ES2597441T3 - 2,6-diamino-pirimidin-5-il-carboxamidas como inhibidores de las syk o JAK quinasas - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula I:**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: D1 es cicloalquilo C3-8, opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en: alquilo C1-8, amino, hidroxi, alquilcarbonilo C1-8, aminocarbonilo, alcoxicarbonilamino C1- 8, arilalcoxicarbonilamino C1-8, fenilo y heterociclil-alquileno C1-8; R1 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-8, amino, aminocarbonilo, hidroxilo, alcoxi C1-8, haloalquilo C1-8, alquenilo C2-8, alquinilo C2-8, oxo, ciano, alcoxicarbonilo C1-8, cicloalquilo C3-8, arilo y heterociclilo; y cada heterociclilo está opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en: alquilo C1-8, halo, oxo, amino, alcoxi C1-8, alquilcarbonilo C1-8, arilalcoxicarbonilo C1-8, aminocarbonilo, arilalquilenocarbonilo C1-8 y alquilsulfonilo C1-8; Y1 se selecciona entre el grupo que consiste en (a) arilo; opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes, R4a, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8-alquilo C1-8, aminocarbonil-, hidroxilo, oxo, halógeno, hidroxi, alcoxi C1-8 y alquilsulfonilo C1-8; (b) heteroarilo, opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes, R4a, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8-alquilo C1-8, aminocarbonil-, hidroxilo, oxo, halógeno, hidroxi, alcoxi C1-8 y alquilsulfonilo C1-8; R2 es un heterociclilo o heteroarilo sustituido con al menos un grupo, R3, seleccionado entre el grupo que consiste en aminoalquil C1-8-, alcoxi C1-8-alquil C1-8-, oxo-, alquilcarbonilo C1-8, cicloalquilcarbonilo C3-8, heterociclilcarbonilo, alquilcarbonilamino C1-8, cicloalquilcarbonilamino C3-8, heterociclilcarbonilamino, alquilsulfonilo C1-8, cicloalquilsulfonilo C3-8 y heterociclilsulfonilo; y en la que R2 está opcionalmente sustituido adicionalmente con 1 a 2 sustituyentes, R4c, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8, halo, aminocarbonilo, oxo, hidroxilo, aminoalquileno C1-8, alcoxi C1-8-alquileno C1-8, alquilcarbonilo C1-8, cicloalquilcarbonilo C3-8, heterociclilcarbonilo, alquilcarbonilamino C1-8, cicloalquilcarbonilamino C3-8, heterociclilcarbonilamino, alquilsulfonilo C1-8, cicloalquilsulfonilo C3-8, heterociclilsulfonilo, cicloalquilo C3-8, alquilcicloalquileno C1-8, heteroarilo; donde cicloalquilo se refiere a un grupo hidrocarburo mono o policíclico alquilo, alquenilo o alquinilo que puede formar un anillo puenteado o un anillo espiro, y que puede tener uno o más dobles o triples enlaces.

Description

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DESCRIPCION
2,6-diamino-pirimidin-5-il-carboxamidas como inhibidores de las syk o JAK quinasas Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a compuestos de pirimidina-5-carboxamida que actuan como inhibidores de la tirosina quinasa del bazo (syk) y/o las JAK quinasas. Esta invencion tambien se refiere a composiciones farmaceuticas que contienen compuestos de pirimidina-5-carboxamida y a los metodos de uso de los compuestos o composiciones para tratar una afeccion caracterizada por trombosis no deseada. La invencion tambien se refiere a metodos para preparar los compuestos descritos en el presente documento.
Estado de la tecnica
Las protelna quinasas constituyen una gran familia de enzimas relacionadas estructuralmente que son responsables del control de una diversidad de procesos de transduccion de senales dentro de las celulas (vease, por ejemplo, Hardie y Hanks, The Protein Kinase Facts Book, I y II, Academic Press, San Diego, Calif., 1995). Se piensa que las protelna quinasas han evolucionado a partir de un gen ancestral comun debido a la conservacion de su estructura y funcion catalltica. Casi todas las quinasas contienen un dominio catalltico similar de 250-300 aminoacidos. Las quinasas se pueden categorizar en familias por los sustratos que fosforilan (por ejemplo, protelna-tirosina, protelna- serina/treonina, llpidos, etc.). Se han identificado motivos de secuencia que en general corresponden con cada una de estas familias (vease, por ejemplo, Hanks y Hunter, (1995), FASEB J. 9: 576-596; Knighton et al., (1991), Science 253: 407-414; Hiles et al., (1992), Cell 70: 419-429; Kunz et al., (1993), Cell 73: 585-596; Garcia-Bustos et al., (1994), EMBO J. 13: 2352-2361).
Muchas enfermedades estan asociadas con respuestas celulares anomalas desencadenadas por sucesos mediados por protelna quinasas. Estas enfermedades incluyen enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias, enfermedades oseas, enfermedades metabolicas, enfermedades neurologicas y neurodegenerativas, cancer, enfermedades cardiovasculares, alergias, asma, enfermedad de Alzheimer y enfermedades relacionadas con las hormonas. En consecuencia, ha habido esfuerzos sustanciales en la qulmica de farmacos para encontrar inhibidores de las protelna quinasas para su uso como agentes terapeuticos.
La senalizacion mediada por motivos de activacion de inmunorreceptores por tirosina (ITAM) ha emergido como un suceso principal en las rutas de senalizacion responsables de patologlas humanas. La senalizacion mediada por ITAM es responsable de la retransmision de senales de activacion iniciadas en receptores inmunitarios clasicos tales como los receptores de linfocitos T, receptores de linfocitos B, receptores Fc, en celulas inmunitarias y en GPVI y FcYRIIa en las plaquetas hacia moleculas intracelulares aguas abajo tales como syk y ZAP-70 (Underhill, D.M y Goodridge, H. S., Trends Immunol., 28: 66-73, 2007).
La union de un ligando a un receptor que contiene ITAM desencadena sucesos de senalizacion que permiten la incorporacion de protelnas de una familia de tirosina quinasas no receptoras denominadas la familia Src. Estas quinasas fosforilan restos de tirosina dentro de la secuencia ITAM, una region con la que interactuan los dominios SH2 en tandem en ya sea syk o ZAP-70.
Syk, junto con Zap-70, es un miembro de la familia syk de protelnas tirosina quinasas. La interaccion de syk o de zAP-70 con secuencias de ITAM difosforiladas induce un cambio de la conformacion en las quinasas que permite la fosforilacion de tirosinas en la propia quinasa. Los miembros de la familia Syk fosforilados activan una multitud de protelnas de la ruta de senalizacion aguas abajo, que incluye la fosfoprotelna especlfica de leucocitos de 76 kDa (SLP-76), el Enlazador de Activacion de linfocitos T (LAT) y la PLC (fosfolipasa C) y2, que contienen el dominio de homologla con Src 2 (SH2).
Las patologlas humanas atribuidas a la senalizacion mediada por ITAM disfuncional incluye enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, lupus sistemico, esclerosis multiple, anemia hemolltica, purpura trombocitopenica inmunitaria y trombocitopenia inducida por heparina, y arteriosclerosis. Cabe destacar que se piensa que muchas de las enfermedades anteriormente mencionadas se producen a traves del entrecruzamiento de receptores Fc mediante anticuerpos que, a traves de syk, activan una cascada de senalizacion en mastocitos, basofilos y otras celulas inmunitarias, lo que da como resultado la liberacion de mediadores celulares responsables de reacciones inflamatorias. La liberacion de mediadores y la produccion de citocinas en reacciones alergicas e inflamatorias dependientes de la estimulacion por IgE a partir de mastocitos y de basofilos se puede controlar mediante la inhibicion de la actividad tirosina quinasa de syk (Rossi, A.B. et al., J Allergy Clin Immunol., 118: 749755, 2006). En la trombocitopenia inmunitaria, el bazo retira anticuerpos unidos a las plaquetas por un proceso mediado por receptor Fc/ITAM/syk (Crow, A.R. et al., Blood, 106: resumen 2165, 2005). La trombocitopenia inducida por farmacos, provocada por complejos inmunitarios de heparina-factor de plaquetas 4 que activan al FcYRIIa de plaquetas, tambien implica la senalizacion de syk aguas abajo de la interaccion del receptor (Reilly, M.P., Blood, 98:
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Los agonistas de plaquetas inducen la senalizacion de integrinas dentro-fuera dando como resultado la union de fibrinogeno y la agregacion de plaquetas. Esto inicia la senalizacion dentro-fuera que produce estimulacion adicional de las plaquetas. Syk se activa durante ambas fases de la senalizacion de integrinas y la inhibicion de syk se ha demostrado que inhibe la adhesion de plaquetas a protelnas inmovilizadas (Law, D.A. et al., Blood, 93: 2645-2652, 1999). La liberacion de acido araquidonico y de serotonina, y la agregacion de plaquetas inducida por colageno, esta claramente inhibida en plaquetas obtenidas de raton deficiente en syk (Poole, A. et al., EMBO J., 16: 2333-2341, 1997). Por lo tanto, los inhibidores de syk tambien poseen accion de anticoagulacion.
Debido al papel que desempena syk en las activaciones de plaquetas inducidas por Ig, es probable que sea importante en la arteriosclerosis y la reestenosis. La arteriosclerosis es una clase de enfermedad caracterizada por el engrosamiento y el endurecimiento de las paredes arteriales de los vasos sangulneos. Aunque todos los vasos sangulneos son susceptibles a esta seria afeccion degenerativa, la aorta y las arterias coronarias que sirven al corazon son las mas frecuentemente afectadas. La arteriosclerosis tiene una profunda importancia cllnica puesto que puede aumentar el riesgo de ataques cardiacos, infartos de miocardio, ictus y aneurismas.
El tratamiento tradicional para la arteriosclerosis incluye procedimientos de recanalizacion vascular para los bloqueos menos graves y derivacion coronaria quirurgica para los bloqueos importantes. Un efecto grave de los procedimientos intravasculares es que, en un numero significativo de individuos tratados, algunos o todos de los vasos tratados vuelven a sufrir reestenosis (es decir, vuelven a estrecharse). Por ejemplo, la reestenosis de una arteria coronaria aterosclerotica despues de la ACTP se produce en el 10-50 % de los pacientes que se someten a este procedimiento y, posteriormente, requiere angioplastia adicional o un injerto de derivacion de arterias coronarias. Ademas, la reestenosis de una arteria coronaria aterosclerotica despues de la colocacion de estents se produce en el 10-20 % de los pacientes que se someten a este procedimiento y posteriormente requiere tratamientos repetidos para mantener la circulacion sangulnea adecuado a traves de la arteria afectada. En general, la reestenosis se produce en un periodo de tiempo relativamente breve, por ejemplo, aproximadamente menor de seis meses, despues del tratamiento.
Aunque no se han determinado los procesos hormonales y celulares exactos que promueven la reestenosis, se piensa que la reestenosis se debe en parte a la lesion mecanica de las paredes de los vasos sangulneos provocada por el cateter con globo u otro dispositivo intravascular. Por ejemplo, el procedimiento de ACTP, ademas de abrir la arteria obstruida tambien lesiona celulas de musculo liso (CML) de las arterias coronarias residentes. En respuesta a esta lesion, las plaquetas adherentes, los macrofagos infiltrantes, los leucocitos o las mismas celulas de musculo liso, liberan factores de crecimiento derivados de celulas tal como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), con la posterior proliferacion y migration de CML medias a traves de la lamina elastica interna, hacia la zona de la Intima del vaso. La proliferacion adicional y la hiperplasia de las CML de la Intima y, mas significativamente, la production de grandes cantidades de matriz extracelular durante de un periodo de tres a seis meses, da como resultado el llenado y estrechamiento del espacio vascular, suficiente para obstruir de forma significativa la circulacion sangulnea.
Ademas del papel que desempena syk en las activaciones de plaquetas inducidas por Ig, syk desempena un papel muy importante en la senalizacion mediada por colageno. La protelna de adhesion principal responsable de la adhesion y activation de plaquetas es el colageno. El colageno es una protelna filamentosa contenida en las obstrucciones fibroticas de los ateromas, que quedan expuestas a la sangre durante la ruptura de la placa. El colageno funciona de forma inicial uniendo el factor de von Willebrand, que amarra a las plaquetas a traves de la union a GPIb de la membrana plaquetaria. El colageno funciona de forma secundaria interaccionando con los dos receptores de colageno en las plaquetas, GPVI y la integrina a2p1.
GPVI existe en las membranas de las plaquetas como un complejo con FcRy, una interaction necesaria para la expresion de GPVI. La activacion del FcYRNa sobre las plaquetas da como resultado el cambio de la forma de la plaqueta, secretion y trombosis. La senalizacion mediante el complejo GPVI/FcRy se inicia por la fosforilacion de tirosinas del dominio ITAM del FCRy seguido de la incorporation de syk. La activacion de GPVI conduce a la induction de multiples funciones plaquetarias que incluyen: activacion de las integrinas a2p1 para conseguir la firme adhesion plaquetaria y GP IIb-IIIa que media la agregacion plaquetaria y el crecimiento de la trombosis, la secrecion de plaquetas, que permite el suministro de protelnas inflamatorias tales como CD40L, RANTES yTGFp a la pared vascular; y la expresion de P-selectina, que permite la incorporacion de leucocitos. Por lo tanto, se cree que los inhibidores de syk pueden inhibir los sucesos tromboticos mediados por la adhesion, activacion y agregacion plaquetaria.
Se ha notificado que la fosforilacion de tirosinas de protelnas intracelulares (activacion) inducida por la estimulacion de un receptor de anticuerpos IgG, FcyR, y la fagocitosis mediada por FcyR, esta inhibida de forma considerable en macrofagos obtenidos de raton deficiente en syk (Crowley, M.T. et al., J. Exp. Med., 186: 1027-1039, 1997). Esto sugiere que syk tiene un papel claramente importante en la fagocitosis mediada por FcyR de macrofagos.
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Tambien se ha notificado que un oligonucleotido antisentido de syk suprime la inhibicion de la apoptosis de eosinofilos inducida por GM-CSF (Yousefi, S. et al., J. E. Med., 183: 1407-1414, 1996), mostrando que syk es esencial para la senal de extension de la vida de los eosinofilos provocada por GM-CSF y similares. Puesto que la extension de la vida de los eosinofilos esta estrechamente relacionada con la transicion de enfermedades a estados cronicos en trastornos alergicos, tales como el asma, los inhibidores de syk tambien pueden servir como agentes terapeuticos para la inflamacion eosinofllica cronica.
Syk es importante para la activacion de linfocitos B a traves del receptor de antlgeno de linfocitos B y esta implicada en el metabolismo del fosfatidilinositol y en el aumento de la concentracion de calcio intracelular provocada por la estimulacion del receptor de antlgeno (Hutchcroft, J E. et al., J. Biol. Chem., 267: 8613-8619,1992; y Takata, M. et al., EMBO J., 13: 1341-1349, 1994). Por lo tanto, los inhibidores de syk se pueden utilizar para controlar la funcion de los linfocitos B y, por lo tanto, se espera que sirvan como agentes terapeuticos para enfermedades relacionadas con anticuerpos.
Syk se une a un receptor de antlgeno de linfocitos T, rapidamente experimenta fosforilacion de las tirosinas a traves del entrecruzamiento del receptor y actua de forma sinergica sobre las senales intracelulares mediadas por las tirosina quinasas Src tales como Lck (Couture, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 5301-5305,1994; y Couture, C. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 5249-5258, 1994). Syk esta presente en poblaciones de linfocitos T maduros, tales como linfocitos T y5 intraepiteliales y linfocitos T ap sin exposition previa, y se ha notificado que tienen la capacidad de fosforilar multiples componentes de la cascada de serialization del TCR (Latour, S. et al., Mol Cell Biol., 17: 44344441, 1997). En consecuencia, los inhibidores de syk pueden servir como agentes para la inhibicion de la inmunidad celular mediada por el receptor de antlgeno de los linfocitos T.
Estudios recientes de hibridacion genomica comparativos han identificado a syk como otro gen importante en la patogenia del Linfoma de Celulas del Manto (LCM) (Chen, R. et al. Journal of Clinical Oncology, 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition). Vol 25, n.° 18S (suplemento del 20 de junio), 2007: 8056). El LCM representa el 5-10 % de todos los linfomas no Hodgkin y es una forma de linfoma diflcil de tratar. Tiene el peor pronostico entre los linfomas de linfocitos B con una supervivencia media de tres anos. Se ha notificado que Syk esta sobreexpresada en el LCM (Rinaldi, A, et al., Br. J. Haematol., 2006; 132:303-316) y que Syk media en las senales de supervivencia de mTOR (diana de la Rapamicina en mamlfero) en el linfoma folicular, de celulas del manto, de Burkitt y difuso de linfocitos B grandes (Leseux, L., et al., Blood, 2006; 108: 4156-4162).
