ES2595307T3 - Células T reguladoras redirigidas, modificadas genéticamente y su uso en la supresión de enfermedades autoinmunes e inflamatorias - Google Patents

Abstract

Una población linfocitos T redirigidos con un fenotipo regulador (células T redirigidas), estando las células T redirigidas dotadas con especificidad hacia un antígeno o ligando objetivo, cuyo antígeno o ligando objetivo es uno que está presente o expresado en un sitio o tejido de una respuesta inmune o inflamatoria no deseada, cuyas células comprenden cada una, una molécula quimérica de ácido nucleico que se expresa, en una cadena continua única, un polipéptido receptor quimérico que comprende una región de reconocimiento extracelular, una región transmembrana y una región de señalización intracelular, de tal manera que la región extracelular de la mismos se despliega sobre la superficie de dichas células, en donde dicha molécula quimérica de ácido nucleico comprende: (a) un primer segmento de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica dicha región de reconocimiento extracelular específica para dicho antígeno o ligando objetivo, cuya región no comprende un dominio extracelular de proteína del MHC; y en donde dicha región se une al antígeno o ligando objetivo en una forma no restringida al MHC o en una manera no dependiente del MHC; (b) un segundo segmento de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica dicha región transmembrana; y (c) un tercer segmento de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica dicha región señalización intracelular que comprende una combinación de fracciones del polipéptido de señalización de células T.

Description

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DESCRIPCION

Celulas T reguladoras redirigidas, modificadas geneticamente y su uso en la supresion de enfermedades autoinmunes e inflamatorias

Antecedentes de la invencion Campo de la invencion

La invencion en el campo de la inmunologfa y la medicina se refiere a la modificacion genetica de las celulas T reguladoras con receptores quimericos con especificidad tipo anticuerpo, y el uso de tales celulas para suprimir la accion de las celulas T efectoras y tratar cualquiera de una serie de enfermedades y condiciones en las que tal supresion es beneficiosa, principalmente enfermedades autoinmunes e inflamatorias tales como enfermedades inflamatorias del intestino (IBD), enfermedades autoinmunes espedficas de organos, rechazo de aloinjertos y enfermedad del huesped versus injerto.

Descripcion del estado de la tecnica

Celulas T reguladoras (Treg)

Una lmea de investigacion que condujo al descubrimiento de las celulas Treg fue la observacion de que la timectoirna de los ratones de ciertas cepas susceptibles el dfa 3 despues del nacimiento trae como resultado un espectro de efectos autoinmunes espedficos de organos, que eran prevenibles por "reconstitucion" de estos animales de manera temprana en la vida con linfocitos adultos normales (Asano M y colaboradores, J Exp Med 1996; 184: 387-96). Los efectores y supresores de la autoinmunidad en este modelo de autoinmunidad multiorganica eran celulas T CD4+. Posteriormente se demostro que las celulas T reguladoras CD4+ Treg que previenen enfermedades coexpresan CD25. Las celulas T reguladoras CD4+CD25+ representan 5-10% de las celulas CD4+ perifericas totales en ratones y 3-6% de las celulas T CD4+ totales de sangre periferica en los seres humanos (Jonuleit H y colaboradores, J Exp Med 2001; 193: 1285-1294).

Durante la ultima decada, las celulas T reguladoras CD4+CD25+ han sido estudiadas por su funcion en enfermedades autoinmunes. Las celulas T reguladoras CD4+CD25+ suprimieron una enfermedad inducida por celulas T efectoras espedficas de autoantfgeno clonadas (Suri-Payer, E y colaboradores, J. Immunol, 1998; 160: 1212-1218). Las celulas Treg CD4+CD25+ parecen ser miembros de un unico linaje de celulas T reguladoras. Estos autores observaron que, aunque el(los) antfgeno(s) objetivo y el mecanismo de accion de las celulas T CD4+CD25+ quedaron aun por determinar, es probable que jueguen un papel importante en la modulacion de otras enfermedades autoinmunes que estan mediadas por la activacion de celulas T autorreactivas. Las Treg previenen enfermedades autoinmunes espedficas de organos, incluyendo la tiroiditis autoinmune, la gastritis autoinmune, la insulitis y la artritis.

Mas recientemente, se descubrio que las celulas T reguladoras expresan un factor de transcripcion conocido como Foxp3 intracelular. La ausencia del factor de transcripcion llamado escurfina (tambien caja cabeza de tenedor P3) y codificado por el gene Foxp3 se sabe que causa una enfermedad linfoproliferativa con desenlace fatal rapido, similar a la observada en ratones que carecen de antfgeno 4 asociado a linfocitos T citolfticos (CTLA-4). Khattri R y colaboradores (Nat Immunol. 2003; 4: 337-42) mostro que Foxp3 fue altamente expresado por las celulas Treg y se asocio con su actividad y fenotipo. Los ratones deficientes en Foxp3 caredan de celulas Treg mientras que los ratones que sobreexpresa Foxp3 poseen mas celulas Treg. Las Treg constitutivamente expresan el factor de transcripcion Foxp3 y la molecula coestimuladora inhibitoria CTLA-4 (Chen W y colaboradores, J Exp Med 1998; 188: 1849-1857).

Se cree que Foxp3 actua a traves de la regulacion transcripcional negativa de genes de citoquinas, incluyendo IL2, IL4 e IFN-y (Kasprowicz DJ y colaboradores, J Immunol 2003; 171: 1216-1223, 2003), aunque muchos aspectos de la actividad de Foxp3 y regulacion de su expresion siguen siendo oscuros.

Loser K y colaboradores, Gene Ther, 2005; 12: 1294-304, generaron Treg in vitro mediante infeccion de celulas T CD4+CD25- no activadas con un retrovirus que codifica Foxp3. Las celulas T infectadas con Foxp3 eran similares a las celulas Treg de origen natural como se evidencia por la expresion y funcion de un marcador de superficie. Estos autores investigaron los efectos de las celulas T infectadas con Foxp3 sobre las respuestas de hipersensibilidad de contacto mediadas por celulas T efectoras mediante la inyeccion en ratones sensibilizados de celulas T infectadas con un virus de control o con Foxp3. Solo la inyeccion de celulas T infectadas con Foxp3 inhibio significativamente CHS en comparacion con los controles, lo que indica que las celulas T infectadas con Foxp3 son supresoras in vivo. Los autores usaron por lo tanto celulas T infectadas con Foxp3 para el tratamiento de ratones transgenicos (Tg) CD40L propensos a autoinmunidad (Tg), que desarrollan una enfermedad autoinmune sistemica grave, incluyendo celulas T y autoanticuerpos autorreactivos. La inyeccion de celulas T infectadas con Foxp3 en estos ratones inhibio el desarrollo en curso de dermatitis autoinmune y la activacion de celulas T CD8+ citotoxicas. Este tratamiento tambien redujo las concentraciones en suero de anticuerpos antinucleares, que estuvo acompanado con una reduccion de las deposiciones de inmunoglobulina renal y aumento de la funcion renal. Los autores concluyeron que las celulas T reguladoras

recientemente generadas in vitro se pueden utilizar para tratar exitosamente trastornos autoinmunes inflamatorios y en curso.

Suri-Pagador E y Fritzsching B (Springer Semin Immunopathol. 2006; 28: 3-16) resumieron recientemente evidencia del papel de Treg en la supresion de las respuestas inmunes innata y adaptativa en modelos experimentales de 5 autoinmunidad incluyendo artritis, colitis, diabetes, encefalomielitis autoinmune, lupus, gastritis, ooforitis, prostatitis, y tiroiditis. Una observacion comun a partir de tales estudios es que las Treg se activan de una manera espedfica por el antigeno, pero ejercen su funcion de supresion de una forma independiente del antigeno, principalmente mediante la produccion y secrecion de citoquinas supresoras, tales como IL-10 y TGF-p. Las Treg pueden suprimir celulas T "convencionales" in vitro por contacto celular directo. Se apreciara, sin embargo, que la subregulacion de la funcion 10 celular de presentacion de antfgenos (APC), tal como aquella de las celulas dendnticas, y la atenuacion de la secrecion de citoquinas inhibidoras, tales como IL-10 y TGF-p podna ser importante para la funcion de las Treg in vivo. El resultado final de la autoinmunidad versus la tolerancia depende del equilibrio entre las senales estimuladoras con respecto a las celulas T efectoras y las senales inhibidoras de Treg. Mientras que los estudios anteriores analizaron la capacidad de las Treg para prevenir la aparicion de la enfermedad autoinmune, los informes mas recientes indican el 15 tratamiento exitoso de la enfermedad en curso.

In vivo, la transferencia adoptiva de las Treg logro los siguientes efectos:

(1) desarrollo de autoinmunidad suprimida;

(2) rechazo agudo de organos solidos trasplantados suprimido; y

(3) inmunidad antitumoral suprimida,

20 Una revision de Sakaguchi S y colaboradores, Immunol Rev., 2006; 212: 8-27, observaron que el surgimiento de forma natural de celulas Treg CD25+CD4+ desempena un papel clave en el mantenimiento de autotolerancia inmunologica y control negativo de una variedad de respuestas inmunes fisiologicas y patologicas. La mayona de estas celulas son producidas por el timo normal como una subpoblacion de celulas T funcionalmente maduras. Las Treg naturales expresan espedficamente Foxp3, un factor de transcripcion que juega un papel fundamental en su desarrollo y funcion. 25 El agotamiento completo de Treg naturales que expresan Foxp3 (ya sean CD25+ o CD25-) activo incluso clones de celulas T efectoras autorreactivas debiles o poco comunes, induciendo enfermedades inflamatorias/autoinmunes severas y generalizadas. Las Treg naturales son altamente dependientes de la interleuquina (IL)-2 proporcionada de forma exogena para su supervivencia en la periferia. Ademas de Foxp3 e IL-2/receptor de IL-2, una deficiencia o alteracion funcional de otras moleculas (expresado por celulas T o no por celulas T), pueden afectar el desarrollo o la 30 funcion de las Treg, de las celulas T efectoras autorreactivas, o de ambas, y en consecuencia inclinar la balanza entre

las dos poblaciones en la periferia hacia la autoinmunidad. Por lo tanto, las Treg suprimen la actividad de las celulas T efectoras que son una causa principal de trastornos inflamatorios autoinmunes espedficas del antfgeno. Las Treg inducen anergia y promueven la supresion por un proceso que implica tanto contacto celula-celula, y probablemente mas importante aun, por su secrecion de TGF-p y IL-10.

35 Sakaguchi y colaboradores, citado mas arriba, establecieron que la elucidacion de las bases moleculares y celulares de mantenimiento activo mediado por Treg de la autotolerancia facilitara (1) nuestra comprension de la patogenesis de la enfermedad autoinmune y (2) el desarrollo de nuevos metodos de prevencion y tratamiento de enfermedades autoinmunes.

La presente invencion esta dirigida a uno de tales enfoques novedosos para prevenir o tratar enfermedades 40 autoinmunes y condiciones inflamatorias/inmunologicas relacionadas mediante la imposicion del control mediado por

Treg sobre las celulas T efectoras.

Diseno de receptores quimericos con la especificidad de anticuerpo en celulas T

Los esfuerzos para conferir especificidad similar a anticuerpo a los linfocitos T surgieron como respuesta a ciertos descubrimientos basicos y fallaron en convertirlos en un exito terapeutico. Los antfgenos asociados a tumores humanos 45 se ha demostrado que existen como peptidos asociados con protemas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). La falta de exito en la vacunacion de pacientes con tumores con una gran variedad de vacunas de antfgenos asociados a tumores era por lo tanto frustrante (Rosenberg SA y colaboradores, Nat Med 2004; 10: 909-15). La vacunacion pasiva con anticuerpos antitumorales (Abs), linfocitos que infiltran un tumor (TIL), o celulas asesinas activadas por linfoquinas (LAK) mostraron una eficacia muy limitada (principalmente para tumores vasculares). Los 50 exitos mas recientes con la transferencia adoptiva de TIL en pacientes con melanoma en etapa IV (Dudley ME, y colaboradores, J Immunother 2001; 24: 363-73; Dudley ME, y colaboradores, Science 2002; 298: 850-4) aun teman un inconveniente por el hecho de que los resultados se limitaban a unos pocos tipos de cancer y a individuos de los que es posible derivar TIL espedficos.

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Para superar tales limitaciones en la inmunoterapia celular adoptiva de cancer, y con el fin de desarrollar un enfoque que no se restrinja a pacientes individuales o se limite a una forma espedfica de cancer, uno de los presentes inventores y sus colegas desarrollaron el enfoque del "cuerpo T" (Gross G y colaboradores, Proc Natl Acad Sci USA, 1989; 86: 10024-8; Gross G y Eshhar, Z, FAsEb J 1992; 6: 3370-8). Veanse tambien las siguientes publicaciones de patentes de Eshhar y sus colegas, todas las cuales se incorporan por referencia en su totalidad: la publicacion de la patente estadounidense No. 2002-0137697, la patente estadounidense No. 5.912.172, la patente estadounidense No. 5.906.936, las publicaciones internacionales de patente WO 00/31239, WO 97/15669, WO 95/14710 y WO 93/19163. En estos enfoques, se elaboro un receptor quimerico (CR), por ejemplo, mediante la fusion de la porcion variable de un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal antitumoral (mAb), a un dominio de activacion intracelular de linfocitos, a fin de ser expresado por las celulas T en las que se ha transfectado el gen como el dominio extracelular de esa molecula que activa las celulas T. Tras la expresion de dichos genes CR en celulas efectoras inmunes (celulas T y celulas asesinas naturales (NK)), las celulas modificadas resultantes (apodadas "cuerpos T") reconocen sus objetivos tumorales y eficientemente los matan. Por lo tanto, el receptor inmune quimerico confiere especificidad antigenica redirigida acoplada para dirigir la activacion independiente de MHC de la activacion celular en respuesta a la union de un antigeno objetivo predefinido.

En un principio, la configuracion del CR heterodimerico compuesta de las dos cadenas a y p del receptor de celulas T (TCR) en la que cada par de dominios variables de TCR (Va y Vp) fue reemplazado con un par de dominios Vh y Vl derivados de un anticuerpo seleccionado. Estas dos secuencias de codificacion derivadas de Ab fueron cotransfectadas en lmeas de celulas T y se encontro que confieren la especificidad del anticuerpo (Gross y colaboradores, 1989, citado mas arriba). Por lo tanto, las celulas T podnan ser activadas para la funcion efectora tal como la destruccion de celulas o la actividad citotoxica frente a un blanco inmunologicamente espedfico de una manera que fuera independiente de MHC (y de esta manera no restringida) (Gross y colaboradores, 1992, citado mas arriba).

En CR de "segunda generacion", la configuracion de una sola cadena del CR fue manipulada adicionalmente para obtener una configuracion que sena util sobre todo para terapia contra el cancer o antiviral. Aqm, se ligo un Fv de cadena sencilla (scFv) de un anticuerpo a los dominios transmembrana y citoplasmaticos de fracciones que activan linfocitos tales como la cadena Z asociada al complejo TCR/CD3, o la cadena y del receptor de Fc (Eshhar Z y colaboradores, Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 720-4). Esta configuracion de cadena unica, que combina el reconocimiento de anticuerpos y la senalizacion de las celulas T en una sola protema continua, era una estructura modular con dominios funcionales que son faciles de manipular, y puede expresarse facilmente en linfocitos humanos usando vectores basados en retrovirus (Eshhar Z y colaboradores, J. Imm Meth 2001; 248: 67-76). Otros de estos receptores disenados por algunos de los presentes inventores y colegas, y que se discuten en mayor detalle mas adelante, se denominan receptores quimericos como tripartitos (TpCR) que tambien incluyen un dominio(s) coestimulador(es) (por ejemplo, CD28, 4-1BB).

Con el tiempo, se ha sabido que el redireccionamiento de la especificidad de las celulas T efectoras usando CR de una sola cadena se ha convertido en una opcion terapeutica valida para el cancer. Muchos investigadores han adaptado este enfoque de "cuerpo T" para dotar a las celulas T con diferentes especificidades y funciones (Gross y Eshhar, citado mas arriba; Willemsen RA y colaboradores, Hum Immunol 2003; 64: 56-68; Baxevanis CN y colaboradores, Cancer Immunol Immunother 2004; 53: 893-903). Para una revision reciente, vease: Eshhar, Z. "The T-Body Approach: Redirecting T Cells with Antibody Specificity", en Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology 181, Chernajovsky y Nissim (eds.), Springer-Verlag, 2008, paginas 329-342.

En la presente invencion, los inventores han concebido usos expandidos de tales CR para el tratamiento de condiciones inflamatorias/inmunologicas no deseadas tales como enfermedades autoinmunes (con un enfasis inicial particular sobre la enfermedad inflamatoria del intestino, IBD) y el rechazo de injertos.

Enfermedades inflamatorias cronicas y modelos animales

Las condiciones inflamatorias, particularmente enfermedades inflamatorias cronicas, son de particular importancia en la medicina clmica. Estas enfermedades, causadas por acciones del sistema inmune, implican la activacion inadecuada o excesiva de ciertas celulas T, la expresion de citoquinas reguladoras y quimiocinas, la perdida de la tolerancia inmune, y similares. Ejemplos de enfermedades inflamatorias autoinmunes y/o cronicas son la esclerosis multiple, enfermedades inflamatorias del intestino (IBD), enfermedades de las articulaciones tales como artritis reumatoide y lupus eritematoso sistemico. Algunas de estas enfermedades son mas bien espedficas de organos/tejidos como sigue: del intestino (enfermedad de Crohn), de la piel (psoriasis), de los nervios mielinizados (esclerosis multiple o MS), de los islotes pancreaticos o celulas p (diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) o diabetes de tipo I), de las glandulas salivales (enfermedad de Sjogren), del musculo esqueletico (miastenia grave), de la tiroides (tiroiditis de Hashimoto; enfermedad de Graves), de la camara anterior del ojo (uveftis), de tejido de las articulaciones (artritis reumatoide), y diversas enfermedades cardiovasculares.

La enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) es un termino colectivo utilizado para describir dos trastornos intestinales cuya etiologfa no se entiende por completo: la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La IBD se produce en todo el mundo y afecta a varios millones de personas (0,3% de la poblacion de los pafses occidentales), y su incidencia va en

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aumento (Tsironi E, y colaboradores, Am J Gastroenterol. 2004; 99: 1749-1755). El curso y pronostico de la IBD es muy variable. El inicio de la IBD es predominante en la edad adulta y generalmente se presenta con diarrea, dolor abdominal y fiebre; anemia y perdida de peso son tambien signos comunes. Entre el 10% y el 15% de las personas con IBD requieren cirugfa durante un penodo de diez anos. Los pacientes con IBD tambien tienen un mayor riesgo de desarrollar cancer intestinal. Estas enfermedades estan acompanadas de una alta frecuencia de smtomas psicologicos, como la ansiedad y la depresion.

Aunque la patogenesis de este trastorno comun mediado por celulas T sigue siendo incierto, se cree que resulta de la perdida de tolerancia en el sistema inmunitario intestinal debido a la presencia de la estimulacion antigenica constante proporcionada por el gran numero de bacterias residentes (Podolsky DK, N Engl J Med 2002; 347: 417-29). Por desgracia, las nuevas terapias para la IBD son pocas, y tanto el diagnostico como el tratamiento se han visto obstaculizados por la falta de un conocimiento detallado de la etiologfa. Una combinacion de factores geneticos, desencadenantes exogenos y microflora endogena puede contribuir al dano mediado por el sistema inmune de la mucosa intestinal. Las bacterias han sido implicadas en el inicio y el avance de la enfermedad de Crohn ya que la inflamacion intestinal responde con frecuencia a los antibioticos. Los colonizadores intestinales comunes y patogenos novedosos han sido implicados, ya sea por deteccion directa o por respuestas inmunes antimicrobianas asociadas con la enfermedad. En muchos modelos animales geneticamente susceptibles de colitis cronica, los microorganismos luminales parecen ser un cofactor necesario para la enfermedad.

La etapa de iniciacion en la patologfa de las enfermedades autoinmunes es a menudo oscura en los seres humanos, donde las enfermedades son en gran medida esporadicas, y los smtomas pueden aparecer anos despues de la activacion de la primera celula T patogena. Por lo tanto, ha sido diffcil disenar terapias eficaces para bloquear la induccion de la enfermedad. En contraste, existen caractensticas comunes en muchas de las etapas posteriores de estas enfermedades. La inflamacion en el sitio de la enfermedad/organo objetivo esta presente tfpicamente, causada por la liberacion de citoquinas inflamatorias, tambien denominadas "proinflamatorias" (por ejemplo, TNF-a e interferones) por las celulas T y por otras celulas que contribuyen a las etapas de activacion y rutas efectoras de los procesos inmunes/inflamatorios. Estas celulas incluyen (entre otros) macrofagos, celulas dendnticas y sus precursores, linfocitos B y celulas plasmaticas y celulas NK (incluyendo las celulas NKT). Estas reacciones a menudo implican la destruccion de las celulas "objetivo" y dano tisular.

Los estudios que usan modelos murinos de inflamacion cronica experimental estan ayudando a definir la naturaleza de la desregulacion inmunologica que inicia la inflamacion y conduce a la destruccion de organos terminales espedficos, asf como para las terapias de prueba. Vease, por ejemplo, Mombaerts y colaboradores. Cell, 1993; 75: 274-82; Tarrant y colaboradores, 2998; J Immunol, 161: 122-7; Powrie y colaboradores, Immunity, 1994; 1: 553-62; Hong y colaboradores, J Immunol, 1999; 162: 7480-91; Horak, Clin Immunol Immunopathol, 1995, 76 (3 Pt 2): S172-173; Ehrhardt y colaboradores. J Immunol, 1997; 158: 566-73; Davidson y colaboradores, J Immunol, 1998; 161: 3143-9; Kuhn y colaboradores. Cell, 1993, 75: 263-74; Neurath y colaboradores, J Exp Med, 1995. 182: 1281-1290. W. Strober, 2002; Annu. Rev. Immunol. 20: 495-54 revisan modelos de inflamacion de la mucosa, y se incorporan por referencia en su totalidad. Un sello distintivo de los mejores de estos modelos es que la histopatologfa y la fisiopatologfa se asemejan a la de las condiciones humanas paralelas, mejorando aun mas la utilidad de los modelos en la prueba de nuevas estrategias de tratamiento. En el caso de la IBD este desarrollo no ha sido uniforme. El mayor enfasis ha puesto en la modulacion de los mecanismos inmunes (Blumberg RS y colaboradores, Curr Opin Immunol. 1999; 11: 648-56; Strober y colaboradores, citado mas arriba) y recientemente de la flora enterica (Sartor RB, Curr Opin Gastroenterol. 2001; 4: 324-330).

Bhan AK y colaboradores, 1999 Immunol Rev. 169: 195-207 revisaron estudios de la colitis en modelos animales transgenicos (Tg) y con genes desactivados (KO) para la inflamacion de la mucosa en la IBD. La genetica y el medio ambiente, en particular la flora enterica normal, fueron factores en el desarrollo de la inflamacion de la mucosa, como se ha indicado anteriormente. La homeostasis normal de la mucosa fue interrumpida por un desequilibrio de citoquinas, la aniquilacion de la tolerancia oral, la ruptura de las barreras epiteliales, y la perdida de celulas inmunorreguladoras. Algunas, pero no todas las inmunodeficiencias, en el valor adecuado, condujeron a la colitis. Las celulas T efectoras CD4+ han sido identificadas como los linfocitos patogenos en la colitis, y pueden mediar la inflamacion ya sea por la ruta Th1 o la Th2. La ruta Th1 domina en la mayona de los modelos de colitis (y la enfermedad de Crohn humana). Por el contrario, en la colitis observada en ratones, los ratones con genes desactivados en la cadena a del receptor de celulas T (TCR) los ratones (ratones KO TCRa) comparten muchas caractensticas de la colitis ulcerosa, incluyendo la dominancia de la ruta Th2 en la inflamacion del colon. Tales modelos son importantes para el desarrollo de estrategias terapeuticas para el tratamiento de la IBD. En una revision posterior, el mismo grupo (Mizoguchi A y colaboradores, 2003, Inflamm Bowel Dis. 9: 246-259) observo que las respuestas inmunes exageradas a microflora enterica normal estan implicadas en la iniciacion y perpetuacion de la inflamacion intestinal cronica. Una via importante implica el desarrollo de respuestas inmunes "adquiridas" por las interacciones de las celulas T CD4+ TCRap+ con celulas presentadoras de antfgeno (APC), en particular celulas dendnticas. Las celulas Treg CD4+CD25+ atenuadas activan respuestas de celulas T.

El avance de la fase aguda a la fase cronica de la IBD no ha sido bien caracterizado en modelos animales y no puede ser evaluado facilmente en los pacientes. Spencer DM y colaboradores. Gastroenterol. 2002; 122: 94-105 reporto

cambios en la respuesta immune de la mucosa con el tiempo en la colitis experimental. La severidad de la colitis, la masa corporal, la consistencia de las heces y el contenido de sangre, de amiloide A en suero, y la histologfa del tejido fueron examinados en ratones deficientes en interleuquina 10 (IL-10) durante 35 semanas. Se midio la correspondiente produccion de IL-12, IL-18, IFNy, TNFa, IL-4 e IL-13 por las celulas mononucleares de la lamina propia en el intestino 5 inflamado. La administracion de un anticuerpo monoclonal anti-IL-12 neutralizante (mAb) en momentos distintos durante el avance de la enfermedad permite la evaluacion del potencial terapeutico de este agente. Las celulas mononucleares de la lamina propia de los ratones con enfermedad temprana sintetizan progresivamente mas IL-12 e IFNy, mientras que la produccion de ambas citoquinas se redujo drasticamente y regreso a los niveles previos a la enfermedad en la fase tardfa. De forma consistente con este patron, la neutralizacion de anti-IL-12 invirtio tempranamente, la enfermedad, y no 10 en forma tardfa. Por el contrario, la produccion de IL-4 e IL-13 aumento progresivamente dese la fase temprana a la tardfa de la enfermedad. Se concluyo que la colitis en desarrollo en los ratones deficientes en IL-10 evoluciona en dos fases distintas. IL-12 desempena un papel fundamental en la colitis temprana, mientras que otros mecanismos inmunes, presumiblemente mediados por IL-4 e iL-13, predominan en la enfermedad tardfa para mantener la inflamacion cronica.

