ES2595207T3 - Composición de vacuna para prevenir o tratar la leishmaniosis - Google Patents
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Abstract
Composición de vacuna para la prevención o el tratamiento de la leishmaniosis en un mamífero de la especie Canis lupus, caracterizada porque consiste en: - una cantidad de proteínas de excreción-secreción (ESPs) procedentes de promastigotes y/o amastigotes de Leishmania sp, producidas en un medio axénico y exento de suero, que comprende entre 80 y 140 μg por dosis de vacuna; - una cantidad de saponina QA21 purificada de 60 μg por dosis de vacuna; y - opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Description
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DESCRIPCION
Composicion de vacuna para prevenir o tratar la leishmaniosis
La presente invencion se refiere a una composicion de vacuna, a base de protemas de excrecion-secrecion procedentes de promastigotes y/o amastigotes de Leishmania sp., para la prevencion o el tratamiento de leishmaniosis en canidos.
Las leishmaniosis son infecciones parasitarias endemicas causadas por un protozoo flagelado de la familia Trypanosomidae y del genero Leishmania, transmitido por un flebotomo (para una revision, vease Chang, Leishmaniases, Encyclopedia of Life Sciences, 2005, John Wiley & Sons, Ltd.; Bates, Leishmania, Encyclopedia of Life Sciences, 2006, John Wiley & Sons, Ltd.). Una gran variedad de especies de mairnferos, incluyendo el ser humano y el perro, se infectan con este parasito. Los flebotomos hembra transmiten al hospedador marnffero, en el momento de la picadura, el parasito en su forma flagelada infecciosa, el promastigote metadclico. Los promastigotes metadclicos son fagocitados a continuacion por los macrofagos presentes en la dermis y se transforman en una forma no flagelada llamada amastigote.
Once especies de Leishmania, divididas en dos subgeneros, Leishmania Leishmania y Leishmania Viannia tienen importancia medica en los seres humanos. Cada especie de Leishmania es responsable de una manifestacion clmica bien definida: visceral, cutanea, cutanea difusa y mucocutanea, segun el parasito infecte fagocitos mononucleares de las vfsceras, de la dermis o de las mucosas.
La leishmaniosis es endemica en 88 pafses (entre ellos India, Bangladesh, Nepal, Sudan y Brasil), poniendo en peligro a 350 millones de personas. La leishmaniosis visceral, causada por Leishmania (L) donovani y Leishmania (L) infantum (o L. chagasi) afecta a 500.000 personas cada ano en todo el mundo. Representa la forma mas grave de leishmaniosis.
En las zonas afectadas por la leishmaniosis visceral debida a L. infantum, sobre todo en la region mediterranea, los perros, fuertemente infectados, representan un reservorio de parasitos para el ser humano.
En los seres humanos, las leishmaniosis se tratan principalmente con derivados de antimonio: antimoniato de meglumina (Glucantime®) y estibogluconato de sodio (Pentostam®). Sin embargo, en algunas regiones del mundo, el parasito se ha vuelto resistente al antimonio. Por lo que ahora se emplea la anfotericina B (AmBisome®) para el tratamiento de la leishmaniosis visceral o mucocutanea.
Sin embargo, actualmente no existe ninguna vacuna o medicamento profilactico para prevenir las leishmaniosis en el ser humano. De hecho, la puesta a punto de una composicion de vacuna sigue siendo problematica en la actualidad.
Se han propuesto varias composiciones de vacuna para proteger al ser humano y/o los perros de la leishmaniosis:
- una composicion de vacuna a base de una fraccion de membrana antigenica de Leishmania donovani (denominada antfgeno FML, «fucose mannose ligand») y un adyuvante tal como el alumbre (adyuvante a base de aluminio), FIA (adyuvante incompleto Freund), BCG (Bacillus Calmette Guerin), interleucina 12, mezclas de saponinas tales como saponina Riedel-de Haen R (Sigma-Aldrich) o Quil A (Brenntag) y la saponina purificada QS21 (para una revision, vease: Palatnik-de-Sousa et al., Expert. Rev. Vaccines, 2008. 7:833-851). La fraccion de membrana antigenica FML comprende una glicoprotema GP36 glicosilada, asf como varias protemas que no se han caracterizado todas.
- una composicion de vacuna a base de protemas de excrecion-secrecion procedentes de promastigotes y/o amastigotes de Leishmania sp. (ESPs) y de MDP (muramil dipeptido) como adyuvante que induce una respuesta inmune de tipo Th1 (Bourdoiseau et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 2009, 128:71-78; Lemesre et al., Vaccine, 2007, 25:4223-4234; Lemesre et al., Vaccine, 2005, 23:2825-2840; documentos de solicitudes internacionales n° WO 94/26899 y WO 2002/100430;
- una composicion de vacuna que comprende dos peptidos (A16E y A16G) procedentes de Leishmania y/o derivados de los mismos y un adyuvante tal como MDP (documento de solicitud internacional WO 03/025012) o QS21. Esta composicion, sin embargo, tiene la desventaja de inducir inmunidad dirigida contra un numero limitado de antfgenos;
- una composicion de vacuna a base de promastigotes de Leishmania braziliensis inactivados mediante ultrasonidos y la mezcla de saponinas de Riedel-de Haen R como adyuvante (Giunchetti et al., Vaccine, 2007, 25:7674-7686 y Giunchetti et al., Vaccine, 2008, 26:623-638; documento de solicitud de patente brasilena PI 0601225-6). Esta composicion presenta sin embargo el inconveniente de que contiene una mezcla de antfgenos no caracterizados que podnan plantear problemas de inocuidad y que algunos pueden inducir respuestas inmunes de tipo Th1 y otras de tipo Th2;
- una composicion de vacuna que comprende la protema A2 recombinante que proviene de la forma amastigote de Leishmania donovani y un adyuvante tal como la mezcla de saponinas de Riedel-de Haen R (Fernandes et al., Vaccine, 2008, 26:5888-5895, documento de solicitud internacional WO 2008/009088).