Varias llneas de evidencia sugieren que muchos linfomas de linfocitos B dependen de senales de supervivencia mediadas por el receptor de linfocitos B (BCR). La senalizacion del BCR induce la oligomerization del receptor y la fosforilacion de los motivos de activacion de inmunorreceptor Iga y p mediante las quinasas de la familia SRC. La fosforilacion del ITAM da como resultado la incorporation y activacion de syk, que inicia los sucesos aguas abajo y amplifica la senal original del BCR. Dado el papel de la senalizacion del BCR tonica en linfocitos B normales y la supervivencia dependiente de syk de las llneas celulares de linfoma no Hodgkin in vitro (Chen, L., et al., Blood, 2006; 108: 3428-3433), la inhibicion de syk es una diana de tratamiento razonable prometedora para determinados linfomas de linfocitos B y leucemia linfocltica cronica (LLC) (Stefania Gobessi, Luca Laurenti, Pablo Longo, Laura Carsetti, Giuseppe Leone, Dimitar G. Efremov, Constitutive activation of the protein tyrosine kinase Syk in Chronic Lymphocytic Leukemia B-cells, Blood, 2007, 110, Resumen 1123). Datos recientes muestran que la administration de un inhibidor de multiples quinasas que inhibe a syk, puede tener actividad cllnica significativa en pacientes con LLC (Friedberg JW et al., Blood 2008; 112(11), Resumen 3).
El potencial oncogenico de la tirosina quinasa del bazo (Syk) se ha descrito en varios contextos distintos. Cllnicamente, la expresion aumentada de Syk se describe en el Linfoma de Celulas del Manto (Rinaldi, A, et al., Br. J. Haematol., 2006; 132: 303-316) y la protelna de fusion TEL-Syk (Leucemia del ETS Traslocado) que genera una translocation cromosomica (t(9;12)(q22;p12)) conduce a la actividad aumentada de Syk y se asocia con el slndrome mielodisplasico (Kuno, Y., et al., Blood, 2001; 97:1050-1055). Las celulas de medula osea transferidas de forma adoptiva que expresan TEL-Syk humana inducen leucemia en ratones (Wossning, T., JEM, 2006; 203: 28292840). Adicionalmente, en celulas de medula osea primarias de raton, la expresion aumentada de Syk da como resultado el crecimiento en cultivo independiente de lL-7 (Wossning, T., et al., JEM, 2006; 203: 2829-2840).
Cabe destacar que la senalizacion de Syk parece ser necesaria para el desarrollo y la supervivencia de los linfocitos B en el ser humano y el raton. La perdida inducible del receptor de linfocitos B (Lam, K., et al., Cell, 1997; 90: 10731083) o de Iga (Kraus, M., et al., Cell, 2004; 117: 787-800) da como resultado la perdida de linfocitos B perifericos en ratones. La expresion aumentada de la protelna tirosina fosfatasa de PTP-RO, la cual se sabe que regula de forma negativa la actividad de Syk, inhibe la proliferation e induce la apoptosis de llneas celulares obtenidas de linfomas no Hodgkin (Chen, L., et al., Blood, 2006; 108: 3428-3433). Para finalizar, los linfomas de linfocitos B raramente presentan perdida de expresion del BCR y la terapia antidiotipo raramente conduce a resistencia (Kuppers, R. Nat Rev Cancer, 2005; 5:251-262).
El reconocimiento del receptor especlfico de antlgeno de linfocitos B (BCR) activa multiples rutas de senalizacion que en ultima instancia regulan el estado de activacion de las celulas, promoviendo la supervivencia y la expansion clonal. La senalizacion a traves del BCR se hace posible por su asociacion con otros dos miembros de la
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superfamilia de las inmunoglobulinas, Iga e Igp, cada uno portando un inmuno-dominio de activacion basado en tirosina (ITAM) (Jumaa, Hendriks et al. Annu Rev Immunol 23: 415-45 (2005)). En respuesta al reconocimiento del BCR, la quinasas de la familia Src fosforilan de forma directa el dominio ITAM. La tirosina quinasa del bazo (Syk) se acopla con el ITAM y lo fosforila, un proceso que potencia su actividad quinasa, dando como resultado la autofosforilacion de Syk y la fosforilacion de tirosinas de multiples sustratos aguas abajo (Rolli, Gallwitz et al. Mol Cell 10(5): 1057-69 (2002)). Esta ruta de senalizacion esta activa en los linfocitos B al comienzo de la transicion de la fase pro- a pre-linfocito B del desarrollo, cuando se expresa el pre-BCR recientemente formado. De hecho, en ratones genosuprimidos para Syk el desarrollo de los linfocitos B de detiene en la etapa de linfocito pro-B (Cheng, Rowley et al. 1995; Turner, Mee et al. Nature 378(6554): 303-6 (1995)). La perdida inducible del receptor de linfocitos B (Lam, Kuhn et al. Cell 90(6): 1073-83 (1997)) o de Iga (Kraus, Alimzhanov et al. Cell 117(6): 787-800 (2004)) da como resultado la perdida de linfocitos B perifericos en ratones. Los linfocitos B de ser humano tambien parecen necesitar a Syk para la proliferacion y supervivencia. La expresion aumentada de la protelna tirosina fosfatasa PTP-RO, un regulador negativo de la actividad de Syk, inhibe la proliferacion e induce la apoptosis en llneas celulares obtenidas de linfomas no Hodgkin (LNH) (Chen, Juszczynski et al. Blood 108(10): 3428-33 (2006)). La genosupresion de Syk mediante ARNip en la llnea de LNH SUDHL-4 condujo a un bloqueo en la transicion G1/S del ciclo celular (Gururajan, Dasu et al. J Immunol 178(1): 111-21 (2007)). Juntos, estos datos sugieren que la senalizacion de Syk es necesaria para el desarrollo, proliferacion e incluso la supervivencia de linfocitos B de ser humano y de raton.
A la inversa, el potencial oncogenico de Syk se ha descrito en varios contextos distintos. Cllnicamente, la expresion aumentada de Syk se describio en el Linfoma de Celulas del Manto (Rinaldi, Kwee et al. Br J Haematol 132(3): 30316 (2006) y la protelna de fusion TEL-Syk (Leucemia del ETS Traslocado) generada por una translocacion cromosomica (t(9;12)(q22;p12)) conduce a la actividad aumentada de Syk y se asocia con el slndrome mielodisplasico (Kuno, Abe et al. Blood 97(4): 1050-5 (2001). Las celulas de medula osea transferidas de forma adoptiva que expresan TEL-Syk humana inducen leucemia en ratones (Wossning, Herzog et al. J Exp Med 203(13): 2829-40 (2006). Adicionalmente, en celulas de medula osea primarias de raton, la expresion aumentada de Syk da como resultado el crecimiento en cultivo independiente de IL-7 (Wossning, Herzog et al. 2006). Consecuentemente, se ha descrito que Syk media las senales de supervivencia de mTOR (diana de la Rapamicina en mamlferos) en LNH folicular, de celulas del manto, de Burkitt y de linfocitos B grandes difusos (Leseux, Hamdi et al. Blood 108(13): 4156-62 (2006). Ademas, estudios recientes adicionales sugieren que las senales de supervivencia dependientes de Syk pueden desempenar un papel en los canceres de linfocitos B, incluyendo LDCBG, linfoma de celulas del manto y linfoma folicular (Gururajan, Jennings et al. 2006; Irish, Czerwinski et al. J Immunol 176(10): 5715-9 (2006). Dado el papel de la senalizacion tonica del BCR en linfocitos B normales y la supervivencia dependiente de Syk de llneas celulares de LNH in vitro, la inhibition especlfica de Syk podrla resultar prometedora para el tratamiento de determinados linfomas de linfocito B.
Recientemente, se describio que R406 (Rigel Pharmaceuticals) inhibe la senalizacion del ITAM en respuesta a diversos estlmulos, incluyendo FceR1 y BCR inducido por la activacion de Syk (Braselmann, Taylor et al. J Pharmacol Exp Ther 319(3): 998-1008 (2006). Cabe destacar que este inhibidor de Syk competitivo de AtP tambien fue activo frente a las Flt3, cKit y JAK quinasas, pero no frente a la Src quinasa (Braselmann, Taylor et al. 2006). La activacion de mutaciones de Flt3 esta asociada con la LMA y la inhibicion de esta quinasa esta actualmente bajo desarrollo cllnico (Burnett and Knapper Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007: 429-34 (2007). El aumento de la activacion de la tirosina quinasa cKit tambien esta asociada con canceres hematologicos y es una diana para la terapia del cancer (Heinrich, Griffith et al. Blood 96(3): 925-32 (2000). De manera similar, la senalizacion de JAK3 esta implicada en leucemias y linfomas, y actualmente se esta explotando como una diana terapeutica potencial (Heinrich, Griffith et al. 2000). Hay que destacar que la actividad inhibidora multiquinasas de R406 atenua la senalizacion del BCR en las llneas celulares de linfoma y en muestras de linfoma humano primario, dando como resultado la apoptosis de estas (Chen, Monti et al. Blood 111(4): 2230-7 (2008). Adicionalmente, un ensayo cllnico de fase II notifico resultados favorables para este compuesto en el LNH refractario y en leucemia linfocltica cronica (Friedberg JW et al., Blood 2008; 112(11), Resumen 3). Aunque el mecanismo preciso de action para R406 no esta claro, los datos sugieren que la inhibicion de las quinasas que median las senales de supervivencia en linfocitos es cllnicamente beneficiosa.
Ademas, estudios adicionales recientes sugieren que las senales de supervivencia dependientes de syk pueden desempenar un papel en los canceres de linfocitos B, incluyendo el LDCBG, linfoma de celulas del manto y linfoma folicular (vease por ejemplo, S. Linfengshen et al. Blood, Feb. 2008; 111: 2230-2237; J. M. Irish et al. Blood, 2006; 108: 3135-3142; A. Renaldi et al. Brit J. Haematology, 2006; 132: 303-316; M. Guruoajan et al. J. Immunol, 2006; 176: 5715-5719; L. Laseux et al. Blood, 2006; 108: 4156-4162).
Las JAK quinasas (Quinasas Janus) son una familia de protelnas tirosina quinasas citoplasmaticas que incluye a JAK1, JAK2, JAK3 y TYK2. Las JAK desempenan un papel crucial en la senalizacion de citocinas. Cada una de las JAK quinasas es selectiva para los receptores de determinadas citocinas, si bien multiples JAK quinasas pueden estar afectadas por citocinas o rutas de senalizacion particulares. Los estudios sugieren que JAK3 se asocia con la cadena gamma del receptor de citocinas comun (fcY o yc) de diversos receptores de citocinas. JAK3 en particular se une a receptores de forma selectiva y es parte de la ruta de senalizacion de citocinas para, y activada por, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. JAK1 interactua con, entre otros, los receptores para las citocinas IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-
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21, mientras que JAK2 interactua con, entre otros, los receptores para IL-9 y TNF-a. Despues de la union de determinadas citocinas a sus receptores (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21), se produce la oligomerizacion del receptor, dando como resultado que las colas citoplasmaticas de las JAK quinasas asociadas se coloquen de forma proximidad y faciliten la transfosforilacion de los restos de tirosina en la JAK quinasa. Esta transfosforilacion da como resultado la activacion de la JAK quinasa.
Los sustratos aguas abajo de las quinasas de la familia JAK incluyen a las protelnas transductoras de senal y activadoras de la transcripcion (STAT). Las JAK quinasas fosforiladas se unen a diversas protelnas STAT (Transductoras de Senal y Activadoras de la Transcripcion). Las protelnas STAT, que son protelnas de union a ADN activadas mediante la fosforilacion de residuos de tirosina, funcionan como moleculas de senalizacion y factores de transcripcion y en ultima instancia se unen a secuencias de ADN especlficas presentes en los promotores de los genes sensibles a citocinas (Leonard et al., (2000), J. Allergy Clin. Immunol. 105: 877-888).
Se ha implicado a la senalizacion JAK/STAT en la mediacion de muchas respuestas inmunitarias anomalas tales como alergias, asma, enfermedades autoinmunitarias tales como rechazo de trasplante (aloinjerto), artritis reumatoide, esclerosis lateral amiotrofica y esclerosis multiple, as! como en canceres solidos y hematologicos tales como leucemias y linfomas. Para una revision de la intervencion farmaceutica de la ruta JAK/STAT vease Frank, (1999), Mol. Med. 5:432:456 y Seidel et al., (2000), Oncogene 19:2645-2656.
En particular, se ha implicado a JAK3 en una diversidad de procesos biologicos. Por ejemplo, la proliferacion y supervivencia de mastocitos murinos inducida por IL-4 e iL-9 se ha demostrado que es dependiente de la senalizacion de JAK3 y de la cadena gamma (Suzuki et al., (2000), Blood 96: 2172-2180). JAK3 tambien desempena un papel crucial en las respuestas de degranulacion de mastocitos mediada por el receptor de IgE (Malaviya et al.,
(1999) , Biochem. Biophys. Res. Commun. 257: 807-813), y la inhibicion de la JAK3 quinasa ha demostrado prevenir las reacciones de la hipersensibilidad de tipo I, incluyendo anafilaxia (Malaviya et al., (1999), J. Biol. Chem. 274: 27028-27038). Tambien se ha demostrado que la inhibicion de JAK3 da como resultado la supresion inmunitaria para el rechazo de aloinjertos (Kirken, (2001), Transpl. Proc. 33: 3268-3270). Tambien se ha implicado a las JAK3 quinasas en el mecanismo implicado en las etapas temprana y tardla de artritis reumatoide (Muller-Ladner et al.,
(2000) , J. Immunal. 164: 3894-3901); la esclerosis lateral amiotrofica familiar (Trieu et al., (2000), Biochem Biophys. Res. Commun. 267: 22-25); la leucemia (Sudbeck et al., (1999), Clin. Cancer Res. 5: 1569-1582); la micosis fungoide, una forma de linfoma de linfocitos T (Nielsen et al., (1997), Prac. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6764-6769) y el crecimiento celular anomalo (Yu et al., (1997), J. Immunol. 159: 5206-5210; Catlett-Falcone et al., (1999), Immunity 10: 105-115).
JAK1, JAK2 y TYK2 se expresan de forma ubicua, mientras que JAK3 se expresa de forma predominante en celulas hematopoyeticas. Las JAK quinasas, incluyendo JAK3, se expresan de forma abundante en celulas de leucemia primarias de ninos con leucemia linfoblastica aguda, la forma mas comun de cancer en la infancia, y los estudios han correlacionado la activacion de STAT en determinadas celulas con senales que regulan la apoptosis (Demoulin et al., (1996), Mol. Cell. Biol. 16: 4710-6; Jurlander et al., (1997), Blood. 89: 4146-52; Kaneko et al., (1997), Clin. Exp. Immun. 109: 185-193 y Nakamura et al., (1996), J. Biol. Chem. 271: 19483-8). Ademas se sabe que son importantes para la diferenciacion, funcion y supervivencia de linfocitos. JAK-3 en particular desempena un papel esencial en la funcion de linfocitos, macrofagos y mastocitos. Dada la importancia de esta JAK quinasa, los compuestos que modulan la ruta de JAK, incluyendo los selectivos para JAK3, pueden ser utiles para el tratamiento de enfermedades o trastornos donde esta implicada la funcion de linfocitos, macrofagos o mastocitos (Kudlacz et al., (2004) Am. J. Transplant 4: 51-57; Changelian (2003) Science 302: 875-878). Los trastornos en los que se contempla que la accion sobre la ruta de JAK o la modulation de las JAK quinasas, en particular de JAK3, sea terapeuticamente util incluyen, leucemia, linfoma, rechazo de trasplante (por ejemplo, rechazo de trasplante de islotes pancreaticos, aplicaciones en trasplantes de medula osea (por ejemplo, enfermedad injerto contra el hospedador), enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, diabetes, artritis reumatoide, lupus, psoriasis) e inflamacion (por ejemplo, asma, reacciones alergicas). Mas adelante se discuten con mas detalle los trastornos que se pueden beneficiar de la inhibicion de JAK3. Se han notificado datos recientes sobre la inhibicion de JAK en pacientes de aloinjerto de rinon tratados con CP-690.550, y muestran que los marcadores de respuesta alogena (interferon gamma) pueden estar reducidos (Van Gurp EA et al. (2009) Transplanatation 87: 79-86).
A la vista de las numerosas afecciones que se contempla que se beneficien del tratamiento que implica la modulacion de la ruta de JAK, es inmediatamente obvio que los compuestos nuevos que modulan las rutas de JAK y los metodos de uso de estos compuestos deberlan proporcionar sustanciales beneficios terapeuticos a una amplia diversidad de pacientes. Se proporcionan en el presente documento compuestos de 2,4-pirimidina diamina nuevos para su uso en el tratamiento de afecciones en las que la accion sobre la ruta de JAK o la inhibicion de las JAK quinasas, en particular de JAK3, sea terapeuticamente util.