IL-10 y la enfermedad inflamatoria cronica

15 Se ha sabido desde hace algunos anos que IL-10 afecta el crecimiento y diferenciacion de muchos tipos de celulas hematopoyeticas in vitro y es un supresor particularmente potente de funciones de los macrofagos y de las celulas T. Estas observaciones se basaron en parte del uso de ratones mutantes deficientes en IL-10 (con genes desactivados, KO) mediante modificacion de un gen por recombinacion homologa (Kuhn R y colaboradores, Cell 1993; 75: 263-74). En estos ratones, el desarrollo de linfocitos y las respuestas de anticuerpos son normales, pero la mayona de los animales 20 presentan crecimiento retardado, anemicos y sufren de enterocolitis cronica. Las alteraciones en el intestino incluyen extensa hiperplasia de la mucosa, inflamacion, y expresion epitelial aberrante de las moleculas de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Por el contrario, los mutantes KO de IL-10 mantenidos bajo condiciones espedficas libres de patogenos, desarrollan unicamente una inflamacion localizada (limitada al colon proximal). Se concluyo que (1) la inflamacion intestinal en estos mutantes originada a partir de respuestas inmunes no controladas 25 estimuladas por antigenos entericos y (2) la IL-10 es un regulador esencial (negativo) en el tracto intestinal.

En un estudio de validacion de este modelo de raton KO de IL-10 de colitis, T. Scheinin, T y colaboradores. (Clin Exp Immunol 2003; 133: 38-43) se enfatizo que un modelo animal valioso debe responder a la terapia existente de una forma que se asemeja a la respuesta de la enfermedad humana. Puesto que la enfermedad refractaria de Crohn respondio bien a la terapia con anticuerpos anti-TNFa, los investigadores examinaron las respuestas de los ratones KO 30 de IL-10 a la terapia anti-TNFa, utilizando un nuevo sistema de puntuacion similar al "mdice de actividad" de la enfermedad de Crohn en los seres humanos. Se analizaron las muestras de heces por la presencia de citoquinas y se compararon los resultados con la histologfa. Los resultados mostraron que la terapia con anticuerpos anti-TNF a partir de las 4 semanas mejoro marcadamente la enfermedad (como se juzga por la puntuacion clmica o por la histologfa del intestino). Se observo una disminucion marcada de las citoquinas inflamatorias en las muestras de heces, anadiendo 35 una medida mas precisa de mejona clmica. Los autores concluyeron que este modelo es util para evaluar otras modalidades terapeuticas de relevancia para la enfermedad de Crohn.

Celulas Treg y la enfermedad inflamatoria del intestino

Uno de los modelos animales comunmente utilizados de IBD implica la transferencia adoptiva de celulas T CD45RBhi CD4+ en ratones SCID, lo que conduce al desarrollo de infiltrados masivos de celulas mononucleares de colon, 40 hiperplasia de las celulas epiteliales y ulceracion (Thornton AM, y colaboradores, J Immunol 2000; 164 (1): 183-90). La transferencia conjunta de un gran numero de las Treg CD4+CD25+ impidio el desarrollo de colitis o colitis establecida curada, un efecto que requiere la senalizacion a traves de CTLA-4 (Read S, y colaboradores, JExp Med 2000; 192: 295302; 2000; Morrissey PJ, y colaboradores, JExp Med 1993; 178: 237-44). Incluso despues del desarrollo de colitis mediada inmunologicamente, la transferencia adoptiva de 106 celulas CD4+CD25+ causo una mejora significativa de la 45 inflamacion intestinal (Fantini MC y colaboradores, Gut 2006; 55: 671-80; Mottet C, y colaboradores, J Immunol 2003; 170 (8): 3939-43; Uraushihara K, y colaboradores, J Immunol 2003; 171: 708-16).

En los seres humanos que sufren de IBD, las celulas CD4+CD25+ reguladoras perifericas retienen la actividad supresora. Sin embargo, en contraste con otros trastornos inflamatorios intestinales, el numero de estas celulas reguladoras disminuye en la sangre periferica durante la inflamacion activa y solo aumenta ligeramente en las lesiones 50 intestinales (Mutilar J, y colaboradores, Gastroenterology 2005; 128 (7): 1868-1878). Esta aberracion sugiere que los defectos de busqueda de Treg, asf como la activacion desregulada in situ contribuyen a la patogenesis de IBD.

Por tanto, existe una necesidad reconocida en la tecnica para encontrar modalidades para suprimir reacciones autoinmunes/inflamatorias y enfermedades, incluyendo pero no limitado a IBD, asf como para suprimir el rechazo de injertos de organos y tejidos y prevenir la enfermedad de injerto contra huesped (GVH). La presente invencion 55 proporciona un nuevo enfoque, aquel de redirigir las celulas Treg, como un medio para reclutar celulas T reguladoras a los sitios de inflamacion, y activarlas para suprimir tales reacciones inmunes/inflamatorias y proteger contra, aliviar e incluso curar tales enfermedades como la IBD.

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Resumen de la invencion

La presente invencion se basa en la concepcion de los inventores de que la redireccion mediada por CR y la activacion de las celulas Treg a los sitios de la inflamacion resulta en la supresion de las condiciones inflamatorias, comunmente parte de la enfermedad autoinmune espedfica del organo y se ejemplifica en el presente documento como la inflamacion en el colon en la IBD experimental. Los inventores han concebido adicionalmente usar estas celulas para superar el rechazo de las celulas y tejidos no coincidentes por celulas T efectoras que surgen en los receptores de trasplantes o para inhibir la accion patogena de las celulas inmunocompetentes trasplantadas en el caso de la enfermedad gVh.

La invencion se basa en el enfoque innovador del cuerpo T de los inventores que hasta el momento ha demostrado ser util para la inmunoterapia del cancer (y se encuentra actualmente en fase I/II de ensayos clmicos). La invencion proporciona un nuevo enfoque para la explotacion de las celulas Treg para la mejora de las respuestas inmunes patologicas y no deseadas, en particular la inmunoterapia de condiciones autoinmunes e inflamatorias, incluyendo diversas enfermedades autoinmunes predominante de organos, y otras respuestas inmunes patologicas o indeseables, tales como rechazo de injerto y enfermedad de rechazo versus huesped.

De acuerdo con la presente invencion, las celulas Treg estan dotadas con CR que son espedficos para un antfgeno o ligando objetivo seleccionado. Tal modificacion causa la activacion de Treg redirigidas a sitios de inflamacion para suprimir las respuestas inmunitarias proinflamatorias de tipo efector. Con base en los resultados de los presentes inventores ('y sus colegas') con el redireccionamiento de los linfocitos efectores antitumorales, se espera que las Treg, dotadas de especificidad predefinida, migraran/volveran y se acumulan en un sitio objetivo, tal como el colon inflamado, donde suprimiran las celulas T efectoras que median en la enfermedad. Para evitar la necesidad de la migracion o vuelta al sitio de destino, las Treg pueden, cuando sea posible, ser administradas directamente en o a tal sitio, donde volveran a activarse y suprimir las celulas T efectoras que median en la enfermedad.

Tales celulas Treg redirigidas, tambien conocidas como "cuerpos T" son celulas Treg que han sido manipuladas geneticamente para expresar un receptor quimerico tripartita (TpCR) que esta elaborado con una unidad de reconocimiento extracelular de una sola cadena, una region transmembrana, y una region de senalizacion intracelular.

La region de reconocimiento extracelular es espedfico para un antfgeno o ligando objetivo seleccionado y puede ser preferiblemente una region variable de anticuerpo de cadena unica (scFv) u otro ligando que sea capaz de unirse al antfgeno o ligando objetivo. La region extracelular de reconocimiento no comprende un dominio extracelular de protema del MHC, y dicha region se une al antfgeno o ligando objetivo de una forma no restringida al MHC o de una forma no dependiente del MHC. Las Treg redirigidas de la presente invencion se denominan a veces en esta memoria como "cuerpos T" a pesar del hecho de que la region extracelular de reconocimiento no es necesariamente un dominio de anticuerpo. Por lo tanto, este termino no esta destinado a estar limitado a celulas T reguladoras con especificidad similar a un anticuerpo, pero tambien incluye celulas T reguladoras con especificidad similar a la del ligando-receptor de otro modo.

Una region espaciadora flexible puede estar presente entre la region de reconocimiento extracelular y la region transmembrana. Tal espaciador flexible es preferiblemente una bisagra similar al de la inmunoglobulina (Ig), tal como cualquier region bisagra derivada de la superfamilia de Ig.

La region intracelular incluye una combinacion de fracciones de polipeptidos de senalizacion de las celulas T, fusionadas en tandem, donde la combinacion de fracciones, tras la union de la region de reconocimiento extracelular al antfgeno o ligando objetivo seleccionado, desencadena la activacion de las celulas Treg para provocar la supresion de la inmunidad mediada por celulas T. Las fracciones de senalizacion de celulas T incluyen, preferiblemente, uno o mas dominios citoplasmaticos de una molecula coestimuladora (por ejemplo, CD28) y un dominio estimulador de celulas T citoplasmaticas, por ejemplo, de FcRy o una cadena CD3-Z. Las celulas Treg redireccionadas se activan espedficamente, tras la union de la region de reconocimiento extracelular del CR a su antfgeno o ligando objetivo, de una forma que esta, preferiblemente, (1) no restringida por, o que depende de, la union del antfgeno o ligando objetivo a un MHC, ni tampoco es dependiente de cualquier forma del haplotipo del MHC (HL-A) del receptor y (2) independiente de acoplamiento del (de los) ligando(s) coestimulador(es) en una celula objetivo.

Una enfermedad preferida objetivo de esta invencion es una IBD como la colitis ulcerosa, en donde los presentes metodos, tal como se utiliza con exito en un modelo animal, permitiran que las celulas Treg lleguen a las lesiones intestinales en pacientes con IBD y se activen de manera eficiente en el sitio de la inflamacion. La presente invencion resulta en la acumulacion de Treg espedficas del sitio, dando lugar, en ultima instancia, a la activacion espedfica del antfgeno mediada por CR, que resulta en la produccion de citoquinas supresoras que a su vez suprimen celulas T efectoras autoinmunes en una forma no espedfica del antfgeno, lo que lleva al alivio de los smtomas y por lo tanto al tratamiento de la enfermedad.

El enfoque terapeutico actual tiene varias ventajas unicas. En contraste con otros modelos inmunoterapeuticos,

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involucra cuerpos T redirigidos con un TpCR, que combina el reconocimiento del anticuerpo/antigeno o ligando/receptor con motivos estimulantes y coestimuladores. Por lo tanto, cuerpos T pueden ser totalmente activados de una forma que no esta restringida por el MHC y es independiente de un requisito para coestimulacion. La segunda ventaja de la presente invencion se deriva del hecho de que, aunque la activacion de Treg es dependiente de antigeno, la accion supresora de estas celulas es de independiente del antfgeno, de TCR y de MHC. Mediante la explotacion de esta propiedad, se puede construir un receptor quimerico que es espedfico para uno o mas antigenos asociados a los tejidos en lugar de requerir especificidad para un numero desconocido de antigenos espedficos de la enfermedad autoinmune aun no definidos. La expresion de tales receptores quimericos en Treg redirige estas celulas y su activacion al tejido objetivo adecuado (en una realizacion preferida, el colon), de modo que se activan de una forma espedfica del antigeno, donde sus efectos supresores potentes tienen lugar sin la necesidad de un reconocimiento adicional de los antfgenos asociados con las enfermedades (el "efecto de espectador"). Mediante el uso de Treg activadas espedficamente, se requieren muchas menos celulas para tratar condiciones inflamatorias autoinmunes; tal como la IBD, o reacciones asociadas a aloinjertos en pacientes en los que hubiera sido posible antes de esta invencion, cuando se habnan necesitado un numero mucho mayor de celulas T reguladoras no espedficas.

Los presentes inventores han construido cepas de ratones transgenicos (Tg) cuyas celulas T y celulas asesinas naturales (NK) expresan un TpCR espedfico del antigeno. Como ejemplo de la invencion, los inventores seleccionaron el hapteno trinitrofenilo (TNP) como el objetivo espedfico de los TpCR. Las Treg espedficas de TNP aisladas de estos ratones Tg reprimieron las celulas T efectoras espedficas de TNP in vitro e in vivo y fueron capaces de suprimir la colitis inducida por el acido trinitrobencenosulfonico (TNBS) en ratones. En esta realizacion, el antfgeno objetivo para Treg y el antfgeno patogeno - el hapteno TNP - son los mismos. En otro ejemplo, las celulas T reguladoras espedficas para TNP reprimieron la colitis inducida por oxazolona en ratones en los que se introdujo una dosis baja de TNP en el colon, junto con la exposicion a la oxazolona. Sin embargo, las celulas T reguladoras espedficas de TNP no tuvieron ningun efecto en la colitis inducida por oxazolona en ausencia de la introduccion de TNP. Esto establece el efecto de "espectador" de la presente invencion, es decir, que el antfgeno objetivo no necesita ser el antfgeno patogeno, siempre que las celulas T reguladoras redirigidas se activen en las proximidades de la respuesta inmune patogenica o no deseada.

Una ventaja distinta de la presente invencion es que proporciona celulas y metodos que permiten activacion espedfica del antfgeno y accion no espedfica del antfgeno de las celulas Treg utilizadas para suprimir las respuestas de celulas T efectoras (y tratar las consiguientes patologfas) en una forma que no requiere la identidad entre el ligando (por ejemplo, el antfgeno) reconocido por el TpCR (por ejemplo, por su porcion de reconocimiento del objetivo) y el ligando/antigeno que juega un papel patogenico en el proceso de la enfermedad. De este modo, el antfgeno que es patogeno no tiene que ser reconocido por las celulas T efectoras que son suprimidas, y, de hecho, pueden no estar relacionadas con la enfermedad o condicion que esta siendo tratada. Por lo tanto, la invencion aprovecha el efecto de "espectador". Siempre y cuando la Treg este en la vecindad correcta donde se encuentran las celulas T efectoras y mediante sus efectos no deseados, las Treg redirigidas de la presente invencion pueden ser desencadenadas o activadas en ese lugar para la liberacion de citoquinas supresoras (por ejemplo, IL-10 y TGF-p), lo que resultara en la supresion de cualquiera de las celulas T efectoras "espectador", y por este mecanismo, suprimir una respuesta inflamatoria /autoinmune en curso.

Las caractensticas unicas del sistema Tg utilizado en los presentes ejemplos permite la evaluacion del efecto supresor de celulas T reguladoras espedficas del antfgeno en la IBD tanto in vivo como in vitro. Se usan diferentes medios para inducir celulas T reguladoras, lo que permite a los expertos en la tecnica seleccionar el metodo optimo para la generacion de cantidades eficientes de Treg redirigidas espedficas del antfgeno para un antfgeno o una enfermedad/condicion deseada. De acuerdo con esta invencion, las Treg humanas redirigidas constituyen una modalidad terapeutica eficaz basada en celulas para IBD o colitis ulcerosa y, en forma mas general, para cualquier enfermedad o condicion mediada por celulas T efectoras.

Para superar la escasez de celulas T reguladoras espedficas del antfgeno, la presente invencion incluye metodos para inducir estas celulas utilizando citoquinas (por ejemplo, TGF-p) o mediante la expresion de transgenes (por ejemplo, que codifican el factor de transcripcion Foxp3) que, junto con el TpCR, permitira la expansion de Treg espedficas del antfgeno.

De acuerdo con la presente invencion, las celulas Treg humanas, derivadas ya sea del sujeto con la enfermedad o condicion inflamatoria/autoinmune a tratar, o de un donante sano con HLA compatibles (o una celula universal que no es reconocida por el sistema inmune del receptor), estan dotadas con especificidad de antfgeno/ligando, mediante transduccion con el TpCR espedfico del antfgeno/ligando como se describe en el presente documento. Alternativamente, las celulas que estan dotadas con especificidad de antfgeno son toda la poblacion de celulas T y el constructo de acido nucleico que incluye la secuencia que codifica el TpCR incluye ademas un transgen Foxp3 que esta presente como un cistron transcrito de forma independiente. En otro ejemplo alternativo, se transfecta por separado un transgen Foxp3 en la poblacion de celulas T, para convertir las celulas T en celulas Treg. Los ejemplos suministrados a continuacion incluyen estudios usando colonoscopia murina, imagenologfa in vivo e inmunofluorescencia, y proporcionar las bases para una nueva modalidad terapeutica basada en celulas para la IBD, y, por extension, para otras respuestas inmunes patologicas y no deseadas mediadas por celulas T efectoras espedficas del antfgeno.

Se describen mas espedficamente a continuacion diversas formas de realizacion de la invencion.

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La presente invencion esta dirigida a una poblacion de linfocitos T reguladores redirigidos (celulas Treg) dotados de especificidad hacia un antfgeno o ligando objetivo seleccionado, donde las celulas comprenden cada una, una molecula quimerica de acido nucleico que codifica un polipeptido receptor quimerico (CR) que comprende, expresado en una sola cadena continua, una region de reconocimiento extracelular, una region transmembrana y una region de senalizacion intracelular, y se expresa en la celula Treg con el fin de desplegar la region extracelular en la superficie celular, en donde

(a) la region de reconocimiento extracelular del receptor quimerico es espedfica para el antfgeno o ligando objetivo seleccionado, y no comprende un dominio extracelular de protema MHC, y dicha region se une al antfgeno o ligando objetivo de una forma no restringida de MHC o de una forma que no depende del MHC; y

(b) la region intracelular comprende una combinacion de fracciones de polipeptidos de senalizacion de celulas T cuya combinacion de fracciones, tras la union de la region de reconocimiento extracelular al antfgeno o ligando objetivo seleccionado, desencadena la activacion de las celulas Treg para causar la represion de la inmunidad mediada por las celulas T.

En formas de realizacion preferidas de la presente invencion, la region de reconocimiento extracelular es un dominio de scFv derivado de anticuerpo que es espedfico para un antfgeno seleccionado. En otra realizacion preferida, la region de reconocimiento extracelular es un miembro de un par ligando-receptor, que es espedfico para el otro miembro de ese par.

Preferiblemente, la region de reconocimiento extracelular esta enlazada a la region transmembrana a traves de un espaciador flexible, que, mas preferiblemente, es una bisagra de una molecula de la familia de las inmunoglobulinas.

La region de senalizacion intracelular incluye preferiblemente una fraccion de senalizacion de una cadena de un receptor de celulas T espedficas del antfgeno, que mas preferiblemente es una que tiene una region de polipeptido que comprende un motivo de activacion basado en la tirosina del inmunorreceptor (ITAM). Los ejemplos no limitantes de receptores de celulas T espedficas del antfgeno son cadenas del complejo TCR/CD3, una cadena TCR a, p, y o 6, y la cadena y de un receptor del Fc de Ig (FcRy). La cadena de un receptor de celulas T espedficas del antfgeno es preferiblemente la cadena CD3/Z o una subunidad FcRy.

La region de senalizacion intracelular incluye ademas preferiblemente una fraccion de senalizacion de una protema coestimuladora-receptora de una celula T. La protema coestimuladora-receptora se selecciona preferiblemente de CD28, OX40, CD40L (gp39), el 4-1BB y PD-1 (o preferiblemente, la forma humana u homologa de estas moleculas coestimuladoras). Las mas preferidas entre estas son CD28 o 4-1BB. En otra realizacion preferida, la region de senalizacion intracelular incluye mas de una de las fracciones de senalizacion de la protema coestimuladora-receptora. Por ejemplo, la combinacion de fracciones de polipeptidos de senalizacion de celulas T en la region de la senalizacion intracelular puede incluir tanto CD28 como 4-1BB. En una realizacion particularmente preferida, las regiones de bisagra y transmembrana extracelulares de CD28 se utilizan como las regiones de bisagra y transmembrana extracelulares del receptor quimerico.

La region de senalizacion intracelular puede incluir tambien una fraccion de senalizacion de un receptor de citoquinas de una celula T, tal como el receptor de IL-2 o el receptor de TGF-p. Esto ultimo puede ayudar a inducir la celula T que contiene el receptor quimerico a adoptar las caractensticas de una celula Treg.

La region intracelular tambien puede incluir una enzima de transduccion de senal que (a) es una enzima de la ruta de transduccion de senales de un receptor de celulas T espedficas del antfgeno o (b) es una enzima con la correspondiente especificidad y la actividad como la de la enzima de (a), derivada de un linfocito que no es de celulas T. Dicha enzima es preferiblemente una quinasa, tal como la quinasa Syk.

El acido nucleico quimerico que codifica al CR tambien puede incluir una secuencia de nucleotidos que codifica Foxp3 dispuesta de tal manera que Foxp3 se expresa mediante la celula Treg independientemente del receptor quimerico. En otras palabras, el acido nucleico quimerico puede ser bicistronico de tal manera que el transgen Foxp3 esta presente como un cistron transcrito de forma independiente.

El antfgeno o ligando objetivo es preferiblemente uno que esta presente o expresado en un sitio o tejido objetivo de una respuesta inmune o inflamatoria mediada por celulas T efectoras. La respuesta autoinmune o inflamatoria puede comprender una respuesta o enfermedad autoinmune, una respuesta o rechazo de un aloinjerto o xenoinjerto, o enfermedad injerto contra huesped (GVH). En una realizacion preferida alternativa, el antfgeno o ligando objetivo puede ser un autoantfgeno o un antfgeno que es de reaccion cruzada con un autoantfgeno, es decir, tambien esta unido por un anticuerpo que es espedfico para el autoantfgeno. El autoantfgeno puede ser un antfgeno patogenico en la fisiopatologfa de la enfermedad autoinmune.

El antfgeno no es necesariamente un autoantfgeno, pero puede ser, por ejemplo, un antfgeno que es parte de la flora

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bacteriana, tal como LPS derivado de las bacterias nativas del colon.

La enfermedad autoimmune o la respuesta al injerto y el antigeno/ligando o antigenos/ligandos contra la cual la Treg es espedfica se selecciona preferiblemente de entre el siguiente grupo:

(a) enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), en donde el antigeno o ligando es uno que se expresa en colon o Aeon enfermo;

(b) artritis reumatoide, en donde el antigeno o ligando es un epftopo de colageno o un antigeno presente en las articulaciones;

(c) diabetes mellitus tipo I o insulitis autoimmune, en donde el antigeno o ligando es un antigeno de las celulas p del pancreas;

(d) esclerosis multiple, en donde el antigeno o ligando es, por ejemplo, un antfgeno de protema basica de mielina (MBP) o MOG-1 o MOG2-2, o un antigeno neuronal.

(e) tiroiditis autoimmune, en donde el antigeno o ligando es un antigeno de la tiroides;

(f) gastritis autoimmune, en donde el antfgeno o ligando es un antfgeno gastrico;

(g) uveitis autoimmune o uveorretinitis, en donde el antfgeno o ligando es antfgeno S u otro antfgeno uveal o retinal

(h) orquitis autoimmune, en donde el antfgeno o ligando es un antfgeno testicular;

(i) ooforitis autoimmune, en donde el antfgeno o ligando es un antfgeno de ovario;

(j) psoriasis, en donde el antfgeno o ligando es un antfgeno de queratinocitos u otro antfgeno presente en la dermis o epidermis;

(k) vitiligo, en donde el antfgeno o ligando es un antfgeno de melanocito, tal como melanina o de tirosinasa;

(l) prostatitis autoinmune, en donde el antfgeno o ligando es un antfgeno de prostata;

(m) cualquier respuesta inmune no deseada, en donde el antfgeno o ligando es un antfgeno de activacion u otro antfgeno expresado en celulas T efectoras presentes en el sitio de la respuesta no deseada;

(n) rechazo de tejidos, en donde el antfgeno o ligando es el MHC espedfico para el tejido trasplantado; y

(o) una condicion inflamatoria, en donde el antfgeno o ligando es uno que se expresa en celulas no linfoides del linaje hematopoyetico que participan en la inflamacion.

La mas preferida es una celula Treg que es capaz de actuar y suprimir IBD o la colitis ulcerosa, y puede ser espedfica para un antfgeno asociado con IBD tal como el antfgeno carcinoembrionario (CEA) o un antfgeno de la flora bacteriana intestinal, tal como lipopolisacarido bacteriano (LPS) o un componente del mismo, preferiblemente un componente del Lfpido A.

La Treg puede ser espedfica para un antfgeno de activacion expresado en celulas T efectoras, tales como CD69 o CD107a. La Treg puede ser espedfica para un antfgeno expresado en una celula dendntica, macrofago/monocito, granulocito o eosinofilo o presente en el sitio de la inflamacion.

En una realizacion preferida, la celula Treg anterior es espedfica para un antfgeno que se introduce de forma exogena a un sujeto en el sitio o tejido objetivo de la respuesta inmune o inflamatoria, ya sea antes, al mismo tiempo con, o despues de la administracion de la celula Treg.

La celula Treg anterior preferiblemente es una que expresa CD4 o CD8, junto con CD25 en su superficie y expresa el factor de transcripcion Foxp3 en forma intracelular. El factor de transcripcion Foxp3 se puede expresar en la celula de forma endogena (es decir, desde el propio gen Foxp3 de la celula); esta expresion se ve reforzada por la exposicion de las celulas a TGF-p u otra citoquina que induce la expresion de Foxp3 e induce un fenotipo de Treg en celulas T. En otra realizacion de la celula Treg anterior, Foxp3 se expresa a partir de un acido nucleico que ha sido introducido en la celula de forma exogena (es decir, transducido) como un constructo de expresion de acido nucleico recombinante que codifica Foxp3 y que regula su expresion. La anterior Treg puede ser obtenida de un sujeto mairnfero antes de la introduccion del acido nucleico quimerico y antes de la estimulacion que induce la expresion de Foxp3, o antes de la

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transduccion del constructo que codifica Foxp3 exogeno. El acido nucleico quimerico que codifica el receptor quimerico y el constructo de acido nucleico que codifica Foxp3 puede ser cotransducido en la celula. En una realizacion, se logra la cotransduccion usando un vector bicistronico que incluye, en un solo vector, una secuencia de (i) el acido nucleico quimerico que codifica el receptor quimerico y (ii) el constructo de acido nucleico que codifica Foxp3, bajo el control de un promotor comun (o separado) y las secuencias reguladoras.

Las celulas Treg anteriores pueden ser enriquecidas o purificadas a partir de una poblacion mixta de linfocitos o celulas T sobre la base de la expresion de las celulas T CD4 (o CD8) y CD25 y/o Foxp3. La celula puede ser sometida al siguiente tratamiento:

(a) exposicion ex vivo de:

(i) celulas mononucleares de sangre periferica,

(ii) linfocitos de sangre periferica,

(iii) celulas T enriquecidas o purificadas a partir de (i) o (ii), o

(iv) un subconjunto de celulas T enriquecidas o purificadas a partir de (iii);

a una cantidad de TGF-p u otra citoquina o agente que induce Treg que es eficaz para convertir las celulas T en un fenotipo de Treg y para inducir la expresion de Foxp3 ; y

(b) opcionalmente, el cultivo y la expansion de las celulas expuestas de la etapa (a).

