcadores de la superficie celular espedficos. Las composiciones de MSC homogeneas se obtienen mediante seleccion positiva de las celulas adherentes de la medula, de la fraccion del estroma vascular del tejido adiposo o del periostio que estan libres de marcadores asociados con las celulas hematopoyeticas o las celulas mesenquimales diferenciadas. Estas poblaciones de celulas mesenquimales aisladas muestran caractensticas epitopicas asociadas solo con las celulas madre mesenquimales, tienen la capacidad de regenerarse en cultivo sin diferenciarse, y tienen la capacidad de diferenciarse en linajes mesenquimales espedficos cuando se inducen in vitro o se colocan in vivo en el sitio del tejido danado. Para obtener celulas madre mesenquimales humanas, es necesario aislar celulas madre mesenquimales pluripotentes raras a partir de otras celulas en la medula osea u otra fuente de MSC. Las celulas de la medula osea pueden obtenerse de la cresta ilfaca, femures, tibias, columna vertebral, costillas u otros espacios medulares. Otras fuentes de celulas madre mesenquimales humanas incluyen saco vitelino embrionario, placenta, cordon umbilical, piel fetal y adolescente, sangre y tejidos adiposos.
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Un metodo, incorporado en la presente descripcion como referencia, para obtener una poblacion de celulas enriquecida en MSC se describe, por ejemplo, en la patente num. US5486359.
En una modalidad de la invencion, las celulas Tr1 pueden obtenerse de la siguiente manera:
a) aislar una poblacion de celulas progenitoras a partir de un sujeto,
b) obtener una poblacion de celulas dendnticas mediante el cultivo de dicha poblacion de celulas progenitoras en presencia de IL-10
c) poner en contacto las celulas de la etapa b) con una poblacion de linfocitos T CD4+ aislados a partir de dicho sujeto en la presencia de un antigeno para permitir la diferenciacion de dichas celulas T CD4+ a la poblacion de celulas Tr1, y
d) recuperar la poblacion de celulas Tr1 de la etapa c).
En la etapa b), IL-10 esta presente de 50 a 250 U/ml, preferentemente a 100 U/ml en el medio de cultivo. Dicho metodo para obtener celulas Tr1 se describe en Wakkach y otros (Immunity, Mayo de 2003; 18(5):605-17), incorporado en la presente descripcion como referencia.
Dicho metodo puede llevarse a cabo, ademas, mediante el uso de dexametasona, vitamina D3, o DC tolerogenizadas o inmaduras en lugar de las DC de la etapa b).
En otra modalidad de la presente invencion, las celulas Tr1 pueden obtenerse de la siguiente manera:
a) cultivar una poblacion de celulas T CD4+ aisladas de un sujeto en un medio con una cantidad apropiada de IFN-a, y
b) recuperar la poblacion de celulas Tr1.
El IFN-a esta preferentemente presente en los medios a 5 ng/ml. En la etapa a), los medios pueden comprender ademas una cantidad apropiada de IL-10, preferentemente a 100 U/ml.
En la etapa b), la poblacion de celulas Tr1 se cultiva en un medio que comprende IL-15 para permitir la proliferacion, donde la IL-15 esta preferentemente a 5 ng/ml en el medio. Dicho metodo, incorporado en la presente descripcion como referencia, para obtener celulas Tr1 se describe en la patente num. US6746670.
Aun en otra modalidad de la invencion, las celulas Tr1 pueden obtenerse de la siguiente manera:
a) activar in vitro una poblacion de celulas T CD4+ en presencia del antfgeno, presentado por celulas presentadoras de antfgenos artificiales, y
b) recuperar las celulas T CD4+ activadas que comprenden al menos 10 % de celulas Tr1.
Preferentemente, las celulas presentadoras de antfgenos artificiales expresan una molecula del sistema de HLA II y una molecula LFA-3 humana y no expresan las moleculas de coestimulacion B7-1, B7-2, B7-H1, CD40, CD23 e ICAM-1.