Las patentes y solicitudes de patente relacionadas con la modulacion de la ruta de JAK incluyen: las Patentes de Estados Unidos n.° 5.728.536; 6.080.747; 6.080.748; 6.133.305; 6.177.433; 6.210.654; 6.313.130; 6.316.635; 6.433.018; 6.486.185; 6.506.763; 6.528.509; 6.593.357; 6.608.048; 6.610.688; 6.635.651; 6.677.368; 6.683.082; 6.696.448; 6.699.865; 6.777.417; 6.784.195; 6.825.190; 6.506.763; 6.784.195; 6.528.509; 6.608.048; 7.105.529; 6.699.865; 6.825.190; 6.815.439; 6.949.580; 7.056.944; 6.998.391; 7.074.793; 6.969.760; Solicitudes de Patente de
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Estados Unidos n.° 2001/0007033 A1; 2002/0115173 A1; 2002/0137141 A1; 2003/0236244 A1; 2004/0102455 A1; 2004/0142404 A1; 2004/0147507 A1 y 2004/0214817 A1; y las Solicitudes de Patente Internacional WO 95/03701A1; WO 99/15500A1; WO 00/00202A1; WO 00/10981A1; WO 00/47583A1; WO 00/51587A2; WO 00/55159A2; WO 01/42246A2; WO 01/45641A2; WO 01/52892A2; WO 01/56993A2; WO 01/57022A2; WO 01/72758A1; WO 02/00661A1; WO 02/43735A1; WO 02/48336A2; WO 02/060492A1; WO 02/060927A1; WO 02/096909A1; WO 02/102800A1; WO 03/020698A2; WO 03/048162A1; WO 03/101989A1; WO 2004/016597A2; WO 2004/041789A1; WO 2004/041810A1; WO 2004/041814A1; WO 2004/046112A2; WO 2004/046120A2; WO 2004/047843A1; WO 2004/058749A1; WO 2004/058753A1; WO 2004/085388A2; WO 2004/092154A1; WO 2005/009957A1; WO 2005/016344A1; WO 2005/028475A2 y WO 2005/033107A1.
Las patentes y solicitudes de patente que describen compuestos de pirimidina diamina sustituidas incluyen: la solicitud de Estados Unidos n.° de Ser. 10/355.543 presentada el 31 de enero de 2003 (US2004/0029902A1), la solicitud internacional n.° de Serie PCT/US03/03022 presentada el 31 de enero de 2003 (wO 03/063794), la solicitud de Estados Unidos n.° de Ser. 10/631.029 presentada el 29 de junio de 2003, la solicitud internacional n.° de Serie PCT/US03/24087 (WO 04/014382), la solicitud de Estados Unidos n.° de Ser. 10/903.263 presentada el 30 de julio de 2004 y la solicitud internacional n.° de Serie PCT/US2004/24716 (WO 05/016893). Los compuestos de pirimidina diamina sustituidas tambien se describen en las solicitudes de patente internacional numeros de publicacion: WO 02/059110, WO 03/074515, WO 03/106416, WO 03/066601, WO 03/063794, WO 04/046118, WO 05/016894, WO 05/122294, WO 05/066156, WO 03/002542, WO 03/030909, WO 00/39101, WO 05/037800 y la patente de Estados Unidos n.° de publicacion 2003/0149064.
El documento WO 2008/009458 A1 describe compuestos de pirimidina tales como compuestos de 2,4-di(arilamino)- pirimidina-5-carboxamida que presentan actividades de inhibicion de las JAK-3 y JAK-2 quinasas. El documento EP1518855 A1 describe compuestos de diaminopirimidina carboxamida que se pueden utilizar para la prevencion o el tratamiento de enfermedades respiratorias en las que STAT 6 esta implicado, tales como asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica y similares. El documento US 2004/0029902 A1 describe compuestos de 2,4-pirimidina diamina que inhiben las cascadas de senalizacion de los receptores de IgE y/o IgG, junto con metodos de slntesis de tales compuestos y metodos para el uso de tales compuestos en metodos de tratamiento medico.
Aunque se han hecho progresos en este campo, todavla existe una necesidad en la tecnica de compuestos que inhiban la syk y/o JAK quinasa, as! como de metodos para el tratamiento de afecciones en un paciente, tales como la reestenosis, la trombosis y/o la inflamacion, que puedan beneficiarse de tal inhibicion. Ademas, tambien serla conveniente la disponibilidad de compuestos que inhiban de forma selectiva una de estas quinasas en comparacion con otras quinasas. La presente invencion satisface esta y otras necesidades.
Breve sumario de la invencion
La presente invencion proporciona compuestos nuevos que tienen actividad como inhibidores de la actividad de syk (tambien denominados en el presente documento como “inhibidores de syk”) y/o de la actividad de la JAK quinasa (tambien denominados en el presente documento como "inhibidores de JAK "), as! como metodos para su preparacion y uso, y composiciones farmaceuticas que contienen los mismos. Tales compuestos tienen la siguiente estructura (I):
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o un tautomero, sal o estereoisomero de los mismo farmaceuticamente aceptable, en la que D1, R1, Y1 y R2 son como se definen mas adelante.
La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de formula I, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un transportador y/o diluyente farmaceuticamente aceptable.
Los compuestos de la presente invencion tienen utilidad sobre un amplio intervalo de aplicaciones terapeuticas y pueden utilizarse para tratar una diversidad de afecciones, mediadas al menos en parte por la actividad de syk, tanto en hombres como en mujeres, as! como en un mamlfero en general (tambien denominado en el presente documento como un “sujeto”). Por ejemplo, tales trastornos incluyen, pero sin limitacion, los asociados con enfermedad cardiovascular, enfermedad inflamatoria o enfermedad autoinmunitaria. En concreto, los compuestos de la presente
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invencion tienen utilidad para el tratamiento de afecciones o trastornos que incluyen, pero sin limitacion: reestenosis, trombosis, inflamacion, trombocitopenia inducida por heparina, miocardiopatla dilatada, anemia de celulas falciformes, aterosclerosis, infarto de miocardio, inflamacion vascular, angina inestable, slndromes coronarios agudos, alergia, asma, artritis reumatoide, enfermedades mediadas por linfocitos B tales como linfomas no Hodgkin , slndrome antifosfolipldico, lupus, psoriasis, esclerosis multiple, nefropatla terminal, anemia hemolltica, purpura trombocitopenica inmunitaria y leucemia linfocltica cronica. Por lo tanto, en una realization, la invencion proporciona un compuesto de formula (I), normalmente en la forma de una composition farmaceutica, para su uso en el tratamiento de un sujeto que lo necesite, incluyendo dicho tratamiento la administration de una cantidad eficaz de dicho compuesto.
Las afecciones asociadas con enfermedad cardiovascular se seleccionan del grupo que consiste en slndrome coronario agudo, infarto de miocardio, angina inestable, angina resistente, trombosis coronaria oclusiva que se presenta despues de la terapia trombolltica o angioplastia poscoronaria, un slndrome cerebrovascular mediado de forma trombotica, ictus embolico, ictus trombotico, crisis isquemicas transitorias, flebotrombosis, flebotrombosis profunda, embolia pulmonar, coagulopatla, coagulation intravascular diseminada, purpura trombocitopenica trombotica, tromboangitis obliterante, enfermedad trombotica asociada con trombocitopenia inducida por heparina, complicaciones tromboticas asociadas con la circulation extracorporea, complicaciones tromboticas asociadas con la instrumentation tales como el cateterismo cardiaco u otros cateterismos cardiovasculares, globo de contrapulsacion aortica, estent coronario o valvula cardiaca, y afecciones que necesitan el ajuste de dispositivos protesicos.
Los compuestos de la presente invencion tambien pueden utilizarse en un metodo para la inhibition de la actividad de syk de una muestra sangulnea, que comprende poner en contacto dicha muestra con un compuesto de la presente invencion.
La presente invencion proporciona adicionalmente compuestos en forma purificada, as! como intermediarios qulmicos.
Estos y otros aspectos, objetivos, caracterlsticas y ventajas de la invencion seran obvios tras la referencia a la siguiente description detallada y las figuras. Para tal fin, se exponen en el presente documento diversas referencias que describen con mas detalle determinada information anterior, procedimientos, compuestos y/o composiciones.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra como Syk sirve como un mediador clave de la serialization mediada por el receptor Fc en la biologla celular y en multiples enfermedades.
La Figura 2 muestra como la manipulation genetica dirigida de Syk indica que Syk sirve como un mediador clave en la biologla de plaquetas arteriales y una diana selectiva para el tratamiento de la trombosis arterial.
La Figura 3 muestra una slntesis general de los compuestos de la presente invencion.
La Figura 5 proporciona la Tabla 2, que ilustra los compuestos de la presente invencion y las CI50 de Syk.
La Figura 8 muestra una serie de compuestos que se identificaron como que inhiben de forma selectiva a Syk en ensayos de quinasa purificada. Figura 8A) Compuestos de la serie especlfica para Syk (P459-72 y P505-15) y de la serie de multiquinasas (ejemplo 100b) se exploraron a 300 nM frente al panel de quinasas purificadas de Millipore (270 quinasas analizadas con ATP 10 pM) para determinar la potencia y la selectividad por Syk. Los datos se representan como un mapa de calor, definido en la parte inferior. Figura 8B) Subconjunto de quinasas purificadas que tuvieron una inhibicion > 80 % para cualquiera de los tres compuestos. P459-72 solamente inhibio a Syk y MLK1. P505-15 a 50 nM (~10x mayor que su CI50 para Syk) solo inhibio a Syk. El ejemplo 100b inhibio a multiples quinasas, incluyendo a Syk, jAK2 y JAK3. La CI50 de la inhibicion de Syk se notifica para cada compuesto a la derecha del mapa de calor. La inhibicion de quinasa porcentual se proporciona en cada panel dentro del mapa de calor.
La Figura 9 muestra la inhibicion selectiva de Syk en llneas celulares de linfoma no Hodgkin. Los linfocitos B se estimularon con anticuerpo anti BCR en presencia de las concentraciones indicadas de los inhibidores especlficos de Syk, P459-72 y P505-15 (Figura 9A y Figura 9B) o el inhibidor dual de Syk/JAK, el ejemplo 100b (Figura 9C). Despues, se realizaron analisis por transferencia de Western de lisados de celula completa para evaluar la actividad de la Syk quinasa (pBLNK Y84 y BLNK total; los dos geles de la parte superior) y la actividad de la Src quinasa (pSyk Y352 y Syk total; los dos geles de la parte inferior). Los experimentos se realizaron 2-3 veces cada uno, los graficos de barras representan la media ± D.T. de pBLNK Y84. Las CI50 calculadas para la inhibicion de la Syk quinasa se presentan encima de los graficos.
La Figura 10 proporciona una comparacion de la inhibicion especlfica de Syk y dual de Syk/JAK en llneas celulares de lNh. Se estimularon linfocitos B con anti BCR (Figura 10A) o IL-4 (Figura 10B) durante 15 min en
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presencia de diversas concentraciones de cada inhibidor, segun se indica. Despues, se evaluo en las celulas la inhibicion de las rutas de senalizacion por fosfo-citometrla de flujo. Figura 10A) Los graficos de barras (media ± D.T., n=3) representan la actividad de Src (IFM de pSyk Y352) y la actividad de Syk (IFM de pERK Y204) despues de la estimulacion del BCR en diversas condiciones de tratamiento. Figura 10B) Los graficos de barras representan IFM de pSTAT-6 Y641 (media ± D.T., n=3) despues de la estimulacion con IL-4 en presencia de diversas concentraciones de cada inhibidor, segun se indica.
La Figura 11 muestra como los inhibidores especlficos de Syk alteran la proliferation y supervivencia, e inducen la apoptosis, en llneas celulares de LNH. Las llneas celulares de LNH “de tipo BCR” dependientes de Syk y "de tipo no BCR” independiente de Syk se describieron anteriormente (Polo, Juszczynski et al. Proc Natl Acad Sci USA 104(9): 3207-12 (2007). Figura 11A) Las celulas se trataron durante 72 h con el inhibidor P505-15 especlfico de Syk a 1 y 3 pM. La apoptosis se determino mediante analisis de FACS de la caspasa 3 activa; los datos se representan como histogramas. Figura 11B) Se analizo la sensibilidad especlfica de Syk (P459-72 y P505-15) en llneas celulares adicionales frente a la inhibicion dual de Syk/JAK (ejemplo 100b). Los graficos de barras representan la media ± D.T. (n=3) del porcentaje de celulas positivas para caspasa 3 siguiendo cada condition.
Descripcion detallada de la invencion
Como se usa en el presente documento, los terminos a continuation tienen los siguientes significados, a menos que se especifique otra cosa:
1. Abreviaturas y definiciones
Las abreviaturas usadas en el presente documento son convencionales, a menos que se indique otra cosa. Se usan las siguientes abreviaturas: AcOH = acido acetico, AIBN = azobisisobutironitrilo (tambien azobisisobutilonitrilo), ac. = acuoso, Boc = t-butilcarboxi, Bz - bencilo, BOP = hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)-fosfonio, BPO = peroxido de benzollo, nBuOH = n-butanol, CBr4 = tetrabromometano, mCPBA = acido m-cloroperoxibenzoico, CH2O2 o DCM = diclorometano, Cs2CO3 = carbonato de cesio, CuCl2 = cloruro de cobre; DIBAL = hidruro de diisobutilaluminio, DIEA = base de Hunig o diisopropil etilamina, DME = dimetil eter, DMF = dimetil formamida, DMSO = dimetilsulfoxido, DPPA = difenil fosforil azida, Et3N = trietilamina, EtOAc = acetato de etilo, g = gramo, HATU = hexafluorofosfato de 2-(1H 7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uronio, H2 = hidrogeno; H2O = agua; HBr = bromuro de hidrogeno; HCl = cloruro de hidrogeno, VIH = virus de la inmunodeficiencia humana, HPLC = cromatografla llquida de alta presion, h = hora, IgE = inmunoglobulina E, IC50 = La concentration de un inhibidor que se requiere para una inhibicion al 50 % de una enzima in vitro, IPA = alcohol isopropllico, kg = kilogramo, KCN = cianuro potasico, KOH = hidroxido potasico, K2PO4 = fosfato potasico, LDA = diisopropilamina de litio, LiAlH4 = hidruro de litio y aluminio = LiOH: hidroxido de litio; MeCN = acetonitrilo; MS = Espec. de masas, m/z = relation masa-carga, MHz = Megahertzio, MeOH = metanol, pM = micromolar, pl = microlitro, mg = miligramo, mm = millmetro, mM = milimolar, mmol = milimol, ml = mililitro, mOD/min = unidades de densidad milioptica por minuto, min = minuto, M = molar, Na2CO3 = carbonato sodico, ng = nanogramo, NaHCO3 = bicarbonato sodico; NaNO2 = nitrito sodico; NaOH = hidroxido sodico; Na2S2O3 = bisulfato sodico; Na2SO4 = sulfato sodico; NBS = N-bromosuccinamida; NH4Cl = cloruro de amonio; NH4OAc = acetato amonico; NaSMe = metiltiolato sodico, NBS = N-bromosuccinamida, n-BuLi = n-butil litio, nm = nanometro, nM = nanomolar, N = Normal, NMP = N-metilpirrolidina, RMN = resonancia magnetica nuclear, Pd/C = paladio sobre carbono, Pd(PPh3)4 = 7etraquis-(trifenilfosfina)-paladio, pM = picomolar, Pin = pinacolato, PEG = polietilenglicol, PPh3 o Ph3P = trifenil fosfina, RLV = virus de la leucemia Rauscher, Ra-Ni = Nlquel Raney, SOCl2 = cloruro de tionilo, TA = temperatura ambiente, TEA = trietilamina, THF = tetrahidrofurano, TFA = acido trifluoroacetico, TLC = cromatografla de capa fina, TMS = trimetilsililo, Tf = trifluorometilsulfonilo y TSC = citrato trisodico.
Se aprecia aqul que, como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, la formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa.
"Alquilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere, a menos que se indique otra cosa, a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, completamente saturado alifatico que tiene el numero de atomos de carbono designado. Por ejemplo, "alquilo C1-8" se refiere a un radical hidrocarburo lineal o ramificado, que contiene de 1 a 8 atomos de carbono que se obtiene por la elimination de un atomo de hidrogeno de un unico atomo de carbono de un alcano precursor. La expresion "alquilo sin sustituir" se refiere a grupos alquilo que no contienen grupos distintos de los radicales hidrocarburo alifaticos completamente saturados. Por lo tanto, la frase incluye grupos alquilo de cadena lineal tales como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo y similares. La expresion tambien incluye isomeros de cadena ramificada de grupos alquilo de cadena lineal tales como isopropilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, y similares. Los grupos alquilo representativos incluyen grupos alquilo de cadena lineal y ramificada que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 atomos de carbono. Los grupos alquilo representativos adicionales incluyen grupos alquilo de cadena lineal y ramificada que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 atomos de carbono.