Las celulas Treg preferidas comprenden la celula anterior que ha sido transducida con un vector de expresion que codifica Foxp3.

Tambien se proporciona en el presente documento es una composicion farmaceutica inmunorreguladora para la supresion de una respuesta inmune/inflamatoria mediada por celulas T efectoras o el tratamiento de una enfermedad o condicion inmunes/inflamatoria mediada por celulas T efectoras, que comprende una Treg redirigida como se describio anteriormente y un vehnculo farmaceutica e inmunologicamente aceptable, excipiente o diluyente.

Esta invencion tambien esta dirigida a un metodo para producir la Treg anterior redirigida que expresa un receptor quimerico como el descrito. Este metodo comprende preferiblemente:

(a) obtener de un sujeto y, opcionalmente, enriquecer o aislar y propagar, una poblacion de linfocitos o celulas T;

(b) inducir el fenotipo de Treg en estos linfocitos mediante la estimulacion de forma adecuada o la activacion de las celulas mediante la exposicion a TGF-p u otra citoquina o agente que induce la expresion de Foxp3 y un fenotipo de Treg;

(c) antes o despues de la etapa (b), la transfeccion o transduccion de las celulas ex vivo con un vector de expresion que codifica el receptor quimerico que se expresa en la Treg; y

(d) opcionalmente, el cultivo o expansion in vitro de las celulas obtenidas como anteriormente.

En otra realizacion, este metodo comprende:

(a) obtener de un sujeto y, opcionalmente, enriquecer o aislar y propagar, una poblacion de linfocitos o celulas T;

(b) transfectar o transducir las celulas ex vivo con un vector que codifica al receptor quimerico;

(c) antes, despues, o simultaneamente con la etapa (b), la transfeccion o transduccion de las celulas ex vivo con un constructo de expresion de acido nucleico recombinante que codifica Foxp3; y

(d) opcionalmente, el cultivo o expansion in vitro de las celulas obtenidas como anteriormente.

Esta invencion ademas esta dirigida a la poblacion anterior de celulas T redirigidas para su uso en un metodo de supresion de la actividad no deseada de celulas T efectoras en la mediacion de una respuesta inmune o inflamatoria, que comprende suministrar a una poblacion de celulas T efectoras que va a ser suprimida (o a un sitio donde dichas celulas T efectoras estan presentes) una cantidad/numero de celulas T reguladoras redirigidas como anteriormente,

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eficaz para suprimir la actividad de las celulas T efectoras.

uso en un metodo de supresion de la cuyo metodo comprende el suministro a donde dichas celulas T efectoras estan presentes) una cantidad/numero de celulas T reguladoras redirigidas producidas de acuerdo con los metodos anteriores que son eficaces para suprimir la actividad de las celulas T efectoras.

Este suministro se preferiblemente in vivo. Las celulas Treg redirigidas son suministradas por inyeccion o infusion a un sujeto en el que la actividad de las celulas T efectoras debe ser suprimida, preferiblemente por una ruta seleccionada de intravenosa, intramuscular, subcutanea, intraperitoneal, intraarticular, intratecal, intraluminal, intracerebroventricular, rectal, y topica. En una realizacion, las celulas Treg se suministran en forma regional o local a un sitio de la inflamacion.

El metodo anterior es para uso en situaciones en donde las celulas T efectoras median una respuesta o trastorno inflamatorio autoinmune, rechazo de un trasplante o enfermedad GVH.

En una realizacion, el metodo para tratar o mejorar los smtomas de una enfermedad o condicion en un sujeto que esta mediada por la actividad no deseada de las celulas T efectoras comprende la administracion al sujeto que requiera del mismo, una cantidad/numero efectivo de celulas Treg como se describio anteriormente, o una composicion farmaceutica descrita anteriormente, en donde el dominio de reconocimiento objetivo de las celulas Treg redirigidas es espedfico para un antigeno/ligando presente en el sujeto en la vecindad de las celulas T efectoras de modo que, tras el reconocimiento y union al antfgeno, estas celulas Treg redirigidas se activan para secretar citoquinas supresoras que suprimen las celulas T efectoras de una forma no espedfica del antigeno. Como se senalo anteriormente, la activacion de las celulas Treg se produce de una manera que no esta restringida por el MHC y no requiere de coestimulacion por un ligando para la protema de senalizacion coestimuladora.

Tambien se incluye un metodo para tratar o mejorar los smtomas de una enfermedad o condicion en un sujeto que esta mediada por la actividad no deseada de las celulas T efectoras, comprendiendo el metodo: (a) producir celulas Treg redirigidas utilizando los metodos de produccion descritos anteriormente; (b) la administracion al sujeto que requiera del mismo una cantidad/numero efectivo de estas celulas Treg, tratando de este modo o mejorando los smtomas de la enfermedad o condicion.

Dicho de forma mas general, la invencion esta dirigida a la poblacion anterior de celulas T redirigidas para su uso en un metodo para suprimir un proceso inmune/inflamatorio mediado por celulas T efectoras en un sujeto que requiera del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad/numero efectivo de celulas Treg redirigidas que expresan en su superficie un receptor quimerico espedfico del antfgeno que incluye porciones que activan las celulas Treg tras el contacto con el antfgeno para el cual el receptor es espedfico, siendo el antfgeno uno que esta presente en el entorno de la actividad inmune/inflamatoria. La enfermedad o condicion a tratar o mejorar es preferiblemente: (a) IBD; (b) artritis reumatoide; (c) diabetes mellitus tipo I o insulitis autoinmune; (d) esclerosis multiple; (e) tiroiditis; (f) gastritis; (g) uveftis o uveorretinitis; (h) orquitis; (I) ooforitis; (j) psoriasis; (k) prostatitis; (l) encefalomielitis; (m) vitiligo; (n) rechazo de un injerto de celulas, tejido u organos no compatibles; u (o) enfermedad GVH.

El presente metodo se usa para inhibir el rechazo de celulas, tejidos o un organo trasplantado (aloinjerto o xenoinjerto) que es, por ejemplo, no compatible para un antfgeno mayor y/o uno o mas menores de histocompatibilidad. En el caso de la enfermedad de injerto contra huesped, el receptor generalmente ha recibido un trasplante de celulas de medula osea alogenicas, semialogenicas o no compatibles con MHC o celulas madre hematopoyeticas enriquecidas o aisladas que son responsables de la mediacion de efectos patogenos.

La presente invencion esta dirigida ademas a la nueva molecula de ADN quimerica que se puede utilizar para producir las celulas T redirigidas descritas anteriormente, asf como a la protema receptora quimerica codificada por el mismo. Tal ADN quimerico comprende:

un primer segmento de ADN que codifica una region de reconocimiento extracelular espedfica para un antfgeno o ligando objetivo seleccionado, cuya region no comprende un dominio extracelular de protema del MHC, y en donde dicha region se une al antfgeno o ligando objetivo de una manera no restringida al MHC o de una manera no dependiente del MHC; el antfgeno o ligando objetivo seleccionado que es uno que esta presente o expresado en un sitio o tejido objetivo de una respuesta inmune patogenica o no deseada mediada por celulas T efectoras;

un segundo segmento de ADN que codifica una region transmembrana; y

un tercer segmento de ADN que codifica una region de senalizacion intracelular que comprende una combinacion de fracciones de senalizacion de celulas T, y

una secuencia de nucleotidos que codifica Foxp3 que, tras la transfeccion o transduccion de la molecula de acido

Tambien se pretende la poblacion anterior de celulas T redirigidas para su actividad no deseada de las celulas T efectoras como se indico anteriormente, una poblacion de celulas T efectoras que van a ser suprimidas (o a un sitio

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nucleico quimerico en una celula T, hara que las celulas T transfectadas o transducidas expresen Foxp3,

cuya combinacion de fracciones, tras la transfeccion del ADN quimerico en un linfocito T regulador (celula Treg) y union de la region de reconocimiento extracelular al antfgeno o ligando objetivo seleccionado del mismo, provoca la activacion de las celulas Treg para causar la supresion de la inmunidad mediada por celulas T,

en donde, despues de la transfeccion o transduccion de la molecula de ADN quimerico en una celula Treg, la celula T expresa un polipeptido receptor quimerico que comprende la region de reconocimiento extracelular, la region transmembrana y la region de senalizacion intracelular en una cadena continua unica, con las celulas T que muestran la region extracelular en la superficie de la celula y expresan Foxp3, convirtiendose asf en un linfocito T redirigido dotado con un fenotipo de celulas Treg, de manera que las Treg transfectadas se activan para activar y causar la supresion de la inmunidad mediada por celulas T cuando la region de reconocimiento extracelular expresada se une a su antfgeno o ligando objetivo seleccionado.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Diagrama esquematico de la estructura de TpCR espedfica de TNP. (A) Representacion esquematica de los receptores quimericos espedficos de TNP. El CR espedfico de TNP abarca un scFv derivado de los mAb anti-TNP, Sp6. En la configuracion tripartita, el scFv se une en tandem a una porcion corta de CD28 (que carece del sitio de union al ligando) de la extracelular e incluyendo la transmembrana, y dominios citoplasmaticos fusionados al dominio ITAM FcRy. (B) constructos del transgen receptor quimerico. Los constructos usados para generar los ratones transgenicos se colocaron bajo el control del promotor/reforzador de CD2 humano que dirige la expresion solo en las celulas T y NK. CYT indica dominio citoplasmatico; H, dominio de bisagra; L, grna de inmunoglobulina; LCR, region de control del locus; P, promotor; pL, secuencia del plasmido; TM, dominio transmembrana; VH y VL, dominios variables de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, respectivamente; ACD28, CD28 truncado que contiene parte del domino extracelular y transmembrana, y que carece de la fraccion de senalizacion citoplasmatica.

Figura 2: Resultados de la citometna de flujo de la tincion de Foxp3 de las Treg espedficas para TNP. Los esplenocitos aislados de ratones TNP-Tg y de tipo silvestre se tineron para Foxp3 intracelular y para el receptor quimerico espedfico de TNP usando el anticuerpo antiidiotfpico para el scFv de Sp6. Los analisis representativos de citometna de flujo se muestran para un raton individual de los cinco ratones ensayados. Los porcentajes indican celulas doblemente tenidas.

Figura 3: Grafico que muestra la relacion de celulas CD4+CD25+ con respecto a celulas CD4+ en esplenocitos de ratones de tipo silvestre y Tg. Los grupos son: los ratones de tipo silvestre, los ratones Tg para un receptor quimerico espedfico para un antfgeno "irrelevante", ErbB2 (tambien denominados como ratones ErbB2-Tg), los ratones TNP-Tg que han sido transfectados con un vector que carece del dominio coestimulador transgenico CD28 (tambien denominados como ratones TNPACD28-Tg) y TNP-Tg. Las Treg de TNP-Tg expresar plenamente el TpCR espedfico de TNP.

Figura 4: Grafico (izquierda) que muestra la relacion de celulas Foxp3+/CD4 en ratones ErbB2-Tg, TNPACD28-Tg, y TNP-Tg de tipo silvestre. Citogramas de flujo (derecha) que muestran la expresion de Foxp3 esplenica. Los resultados comparan los ratones ErbB2-Tg, TNP-Tg y TNPACD28-Tg de tipo silvestre.

Figura 5: Citogramas de flujo que muestra la tincion de Foxp3 en celulas T efectoras CD4+CD25+ de ErbB2-Tg, TNP-Tg y TNP-ACD28-Tg de tipo silvestre.

Figura 6: Grafico (izquierda) que muestra la relacion de celulas Foxp3+ con relacion a CD25+/Foxp3+. Citograma de flujo (derecha) que muestra la tincion conjunta de Foxp3 y CD25. Los resultados comparan los esplenocitos de ErbB2- Tg, TNP-Tg y TNP-ACD28-Tg de tipo silvestre.

Figura 7: Grafico que muestra el porcentaje de esplenocitos Foxp3+ en la poblacion total de celulas T CD3+ tras la induccion de la colitis inducida por TNBS. Los linfocitos del bazo se aislaron de ratones TNP-Tg y de tipo silvestre antes o 48 horas despues de la induccion de la colitis inducida por TNP, y se tineron doblemente con anticuerpos anti-Foxp3 y anti-CD3.

Figura 8: Grafico que muestra el porcentaje de linfocitos Foxp3+ extrafdos de lamina propia del colon despues de la induccion de la colitis por TNBS. Los linfocitos se aislaron de ratones TNP-Tg y de tipo silvestre antes y 48 horas despues de la induccion de colitis por TNP, y se tineron doblemente como en la Fig. 7. El porcentaje de linfocitos Foxp3+ en la poblacion CD3+ se presenta como la relacion media de Foxp3/CD3 ± la desviacion estandar de cada grupo de cinco ratones. Los datos mostrados son la media de dos experimentos realizados en forma independiente. Las diferencias en las proporciones entre los ratones TNP-Tg que indujeron colitis y los que no fueron significativas (P <0,05).

Figura 9: Serie de 6 graficos que muestran la estimulacion de la proliferacion de celulas T reguladoras redirigidas

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(izquierda) y las celulas T efectoras (derecha) mediante un estfmulo no espedfico de antigeno (mAb anti CD3 y anti CD28) y estimulo espedfico de antigeno (TNP).

Figura 10: Grafico que muestra la activacion policlonal con Concanavalina A (Con A) de cocultivos de celulas Treg y celulas T efectoras (y los cultivos de control de poblaciones de celulas individuales)

Figura 11: Graficos que muestran la activacion espedfica de las Treg de TNP-Tg y su supresion de celulas T efectoras requiere de la coestimulacion con TNP y CD28. En el panel izquierdo, se muestra la activacion espedfica (TNP) de las celulas T reguladoras. Las Treg TNP-Tg y de tipo silvestre (5 x 104) se cocultivaron con Teff TNP-Tg o de tipo silvestre (5 x 104) en presencia de APC esplenicas con TNP, sin celulas T, irradiadas, (1,5 x 105). La proliferacion de Teff se midio despues de 48 horas mediante la incorporacion 3H-Timidina. Panel derecho: APC cargadas con TNP como estimulo.

Figura 12: Grafico que muestra la respuesta a la dosis de la estimulacion espedfica de TNP de cocultivos de celulas efectoras T + celulas Treg. Las APC eran celulas de mastocitoma P815 estimuladoras P815 modificadas con TNP, que no expresan B7 (P815-TNP) o celulas P815 modificadas con TNP en las que se transfecto de forma estable el gen B7 (B7-TNP).

Figura 13: Grafico que muestra la activacion espedfica de Treg TNP-Tg y su supresion de celulas T efectoras requiere de TNP y coestimulacion de CD28. Para establecer si se requiere la senalizacion coestimuladora para la activacion de Treg TNP-Tg, se repitieron los experimentos de cocultivo utilizando como APC celulas de mastocitoma P815 irradiadas (1,5 x 105) que fueron o bien transfectadas de forma estable (o no) con ADNc de B7. La proliferacion de celulas de Teff se midio despues de 48 horas mediante la incorporacion de 3H-timidina. Cada grupo se cultivo por triplicado y se repitio el experimento tres veces. Los datos mostrados representan la media (+ d.e.) de cultivos por triplicado de un experimento representativo. Las diferencias en el mdice de estimulacion entre Treg de Teff + tipo silvestre y Treg de Teff + TNP-Tg fueron significativas (P <0,01).

Figura 14: Fotograffa de colon de ratones de tipo silvestre (izquierda) y ratones TNP-Tg (derecha) cuatro dfas despues de la induccion de colitis con TNBS en una dosis alta mediante instilacion intrarrectal de TNBS en el dfa 0.

Figura 15: Curva de mortalidad de los ratones Tg-TNP, ErbB2-Tg y TNP-ACD28-Tg de tipo silvestre (WT) despues de la induccion de la colitis por TNBS mediante instilacion intrarrectal de TNBS en el dfa 0.

Figura 16: Fotomicrograffa de tejido tenido (H&E, 40x) de los dos colon de la Fig. 14.

Figura 17: Curva de mortalidad de los ratones WT, TNP-Tg, ErbB2-Tg y TNP-ACD28-Tg despues de la induccion de la colitis con oxazolona (OXA; un hapteno/antigeno que es distinto de TNP). Estos resultados sirven como un control para la especificidad de Treg en el experimento cuyos resultados se muestran en las Figs. 14-16. La colitis se indujo usando el hapteno no relacionado, oxazolona, que se instilo por via rectal en las cepas similares de ratones (n = 10).

Figura 18: Citogramas de flujo de la tincion de Foxp3 de celulas T efectoras de ErbB2-Tg, TNP-ACD28-Tg y TNP-Tg de tipo silvestre despues de una semana de cultivo en presencia de los siguientes "estimulos" (a traves de la parte superior): anti-CD3, TGF-p, anti-CD3+TGF-p, TNP, o TNP + TGF-p.

Figura 19: Graficos que muestran la tasa de mortalidad o de supervivencia de los ratones de tipo silvestre sometidos a induccion de colitis por TNBS moderada (panel de la izquierda) y severa (panel de la derecha) despues de transferencia adoptiva de las siguientes poblaciones de Treg: WT, ErbB2-Tg, TNP-Tg y TNP- ACD28-Tg.

Figura 20: Grafico que muestra la puntuacion de severidad de la colitis de Wallach de los ratones de tipo silvestre sometidos a la induccion de la colitis con TNBS despues de la transferencia adoptiva de celulas de donantes de WT, ErbB2-Tg o TNP-TG. La colitis por TNBS se indujo en ratones WT (n = 8) en el dfa 0. Despues de 16 horas, las Treg (1x105) de ratones TNP-Tg, ErbB2-Tg o WT fueron transferidos adoptivamente a los ratones receptores. Cada experimento fue repetido tres veces. Los datos mostrados representan la media de un experimento representativo.

Figura 21: Fotograffa de los colones extirpados de los ratones de tipo silvestre en los que se indujo colitis con TNBS, despues de la transferencia adoptiva de ratones de tipo silvestre, ErbB2-Tg y TNP-Tg en el experimento descrito en la Fig. 20.

Figura 22: Fotomicrograffa de secciones de tejido de colon tenidas (H&E, 40x) de los ratones de tipo silvestre con colitis por TNBS despues de la transferencia adoptiva de Treg de los siguientes donantes: (A) de tipo silvestre (B) ErbB2-Tg y (C) TNP-Tg. El panel D muestra colon de control normal.

Figura 23: Localizacion de Treg en el colon. Citogramas de flujo de Treg de tincion fluorescentes marcadas con el colorante intracelular carboxifluorescema diacetato succinimidil ester (CFSE) en la lamina propia del colon de ratones no

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retados o ratones con colitis por TNBS. Las Treg marcadas se inyectan por via intraperitoneal 24 horas despues de la induccion de colitis con TNBS. Los linfocitos de la lamina propia se obtuvieron 16 horas despues de la transferencia adoptiva de 106 Treg de tipo silvestre o TNP-Tg a los receptores indicados. Las Treg marcadas con CFSE eran 9 veces mas abundantes en colones enfermos. Los datos mostrados representan los porcentajes de celulas positivas para CFSE en las correspondientes entradas de un raton representativo de cada grupo de cuatro ratones. Cada experimento se repitio dos veces.

Figura 24: Localizacion de celulas T reguladoras en el colon. La formacion de imagenes in vivo de ratones WT que reciben Treg de tipo silvestre y TNP-Tg marcadas con DiR (1 x 106) 16 horas despues de la induccion de colitis con TNP (n = 3). Los ratones fueron sometidos a obtencion de imagenes de cuerpo entero (sistema de obtencion de imagenes IVIS® Serie 100) a intervalos de 12 horas. Se muestra un solo raton representativo de los tres en cada grupo en todos los puntos de tiempo. Se realizaron dos experimentos independientes, con resultados similares.

Figura 25: Localizacion de las celulas T reguladoras en el colon. Evaluacion microendoscopica fluorescente in situ (Cell Vizio) de celulas T reguladoras marcadas con CFSE que se acumulan en la capa mucosa preluminal colonica. El diseno experimental es identico al descrito en la Fig. 23. La figura muestra los marcos representativos tomados 48 horas despues de la transferencia adoptiva. Cada grupo constaba de cuatro ratones, y cada experimento se repitio dos veces.

Figura 26: La administracion intrarrectal de TNBS trae como resultado un efecto protector mediado por Treg en TNP-Tg de la colitis por oxazolona. (a) Tasas de mortalidad de los ratones de tipo silvestre y TNP-Tg a los que se les suministro ± dosis bajas de TNBS, una semana despues de la sensibilizacion previa solo con oxazolona. (b) Imagenes de colonoscopia murina de ratones WT y TNP-Tg representativos. (c) Aspecto macroscopico de colones representativos de varios grupos de ratones. (d) Apariencia microscopica de colones que se muestran en c. (e) Transferencia adoptiva de las Treg (Tr) a ratones previamente sensibilizados con oxazolona (O) indujo una semana mas tarde colitis con oxazolona (O) en presencia de baja dosis de TNBS (T). Se administraron a los ratones Treg de WT o TNP-Tg (n = 8) 16 horas despues de la induccion de colitis.

La Figura 27 muestra 8 figuras esquematicas de las celulas T que son transducidas con un vector retroviral que porta uno de los 8 constructos de CR que incluyen la protema fluorescente detectable, eGFP. Los representados en la mitad inferior de la figura son constructos bicistronicos que codifican una fusion de GFP y el factor de transcripcion Foxp3. Se usaron microscopfa de luz y de fluorescencia para rastrear la expresion de la GFP en el citoplasma del nucleo de las celulas transducidas. Los constructos estan etiquetados como sigue (donde "TpCR" se refiere a un "receptor quimerico tripartita" a pesar de que, algunos de estos CR eran "mas" que tripartitas).

a. TNP-TpCR: region de reconocimiento extracelular que consta de un scFv de un mAb espedfico de TNP espedfico.

b. MD2-TpCR: region de reconocimiento extracelular que consta de un fragmento o motivo que se une a un LPS de la protema MD2 humana, un correceptor de LPS (que interactua con los receptores de TLR4). El fragmento de MD2 corresponde a los residuos 120-132 de la SEQ ID NO: 5. Las secuencias de tales acidos nucleicos quimericos utilizados aqrn son las SEQ ID NO: 8 y 9.

c. CD14-TpCR: region de reconocimiento extracelular que consta de un fragmento que se une a un LPS de la protema CD14 humana, un receptor de LPS conocido. El fragmento de CD14 corresponde a los residuos 100-119 de la SEQ ID NO: 4. Las secuencias de tales acidos nucleicos quimericos utilizados aqrn son las SEQ ID NO: 6 y 7.

d. MD2-CD14-TpCR: la region de reconocimiento extracelular que consta tanto del fragmento de MD2 y como de los fragmentos de CD14 descritos anteriormente. Las secuencias de tales acidos nucleicos quimericos utilizados aqrn son las SEQ ID NO: 10 y 11.

Cada uno de los constructos codificados como fracciones estimuladoras y coestimuladoras, secuencias unidas en tandem que codifican CD28 y FcRy. Los resultados se muestran como micrograffas una al lado de la otra con microscopio de luz y de fluorescencia.

Figura 28. Una secuencia anotada de nucleotidos (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 2) de un CR tripartita espedfico de TNP como se usa en el presente documento. Las anotaciones incluyen el origen de las regiones (scFv, aqrn el mAb "Sp6"), la region "CD28", y las regiones de FcRy (indicadas como "GAMMA"), asf como sitios de restriccion, secuencia grna, etc. La protema madura comienza en el residuo del aminoacido 23.

Figura 29. Una secuencia anotada de nucleotidos (SEQ ID NO: 3) de un plasmido pBullet que incluye un constructo que codifica CR que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el scFv de mAb HB 9081 (es decir, producido por un hibridoma dado ATCC No. de acceso HB9081) fusionado C28/FcRy. Este mAb y, por lo tanto, el scFv, es espedfico para LPS. Las anotaciones muestran varios sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion, la secuencia grna y secuencias de plasmido.

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Figura 30A-30B. La Figura 30A es una secuencia anotada de aminoacidos de CD14 humana (SEQ ID NO: 4). Vease GenBank No. de Acceso P08571. Se observan una secuencia de senal y un motivo de union a LPS (residuos 100-119). Esta protema sirve como un receptor de LPS en las celulas. La Figura 30B es una secuencia anotada de aminoacidos de la protema MD-2 humana (SeQ ID NO: 5). Vease GenBank No. de Acceso NP_056179. Se observaron una secuencia de senal y un motivo de union a LPS (residuos 120-132). Esta protema de union a LPS interactua con TLR-4 como un correceptor.

Figura 31A-31B. La Figura 31A es una secuencia anotada de nucleotidos (SEQ ID NO: 6) que muestra la secuencia de nucleotidos de un receptor quimerico que comprende al motivo de CD14, CD28-FcRv. La Figura 31B es una secuencia anotada de nucleotidos (SEQ ID NO: 7) que muestra la secuencia de nucleotidos de un receptor quimerico, bicistronico: motivo de CD14-CD28-FcRv-IRES-GFP-Foxp3. Tambien se muestra la secuencia de aminoacidos (codigo de una letra) del motivo de CD14 (residuos 110-119 de la SEQ ID NO: 4). Las anotaciones muestran varios sitios de restriccion, principios y finales de las regiones de la protema, la region IRES, etc.

Figura 32A-32B. La Figura 32A es una secuencia anotada de nucleotidos (SEQ ID NO: 8) que muestra la secuencia de nucleotidos de un receptor quimerico que comprende el motivo de MD2-CD28-FcRy. La Figura 32B es una secuencia anotada de nucleotidos (SEQ ID NO: 9) que muestra la secuencia de nucleotidos de un receptor quimerico, bicistronico: motivo de MD2-CD28-FcRy-IRES-GFP-Foxp3. Tambien se muestra la secuencia de aminoacidos del motivo de MD2 (residuos 120-132 de la SEQ ID NO: 4. Las anotaciones muestran diversos sitios de restriccion, principios y finales de regiones de la protema, la region IRES, etc.