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En el perro, existen en la actualidad dos vacunas comercializadas en Brasil: una composicion de vacuna denominada Leishmune®, constituida por el antigeno FML, la mezcla de saponinas de Riedel-de Haen R y NaCl (documento de solicitud internacional n° WO 2006/122382; Palatnik de Sousa et al., 2008, antes citado), y una composicion de vacuna denominada LeishTec®, constituida por el antfgeno A2 y una mezcla de saponinas.
Esta claro a partir de numerosos estudios sobre la respuesta inmune de los hospedadores (especialmente en el perro) durante la infeccion con Leishmania, que la eficacia de un candidato potencial de vacuna se debe traducir en la activacion en el hospedador de una respuesta inmune de tipo Th1 con produccion de interferon gamma (Barbieri, Parasite Immunol., 2006, 28:329-337, revision; Alvar et al., Adv. Parasitol., 2004, 57:1-88; Ravindran et Ali, Curr. Mol. Med., 2004, 4:697-709 y Gradoni, Vet. Parasitol., 2001, 100:87-103). Muchos adyuvantes, tales como la saponina purificada QS21, son capaces de estimular una respuesta inmune de tipo Th1.
Las saponinas de tipo Quillaja son una mezcla de glicosidos de triterpenos extrafdos de la corteza del arbol Quillaja saponaria. Estos son productos naturales que se caracterizan por una serie de propiedades comunes, incluyendo la capacidad de producir espuma en solucion acuosa. Otras caractensticas complementarias son la actividad hemolftica, la toxicidad para los peces, la formacion de complejos con el colesterol y, en algunos casos, una actividad antibiotica. (Kofier, Die Saponine (Springer verlag), Berlin, 1927; Tschesche et al., Chemie und Biologie der Saponine. Fortscher. 30 Chem. Org. Naturst. XXX'Abl (1972)).
Las mezclas de saponinas de Quillaja disponibles en el mercado son mezclas en bruto que, debido a su variabilidad y a su falta de caracterizacion completa, no son deseables para un uso en la practica veterinaria o en composiciones farmaceuticas para el hombre. Las impurezas presentes en los productos disponibles en el mercado pueden causar reacciones adversas. Ademas, el contenido en sustancia activa de un lote a otro de mezclas de saponinas puede variar, disminuyendo de ese modo la reproducibilidad.
Se han identificado adyuvantes de saponina y se han purificado por cromatograffa lfquida de alta presion (HPLC). El metodo de produccion de estas fracciones purificadas se describe en el documento de patente US 5.057.540.
Entre ellas, la saponina QA21 (o QA-21) sustancialmente pura, se caracteriza por las siguientes propiedades:
- actividad adyuvante inmune,
- contiene aproximadamente 22% de hidratos de carbono (analizado por antrona) en peso seco,
- tiene un maximo de absorcion UV a 205-210 nm,
- tiene un tiempo de retencion de aproximadamente 51 minutos por RP-HPLC en una columna Vydac C4 que tiene partfculas de 5 pm, poros de 330 A, un diametro interno de 4,6 mm y una longitud de 25 cm en un disolvente de acido acetico 40 mM en metanol:agua (58:42; v:v) con un caudal de 1 ml por minuto,
- se eluye con metanol al 69-70% de una columna Vydac C4 que tiene partfculas de 5 pm, poros de 330 A, un diametro interno de 10 mm y una longitud de 25 cm en un disolvente de acido acetico 40 mM con un gradiente de elucion de 50 a 80% de metanol,
- tiene una concentracion micelar cntica de 0,03% (p:v) en agua y de 0,02% (p:v) en solucion salina tamponada con fosfato,
- causa hemolisis de los globulos rojos de oveja a concentraciones de 25 pg por ml o superiores, y
- contiene los monosacaridos ramnosa terminal, arabinosa terminal, apiosa terminal, xilosa terminal, 4-ramnosa, glucosa terminal, galactosa terminal, 2-fucosa, 3-xilosa, 3,4-ramnosa y acido 2,3-glucuronico.
La expresion "sustancialmente puro" significa sustancialmente exento de compuestos asociados normalmente a la saponina en su estado natural y que provocan una respuesta cromatografica, perfiles de elucion y una actividad biologica constantes y reproducibles.