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"Alquenilo" por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a una cadena lineal o ramificada, que puede ser mono o poliinsaturada, que tiene el numero de atomos de carbono designado. Por ejemplo, "alquenilo C2-C8" se refiere a un radical alquenilo que tiene de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 atomos que se obtiene mediante la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un unico atomo de carbono de un alcano precursor. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion vinilo, 2-propenilo, es decir-CH=C(H)(CH3), -CH=C(CHa)2, -C(CH3)=C(H)2, -C(CH3)=C(H)(CHa), - C(CH2CH3)=CH2, butadienilo, por ejemplo, 2-(butadienilo), pentadienilo, por ejemplo 2,4-pentadienilo y 3-(1,4- pentadienilo), y hexadienilo, entre otros, y homologos superiores y estereoisomeros de los mismos. Un grupo alquenilo "sustituido" incluye grupos alquenilo en los que un atomo no carbono o no hidrogeno esta unido a un carbono doble unido a otro carbono y aquellos en los que uno de los atomos no carbono o no hidrogeno esta unido a un carbono no implicado en un doble enlace a otro carbono. Cada sitio de insaturacion puede ser de configuracion cis o trans sobre el doble o dobles enlaces.
El termino "alquinilo", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, que puede estar mono o poliinsaturado, que tiene el numero de atomos de carbono designado. Por ejemplo, "alquinilo C2-C8" se refiere a un radical alquinilo que tiene de 2 a 8 atomos de carbono que se obtiene por la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un unico atomo de carbono de un alcano precursor. "Alquinilo sin sustituir" se refiere a grupos de cadena lineal y ramificada tales como los descritos con respecto a los grupos alquilo sin sustituir como se ha definido anteriormente, excepto que existe al menos un triple enlace entre dos atomos de carbono. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, etinilo, por ejemplo, -C°C(H), 1 -propinilo, por ejemplo, - C°C(CH3), -C°C(CH2CH3), -C(H2)C°C(H), -C(H)2C°C(CH3), y -C(H)2C°C(CH2CH3) entre otros, y homologos superiores e isomeros de los mismos. Un grupo alquinilo "sustituido" incluye grupos alquinilo en los que un atomo no carbono o no hidrogeno esta unido a un triple carbono unido a otro carbono y aquellos en los que un atomo no carbono o no hidrogeno esta unido a un carbono no implicado en un triple enlace a otro carbono.
"Alquileno", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un radical divalente obtenido a partir de un alcano, como se ilustra por -CH2CH2CH2CH2-. Tlpicamente, un grupo alquileno tendra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 atomos de carbono, que se obtiene por la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un unico atomo de carbono de un alquilo precursor.
"Cicloalquilo" o "carbociclo", por si mismos o junto con otros terminos, representan, a menos que se indique otra cosa, versiones clclicas de "alquilo", "alquenilo" y "alquinilo" en las que todos los atomos en el anillo son carbono. "Cicloalquilo" o "carbociclo" se refiere a un grupo mono o policlclico. Cuando se usa junto con sustituyentes cicloalquilo, el termino "policlclico" se refiere en el presente documento a estructuras clclicas alquilo condensadas o no condensadas. "Cicloalquilo" o "carbociclo" puede formar un anillo puenteado o un anillo espiro. El grupo cicloalquilo puede tener uno o mas dobles o triples enlaces. El termino "cicloalquenilo" se refiere a un grupo cicloalquilo que tiene al menos un sitio de insaturacion alquenilo entre los vertices anulares. El termino "cicloalquinilo" se refiere a un grupo cicloalquilo que tiene al menos un sitio de insaturacion alquinilo entre los vertices anulares. Cuando "cicloalquilo" se usa junto con "alquilo", como en cicloalquil C3-8-alquileno C3-8-, la porcion cicloalquilo tiene que tener el numero indicado de atomos de carbono (por ejemplo, de tres a ocho atomos de carbono), mientras que la porcion alquileno tiene de uno a ocho atomos de carbono. Los sustituyentes cicloalquilo tlpicos tienen de 3 a 8 atomos en el anillo. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen ciclopentilo, ciclohexilo, 1- ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo, y similares.
"Arilo" por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un grupo hidrocarburo poliinsaturado, aromatico, que contiene de 6 a 14 atomos de carbono, que puede ser un unico anillo o multiples anillos (hasta tres anillos) que estan condensados entre si o unidos covalentemente. Por lo tanto, la frase incluye, pero sin limitacion, grupos tales como fenilo, bifenilo, antracenilo, naftilo a modo de ejemplo. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo sin sustituir incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo y 4-bifenilo. "Grupo arilo sustituido" incluye, por ejemplo, -CH2OH (un atomo de carbono y un heteroatomo que reemplaza un atomo de carbono) y -CH2SH. El termino "heteroalquileno", por si mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un radical divalente obtenido a partir de heteroalquilo, como se ilustra por -CH2-CH2-S-CH2CH2- - y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para los grupos heteroalquileno, los heteroatomos tambien pueden ocupar cualquiera o ambos de los extremos de la cadena (por ejemplo, alquilenooxi, alquilenodioxi, alquilenoamino, alquilenodiamino, y similares). Aun adicionalmente, para los grupos de union de alquileno y heteroalquileno, no esta implicada ninguna orientacion del grupo de union.
Las expresiones "heterociclo", "heterociclilo" o "heteroclclico" se refiere a un grupo clclico saturado o insaturado no aromatico que contiene al menos un heteroatomo. Como se usa en el presente documento, el termino "heteroatomo" pretende incluir oxlgeno (O), nitrogeno (N), azufre (S) y silicio (Si). Cada heterociclo puede estar unido en cualquier carbono o heteroatomo del anillo disponible. Cada heterociclo puede tener uno o mas anillos. Cuando estan presentes multiples anillos, pueden condensarse entre si o unirse covalentemente. Cada heterociclo contiene tlpicamente 1, 2, 3, 4 o 5, heteroatomos independientemente seleccionados. Preferiblemente, estos grupos contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 atomos de carbono, 0, 1, 2, 3, 4 o 5 atomos de nitrogeno, 0, 1 o 2 atomos de azufre y 0, 1 o 2 atomos de oxlgeno. Mas preferiblemente, estos grupos contienen 1, 2 o 3 atomos de nitrogeno, 0-1 atomos de azufre y 0-1 atomos de oxlgeno. Los ejemplos no limitantes de grupos heterociclo incluyen morfolin-3- ona, piperazin-2-ona, piperazin-1-oxido, piridin-2-ona, piperidina, morfolina, piperazina, isoxazolina, pirazolina, imidazolina, pirazol-5-ona, pirrolidin-2,5-diona, imidazolidin-2,4-diona, pirrolidina, tetrahidroquinolinilo,
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decahidroquinolinilo, tetrahidrobenzooxazepinil dihidrodibenzooxepin y similares.
"Heteroarilo" se refiere a un radical aromatico clclico o policlclico que contiene de uno a cinco heteroatomos seleccionados entre N, O y S, en el que los atomos de nitrogeno y azufre estan opcionalmente oxidados, y el atomo o atomos de nitrogeno estan opcionalmente cuaternizados. Un grupo heteroarilo puede estar unido al resto de la molecula a traves de un heteroatomo o a traves de un atomo de carbono, y puede contener de 5 a 10 atomos de carbono. Los ejemplos no limitantes de grupos heteroarilo incluyen 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 1-pirazolilo, 3- pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5- isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2- pirimidilo y 4-pirimidilo. Si no se indica especlficamente, los sustituyentes para cada uno de los sistemas anulares arilo y heteroarilo indicados anteriormente se seleccionan entre el grupo de sustituyentes aceptables descritos en el presente documento. "Heteroarilo sustituido" se refiere a un grupo heteroarilo sin sustituir como se ha definido anteriormente, en el que uno o mas de los miembros en el anillo estan unidos a un atomo no hidrogeno, tal como se ha descrito anteriormente con respecto a los grupos alquilo sustituidos y los grupos arilo sustituidos. Los sustituyentes representativos incluyen grupos alquilo de cadena lineal y ramificada -CH3, -C2H5, -CH2OH, -OH, - OCH3, -OC2H5, -OCF3, -OC(=O)CH3,-OC(=O)NH2, -OC(=O)N(CH3)2, -CN, -NO2, -C(=O)CHa, -CO2H, -CO2CH3, - CONH2,-NH2,-N(CH3)2, -NHSO2CH3, -NHCOCH3, NHC(=O)OCH3, -NHSO2CH3, -SO2CH3,-SO2NH2 y halo.
"Heteroarilo biclclico" se refiere a un radical aromatico biclclico que contiene de uno a cinco heteroatomos seleccionados entre N, O y S, en el que los atomos de nitrogeno y azufre estan oxidados opcionalmente, y el atomo o atomos de nitrogeno estan opcionalmente cuaternizados. Un grupo heteroarilo biclclico puede unirse al resto de la molecula a traves de un heteroatomo o a traves de un atomo de carbono, y puede contener de 5 a 10 atomos de carbono. Los ejemplos no limitantes de grupos heteroarilo biclclicos incluyen 5-benzotiazolilo, purinilo, 2- bencimidazolilo, benzopirazolilo, 5-indolilo, azaindol, 1 -isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3- quinolilo y 6-quinolilo. Si no se indica especlficamente, los sustituyentes para cada uno de los sistemas anulares arilo y heteroarilo indicados anteriormente se seleccionan entre el grupo de sustituyentes aceptables descritos en el presente documento.
En cada una de las realizaciones anteriores, la designacion de un numero de atomos, por ejemplo "C1-8" pretende incluir todas las realizaciones posibles que tienen un atomo menos. Los ejemplos no limitantes incluyen C1-7, C2-8, C2-7, C3-8, C3-7 y similares.
Cada de los terminos en el presente documento (por ejemplo, "alquilo", "heteroalquilo", "arilo" y "heteroarilo") pretende incluir tanto formas "sin sustituir" como opcionalmente "sustituidas" del radical indicado, a menos que se indique otra cosa. Tlpicamente, cada radical esta sustituido con 0, 1, 2, 3, 4 o 5 sustituyentes, a menos que se indique otra cosa. A continuacion se proporcionan ejemplos de sustituyentes para cada tipo de radical.
"Sustituido" se refiere a un grupo como se define en el presente documento, en el que uno o mas enlaces a uno o mas carbono o uno o mas hidrogeno se reemplazan por un enlace a "sustituyentes" de atomos no hidrogeno y no carbono, tal como, pero sin limitacion, un atomo de halogeno, tal como F, Cl, Br e I; un atomo de oxlgeno en grupos tales como grupos hidroxilo, grupos alcoxi, grupos ariloxi y grupos aciloxi; un atomo de azufre en grupos tales como grupos tiol, grupos sulfuro de alquilo y arilo, grupos sulfona, grupos sulfonilo, y grupos sulfoxido; un atomo de nitrogeno en grupos tales como amino, alquilaminas, dialquilaminas, arilaminas, alquilarilaminas, diarilaminas, alcoxiamino, hidroxiamino, acilamino, sulfonilamino, N-oxidos, imidas y enaminas; y otros heteroatomos en diversos grupos diferentes. Los "sustituyentes" tambien incluyen grupos en los que uno o mas enlaces a un atomo de uno o mas carbono o hidrogeno se reemplazan por un enlace de orden superior (por ejemplo, un enlace doble o triple) a un heteroatomo, tal como oxlgeno en grupos oxo, acilo, amido, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, carboxilo y ester; nitrogeno en grupos tales como iminas, oximas, hidrazonas y nitrilos. Los "sustituyentes" incluyen adicionalmente grupos en los que uno o mas enlaces a uno o mas atomos de carbono o hidrogeno se reemplazan por un enlace a un grupo cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo. Los "sustituyentes" representativos incluyen, entre otros, grupos en los que uno o mas enlaces a un atomo de carbono o hidrogeno se reemplazan por uno o mas enlaces a un grupo fluor, cloro o bromo. Otro "sustituyente" representativo es el grupo trifluorometilo y otros grupos que contienen el grupo trifluorometilo. Otros "sustituyentes" representativos incluyen aquellos en los que uno o mas enlaces a un atomo de carbono o hidrogeno se reemplazan por un enlace a un atomo de oxlgeno de tal forma que el grupo alquilo sustituido contiene un grupo hidroxilo, alcoxi o ariloxi. Otros "sustituyentes" representativos incluyen grupos alquilo que tienen una amina, o un grupo alquilamina sustituida o sin sustituir, dialquilamina, arilamina, (alquil)(aril)amina, diarilamina, heterociclilamina, diheterociclilamina, (alquil)(heterociclil)amina, o (aril)(heterociclil)amina. Aun otros "sustituyentes" representativos incluyen aquellos en los que uno o mas enlaces a uno o mas atomos de carbono o hidrogeno se reemplazan por un enlace a un grupo alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo.
Los grupos definidos en el presente documento pueden incluir prefijos y/o sufijos que se usan comunmente en la tecnica para crear grupos de sustituyentes ya reconocidos adicionales. Como ejemplos, "alquilamino" se refiere a un grupo de la formula -NRaRb. A menos que se indique otra cosa, para los siguientes grupos que contienen Ra, Rb, Rc, Rd y Re: cada uno de Ra, y Rb se selecciona independientemente entre H, alquilo, alcoxi, tioalcoxi, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, o heterociclilo o estan opcionalmente unidos junto con el atomo o atomos a los que estan unidos para
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formar un grupo ciclico. Cuando Ra y Rb estan unidos al mismo atomo de nitrogeno, pueden combinarse con el atomo de nitrogeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NRaRb pretende incluir 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo.
Cada uno de Rc, Rd, Re y Rf se selecciona independientemente entre alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo o alquilenoarilo como se define en el presente documento.
Tlpicamente, un radical particular tendra 0, 1, 2 o 3 sustituyentes, siendo preferidos en la presente invencion aquellos grupos que tienen dos o menos sustituyentes. Mas preferiblemente, un radical estara sin sustituir o monosustituido. Mas preferiblemente, un radical estara sin sustituir.
Los "sustituyentes" para los radicales alquilo y heteroalquilo (as! como aquellos grupos denominados como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo) pueden ser una diversidad de grupos seleccionados entre: -ORa, =O, =NRa, =N-ORa, -NRaRb, -SRa, halogeno, -SiRaRbRc, -OC(O)Ra, -C(O)Ra, - CO2Ra, -CONRaRb, -OC(O)NRaRb, -NRbC(O)Ra, -NRa-C(O)NRbRc, -NRa-SO2NRbRc, -NRbCO2Ra, -NH-C(NH2)=NH, - NRaC(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NRa, -S(O) Ra, -SO2Ra, -SO2NRaRb, -NRbSO2R, -CN y -NO2, en un numero que varla de cero a tres, siendo particularmente preferidos aquellos grupos que tengan cero, uno o dos sustituyentes.
En algunas realizaciones, los "sustituyentes" para los radicales alquilo y heteroalquilo se seleccionan entre: -ORa, =O, - NRaRb, -SRa, halogeno, -SiRaRbRc, -OC(O)Ra, -C(O)Ra, -CO2Ra, -CONRaRb, -OC(O)NRaRb, -NRbC(O)Ra, - NRbCO2Ra -NRa-SO2NRbRc, -S(O) Ra, -SO2Ra, -SO2NRaR, -NRcSO2R, -CN y -NO2, donde Ra y Rb son como se han definido anteriormente. En algunas realizaciones, los sustituyentes se seleccionan entre: -ORa, =O, - NRaRb, halogeno, -OC(O) Ra, -CO2Ra, -CONRaRb, -OC(O)NRaRb, -NRbC(O)Ra, -NRbCO2Ra, -NRa-SO2NRbRc, -SO2Ra, -
SO2NRaRb, -NR"SO2R, -CN y -NO2.
Los ejemplos de alquilo sustituido son: -(CH2)3NH2, -(CH2)3NH(CH3), -(CH2)3NH(CH3)2, -CH2C(=CH2)CH2NH2, - CH2C(=O)CH2NH2, -CH2S(=O)2CH3,-CH2OCH2NH2, -CO2H. Los ejemplos de sustituyentes de alquilo sustituido son: CH2OH, -OH,-OCH3, -OC2H5, -OCF3, -OC(=O)CH3, -OC(=O)NH2,-OC(=O)N(CH3)2,-CN, NO2,-C(=O)CH3, -CO2H, - CO2CH3, -CONH2, NH2,-N(CH3)2, NHSO2CH3,-NHCOCH3, -NHC(=O)OCH3, -NHSO2CH3, -SO2CH3, -SO2NH2, y halo.