Figura 33A y 33B. La Figura 33A es una secuencia anotada de nucleotidos (SEQ ID NO: 10) que muestra la secuencia de nucleotidos de un receptor quimerico que comprende el motivo de MD2-motivo de CD14-Cp28-FcRv. La Figura 33B es una secuencia anotada de nucleotidos (SEQ ID NO: 11) que muestra la secuencia de nucleotidos de un receptor quimerico, bicistronico: motivo de MD2-motivo de CD14-CD28-FcRv-IRES-GFP-Foxp3. Tambien se muestra la secuencia de aminoacidos del motivo de MD2 (residuos 120-132 de la SEQ ID NO: 4) y la secuencia de aminoacidos del motivo de CD14 (residuos 100-119 de la SeQ ID NO: 3). Los nucleotidos 106-148 de la SEQ ID NO: 11 (doble subrayado) codifican un enlazador flexible (14 aminoacidos, SEQ ID NO: 12, tambien doble subrayado). Las anotaciones muestran varios sitios de restriccion, principios y finales de las regiones de la protema, la region IRES, etc.

La Figura 34 es una secuencia anotada de nucleotidos (SEQ ID NO: 13) que muestra la secuencia de nucleotidos de un receptor quimerico que comprende MD2-CD28-FcRv (SEQ ID NO: 13). Tambien se muestra la secuencia de aminoacidos de la protema mD2 de longitud completa (SEQ ID NO: 4). La region de union a LPS de esta secuencia de aminoacidos esta subrayada. Las anotaciones muestran varios sitios de restriccion, principios y finales de las regiones de protemas, etc.

La Figura 35 es una secuencia anotada de nucleotidos (SEQ ID NO: 14) que muestra la secuencia de nucleotidos de un receptor quimerico, bicistronico: MD2-CD28-FcRv-IRES-GFP-Foxp3. Tambien se muestra la secuencia de aminoacidos de la protema MD2 de longitud completa (SEQ ID NO: 4). La region de union a LPS de esta secuencia de aminoacidos esta subrayada. Las anotaciones muestran varios sitios de restriccion, principios y finales de las regiones codificantes de protemas, IRES, secuencia del vector, etc.

Descripcion de las realizaciones preferidas

Definiciones

"Linfocito T regulador" o "celula T reguladora" o "Treg", tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones son sinonimos y tienen la definicion estandar tal como se utiliza en la tecnica. Las celulas Treg son una subpoblacion especializada de las celulas T que actuan de una manera "reguladora" para suprimir la activacion del sistema inmune y por lo tanto mantener la homeostasis del sistema inmune y la tolerancia a los antfgenos propios. Las Treg en ocasiones han sido denominadas celulas T supresoras. Las celulas Treg se caracterizan por la expresion del factor de transcripcion de la familia forkhead Foxp3 (forkhead box p3). Tambien pueden expresar protemas de superficie CD4 o CD8. Por lo general, tambien expresan CD25. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, y a menos que se especifique lo contrario, las Treg incluyen Treg naturales e inducidas o Treg adaptativas y Treg que han sido creadas utilizando la tecnologfa de ADN recombinante. Las celulas Treg de origen natural (CD4+CD25+Foxp3+) surgen como todas las otras celulas T en el timo. Por el contrario, las celulas Treg adaptativas (tambien conocidas como celulas Tr1 o celulas Th3) pueden originarse durante una respuesta inmune normal. La activacion espedfica de antfgenos de celulas T efectoras humanas conduce a la expresion inducible de Foxp3 en un subgrupo de las celulas efectoras activadas, y este subgrupo puede desarrollar un fenotipo regulador (Treg). Una manera de inducir celulas T reguladoras es mediante la exposicion prolongada de las celulas T efectoras a TGF-p. Las celulas T tambien se pueden convertir en celulas Treg mediante transfeccion o transduccion del gen Foxp3 en una poblacion mixta de celulas T. Una celula T que es forzada a expresar Foxp3 adopta el fenotipo de Treg y tales Treg recombinantes tambien se definen en el presente documento como "Treg".

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"Treg redirigida" pretende ser un termino exhaustivo para las Treg que portan un receptor quimerico (CR) como se describe y reivindica en el presente documento que le confiere a las celulas la capacidad de unirse a y ser activadas por un antigeno objetivo o ligando que es diferente de aquel para el cual una poblacion de Treg puede haber sido previamente espedfica (tal como se controla por su TCR espedfico de antigeno endogeno). Las Treg redirigidas son "independientes de MHC" y "no restringidas a MHC" en el proceso de su activacion y en sus acciones, ya que no requieren la asociacion de un peptido derivado de su antfgeno objetivo o ligando con MHC con el fin de reconocerlo. Sin embargo, para fines especiales, puede ser posible disenar una Treg redirigida que reconoce un epftopo espedfico de una molecula de MHC en sf, por ejemplo, que funciona como un antfgeno de trasplante. En tal caso estas Treg redirigidas aun no estan restringidas a MHC.

El termino "antfgeno o ligando objetivo seleccionado" significa una molecula a la que se pretende unir la region de reconocimiento extracelular de la Treg redirigida con el fin de activar esa Treg. Si el objetivo seleccionado es un antfgeno, entonces puede surgir un anticuerpo en contra de el y las regiones de union de tal anticuerpo utilizado para construir la region de reconocimiento extracelular de la Treg redirigida. Si la molecula objetivo es un miembro de un par receptor/ligando (definido a continuacion), entonces el otro miembro de ese par se puede utilizar como parte de la region de reconocimiento extracelular de la Treg redirigida. Generalmente, en el diseno de una Treg redirigida para uso de acuerdo con esta invencion, se identifica primero el tejido o sitio objetivo deseado o sitio donde la Treg se va a emplear y, a continuacion, se identifica un antfgeno o ligando que esta presente en o cerca de este tejido o sitio objetivo deseado. A continuacion, se identifica un anticuerpo o ligando/receptor que se une al mismo, o, si es necesario, se crea o se construye para su uso en la Treg redirigida.

El termino "ligando" como se usa en el presente documento, y en particular como parte del termino "antfgeno o ligando objetivo" o el termino "par receptor/ligando" se refiere a una molecula que es capaz de unirse a y formar un complejo con otra biomolecula para servir a un proposito biologico. A menudo, la pareja de union de un ligando se denomina un receptor de manera que las dos parejas de union se denominan un "par receptor/ligando". Para el proposito de la presente especificacion y reivindicaciones, el termino "receptor", cuando se usa en el sentido de un "par receptor/ligando", tiene un significado mas amplio que, por ejemplo, una definicion tfpica de un "receptor" como una protema en o sobre una celula que se une a un ligando espedfico. Mas bien, pretende significar cualquier pareja de union para un ligando. Cualquier miembro de un par de union puede ser considerado como el "ligando", mientras que el otro miembro es considerado como el "receptor". Por lo tanto, un receptor clasico puede calificar como un "ligando" cuando se usa en el presente documento en el termino "antfgeno o ligando objetivo", ya que es un miembro de un par de union receptor/ligando. Por ejemplo, IL-2 puede ser un ligando, ya que se une a y forma un complejo con otra biomolecula, es decir, un receptor de IL-2 (IL-2R), para servir a un proposito biologico. Sin embargo, IL-2r es tambien un "ligando", porque es una molecula que se une y forma un complejo con otra biomolecula, es decir, IL-2, para servir a un proposito biologico. Asf, bajo el presente uso, si IL-2R se considera un ligando en el par de union IL2R/IL-2, IL-2 puede ser considerado el receptor, y viceversa.

Un "receptor quimerico", como se usa en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, es un polipeptido recombinante que incluye una region de reconocimiento extracelular que se deriva de una molecula y al menos una fraccion de senalizacion intracelular que se deriva de una molecula diferente. En ese sentido, es quimerico.

Un "acido nucleico quimerico" es un polinucleotido recombinante que incluye una secuencia que codifica un receptor quimerico.

Los terminos "recombinante" o "en forma recombinante" cuando se aplican a un polinucleotido, polipeptido o celula significan que la molecula o celula se elaboran mediante tecnicas de ingeniena genetica, no existinan de no ser por la intervencion humana.

El termino "fraccion de polipeptido de senalizacion de celulas T" significa la porcion de una molecula endogena a una celula T que media la senalizacion. Puede ser una parte de una molecula receptora de las celulas T que media la senalizacion, o una enzima de transduccion de la senal secuencia abajo o una porcion de la misma que media la senalizacion, es decir, que tiene actividad enzimatica.

El termino "dominio del scFv derivado del anticuerpo" significa un anticuerpo de cadena sencilla en donde Vl de un anticuerpo espedfico se une al Vh del mismo mediante un enlazador o espaciador flexible.

El termino "un dominio extracelular de la protema del MHC" se refiere a la divulgacion de Meal DJ y colaboradores. (Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 11817-22), discutido mas adelante, y Jodi MD y colaboradores, Nat. Biotechnol., 2002, 20: 1215-1220. Estas publicaciones describen celulas Treg redirigidas contra celulas T en un sistema murino. Utilizaron las cadenas Is a e Is p del MHC clase II como regiones extracelulares de dos receptores quimericos separados para su uso en una Treg redirigida. El termino dominio extracelular de la protema del mHc se define para poder abarcar lo que se utilizo en las publicaciones de Meal y colaboradores y Jodi y colaboradores cualquiera de sus analogos o fracciones que hubiera sido obvia para una persona experta en la tecnica para sustituir por tales dominios con el proposito divulgado por Meal y colaboradores y por Jodi y colaboradores, es decir, para provocar la union de la Treg redirigida a un linfocito T dirigido espedficamente a un autoantfgeno particular.

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El termino "espaciador flexible" significa cualquier fraccion flexible de peptidico que facilitara la funcionalidad de la region de reconocimiento extracelular. Cuando esta region no esta unida ngidamente a la region transmembrana, pero se permite un cierto grado de flexibilidad con respecto a la membrana celular, la capacidad de la region de reconocimiento para reconocer y unirse a su antigeno o ligando objetivo se ve facilitada. Los pequenos aminoacidos neutros, tales como glicina y serina, confieren tal flexibilidad. Ejemplos son Gly4Ser y Gly4Ser3.

La "superfamilia de las inmunoglobulinas" (Ig) significa el gran grupo de protemas de la superficie celular y solubles que estan implicadas en los procesos de reconocimiento, union, o adhesion de las celulas. Las moleculas se clasifican como miembros de esta superfamilia con base en las caractensticas estructurales compartidas con inmunoglobulinas (tambien conocidas como anticuerpos); todos ellas poseen un dominio conocido como un dominio o plegamiento de la inmunoglobulina. Los miembros de la Ig incluyen diversos receptores antigenicos de la superficie de la celula, correceptores y moleculas coestimuladoras del sistema inmune, moleculas implicadas en la presentacion de antfgenos a los linfocitos, moleculas de adhesion celular y ciertos receptores de citoquinas. Estan comunmente, aunque no exclusivamente, asociados con funciones en el sistema inmunologico.

El termino "bisagra" cuando se refiere a una region de una molecula de la Ig significa la region entre los dominios de Ch1 y Ch2 que consiste en un pequeno numero de aminoacidos. La bisagra es flexible y permite que la region de union se mueva libremente con relacion al resto de la molecula. En la region de bisagra son los puentes disulfuro que unen los dos dfmeros, creando la unidad estructural tetramerica. Ejemplos de tales secuencias de bisagra de la inmunoglobulina se pueden encontrar en la patente estadounidense No. 6.165.476, que se incorpora aqu por referencia.

El termino "receptor espedfico de antfgeno de una celula T" se refiere a un receptor que se encuentra en una celula T que es espedfica del antfgeno, es decir, naturalmente tiene una region extracelular que se une espedficamente a un antfgeno particular de preferencia a otro. Ejemplos de tales receptores espedficos del antfgeno de una celula T son las cadenas a, p, y o 6 del TCR, el dfmero TCRap y el dfmero TCR.

El termino "complejo TCR/CD3" a veces se llama el "complejo TCR". CD3 es un complejo de protema compuesto de cuatro cadenas en mairnferos (las cadenas CD3y, CD36 y dos CD3£), que se asocian con moleculas conocidas como el receptor de celulas T (TCR; vease mas arriba) y con la cadena Z y la cadena n (como homo o heterodfmeros) para generar una senal de activacion en linfocitos T. Las colas intracelulares de estas moleculas de CD3 contienen un solo motivo conservado conocido como un "motivo de activacion inmunorreceptor basado en tirosina" o ITAM en forma corta, que es esencial para la capacidad de senalizacion del TCR. Las cadenas CD3-y, 6, y £ y las cadenas Z y n, tambien conocidas como cadenas CD3-Z y CD3-n, junto con el TCR, forman lo que se conoce como el complejo receptor de celulas T.

El termino "protema coestimuladora-receptora de celulas T" significa un receptor de la celula T que proporciona una senal coestimuladora. Durante la activacion de las celulas T, la coestimulacion a menudo es crucial para la generacion de una respuesta inmune efectiva. Las celulas T requieren dos senales para ser plenamente activadas. Una primera, la senal espedfica de antfgeno se proporciona a traves del complejo receptor/CD3 de celulas T. Una segunda senal, la senal coestimuladora, es antfgeno no espedfica del antfgeno y es proporcionada por moleculas coestimuladoras expresadas en la membrana de las celulas T. Los ejemplos de protemas coestimuladoras-receptoras de celulas T son CD28, OX40, CD40L, 4-1BB y PD-1.

La presente invencion se basa en la concepcion de que las celulas T reguladoras (Treg) que han sido modificadas para poseer especificidad antigenica similar al anticuerpo, puede ser aprovechada para suprimir la funcion de las celulas T efectoras in vivo. La accion de estas celulas Treg esta mediada en una forma no espedfica del antfgeno, principalmente por la liberacion de citoquinas supresoras en la vecindad donde las celulas T reguladoras son activadas o estimuladas por un antfgeno reconocido por su TpCR. Una vez activadas, las celulas T reguladoras pueden suprimir las respuestas de celulas T espectadoras. Por lo tanto, la transferencia de estas celulas que han sido modificadas para expresar los CR (como se describe en el presente documento) en un sujeto en quien se desea suprimir una respuesta de celulas T efectoras y su inflamacion concomitante o consiguiente, y su administracion a, y activacion en el sitio de tal actividad inflamatoria, produce efectos terapeuticos.

Por lo tanto, las enfermedades o condiciones objetivo preferidas para esta invencion son enfermedades autoinmunes, mas preferiblemente, enfermedades autoinmunes mediadas por celulas T espedficas de un organo. Otros ejemplos de la capacidad de respuesta inmune no deseada detectada en el presente documento son el rechazo de injerto de injertos de tejido y organos solidos, asf como injertos de celulas suspendidas (por ejemplo, trasplantes de medula osea (Bm) o trasplante de celulas madre hematopoyeticas (HSV)). Otra enfermedad objetivo es la enfermedad de injerto contra huesped (GVH), que es una consecuencia comun de un trasplante de BM o HSV no compatible. Una condicion adicional considerada en esta invencion es el rechazo de trasplantes (por ejemplo, de un rinon no compatible) donde las celulas efectoras inmunes del receptor rechazan el injerto.

Debido a que el factor de transcripcion Foxp3 (un miembro de la familia forkhead) parece ser esencial para el desarrollo y la funcion de Treg, y es un marcador distintivo para estas celulas (junto con CD4 y CD25), la presente invencion proporciona metodos para producir celulas T reguladoras, asf como proporcionar las Treg producidas por estos

metodos, que se basan en la induccion de Foxp3 en las celulas T en un proceso de conducir las celulas a lo largo de la v^a hasta la condicion de Treg.

En otra realizacion, se transduce o transfecta el ADN que codifica Foxp3 en celulas T utilizando cualquier vector de expresion adecuado como vedculo de administracion en un proceso para conducir estas celulas hasta convertirse en 5 celulas T reguladoras. Mas apoyo para esta concepcion se encuentra en los reportes de que la prevencion de la expresion de Foxp3 in vivo se traduce en animales con una propension para el desarrollo de trastornos autoinmunes y linfoproliferativos (Sakaguchi S, y colaboradores, J Immunol 1995; 155: 1151-1164; Hori S y colaboradores, Science 2003; 299: 1057-1061; Khattri R, y colaboradores, citado mas arriba; Fontenot JD y colaboradores, Nat Immunol. 2003; 4: 330-6).

10 La poblacion de partida puede ser PBL totales, celulas T que han sido enriquecidas o aisladas de PBL o celulas T CD4+ que han sido enriquecidas o aisladas a partir de tales celulas T (ya sea que expresan CD25 o no). Estas celulas pueden ser redirigidas mediante la transduccion del TpCR antes de, concomitantemente con, o despues de la transduccion del ADN que codifica ADN de Foxp3, preferiblemente en la forma de un vector de expresion de Foxp3. Walker MR. y colaboradores, 2005, Proc Natl Acad Sci USA. 102: 4103-8, han demostrado que las celulas Treg CD4+CD25+ 15 humanas espedficas del antigeno pueden ser generadas de nuevo a partir de celulas CD4+CD25-. La ventaja de la presente invencion sobre el enfoque descrito por Walker y colaboradores es que la especificidad del antigeno y los requisitos de activacion de Treg son independientes del MHC. Esta mejora importante hace que el aislamiento y la activacion de celulas T reguladoras espedficas del antfgeno sean mas simples y permite metodos terapeuticos (descritos a continuacion) en los el antfgeno se puede administrar convenientemente junto con las celulas Treg 20 transferidas a un sitio deseado, tal como un sitio inflamatorio, ejemplificado por la de colon en la IBD.

Celulas T reguladoras inducibles contra las de origen natural

Las Treg "clasicas" de origen natural son derivadas del timo, expresan altos niveles de Foxp3 y suprimen la activacion de los linfocitos efectores. La activacion espedfica del antfgeno de celulas T efectoras humanas conduce a la expresion inducible de Foxp3 en un subgrupo de las celulas efectoras activadas, cuyo subgrupo puede desarrollar un fenotipo 25 regulador (Treg). Estas celulas T reguladoras inducidas pueden suprimir (independientemente del contacto celular) celulas efectoras recien aisladas (Walker MR, y colaboradores, 2005, citado mas arriba; Walker MR, y colaboradores, 2003, J Clin Invest. 112: 1437-1443). En ratones, tanto la induccion in vitro como in vivo de las Treg se logra mediante la exposicion prolongada de las celulas efectoras a TGF-p (Wan YR, y colaboradores, 2005, Proc Natl Acad Sci USA. 102: 5126-31; Mantini MC, y colaboradores, 2004, J Immunol 72: 5149-53; Mantini y colaboradores, 2006, citado mas arriba). 30 Esta poblacion pequena, generada perifericamente de celulas T reguladoras inducibles se cree que juegan un papel central en la regulacion y que contienen las respuestas inmunes en curso tal como la falta de induccion de Treg se asocia con una propension a la autoinmunidad.

Manipulacion genetica de las celulas reguladoras T CD4+CD25+

DE acuerdo con la presente invencion, los enfoques que espedficamente redirigen las celulas T reguladoras para 35 suprimir la actividad de las celulas T patologicos son beneficiosos en condiciones inflamatorias, facilitando la localizacion de celulas T reguladoras en los sitios inflamatorios y su activacion espedfica mediante antfgenos asociados con la inflamacion. Cuando se activan espedficamente en las lesiones inflamatorias, se espera que tales celulas T reguladoras atenuen la enfermedad inflamatoria mediante la supresion de los linfocitos T efectores patogenos en una forma no restringida al MHC, no espedfica del antfgeno.

40 La activacion independiente de MHC y la accion de las celulas Treg de acuerdo con la presente invencion es una ventaja importante. Tal accion se contrasta con el reporte de Meal DJ y colaboradores. (Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 11817-22) de un estudio de la encefalomielitis alergica experimental (EAE), que describe celulas Treg CD4+25+ redirigidas contra celulas T reactivas del epftopo 89-101 de protema basica de mielina (MBP) por un CR que incluye el epftopo de MBP enlazado a la protema del mHc clase II. Mediante el refuerzo de la interaccion entre una celula Treg y 45 las celulas T autorreactivas dirigidas contra el epftopo 89-101 de MBP, la actividad de Treg esta enfocada espedficamente al antfgeno contra las celulas T autorreactivas. Un modelo de este tipo requiere un cierto grado de dependencia del MHC ya que CR unico solo puede tener dominios de un MHC unico y por lo tanto solo se puede utilizar para pacientes con esa HLA caractenstica.

Por el contrario, las celulas Treg de la presente invencion actuan para suprimir las celulas T efectoras patogenas de una 50 forma independiente del MHC, haciendolas mas ventajosas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes/ inflamatorias porque pueden elegir como blanco antfgenos objetivo comunes compartidos entre muchos individuos. En el modelo de Meal y colaboradores, citado mas arriba, las Treg actuan mediante acoplamiento con MHC y restringido al antfgeno. A medida que estas celulas T reguladoras, que expresan el ligando que es reconocido por el TCR de las celulas T autorreactivas, son estimuladas por esta interaccion y suprimen las celulas efectoras. Sin embargo, como 55 enfoque cftnico este sufre de la desventaja de que se requerina compatibilidad completa del MHC dl donante-receptor en la poblacion humana en la que la diversidad de MHC (HLA) es sustancial. Por otra parte, este enfoque estana limitado a la supresion de clones que son autorreactivos contra un unico epftopo peptfdico reconocible en el contexto del

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MHC-II definido (HLA-DR). Una ventaja adicional significativa de la presente invencion es que supera el requisito de que el antigeno patogenico se conocido. De hecho, los antigenos asociados con enfermedades en un gran numero de trastornos autoinmunes humanos, incluyendo IBD humana, no son aun conocidos y pueden muchos.

El enfoque de "cuerpo T" de la presente invencion

El enfoque del "cuerpo T" fue disenado por uno de los presentes inventores y sus colegas como una modalidad novedosa para la redireccion y activacion espedfica de linfocitos T efectores hacia objetivos predefinidos, sobre todo los asociados con procesos neoplasicos (por ejemplo, Pin thus JHU y colaboradores, J Clin Invest 2004; 114: 1774-1781) y enfermedades infecciosas (Bitton N, y colaboradores, Curr Top Microbiol Immunol 2001; 260: 271-300). El enfoque del cuerpo T estaba destinado a superar la relativa inaccesibilidad de los anticuerpos a ciertos sitios (tal como tumores solidos) y la ineficacia general de los linfocitos infiltrantes del tumor para combatir tumores solidos mediante la combinacion en una poblacion de celulas efectoras de las propiedades de los brazos humoral y celular del sistema inmune (Gross G y colaboradores, 1989; citado mas arriba. Eshhar Z, y colaboradores, Br J Cancer Suppl, 1990; 10: 279).

Los receptores quimericos preferidos del cuerpo T comprenden una porcion de union al ligando, preferiblemente (1) una region variable del anticuerpo de cadena unica (scFv) dirigida contra un antigeno asociado a la enfermedad, ligado a (2) un espaciador extracelular opcional y una region transmembrana y (3) una o mas fracciones intracitoplasmaticas de celulas T coestimuladoras y moleculas estimuladoras/de senalizacion. Tales CR como los desarrollados inicialmente permiten un reconocimiento espedfico similar a anticuerpos, no restringido al MCH, alojamiento y penetracion de tejidos neoplasicos. Dentro de los tejidos objetivo, la activacion espedfica del antfgeno de las celulas T efectoras que portan al receptor quimerico permite la destruccion mediada por celulas T de las celulas tumorales ya sea por citotoxicidad directa o por la induccion de una respuesta inflamatoria local.

Aunque el dominio del scFv es la unidad de reconocimiento preferida de la presente invencion, en otras realizaciones, puede ser sustituida por otra estructura que sirve como un ligando de direccionamiento (o companero de union al ligando) que facilitara traer las celulas Treg que expresan el CR a un sitio seleccionado o un antfgeno seleccionado. Capon y sus colegas han divulgado una cantidad de CR de este tipo, tal como uno donde un polipeptido companero de union al ligando se fusiona en su terminal C al terminal N de una region constante de inmunoglobulina. Vease, por ejemplo, Roberts MR. y colaboradores, Blood 1994; 84: 2878-89; Ashkenazi A y colaboradores, Int Rev. Immunol. 1993; 10: 219-27; Chamow SM y colaboradores, Int J Cancer Suppl. 1992; 7: 69-72. Veanse tambien las patentes estadounidenses Nos. 6.710.169; 6.407.221; 6.406.697; 6.319.494; 6.117.655; 6.103.521; 6.077.947; 5.741.899; 5.714.147; 5.514.582; 5.455.165; 5.428.130; 5.359.046; 5.336.603; 5.225.538; y 5.116.964. Todos estos documentos se incorporan por referencia en su totalidad.

El polipeptido CR de la presente invencion se caracteriza en terminos generales por comprender (1) una porcion extracelular o un dominio capaz de unirse a un ligando (tal como un antfgeno objetivo) de una manera no restringida a MHC, (2) un espaciador extracelular opcional y un dominio transmembrana y (3) una region citoplasmatica (uno o mas dominios) capaz de activar una via de senalizacion intracelular.

Ejemplos de CR preferidos de celulas T comprenden un primer dominio de union, un ejemplo preferido de los cuales es un fragmento scFv extracelular derivado de un anticuerpo monoclonal (mAb) espedfico para un antfgeno seleccionado. El dominio anterior se fusiona a un dominio espaciador (preferiblemente un dominio de bisagra de la familia de Ig que proporciona espaciamiento y flexibilidad), un dominio transmembrana, una region coestimuladora, por ejemplo, partes de una molecula de CD28, y una fraccion de senalizacion intracelular adicional para celulas T. Ejemplos de estos ultimos incluyen una cadena Z o una cadena n asociada al complejo TCR/CD3, o una region citoplasmatica que contiene ITAM, tal como la cadena y de un receptor del Fc de Ig (FcRy). Un ITAM es un "motivo de activacion del inmunorreceptor basado en tirosina; para una revision, vease Humphrey MB y colaboradores, Immunol Rev. Dic de 2005; 208: 50-65; Pitcher LA y colaboradores, Trends Immunol. 2003; 24: 554-60; Isakov N, Receptors Channels. 1998; 5: 243-53; Daeron M, Annu Rev. Immunol. 1997; 15: 203-34; Isakov N, J Leukoc Biol. 1997, 61: 6-16; Cambier JC, J Immunol. 1995; 155: 3281-5; Flaswinkel H y colaboradores, Semin Immunol. 1995; 7: 21-7, todos los cuales se incorporan por referencia en su totalidad. Tambien es posible utilizar las porciones intracelulares de moleculas receptoras TCR a, p, y o 5 en el CR para este proposito. La fraccion de senalizacion de un receptor de citoquina tambien puede estar presente en la cadena del receptor quimerico para su uso en la presente invencion. Por ejemplo, la adicion de la porcion de senalizacion del receptor de IL-2 hara que la celula Treg actue ademas como si hubiera sido sometida a IL-2 externa tras la union del dominio de direccionamiento extracelular al antfgeno o ligando objetivo seleccionado. Ademas, la adicion de la fraccion de senalizacion del receptor de TGFp inducira una celula T efectora para convertirse en una celula Treg y por lo tanto esto tambien puede ser una adicion util a la cadena del receptor quimerico de la presente invencion. Tales CR expresados en las celulas T son conocidos por ser funcionales y, tras la exposicion al antfgeno, promueven la produccion de citoquina (y, cuando se expresan en un tipo de celula efectora apropiada en el estado de la tecnica, promovieron la lisis de celulas objetivo que portan el antfgeno (Stancovski I, y colaboradores, J Immunol 1993; 151: 6577-82)).