Dicho proceso, incorporado en la presente descripcion como referencia, para obtener celulas Tr1 se describe en la solicitud de patente num. WO02/92793.
Aun en otra modalidad de la invencion, las celulas Tr1 pueden obtenerse de la siguiente manera:
a) activar in vitro una poblacion de celulas T CD4+ en presencia de un antfgeno y una cantidad apropiada de IL-10; y
b) recuperar la poblacion de celulas Tr1.
Preferentemente, la IL-10 esta presente en los medios a 100 U/ml. Dicho metodo se describe en Groux y otros (Nature 1997, 389(6652):737-42), que se incorpora en la presente descripcion como referencia.
Aun en otra modalidad de la invencion, las celulas Tr1 espedficas de antfgeno pueden obtenerse de la siguiente manera:
a) estimular una poblacion de leucocitos o una poblacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con un antfgeno,
b) recuperar la poblacion de celulas Tr1 espedficas del antfgeno a partir de la poblacion estimulada,
c) opcionalmente expandir dicha poblacion de celulas Tr1 espedficas del antfgeno.
Los leucocitos incluyen varios tipos de celulas, que se caracterizan por su importancia, su distribucion, su cantidad, su duracion y su potencialidad. Estos tipos son los siguientes: los leucocitos polinucleares o granulares, entre los que se encuentran los leucocitos eosinofilos, los neutrofilos y los basofilos, y las celulas mononucleares, o celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), que son grandes celulas blancas de la sangre y consisten en los tipos celulares del sistema inmunologico (linfocitos y monocitos). Los leucocitos o las PBMC pueden separarse de la sangre periferica mediante cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. Favorablemente, para la separacion de las PBMC, se puede usar la centrifugacion, preferentemente centrifugacion en gradiente de densidad, centrifugacion en
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gradiente de densidad preferentemente discontinuo. Una alternativa es el uso de anticuerpos monoclonales espedficos. En determinadas modalidades las PBMC tipicamente se a^slan a partir de la sangre entera por medio de Ficoll- Hypaque, mediante el uso de procedimientos estandares. En otras modalidades, las PBMC se recuperan por medio de leucoferesis.
Dicho metodo, incorporado en la presente descripcion como referencia, se describe en la solicitud de patente num. WO2007/010406.
Aun en otra modalidad, las celulas Tr1 pueden obtenerse de la siguiente manera:
a) cultivar una poblacion de leucocitos o una poblacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) con celulas madre mesenquimales en presencia de un antigeno,
b) recuperar la poblacion de celulas Tr1.
Dicho metodo puede llevarse a cabo, ademas, con celulas T vfrgenes o de memoria en lugar de PBMC o leucocitos.
La poblacion de celulas Tr1 obtenida de esta manera puede, ademas, expandirse por cultivo en presencia de citocinas tales como interleucina-2 e interleucina-4. Alternativamente, podnan utilizarse, ademas, la interleucina-15 y la interleucina-13 en los cultivos de expansion de celulas Tr1.
Aun en otra modalidad, las celulas Tr1 pueden obtenerse de la siguiente manera:
a) cultivar celulas T CD4+ con celulas dendnticas previamente tratadas con dexametasona (aproximadamente 10-7 M) y un antigeno seleccionado,
b) recuperar la poblacion de celulas Tr1 una semana despues del comienzo del cultivo.
En los metodos descritos anteriormente, las celulas Tr1 pueden caracterizarse por el metodo de identificacion descrito en la patente num. WO2005/000344. Dicho metodo de identificacion de celulas Tr1 se basa en la deteccion de la presencia simultanea de los productos de expresion de genes que codifican la molecula CD4 y las moleculas del grupo que comprende CD18 y/o cDlla, y CD49b. Las celulas Tr1 pueden identificarse y/o purificarse por Elisa, citometna de flujo, o metodos de purificacion por inmunoafinidad con anticuerpos dirigidos contra dichos marcadores.
Las celulas Tr1 pueden enriquecerse, ademas, mediante seleccion positiva o seleccion negativa mediante el uso de citometna de flujo o perlas magneticas. Tales metodos, incorporados en la presente descripcion como referencia, se describen ademas en la patente num. WO2005/000344.