De forma analoga, los "sustituyentes" para los grupos arilo y heteroarilo son variados y se seleccionan entre: - halogeno, -ORa, -OC(O) Ra, -NRaRb, -SRa, -Ra, -CN, -NO2, -CO2Ra, -CONRaRb, -C(O) Ra, -OC(O)NRaRb, -NRbC(O)
Ra, -NRbC(O)2,Ra, -NRa-C(O)NRbRc, -NH-C(NH2)=NH, -NRaC(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NRa, -S(O) Ra, -S(O)2Ra, -S(O) 2NRaRb, -N3, -CH(Ph)2, perfluoroalcoxi Ci_8, y perfluoroalquilo Ci_8, en un numero que varla de cero al numero total de valencias abiertas en el sistema anular aromatico; y donde Ra, Rb y Rc se seleccionan independientemente entre hidrogeno, alquilo C1-6 y heteroalquilo, arilo y heteroarilo sin sustituir, (aril sin sustituir)-alquilo C1.8, y (aril sin sustituir)oxi-alquilo C1.8.
Dos de los "sustituyentes" en atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente con un sustituyente de la formula -T-C(O)-(CH2)q-U-, en la que T y U son independientemente -NH-, -O-, -CH2- o un enlace sencillo, y q es 0, 1 o 2. Como alternativa, dos de los sustituyentes en los atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente con un sustituyente de la formula -A-(CH2)r-B-, en la que A y B son independientemente -CH2., -O-, -nH-, -S-, -S(O)-, -S(O)2., -S(O) 2NRa- o un enlace sencillo, y r es 1, 2 o 3. Uno de los enlaces sencillos del nuevo anillo formado de este modo puede reemplazarse opcionalmente con un doble enlace. Como alternativa, dos de los sustituyentes en los atomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden reemplazarse opcionalmente con un sustituyente de la formula -(CH2)s-X-(CH2)t- -, donde s y t son independientemente numeros enteros de 0 a 3, y X es -O-, -NRa-, -S- , -S(O)-, -S(O)2-, o -S(O) 2NRa-. El sustituyente Ra en -NRa- y -S(O)2NRa- se selecciona entre hidrogeno o alquilo C1-6 sin sustituir. De otro modo, R' es como se ha definido anteriormente.
A menos que se indique otra cosa, la nomenclatura de los sustituyentes que no se definen expllcitamente en el presente documento se obtiene nombrando la porcion terminal de la funcionalidad seguido de la funcionalidad adyacente hacia el punto de union. Por ejemplo, el sustituyente "arilalquiloxicarbonilo" se refiere al grupo (aril)- (alquil)-O-C(O)-.
El termino "acilo" se refiere al grupo -C(=O)Rc, donde Rc es alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo. Acilo incluye el grupo "acetilo" -C(=O)CH3.
"Acilamino-" se refiere al grupo -NRaC(=O)Rc, donde Rc es alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo.
"Aciloxi" se refiere a -OC(=O)-Rc, donde Rc es alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo.
"Alcoxi" se refiere a -ORd, en la que Rd es alquilo como se define en el presente documento. Los ejemplos representativos de grupos alcoxi incluyen metoxi, etoxi, f-butoxi, trifluorometoxi, y similares.
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"Alcoxicarbonilo" se refiere a -C(=O)ORd, en la que Rd es alquilo. Los grupos alcoxicarbonilo representativos incluyen, por ejemplo, los mostrados a continuacion.
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Estos grupos alcoxicarbonilo pueden estar sustituidos adicionalmente como sera evidente para los expertos en la tecnica de la qufmica organica y medicinal junto con la divulgacion en el presente documento.
"Alcoxicarbonilamino" se refiere a -NRaC(=O)ORd, en la que Rd es alquilo.
"Alcoxisulfonilamino" se refiere al grupo NRaS(=O)2-ORd, donde Rd es alquilo.
"Alquilcarbonilo" se refiere al grupo -C(=O)Rc, donde Rc es alquilo.
"Alquilcarboniloxi" se refiere a -OC(=O)-Rc, donde Rc es alquilo.
"Alquilcarbonilamino" se refiere a -NRaC(=O)Rc, en la que Rc es alquilo. Los grupos alquilcarbonilamino representativos incluyen, por ejemplo, NHC(=O)CH3, NHC(=O)CH2CH3, -NHC(=O)CH2NH(CH3),
NHC(=O)CH2N(CH3)2, o -NHC(=O)(CH2)3OH.
"Alquilsulfanilo", "alquiltio", o "tioalcoxi" se refiere al grupo S-Rd, donde Rd es alquilo.
"Alquilsulfonilo" se refiere a -S(=O)2Re, donde Re es alquilo. Los grupos alquilsulfonilo empleados en los compuestos de la presente invencion son tfpicamente los grupos alquilsulfonilo Ci-6.
"Alquilsulfonilamino" se refiere a NRaS(=O)2-Re, en la que Re es alquilo.
"Alquiniloxi" se refiere al grupo -O-alquinilo, en el que alquinilo es como se define en el presente documento. Alquiniloxi incluye, a modo de ejemplo, etiniloxi, propiniloxi, y similares.
"Amidino" se refiere al grupo -C(=NRa)NRbRc, en el que Rb y Rc independientemente se seleccionan entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heteroarilo, heterocfclico, y donde Rb y Rc estan unidos opcionalmente junto con el nitrogeno unido a los mismos para formar un grupo heterocfclico o heterocfclico sustituido. Ra se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, arilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heteroarilo, heterocfclico, heterocfclico sustituido, nitro, nitroso, hidroxi, alcoxi, ciano, -N=N-N-alquilo, -N(alquil)SO2-alquilo,-N=N=N-alquilo, acilo y -SO2-alquilo.
"Amino" se refiere a un radical monovalente -NRaRb o un radical divalente -NRa-. El termino "alquilamino" se refiere al grupo -NRaRb donde Ra es alquilo y Rb es H o alquilo. El termino "arilamino" se refiere al grupo -NRaRb donde al menos un Ra o Rb es arilo. El termino "(alquil)(aril)amino" se refiere al grupo -NRaRb donde Ra es alquilo y Rb es arilo. Ademas, para los grupos dialquilamino, las porciones alquilo pueden ser las mismas o diferentes y tambien pueden combinarse para formar un anillo de 3-7 miembros con el atomo de nitrogeno al que esta unido cada uno. Por consiguiente, un grupo representado como -NRaRb pretende incluir piperidinilo, pirrolidinilo, morfolinilo, azetidinilo y similares.
"Aminocarbonilo" o "aminoacilo" se refiere a la amida -C(=O)-NR R . El termino "alquilaminocarbonilo" se refiere en el presente documento al grupo -C(=O)-NRaRb donde Ra es alquilo y Rb es H o alquilo. El termino "arilaminocarbonilo" se refiere en el presente documento al grupo -C(=O)-NRaRb donde Ra o Rb es arilo. Los grupos aminocarbonilo representativos incluyen, por ejemplo, los mostrados a continuacion. Este grupo aminocarbonilo puede estar sustituido adicionalmente como sera evidente para los expertos en la tecnica de la qufmica organica y
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medicinal junto con la divulgacion en el presente documento.
"Aminocarbonilamino" se refiere al grupo -NRaC(O)NRaRb, en el que Ra es hidrogeno o alquilo y Ra y Rb independientemente se seleccionan entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heteroarilo, heteroclclico, y donde Ra y Rb estan unidos opcionalmente junto con el nitrogeno unido a los mismos para formar un grupo heteroclclico o heteroclclico sustituido.
"Aminosulfonilo" se refiere a -S(O)2NRaRb donde R se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroclclico, heteroclclico sustituido, y donde Ra y Rb estan unidos opcionalmente junto con el nitrogeno unido a los mismos para formar un grupo heteroclclico o heteroclclico sustituido y alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroclclico y heteroclclico sustituido son como se definen en el presente documento.
"Aminosulfoniloxi" se refiere al grupo -O-SO2NRaRb, en el que Ra y Rb independientemente se seleccionan entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heteroarilo y heteroclclico; Ra y Rb estan unidos opcionalmente junto con el nitrogeno unido a los mismos para formar un grupo heteroclclico o heteroclclico sustituido.
"Aminosulfonilamino" se refiere al grupo -NRa-SO2NRbRc, en el que Ra es hidrogeno o alquilo y Rb y Rc independientemente se seleccionan entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroclclico, y heteroclclico sustituido, y donde Rb y Rc estan unidos opcionalmente junto con el nitrogeno unido a los mismos para formar un grupo heteroclclico o heteroclclico sustituido, y en el que alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroclclico y heteroclclico sustituido son como se definen en el presente documento.
"Aminotiocarbonilo" se refiere al grupo -C(S)NRaRb, en el que Ra y Rb independientemente se seleccionan entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroclclico, y heteroclclico sustituido, y donde Ra y Rb estan unidos opcionalmente junto con el nitrogeno unido a los mismos para formar un grupo heteroclclico o heteroclclico sustituido, y en el que alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloalquenilo, cicloalquenilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroclclico, y heteroclclico sustituido son como se definen en el presente documento.
"Aminotiocarbonilamino" se refiere al grupo --NRaC(S)NRaRb, en el que Ra es hidrogeno o alquilo y Rb y Rc estan unidos opcionalmente junto con el nitrogeno unido a los mismos para formar un grupo heteroclclico o heteroclclico sustituido.
"Arilcarbonilo" se refiere al grupo -C(=O)Rc, donde Rc es arilo.
"Arilcarbonilamino" se refiere a -NRaC(=O)Rc, en la que Rc es arilo.
"Arilcarboniloxi" se refiere a -OC(=O)-Rc, donde Rc es arilo.
"Ariloxi" se refiere a -ORd, donde Rd es arilo. Los ejemplos representativos de grupos ariloxi incluyen fenoxi, naftoxi, y similares.
"Ariloxicarbonilo" se refiere a -C(=O)ORd, en la que Rd es arilo.
"Ariloxicarbonilamino" se refiere a -NRaC(=O)ORd, en la que Rd es arilo.
"Arilsulfanilo", "ariltio" o "tioariloxi" se refiere al grupo S-Rd, donde Rd es arilo.
"Arilsulfonilo" se refiere a -S(=O)2Re, donde Re es arilo.
"Arilsulfonilamino" se refiere a NRaS(=O)2-Re en la que Re es arilo.
"Ariltio" se refiere al grupo -S-arilo, en el que arilo es como se define en el presente documento. En otras realizaciones, el azufre puede oxidarse para dar los restos -S(O)- o -SO2-. El sulfoxido puede existir como uno o mas estereoisomeros.
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"Enlace" cuando se usa un elemento en un grupo Markush, significa que el grupo correspondiente no existe, y los grupos de ambos lados estan unidos directamente.
"Carbonilo" se refiere al grupo divalente -C(=O)-.
"Carboxi" o "carboxilo" se refiere al grupo -CO2H.
"Carboxil ester" o "carboxi ester" se refiere a los grupos -C(=O)ORc.
"(Carboxil ester)amino" se refiere a los grupos -NRa-C(O)ORc, donde Ra es alquilo o hidrogeno.
"(Carboxil ester)oxi" o "Carbonato ester" se refiere a los grupos -O-C(=O)ORc.
"Ciano" se refiere a -CN.
"Cicloalcoxi" se refiere a -ORd donde Rd es cicloalquilo.
"Cicloalcoxicarbonilo" se refiere a -C(=O)ORd, en la que Rd es cicloalquilo.
"Cicloalcoxicarbonilamino" se refiere a NRaC(=O)ORd, en la que Rd es cicloalquilo.
"Cicloalquilalquileno" se refiere a un radical -RxRy en el que Rx es un grupo alquileno y Ry es un grupo cicloalquilo como se define en el presente documento, por ejemplo, ciclopropilmetilo, ciclohexenilpropilo, 3-ciclohexil-2- metilpropilo, y similares.
"Cicloalquilcarbonilo" se refiere al grupo -C(=O)Rc donde Rc es cicloalquilo.
"Cicloalquilcarbonilamino" se refiere a NRaC(=O)Rc en la que Rc es cicloalquilo.
"Cicloalquilcarboniloxi" se refiere a -OC(=O)-Rc donde Rc es cicloalquilo.
"Cicloalquilsulfonilamino" se refiere a NRaS(=O)2-Re en la que Re es cicloalquilo.
"Cicloalquiltio" se refiere a -S-cicloalquilo. En otras realizaciones, el azufre puede oxidarse para dar los restos -S(O)- o -SO2-. El sulfoxido puede existir en forma de uno o mas estereoisomeros.
"Cicloalquenilox" se refiere a -O-cicloalquenilo.
"Cicloalqueniltio" se refiere a -S-cicloalquenilo. En otras realizaciones, el azufre puede oxidarse para dar los restos sulfinilo o sulfonilo. El sulfoxido puede existir en forma de uno o mas estereoisomeros.
"Ester" se refiere a -C(=O)ORd, en la que Rd es alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, o heterociclilo.
"Guanidino" se refiere al grupo -NHC(=NH)NH2.
"Halo" o "halogeno", por si mismos o como parte de otro sustituyente, se refieren, a menos que se indique otra cosa, a un atomo de fluor, cloro, bromo o yodo. Ademas, los terminos tales como "haloalquilo", pretenden incluir alquilo en el que uno o mas hidrogeno estan sustituidos con atomos de halogeno que pueden ser iguales o diferentes, en un numero que varla de uno hasta el numero maximo de halogenos permitido, por ejemplo, para alquilo, (2m'+1), donde m' es el numero total de atomos de carbono en el grupo alquilo. Por ejemplo, el termino "haloalquilo C1-8" pretende incluir trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo, y similares. El termino "perhaloalquilo" se refiere, a menos que se indique otra cosa, a alquilo sustituido con (2m'+1) atomos de halogeno, donde m' es el numero total de atomos de carbono en el grupo alquilo. Por ejemplo, el termino "perhaloalquilo CW, pretende incluir trifluorometilo, pentacloroetilo, 1,1,1-trifluoro-2-bromo-2-cloroetilo, y similares. Ademas, el termino "haloalcoxi" se refiere a un radical alcoxi sustituido con uno o mas atomos de halogeno.
"Heteroalquilo" se refiere a un radical alquilo como se define en el presente documento, con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre ciano, -ORw, -NRxRy, y -S(O)nRz (donde n es un numero entero de 0 a 2 ), con el entendimiento de que el punto de union del radical heteroalquilo es a traves de un atomo de carbono del radical heteroalquilo. Rw es hidrogeno, alquilo, cicloalquilo, cicloalquil-alquilo, arilo, araalquilo, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, carboxamido, o mono- o di-alquilcarbamollo. Rx es hidrogeno, alquilo, cicloalquilo, cicloalquil-alquilo, arilo o araalquilo. Ry es hidrogeno, alquilo, cicloalquilo, cicloalquil-alquilo, arilo, araalquilo, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, carboxamido, mono- o di-alquilcarbamollo o alquilsulfonilo. Rz es hidrogeno (siempre que n sea 0), alquilo, cicloalquilo, cicloalquil-alquilo, arilo, araalquilo, amino, mono-alquilamino, di-
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alquilamino, o hidroxialquilo. Los ejemplos representatives incluyen, por ejemplo, 2-hidroxietilo, 2,3-dihidroxipropilo, 2-metoxietilo, benciloximetilo, 2-cianoetilo y 2-metilsulfonil-etilo. Para cada uno de los anteriores, Rw, Rx ,Ry, y Rz pueden estar sustituidos adicionalmente por amino, fluor, alquilamino, di-alquilamino, OH o alcoxi. Ademas, el prefijo que indica el numero de atomos de carbono (por ejemplo, C1-C10) se refiere al numero total de atomos de carbono en la porcion del grupo heteroalquilo exclusiva de las porciones ciano, -ORw, -NRxRy, o -S(O)nRz.
"Heteroarilcarbonilo" se refiere al grupo -C(=O)Rc, donde Rc es heteroarilo.
"Heteroarilcarbonilamino" se refiere a -NRaC(=O)Rc en la que Rc es heteroarilo.
"Heteroarilcarboniloxi" se refiere a -OC(=O)-Rc donde Rc es heteroarilo.
"Heteroariloxi" se refiere a -ORd, donde Rd es heteroarilo.
"Heteroariloxicarbonilo" se refiere a -C(=O)ORd, en la que Rd es heteroarilo.
"Heteroariloxicarbonilamino" se refiere a NRaC(=O)ORd, en la que Rd es heteroarilo.
"Heteroarilsulfonillamino" se refiere a NRaS(=O)2-Re, en la que Re es heteroarilo.
"Heteroariltio" se refiere al grupo --S-heteroarilo. En otras realizaciones, el azufre puede oxidarse para dar los restos -S(O)- o -SO2-. El sulfoxido puede existir en forma de uno o mas estereoisomeros.
"Heterociclilalquilo" o "Cicloheteroalquil-alquilo" significa un radical -RxRy donde Rx es un grupo alquileno y RY es un grupo heterociclilo como se define en el presente documento, por ejemplo, tetrahidropiran-2-ilmetilo, 4-(4-sustituido- fenil)piperazin-1-ilmetilo, 3-piperidiniletilo, y similares.