La saponina QA21 sustancialmente pura, descrita anteriormente tambien se denomina QS21 (o QS-21) (para una revision, vease, Kensil et al., Pharm. Biotechnol., 1995, 6:525-541; Kensil y Kammer, Expert Opin. Investig. Drugs., 1998, 7:1475-1482 y Soltysik et al., Vaccine, 1995, 13:1403-10). QS21 es una molecula anfipatica (soluble en agua), que tiene una masa molar de 1988 g/mol. Su formula desarrollada se muestra en la Figura 1. Un procedimiento para la obtencion de QS21 se describe en el documento de patente US 5.057.540. Sin embargo, QS21 tambien se puede purificar a partir de mezclas de saponinas tales como saponina de Riedel-de Haen R o Quil A. Se ha evaluado la eficacia de QS21 en inmunologfa humana y veterinaria, en su forma pura, para el tratamiento de canceres, SIDA o la malaria o la leucemia felina (vacuna Leucogen® - Virbac). En las mezclas de saponinas de Riedel-de Haen R y Quil A, QS21 representana la fraccion de saponina mayoritaria, respectivamente, en torno al 18% y 40-50% (Palatnik-de- Sousa et al., 2008, citado anteriormente y Parra et al., Vaccine, 2007, 25:2180-2186). La proporcion en QS21 en las mezclas de saponinas de Riedel-de Haen R y Quil A vana, sin embargo, en funcion de las publicaciones: por ejemplo, en la mezcla Quil A, de acuerdo con Kensil et al. (J. Immunol., 1991, 146:431-437), QS21 no representa la fraccion de saponina mayoritaria mientras que segun otras publicaciones de los mismos autores, representana el
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40% (Parra et al., 2007, citado anteriormente) o el 49% (Santos et al., 2002, Vaccine, 21, 30-43) de la mezcla. Esta variabilidad en cantidad de QS21 puede enfatizar una baja reproducibilidad de la produccion de estas mezclas de saponinas. QS21 induce una buena respuesta inmune de tipo Th1, pero tiene sin embargo varios efectos secundarios, entre los que se pueden citar: edemas a nivel del sitio de inyeccion debido a una fuerte respuesta inflamatoria local, dolor local, anorexia, apatia, vomitos y diarrea. Por tanto estos efectos secundarios limitan su uso. Una solucion propuesta para remediar estos inconvenientes consiste en asociar QS21 con compuestos que reducen sus efectos secundarios, tales como, por ejemplo, un esterol (documento de solicitud Internacional WO 96/33739).
Los inventores tienen como objeto proporcionar una nueva composicion de vacuna para la prevencion o el tratamiento de la leishmaniosis que proteja de forma duradera a los mairnferos contra estas enfermedades, que responda mejor a las necesidades de la puesta en practica que las composiciones de vacuna previamente propuestas y que no cause apenas o ningun efecto secundario.
La presente invencion tiene como objeto en consecuencia una composicion de vacuna para la prevencion o el tratamiento de la leishmaniosis, tal como se define en las reivindicaciones.
Se entiende por «prevencion de la leishmaniosis», la induccion de una proteccion o de una respuesta inmune contra las infecciones por Leishmania.
Se entiende por «tratamiento de la leishmaniosis», la disminucion de los smtomas de la leishmaniosis o la disminucion o la supresion de las Leishmania en el mam^era infectado.
Dichas protemas de excrecion-secrecion (ESPs) son susceptibles de ser obtenidas poniendo en practica los procedimientos descritos en los documentos de solicitudes internacionales WO 94/26899 y WO 2002/100430.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dichas protemas de excrecion-secrecion proceden de promastigotes y/o amastigotes, preferentemente solamente promastigotes, de Leishmania (L) infantum.
La cantidad de saponina QA21 sustancialmente pura en dicha composicion de vacuna es de 60 pg/dosis de vacuna.
Se entiende por "dosis de vacuna", el volumen de la composicion de vacuna de acuerdo con la presente invencion administrado a un mai^ero. La dosis de la vacuna vana dependiendo del tamano del marnffero al que se administra la composicion de vacuna. Esta dosis es generalmente de 0,1 a 5 mL. Preferiblemente, la dosis de vacuna es de 1 mL.
Sorprendentemente, los inventores han mostrado que una dosis de QA21 de 60 pg por dosis de vacuna tema la mejor relacion eficacia/inocuidad para los perros tratados. De hecho, las reacciones (efectos secundarios) generales de los animales vacunados con esta dosis eran inexistentes y las reacciones locales debiles. Ademas, a esta dosis, se conservaba la respuesta humoral (cinetica y tftulo) en comparacion con las dosis mas elevadas. Ademas, no es necesario asociar QA21 a compuestos tales como esteroles como se recomienda en la tecnica anterior, para reducir sus efectos secundarios, o utilizarlos en mezclas de saponinas tales como saponina de Riedel de Haen R o Quil A, por lo que la fabricacion de una composicion de vacuna es mas simple y contiene un adyuvante caracterizado, definido y reproducible, por lo que se puede controlar mejor, e induce una relacion actividad/inocuidad constante en el tiempo.
De acuerdo con una realizacion ventajosa de la invencion, la cantidad de ESPs en dicha composicion de vacuna es de 80 a 140 pg por dosis de vacuna, especialmente de 90 a 130 pg por dosis de vacuna y mas preferiblemente de 110 pg por dosis de vacuna.
De acuerdo con otra realizacion de la invencion, la saponina QA21 sustancialmente pura es el unico adyuvante saponina de la composicion.
De acuerdo con una realizacion aun mas ventajosa, la saponina QA21 sustancialmente pura es el unico adyuvante de la composicion. (Ningun otro elemento de la composicion puede potenciar los antfgenos).
El excipiente farmaceuticamente aceptable puede ser cualquier excipiente conocido por el experto en la materia. Preferiblemente, comprende o consiste en uno o varios de los compuestos seleccionados entre el grupo que consiste en cloruro de sodio (NaCl), agentes de liofilizacion tales como manitol y sacarosa, tampones tales como Tris (trishidroximetilaminometano), conservantes o estabilizantes.
De acuerdo con la invencion, la composicion de vacuna esta destinada a la prevencion o al tratamiento de la leishmaniosis en un mamffero de la especie Canis lupus (el perro).
De acuerdo con otra realizacion ventajosa de la invencion, dicha composicion de vacuna esta destinada a la prevencion o al tratamiento de la leishmaniosis visceral, especialmente la causada por Leishmania (L) infantum, Leishmania (L) chagasi y Leishmania (L) donovani.
De acuerdo con esta realizacion, dicha composicion de vacuna puede estar en forma liofilizada.