Una configuracion inicial de un CR con base en scFv comprendfa un dominio de reconocimiento extracelular y una

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fraccion de senalizacion intracelular. La activacion completa de tales cuerpos T a traves del CR requirio ya sea de estimulacion previa del cuerpo T o activacion de una via coestimuladora por la exposicion a celulas presentadoras de antigeno (ApC) que portan CD08/CD86 (B7).

La creacion de un receptor quimerico tripartita (TpCR) por uno de los presentes inventores y por otros (Pule MA, y colaboradores, Mol Ther. 2005; 12: 933-41)), en donde se anadio el dominio de senalizacion de la molecula coestimuladora CD28 al dominio citoplasmatico del CR, permitio la activacion mediada por antigeno tanto de las vfas de senalizacion estimuladoras y coestimuladoras independiente de las interacciones B7-CD28 (Eshhar y colaboradores, 2001, citado mas arriba). Este enfoque facilita la activacion completa de los linfocitos que expresan scFv, dando como resultado efectos mejorados (en el caso de las celulas T efectoras, antitumorales mejorados; Pin thus JHU y colaboradores, citado mas arriba).

Otro dominio de senalizacion intracelular util para la presente invencion es todo o parte del dominio citoplasmatico de una fosfotirosina quinasa (por ejemplo, una molecula de la familia Syk) que esta fusionado al CR. Vease, por ejemplo, Eshhar Z & Fitzer-Attas CJ, Adv Drug Deliv Rev. 1998; 31: 171-82; Fitzer-Attas CJ y colaboradores, J Immunol. 1998; 160: 145-54; y Eshhar Z y colaboradores, Springer Semin Immunopathol. 1996; 18 (2): 199-209. El uso de tal fraccion de senalizacion no pasa por eventos de senalizacion proximos a la membrana que a menudo son defectuosos en las celulas T de los sujetos con inflamacion aguda o cronica o cancer.

Dominios/regiones coestimuladoras y senales en el receptor quimerico tripartita

La expresion retroviral mediada de CR en las celulas T en general requiere la activacion de celulas T cuya activacion se consigue normalmente mediante el uso combinado de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Tal activacion previa fue suficiente para cebar las celulas T que responden a una senal mediada a traves del CR tras la interaccion con el antigeno para el que el CR es espedfico tanto in vitro como in vivo (por ejemplo, Schwartz RH; Annu Rev Immunol 2003; 21: 305-34). Una senal coestimuladora es ventajosa para la funcion optima y sostenida de las celulas T y reactivacion impulsada por el antigeno, incluso mediante objetivos que a menudo carecen de ligandos para moleculas coestimuladoras.

La estimulacion del antigeno solo de los CR que carecen de una estructura o mecanismo para senalizacion coestimuladora es generalmente inadecuada para activar a los linfocitos en descanso o sin alteracion (Brocker T y colaboradores, J Exp Med 1995; 181: 1653-9). Por lo tanto, en ausencia de senalizacion coestimuladora por CD28, los linfocitos T en reposo normalmente experimentan anergia o apoptosis (Boussiotis VA y colaboradores, Immunol Rev 1996; 153: 5-26). Para una discusion adicional de CD28 y sus interacciones con B7, consultar tambien, L. Chen (ed.) The B7-CD28 Family Molecules, Landes Bioscience, 2003, que se incorpora por referencia en su totalidad.

Para superar estas limitaciones en los CR utilizados en la presente invencion, el primer dominio (reconocimiento), preferiblemente un dominio de scFv, se enlaza preferiblemente a traves de un espaciador de bisagra de la Ig y segmentos transmembrana al segmento intracelular de una molecula de senalizacion coestimuladora, preferiblemente CD28, y luego a una region de activacion intracelular, tal como de la cadena Z de CD3 o la cadena y de FcR. Se encontro que la coexpresion de dos CR, cada uno con el mismo scFv, el primero enlazado a Z de CD3 y el segundo a CD28, proporciona las senales estimuladoras y coestimuladoras necesarias para la activacion de celulas T (Beecham EJ y colaboradores, J Immunother, 2000; 23: 631-42).

Por lo tanto, en una realizacion preferida en la presente invencion, un sitio de reconocimiento extracelular, preferiblemente un sitio de reconocimiento con base en el anticuerpo tal como un scFv, se enlaza a un dominio intracelular de CD28 "en serie" y ademas se enlaza a la region de senalizacion intracelular de la cadena Z del complejo TCR. Tal constructo era 20 veces mas potente en la estimulacion de la produccion de IL-2 tras la exposicion al antfgeno en fase solida (en comparacion con los CR que expresan transfectantes que carecen del dominio de CD28 (Finney HM y colaboradores, J Immunol 1998; 161: 2791-7)). Intracelularmente, este dominio en el CR se une a la subunidad p85 de fosfatidilinositol 3'-quinasa.

Uno de los presentes inventores diseno un CR tripartita novedoso compuesto de un fragmento de reconocimiento de scFv fusionado a la parte que no se une al ligando del dominio extracelular (ECD) de CD28, toda la transmembrana y dominios intracelulares de CD28, y el dominio estimulador intracelular de FcRy ("scFv-CD28-Y") (Eshhar y colaboradores, 2001, citado mas arriba). Los PBL humanos transducidos con un constructo de acido nucleico que codifica este CR fueron espedficamente estimulados para producir IL-2. La activacion dependio de la actividad coestimuladora de CD28.

El laboratorio de los presentes inventores ha generado varias lmeas de ratones Tg que expresan CR bajo el control de secuencias reguladoras espedficas de celulas T. Los linfocitos T de ratones no modificados sin imprimacion, que son Tg para las respuestas potentes manifestadas por el TpCR scFv-CD28-Y (proliferacion, secrecion de IL-2, y rescate de la apoptosis) tras la estimulacion unicamente por el antfgeno afm en forma inmovilizada (Friedmann-Morvinski D y colaboradores, citado mas arriba).

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De acuerdo con la presente invencion, moleculas distintas de, o ademas de, CD28 son explotadas para proporcionar senales coestimuladoras cuando se incluye en la presente configuracion de CR. Los ejemplos preferidos de estas son los miembros de la familia "coestimuladora inducible" (ICOS), que incluye OX40 (CD 134), al ligando CD40 (CD40L, CD154), PD-1 ("receptor 1 de muerte programada"), y 4-1BB (CD137). Cada uno de estos pares ligando/receptor posee funciones distintas que difieren de acuerdo con la naturaleza del estfmulo y la "historia antigenica" de las celulas T en las que se expresan. Por ejemplo, la senalizacion de CD28 esta acompana por induccion de ICOS, que, a su vez, coestimula la activacion de celulas T CD4+. El acoplamiento de OX40 (estudiado en el contexto de inmunoterapia adoptiva espedfica del tumor) mejoro la supervivencia y las acciones antimetastasicas de las celulas T efectoras mediante un mecanismo que depende de celulas T auxiliares CD4+ (Weinberg AD, Trends Immunol 2002; 23: 102-9). La activacion de OX40 promueve la expresion de protemas antiapoptoticas Bc/-XL y Bcl-2 y, en consecuencia, mejora la supervivencia y por lo tanto el numero de celulas T CD4+ espedficas del antfgeno, dando como resultado una memoria mas fuerte de celulas T CD4+ espedficas del antfgeno. El acoplamiento del receptor coestimulador 4-1BB (CD137) con su ligando, 4-1BBL, aumento la proliferacion, supervivencia y produccion de citoquinas inducidas por TCR tanto en celulas T CD4+ como CD8+ (Cheuk AT y colaboradores, The Cancer Gene 2004; 11: 215-26). La supervivencia celular se asocio con una mayor expresion de los genes antiapoptoticos bc/-XL y bfl-l. En general el par que interactua ligando/ receptor 4-1BB/4-1BBL actua para amplificar senales coestimuladoras existentes, en particular las que emanan de CD28 (Guinn BA y colaboradores, J Immunol 1999; 162: 5003-10). Las celulas T CD4+ humanas expresan PD-1 y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, tras la activacion. Los anticuerpos para el receptor pueden ser agonistas o antagonistas de la via apoptotica. El acoplamiento de PD-1 puede promover la coestimulacion mediada por ICOS o CD28. (por ejemplo, Bennett F y colaboradores, J Immunol 2003; 170: 711-8.

La actividad de los dominios coestimuladoras de CD28, ICOS, OX40 (CD134), y 4-1BB (CD137) en los CR tambien se conoce en celulas T CD4+ y CD8+ humanas (Finney HM y colaboradores, J Immunol 2004; 172: 104-13). En ese estudio, los genes tripartitos se sometieron a electroporacion en las celulas para evitar la activacion previa de las celulas. Cuando las celulas T que portan CR fueron estimuladas por su antfgeno espedfico (CD33), mejoro dramaticamente la liberacion de citoquina y la actividad citotoxica en comparacion con las celulas en las que los CR caredan de estructuras de senalizacion coestimuladoras. La inclusion del dominio de senalizacion 4-1BB como fraccion coestimuladora en un TpCR en linfocitos T humanos con especificidad contra el antfgeno CD 19 (anti-CD 19-1BB-Z) dio lugar a una potente citotoxicidad contra las celulas objetivo de leucemia linfoblastica aguda que portan CD19 in vitro (Imai C, y colaboradores, 2004; 18: 676-84).

Aunque la presente invencion incluye el uso de un dominio intracelular o parte de cualquiera de estas secuencias coestimuladoras en el CR, no es seguro que la senalizacion evocada por estas moleculas tenga ventajas practicas sobre el uso de las secuencias coestimuladoras CD28 solas. Por lo tanto, a pesar de que el desempeno de CD28 parece hasta ahora ser muy satisfactorio tanto in vitro como in vivo, la presente invencion incluye dentro de su alcance el uso de sistemas coestimuladores adicionales o alternativos para CD28 para la generacion de celulas T reguladoras que se comportan de manera optima en la supresion de las celulas T efectoras y el tratamiento autoinmune/inflamatorio y otras condiciones como se describe aqrn. 4-1BB ha sido utilizado con exito como una alternativa a CD28 en cuerpos T. Ver Zhang y colaboradores, J. Immunol, 2007; 179: 4910-4918.

Transferencia de celulas T reguladoras redirigidas a los sujetos receptores

El uso de celulas T transferidas in vivo en terapia adoptiva requiere que las celulas transferidas sobrevivan, superen los mecanismos de control homeostaticos del huesped que pueden servir para obstaculizar la aceptacion de estas celulas, y migren (permanezcan, o circulen) y se acumulen o se localicen en, el(los) sitio(s) objetivo deseado(s).

El sistema inmune utiliza estfmulos internos para regular el tamano total de combinaciones de linfocitos. El numero total de linfocitos T perifericos se mantiene bastante constante, a pesar de la produccion de nuevas celulas, renovacion de las celulas existentes, y la expansion clonal de celulas espedficas del antfgeno durante una respuesta inmune (Jameson SC. Nat Rev Immunol 2002; 2: 547-56). Estos "estimulos internos", incluyen citoquinas y ligandos del MHC del mismo peptido para el TCR. Se cree que al menos dos mecanismos generales son los responsables de los efectos homeostaticos de las celulas T espectadoras en la limitacion de la proliferacion: (1) la inhibicion por interacciones ffsicas de las celulas T con celulas T; y/o (2) competencia por los "recursos" limitados (por ejemplo, IL-7 y el acceso a las APC con ligandos adecuados propios del MHC). Las citoquinas mas importantes en este proceso son las que senalizan a traves de receptores que contienen una cadena y comun, denominadas colectivamente "citoquinas yC". Estas incluyen IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, e IL -21. El control homeostatico de la expansion de celulas T no modificadas (examinadas in vitro) esta soportado por IL-4, IL-7, IL-15 e IL-21 a traves de la region transmembrana CD28, mientras que solo parece requerirse de IL-7 in vivo (Jameson, citado mas arriba).

El agotamiento de los linfocitos o "destruccion de linfocitos" se lleva a cabo preferiblemente para acondicionar un receptor de las celulas T reguladoras transducidas de la presente invencion. Se puede utilizar cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, irradiacion, tratamiento con ciertos antimetabolitos tales como fludarabina, etc. Tales tratamientos han sido utilizados en combinacion con terapia adoptiva de celulas T en otros contextos. Se sabe que el agotamiento de los linfocitos in vivo realizado como una etapa previa de la transferencia adoptiva de celulas refuerza la actividad inmunoterapeutica antitumoral en ratones y en seres humanos (como se estudio particularmente

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con celulas T efectoras autologas reactivas a los tumores; Klebanoff CA y colaboradores, Trends Immunol 2005; 26: 111-7). En ensayos clmicos, se observaron tasas de respuesta objetivas del 50% en pacientes con tumores metastasicos solidos que hadan sido sometidos primero a agotamiento de linfocitos. Los mecanismos que se cree que son la verdadera razon de tales efectos incluyen: la eliminacion de los 'sumideros' de citoquina celular para citoquinas YC homeostaticas (tales como IL-7, IL-15 y, posiblemente, IL-21 (que sirven para activar y expandir las celulas T efectoras )), la induccion de apoptosis de celulas tumorales y necrosis junto con la activacion de APC, y, lo mas importante para la presente invencion, el deterioro de las celulas Treg CD4+CD25+ que suprimen las celulas T efectoras.

Como se ha indicado, el tratamiento con citoquinas homeostaticas se puede utilizar para mantener las poblaciones de Treg en el receptor.

El presente grupo de inventores encontro que la activacion de las celulas T en general y, de cuerpos T en particular (tal como la que se requiere durante manipulaciones ex vivo para expresar el CR con ciertos vectores) subregulo la expresion del receptor de quimoquinas CXCR4, deteriorando de este modo la vuelta al reposo de las celulas T en respuesta a la quimoquina SDF-1, por ejemplo. SDF-1 es un quimioatrayente para celulas T que expresan el CXCR4 (Bleul CC y colaboradores, JExp Med 1996; 184: 1101-9; Beider K y colaboradores, Blood 2003; 102: 1951-8). El uso de cuerpos T humanos espedficos de ErbB2-T; estos investigadores mostraron que esta vuelta al reposo es un paso esencial para que las celulas T efectoras actuen in vivo, medido como inhibicion del progreso del cancer de prostata avanzado e incluso la cura (Pin thus y colaboradores, citado mas arriba). Con base en el conocimiento anterior, de acuerdo con la presente invencion, las celulas Treg redirigidas deben o bien volver al reposo/migrar a los sitios objetivo deseados o ser administrados a tales sitios.

Persistencia de las respuestas de celulas T que portan TpCR

Un factor clave para el exito de la terapia de celulas T adoptivamente transferidas (que hasta ahora ha sido examinado mas a fondo con las celulas T efectoras en el cancer) es el mantenimiento de la funcion de las celulas T transducidas (efectoras). En una realizacion de la presente invencion, se desea mantener la funcion de las celulas T reguladoras que han sido administradas para realizar una funcion de supresion. En otra realizacion, puede ser preferible que las Treg actuen en "rafagas" mas cortas para reducir una respuesta efectora T mas aguda (en lugar de una cronica).

Debido a que los linfocitos que se encuentran en pacientes con tumores incluyen celulas Treg CD4+ CD25+ que suprimen las celulas T efectoras (Wang HY y colaboradores, Immunity 2004; 20: 107-18; Curiel TJ, y colaboradores, Nat Med 2004; 10: 942- 9), tal actividad supresora "endogena" debe ser superada para optimizar la accion de las celulas T efectoras redirigidas. En la presente invencion, el objetivo es lo contrario: se administran las celulas Treg redirigidas a un sujeto que lo requiera para reprimir o bien inhibir las respuestas inmunes/inflamatorias que caracterizan las condiciones autoinmunes, el rechazo de trasplantes, etc.

Ejemplos de ensayos clmicos utilizando celulas T redirigidas

Si bien los ensayos clmicos utilizando celulas T reguladoras, de acuerdo con la presente invencion aun no han sido llevados a cabo, se describen a continuacion una serie de ensayos que utilizaron celulas T efectoras redirigidas que portan CR. Se pueden aprovechar diversas lecciones aprendidas en estos ensayos para llevar a cabo la presente invencion.

En la fase I de un ensayo en sujetos infectados con el VIH, se administraron linfocitos autologos que portan un CR CD4- Z (Mitsuyasu RT, y colaboradores, 2000, Blood 96: 785-93). De 24 pacientes, 11 recibieron tambien infusiones concurrentes de IL-2 durante 5 dfas. El tratamiento fue bien tolerado. En algunos pacientes, se observo una disminucion transitoria de la carga viral en plasma y la mucosa rectal (el deposito de tejido para el VIH). Todos los sujetos dieron negativo para el retrovirus competente para la replicacion (el vector de administracion) por hasta 1 ano despues de la infusion.

Cell Genesys, Inc. llevo a cabo ensayos clmicos de fase I en pacientes con cancer colorrectal utilizando un CR anti- TAG72-Z elaborado a partir del mAb humanizado CC49 (Warren R y colaboradores, En: 7a Conferencia Internacional sobre Terapia Genica del Cancer; 1998).

El grupo de Junghans probo 24 dosis de linfocitos que portan CR cuya especificidad del antfgeno fue dirigida a CEA en pacientes con cancer colorrectal. Se suministraron hasta 1011 celulas/paciente. El tratamiento fue tolerado de forma adecuada (Junghans R y colaboradores, Proc Am Assoc Can Res, 2000, 41: 543).

Hwu y colaboradores en el Instituto Nacional del Cancer llevaron a cabo un ensayo clmico de fase I en pacientes con cancer de ovario usando cuerpos T que expresan un CR dirigido contra la protema de union anti-folato murino de MoV18. Se infundieron grandes dosis de celulas modificadas en los pacientes junto con la administracion controlada de IL-2. No se reportaron efectos secundarios adversos. Se encontraron anticuerpos neutralizantes espedficos para

determinates de mAb de MoV18 murino en los sueros de varios pacientes (Kershaw MH y colaboradores, Clin Canc Res, 2006; 12: 6106-15.

Un ensayo clmico en fase I en cancer de celulas renales (CCR) empleo linfocitos T modificados geneticamente espedficos de G250 autologo (Lamers CHJ y otros, Daniel den Hoed, Cancer News, 2004, 2: 8-10). Las infusiones de 5 estas celulas fueron clmicamente bien toleradas. Despues de 4-5 infusiones, los pacientes comenzaron a desarrollar alteraciones de las enzimas hepaticas, un hallazgo explicado por la reactividad de las celulas T infundidas con G250L expresado en el epitelio del conducto biliar, aunque a niveles bajos. El tratamiento se limito por lo tanto solo a dosis bajas de cuerpos T que expresan CR. Los resultados mostraron en cualquier caso que las celulas T redirigidas ejercieron funciones dictadas por CR in vivo.

10 Se han iniciado otros dos ensayos clmicos de fase I a pesar de que sus resultados aun no se han reportado para el mejor conocimiento de los inventores. Un ensayo de fase I trato pacientes con neuroblastoma con PBL y CTL espedficos del virus de Epstein Barr, que expresan ambos receptores de celulas T quimericas espedficas de GD-2 (Brenner MK.
www.clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00085930, 2005). El otro ensayo emplea CTL CD8+ espedficas de CD20 modificada geneticamente para el linfoma folicular recidivante (Wang J, y colaboradores, Mol Ther 2004; 9: 57715 86.

Los presentes inventores reconocen que ciertos acontecimientos pueden interferir con la eficacia de la terapia utilizando celulas Treg que expresan CR in vivo en humanos, por ejemplo:

(1) la formacion de anticuerpos anti-idiotfpicos neutralizantes dirigidos a un idiotipo de la parte de scFv del CR que podna reducir la esperanza de vida o la eficacia de las celulas T reguladoras;

20 (2) la baja proporcion de celulas modificadas que eventualmente alcanzaron los sitios objetivo; y

(3) el dano potencial al tejido sano que expresa el antfgeno espedfico.

El uso de celulas T reguladoras de acuerdo con la presente invencion tiene un riesgo mucho menor de (3). Como se describe aqrn, la administracion directa de celulas T reguladoras a los sitios de inflamacion debe superar la limitacion de (1) - (3). Se espera que el ajuste de los regfmenes de dosis (numero de celulas, la frecuencia de administracion) 25 utilizando consideraciones clmicas de rutina para limitar el impacto de los factores limitantes anteriores.

De acuerdo con la presente invencion, se administra una cantidad eficaz de las celulas Treg redirigidas a un sujeto. Los vetculos preferidos para las celulas Treg son regulados de fosfato, preferiblemente 0,01-0,1 M, mas preferiblemente 0,05 M, o solucion salina al 0,8%. Los diluyentes o portadores aceptables para diversas vfas de administracion son bien conocidos.

30 Aunque las necesidades individuales vanan, la determinacion de los intervalos optimos de cantidades eficaces de un determinado tipo de celulas para una enfermedad o condicion en particular esta dentro de la experiencia de la tecnica. La dosificacion administrada sera dependiente de la edad, salud, y peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. La determinacion de las cantidades eficaces puede hacerse facilmente empmcamente por parte de aquellos ordinariamente capacitados en la tecnica sin 35 experimentacion indebida.

Las dosis tfpicas estan entre aproximadamente 106 y aproximadamente 1011 celulas Treg por inyeccion o infusion, mas preferiblemente, aproximadamente 107 hasta aproximadamente 1010 celulas. Si se va a administrar un antfgeno con las celulas (o por separado, pero en un sitio en el que se pretende activar las celulas), se prefiere una dosis de aproximadamente 0,01 a 100 mg/kg/de peso corporal, preferiblemente de 0,1 a 50 mg/kg/de peso corporal.

40 Una cantidad eficaz de celulas Treg es aquella que se necesita para inducir un cambio medible, en general una disminucion en la severidad de cualquier smtoma medible de la enfermedad, preferiblemente mas de un smtoma, y lo mas preferiblemente, que dana lugar a la cesacion de los smtomas y la curacion de la enfermedad o condicion. Por ejemplo, sin limitar la invencion, la disminucion anterior puede ser al menos aproximadamente del 10%, mas preferiblemente al menos aproximadamente del 20%, mas preferiblemente al menos aproximadamente del 30%, incluso 45 mas preferiblemente, al menos aproximadamente del 40%, y mas preferiblemente, al menos aproximadamente del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99%. Esta dentro de la capacidad de un medico tratante determinar cuando se han logrado estos objetivos terapeuticos, y ajustar la dosis o frecuencia de administracion en consecuencia, o cesar el tratamiento adicional.

Las celulas Treg de la invencion pueden administrarse una vez o en multiples ocasiones, a traves de una o diversas 50 rutas. Las celulas se pueden administrar diariamente, o, preferiblemente, en dfas alternos, preferiblemente semanalmente o cada dos semanas. La administracion puede hacerse en un intervalo de varios dfas a semanas, o incluso meses o anos. La frecuencia y duracion de la administracion pueden determinarse empmcamente, o con base

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en la historia clmica y la experiencia del sujeto.

Las composiciones celulares de la presente invencion se pueden administer mediante cualquiera de una serie de medios y rutas conocidas en la tecnica. La administracion es preferiblemente parenteral. Las vfas preferidas incluyen, por v^a intravenosa, intramuscular, subcutanea, intraperitoneal, intraarticular, intracerebroventricular, intraluminal (preferiblemente en el lumen del Aeon o colon), rectal o la via topica. Tambien se incluye la ruta "intratecal", que se pretende que abarque inyeccion, infusion o instilacion directamente en una cavidad o espacio (teca) que rodea un organo o region corporal en la que se produce una respuesta inflamatoria/inmune no deseada. Dichos espacios incluyen el espacio pleural, peritoneal, el espacio subaracnoideo o espacio dural, o el espacio pericardico. El termino generico para la administracion en una envoltura que encierra un organo se denomina "intratecal" (vease, por ejemplo, la definicion en Dorland's Medical Dictionary, vigesimonovena edicion, WB Saunders (2000) y en Stedman's Medical Dictionary, vigesimoseptima edicion, Lippincott, Williams & Wilkins (2000)) que significa "dentro de una envoltura". Como se usa en este documento, este termino pretende ser mas amplio que una definicion mas comunmente utilizada, que se limita a los espacios intracraneales.

Las composiciones, metodos y productos de esta invencion son aplicables a los usos humanos y veterinarios. El sujeto preferido es un ser humano.

Ratones transgenicos que expresan receptores quimericos espedficos de TNP

Se describen en la presente memoria varias cepas de ratones Tg que expresan al TpCR espedfico de TNP, que fueron producidos recientemente por los presentes inventores y sus colegas (Friedmann-Morvinski D, 2005). Estos ratones son la fuente de celulas T efectoras y celulas T reguladoras espedficas de TNP y se utilizan como animales de experimentacion en los que se evalua la induccion de la colitis mediante el hapteno reactivo "clasico", TNBS. Como control de estas celulas que portan CR, se usan celulas de ratones TpCR Tg espedficos de erbB-2 que fueron producidos en el laboratorio de los presentes inventores, ya que expresan un CR espedfico para un antfgeno irrelevante.

Todas las celulas T maduras y celulas NK en estos ratones Tg expresan el constructo scFv-CD28-FcRY. Las celulas T de Tg no manipulado pueden ser activadas completamente mediante TNP inmovilizado sobre plastico sin la necesidad de sensibilizacion previa. (Friedmann-Morvinski D, y colaboradores, citado mas arriba). Los resultados en los Ejemplos de este documento muestran que las Treg CD4+CD25+ esplenicas aisladas de tales ratones suprimen espedficamente la proliferacion y la secrecion de citoquinas mediante las celulas T efectoras espedficas de TNP. Ademas, estas Treg son responsables del retraso en el desarrollo y la atenuacion de la colitis inducida por TNBS en estos animales. De importancia es el hecho de que el nivel de celulas T reguladoras en la periferia de las cepas que expresan TpCR espedfico de TNP es mayor que en ratones de tipo silvestre (WT) y que las celulas T reguladoras no requieren de activacion previa para exhibir su actividad supresora in vivo. Se cree que es el resultado de la reactividad cruzada del mAb SP6, del cual se deriva el scFv del TpCR.