"Heterocicloxicarbonilamino" se refiere a NRaC(=O)ORd, en la que Rd es heterociclilo.
"Heterociclilcarbonilo" se refiere a -C(=O)Rc, donde Rc es heterociclilo.
"Heterociclilcarbonilamino" se refiere a NRaC(=O)Rc en la que Rc es heterociclilo.
"Heterociclilcarboniloxi" se refiere a -OC(=O)-Rc, donde Rc s heterociclilo.
"Heterocicliloxi" se refiere a -ORd, donde Rd es heterociclilo.
"Heterocicliloxicarbonilo" se refiere a -C(=O)ORd, en la que Rd es heterociclilo.
"Heterociclilsulfonilo" se refiere a -S(=O)2Re donde Re es heterociclilo.
"Heterociclilsulfonillamino" se refiere a NRaS(=O)2-Re, en la que Re es heterociclilo.
"Heterocicliltio" se refiere al grupo -S-heterociclilo. En otras realizaciones, el azufre puede oxidarse para dar los restos -S(O)- o -SO2-. El sulfoxido puede existir en forma de uno o mas estereoisomeros.
"Hidroxi" o "hidroxilo" se refiere al grupo -OH.
"Hidroxiamino" se refiere al grupo NHOH.
"Nitro" se refiere a -NO2.
"Nitroso" se refiere al grupo --NO.
Las expresiones "opcional" u "opcionalmente" como se usan a lo largo de toda la memoria descriptiva significan que el evento o circunstancia descrita posteriormente puede no ocurrir necesariamente, y que la descripcion incluye casos en los que el evento o circunstancia se produce y casos en los que no. Por ejemplo, "grupo heterociclo opcionalmente mono o di-sustituido con un grupo alquilo significa que el alquilo puede no estar presente necesariamente, y la descripcion incluye situaciones en las que el grupo heterociclo esta mono o disustituido con un grupo alquilo y situaciones en las que el grupo heterociclo no esta sustituido con el grupo alquilo.
"Opcionalmente sustituido" significa un anillo que esta opcionalmente sustituido independientemente con sustituyentes. Un sitio de un grupo que esta sin sustituir puede sustituirse con hidrogeno.
"Oxo" se refiere al grupo divalente =O.
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"Sulfinilo" se refiere al grupo -S(=O)-Rc donde Re es como se define en el presente documento.
"Acido sulfonico" se refiere al grupo -S(O)2-OH.
"Sulfonilo" se refiere al grupo -S(O)2-Re donde Re es como se define en el presente documento.
"Sulfonilamino" se refiere a NRaS(=O)2-Re donde Ra se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heteroarilo y heterociclilo y Re es como se define en el presente documento.
"Sulfoniloxi" se refiere al grupo -OSO2-Rc.
Los compuestos que tienen la misma formula molecular pero que difieren en la naturaleza o secuencia de union de sus atomos o en la disposicion de sus atomos en el espacio se denominan "isomeros". Los isomeros que difieren en la disposicion de sus atomos en el espacio se denominan "estereoisomeros". Los terminos “estereoisomero” y “estereoisomeros” se refieren a compuestos que existen en diferentes formas estereoisomericas si tienen uno o mas centros asimetricos o un doble enlace con sustitucion asimetrica y, por lo tanto, pueden producirse como estereoisomeros individuales o como mezclas. Los estereoisomeros incluyen enantiomeros y diastereomeros. Los estereoisomeros que no son imagenes especulares entre si se denominan “diastereomeros” y aquellos que son imagenes especulares no superponibles entre si se denominan “enantiomeros”. Cuando un compuesto tiene un centro asimetrico, por ejemplo, si esta unido a cuatro grupos diferentes, es posible un par de enantiomeros. Un enantiomero puede caracterizarse por la configuracion absoluta de su centro asimetrico, y se describe de acuerdo con las reglas de secuenciacion de R y S de Cahn y Prelog, o mediante la manera en que la molecula hace rotar el plano de la luz polarizada y se designa como dextrogiro o levogiro (es decir, como isomeros (+) o (-), respectivamente). Un compuesto quiral puede existir ya sea como un enantiomero individual o como una mezcla del mismo. Una mezcla que contiene iguales proporciones de los enantiomeros se denomina "mezcla racemica". A menos que se indique otra cosa, la descripcion tiene por objeto incluir tanto los estereoisomeros individuales, as! como las mezclas. Los metodos para la determinacion de la estereoqulmica y la separacion de los estereoisomeros se conocen bien en la tecnica (vease el analisis en el Capltulo 4 de ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 4a edicion, J. March, John Wiley and Sons, Nueva York, 1992) y difieren en la quiralidad de uno o mas estereocentros.
"Tioacilo" se refiere a los grupos Ra-C(S)-.
"Tiol" se refiere al grupo --SH.
"Tautomero" se refiere a formas alternativas de una molecula que difieren en la posicion de un proton, tales como los tautomeros enol-ceto e imina-enamina, o las formas tautomericas de grupos heteroarilo que contienen una disposicion de atomos anulares -N=C(H)-NH-, tales como pirazoles, imidazoles, bencimidazoles, triazoles y tetrazoles. Un experto en la tecnica reconocera que son posibles otras disposiciones de atomos anulares tautomericos.
Se entendera que en todos los grupos sustituidos que se han definido anteriormente, los pollmeros a los que se llega definiendo sustituyentes con otros sustituyentes a si mismos (por ejemplo, arilo sustituido que tiene un grupo arilo sustituido que a su vez esta sustituido con un grupo arilo sustituido, etc.) no pretenden incluirse en el presente documento. En tales casos, el numero maximo de tales sustituciones es de tres. Por ejemplo, las sustituciones en serie de grupos arilo sustituidos estan limitadas a -arilo sustituido-(arilo sustituido)-arilo sustituido.
"Grupo protector" se refiere a un grupo de atomos que, cuando estan unidos a un grupo funcional reactivo en una molecula, enmascaran, reducen o impiden la reactividad del grupo funcional. Tlpicamente, un grupo protector puede eliminarse selectivamente segun se desee durante el transcurso de una slntesis. Pueden encontrarse ejemplos de grupos protectores en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 3a Ed., 1999, John Wiley & Sons, NY y Harrison y col., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vol. 1-8, 1971-1996, John Wiley & Sons, NY. Los grupos protectores amino representativos incluyen, pero sin limitacion, formilo, acetilo, trifluoroacetilo, bencilo, benciloxicarbonilo ("CBZ"), terc-butoxicarbonilo ("Boc"), trimetilsililo ("TMS "), 2-trimetilsilil-etanosulfonilo ("TES "), tritilo y grupos tritilo sustituidos, aliloxicarbonilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo ("FMOC"), nitro-veratriloxicarbonilo ("NVOC") y similares. Los grupos protectores hidroxi representativos incluyen, pero sin limitacion, aquellos en los que el grupo hidroxi esta acilado o alquilado, tal como eteres bencllicos y tritllicos, as! como eteres alqullicos, tetrahidropiranil eteres, trialquilsilil eteres (por ejemplo, grupos TMS o TIPPS) y eteres alllicos.
La expresion "sales farmaceuticamente aceptables" pretende incluir sales de los compuestos activos que se preparan con acidos o bases relativamente no toxicos, dependiendo de los sustituyentes particulares encontrados en los compuestos descritos en el presente documento. Cuando los compuestos de la presente invencion contienen funcionalidades relativamente acidas, las sales de adicion de bases se pueden obtener poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente de la base deseada, pura o en un disolvente inerte
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apropiado. Los ejemplos de sales derivadas de bases inorganicas farmaceuticamente aceptables incluyen aluminio, amonio, calcio, cobre, ferrico, ferroso, litio, magnesio, manganico, manganoso, potasio, sodio, cinc y similares. Las sales derivadas de bases organicas farmaceuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, incluyendo aminas sustituidas, aminas clclicas, las aminas de origen natural, y similares, tales como arginina, betalna, cafelna, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procalna, purines, teobromo, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares. Cuando compuestos de la presente invention contienen funcionalidades relativamente basicas, pueden obtenerse sales de adicion de acidos poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente del acido deseado, ya sea puro o en un solvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adicion de acidos farmaceuticamente aceptables incluyen aquellas obtenidas a partir de acidos inorganicos como acido clorhldrico, bromhldrico, nltrico, carbonico, monohidrlgenocarbonico, fosforico, monohidrogenofosforico, dihidrogenofosforico, sulfurico, monohidrogenosulfurico, yodhldrico, o fosforoso y similares, as! como las sales obtenidas a partir de acidos organicos relativamente no toxicos como acetico, propionico, isobutlrico, malonico, benzoico, succlnico, suberico, fumarico, mandelico, ftalico, bencenosulfonico, p-tolilsulfonico, cltrico, tartarico, metanosulfonico, y similares. Tambien se incluyen sales de aminoacidos tales como arginato y similares, y sales de acidos organicos como acido glucuronico o galactunorico y similares (vease, por ejemplo, Berge, S.M. y col., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 66: 1-19, 1977). Ciertos compuestos especlficos de la presente invencion contienen funcionalidades tanto basicas como acidas que permiten que los compuestos se conviertan en sales de adicion de bases o acidos.
Las formas neutras de los compuestos se pueden regenerar poniendo en contacto la sal con una base o acido y aislando el precursor de la manera convencional. La forma precursora del compuesto difiere de las distintas formas de sal en ciertas propiedades flsicas, tales como solubilidad en disolventes polares, pero de otro modo, las sales son equivalentes a la forma precursora del compuesto para los fines de la presente invencion.
Ademas de las formas de sal, la presente invencion proporciona compuestos que estan en una forma ester del profarmaco. “Profarmacos” de los compuestos descritos en el presente documento son los compuestos que experimentan facilmente cambios qulmicos en condiciones fisiologicas para proporcionar los compuestos de la presente invencion. De forma adicional, los profarmacos se pueden convertir en los compuestos de la presente invencion mediante metodos qulmicos y bioqulmicos en un entorno ex vivo. Por ejemplo, los profarmacos pueden convertirse de forma lenta en los compuestos de la presente invencion cuando se colocan en un deposito de parche transdermico con una enzima o reactivo qulmico adecuado. Los profarmacos con frecuencia, pero no necesariamente, estan farmacologicamente inactivos hasta convertirse en farmacos activos. Normalmente, los profarmacos se obtienen enmascarando un grupo funcional en el farmaco que se cree que es en parte necesario para la actividad, con un progrupo (definido a continuation), para formar un prorresiduo que experimenta una transformation, tal como una escision, en las condiciones especlficas de uso para liberar al grupo funcional y, por lo tanto, al farmaco activo. La escision de prorresiduo puede desarrollarse de forma espontanea, tal como por medio de una reaction de hidrolisis, o se puede catalizar o inducir mediante otro agente, tal como mediante una enzima, mediante luz, mediante acido o base, o mediante un cambio de, o la exposition a, un parametro flsico o del entorno, tal como un cambio de temperatura. El agente puede ser endogeno para las condiciones de uso, tal como una enzima presente en las celulas a las que se administra el profarmaco o las condiciones acidas del estomago, o puede proporcionarse de forma exogena.
“Progrupo” se refiere a un tipo de grupo protector que, cuando se utiliza para enmascarar un grupo funcional dentro de un farmaco activo para formar un prorresiduo, convierte al farmaco en un profarmaco. Normalmente, los profarmacos estan unidos al grupo funcional del farmaco a traves de enlaces que pueden escindirse en condiciones de uso especificadas. Por lo tanto, un progrupo es la portion de un prorresiduo que se escinde para liberar al grupo funcional en las condiciones especificadas de uso. Como ejemplo especlfico, un prorresiduo amida de la formula -NH-C(O)CH3 comprende el progrupo -C(O)CH3.
Son bien conocidos en la tecnica una amplia diversidad de progrupos, as! como los prorresiduos resultantes, adecuados para enmascarar grupos funcionales en los compuestos inhibidores selectivos de syk y/o JAK activos para producir profarmacos. Por ejemplo, un grupo hidroxilo funcional se puede enmascarar como un residuo sulfonato, ester (tal como acetato o maleato) o carbonato, que pueden hidrolizarse in vivo para proporcionar el grupo hidroxilo. Un grupo funcional amino se puede enmascarar como un prorresiduo amida, carbamato, imina, urea, fosfofenilo, fosforilo o sulfenilo, que pueden hidrolizarse in vivo para proporcionar el grupo amino. Un grupo carboxilo puede enmascararse como un prorresiduo ester (que incluye metilo, etilo, pivaloiloximetilo, esteres de sililo y tioesteres), amida o hidracida, que pueden hidrolizarse in vivo para proporcionar el grupo carboxilo. La invencion incluye los esteres y grupos acilo conocidos en la tecnica para modificar la solubilidad o las caracterlsticas de hidrolisis para su uso como formulaciones de liberation sostenida o de profarmaco. Seran obvios para los expertos en la materia otros ejemplos especlficos de progrupos adecuados y sus respectivos prorresiduos.
Determinados compuestos de la presente invencion pueden existir en formas no solvatadas as! como en formas solvatadas, incluyendo formas hidratadas. “Solvato” se refiere a un complejo formado por la combination de
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moleculas de disolvente con moleculas o iones del soluto. Un disolvente puede ser un compuesto organico, un compuesto inorganico o una mezcla de ambos. Algunos ejemplos de disolventes incluyen, pero sin limitation, metanol, N,N-dimetilformamida, tetrahidrofurano, dimetilsulfoxido y agua. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y se pretende que esten abarcadas dentro del ambito de la presente invention. Determinados compuestos de la presente invention pueden existir en multiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas flsicas son equivalentes para los usos contemplados en la presente invencion y se pretende que esten dentro del ambito de la presente invencion.
Determinados compuestos de la presente invencion poseen atomos de carbono asimetricos (centros opticos) o enlaces dobles; se pretende que todos los racematos, diastereomeros, isomeros geometricos, regioisomeros e isomeros individuales (por ejemplo, enantiomeros separados) esten abarcados dentro del ambito de la presente invencion. Estos isomeros pueden resolverse o sintetizarse de forma asimetrica utilizando metodos convencionales para dar los isomeros “opticamente puros”, es decir, sustancialmente libres de sus otros isomeros. Si, por ejemplo, se desea un enantiomero particular de un compuesto de la presente invencion, este se puede preparar mediante slntesis asimetrica o mediante derivation con un auxiliar quiral, donde la mezcla diastereomerica resultante se separa y el grupo auxiliar se escinde para proporcionar los enantiomeros puros deseados. Como alternativa, cuando la molecula contiene un grupo funcional basico, tal como amino, o un grupo funcional acido, tal como carboxilo, las sales diastereomericas se forman con un acido o base opticamente activo apropiado, seguido de la resolution de los diastereomeros as! formados por cristalizacion fraccional o por medios cromatograficos bien conocidos en la tecnica, y la posterior recuperation de los enantiomeros puros.
Ademas, los compuestos de la presente invencion pueden contener proporciones no naturales de isotopos atomicos en uno o mas atomos de los atomos que constituyen tales compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden estar radiomarcados con isotopos radioactivos, tales como por ejemplo tritio (3H), yodo 125 (125I) o carbono 14 (14C). Todas las variantes isotopicas de los compuestos de la presente invencion, ya sean radioactivas o no, se pretende que esten abarcadas dentro del ambito de la presente invencion.
El termino “administrar” se refiere a la administration oral, administration como un supositorio, contacto topico, administration intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal o subcutanea, o la implantation de un dispositivo de liberation lenta por ejemplo, una bomba miniosmotica, en un sujeto. La administracion es mediante cualquier via, incluyendo la parenteral y la transmucosa (por ejemplo, bucal, sublingual, palatal, gingival, nasal, vaginal, rectal o transdermica). La administracion parenteral incluye, por ejemplo, la intravenosa, intramuscular, intrarteriola, intradermica, subcutanea, intraperitoneal, intraventricular e intracraneal. Otros modos de suministro incluyen, pero sin limitacion, el uso de formulaciones liposomales, infusion intravenosa, parches transdermicos, etc.
Un "agonista" o "activador" se refiere a un agente o molecula que se une a un receptor de la invencion, estimula, aumenta, abre, activa, facilita, potencia la activation o la actividad enzimatica, sensibiliza o regula de forma positiva la actividad de un receptor de la invencion.
Un “antagonista” o “inhibidor” se refiere a un agente o molecula que inhibe o se une a, bloquea de forma parcial o total la estimulacion o actividad, disminuye, cierra, previene, retrasa la activacion o la actividad enzimatica, inactiva, desensibiliza o regula de forma negativa la actividad de un receptor de la invencion. Como se usa en la presente invencion, “antagonista” tambien incluye un agonista reverso o inverso.