En otra modalidad de la invencion, dicha composicion para el uso que consiste en celulas Tr1 y MSC puede obtenerse por cocultivo de MSC con celulas T autologas durante una a dos semanas.
En una modalidad preferida de la invencion, la composicion para el uso que consiste en dichas celulas Tr1 y dichas MSC, comprende ademas el antfgeno para el que las celulas Tr1 son espedficas.
En una modalidad de la invencion, el antfgeno para el que las celulas Tr1 son espedficas puede administrarse por separado a la composicion de la invencion, por ejemplo un antfgeno de la dieta puede administrarse en el alimento a un sujeto. En otra modalidad, el antfgeno para el que las celulas Tr1 son espedficas se anade en la composicion de la invencion.
En una modalidad preferida de la invencion, dicho antfgeno para el que las celulas Tr1 son espedficas es un antfgeno tolerado normalmente en un sujeto sano.
En una modalidad de la invencion, dicho antfgeno tolerado normalmente en un sujeto sano es un alergeno. Una lista de alergenos puede encontrarse en
http://www.allergen.org/.
En una modalidad preferida, dicho alergeno se selecciona del grupo de polen, acaros del polvo domestico, alergenos felinos o de roedores, humedades.
En otra modalidad de la invencion, dicho antfgeno tolerado normalmente en un sujeto sano es un antfgeno de alimentos.
El termino "antfgeno de alimentos" se refiere a un peptido inmunogenico, que proviene de productos alimenticios, tales como los antfgenos de alimentos de la siguiente lista no limitante: antfgenos de la especie bovina tal como lipocalina, S1OO de union al Ca, alfa-lactoalbumina, beta-lactoglobulina, albumina de suero bovino, inmunoglobulina o casemas. Los antfgenos de alimentos pueden ser, ademas, antfgenos de salmon atlantico tal como parvalbumina, antfgenos de pollo tales como ovomucoide, ovoalbumina, Ag22, conalbumina, lisozima o albumina de suero de pollo, cacahuetes, antfgenos de camarones tales como tropomiosina, antfgenos del trigo tales como aglutinina u omega-5 gliadina, antfgenos de apio tales como profilina de apio, antfgenos de zanahoria tales como profilina de zanahoria, antfgenos de manzana tales como taumatina, protema de transferencia de lfpidos de manzana, profilina de manzana, antfgenos de la pera tales como profilina de pera, reductasa de isoflavonas, antfgenos de aguacate tales como endoquitinasa, antfgenos
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de albaricoque tales como la protema de transferencia de Kpidos de albaricoque, antigenos de durazno tales como la protema de transferencia de Kpidos de durazno o profilina de durazno, antigenos de soja, tales como HPS, profilina de soja o prot PR-10 (SAM22).
En otra modalidad de la invencion, dicho antigeno tolerado normalmente en un sujeto sano es un autoantfgeno.