Administracion de ADN que codifica el CR en celulas T

La modificacion genetica de las celulas T perifericas humanas se logra en una realizacion mediante el uso de vectores retrovirales (Eshhar Z, y colaboradores, 2001, citado mas arriba). Como ejemplo no limitante, se utiliza el vector pBullet, en el que se introduce el ADNc que codifica CR (Weijtens ME, y colaboradores, 1998). Se usa un constructo de expresion bicistronico en el que se expresan el ADNc de TpCR y de eGFP bajo el control del LTR. Esto sirve para generar una celula de empaquetamiento basado en PG13 que se utiliza para el pseudotipado del vector retroviral con el virus de la leucemia del mono gibon (GALV). Se hizo una clasificacion por citometna de flujo con base en la expresion de eGFP, y se seleccionan las celulas de empaquetamiento que producen viriones de alto tftulo para conseguir una alta eficacia de la transduccion.

Para transducir los linfocitos humanos de donantes sanos, los linfocitos se activan en cultivo con mAb anti-CD3 y anti- CD28 unido a la placa (o el uso de microperlas comerciales recubiertas con estos anticuerpos, por ejemplo de Invitrogen, Miltenyi Biotec, Inc.,) y se transfieren a placas revestidas con placas de RetroNectinMR (fragmento de fibronectina CH-296) junto con sobrenadantes frescos tomados de las celulas de empaquetamiento. Al final del proceso que toma 5-8 dfas, las celulas se propagan en presencia de IL-2 y, a continuacion se recogen y se utilizan. Siguiendo este procedimiento ex vivo, 45-70% de las celulas son positivas para la expresion de CR (y GFP).

Los reactivos adicionales utiles son anticuerpos antiidiotipicos contra idiotipos del scFv del TpCR. Estos permiten la marcacion directa y visualizacion de TpCR en las membranas celulares. Tales anticuerpos contra el scFv SP6 (ejemplificado mas abajo) han sido elaborados y utilizados por los presentes inventores.

Una secuencia de nucleotidos anotada (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 2) del TpCR espedfico de TNP usado en este documento se muestra en la Figura 27. La protema madura comienza en el residuo de aminoacido 23 de la SEQ ID NO: 2.

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Una secuencia preferida que excluye el scFv anterior, y que puede enlazarse con cualquier otra region apropiada de union al ligando, preferiblemente un scFv espedfico diferente para otro antigeno, es la definida por las secuencias anteriores que comienzan en la region de CD28. Por lo tanto, una secuencia preferida que codifica nucleotidos es de los nucleotidos 2203 - 2523 de la SEQ ID NO: 1 y los aminoacidos 260-367 de la SEQ ID NO: 2. Los nucleotidos adicionales que comprenden un sitio de restriccion 5', y aminoacidos "inadvertidamente" codificados por los mismos, tambien se pueden incluir en una secuencia preferida. La secuencia de codificacion adicional anadida en el extremo 3' de 2203 a 2523 de la SEQ ID NO: 1, o los aminoacidos adicionales codificados por la misma y anadidos al terminal C de 260 a 367 de la SEQ ID NO: 2, pueden estar presentes, siempre que permitan la secuencia codificada, tal como se expresa en las Treg redirigidas, para funcionar como un TpCR en las formas descritas en este documento. Los expertos en la tecnica de la tecnologfa de clonacion y de ADN recombinante entenderan como modificar estas secuencias para lograr el objetivo deseado sin experimentacion indebida.

Los vectores de expresion que comprenden las secuencias anteriores tambien se utilizan en la presente invencion, en la produccion de las Treg que expresan TpCR.

Generacion y expresion de TpCR y el gen de fusion Foxp3-GFP y su expresion

Las celulas T redirigidas son "convertidas" en Treg haciendoles expresar tanto el factor de transcripcion Foxp3 como el TpCR espedfico del antigeno. Tal manipulacion permite la produccion de grandes numeros de Treg para la evaluacion y uso terapeutico. El exito de la transduccion o expresion conjuntas se prueba mediante la inclusion de un gen de fusion Foxp3-GFP en el mismo constructo que un TpCR para expresar ambos en las mismas celulas. Este enfoque es particularmente util cuando las poblaciones de celulas de partida son PBL humana en los que las Treg constituyen solo aproximadamente 3-5% de las celulas T CD4+. Esto evita las complicaciones de otro enfoque, tambien dentro del alcance de la invencion, en el que se requiere la propagacion a gran escala de Treg para la transduccion eficaz con vectores retrovirales. Ademas, simplificara el aislamiento de las Treg y evaluacion de su destino in vivo.

En un ejemplo no limitante, se clona ARN mensajero (ARNm) para Foxp3 a partir de celulas T reguladoras purificadas usando PCR. Se clona ADNc de Foxp3 en un plasmido eGFP Clontech para crear una protema de fusion Foxp3-GFP. Se clona la protema de fusion en el vector pBullet que contiene TpCR insertado despues de un IRES para crear un vector de expresion bicistronico. Tanto un vector retroviral del gen unico Foxp3-GFP como un vector retroviral del gen doble TpCR-IRES-Foxp3-GFP bicistronico son transducidos en celulas T aisladas de sangre periferica humana CD4+ CD25- despues de su activacion con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Las celulas resultantes se analizan por la expresion de los tres genes mediante FACS utilizando (1) anticuerpos antiidiotipicos espedficos para el idiotipo del scFv, o anticuerpos de la region anti-bisagra y (2) GFP intracelular y Foxp3 mediante la tincion de celulas fijadas con anticuerpos primarios espedficos para Foxp3 ( Alexis Biochemicals, Lausana, Suiza).

En otra realizacion, se utilizan los protocolos de expresion secuencial (primero TpCR y luego los genes Foxp3-GFP) o los protocolos de expresion conjunta. Una vez que los genes se expresan, se puede obtener un numero relativamente grande de celulas T reguladoras y se separan por medio de un clasificador de celulas (clasificacion de celulas activadas por fluorescencia FACSaria (Becton Dickinson, Mountain View, CA), clasificando las celulas que expresan conjuntamente GFP y TpCR.

El constructo de Foxp3 puede estar en la forma de un vector bicistronico que incluye ADN que codifica una molecula informadora tal como una protema fluorescente. Las moleculas informadoras adecuadas son bien conocidas en la tecnica e incluyen protemas fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogenicas, por ejemplo la protema fluorescente verde (GFP) o la protema fluorescente amarilla mejorada (EYFP) o un homologo fluorescente de la misma, la protema luciferasa de luciernaga (codificada por el gen Luc), las enzimas cloranfenicol acetil-transferasas (CAT), o LacZ bacteriana, (p-galactosidasa) o el gen de la timidina quinasa (codificada por el gen HSV1 TK. GFP y EYFP se detectan por fluorometna o histoqmmica de fluorescencia; algunas enzimas se detectan mediante el uso de un sustrato cromogenico que se convierte en un producto coloreado que se puede utilizar en la deteccion colorimetrica histoqmmica de la actividad enzimatica. La luciferasa se mide por la activacion de la luciferina que emite luz a una longitud de onda conocida. Las moleculas informadoras pueden ser detectadas in vivo mediante tecnicas de deteccion no invasivas tales como la formacion de imagenes opticas por fluorescencia (FOI), formacion de imagenes opticas por bioluminiscencia (BOI), un dispositivo acoplado cargado y enfriado (CCD), formacion de imagenes opticas mediante una camara (CCOI) y tomograffa por emision de positrones (PET).

Se demostro que la infeccion de linfocitos T CD4+CD25- humanos con vectores retrovirales que portan el gen Foxp3 convierte estas celulas en unas que tienen un fenotipo de Treg (Walker y colaboradores, 2005, citado mas arriba; Wan y colaboradores, 2005, citado mas arriba).

Cualquier metodo para introducir ADN en una celula y expresarlo puede ser utilizado en la presente invencion, incluyendo, pero no limitado a vectores tales como vectores retrovirales o lentivirales, electroporacion, lipofeccion, y similares.

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La funcionalidad de las Treg redirigidas se puede determinar mediante pruebas de cocultivo como se describe en los Ejemplos. Si se van a utilizar APC en estos ensayos, una fuente preferida es la de monocitos irradiados. El antfgeno se carga en APC humanas irradiadas que lo presentaran a celulas T efectoras y celulas T reguladoras. En el caso de antigenos tales como CEA, se pueden usar celulas de carcinoma de colon humano transfectadas de forma estable con el epttopo de CEA. En dichos ensayos de cocultivo, se puede detectar la activacion espedfica de celulas T reguladoras que portan TpCR a traves del TpCR. La activacion de Treg se evalua mediante el examen de la accion de estas celulas en la (1) proliferacion de celulas T efectoras y (2) el perfil de secrecion de citoquinas, centrandose en IL-2, IL-4, IL-10, IFN-y y TGF-p (utilizando kits comerciales de ELISA, por ejemplo, el kit de ELISA Ready-Set Go, eBioscience, CA). Se prefiere analizar TGF-p y/o IL-10 como una indicacion del fenotipo de las celulas Treg.

En una realizacion preferida, la presente invencion redirige Treg a los sitios de inflamacion del colon, mediante la introduccion en dichas celulas de CR con especificidad de tipo anticuerpo. En los sitios de inflamacion se activan las celulas T reguladoras redirigidas para suprimir la respuesta inmune asociada a la IBD. Las Treg dotadas con especificidad predefinida migran y regresan a los sitios inflamados en el colon, donde se someten a la activacion y, como resultado, suprimen las celulas T efectoras que median los procesos de la enfermedad.

Las presentes Treg redirigidas representan una forma novedosa de 'cuerpos T' discutidos mas arriba y se emplean como una modalidad terapeutica novedosa en la IBD. Estos cuerpos T son celulas T que han sido modificadas geneticamente para expresar TpCR en donde una region variable del anticuerpo es la unidad de reconocimiento enlazada a los dominios coestimuladores y estimuladores de celulas T que permiten la activacion espedfica de estas celulas T, pero en una forma que es independiente del MHC y no restringida al MHC. Sobre la base de estudios previos utilizando modelos de tumores descritos anteriormente, estas celulas T reguladoras redirigidas se ponen a prueba en modelos murinos de modelos de IBD.

Un aspecto importante de esta invencion es la concepcion de los inventores de que, en el contexto del tratamiento de la IBD, el(los) antigeno(s) asociado(s) con el colon a los que se redirigen y enfocan los cuerpos T no son necesariamente los autoantfgenos patogenos reconocidos por las celulas T efectoras autoagresivas. Por lo tanto, esta invencion puede explotar el fenomeno de reactividad "espectadora" - donde la presencia de los antfgenos pertinentes en los sitios de las reacciones inflamatorias sirven para atraer y "mantener" o localizar las Treg redirigidas, permitiendoles ser activadas y ejercer su efectos supresores de una forma paracrina - que actuan sobre las celulas efectoras objetivo en el entorno con independencia de las diferencias en la especificidad del antfgeno de las celulas T efectoras y las celulas Treg.

Antigenos del colon CEA y de LPS como objetivos para las Treg humanas redirigidas en la IBD

Se saco ventaja de un modelo de IBD espedfico de hapteno que se basa en la especificidad por el hapteno TNP para estudiar los efectos supresores de las Treg. En la enfermedad humana, otros antfgenos que se expresan en el tejido intestinal o del colon, ya sea normalmente o en el estado de la enfermedad en cuestion son los objetivos preferidos. Incluyen el antfgeno carcinoembrionario, CEA, y los antfgenos de la flora bacteriana tales como lipopolisacaridos, LPS.

La IBD humana es idiopatica hasta el punto en que el(los) antfgeno(s) patogeno(s) sigue(n) siendo desconocido(s). La falta de conocimiento del antfgeno parece ser un obstaculo para la implementacion clmica de los cuerpos T. Sin embargo, de acuerdo con la presente invencion, no hay ningun requisito de que un antfgeno patogeno tambien deba ser el antfgeno objetivo para el redireccionamiento y activacion de las Treg. La activacion de Treg es de hecho espedfica del antfgeno y por lo tanto depende de los TCR, o en las presentes celulas T reguladoras, de la especificidad basada en anticuerpos, asociada con la coestimulacion junto con la activacion/mediada por las fracciones de senalizacion intracelulares de los presentes constructos. Sin embargo, una vez se activan las celulas T reguladoras, su accion supresora es independiente del antfgeno, y se lleva a cabo mediante la secrecion de citoquinas supresoras (por ejemplo, TGF-p e IL-10), incluso despues de que se ha eliminado el antfgeno de activacion. Por lo tanto, la induccion de la activacion de Treg del colon por cualquier antfgeno local asociado al colon promovera la activacion y proliferacion potente de Treg, mientras que la accion de estas celulas en la inhibicion de procesos inflamatorios locales procede de forma independiente del antfgeno. CEA se sobreexpresa significativamente en el tejido enfermo del colon en pacientes con colitis ulcerosa activa en comparacion con individuos normales y con pacientes con IBD inactiva (Smithson JE y colaboradores, J Pathol. 1996; 180: 146-51; Pavelic ZP y colaboradores, Anticancer Res. 1991; 11: 1671-5). Esta expresion mejorada en el tejido de CEA era independiente de los cambios displasicos y es un resultado de la reaccion de la mucosa al proceso inflamatorio mismo. Por lo tanto, CEA es un candidato preferido para la focalizacion de TpCR de Treg en la colitis ulcerosa activa.

Un segundo antfgeno candidato (o ligando "no antigenico") al cual se pueden redirigir las Treg es endotoxina o LPS, derivada de la membrana externa de las bacterias Gram negativas residentes en el colon. En una realizacion, la parte similar al anticuerpo (scFv) la region de reconocimiento extracelular del CR se puede derivar de un anticuerpo anti-LPS, tal como el mAb producido por el hibridoma con ATCC con No. de acceso HB9081. La secuencia de nucleotidos de un scFv elaborada a partir de este mAb se muestra como una anotacion en la Figura 29 como parte de la secuencia completa de un plasmido (pBullet) que comprende este scFv - SEQ ID NO: 3. Por lo tanto, una Treg que expresa un TpCR que muestra este scFv extracelularmente, en un sitio donde LPS esta presente tal como el tejido de colon inflamado (si el lumen del intestino, la lamina propia o incluso los ganglios linfaticos regionales y otros tejidos linfatico

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asociados al intestino) se unira al LPS y sera activada para causar la supresion de las celulas T efectoras en el entorno de una forma no espedfica del antigeno e independiente del MCH.

Se conocen en la tecnica varios tipos de receptores de LPS que no son anticuerpos. CD 14 (SEQ ID NO: 4) es una clase de receptor de LPS que es una glicoprotema de 356 aa anclada a GPI. Contiene un peptido senal de 19 aa, un dominio extracelular que contiene 11 dominios de repeticion ricos en leucina (LRR), 4 sitios de N-glicosilacion y un numero desconocido de sitios de O-glicosilacion. Se han descrito al menos 2 formas solubles de CD 14, una retiene GPI y se libera de la superficie de la celula que da lugar a una molecula de aproximadamente 48 kDa y la otra se libera antes de la adicion del anclaje a GPI que resulta en un mayor peso molecular (> 48 kDa).

Si bien LPS interacciona con CD 14, CD 14 no es capaz de iniciar una senal de activacion transmembrana porque es una protema anclada a glicosilfosfatidilinositol (GPI). De este modo, LPS debe interactuar con un receptor(es) transmembrana que es responsable de la transduccion de senales. LPS es reconocido por el receptor de tipo toll TLR4 y MD-2 (SEQ ID NO: 5; humano), una molecula asociada con el dominio extracelular de TLR4. CD14 mejora en gran medida la formacion de complejos LPS-TLR4-MD-2, al parecer cargando LPS sobre TLR4-MD-2 pero no en la propia interaccion entre LPS y TLR4-MD-2. (Akashi S, y colaboradores, J. Exp Med 198: 1035-1042 (2003)).

La interaccion de LPS con MD-2 en un complejo TLR4-MD-2 activa una cascada de transduccion de senal intracelular que conduce a la produccion y liberacion de citoquinas proinflamatorias, en particular TNF-a (Dauphinee SM y colaboradores, 2006, Lab. Invest. 86, 9-22). Los pacientes con IBD muestran aumento de los niveles en colon y suero de endotoxina, LBP, CD14, y MD-2 (Pastor Rojo 0, y colaboradores, 2006, Inflamm Bowel Dis., Dic 19 (epub); Amati L y colaboradores, Curr. Pharm Des 2003; 9: 1937-1945; Cario E y colaboradores, J Immunol. 2006; 176: 4258-66). Este cambio se correlaciona con la actividad de la enfermedad, y los niveles de citoquinas proinflamatorias vuelven a la normalidad despues del tratamiento.

Un motivo de MD-2 humano, por ejemplo, a partir de los aminoacidos 119-132 (14 residuos) de la SEQ ID NO: _ puede sustituir a MD-2 en el complejo MD-2-TLR4 uniendose a la fraccion de lfpido A de LPS, que (Mancek M y colaboradores, Biochem Biophys Res Comm 2002; 292: 880-5; Kobayashi M y colaboradores, J Immunol 2006; 176: 6211-8).

Por lo tanto, en un TpCR preferido de la presente invencion, la region de reconocimiento extracelular comprende, en lugar de una estructura similar a un anticuerpo (por ejemplo, un scFv), un receptor que se une a un ligando que no esta actuando como un "antigeno". Un ligando preferido en la presente invencion es LPS. Por lo tanto, la region de reconocimiento extracelular puede comprender cualquiera de las siguientes estructuras de los receptores:

(a) CD14 (SEQ ID NO: 4),

(b) un motivo de union a LPS de CD 14, tales como los residuos 100-119 de la SEQ ID NO: 4,

(c) MD-2 de longitud completa (SEQ ID NO: 5),

(d) un motivo de union a LPS de MD-2 (residuos 120-132 de la SEQ ID NO: 5),

(e) una combinacion de un CD 14 y un MD-2 o

(f) una combinacion de un motivo de CD14-motivo y un motivo de MD-2 (como la codificada por el segmento relevante del acido nucleico quimerico de la SEQ ID NO: 10).

Cualquiera de estos constructos, cuando se despliega en una superficie de Treg, permitiran a la Treg redirigida unirse a, y ser activada por moleculas de LPS, por ejemplo, en los sitios inflamatorios del colon, y por lo tanto ejercer sus actividades supresoras alrededor de esos sitios. Nuevamente, esto es un ejemplo de union/reconocimiento del receptor- ligando que no es "similar al anticuerpo" pero sin embargo permite que el TpCR actue de acuerdo con esta invencion y active celulas T reguladoras de una manera no espedfica del antfgeno (e independiente del MHC).

La presente invencion incluye una realizacion en la que las Treg redirigidas que portan un TpCR estan disenadas para ser espedficas para un antfgeno, denominado en este documento como "AgX", que puede tener una relacion inherente con el tejido objetivo o la enfermedad a tratar. En esta realizacion, las Treg espedficas para AgX se activan espedficamente en un sitio seleccionado administrandolas junto con AgX a ese sitio. El sitio es uno donde se encuentran las celulas T efectoras y activas, donde la inflamacion en curso debe ser suprimida. El receptor similar al anticuerpo espedfico de AgX de las Treg reconocera AgX sin necesidad de presentacion de antfgenos, MHC, etc., y las fracciones de senalizacion enlazadas en el TpCR serviran para activar las celulas T reguladoras para liberar citoquinas inhibidoras en ese sitio. Este proceso dara lugar a la supresion no espedfica de las celulas T efectoras en curso y la actividad inflamatoria.

Los metodos y composiciones descritos en este documento son utiles para cualquiera de una serie de enfermedades

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autoinmunes que implican actividad de celulas T efectoras no deseadas como una causa subyacente o como consecuencia de la fisiopatologfa. Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, IBD, artritis reumatoide, diabetes de tipo I, esclerosis multiple, tiroiditis autoinmune, uveorretinitis autoimmune, orquitis autoimmune, insulitis autoimmune, ovaritis autoinmune, psoriasis, polimiositis autoinmune y similares. Vease, por ejemplo, Theofilopoulos, A., en: Stites, DP y colaboradores, eds., Basic and Clinical Immunology, Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 1988)).

Habiendo descrito ahora en forma general la invencion, la misma se entendera mas facilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion, salvo que se especifique de ese modo.

Ejemplo I

Materiales y metodos

Los siguientes materiales y metodos se utilizan en varios de los Ejemplos que se presenta a continuacion, asf como en la realizacion de ciertas realizaciones de la invencion.

Fraccionamiento y aislamiento de las celulas

Las celulas T reguladoras CD4+CD25+ se purificaron a partir de linfocitos esplenicos o poblaciones de celulas mononucleares de sangre periferica utilizando diversos metodos. Un metodo utilizo separacion con perlas magneticas (MACS). Los bazos se mezclaron suavemente en HBSS/5% de FCS para preparar suspensiones de celulas individuales.

Las celulas T CD4+ se purificaron mediante seleccion negativa por incubacion con perlas MACS de CD4 conjugadas con biotina (Miltenyi Biotec, Inc., Auburn, CA). La purificacion adicional de las celulas CD4+CD25+ se realizo mediante incubacion con anticuerpos anti-CD25 o anti-CD45RBalto conjugados con ficoeritrina (PE), seguido de incubacion con microperlas de anti-PE (Miltenyi Biotec, Inc., Auburn, CA). La separacion magnetica se realizo utilizando columnas magneticas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para las Treg altamente purificadas (> 99%) y la subpoblacion de linfocitos T efectores, se aplica la clasificacion de celulas a alta velocidad, utilizando el sistema de clasificacion de celulas BD FACSAria (®) (BD Bioscience)

Se aislaron linfocitos de la lamina propia del colon como se describio previamente (Han X y colaboradores, Gastroenterology. 2005; 129: 185-203). En resumen, se diseco la mucosa del colon, seguido de incubacion con una solucion salina equilibrada de Hanks (HBSS) libre de Ca2+ - Mg2+ que contiene ditiotreitol 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 30 min para eliminar el moco, y luego se incubaron en serie dos veces en medio que contiene EDTA 0,75 mM (Sigma-Aldrich) durante 60 minutos en cada incubacion. Los sobrenadantes de estas incubaciones que contienen epitelio y una poblacion de linfocitos intraepiteliales se descartan, y se combinan los fragmentos residuales y se tratan con 2 mg/ml de colagenasa A (Worthington Biomedical, Freehold, NJ) y 0,01% de DNasa (Worthington) en aire humidificado a 37°C por 2 horas. Las celulas se sedimentaron a continuacion dos veces a traves de una solucion isotonica de Percoll al 40%, despues de lo cual se purifican adicionalmente por centrifugacion en gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (40%/75%).

Induccion in vitro de celulas T reguladoras

Las Treg de origen natural se derivan del timo, expresan altos niveles del factor de transcripcion forkhead Foxp3 y suprimen la activacion de los linfocitos efectores. Se ha descubierto que la activacion espedfica del antfgeno de celulas T efectoras humanas puede inducir la expresion de Foxp3 en un subgrupo de las celulas efectoras activadas, que a su vez desarrollan un fenotipo regulador. Se demostro que estas celulas T reguladoras inducidas son capaces de supresion dependiente del contacto con celulas de celulas efectoras recien aisladas (Walker y colaboradores, 2003, citado mas arriba). En ratones, la exposicion prolongada de las celulas efectoras a TGF-p induce Treg tanto in vitro como in vivo (Fantini y colaboradores, J Immunol. 2004 y 2006, citado mas arriba). Esta poblacion pequena, generada perifericamente de celulas T reguladoras inducibles puede ser central en la regulacion y la contencion de la respuesta inmune en curso, mientras que la incapacidad para inducir tales celulas T reguladoras puede ser responsables de una propension a desarrollar autoinmunidad.

Para probar si tal induccion se produjo despues de la estimulacion de las celulas T efectoras a traves del TpCR, de tipo silvestre, se aislaron celulas T efectoras TNP-Tg, ErbB2-Tg y TNP-CD28A-Tg mediante clasificacion por FACS y se cultivaron durante 7 dfas en presencia de cualquiera de (1) Ab anti-CD3, (2) TGF-p murino, (3) mAb para TNP, (4) Ab anti-CD3 + TGF-p, o (5) Ab anti-TNP + TGF-p. Se evaluo la induccion de Foxp3 en las celulas que se "desarrollan" a partir de estas celulas T efectoras despues de siete dfas de cultivo utilizando tincion intracelular de Foxp3.

La activacion espedfica del antfgeno de celulas T efectoras humanas conduce a la expresion inducible de Foxp3 en un subgrupo de celulas efectoras activadas, que a su vez desarrollan un fenotipo regulador. Estas celulas T reguladoras

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inducidas son capaces de supresion dependiente del contacto con celulas de celulas efectoras reden aisladas. En ratones, tanto la induccion in vitro como in vivo de las Treg se puede lograr con la exposicion prolongada de las celulas efectoras a TGF-p (Fantini y colaboradores, 2004, 2006, citado mas arriba). Los presentes inventores adoptaron esta tecnologfa para inducir celulas T reguladoras redirigidas de murino a partir de celulas T efectoras redirigidas (vease la Figura 3).

Animales

Se usaron varias cepas de raton en los estudios descritos a continuacion y se utilizan en diversas otras realizaciones de la invencion. Estas incluyen lmeas de ratones transgenicos que expresan espedficamente TpCR anti-TNP o anti-ErbB2 (que contienen cadenas de senalizacion CD28-FcR^^) bajo el control de un promotor de CD2, asf como una lmea de ratones transgenicos que expresan CEA humano (Saha A y colaboradores, Immunology 2006, 118: 483-496).

Todos los ratones transgenicos fueron nuevamente cruzados con ratones Balb/c. Los ratones Balb/c de tipo silvestre sirven como controles de rutina y receptores de las celulas transferidas de forma adoptiva.

Se usa un modelo de colitis de transferencia de celulas en ratones Rag-/" y SCID deficientes.

Todos los procedimientos invasivos fueron y se realizan bajo anestesia general con ketamina y xilazina (127,5 y 4,5 mg/kg, respectivamente). Las inyecciones subcutaneas (s.c.) se llevan a cabo bajo anestesia local con xilocama al 10% en aerosol.

Induccion y evaluacion de la colitis:

Para inducir colitis mediada por hapteno TNP se sensibilizaron los ratones con 150 pl de agente haptenacion, el acido 2,4,6-trinitrobencenosulfonico (TNBS, Sigma-Aldrich) a una concentracion de 2,5% v/v en etanol al 50% mediante pintura en la piel en el dfa 1. En el dfa 8, se administraron 150 pl de TNBS al 1% en etanol al 50% por via rectal a traves de un cateter 3,5 F bajo anestesia general.