Como se usa en la presente invencion, la expresion “afeccion o trastorno sensible a la modulation de syk y/o JAK" y los terminos y frases relacionados, se refieren a una afeccion o trastorno asociado con actividad inadecuada, por ejemplo, menor de o mayor de lo normal, de syk y/o JAK y al menos parcialmente sensible a, o afectado por, la modulacion de syk y/o jAk (por ejemplo, los antagonistas o agonistas de syk y/o JAK dan como resultado algo de mejora en el bienestar del paciente en al menos algunos pacientes). La actividad funcional inadecuada de syk y/o JAK podrla aparecer como resultado de la expresion de syk y/o JAK en celulas que normalmente no expresan el receptor, mayor que la production normal de syk y/o JAK, o mas lenta que la inactivation o elimination metabolica normal de syk y/o JAK o de sus metabolitos activos, la expresion de syk y/o JAK o el grado de activacion intracelular (lo que conduce a, por ejemplo, trastornos y afecciones inflamatorios e inmuno-relacionados) aumentados o la expresion disminuida de syk y/o JAK. Una afeccion o trastorno asociado con syk y/o JAK puede incluir una "afeccion o trastorno mediado por syk y/o JAK".
Como se usa en el presente documento, las frases “una afeccion o trastorno mediado al menos en parte por la actividad syk o JAK quinasa ", y las frases y terminos relacionados, se refieren a una afeccion o trastorno caracterizado por la actividad inadecuada, por ejemplo, mayor de lo normal, de syk y/o JAK. La actividad funcional inadecuada de syk y/o JAK podrla aparecer como resultado de la expresion de syk y/o JAK en celulas que normalmente no expresan syk y/o JAK o de la expresion o grado de activacion intracelular de syk y/o JAK aumentados (lo que conduce a, por ejemplo, trastornos y afecciones inflamatorios e inmuno-relacionados). Una afeccion o trastorno mediado al menos en parte por la actividad de la syk o JAK quinasa puede estar mediado de forma completa o parcial por la actividad funcional inadecuada de syk y/o JAK. Sin embargo, una afeccion o trastorno mediado al menos en parte por la actividad de la syk o JAK quinasa es uno en que la modulacion de syk y/o JAK da como resultado algun efecto sobre la afeccion o trastorno subyacente (por ejemplo, un antagonista de
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syk y/o JAK da como resultado alguna mejora en el bienestar del paciente en al menos algunos pacientes).
El termino "inflamacion" como se utiliza en el presente documento se refiere a la infiltracion de globulos blancos (por ejemplo, leucocitos, monocitos, etc.) en la zona tratada por reestenosis.
El termino “intervencion” se refiere a una accion que produce un efecto o que se pretende que altere el curso del proceso de la enfermedad. Por ejemplo, “intervencion vascular” se refiere al uso de un procedimiento intravascular tal como una angioplastia o un estent para abrir un vaso sangulneo obstruido.
La expresion “dispositivo intravascular” se refiere a un dispositivo util para un procedimiento de recanalizacion vascular para restablecer la circulacion sangulnea a traves de un vaso sangulneo obstruido. Los ejemplos de dispositivos intravasculares incluyen, pero sin limitation, estents, cateteres con globo, injertos venosos/arteriales autologos, injertos venosos/arteriales protesicos, cateteres vasculares y desviaciones vasculares.
Como se usa en el presente documento, el termino "JAK" se refiere a una quinasa Janus (n.° de acceso de RefSeq P-43408) o una variante de la misma que tenga la capacidad de mediar la expresion genica in vitro o in vivo. Las variantes de JAK incluyen protelnas sustancialmente homologas a JAK nativa, es decir, protelnas que tienen una o mas deleciones, inserciones o sustituciones de aminoacidos de origen natural o que no son de origen natural (por ejemplo, derivados, homologos y fragmentos de JAK). La secuencia de aminoacidos de la variante de JAK preferentemente es al menos aproximadamente el 80% identica a una JAK nativa, mas preferentemente al menos aproximadamente el 90 % identica y muy preferentemente al menos aproximadamente el 95% identica.
El termino “leucocito” se refiere a cualquiera de las diversas celulas sangulneas que tienen un nucleo y un citoplasma, que se separan en una fina capa blanca cuando se centrifuga la sangre completa, y que ayudan a proteger al cuerpo de las infecciones y enfermedades. Los ejemplos de leucocitos incluyen, sin limitacion, neutrofilos, eosinofilos, basofilos, linfocitos y monocitos.
El termino “mamlfero” incluye, pero sin limitacion, seres humanos, animales domesticos (por ejemplo, perros o gatos), animales de granja (vacas, caballos o cerdos), monos, conejos, ratones y animales de laboratorio.
El termino “modular”, “modulation” y similares, se refiere a la capacidad de un compuesto para aumentar o disminuir la funcion y/o la expresion de syk y/o JAK, en donde tal funcion puede incluir actividad reguladora de la transcription y/o la union a protelnas. La modulacion puede producirse in vitro o in vivo. La modulacion, como se define en el presente documento, incluye la inhibition, antagonismo, antagonismo parcial, activation, agonismo o agonismo parcial de una funcion o caracterlstica asociada con syk y/o JAK, ya sea de forma directa o indirecta, y/o la regulation por aumento o disminucion de la expresion de syk y/o JAK, ya sea de forma directa o indirecta. En una realization preferente, la modulacion es directa. Los inhibidores o antagonistas son compuestos que, por ejemplo, se unen a, bloquean de forma parcial o total la estimulacion, disminuyen, previenen, inhiben, retrasan la activacion, inactivan, desensibilizan o regulan de forma negativa la transduction de senales. Los activadores o agonistas son compuestos que, por ejemplo, se unen a, estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, potencias la accion, activan, sensibilizan o regulan de forma positiva la transduccion de senales. La capacidad de un compuesto para inhibir la funcion de syk y/o JAK se puede demostrar en un ensayo bioqulmico, por ejemplo, un ensayo de union, o un ensayo basado en celulas, por ejemplo, un ensayo de transfection transitoria.
“Moduladores” de actividad se utiliza para referirse a “ligandos”, “antagonistas” y “agonistas” identificados utilizando ensayos in vitro e in vivo para actividad, o sus homologos y mimeticos. Los moduladores incluyen ligandos, antagonistas, agonistas, moleculas y similares, de origen natural y sinteticos. Los ensayos para identificar antagonistas y agonistas incluye, por ejemplo, aplicar a celulas supuestos compuestos moduladores, en presencia o ausencia de un receptor de la invention y, despues, determinar los efectos funcionales sobre un receptor de la actividad de la invencion. Las muestras o ensayos que comprenden un receptor de la invencion, que se tratan con un activador, inhibidor o modulador potencial, se comparan con muestras de control sin el inhibidor, activador o modulador, para examinar el grado del efecto. A las muestras de control (no tratadas con moduladores) se les asigna un valor de actividad relativa del 100 %. La inhibicion se consigue cuando el valor de actividad de un receptor de la invencion con respecto al control es de aproximadamente el 80 %, opcionalmente el 50 % o 25-1 %. La activacion se consigue cuando el valor de actividad de un receptor de la invencion con respecto al control es el 110 %, opcionalmente el 150 %, opcionalmente el 200-500 % o el 1000-3000 % mas elevado.
“Paciente” se refiere a animales humano o que no humanos, en especial mamlferos. Los ejemplos de pacientes incluyen, pero sin limitacion, seres humanos, vacas, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos y conejos.
Respecto a las composiciones de la invencion, la expresion “transportador o excipiente farmaceuticamente aceptable” significa un transportador o excipiente que es util en la preparation de una composition farmaceutica que en general es segura, no toxica y ni biologica ni de otra forma no conveniente, e incluye un transportador o excipiente que es aceptable para el uso veterinario as! como para el uso farmaceutico en el ser humano. Un “transportador o excipiente farmaceuticamente aceptable” como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, incluye uno o mas de uno de tales transportadores o excipientes.
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Las expresiones “cantidad farmaceuticamente eficaz”, “cantidad terapeuticamente eficaz” o “dosis terapeuticamente eficaz”, se refieren a la cantidad del compuesto objeto que suscitara la respuesta biologica o medica de un tejido, sistema, animal o ser humano, que busca el investigador, veterinario, doctor en medicina u otro facultativo. La expresion “cantidad terapeuticamente eficaz” incluye la cantidad de un compuesto que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar en algun grado, uno o mas de los slntomas de la afeccion o trastorno a tratar. La cantidad terapeuticamente eficaz variara dependiendo del compuesto, el trastorno o afeccion y su gravedad, y la edad, peso, etc. del mamlfero a tratar.
El termino “plaqueta” se refiere a una celula diminuta, anucleada, discoidal encontrada en el plasma sangulneo de los mamlferos, que funciona para promover la coagulacion sangulnea.
Los terminos “prevenir”, “que previene”, “prevencion” y variaciones gramaticales de los mismos como se usan en el presente documento, se refieren a un metodo para retrasar o impedir, de forma parcial o completa, el inicio o recurrencia de un trastorno o afeccion y/o uno o mas de los slntomas que la acompanan, o impedir que un sujeto adquiera o readquiera un trastorno o afeccion, o reducir el riesgo de un sujeto de adquirir o readquirir un trastorno o afeccion o uno o mas de los slntomas que lo acompanan.
El termino “recanalizacion” se refiere a un procedimiento para reestablecer el flujo para, o reunir, un canal interrumpido del cuerpo, tal como un vaso sangulneo.
El termino “reestenosis” se refiere a un reestrechamiento o bloqueo de una arteria en el mismo sitio donde se ha realizado el tratamiento, tal como una angioplastia o un procedimiento de estent.
La frase “de forma selectiva” o “de forma especlfica”, cuando se refieren a la union a un receptor, se refiere a una reaccion de union que es determinante de la presencia del receptor, a menudo en una poblacion heterogenea de receptores u otros productos biologicos. Por lo tanto, en condiciones especlficas, los compuestos se unen a un receptor particular al menos dos veces el fondo y mas normalmente mas de 10 a 100 veces el fondo. La union especlfica de un compuesto en tales condiciones necesita un compuesto que se seleccione por su especificidad por un receptor particular. Por ejemplo, pueden explorarse moleculas organicas pequenas para obtener solo los compuestos que se unen de forma especlfica o selectiva a un receptor seleccionado y no a otros receptores o protelnas. Se puede utilizar para seleccionar compuestos que sean selectivos para un receptor particular una diversidad de formatos de ensayo. Por ejemplo, para seleccionar compuestos que sean selectivos para un receptor particular se utilizan de forma rutinaria ensayos de exploration de alto rendimiento.
Como se usa en el presente documento, la expresion “anemia falciforme” se refiere a un trastorno hereditario de los globulos rojos en el que ambos alelos de la hemoglobina codifican para la protelna hemoglobina falciforme (S), es decir, el genotipo S/S. La presencia de hemoglobina anomala da como resultado la production de celulas con forma inusual, que no sobreviven el periodo de tiempo usual en la circulation sangulnea. Por lo tanto, resulta en anemia. “Anemia” se refiere a una reduction del numero de globulos rojos y/o de hemoglobina en la sangre.
La expresion “anemia de celulas falciformes” se refiere a un trastorno hereditario de los globulos rojos en el que un alelo de la hemoglobina codifica la protelna hemoglobina falciforme (S), y el otro alelo codifica otra protelna hemoglobina inusual, tal como hemoglobina (S), (C), (D), (E) y (pTha1). Los ejemplos de genotipos de anemia de celulas falciforme incluyen, pero sin limitation, los genotipos s/s, S/C, S/D, S/E y S/pTha1. Los tipos mas comunes de anemia de celulas falciformes incluyen anemia de celulas falciformes, enfermedad de la hemoglobina C, beta talasemia + y beta talasemia 0.
El “sujeto” como se define en el presente documento para incluir animales tales como mamlferos, incluye, pero sin limitacion, primates (por ejemplo, seres humanos), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones y similares. En realizaciones preferentes, el sujeto es un ser humano.
Como se usa en el presente documento, el termino "syk" se refiere a una tirosina quinasa del bazo (n.° de Acceso de RefSeq P-043405) o una variante de la misma que tenga la capacidad de mediar una respuesta celular para receptores de linfocitos T in vitro o in vivo. Las variantes de syk incluyen protelnas sustancialmente homologas a syk nativa, es decir, protelnas que tienen una o mas deleciones, inserciones o sustituciones de aminoacidos de origen natural o que no son de origen natural (por ejemplo, derivados, homologos o fragmentos de syk). La secuencia de aminoacidos de la variante de syk preferentemente es al menos aproximadamente el 80 % identica a una syk nativa, mas preferentemente al menos aproximadamente el 90 % identica y muy preferentemente al menos aproximadamente el 95 % identica.
La expresion “inhibidor de syk” se refiere a cualquier agente que inhibe la actividad catalltica de la tirosina quinasa del bazo.
El termino “trombosis” se refiere al bloqueo o coagulacion de un vaso sangulneo provocado por una acumulacion de celulas, dando como resultado la obstruction de la circulacion sangulnea. El termino “trombosis” se refiere al coagulo que se forma dentro del vaso sangulneo.
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El termino “tratar”, “que trata”, “tratamiento” y las variaciones gramaticales de los mismos como se usan en el presente documento, incluyen el retraso, alivio, mitigacion o reduccion, de forma parcial o total, de la intensidad de uno o mas slntomas acompanantes de un trastorno o afeccion y/o el alivio, mitigacion o impedimento de una o mas de las causas de un trastorno o afeccion. Los tratamientos de acuerdo con la invencion se pueden aplicar de forma preventiva, profilactica, paliativa o curativa.
El termino “vasos” se refiere a cualquier canal para transportar un fluido, tal como una arteria o vena. Por ejemplo, un “vaso sangulneo” se refiere a cualquiera de los vasos a traves de los cuales circula la sangre en el cuerpo. La luz de un vaso sangulneo se refiere al espacio abierto interno o cavidad del vaso sangulneo.
2. Realizaciones de la invencion
a. Compuestos
La presente invencion proporciona en una realization, un compuesto que tiene la formula I:
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que:
D1 es
(a) cicloalquilo C3-8, opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en: alquilo C1-8, amino, hidroxi, alquilcarbonilo C1-8, aminocarbonilo, alcoxicarbonilamino C1-8, arilalcoxicarbonilamino C1-8, fenilo y heterociclil-alquileno C1-8;
R1 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-8, amino, aminocarbonilo, hidroxilo, alcoxi C1-8, haloalquilo C1-8, alquenilo C2-8, alquinilo C2-8, oxo, ciano, alcoxicarbonilo C1-8, cicloalquilo C3-8, arilo y heterociclilo; y cada heterociclilo esta opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en: alquilo C1-8, halo, oxo, amino, alcoxi C1-8, alquilcarbonilo C1-8, arilalcoxicarbonilo C1-8,
aminocarbonilo, arilalquilenocarbonilo C1-8 y alquilsulfonilo C1-8 Y1 se selecciona entre el grupo que consiste en
(a) arilo; opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes, R4a, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8-alquilo C1-8, aminocarbonil-, hidroxilo, oxo, halogeno, hidroxi, alcoxi C1-8 y alquilsulfonilo C1-8;
(b) heteroarilo, opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes, R4a, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8-alquilo C1-8, aminocarbonil-, hidroxilo, oxo, halogeno, hidroxi, alcoxi C1-8 y alquilsulfonilo C1-8;
R2 es un heterociclilo o heteroarilo, sustituido con al menos un grupo, R3, seleccionado entre el grupo que consiste en aminoalquil C1-8-, alcoxi C1-8-alquil C1-8-, oxo-, alquilcarbonilo C1-8, cicloalquilcarbonilo C3-8,
heterociclilcarbonilo, alquilcarbonilamino C1-8, cicloalquilcarbonilamino C3-8, heterociclilcarbonilamino,
alquilsulfonilo C1-8, cicloalquilsulfonilo C3-8 y heterociclilsulfonilo;
y en la que R2 esta opcionalmente sustituido adicionalmente con 1 a 2 sustituyentes, R4c, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8, halo, aminocarbonilo, oxo, hidroxilo, aminoalquileno C1-8, alcoxi C1-8-alquileno C1-8, alquilcarbonilo C1-8, cicloalquilcarbonilo C3-8, heterociclilcarbonilo, alquilcarbonilamino C1-8, cicloalquilcarbonilamino C3-8, heterociclilcarbonilamino, alquilsulfonilo C1-8,
cicloalquilsulfonilo C3-8, heterociclilsulfonilo, cicloalquilo C3-8, alquilcicloalquileno C1-8, heteroarilo; en la que cicloalquilo se refiere a un grupo hidrocarburo mono o policlclico alquilo, alquenilo o alquinilo que puede formar un grupo puenteado o un anillo espiro, y que puede tener uno o mas dobles o triples enlaces.
En un grupo de realizaciones, Y es arilo. En otro grupo de realizaciones, Y es fenilo. En otro grupo de realizaciones, Y1 es heteroarilo. En otro grupo de realizaciones, Y1 es piridinilo.
En un grupo de realizaciones, R2 es heterociclilo. En otro grupo de realizaciones, R2 es heteroarilo.