El termino "autoantigeno" se refiere a un peptido inmunogenico derivado de una protema de dicho individuo. Puede ser, a manera de ejemplo, un autoantfgeno de la siguiente lista no limitante: receptor de acetilcolina, actina, translocador de nucleotidos de adenina, receptor p-adrenergico, descarboxilasa de L-aminoacidos aromaticos, receptor de asialoglicoprotemas, protema aumentadora de la permeabilidad/bactericida (BPi), receptor sensible al calcio, enzima de escision de la cadena lateral del colesterol, cadena Oy del colageno tipo IV, citocromo P450 2D6, desmina, desmoglema-1, desmoglema-3, F-actina, gangliosidos GM, glutamato descarboxilasa, receptor de glutamato, ATPasa de H/K, 17-[alfa]- hidroxilasa, 21-hidroxilasa, IA-2 (ICAS 12), insulina, receptor de insulina, factor intrmseco tipo 1, antfgeno 1 asociado con la funcion leucocitaria, glicoprotema asociada a la mielina, protema basica de la mielina, protema de la mielina de los oligodendrocitos, miosina, P80-coilina, complejo de la piruvato deshidrogenasa E2 (PDC- E2), cotransportador simporte de yoduro de sodio, SOX-10, protema compartida por los musculos de los ojos y la tiroides, tiroglobulina, peroxidasa tiroidea, receptor de tirotropina, transglutaminasa tisular, coactivador de la transcripcion p75, triptofano hidroxilasa, tirosinasa, tirosina hidroxilasa, ACTH, aminoacil tPvNA-histidil sintetasa, cardiolipina, anhidrasa carbonica II, protemas asociadas con el centromero, ATPasa estimulada por el nucleosoma dependiente de ADN, fibrilarina, fibronectina, glucosa-6-fosfato isomerasa, beta 2-glicoprotema I, golgina (95, 97, 160, 180), protemas de choque termico, protema hemidesmosomica 180, histonas H2A, H2B, queratina, receptor de IgE, Ku- protema quinasa dependiente de ADN, Ku-nucleoprotema, La fosfoprotema, mieloperoxidasa, proteinasa 3, ARN polimerasa I-III, protema para el reconocimiento de senales, topoisomerasa I, tubulina, vimentina, protema mielmica basica asociada a oligodendrocitos (MOBP), protema proteolipfdica, protema espedfica de oligodendrocitos (OSP/Claudina 11), nucleotido dclico 3' fosfodiesterasa (CNPasa), antigeno 1 de BP (BPAGl-e), transaldolasa (TAL), autoantigenos mitocondriales humanos PDC-E2 (Novo 1 y 2), OGDC-E2 (Novo 3), y bCoADC-E2 (Novo 4), penfigoide ampolloso (BP) 180, laminina 5 (LN5), protema 48 con caja DEAD (DDX48) o antfgeno 2 asociado a insulinoma.
Preferentemente, el autoantfgeno o el antfgeno de alimentos es un antfgeno recombinante o uno sintetizado.
Preferentemente, el antfgeno es un antfgeno de alimentos seleccionado del grupo que comprende ovoalbumina, casema, protema de soja, gliadina, cacahuetes, fragmentos, variantes y mezclas de estos. Preferentemente, el antfgeno es un autoantfgeno seleccionado del grupo que comprende insulina, protema de la mielina, protemas de choque termico, desmoglemas, protemas articulares, proteinasa 3, fragmentos, variantes y mezclas de estos.
El termino "variante" del autoantfgeno o de un antfgeno de alimentos se refiere en la presente descripcion a un antfgeno que es casi identico al antfgeno natural y que comparte la misma actividad biologica. La diferencia minima entre el antfgeno natural y su variante puede estar por ejemplo en una sustitucion, delecion, y/o adicion de aminoacidos. Tales variantes pueden contener, por ejemplo, sustituciones conservadoras de aminoacidos en la que los residuos de aminoacidos se sustituyen con residuos de aminoacidos que tienen una cadena lateral similar. Las familias de los residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la tecnica, e incluyen las cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), las cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), las cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistema), las cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), las cadenas laterales beta- ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y las cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
En una modalidad de la invencion, dicho antfgeno tolerado normalmente en un sujeto sano es un antfgeno microbiano.
Un antfgeno microbiano incluye, pero no se limita a, un antfgeno derivado de un microorganismo tal como una bacteria, arqueobacteria, hongo, virus, protozoario, parasito, alga, moho mucilaginoso, o prion.
Los ejemplos de dichos microorganismos son Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Haemophilus influenza, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Moraxella catarrhalis, Mycobacteria, Salmonella, Vibrio, Streptomyces, Helicobacter, Lactococcus y Listeria.
Preferentemente, el antfgeno es un antfgeno microbiano derivado del grupo que comprende Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae y protemas de las bacterias comensales.
En una modalidad preferida de la invencion, dichas celulas Tr1 y MSC son autologas.
Esto significa que las MSC y las celulas Tr1 o precursores de estas se obtienen del mismo sujeto y se administraran al sujeto del que proceden.