La colitis inducida por OXA se indujo mediante la sensibilizacion de los ratones con oxazolona (4-etoximetilen-2-fenil-2- oxazolin-5-ona; Sigma-Aldrich) a una concentracion de 3% v/v en etanol al 100% mediante pintura de la piel en dfa 1, seguido de la administracion intrarrectal de 150 pl a una concentracion de 1% v/v en etanol al 50% en el dfa 8.

En modelos preferidos de colitis por transferencia de celulas, se transfieren celulas T CD45RBalto (no modificadas) a ratones inmunodeficientes de ambiente singenico (Powrie F y colaboradores, JExp Med. 1994; 179: 589-600. Este modelo de inflamacion de la mucosa permite separar la funcion de las celulas Treg y de las celulas T efectoras en un sitio inflamatorio.

En todos los modelos, la colitis se evalua despues de la induccion utilizando los siguientes parametros: grado de ulceraciones del colon, adherencias intestinales y peritoneales, espesor de la pared, y el grado de edema de la mucosa. Cada parametro se clasifica en una escala de 0 (completamente normal) a 4 (mas grave) por parte de dos observadores ciegos, experimentados. Para la evaluacion histologica de inflamacion, se remueve el tejido del colon distal (ultimos 10 cm) y se fija en formaldelddo al 10%. Se tinen cinco secciones en parafina de cada raton con hematoxilina-eosina usando tecnicas estandar. El grado de inflamacion se clasifica de forma semicuantitativa en secciones transversales microscopicas del colon de 0 a 4 como sigue: Grado 0: Normal, sin signos de inflamacion; Grado 1: muy bajo nivel de infiltracion de leucocitos; Grado 2: bajo nivel de infiltracion de leucocitos; y Grado 3: alto nivel de infiltracion con alta densidad vascular y engrosamiento de la pared intestinal; Grado 4: infiltrados transmurales con la perdida de celulas caliciformes, alta densidad vascular, engrosamiento de la pared, e interrupcion de la arquitectura normal del intestino.

Colonoscopia de murino

Para la supervision continua de la patologfa de la colitis, se ha utilizado un sistema endoscopico de video del raton de alta resolucion, Becker C y colaboradores, Gut. 2005; 54: 950-4. El sistema de endoscopia experimental (de Karl Storz, Tuttlingen, Alemania) consiste de un endoscopio miniatura (1,9 mm de diametro exterior), una fuente de luz de xenon, una camara de triple chip, y una bomba de aire. Los parametros para la clasificacion de la colitis incluyen el engrosamiento de la pared intestinal, la granularidad, la consistencia fecal, la deposicion de fibrina y el patron vascular. Se utiliza tincion del colon mediante cromoendoscopia con azul de metileno, cuando sea apropiado, para visualizar el patron clave. Se usan pinzas de biopsia flexibles 3 Fr para la toma de la biopsia. Las biopsias se colocan ya sea en formalina para la inclusion en parafina, seccionamiento y posterior inmunohistoqmmica, congelacion en nitrogeno lfquido para obtener criosecciones, o se obtienen y utilizan para el aislamiento del ARN. Un rendimiento tfpico de un especimen de biopsia es de aproximadamente 2 pg de ARN.

Obtencion de imagenes in vivo:

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Para seguir la migracion (tambien denominada como retorno o trafico) de celulas T reguladoras redirigidas en ratones, se uso una camara CCD de cuerpo entero (sistema de formacion de imagenes IVIS® serie 100, Xenogen, Alameda CA). Se marcaron as Treg redirigidas con el colorante de carbocianina lipofflica de infrarrojo cercano (NIR) yoduro de 1,1- dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina (DiR, Invitrogen, EE.UU.). Este colorante tiene maximos de absorcion y de fluorescencia a 750 y 782 nm, respectivamente, permite la marcacion directa segura de membranas de las celulas linfoides humanas con niveles muy bajos de absorcion de luz y de autofluorescencia en tejidos vivos (Miller MJ y colaboradores, Proc Natl Acad Sci USA, 2003; 100: 2604-9; Kalchenko V y colaboradores, presentado para su publicacion, 2007). Se realizo una visualizacion adicional in vivo de las Treg marcadas con succinimidil ester de diacetato de carboxifluorescema (CFSE) en la mucosa del colon mediante insercion intrarrectal de un microendoscopio confocal de 300 y 650 pm de diametro (Cell Vizio, MKT, Pans, Francia). Esta modalidad unica, no probada previamente en modelos de colitis, permite una evaluacion repetida in vivo del retorno de las celulas T reguladoras marcadas con CFSE a las capas mas internas de tejido del colon despues de induccion de la inflamacion.

Determinacion de los niveles de citoquinas en el colon

Se determina la expresion de ARNm en el colon de citoquinas seleccionadas para permitir la evaluacion de los efectos de Treg redirigidas en la respuesta inmune local intestinal, en particular, los niveles de citoquinas proinflamatorias (TNFa e IFNy) y antiinflamatorias (TGFp e IL10), asf como los niveles del factor de transcripcion TH1 Tbet y el factor de transcripcion TH2 GATA-3. Los niveles de citoquina en el colon se evaluan mediante la medicion de la expresion de ARNm y los niveles de protema.

Las muestras para aislamiento de ARNm se remueven del colon de los ratones usando colonoscopia in vivo o durante el sacrificio. El ARN total se afsla y se procesa y se produce ADNc por RT-PCR. En todos los experimentos, los ratones se dividieron en los siguientes grupos: ratones no manipulados, ratones con colitis inducida, y ratones con colitis inducida con transferencia adoptiva de celulas T reguladoras (de origen natural, inducidas o redirigidas, veanse en el presente documento experimentos detallados de transferencia adoptiva). Se utilizan los siguientes conjuntos de oligonucleotidos y condiciones de amplificacion:

SECUENCIA SEQ ID NO: Condiciones de amplificacion

TNF-a sentido

5'-AGTCCGGGCAGGTCTACTTT-3' 15 60°/30 ciclos

antisentido

5'-GAGGCAACCTGACCACTCTC-3' 16

IFN-y sentido

5'-TCTGGAGGAACTGGCAAAA-3' 17 63°/35 ciclos

antisentido

5'-TGAGCTCATTGAATGCTTGG-3' 18

TGF-p sentido

5'-TACAGGGCTTTCGATTCAGC-3' 19 63°/35 ciclos

antisentido

5'-CGCACACAGCAGTTCTTCTC-3' 20

IL-10 sentido

5'-TCCTTGGGAAGCAATTGAAG-3' 21 63°/35 ciclos

antisentido

5'-AACTGGCCACAGTTTTCAGG-3' 22

T-bet sentido

5'-CTAAGCAAGGACGGCGAATGT-3' 23 60°/35 ciclos

antisentido

5'-GGCTGGGAACAGGATACTGG-3' 24

GATA-3' sentido

5'-GCCTGCGGACTCTACCATAA-3' 25 54,8°/30 ciclos

antisentido

5'-CAGGGATGACATGTGTCTGG-3' 26

GAPDH sentido

5'-GTGTTCCTACCCCCAATGTG-3' 27 60°/25 ciclos

antisentido

5'-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3' 28

La expresion relativa de ARNm en comparacion con el GAPDH de mantenimiento se evalua utilizando software de imagenes NIH y promediada a partir de los ratones en cada grupo.

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Los niveles de expresion de protema de IL-10 e IFN-y en tejido de colon se cuantifican mediante un sistema de ELISA basado en citofluorometna. En resumen, se a^slan las protemas enteras de espedmenes de colon en ausencia de detergente. Se usan inmediatamente protemas (100 pg) para la determinacion de citoquinas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Inmunohistoqmmica de Foxp3 de muestras de colon:

Se lleva a cabo la inmunofluorescencia de Foxp3 para estimar in situ el direccionamiento de Treg en el colon enfermo, usando TSA Cy3 y un microscopio de fluorescencia (Olympus). En resumen, se fijan criosecciones en acetona fna durante 10 minutos, seguido de incubacion secuencial con metanol, avidina/biotina (Vector Laboratories, CA), y reactivo de bloqueo de protema para eliminar la tincion de fondo no espedfica. Se incuban luego los portaobjetos durante la noche, con anticuerpos primarios espedficos para Foxp3 (por ejemplo, de Alexis Biochemicals, Lausana, Suiza). Posteriormente, se incuban los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios biotinilados, y se tratan con estreptavidina-peroxidasa de rabano picante y se tinen con tiramida (Cy3 o FITC). Antes del examen, los nucleos se tinen con colorante de contraste Hoechst 3342 (Molecular Probes, Ohio).

Ejemplo I

Caracterizacion fenotfpica de celulas T reguladoras espedficas para TNP

Los inventores han producido ratones transgenicos (Tg) que expresan un receptor quimerico tripartita (TpCR) espedfico de TNP que sirven como fuente de celulas Treg redirigidas espedficas para el hapteno trinitrofenilo (TNP). Este hapteno ha servido como un antfgeno "clasico" desde hace anos en el estudio tanto de anticuerpos como de inmunidad mediada por celulas T. Una forma qdmicamente reactiva de este hapteno, TNBS, es un agente sensibilizador de contacto que induce y evoca respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH), asf como la induccion de colitis en animales, como se describe en el presente documento.

La generacion de Treg espedficas para el TNP se logro mediante la creacion de los ratones Tg que expresan TpCR espedfico para TNP que comprende un scFv del mAb Sp6 mAb espedfico para TNP enlazado a una molecula de CD28 truncada que se inserto entre el scFv y la parte citoplasmatica de la cadena y de FcR (abreviado como y en el presente documento (vease la Figura 1). Este constructo incluye la region de bisagra, la region transmembrana y la region citoplasmatica de CD28, pero carece del sitio de union B7 (ligando).

Para la forma truncada de CD28 (TpCR/CD28, Figura 1) que no incluye el dominio de senalizacion intracelular de CD28, los inventores clonaron el vector en el mismo sitio. Como control, se uso un raton Tg que expresa TpCR espedfico para otro antfgeno irrelevante (Erb-B2).

Para la expresion de TpCR en celulas T de ratones Tg, se clono un constructo que comprende un scFv-CD28-Y derivado de Sp6 anti-TNP en un vector basado en mini gen humano promotor/reforzador de CD2 humana. Se generaron ratones Tg en el Departamento del Instituto Weizmann para Recursos Veterinarios mediante microinyeccion pronuclear de ovulos fertilizados de (BALB/cx C57BL/6)F1 derivados de hembras donantes hiperovuladas. Ratones creadores fueron seleccionados por PCR del ADN de muestras de la cola. Se obtuvieron varias cepas creadoras que expresan alto nivel del TpCR en sus superficies celulares. Estos fueron retrocruzados por mas de nueve generaciones ya sea con ratones BALB/c o C57BL/6 para obtener ratones con MHC homogeneo.

Los estudios a continuacion describen la caracterizacion de diversas subpoblaciones de Treg en las diferentes cepas de ratones transgenicos TNP-Cr, y la expresion de TpCR en estas celulas T reguladoras.

Ejemplo II

Aislamiento de Treg en las que TpCR espedfico de TNP son altamente expresadas

Se aislaron las Treg utilizando separacion doble con perlas magneticas (Miltenyi Biotech) o mediante clasificacion de celulas fluorescentes en las que se clasificaron las celulas CD4+CD25+ marcada de manera fluorescente usando el sistema de clasificacion de celulas FACSAria.

Se evaluo la expresion de Treg de TpCR espedfica de TNP mediante celulas restringidas para Foxp3 (considerado el marcador "estandar dorado" de las Treg) y mAb marcado con PE espedfico para el anticuerpo TNP (generado en laboratorio de los inventores). Los controles incluyeron grupos tenidos con los controles del isotipo apropiado. Como se muestra en la Figura 2, las Treg de ratones TNP-Tg, pero no de ratones de tipo silvestre, expresaron altos niveles de TpCR espedfica de TNP.

Ejemplo III

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Los ratones TNP-Tg poseen un mayor numero de poblacion de Treg Foxp3+

Se tineron linfocitos perifericos del bazo asf como linfocitos asociados al intestino de la lamina propia del colon. Como se muestra en la Figura 3, se elevo modestamente la poblacion de celulas CD4+CD25+ (representada como la relacion de celulas CD4+CD25+ entre celulas T CD4+) en ratones TNP-Tg en comparacion con los ratones de control (ratones ErbB2-Tg y TNP-CD28 sin Tg, de tipo silvestre). Por el contrario, se observo un mayor numero de celulas Foxp3+ en animales TNP-Tg en comparacion con los animales de control en comparacion con todos los otros tipos de raton (Figura 4).

Para resolver lo que parecena ser una inconsistencia entre la poblacion de Treg Foxp3+ muy elevado en ratones TNP- Tg y la poblacion Treg CD4+CD25+moderadamente elevada en estos ratones, se aislaron celulas efectoras CD4+CD25 mediante clasificacion celular hasta un nivel de 99% de pureza. Se tineron las celulas aisladas para Foxp3 (Figura 5). Como se esperaba, no se observo una coloracion positiva de Foxp3 en las celulas T efectoras de ratones, Tg-ErbB2 y TNP-CD28 sin Tg de tipo silvestre. Por el contrario, las celulas T efectoras de TNP-Tg presentaron una poblacion significativa de celulas Foxp3+. Esta observacion fue validada adicionalmente en poblaciones enteras de celulas de bazo que fueron tenidas conjuntamente para Foxp3 y CD25 (Figura 6). La presencia de una poblacion de Treg Foxp3+ CD25 significativamente mayor en ratones TNP-Tg esta soportada por otros resultados recientes del laboratorio de los inventores que muestran que el mAb Sp6 a partir del cual se derivo el scFv del TpCR espedfico de TNP reconoce los antfgenos endogenos del timo de reaccion cruzada. Esto se traduce ya sea en la supresion o liberacion temprana del timo a la periferia antes que varios otros subconjuntos de celulas T inmaduras, incluyendo Treg CD25- inmaduras.

Ejemplo IV

La induccion de colitis con TNBS en ratones TNP-Tg elevo significativamente el numero de celulas que expresan Foxp3+ en poblaciones de linfocitos perifericos y derivados del colon

La induccion de colitis por TNBS trajo como resultado una elevacion adicional de las Treg Foxp3+ de bazo (Figura 7) y colon (Figura 8) en TNP-Tg (Figura 7 y 8, respectivamente). Estos resultados demostraron que ocurrio una expansion de Treg espedficas de TNP despues de la induccion de la colitis en ratones Tg, lo que refleja la proliferacion de Treg despues de la activacion espedfica del antfgeno por TNP.

Ejemplo V

Caracterizacion funcional in vitro de Treg redirigidas

Una condicion previa esencial para la utilidad de Treg que expresan al TpCR espedfico de TNP en el tratamiento de autoinmunidad es la verificacion de su actividad reguladora, a saber, una capacidad para suprimir la proliferacion de celulas T efectoras en una forma dependiente de la dosis. Tambien se examino si dicha activacion de Treg se produce como resultado de la senalizacion de TpCR, y si en realidad era independiente de la interaccion CD28-B7. Una serie de experimentos de cocultivo examino las Treg de diferentes cepas de Tg, como se describe a continuacion.

Ejemplo VI

Treg que contienen al receptor quimerico espedfico de TNP espedficamente suprimio la actividad de las celulas T efectoras

Para caracterizar si las Treg de TNP-Tg retuvieron sus propiedades anergicas, se purificaron celulas Treg CD4+CD25+ y celulas T efectoras CD4+CD25- partir de diferentes creadores del raton Tg (ratones de tipo silvestre (WT) y de control anti-TNP, anti-Erb-b2) se purificaron a partir de esplenocitos a granel. Se incubaron 105 celulas in vitro durante 24h, 48h o 72 horas (Figura 9) y se activaron de forma no espedfica con Ab anti-CD3 y anti-CD28, o espedficamente con TNP modificado con globulina gamma de ave de corral (FyG-TNP). Se midio la proliferacion de celulas T usando la absorcion de un colorante (sal de tetrazolio XTT) o timidina marcada en forma radioactiva. Se midio la secrecion de IL2 usando coloracion de XTT de la lmea celular CTLL-2 que depende de IL-2.

Todas las poblaciones de celulas efectoras mostraron una proliferacion significativamente mayor y secrecion de IL2 despues de estimulacion no espedfica con Ab anti-CD3 + anti-CD28. La estimulacion espedfica mediante FyG-TNP se tradujo en proliferacion y secrecion de IL2 por las celulas T efectoras que contienen el receptor quimerico de TNP, pero no por dichas celulas T de ratones Tg anti-Erb-B2 o WT. Por el contrario, las Treg de ratones de tipo silvestre, ratones Tg receptores quimericos de TNP y ratones Tg Erb-B2 retuvieron sus propiedades anergicas: no experimentaron una proliferacion medible o secrecion de IL2 cuando se sometieron al estfmulo no espedfico o Ag espedfico.

Para caracterizar si la activacion policlonal podna activar la accion supresora de las Treg de TNP-Tg, se cocultivaron estas Treg en microplacas de 96 pozos (0,2 mL) con celulas presentadoras antfgeno irradiadas (APC) y celulas T efectoras (CD4+ CD25-) en una relacion de 1:1. Se activaron las celulas en estos cultivos, ya sea mediante (1)

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"imitacion" del antigeno inmovilizado (anti-CD3 + anti-CD28) o (2) Concanavalina A soluble (ConA). La proliferacion de celulas T se midio como la captacion de timidina y se midio la secrecion de IL2 como el crecimiento de las celulas de la lmea celular CTLL-2 dependiente de IL-2 (coloracion con XTT).

La Figura 10 muestra un experimento de ConA. La estimulacion no espedfica (policlonal) de las Treg indujo a que estas celulas exhibieran una potente inhibicion de la proliferacion de celulas T efectoras y secrecion de IL2, independientemente del origen de las Treg o la presencia del receptor quimerico. Por lo tanto, la manipulacion genetica de las Treg del tipo descrito aqu conserva sus propiedades supresoras.

Ejemplo VII

Estimulacion espedfica del antfgeno de celulas Treg redirigidas con TNP Resultados en la supresion de la proliferacion de celulas T efectoras.

Para estudiar la estimulacion de Treg espedficas del antfgeno a traves del TpCR, se realizaron experimentos de cocultivo en los que las APC cargadas con TNP proporcionaron la presentacion de Ag (Figura 11). Las comparaciones de estimulacion espedficas TNP se llevaron a cabo, comparando las Treg de TNP-Tg versus las de tipo silvestre (Figura 11, panel izquierdo) o las Treg de ErbB2-Tg y TNP-Tg (Figura 11, panel derecho). En ausencia de la estimulacion de TNP, no se produjo la proliferacion de celulas T efectoras (las barras mas a la izquierda en ambas graficas). Por el contrario, la incubacion con las APC modificadas con TNP dio como resultado:

(1) una marcada proliferacion de celulas T efectoras de TNP-Tg pero no de tipo silvestre o de ErbB2-Tg en ausencia Treg; y

(2) la activacion de las Treg de TNP-Tg, pero no de WT o Erb-b2-Tg, que se manifiesta como supresion de la proliferacion de celulas efectoras por las Treg espedficas TNP unicamente.

Estos resultados probaron la forma espedfica del antfgeno de activacion y funcion de las celulas Treg de TpCR espedfica de TNP en respuesta al antfgeno, TNP.

El cocultivo de relaciones variables de celulas T reguladoras espedfico de TNP y de celulas T efectoras espedfica de TNP (Figura 12) demostro la inhibicion exitosa espedfica del antfgeno por las Treg en una relacion de 1 una celula Treg a 8 celulas T efectoras.

Se llevaron a cabo estudios que apoyan la existencia de los efectos espectadores. Se indujo colitis en ratones como anteriormente usando OXA tal como se describe en el Ejemplo I. La transferencia adoptiva de Treg solas espedficas TNP no protegio a estos animales de la colitis. Sin embargo, en presencia de cantidades traza de TNP aplicado al colon, los animales fueron protegidos de esta colitis inducida por OXA.

Ejemplo VIII

La actividad supresora de las Treg redirigidas a TpCR es independiente de los receptores coestimuladores

Para evaluar el papel de la senalizacion coestimuladora en el modelo TpCR-Tg anterior, se llevaron a cabo experimentos de cocultivo usando como APC (a) celulas P815 modificadas con TNP, una lmea celular que no expresa B7, o (b) celulas P815 modificadas geneticamente cargadas con TNP que expresan en forma estable el gen B7 (Figura 13). La estimulacion de celulas T efectoras de TNP-Tg con celulas TNP-P815 indujo proliferacion, que fue marcadamente suprimida por Treg de TNP-Tg. La expresion de B7 en estas APC no promovio ninguna supresion adicional mediada por Treg. Se concluyo que la supresion maxima de Treg se produjo independientemente de B7. Tambien se observo alguna supresion con Treg de tipo silvestre. Esto se explica por la activacion previa de estas celulas antes de su recoleccion. Con base en estos resultados, se puede concluir que la inclusion del dominio de senalizacion intracitoplasmatico de CD28 en el TpCR de celulas Treg redirigidas da como resultado una activacion completa de su actividad supresora cuando son estimuladas por Ag independientemente de la presencia de coestimulacion de B7-CD28.

Ejemplo IX

Caracterizacion funcional de la actividad de Treg espedfica de TNP in vivo en colitis murina

TNBS es un potente inductor de las respuestas de celulas T tal como la sensibilizacion por DTH/contacto. Este hapteno reactivo tambien induce colitis autoinmune cuando se aplica al colon de ratones previamente sensibilizados. Para determinar si las Treg que contienen TpCR podnan suprimir la autoinmunidad, se empleo el modelo de colitis aguda

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mediada por TNBS. La administracion intrarrectal de TNBS conduce a su union con las protemas del colon, volviendo a estas protemas modificadas inmunogenicas de manera que provocan una respuesta inmune mediada por celulas T. El efecto supresor de las Treg transferidas en forma endogena o exogena a una enfermedad inflamatoria autoinmune fue probado en este modelo. Se utilizo un hapteno diferente, oxazolona (OXA) con propiedades de sensibilizacion similares y que induce colitis experimental como un control de in vivo.

Ejemplo X

Los ratones transgenicos cuya poblacion completa de Treg expresa al receptor anti-TNP quimerico, son resistentes a la colitis inducida por TNBS

Se indujo colitis mediada por el hapteno TNP en ratones Tg y WT sensibilizando primero los animales con 150 mL del acido 2,4,6-trinitrobencenosulfonico (TNBS, Sigma-Aldrich) con una concentracion de 2,5% en etanol al 50% pintado sobre la piel el dfa 1. El dfa 8, se administro el antfgeno por via rectal (150 pL de TNBS al 1% en etanol al 50%; colitis de alta dosis). Los ratones WT desarrollaron colitis severa en el lapso de 2-5 dfas despues de la administracion rectal de TNBS (Figura 14, panel izquierdo). Por el contrario, el 90% de los ratones TNP- Tg teman colones de apariencia normal (Figura 14, derecha). Los puntajes de severidad de la colitis fueron los siguientes:

Animales

Puntuacion de colitis (unidades arbitrarias) Mortalidad

Tipo silvestre

12 ± 3,1

TNP-ACD28-Tg

11,1 ±4 90 ± 20%

ErbB2-Tg

12,7 ± 3,2

TNP-Tg

2 ± 2 (p<0,05) 20 ± 20% (p<0,01)

Para producir curvas de mortalidad, se repitieron los experimentos anteriores con dosis mas bajas de TNBS (75 pL de TNBS al 1% en etanol al 50%). Se observaron diferencias similares en la severidad de la colitis y en la mortalidad (Figura 15). Microscopicamente, los colones de ratones de tipo silvestre, TNP-ACD28-Tg y ErbB2-Tg mostraron inflamacion severa, necrosis, hemorragia y en algunos casos perforacion, mientras que aquellos de ratones TNP-Tg paredan normales o casi normales (Figura 16).

La evidencia de la especificidad del antfgeno de la proteccion de la colitis mediada por hapteno provino de estudios de colitis inducida por oXa. Como se muestra en la Figura 17, no se observaron diferencias en la mortalidad entre ratones de tipo silvestre, TNP-Tg, TNP-ACD28-Tg y ErbB2-Tg. Lo mismo puede decirse para las puntuaciones de colitis macroscopicas y microscopicas. A partir de estos experimento in vivo, se concluyo que la presencia de una poblacion de celulas Treg que expresa uniformemente al receptor quimerico anti-TNP resulta en un mayor grado de proteccion contra la inflamacion inducida por TNBS, que se manifiesta como inflamacion reducida del colon y supervivencia significativamente mejor. Es de destacar que la inclusion de la senalizacion coestimuladora con CD28 en el CR mejora significativamente la funcion supresora de las Treg de TNP-Tg.

Ejemplo XI

La estimulacion prolongada con TNP combinado con TGF-p promueve la conversion que conduce de celulas T efectoras espedficas de TNP en Treg espedficas de TNP.

Las Treg de origen natural se derivan del timo, expresan altos niveles de Foxp3 y suprimen la activacion de linfocitos efectores. La activacion espedfica del antfgeno celulas T efectoras humanas puede inducir expresion de Foxp3 en un subgrupo de las celulas efectoras activadas, que a su vez desarrollan un fenotipo regulador. Se demostro que estas celulas T reguladoras inducidas son capaces de supresion dependiente del contacto de la celula de celulas efectoras aisladas recientemente (Walker y colaboradores, 2003, citado mas arriba). En ratones, se ha demostrado que la exposicion prolongada de celulas efectoras a TGF-p induce Treg tanto in vitro como in vivo (Fantini y colaboradores, 2004, 2006, citado mas arriba). Esta pequena poblacion, de celulas Treg inducibles generadas perifericamente puede ser importante en la regulacion y contencion de la respuesta inmune en curso, mientras que la incapacidad para inducir tales celulas Treg puede ser responsable de la propension a desarrollar autoinmunidad.

Para probar si tal induccion ocurrio despues de la estimulacion de celulas T efectoras a traves del TpCR, se aislaron celulas T efectoras de tipo silvestre, TNP-Tg, ErbB2-Tg y TNP-CD28 sin Tg mediante clasificacion por FACS y se cultivaron durante 7 dfas en presencia ya sea de (1) Ab anti-CD3, (2) TGF-p, (3) mAb para TNP, (4) Ab anti-CD3 + TGF-

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p, o (5) Ab anti-TNP + TGF-p. La induccion de Foxp3 en celulas que se "desarroNan" a partir de estas celulas T efectoras fue evaluada despues de siete dfas de cultivo utilizando coloracion de Foxp3 intracelular (Figura 18).