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La presente invencion tambien tiene por objeto un metodo para preparar una composicion de vacuna para la prevencion o el tratamiento de la leishmaniosis en un mai^ero, tal como se define en las reivindicaciones.
De acuerdo con el procedimiento de la invencion, la cantidad de saponina QA21 sustancialmente pura en dicha composicion es de 60 pg/dosis de vacuna, y la cantidad de ESPs es de 80 hasta 140 pg/dosis de vacuna, mas preferiblemente aun de 90 a 130 pg/dosis de vacuna y lo mas preferiblemente de 110 pg/dosis de vacuna.
Tambien se describe un kit que comprende al menos una dosis inyectable de una composicion de vacuna de acuerdo con la presente invencion.
Tambien se describe un metodo para tratar o prevenir la leishmaniosis en un mamftero, que comprende administrar a dicho mamfero una composicion de vacuna tal y como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, la administracion de la composicion de vacuna se efectua mediante inyeccion subcutanea.
Ademas de las disposiciones anteriores, la invencion comprende tambien otras disposiciones que surgiran de la siguiente descripcion que se refiere a ejemplos de aplicacion de la composicion de vacuna objeto de la presente invencion, asf como a los dibujos que se acompanan, en los cuales:
- La Figura 1 muestra la formula desarrollada de QS21;
- La Figura 2 es un grafico que muestra los tftulos medios (en log10) de IgG1 anti-ESPs en funcion del tiempo para cada grupo de perros vacunados con 110 pg/dosis de protemas de excrecion-secrecion procedentes de promastigotes de L. infantum (ESPs) y como adyuvante un cantidad de QA21 respectivamente de 500 pg/dosis, (composicion de vacuna LSH303), 250 pg/dosis (composicion de vacuna LSH304), 125 pg/dosis (composicion de vacuna LSH305) y 60 pg/dosis (composicion de vacuna LSH306);
- La Figura 3 es un grafico que representa los tftulos medios (en log10) de IgG2 anti-ESPs en funcion del tiempo para cada grupo de perros vacunados con la composicion de vacuna LSH303, LSH304, LSH305 o LSH306;
- La Figura 4 es un grafico que representa los tftulos (en log10) de IgG1 anti-ESPs en funcion del tiempo en los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304 (Figura 4A) y en los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH306 (Figura 4B);
- La Figura 5 es un grafico que representa los tftulos (en log10) de IgG2 anti-ESPs en funcion del tiempo en los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304 (Figura 5A) y en los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH306 (Figura 5B);
- La Figura 6 es un grafico que representa, en funcion del tiempo, la actividad leishmanicida (porcentaje de amastigotes de L. infantum destruidos) de macrofagos de los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304 (Figura 6A) y los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH306 (Figura 6B);
- La Figura 7 es un grafico que representa la produccion de NO (nmol/105 celulas/72 h) en funcion del tiempo en los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304 (Figura 7A) y en los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH306 (Figura 7B);
- La Figura 8 es un grafico que representa la cantidad (en porcentaje) de la enzima NO-sintasa inducible en el material sobrenadante de cocultivos de macrofagos y linfocitos autologos procedentes de los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304 (Figura 8A) o los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH306 (Figura 8B).
EJEMPLO 1: Estudio de la inocuidad y la eficacia en el perro, de 3 inyecciones de una composicion de vacuna que comprende las ESPs de L. infantum y QA21.
El objeto de este estudio era someter a ensayo diferentes concentraciones de QA21 en una composicion de vacuna que comprendfa ESPs de promastigotes de L. infantum y QA21 como unico adyuvante para determinar la mejor relacion eficacia/inocuidad.
1.1. Materiales y Metodos
Obtencion de las ESPs
Las protemas de excrecion-secrecion (ESPs) procedentes de promastigotes de Leishmania infantum producidas en un medio axenico y exento de suero se obtuvieron de acuerdo con el metodo descrito en los documentos de solicitudes internacionales WO 2002/100430 y WO 94/26899, empleando medios y parametros de cultivo adaptados a una produccion industrial.
Composiciones de vacuna
Se prepararon las composiciones de vacuna constituidas por 110 pg/dosis de protemas de excrecion-secrecion
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(ESPs) procedentes de promastigotes de Leishmania infantum, producidas en un medio axenico y exento de suero, por cantidades decrecientes de QA21: 500 pg/dosis (composicion de vacuna LSH303), 250 pg/dosis (composicion de vacuna LSH304), 125 pg/dosis (composicion de vacuna LSH305) y 60 pg/dosis (composicion de vacuna LSH306), y por un excipiente farmaceuticamente aceptable (excipiente TRlS manitol sacarosa y NaCI).
Perros: 9 perros de raza beagle con una edad minima de 6 meses, vacunados convencionalmente y desparasitados una semana antes de la primera vacunacion con la composicion de vacuna a base de ESPs y QA21.
Protocolo de vacunacion
2 perros recibieron cada uno 3 inyecciones de la composicion de vacuna LSH303 con 4 semanas de intervalo, el D0, 27 y 55;
2 perros recibieron cada uno 3 inyecciones de la composicion de vacuna LSH304 con 4 semanas de intervalo, el D0, 27 y 55;
2 perros recibieron cada uno 3 inyecciones de la composicion de vacuna LSH305 con 4 semanas de intervalo, el D0, 27 y 55;
3 perros recibieron cada uno 3 inyecciones de la composicion de vacuna LSH306 con 4 semanas de intervalo, el D0, 27 y 55.
Las vacunaciones se realizaron por via subcutanea.