Las MSC y las celulas Tr1 autologas permiten en primer lugar un injerto a largo plazo: no habra rechazo de las celulas ni
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respuestas alogenicas. En segundo lugar, en caso de que se necesite una presentacion de antfgenos por las MSC, el contexto autologo lo hace posible.
La presente invencion se refiere, ademas, a una composicion para el uso como se describio anteriormente, en donde las celulas Tr1 y MSC se envasan por separado para administrarse secuencialmente o simultaneamente. El termino secuencial, se refiere a que las MSC pueden inyectarse primero y las celulas Tr1 pueden inyectarse despues, preferentemente 24 a 48 horas despues de la inyeccion de las MSC.
Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo para inducir tolerancia inmunologica espedfica de un antigeno en un sujeto que padece de una enfermedad que implica una respuesta inmunologica mediada por celulas T, propia o no, que es excesiva, disfuncional o incontrolada, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de una composicion para el uso como se describio anteriormente.
Los vetuculos y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotonicas, por ejemplo solucion salina tamponada con fosfato. La composicion puede formularse para inyeccion parenteral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, inhalacion intranasal, inhalacion pulmonar, administracion intradermica, intraarticular, intratecal, o a traves del tracto digestivo.
Las composiciones para el uso de la invencion se administran tfpicamente al paciente por inyeccion intramuscular, intraperitoneal o intravenosa, o mediante inyeccion directa en los ganglios linfaticos del paciente, preferentemente mediante inyeccion intravenosa.
Tfpicamente, de 104 celulas/kg a 109 celulas/kg, preferentemente de 105 celulas/kg a 107 celulas/kg y con mayor preferencia aproximadamente 106 celulas/kg se administran al sujeto.
Las vfas de administracion y las dosificaciones descritas solo pretenden ser una grna ya que un practicante experto sera capaz de determinar facilmente la via de administracion y dosificacion optimas para cualquier sujeto particular, en dependencia de, por ejemplo, la edad, el peso y el estado del paciente.
En una modalidad preferida, dicha enfermedad que implica una respuesta inmunologica mediada por celulas T, propia o no, que es excesiva, disfuncional o incontrolada es una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad alergica o una enfermedad inflamatoria.
Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, diabetes, esclerosis multiple, y artritis reumatoide. Las afecciones particulares asociadas con las enfermedades autoinmunitarias que pueden tratarse, incluyen: tiroiditis autoinmunitaria (de Hashimoto), hipertiroidismo (enfermedad de Graves), diabetes mellitus tipo I, diabetes resistente a la insulina, insuficiencia suprarrenal autoinmunitaria (enfermedad de Addison), ovaritis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, anemia hemolftica autoinmunitaria, hemoglobinuria paroxfstica por frio, trombocitopenia autoinmunitaria, neutropenia autoinmunitaria, anemia perniciosa, eritroblastopenia, coagulopatfas autoinmunitarias, miastenia gravis, polineuritis autoinmunitaria, esclerosis multiple, penfigo y otras enfermedades ampollosas, carditis reumatica, smdrome de Goodpasture, smdrome poscardiotoirna, lupus eritematoso sistemico, artritis reumatoide, smdrome de Sjorgen, polimiositis, dermatomiositis, esclerodermia; enfermedades inflamatorias del intestino: enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa; enfermedades pulmonares obstructivas cronicas; enfermedades inflamatorias cronicas, enfermedad celfaca, enfermedad de Wegener, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmunitaria, espondiloartritis. Preferentemente, dicha enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que comprende la enfermedad de Wegener, la cirrosis biliar primaria, la colangitis esclerosante primaria, la enfermedad de Crohn, la artritis reumatoide, la esclerosis multiple y la diabetes resistente a la insulina.
Las enfermedades alergicas incluyen, pero no se limitan a, asma, rinitis, urticaria, dermatitis atopica, enfermedades fibroticas y alergia a los alimentos.