En el tiempo 0 hasta el tiempo de la clasificacion de celulas T efectoras, no se observo coloracion de Foxp3. Una semana de estimulacion con anti-CD3 + TGF-p, pero no con TNP + TGF-p, se tradujo en un aumento de 2 veces en celulas Foxp3 + en celulas efectoras T de tipo silvestre, ErbB2-tg y TNP-CD28 sin Tg. Por el contrario, se observo un aumento dramatico de 30 veces en celulas Foxp3+ en celulas efectoras de NP-Tg despues de exposicion a TNP + TGF- p. Curiosamente, no se observo induccion de Foxp3 en celulas T efectoras de TNP-Tg despues de incubacion con Ab anti-CD3 o con TGF-p, probablemente debido a una atenuacion significativa de la expresion de CD3 en celulas T de TNP-Tg (Morvinsky-Friedman y colaboradores, en prensa).

Los resultados anteriores demostraron que la estimulacion espedfica de antigeno a traves del TpCR en presencia de TGF-p, condujo a la induccion de Treg espedficas de Ag a partir de celulas T efectoras, que contribuye ademas a la expansion de Treg. Este cambio era dependiente tanto de la especificidad del antigeno de la unidad de reconocimiento de Ab del TpCR y la fraccion de senalizacion de CD28 intracitoplasmatica.

De acuerdo con la presente invencion, la induccion de Treg de esta forma permite la generacion de grandes poblaciones de Treg que contienen TpCR que pueden ser utilizadas en la terapia de autoinmunidad basada en celulas.

Ejemplo XII

La transferencia adoptiva de las Treg de TNP-Tg en ratones WT con colitis por TNBS mejora los smtomas y la supervivencia.

Se llevaron a cabo estudios para establecer que las Treg de TNP-Tg son responsables de la resistencia de los ratones TNP-Tg a la colitis por TNBS y para evaluar su capacidad terapeutica en la autoinmunidad. Se aislaron y administraron Treg de tipo silvestre, de TNP-Tg y de Erb-B2-Tg en diferentes cantidades a ratones de tipo silvestre un dfa despues de la induccion de colitis por TNBS. Como se describio anteriormente, la transferencia adoptiva de grandes cantidades de Treg de cualquier origen (> 2 x 105) causo una atenuacion no espedfica de la colitis por TNBS. Se cree que esto es el resultado de la presencia de una poblacion suficientemente grande de celulas Treg activadas previamente que pueden ejercer su actividad supresora en ausencia de estimulacion o especificidad del antfgeno. Por el contrario, la transferencia adoptiva de cantidades mas pequenos (5 x 104) de Treg de TNP-TG, pero no de Treg de tipo silvestre o ErbB2-Tg, prolongo la supervivencia (Figura 19), mejoro los puntajes de severidad de la colitis de Wallach (Figura 20), y mejoro significativamente la apariencia macroscopica (Figura 21) y microscopica (Figura 22) del tejido del colon. La Figura 21 muestra un marcado acortamiento del intestino, una manifestacion de inflamacion del colon (en ratones de WT y ErbB2-Tg, pero no en TNP-Tg). La Figura 22 muestra la severidad de la inflamacion transmural, necrosis, sangrado de la mucosa y perdida de la arquitectura normal en colones de ratones WT con colitis por TNBS que hadan recibido control (WT y ErbB2-Tg), pero no en colones de TNP-Tg.

Ejemplo XIII

Migracion/Trafico de Treg redirigidas a sitios de inflamacion: las Treg de TNP-Tg transferidas en forma adoptiva se localizan en los colones en colitis inducida por TNBS

Se realizaron estudios para obtener apoyo adicional para el papel de las Treg de TNP-Tg en la atenuacion de la colitis por TNBS al demostrar que estas celulas de hecho se localizan en el tejido del colon inflamado. Se aislaron Treg de WT y de TNP-Tg y se tineron con el colorante intracelular fluorescente, succinimidil ester de diacetato de carboxifluorescema (CFSE). Despues de la tincion, se administraron 106 Treg por via intraperitoneal (ip) para ratones WT de control o para ratones WT en los cuales se hada inducido colitis por TNBS 12 horas antes. Dieciseis horas despues de este tratamiento, los ratones fueron sacrificados y se aislaron linfocitos de la lamina propia de sus colones. El protocolo utilizado fue descrito anteriormente para aislar los linfocitos de lamina propia. Despues de eso, se examinaron las celulas para determinar la presencia de celulas positivas para CFSE mediante analisis FACS. Como se muestra en la Figura 23, cantidades muy pequenas de Treg transferido adoptivamente de TNP-Tg o WT alcanzaron los colones de ratones normales. La induccion de la colitis condujo a un pequeno aumento (0,5% a 0,8%) en el numero de Treg coloreadas con CFSE de WT en tejido de colon. Por el contrario, la transferencia adoptiva de Treg de TNP-Tg marcadas con CFSE a ratones con colitis condujo a un aumento significativo en la poblacion Treg en el colon, en el intervalo de 0,4% a 3,6%. Esto demuestra que las Treg de TNP-Tg se localizan en un organo objetivo expuesto a TNBS, donde ejercen su funcion supresora.

Ejemplo XIV

Acumulacion de Treg de TNP-Tg transferidas en forma adoptiva dentro de la capa mucosa de los colones de ratones con colitis por TNBS.

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Un aspecto importante de la comprension del papel de las Treg para la terapia adoptiva de la inflamacion autoimmune de la Treg en organos enfermos, donde se espera que ellas ejerzan sus efectos supresores. Para demostrar la localizacion de TNP-Tg-Treg, se marcaron las Treg de WT y TNP-Tg con CFSE y se transfirieron a ratones WT 24 horas despues de la induccion de la colitis con TNBS. Si bien se observaron un numero muy pequeno de Treg de WT marcadas con CFSE en celulas ex^das de la lamina propia de colon de ratones no modificados o a los que se les indujo colitis con TNBS, se observo un incremento de nueve veces en las Treg de TNP-Tg (Figura 23).

Para estudiar la cinetica de localizacion de Treg de TNP-Tg de animales vivos, se empleo el sistema de formacion imagenes IVIS® serie 100 (Xenogen, Alameda CA). Se administraron Treg de tipo silvestre y TNP-Tg, 1.5x106, marcadas con el colorante carbocianina lipofflica de infrarrojo cercano yoduro de 1,T-dioctadecil-3,3,3',3'- tetrametilindotricarbocianina (DiR, Invitrogen eE.UU.), en forma ip a ratones WT con o sin colitis por TNBS, que se controlaron diariamente con la camara CCCD de cuerpo entero de IVIS (Figura 24). Se observo una senal fluorescente abdominal anterior fuerte, que refleja el grueso de las celulas Treg inyectadas, en ratones no modificados 24-48 horas despues de la inyeccion intraperitoneal de las Treg y desaparecieron despues de eso, debido a la redistribucion de las Treg. En ratones con colitis por TNBS, se observo una senal abdominal leve durante 72 horas, que probablemente refleja autofluorescencia relacionada con la inflamacion. En ratones con colitis por TNBS que recibieron Treg marcadas de Wt, se podfa reconocer una senal fluorescente abdominal entre moderada y debil hasta 96 horas despues de la transferencia de Treg. Por el contrario, las Treg de TNP-Tg administradas a ratones WT con colitis por TNBS mostraron una senal fluorescente abdominal distinta hasta por una semana despues de la transferencia de las celulas, sustancialmente mas fuerte que aquella de las Treg de tipo silvestre en todos los puntos de tiempo. Estos resultados reflejan la localizacion persistencia de Treg de TNP-Tg dentro de los colones durante la colitis.

Para determinar si las Treg de TNP-Tg alcanzan la capa interna mucosa del colon, la ubicacion donde la mayor parte del dano de la mucosa inducida por TNBS tiene lugar, se empleo un sistema de microendoscopia confocal Cell Vizio (Cell Vizio, MKT, Pans, Francia). Un microendoscopio confocal de 650 pm de diametro insertado en forma rectal permitio la visualizacion de celulas marcadas con CFSe en un espesor de pared intestinal de hasta 150pm (Figura 25). Se pueden visualizar numerosas Treg de TNP-Tg, marcadas con CFSE transferidas en forma adoptiva en la capa mucosa interna de ratones WT con colitis por TNBS tan pronto como 12 horas despues de la transferencia de sistemica Treg. Este resultado indica que las Treg de TNP-Tg localizadas en respuesta a TNBS colonicas, en un lapso de horas desde su administracion, y que ellas alcanzan las capas mucosas colonicas mas profundas, donde ellas ejercen sus funciones supresoras.

Ejemplo XV

La administracion de Treg de TNP-Tg espedficas para un antfgeno espectador (TNBS) cura la colitis mediada por un antfgeno patogenico (oxazolona)

En contraste con la colitis mediada por hapteno, en la que el antfgeno provocador es predefinido, se desconoce el antfgeno que causa la enfermedad en la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). Para permitir la aplicacion del enfoque del “cuerpo T” en IBD, se analizaron las Treg no modificadas que contienen TpCR para determinar si pueden ser activadas por un antfgeno “espectador” predeterminado asociado con colitis o con el colon, para realizar su accion supresora no espedfica del antfgeno. Para este fin, se sensibilizaron previamente ratones WT y TNP-Tg unicamente a oxazolona. Se introdujeron por via rectal una mezcla de oxazolona y bajas dosis de TNBS. Como se muestra en la Fig. 26a, una exposicion concomitante de ratones WT con TNBS y oxazolona, fue asociada con una tasa de mortalidad del 100% en una semana, en comparacion con solamente una mortalidad del 15% en una semana de ratones TNP-TG (P <0,01). En forma similar, fue evidente una inflamacion mucosa significativa tanto en ratones WT como TNP-Tg con colitis por oxazolona (no mostrada), y fue mas severa en ratones de tipo silvestre a los que se les suministro TNBS + oxazolona (Fig. 26b, caja I) dando como resultado un sangrado severo, deposicion de fibrina y desprendimiento de la mucosa del colon.

En marcado contraste, los ratones TNP- Tg a los que se les administro TNBS + oxazolona mostraron una mucosa colonica de apariencia normal con areas dispersas de colitis leve (Fig. 26b, cuadro II). Macroscopicamente y microscopicamente, los colones de ratones WT tratados concomitantemente TNBS y oxazolona mostraron una colitis severa, en forma opuesta a los colones casi normales en ratones TNP-TG (Figs. 26c y 26d, respectivamente).

Notablemente, este efecto protector "espectador" tambien se presento cuando se transfirieron adoptivamente Treg de TNP-Tg a ratones de tipo silvestre sensibilizados previamente con oxazolona que recibieron un refuerzo intrarrectal con una mezcla de oxazolona y bajas dosis de TNBS (Fig. 26e, P < 0,01). Por el contrario, las Treg de WT transferidas adoptivamente no teman este efecto curativo, y las dosis muy bajas de TNBS en ausencia de sensibilizacion previa fueron insuficientes por sf mismas para inducir colitis por TNBS. Estos resultados demuestran que la activacion de Treg por un antfgeno espectador (TNBS) causa una mejora en la colitis que ha sido inducida por un antfgeno diferente sin reactividad cruzada (oxazolona).

Ejemplo XVI

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Administracion de Foxp3 a nucleos de celulas por vectores que comprenden receptores quimericos

Se realizo un experimento para comprobar que el Foxp3 puede ser expresado despues de la transduccion de las celulas A273 con constructos de vectores retrovirales disenados para transducir celulas Treg. Se genero un gen fusionado que inclma secuencias de eGFP que codifican protema fluorescente verde (denominada como eGFP o GFP). Este fue modificado como un constructo bicistronico con la sola secuencia de GFP o enlazada con una secuencia que codifica Foxp3 (despues de una IRES) en vectores que comprendfan un constructo receptor quimerico con las siguientes regiones de reconocimiento extracelular: Vease la descripcion de la Figura 27 para discusion de los constructos receptores quimericos utilizados. 273 celulas transducidas con vectores que comprenden los mismos receptores quimericos pero con un solo gen eGFP bicistronico (sin Foxp3) sirvieron como controles para la expresion de Foxp2.

Los resultados se muestran en la Figura 27. La mitad superior de la figura muestra los controles unicos de GFP, mientras que la mitad inferior de la figura muestra los constructos GFP-Foxp3. Los rectangulos de dos paneles en la Figura muestran imagenes microscopicas de fluorescencia (mitad derecha) y microscopicas de luz (mitad izquierda) del mismo material (para visualizar y localizar la GFP).

Todo el grupo de control expreso la eGFP en su citoplasma unicamente. Por el contrario, en las celulas que fueron transducidas con los constructos de fusion eGFP-Foxp3, los nucleos eran fluorescente (apareciendo como imagenes nucleares brillantes) debido al transporte y expresion del factor de transcripcion Foxp3 en los nucleos.

En otro experimento no mostrado aqrn, la expresion del receptor quimerico elaborado a partir de la protema MD2 de longitud completa (SEQ ID NO: 5) o la protema CD14 (SEQ ID NO: 4) fue confirmada por la capacidad de las celulas transducidas, que expresaron la region extracelular del CR en su superficie, para unirse al ligando de MD2 y CD14, LPS bacteriano, que se proporciona en forma biotinilada y revelado por union secundaria de avidina fluorescente.

Ejemplo XVII

Los vectores que comprenden receptores quimericos con regiones extracelulares que se unen a LPS

Se han elaborado constructos de acido nucleico y vectores que codifican regiones extracelulares que comprenden un dominio de anticuerpo anti-LPS (por ejemplo, SEQ ID NO: 3 o la porcion del mismo que codifica scFv) y se pueden elaborar otros. Tales vectores expresan dominios de polipeptidos extracelulares que se muestra que se unen a LPS, por ejemplo, en un ensayo usando LPS biotinilado y avidina marcada en forma detectable (por ejemplo, marcada en forma fluorescente). Vease tambien el Ejemplo XVI mas arriba.

Se han elaborado constructos de acido nucleico y vectores que codifican regiones extracelulares que comprenden un polipeptido no anticuerpo que se une a LPS (por ejemplo, SEQ ID Nos: 6-11, 13 y 14). Tales constructos incluyen aquellos bicistronicos que tambien comprenden Foxp3. Se pueden elaborar otros de tales constructos usando el metodo descrito anteriormente, junto con metodos bien conocidos en la tecnica. Tales constructos (tales como SEQ ID NO: 13 y 14) incluyen aquellos que codifican la protema CD14 de longitud completa (SEQ ID NO: 4) o MD2 (SEQ ID NO: 5) y constructos que codifican motivos de los mismos que se unen a LPS (tal como las SEQ ID Nos: 6-9) y combinaciones (tal como las, SEQ ID Nos: 10 y 11). Los constructos que se elaboran incluyen aquellos con regiones estimuladoras/coestimuladoras intracelular de CD28-FcRy y aquellos que utilizan otros del tipo divulgado en el presente documento.

Las celulas Treg se redirigen como se describe en este documento usando los constructos anteriores, incluyendo aquellos que han sido elaborados y probados y aquellos que pueden ser elaborados.

Tales celulas Treg se administran a sujetos que sufren de IBD, tal como colitis ulcerosa. Las celulas Treg se administran en cantidades de acuerdo con los ejemplos anteriores, o en cantidades que son facilmente determinadas como efectivas por aquellos expertos en la tecnica utilizando unicamente experimentacion de rutina, y a traves de vfas de administracion como se ejemplifico anteriormente y se divulgo a traves de este documento. Estas celulas Treg redirigidas que expresan una region de anticuerpo que se une a LPS u otra fraccion que se une a LPS en su superficie (CD14, MD2, fragmentos de las mismas, o combinaciones de estas), como parte de sus CR son capaces de reducir los smtomas, intensidad, severidad y duracion de la IBD en el sujeto en un grado significativo comparado con sujetos de control no tratados o sujetos de control a los que se les administro Treg de control. (tales celulas Treg de control son aquellas no transducidas que expresan los presentes CR, o aquellas redirigidas que son espedficas para los antfgenos o ligandos que no presentes en el sitio de la IBD). La introduccion de moleculas o epftopos relacionados con LPS que se unen a estos mismos receptores extracelulares en las celulas Treg redirigidas a los sitios de administracion (y/o accion esperada) de las celulas Treg redirigidas facilita aun mas su actividad terapeutica.

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   Reivindicaciones

   1. Una poblacion linfocitos T redirigidos con un fenotipo regulador (celulas T redirigidas), estando las celulas T redirigidas dotadas con especificidad hacia un antigeno o ligando objetivo, cuyo antigeno o ligando objetivo es uno que esta presente o expresado en un sitio o tejido de una respuesta inmune o inflamatoria no deseada, cuyas celulas comprenden cada una, una molecula quimerica de acido nucleico que se expresa, en una cadena continua unica, un polipeptido receptor quimerico que comprende una region de reconocimiento extracelular, una region transmembrana y una region de senalizacion intracelular, de tal manera que la region extracelular de la mismos se despliega sobre la superficie de dichas celulas, en donde dicha molecula quimerica de acido nucleico comprende:

   (a) un primer segmento de acido nucleico que comprende una secuencia que codifica dicha region de reconocimiento extracelular espedfica para dicho antfgeno o ligando objetivo, cuya region no comprende un dominio extracelular de protema del MHC; y en donde dicha region se une al antfgeno o ligando objetivo en una forma no restringida al MHC o en una manera no dependiente del MHC;

   (b) un segundo segmento de acido nucleico que comprende una secuencia que codifica dicha region transmembrana; y

   (c) un tercer segmento de acido nucleico que comprende una secuencia que codifica dicha region senalizacion intracelular que comprende una combinacion de fracciones del polipeptido de senalizacion de celulas T.
2. 2. La poblacion de celulas T redirigidas de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha region de reconocimiento extracelular se une al antfgeno o ligando objetivo en una forma independiente del acoplamiento del ligando coestimulador en una celula objetivo.
3. 3. La poblacion de celulas T redirigidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicha region reconocimiento extracelular comprende un dominio de scFv derivado del anticuerpo que es espedfico para el antfgeno o ligando objetivo
4. 4. La poblacion de celulas T redirigidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha region de reconocimiento extracelular se enlaza a dicha region transmembrana a traves de un espaciador flexible, preferiblemente una bisagra de una molecula de la superfamilia de inmunoglobulinas.
5. 5. La poblacion de celulas T redirigidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha region intracelular comprende un fraccion de senalizacion de (i) una cadena de polipeptido de un receptor espedfico del antfgeno de una celula T y/o (ii) un cadena polipeptido de un receptor de una celula T que tiene una region que comprende un motivo de activacion basado en tirosina inmunorreceptor (ITAM), preferiblemente una fraccion de senalizacion de una cadena de polipeptido seleccionado del grupo que consiste de una cadena del complejo TCR/CD3, y la cadena y de un receptor de Fc de Ig (FcRy).
6. 6. La poblacion de celulas T redirigidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha region intracelular incluye una fraccion de senalizacion de una protema coestimuladora-receptora de celula T, preferiblemente al menos una protema seleccionada de entre el grupo que consiste de CD28, OX40, CD40L, 4-1BB (CD137) y PD-1.
7. 7. La poblacion de celulas T redirigidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha region de senalizacion intracelular incluye una enzima de transduccion de senal que (a) es una enzima en la ruta de transduccion de la senal de un receptor espedfico del antfgeno de una celula T o (b) es una enzima con la correspondiente especificidad y actividad que la enzima de (a), derivada de un linfocito que no es de las celulas T, preferiblemente un miembro de la familia quinasa Syk.
8. 8. La poblacion de celulas T redirigidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho acido nucleico quimerico incluye ademas una secuencia de nucleotidos que codifica FoxP3 que provocara que la Treg redirigida exprese Foxp3.
9. 9. La poblacion de celulas T redirigidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho antfgeno o ligando objetivo es uno que esta presente o expresado en un sitio o tejido objetivo de una respuesta autoinmune o inflamatoria mediada por Las celulas T efectoras autoagresivas.
10. 10. La poblacion de las celulas T redirigidas de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicha respuesta autoinmune o inflamatoria y dicho antfgeno o ligando objetivo se seleccionan del grupo que consiste de:

    (a) enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), en donde dicho antfgeno o ligando es uno que se expresa en colon o fleon enfermo;

    5

    10

    15

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    35

    (b) artritis reumatoide, en donde dicho antigeno o ligando es un epftopo de colageno o un antigeno presente en las articulaciones;

    (c) esclerosis multiple, en donde dicho antigeno o ligando es un antfgeno neuronal.

    (d) tiroiditis autoinmune, en donde dicho antigeno o ligando es un antigeno de tiroides;

    (e) gastritis autoinmune, en donde dicho antigeno o ligando es un antfgeno gastrico;

    (f) uvettis autoinmune o uveorretinitis, en donde dicho antigeno o ligando es un antigeno S u otro antigeno uveal o retinal

    (g) orquitis autoinmune, en donde dicho antfgeno o ligando es un antfgeno testicular;

    (h) ooforitis autoinmune, en donde dicho antfgeno o ligando es un antfgeno de ovario;

    (i) psoriasis, en donde dicho antfgeno o ligando es un antfgeno queratinocito u otro antfgeno presente en la dermis o epidermis;

    (j) vitiligo, en donde dicho antfgeno o ligando es un antfgeno de melanocito;

    (k) prostatitis autoinmune, en donde dicho antfgeno o ligando es un antfgeno de prostata;

    (l) cualquier respuesta inmune no deseada, en donde dicho antfgeno o ligando es un antfgeno de activacion expresado en celulas T efectoras presentes en el sitio de la respuesta inmune no deseada;

    (m) rechazo de tejidos, en donde dicho antfgeno o ligando es la molecula del MHC que tiene el haplotipo del tejido trasplantado o una porcion de esa molecula del MHC; y

    (n) una condicion inflamatoria, en donde dicho antfgeno o ligando es uno que se expresa en celulas no linfoides del linaje hematopoyetico que participa en la inflamacion.
11. 11. Una composicion farmaceutica inmunorreguladora para supresion de una respuesta inmune/inflamatoria o tratamiento de una enfermedad o condicion inmune/inflamatoria, que comprende:

    (a) una poblacion de celulas T redirigidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, y

    (b) un vehfculo, excipiente o diluyente farmaceutica e inmunologicamente aceptable.
12. 12. Un metodo para producir la poblacion de celulas T redirigidas de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende las etapas (a) - (d):

    (a) proporcionar una poblacion de linfocitos o celulas T, obtenida de un sujeto, y, opcionalmente, enriquecer o aislar y propagar dicha poblacion de linfocitos o celulas T;

    (b) inducir un fenotipo de celulas Treg en dichas celulas mediante estimulacion o activacion adecuada de las celulas por exposicion a TGF-p u otra citoquina que induce la expresion de Foxp3 induciendo de este modo el fenotipo de Treg;

    (c) antes o despues de la etapa (b), transfectar o la transducir las celulas ex vivo con un vector de expresion que codifica de dicho receptor quimerico que se exprese en dicha celula T; y

    (d) opcionalmente, el crecimiento o expansion de las celulas obtenidas como anteriormente in vitro, o que comprende las etapas (e) - (h);

    (e) proporcionar una poblacion de linfocitos o celulas T, obtenida de un sujeto y, opcionalmente enriquecer o aislar y propagar, una poblacion de linfocitos o celulas T;

    (f) transfectar o transducir las celulas ex vivo con un vector que codifica al receptor quimerico;

    (g) antes, despues, o concomitantemente con la etapa (f), transfectar o la transducir las celulas ex vivo con un constructo de expresion de acido nucleico recombinante que codifica Foxp3; y

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    (h) opcionalmente, cultivar o expandir las celulas obtenidas como anteriormente in vitro.
13. 13. La poblacion de celulas T redirigidas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en una cantidad efectiva, para uso en un metodo para mediacion de una respuesta inmune o inflamatoria o en el tratamiento o alivio de los smtomas de una enfermedad o condicion inmune/inflamatoria en un sujeto mai^ero, mediante la administracion a un sitio de celulas T efectoras que van a suprimir una cantidad de dichas celulas Treg efectivas para suprimir dicha actividad de celulas T efectoras.
14. 14. La poblacion de celulas T redirigidas para uso de acuerdo con la reivindicacion 13, para el tratamiento o alivio de los smtomas de una enfermedad o condicion inmune/inflamatoria en un sujeto mairnfero que es mediada por actividad indeseada de celulas T efectoras, que incluye ademas, ya sea antes, concomitantemente con, o despues de la administracion de las celulas Treg redirigidas, la introduccion al sitio o tejido objetivo de dicha respuesta inmune o inflamatoria, un antigeno o ligando exogeno y dicho antigeno o ligando objetivo es dicho antigeno o ligando exogeno.
15. 15. Una molecula de ADN quimerica que comprende:

    (a) un primer segmento de acido nucleico que comprende una secuencia que codifica una region de reconocimiento extracelular espedfica para un antfgeno o ligando objetivo, cuya region no comprende un dominio extracelular de protema del MHC, y en donde dicha region se une al antfgeno o ligando objetivo de una manera no restringida al MHC o de una manera que no depende del MHC; dicho antfgeno o ligando objetivo siendo uno que esta presente o expresado en un sitio o tejido de una respuesta inmune o inflamatoria no deseada;

    (b) un segundo segmento de acido nucleico que comprende una secuencia que codifica una region transmembrana;

    (c) un tercer segmento de acido nucleico que comprende una secuencia que codifica una region de senalizacion intracelular que comprende una combinacion de fracciones de polipeptidos de senalizacion de celulas T, y

    (d) una secuencia de nucleotidos que codifica Foxp3 que, tras la transfeccion o transduccion de la molecula quimerica de acido nucleico en una celula T, causara que la celula T transfectada o transducida exprese Foxp3,

    en donde, despues de la transfeccion o la transduccion de la molecula quimerica de acido nucleico en una celula T, la celula T expresa un polipeptido receptor quimerico que comprende dicho region de reconocimiento extracelular, dicha region transmembrana y dicha region de senalizacion intracelular en una sola cadena continua, con la celulas T desplegando la region extracelular en la superficie celular y expresa Foxp3, convirtiendose asf en un linfocito T redirigido dotado de con el fenotipo de la celula Treg.
16. 16. La molecula quimerica de ADN de acuerdo con la reivindicacion 15, en donde dicha region de reconocimiento extracelular se une al antfgeno o ligando objetivo en una forma independiente del acoplamiento del ligando coestimulador en una celula objetivo.