Criterios de evaluacion de la respuesta inmune
(i) Seguimiento clmico local y general: un seguimiento clmico local y general (incluyendo la medicion de la temperatura rectal y el peso) se realizo cada dfa de vacunacion, y 1 y 3 dfas despues de cada vacunacion. En caso de que los signos clmicos persistieran 3 dfas despues de la vacunacion, este seguimiento se llevo a cabo 2 veces a la semana hasta la desaparicion completa de los smtomas. Un examen clmico completo, que consistfa en verificar el estado general de los perros, y que inclma, entre otros, la medicion de la temperatura rectal y el peso, se llevo a cabo una vez por semana.
(ii) Analisis serologico:
Las muestras de sangre se tomaron periodicamente para medir la respuesta serologica de los perros. La dosificacion de los anticuerpos IgG1 e IgG2 anti-ESPs en el suero de los perros vacunados, se realizo utilizando el metodo ELISA (“Enzyme Link Immunosorbent Assay”), con los anticuerpos de cabra anti-IgG1 de perro marcados con peroxidasa (Ref. del laboratorio Bethyl A40-120P) y los anticuerpos de oveja anti-IgG2 de perro marcados con peroxidasa (Ref. del laboratorio Bethyl A40-121P). La evaluacion de la respuesta de IgG1 e IgG2 contra las ESPs se realizo utilizando una transferencia Western.
1.2. Resultados
Examen clmico general
- Para el grupo de perros que habfa recibido la composicion de vacuna LSH303: se observo un pico de hipertermia despues de la 2a vacunacion (39,7°C y 40,8°C), y para uno entre ellos tambien despues de la 3a inmunizacion (39,7°C). Estos perros no mostraron ningun smtoma de orden general. Las perdidas de peso observadas en este grupo nunca excedieron el 3% y son compatibles con los valores observados en los otros 3 grupos.
- Para los grupos de perros que habfan recibido la composicion de vacuna LSH304, LSH305 o LSH306: no se observo ningun signo general despues de la vacunacion. Las variaciones transitorias y puntuales de ganancia de peso observadas en estos grupos son compatibles con la curva de crecimiento de los perros a esa edad y no estaban relacionadas con la vacunacion. Se observaron a veces pequenos incrementos en la temperatura rectal, 24 horas despues de la inyeccion de la vacuna en los grupos que habfan recibido la composicion LSH304 o LSH306, pero no eran significativos.
Examen clmico local
- Para el grupo de perros que habfa recibido la composicion de vacuna LSH303: se observaron reacciones locales graves 24 horas despues de la vacunacion, en donde habfa tumefacciones de mas de 2 cm de diametro, dolor regular en el punto de la inyeccion (simple sensibilidad despues de una palpacion o dolor persistente) y casos de edema de gran superficie. Estos signos para el dolor desaparecieron en un maximo de 7 dfas despues de la inyeccion de la composicion de vacuna, un maximo de 6 dfas para el edema y un maximo de 17 dfas para la inflamacion.
- Para el grupo de perros que habfa recibido la composicion de vacuna LSH304: las reacciones locales que se observaron 24 horas despues de la vacunacion eran tumefacciones entre 1 y 2 cm de diametro, y sensibilidad en el
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punto de la inyeccion de la 2a vacunacion (2 perros) y de la 3a vacunacion (1 perro). Se observo un ligero prurito (menos de 1 minuto) inmediatamente despues de la 3a inmunizacion (1 perro). Se observaron edemas de moderados (localizados) a graves (grandes superficies), respectivamente, a nivel de la 2a y la 3a inyeccion. Estos signos para el dolor desaparecieron en un maximo de 3 dfas despues de las inyecciones, en un maximo de 6 dfas para el edema y en un maximo de 17 dfas para la inflamacion.
- Para el grupo de perros que habfa recibido la composicion de vacuna LSH305: las reacciones locales observadas 24 horas despues de la vacunacion eran similares en intensidad a las observadas para el grupo de perros que habfa recibido la composicion de vacuna LSH304, con tumefacciones entre 1 y 2 cm de diametro, y sensibilidad a nivel del sitio de la inyeccion de la 2a vacunacion (1 perro). Se observaron tambien edemas de moderados (localizados) a graves (grandes superficies), a nivel del punto de la 3a inyeccion. Estos signos para el dolor desaparecieron en un maximo de 3 dfas despues de las inyecciones, en un maximo de 6 dfas para el edema y en un maximo de 17 dfas para la inflamacion.
- Para el grupo de perros que habfa recibido la composicion de vacuna LSH306: los signos clrnicos permanecieron leves y estaban limitados a 2 casos de prurito leve (menos de 1 minuto) observado inmediatamente despues de la 3a inyeccion. Se observo una tumefaccion de hasta 1-2 cm de diametro, 24 horas despues de la 1a y la 2a vacunacion en todos los perros. Esta tumefaccion desaparecio en un maximo de 13 dfas despues de la inyeccion. Solamente un perro mostraba tambien una tumefaccion 24 horas despues de la 3a vacunacion, que desaparecio 6 dfas despues de la inyeccion.
Seguimiento serologico
El resultado de la dosificacion de los anticuerpos IgG1 e IgG2 anti-ESPs se presenta en las Figuras 2 y 3 respectivamente.
La evolucion de los tftulos medios de IgG1 e IgG2 anti-ESPs era similar para los grupos de perros que habfan recibido la composicion de vacuna LSH303 o LSH304:
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- las IgG1 lograron un tftulo medio de 10 , y 10 , (tftulo en log10) dos semanas despues de la ultima inyeccion, respectivamente en el grupo que habfa recibido la composicion de vacuna LSH303 y en el grupo que habfa recibido la composicion de vacuna LSH304;
- las IgG2 lograron un tftulo medio de 103,13 (tftulo en log10) dos semanas despues de la ultima inyeccion en ambos grupos.