Los trastornos inflamatorios incluyen, pero no se limitan a enfermedades cardiovasculares, artritis reumatoide, esclerosis multiple, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso sistemico, polimiositis, choque septico, enfermedad de injerto contra huesped, enfermedad de huesped contra injerto, asma, rinitis, psoriasis, caquexia asociada con cancer, o eccema. Preferentemente, dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que comprende artritis reumatoide, esclerosis multiple, enfermedad de Crohn.
En una modalidad del metodo de la invencion, dichas celulas Tr1 espedficas de un antfgeno tolerado y dichas MSC se administran simultaneamente o secuencialmente.
El termino secuencial, se refiere a que las MSC pueden inyectarse primero y las celulas Tr1 pueden inyectarse despues, preferentemente 24 a 48 horas despues de la inyeccion de las MSC.
En otra modalidad del metodo de la invencion, la composicion para el uso de esta invencion puede administrarse en combinacion con las terapias tradicionales, o en otra modalidad, con dosificaciones reducidas de tales terapias tradicionales. Por ejemplo, la administracion de la composicion para el uso de esta invencion puede estar acompanada
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por la administracion de inmunosupresores, donde se reduce la dosificacion del inmunosupresor o el numero de inmunosupresores.
Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para promover la regeneracion de tejidos en un sujeto. En una modalidad, una cantidad eficaz de una composicion como se describio anteriormente se administra a dicho sujeto.
Los ejemplos de tejidos a tratar incluyen, pero no se limitan a, musculo, hueso y regeneracion del cartflago.
Los vetuculos y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotonicas, por ejemplo solucion salina tamponada con fosfato. La composicion puede formularse para inyeccion parenteral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, inhalacion intranasal, inhalacion pulmonar, administracion intradermica, intraarticular, intratecal, o a traves del tracto digestivo (por ejemplo a traves de las placas de Peyer). Preferentemente, el medicamento o composicion farmaceutica de la invencion puede administrarse directamente a un tejido degenerado.
Tfpicamente, de 104 celulas/kg a 109 celulas/kg, preferentemente de 105 celulas/kg a 107 celulas/kg y con mayor preferencia aproximadamente 106 celulas/kg se administran al sujeto.
Las vfas de administracion y las dosificaciones descritas solo pretenden ser una grna ya que un practicante experto sera capaz de determinar facilmente la via de administracion y la dosificacion optimas para cualquier sujeto particular, en dependencia de, por ejemplo, la edad, el peso y el estado del paciente, y el grado y la gravedad de la herida que se trata.
Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso en el tratamiento de la fibrosis en un sujeto. En una modalidad, una cantidad eficaz de una composicion como se describio anteriormente se administra a dicho sujeto.
Los ejemplos de fibrosis a tratar incluyen, pero no se limitan a, cirrosis del tugado, fibrosis de los rinones asociada con una enfermedad renal en etapa terminal, y fibrosis del pulmon.
Los vetuculos y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotonicas, por ejemplo solucion salina tamponada con fosfato. La composicion puede formularse para inyeccion parenteral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, inhalacion intranasal, inhalacion pulmonar, administracion intradermica, intraarticular, intratecal, o a traves del tracto digestivo.
Las composiciones para el uso de la invencion se administran tfpicamente al paciente por inyeccion intramuscular, intraperitoneal o intravenosa, o mediante inyeccion directa en los ganglios linfaticos del paciente, preferentemente mediante inyeccion intravenosa directa.
Tfpicamente, de 104 celulas/kg a 109 celulas/kg, preferentemente de 105 celulas/kg a 107 celulas/kg y con mayor preferencia aproximadamente 106 celulas/kg se administran al sujeto.
Las vfas de administracion y las dosificaciones descritas solo pretenden ser una grna ya que un practicante experto sera capaz de determinar facilmente la via de administracion y la dosificacion optimas para cualquier sujeto particular, en dependencia de, por ejemplo, la edad, el peso y el estado del sujeto, y el grado y la gravedad de la fibrosis que se trata.
Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso en promover la angiogenesis en un tejido u organo en un sujeto, en donde dicho tejido u organo tienen necesidad de angiogenesis. En una modalidad, una cantidad eficaz de una composicion como se describio anteriormente se administra a dicho sujeto.