La evolucion de los tftulos medios de IgG1 e IgG2 anti-ESPs era menor para los grupos de perros que habfan recibido la composicion de vacuna LSH305 o LSH306:
- las IgG1 lograron un tftulo medio de 102,42 y 101,04 (tftulo en log10) dos semanas despues de la ultima inyeccion, respectivamente en el grupo que habfa recibido la composicion de vacuna LSH305 y en el grupo que habfa recibido la composicion de vacuna LSH306;
- las IgG2 lograron un tftulo medio de 10 ' y 10 ' (tftulo en log10) dos semanas despues de la ultima inyeccion, respectivamente en el grupo que habfa recibido la composicion de vacuna LSH305 y en el grupo que habfa recibido la composicion de vacuna LSH306.
La disminucion de la respuesta serologica observada con las concentraciones mas bajas de adyuvante, es mas importante con el isotipo IgG1.
Por ultimo, no se observo ningun aumento significativo de la respuesta serologica despues de la segunda inyeccion, independientemente de la composicion de vacuna que se utilizara.
La respuesta espedfica de IgG1 e IgG2 contra las ESPs analizada por transferencia Western, revelo una seroconversion del 100% en los 4 grupos de perros.
Conclusion
La inocuidad general de una composicion de vacuna de acuerdo con la presente invencion formulada con 60 pg/dosis de QA21, es buena. En cambio, se observo edema y dolor con las composiciones de vacuna formuladas con 500, 250 y 125 pg/dosis de QA21.
Los datos sobre la inocuidad local estan a favor de una cantidad de 60 pg/dosis de QA21; cantidad para la que solo se observa una ligera tumefaccion que dura menos de 13 dfas.
El seguimiento serologico muestra una conservacion de los anticuerpos IgG2 anti-ESPs y una disminucion de los anticuerpos IgG1 anti-ESPs para las concentraciones mas bajas de qA21: 60 y 125 pg/dosis.
Una dosis de 60 pg de QA21 induce por tanto reacciones locales muy moderadas, mientras que se conserva una
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respuesta humoral elevada y por consiguiente tiene la mejor relacion eficacia/inocuidad para los perros tratados.
EJEMPLO 2: Estudio de la inocuidad y la eficacia en el perro de dos inyecciones de una vacuna compuesta por ESPs de L. infantum y QA21 como adyuvante; analisis de la respuesta inmune
El proposito de este estudio era comparar la eficacia y la inocuidad de dos formulaciones de vacuna basadas en ESPs de promastigotes de L. infantum y que conteman diferentes cantidades de QA21 (60 pg/dosis o 250 pg/dosis). La eficacia se estudio mediante el analisis de la respuesta inmune humoral y celular. La inocuidad se estudio mediante una evaluacion de las reacciones locales y generales.
2.1. Materiales y Metodos
Composiciones de vacuna: LSH304 y LSH306 (vease el Ejemplo 4.1).
Perros: 6 perros SPF de mas de 21 semanas de edad.
Protocolo de vacunacion:
2 perros recibieron cada uno 2 inyecciones de la composicion de vacuna LSH304 con intervalos de 4 semanas, el D0 y el D28;
2 perros recibieron cada uno 2 inyecciones de la composicion de vacuna LSH306 con intervalos de 4 semanas, el D0 y el D28;
2 perros no estaban vacunados.
Las vacunaciones se llevaron a cabo por via subcutanea.
Preparacion de leishmanina
Una cepa de Leishmania infantum se descongelo el D0 y se cultivo. Despues de 5 a 6 dfas de cultivo, se realizo una amplificacion mediante el aumento del volumen de cultivo. Los parasitos se mantuvieron en cultivo hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento. Los parasitos se recogieron a continuacion, la suspension se lavo tres veces con PBS. Los parasitos se lisaron mediante 3 ciclos de congelacion/descongelacion. La leishmanina obtenida de este modo, se almaceno a <-70°C.
Prueba de DTH
La prueba de DTH cutanea (Delayed Type Hypersensibility), bien conocida por el experto en la materia, permite determinar si una respuesta mediada por celulas es de tipo Th1 o Th2 (Black C.A., Dermatol. Online J., 1999, 5:7.
Http://dermatology.cdlib.org/DOJvol5numl/reviews/black.html; Kid P., Alternative Medicine Review, 2003; 8:223-246).
Http://dermatology.cdlib.org/DOJvol5numl/reviews/black.html; Kid P., Alternative Medicine Review, 2003; 8:223-246).
Cuatro semanas despues de la ultima inyeccion (D56), cada perro recibio por via intradermica 0,1 ml de leishmanina en el lado derecho del hocico y 0,1 ml de solucion de control (0,9% de NaCl y 0,4% de fenol) en el lado izquierdo del hocico.
Evaluacion de la actividad leishmanicida:
Se obtuvieron celulas mononucleares de sangre periferica o PBMC por centrifugacion en un gradiente de Ficoll y despues los monocitos se separaron de la poblacion de linfocitos mediante adherencia a plastico, y cada poblacion se incubo a 37°C para permitir que los monocitos se convirtieran en macrofagos maduros. Los macrofagos obtenidos de este modo se infectaron despues con parasitos de Leishmania. Despues de la incubacion, el exceso de parasitos se elimino y despues los macrofagos se incubaron durante 24 h en medio completo. Los linfocitos autologos se anadieron despues a la mitad de los pocillos para evaluar la capacidad de los macrofagos para destruir los parasitos despues de la activacion por los linfocitos. Los pocillos sin celulas sernan de control de la multiplicacion del parasito. Despues de 72 horas, se recupero el material sobrenadante de los cultivos y se conservo, los linfocitos se eliminaron y los macrofagos se fijaron en los pocillos con metanol. Una parte de los macrofagos se tino con Giemsa y se evaluo el porcentaje de inhibicion del mdice parasitario. La otra parte de los macrofagos se utilizo para la deteccion de la NO sintasa inducible (iNOS), utilizando anticuerpos espedficos y/o mediante inmunotincion con la tecnica de complejo avidina-biotina/peroxidasa. La produccion de NO2 (implicada en la cascada de NO) se evaluo en el material sobrenadante de los cultivos, con ayuda de la tecnica de referencia de Griess modificada
Criterios para la evaluacion de la respuesta inmune:
Durante la «fase de vacunacion»: se evaluaron las reacciones generales y locales a partir de D0 a D4 y de D28 a D32, como se describe en el Ejemplo 4.1; el analisis serologico se llevo a cabo como se describe en el Ejemplo 4.1; la actividad leishmanicida de los macrofagos se midio; se hizo un recuento de los linfocitos T CD4+CD5+ y CD8+CD5+ y de los linfocitos B por un metodo de citometna de flujo.
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Durante la «fase DTH» (despues de la inyeccion de leishmanina): la reaccion general fue evaluada todos los d^as desde el D56 al D63; las reacciones locales se midieron todos los dfas con un calibrador pie de rey; el analisis serologico se llevo a cabo por el metodo ELISA y transferencia Western como se describe en el Ejemplo 4.1; la actividad leishmanicida de los macrofagos se midio; se hizo un recuento de los linfocitos T CD4+CD5+ y cD8+CD5+ y de los linfocitos B.
2.2. Resultados
2.2.1 Resultados durante la «fase de vacunacion»
Examen clrnico general,
Uno de los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304 (que contema una dosis de 250 |jg de QA21) padecio hipertermia durante un dfa, asociada con una depresion durante 2 d^as despues de la 1a vacunacion. Los dos perros mostraron una hipertrofia de los ganglios linfaticos poplfteos y subcapsulares despues de la 2a vacunacion; esta hipertrofia desaparecio en 4 dfas. Los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH306 (que contema una dosis de 60 jg de QA21) solamente mostraron una ligera hipertrofia de los ganglios linfaticos poplfteos y subcapsulares despues de la 2a vacunacion, que desaparecio en 4 dfas. Todos los animales mostraron una ganancia de peso de 15% y 37% entre el D0 y el D156.
Examen clrnico local
Se observaron reacciones locales de diferentes intensidades en los dos grupos de perros vacunados:
- en el grupo de perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304: Observacion de un edema de 3 a 4 cm de diametro asociado con dolor despues de la 1a vacunacion. Para uno de los dos perros, el edema evoluciono a un nodulo (1 cm) que desaparecio en 16 dfas. Observacion de un edema cardiogenico grave de 5 a 10 cm de diametro despues de la 2a vacunacion, que desaparecio en 4 dfas.
- en el grupo de perros vacunados con la composicion de vacuna LSH306: Observacion de una tumefaccion de menos de 1,5 cm de diametro despues de la 1a vacunacion, que desaparecio despues de un dfa. Para uno de los dos perros, observacion de un edema cardiogenico de 3 a 5 cm de diametro despues de 2a vacunacion, que desaparecieron en 3 dfas.
Analisis serologico
Todos los perros eran seronegativos para los anticuerpos anti-ESPs antes de la 1a vacunacion.
Los perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304 presentaban tftulos elevados de anticuerpo IgG1 e IgG2 anti-ESPs (veanse las Figuras 4A y 4B). La seroconversion de IgG1 e IgG2 se produjo a partir de la 1a vacunacion.
Los perros vacunados con la composicion de vacuna LSH306 teman tftulos mas bajos de anticuerpos IgG1 e IgG2 anti-ESPs (vease la Figura 5A y 5B). Para uno de los dos perros, la seroconversion en IgG2 se produjo a partir de la 1a vacunacion, mientras que la seroconversion en IgG1 aparecio despues de la 2a vacunacion. Para el otro perro, la seroconversion para los dos serotipos se produjo despues de la 1a vacunacion.
Las Figuras 4 y 5 tambien muestran que los tftulos de los anticuerpos IgG1 e IgG2 se correlacionan con la dosis del adyuvante en la composicion de vacuna.
Para los dos grupos de perros, los anticuerpos IgG2 dirigidos contra las ESPs, reveladas por el metodo de transferencia Western, aparecieron a partir de la 1a vacunacion, mientras que los anticuerpos IgG1 aparecieron a partir de la 2a vacunacion.
Actividad leishmanicida de los macrofagos
Todos los perros eran negativos para la actividad leishmanicida de los macrofagos antes de la 1a vacunacion. Los macrofagos de los perros de los dos grupos vacunados eran capaces de destruir los amastigotes de L. infantum despues de la 2a vacunacion, cuando se cocultivaron con linfocitos autologos. El nivel de actividad leishmanicida de los macrofagos era similar en los dos grupos vacunados (Figuras 6A y 6B). Sin embargo, no se midio ninguna actividad leishmanicida en los macrofagos de los perros en el grupo de control durante el estudio.
Para determinar si el oxido de nitrogeno (NO) desempenaba un papel en la muerte de la forma amastigote de L. infantum despues de haber sido puesto en contacto con los macrofagos de los perros vacunados, la produccion de NO y la presencia de la enzima No sintasa inducible (iNOS) se midieron en el material sobrenadante de las celulas (macrofagos y linfocitos) cocultivadas.
Los resultados se muestran en las Figuras 7 y 8. Solamente los cocultivos de las celulas de los perros vacunados mostraron una mejora en la produccion de NO. Este aumento se correlaciona con un aumento de la concentracion
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de la enzima NO sintasa inducible (iNOS).