La induccion de la angiogenesis puede usarse para tratar una insuficiencia arterial coronaria y periferica, y por lo tanto puede ser un enfoque no invasivo y curativo para el tratamiento de una enfermedad arterial coronaria, una cardiopatfa isquemica, y una enfermedad arterial periferica. La angiogenesis puede jugar un papel en el tratamiento de enfermedades y trastornos en tejidos y organos distintos del corazon, asf como en el desarrollo y/o mantenimiento de organos distintos del corazon. La angiogenesis puede proporcionar un papel en el tratamiento de heridas internas y externas, asf como ulceras dermicas. La angiogenesis es esencial, ademas, para el acoplamiento de la resorcion del cartflago con la formacion de hueso, y es esencial para la correcta morfogenesis de las placas de crecimiento. La angiogenesis tambien juega un papel en la implantacion del embrion, y el crecimiento de la placenta, asf como en el desarrollo de la vasculatura embrionaria.
Los vehfculos y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotonicas, por ejemplo solucion salina tamponada con fosfato. La composicion puede formularse para inyeccion parenteral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, inhalacion intranasal, inhalacion pulmonar, administracion intradermica, intraarticular, intratecal, o a traves del tracto digestivo.
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Las composiciones para el uso de la invencion se administran tipicamente al paciente por inyeccion intramuscular, intraperitoneal o intravenosa, o mediante inyeccion directa en los ganglios linfaticos del paciente, preferentemente mediante inyeccion intravenosa directa.
Tfpicamente, de 104 celulas/kg a 109 celulas/kg, preferentemente de 105 celulas/kg a 107 celulas/kg y con mayor preferencia aproximadamente 106 celulas/kg se administran al sujeto.
Las vfas de administracion y las dosificaciones descritas solo pretenden ser una gma ya que un practicante experto sera capaz de determinar facilmente la via de administracion y dosificacion optimas para cualquier sujeto particular, en dependencia de, por ejemplo, la edad, el peso y el estado del paciente.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1: deteccion de IFN-gamma producido por las celulas T activadas en presencia o ausencia de MSC y/o celulas Tr1.
La MLR se cultivo en el pocillo inferior de un sistema transwell solo o en presencia de MSC, Tr1 o MSC y Tr1 en el pocillo superior. El sobrenadante se recogio despues de 4 dfas y la secrecion de IFNy se midio por ELISA.
Figura 2: La coadministracion de las MSC mejora la eficacia de la terapia con celulas Tr1 en un modelo de colitis en ratones.
Los ratones Balb/c se trataron con DSS en el agua de beber durante 7 dfas; las celulas Tr1 y MSC se inyectaron por via intravenosa el primer dfa. La puntuacion clmica y el peso corporal se controlaron diariamente.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Preparacion de MSC
Las celulas madre mesenquimales se derivaron de la fraccion de estroma vascular del tejido adiposo de ratones Balb/c. El tejido adiposo se digirio con colagenasa al 0,1 % durante 30 minutos y se filtro a traves de una malla de 70 p. Las celulas adherentes se cultivaron en medio RPMI que contema FCS al l0 % y suero de caballo al 10% suplementado con glutamina y penicilina y estreptomicina. Con frecuencia, se controlo la capacidad de las celulas para diferenciarse tanto en linajes de adipocitos como de osteoblastos.
Preparacion de celulas Tr1
Las celulas Tr1 espedficas para la ovoalbumina se diferenciaron a partir de linfocitos T CD4+ vfrgenes de ratones transgenicos para TCR espedfico de la ovoalbumina DO11-10 despues de la activacion con el peptido de ovoalbumina 323-339 e IL-10 en la presencia de celulas presentadoras de antfgenos singenicas irradiadas. Las celulas se clonaron despues por dilucion limitante para obtener una poblacion monoclonal de celulas Tr1 espedficas para la ovoalbumina. Las celulas utilizadas en el experimento 1 y 2 se obtuvieron a partir del cultivo de un clon de Tr1.