Recuento de los linfocitos T CD4+CD5+ y CD8+CD5+, y de linfocitos B
El numero de linfocitos T auxiliares (CD4+CD5+), de linfocitos T citotoxicos (CD8+CD5+) y de linfocitos B (celulas CD21) se evaluo antes y despues de la vacunacion mediante citometna. El numero de celulas sangumeas, celulas citotoxicas y linfocitos B se mantuvo estable para todos los animales (vacunados y no vacunados) durante el estudio. Uno de los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304 y los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH306, mostraron un ligero aumento, pero no significativo en el numero de linfocitos T auxiliares despues de la 2a vacunacion.
2.2.2 Resultados durante la «fase DTH»
Examen clmico general
No se observo ninguna reaccion general despues de la inyeccion de leishmanina en los perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304 o LSH306. Todos los animales continuaron ganando peso (entre + 4% y + 7% del peso corporal) entre el D56 y el D63.
Examen clmico local
Los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304 presentaban, en el punto de la inyeccion de leishmanina, una induracion asociada con dolor y prurito, que desaparecio en 4 dfas.
Los dos perros vacunados con la composicion de vacuna LSH306 presentaban, en el punto de la inyeccion de leishmanina, una induracion sin dolor y prurito, que desaparecio en 4 dfas.
En contraste, ninguno de los perros vacunados mostro una reaccion local a nivel del punto de la inyeccion de la solucion de control. Ademas, los 2 perros del grupo de control solo mostraron un eritema a nivel del punto de inyeccion de la leishmanina.
Las reacciones leves observadas en el grupo de control son la consecuencia normal de una inyeccion intradermica de 100 |jl de una solucion de antfgenos, mientras que las reacciones graves en el grupo vacunado son indicativas de una respuesta inmune con mediacion celular espedfica de un antfgeno que esta dirigido contra la leishmanina inyectada.
Analisis serologico
Los resultados se representan en las Figuras 4 y 5. La inyeccion de leishmanina no modifica el tttulo de anticuerpos IgG1 o IgG2 anti-ESPs en los perros vacunados con la composicion de vacuna LSH304. En contraste, la inyeccion de leishmanina provoco un ligero incremento del nivel de anticuerpos IgG1 o IgG2 anti-ESPs en los perros vacunados con la composicion de vacuna LSH306.
Actividad leishmanicida de los macrofagos
La capacidad de los macrofagos para destruir las formas de amastigotes de L. infantum se ha incrementado despues de la inyeccion de leishmanina (vease la Figura 6). Este resultado contrasta con la ausencia de actividad leishmanicida de los macrofagos del grupo de control durante todo el estudio. Este aumento de la actividad leishmanicida de los macrofagos se correlaciona con un aumento de la produccion de NO asf como la presencia de NO sintasa inducible (iNOS) (veanse las Figuras 7 y 8).
2.2.3 Conclusion
Segun se desprende de este estudio, la mejor relacion entre la eficacia y la inocuidad se observa con la composicion de vacuna LSH306 (que contiene 60 |jg de QA21). De hecho, se observo una reaccion local solo para un perro despues de la 2a vacunacion. Ademas, no se observo ninguna hipertermia o depresion. La respuesta humoral anti- ESps estaba bien desarrollada. Los macrofagos de los perros vacunados con esta composicion de vacuna eran capaces de destruir amastigotes de L. infantum gracias a la activacion de la enzima iNOS (que produce NO). Ademas, los dos perros vacunados desarrollaron una reaccion intradermica, 48 horas despues de la inyeccion de leishmanina, lo que es indicativo de una respuesta inmune con mediacion celular.
Claims (9)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Composicion de vacuna para la prevencion o el tratamiento de la leishmaniosis en un mai^ero de la especie Canis lupus, caracterizada porque consiste en:- una cantidad de protemas de excrecion-secrecion (ESPs) procedentes de promastigotes y/o amastigotes de Leishmania sp, producidas en un medio axenico y exento de suero, que comprende entre 80 y 140 |jg por dosis de vacuna;- una cantidad de saponina QA21 purificada de 60 jg por dosis de vacuna; y- opcionalmente, un excipiente farmaceuticamente aceptable.
- 2. Composicion segun la reivindicacion 1, caracterizada porque la saponina QA21 purificada es el unico adyuvante a base de saponina.
- 3. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque la saponina QA21 purificada es el unico adyuvante.
- 4. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la cantidad de ESPs es de 110 jg/dosis de vacuna.
- 5. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicho excipiente comprende o consiste en uno o varios de los compuestos seleccionados entre el grupo que consiste en cloruro de sodio, agentes de liofilizacion, tampones, conservantes y estabilizantes.
- 6. Composicion segun la reivindicacion 5, caracterizada porque dicho excipiente comprende Tris (trishidroximetilaminometano), manitol y sacarosa.
- 7. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque dichas protemas de excrecion-secrecion proceden de promastigotes de Leishmania sp.
- 8. Procedimiento de preparacion de una composicion de vacuna para la prevencion o el tratamiento de la leishmaniosis en un mairnfero de la especie Canis lupus, caracterizado porque comprende la mezcla de:- protemas de excrecion-secrecion (ESPs) procedentes de promastigotes y/o amastigotes de Leishmania sp, producidas en un medio axenico y exento de suero, que comprenden entre 80 y 140 jg por dosis de vacuna y- una cantidad de saponina QA21 purificada de 60 jg por dosis de vacuna; y- opcionalmente, un excipiente farmaceuticamente aceptable.
- 9. Composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en el tratamiento o la prevencion de la leishmaniosis en un mai^ero de la especie Canis lupus.
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