Ensayo de activacion de las celulas T
La capacidad supresora de las celulas Tr1 y MSC se evaluo sobre la inhibicion de la MLR. Las MLR se establecieron en el pocillo inferior del sistema transwell con 106 celulas respondedoras (ratones Balb/c) y 106 esplenocitos irradiados de ratones C57 BL6. Las MSC (3x104 celulas) y las celulas Tr1 (105 celulas) se anadieron en el pocillo superior. Despues de 4 dfas, se recogio el sobrenadante de la MLR y la secrecion de IFN gamma se midio por ELISA.
Metodo para determinar la produccion de IFN gamma
La produccion de interferon gamma por los linfocitos T activados se evaluo por un ELISA disponible comercialmente adquirido de BD Biosciences.
Resultados observados (Figura 1)
Los resultados demuestran que tanto las MSC como las celulas Tr1 inhiben de manera independiente la activacion de las celulas T, lo que se midio por la disminucion del IFN gamma liberado por los linfocitos T proinflamatorios. El cocultivo de MSC y celulas Tr1 permite una mayor inhibicion en comparacion con las MSC o las celulas Tr1 solas, lo que muestra que los dos tipos de celulas exhiben un sinergismo de accion que conduce a una mayor inhibicion de la activacion de las celulas T y la liberacion de IFN gamma.
Ejemplo 2
Los ratones BALB/c se trataron con dextrano sulfato de sodio (DSS, 5 % en el agua de beber) para inducir una colitis aguda. Los grupos de ratones se dejaron sin tratar o se trataron por via intravenosa en el dfa 1 con 106 celulas Tr1 espedficas para la ovoalbumina con o sin MSC derivadas de tejido adiposo (0.5x106/raton). Despues de 7 d^as, los signos clmicos de los ratones se evaluaron en base a la siguiente puntuacion:
5
0- No hay signos clmicos
1- Perdida de peso
2- Perdida de peso + diarrea leve
3- Perdida de peso + diarrea severa
10 4- Perdida de peso + diarrea severa + sangre en las heces
Los resultados muestran que la coadministracion de MSC mejora la eficacia de la terapia con celulas Tr1 en este modelo de colitis (Figura 2).

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    Reivindicaciones
    1. Una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso como un medicamento.
  2. 2. Una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso como una composicion farmaceutica.
  3. 3. La composicion para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde las celulas Tr1 son espedficas para un antigeno tolerado normalmente en un sujeto sano.
  4. 4. La composicion para el uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde dicho antigeno tolerado normalmente en un sujeto sano es un alergeno, un autoantigeno, un antigeno de alimentos o un antigeno microbiano.
  5. 5. La composicion para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas el antigeno para el que las celulas Tr1 son espedficas.
  6. 6. La composicion para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales son autologas.
  7. 7. La composicion para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dichas celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales se envasan por separado para administrarse secuencialmente o simultaneamente.
  8. 8. Una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad alergica o una enfermedad inflamatoria.
  9. 9. La composicion para el uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde dicha enfermedad autoinmunitaria se selecciona del grupo que comprende la enfermedad de Wegener, la cirrosis biliar primaria, la colangitis esclerosante primaria, la enfermedad de Crohn, la artritis reumatoide, la esclerosis multiple y la diabetes resistente a la insulina.
  10. 10. La composicion para el uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que comprende artritis reumatoide, esclerosis multiple, enfermedad de Crohn, enfermedad de injerto contra huesped y enfermedad de huesped contra injerto.
  11. 11. La composicion para el uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde dicha enfermedad alergica se selecciona del grupo que comprende asma, rinitis, urticaria, dermatitis atopica, enfermedad fibrotica y alergia a los alimentos.
  12. 12. Una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso en la promocion de la regeneracion de tejidos.
  13. 13. Una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso en el tratamiento de fibrosis.
  14. 14. Una composicion que consiste en celulas Tr1 y celulas madre mesenquimales en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables para el uso en la promocion de la angiogenesis.
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