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La presente invencion proporciona en otro grupo de realizaciones, un compuesto en el que un grupo heteroarilo del compuesto de formula I se selecciona entre el grupo que consiste en:
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cada uno de los cuales esta opcionalmente sustituido como se describe en el presente documento.
La presente invencion proporciona en otro grupo de realizaciones, un compuesto en el que un grupo heteroarilo del compuesto de formula I es un grupo heteroarilo policfclico seleccionado entre el grupo que consiste en:
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y
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opcionalmente sustituidos como se describe en el presente documento; y la llnea ondulada indica el punto de union al resto de la molecula.
La presente invencion proporciona en una realization, un compuesto que tiene la formula I:
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o un tautomero, sal o estereoisomero farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que:
D1 es cicloalquilo C3-8, opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en: alquilo C1-8, amino, hidroxi, alquilcarbonilo C1-8, aminocarbonilo, alcoxicarbonilamino C1- 8, arilalcoxicarbonilamino C1-8, fenilo y heterociclil-alquileno C1-8;
R1 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-8, amino, aminocarbonilo, hidroxilo, alcoxi C1-8,
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haloalquilo Ci-8, alquenilo C2-8, alquinilo C2-8, oxo, ciano, alcoxicarbonilo C1-8, cicloalquilo C3-8, arilo y heterociclilo; y cada heterociclilo esta opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en: alquilo C1-8, halo, oxo, amino, alcoxi C1-8, alquilcarbonilo C1-8, arilalcoxicarbonilo C1-8, aminocarbonilo, arilalquilenocarbonilo C1-8 y alquilsulfonilo C1-8 Y1 se selecciona entre el grupo que consiste en
(a) arilo; opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes, R4a, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8-alquilo C1-8, aminocarbonil-, hidroxilo, oxo, halogeno, hidroxi, alcoxi C1-8 y alquilsulfonilo C1-8;
(b) heteroarilo, opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes, R4a, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8-alquilo C1-8, aminocarbonil-, hidroxilo, oxo, halogeno, hidroxi, alcoxi C1-8 y alquilsulfonilo C1-8;
R2 es heterociclilo;
en la que R2 esta sustituido con al menos un grupo, R3, seleccionado entre el grupo que consiste en aminoalquil C1- 8-, alcoxi C1-8-alquil C1-8-, oxo-, alquilcarbonilo C1-8, cicloalquilcarbonilo C3-8, heterociclilcarbonilo, alquilcarbonilamino C1-8, cicloalquilcarbonilamino C3-8, heterociclilcarbonilamino, alquilsulfonilo C1-8, cicloalquilsulfonilo C3-8,
heterociclilsulfonilo; y en la que R2 esta opcionalmente sustituido adicionalmente con 1 a 2 sustituyentes, R4c, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8, halo, aminocarbonilo, oxo, hidroxilo, aminoalquileno C1-8, alcoxi C1-8-alquileno C1-8, alquilcarbonilo C1-8, cicloalquilcarbonilo C3-8, heterociclilcarbonilo, alquilcarbonilamino C1-8, cicloalquilcarbonilamino C3-8, heterociclilcarbonilamino, alquilsulfonilo C1-8, cicloalquilsulfonilo C3-8, heterociclilsulfonilo, cicloalquilo C3-8 y alquilcloalquileno C1-8.
La presente invencion proporciona en otra realizacion, un compuesto en el que el resto -Y -R se selecciona entre el grupo que consiste en:
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Y2 es N, CH o C;
R4a se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-8;
cada R4c se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, aminocarbonil-, hidroxilo, oxo, alcoxi C1-8 y halo;
cada R4b se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-8 y heterociclilo; el sublndice p es 0, 1,2 o 3; y
la llnea ondulada indica el punto de union al resto de la molecula.
La presente invencion proporciona en otra realizacion, un compuesto que tiene la formula Id:
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o una sal, estereoisomero o profarmaco farmaceuticamente aceptable del mismo.
La presente invencion proporciona en otra realizacion, un compuesto que tiene la formula Id1:
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o una sal, estereoisomero o profarmaco farmaceuticamente aceptable del mismo.
La presente invencion proporciona en otra realizacion, un compuesto que tiene la formula Id2:
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o una sal, estereoisomero o profarmaco farmaceuticamente aceptable del mismo.
La presente invencion proporciona un compuesto en el que: D1 es cicloalquilo C3-8, opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en: alquilo C1-8, amino, hidroxi, alquilarbonilo C1-8, aminocarbonilo, alcoxicarbonilamino C1-8, arilo alcoxicarbonilamino C1-8, fenilo y heterociclil- alquileno C1-8.
La presente invencion proporciona en otra realizacion, un compuesto en el que: D1 es ciclopropilo.
La presente invencion proporciona en otra realizacion, un compuesto en el que: D es ciclobutilo.
La presente invencion proporciona en otra realizacion, un compuesto en el que: D es ciclopentilo. La invencion tambien proporciona un compuesto de formula I en la que D1 es ciclohexilo.
La presente invencion proporciona en otra realizacion, un compuesto en el que -Y -R se selecciona entre el grupo que consiste en:
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Y2 es N o C;
cada R se selecciona entre el grupo que consiste en H y halo; cada R4c se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-8; cada R4b se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-8; y
el sublndice p es 0, 1,2 o 3; y
la llnea ondulada indica el punto de union al resto de la molecula.
La presente invencion proporciona en otra realization, un compuesto en el que el resto -Y1-R2 se selecciona entre el grupo que consiste en:
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Y2 es N o C;
cada R4a se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo Ci-s;
cada R4c se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo Ci-s, aminocarbonil-, hidroxilo, oxo, alcoxi Ci-s y halo;
cada R4b se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo Ci-s, y heterociclilo; y
el sublndice p es 0, 1,2 o 3; y la llnea ondulada indica el punto de union al resto de la molecula.
La presente invention proporciona en otra realization, un compuesto que tiene la formula:
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
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La presente invencion proporciona en otra realizacion un compuesto en el que R es
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opcionalmente sustituido con CONH2 o alquilsulfonilo C1-8; y la llnea ondulada indica el punto de union al resto de la molecula.
La presente invencion proporciona en otra realizacion un compuesto en el que R1 es alquilsulfonilo C1-8.
La presente invencion proporciona en otra realizacion un compuesto que tiene la formula:
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La presente invencion proporciona en otra realizacion un compuesto que tiene la formula:
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o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que: D es cicloalquilo C3-8.
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La presente invencion proporciona en otra realizacion un compuesto en el que D es ciclopropilo o ciclobutilo.
1
La presente invencion proporciona en otra realizacion un compuesto en el que D es ciclopropilo.
La presente invencion proporciona en otra realizacion un compuesto en el que D es ciclobutilo.
La presente invencion proporciona en otra realizacion un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en :
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La presente invencion proporciona en otra realizacion, un compuesto en el que el compuesto se encuentra en los Ejemplos. Por ejemplo, la invencion proporciona un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en:
2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclobutilamino)pirimidin-5-carboxamida;
2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)-3-clorofenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-propionilpiperazin-1-il)fenilamino)pirirnidine-5-carboxamida;
2-(4-(4-(ciclopropanocarbonil)piperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
2-(4-(4-acetil-2-oxopiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)-3-fluorofenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
2-(4-(4-acetil-2-carbamoilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
(R)-2-(4-(4-acetil-3-metilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
(R)-2-(4-(4-acetil-2-metilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
2-(6-(4-acetilpiperazin-1-il)piridin-3-ilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
4-(ciclopropilamino)-2-(4-(1-(metilsulfonil)piperidin-4-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(metilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(etilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
4-(ciclobutilamino)-2-(4-(4-(metilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
2-(4-(1-acetilpiperidin-4-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(pirrolidin-1-carbonil)piperidin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(morfolin-4-carbonil)piperidin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(ciclopropilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
2-(4-(4-acetil-1,4-diazepan-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
2-(4-(4-acetamidopiperidin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
4-(ciclopropilamino)-2-(4-dioxotiomorfolinofenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(2-metoxietil)piperazin-1-il)fenilamino)pirirnidine-5-carboxamida;
4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(N-metilacetamido)piperidin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida; y
2-(4-(4-(aminometil)piperidin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida.
La presente invencion proporciona en otra realizacion, un compuesto que tiene la estructura observada en las tablas.
La presente invencion tambien proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugfa o terapia. La presente invencion proporciona una composicion que comprende un compuesto en combinacion con un transportador o diluyente farmaceuticamente aceptable. La presente invencion tambien proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion seleccionada del grupo que consiste en enfermedad cardiovascular, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria y trastorno proliferativo celular.
La presente invencion tambien proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento de:
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una enfermedad cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en reestenosis, trombosis, purpura trombocitopenica inmunitaria, trombocitopenia inducida por heparina, cardiomiopatia dilatada, enfermedad de celulas falciformes, aterosclerosis, infarto de miocardio, inflamacion vascular, angina inestable y sindromes coronarios agudos;
una enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en alergia, asma, artritis reumatoide, enfermedades mediadas por linfocitos B tales como linfomas no Hodgkin, sindrome antifosfolipidico, lupus, psoriasis, esclerosis multiple, nefropatia terminal y enfermedad de Crohn;
una enfermedad autoinmunitaria seleccionada del grupo que consiste en anemia hemolitica, purpura trombocitopenica inmunitaria, esclerosis multiple, psoriasis y sindrome de Sjogren; o
un trastorno proliferativo celular seleccionado del grupo que consiste en leucemia, un linfoma, trastornos mieloproliferativos, canceres hematologicos y mielofibrosis idiopatica cronica.
La presente invencion tambien proporciona un kit que comprende un envasado e instrucciones para su uso.
Se comprende que en otro grupo de realizaciones, cualquiera de las realizaciones anteriores tambien puede combinarse con otras realizaciones enumeradas en el presente documento, para formar otras realizaciones de la invencion.
b. Metodos de sintesis
Los compuestos de la presente invencion pueden prepararse mediante tecnicas de sintesis organica conocidas, incluyendo los metodos descritos en mas detalle en los Ejemplos. En general, los compuestos de la estructura (I) anterior pueden hacerse mediante la siguiente figura 3, en la que todos los sustituyentes son como se han definido anteriormente a menos que se indique otra cosa.
Los compuestos que tienen la formula I pueden prepararse de acuerdo con la figura 3. El acido carboxilico 1.1 se convierte en cloruro de acido 1.2 a traves de un procedimiento de una etapa por tratamiento con un agente de cloracion, tal como cloruro de tionilo, y esterificacion con un alcohol, tal como etanol, para formar el compuesto 1.3 usando condiciones similares a las descritas a continuacion. El ester 1.3 se diclora con un agente de cloracion, tal como oxicloruro de fosforo. El desplazamiento selectivo del grupo 4-cloro de la 2,4-dicloropirimidina por una amina apropiada, tal como R1-D1-NH2 (disponible en el mercado o sintetizada usando metodos conocidos por los expertos en la tecnica), en condiciones basicas, tal como con diisopropilamina (DIA), proporciona los compuestos de formula 1.5. La hidrolisis posterior del ester, el desplazamiento del segundo grupo cloro con EDC y el tratamiento con amoniaco proporcionan el compuesto 1.7. Tambien puede prepararse el compuesto benzotriazolil eter 1.7 a traves de una ruta lineal. El desplazamiento del grupo benzotriazolil eter con una amina apropiada, tal como R2-Y1-NH2 (disponible en el mercado o sintetizada usando metodos conocidos por los expertos en la tecnica), da el producto deseado I, en el que R1 y R2 son como se han definido anteriormente.
Un experto en la tecnica reconocera que en ciertas realizaciones de la estructura (I), cuando R1-D1 o R2-Y1 comprende un heteroatomo terminal, puede ser ventajoso usar una estrategia de grupo protector. El grupo protector puede eliminarse usando metodos conocidos por los expertos en la tecnica para producir los compuestos de la estructura (1).
Los compuestos de la presente invencion pueden utilizarse generalmente en forma de la base libre. Como alternativa, los compuestos de esta invencion pueden usarse en forma de sales de adicion de acidos como se describe a continuacion.
c. Inhibicion de las syk y JAK quinasas
La actividad de un compuesto especifico como un inhibidor de una JAK quinasa se puede evaluar in vitro o in vivo. En algunas realizaciones, la actividad de un compuesto especifico se puede analizar en un ensayo celular. La selectividad tambien podria establecerse en ensayos bioquimicos con quinasas aisladas.
Para evaluar la actividad inhibidora de la JAK quinasa y para determinar el grado de selectividad del compuesto particular en comparacion con la quinasa syk, pueden utilizarse tipos similares de ensayos. Un medio para evaluar tal inhibicion es la deteccion del efecto de los compuestos de la presente invencion sobre la regulacion positiva de productos genicos aguas abajo. En el ensayo Ramos/IL4, se estimulan linfocitos B con la citocina Interleucina-4 (IL-4) lo que conduce a la activacion de la ruta JAK/Stat a traves de la fosforilacion de la familia de las JAK quinasas, JAK1 y JAK3, que a su vez fosforilan y activan el factor de transcripcion Stat-6. Uno de los genes que Stat-6 regula de forma positiva es el receptor de IgE de baja afinidad, CD23. Para estudiar el efecto de los inhibidores (por ejemplo, los compuestos 2,4-pirimidina diamina sustituidos descritos en el presente documento) sobre las JAK1 y JAK3 quinasas, se estimulan linfocitos B Ramos de ser humano con IL-4. 10' despues de la estimulacion, las celulas se someten a citometna de flujo intracelular para medir el grado de fosforilacion de STAT-6. 20 a 24 horas posestimulacion, las celulas se tinen para la regulacion positiva de CD23 y se analizan usando citometna de flujo. Una reduccion de la cantidad de STAT-6 fosforilada y/o de CD23 presente en la superficie celular en comparacion con las condiciones de control indica que el compuesto de prueba inhibe de forma activa la ruta de la JAK quinasa.
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De forma adicional, la estimulacion con IL-6 de los linfocitos B Ramos induce JAK 1, 2 y Tyk2, lo que conduce a la fosforilacion de Stat-3 y Erk. 10' posestimulacion, las celulas se someten a citometrla de flujo intracelular para medir la capacidad del compuesto para inhibir estos acontecimientos de fosforilacion. Para medir de forma especlfica la actividad de JAK2, se utilizara la llnea celular CellSensor irfl-bla HEL que expresa el gen indicador beta lactamasa, controlado por Stat5 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Estas celulas expresan un mutante de JAK2 activo de forma constitutiva (JAK2V617F), encontrado de forma natural en neoplasias mieloproliferativos (Constantinescu, S., et. al, Trends Biochem Sci., 2008; 33:122-31). La reduccion de la cantidad de la expresion del gen indicador beta- lactamasa se utiliza como una medida de la actividad inhibidora de JAK2 de los compuestos.
La actividad de los compuestos de la invencion puede caracterizarse de forma adicional evaluando el efecto de los compuestos de la presente invencion descritos en el presente documento, sobre las celulas epiteliales de pulmon A549 y las celulas U937. Las celulas epiteliales de pulmon A549 y las celulas U937 regulan de forma positiva la expresion en superficie de ICAM-1 (CD54) en respuesta a una diversidad de estlmulos distintos. Por lo tanto, utilizando la expresion de ICAM-1 como lectura, se pueden evaluar en el mismo tipo celular los efectos del compuesto de prueba sobre distintas rutas de serialization. La estimulacion con IL-1 p a traves del receptor de IL-1 p activa la ruta de TRAF6/NFkB, dando como resultado una regulation positiva de ICAM-1. IFN.gamma induce la regulation positiva de ICAM-1 a traves de la activation de la ruta de JAK1/JAK2. La regulacion positiva de ICAM-1 se puede cuantificar mediante citometrla de flujo a traves de una curva de dosis-respuesta del compuesto y se calculan los valores de la CE50.
La actividad de los compuestos de la invencion puede de forma adicional caracterizarse ensayando sobre las celulas epiteliales de pulmon A549 y las celulas U937 el efecto de los compuestos de la presente invencion descritos en el presente documento. Las celulas epiteliales de pulmon A549 y las celulas u937 regulan de forma positiva la expresion en superficie de ICAM-1 (CD54) en respuesta a una diversidad de estlmulos distintos. Por lo tanto, utilizando la expresion de ICAM-1 como lectura, se pueden evaluar los efectos del compuesto de prueba sobre distintas rutas de senalizacion en el mismo tipo celular. La estimulacion con IL-1 p a traves del receptor de IL-1 p activa la ruta de TRAF6/NFkB dando como resultado la regulacion positiva de ICAM-1. IFN.gamma induce la regulacion positiva de ICAM-1 a traves de la activacion de la ruta de JAK1/JAK2. La regulacion positiva de ICAM-1 se puede cuantificar mediante citometrla de flujo a traves de una curva de dosis-respuesta del compuesto y se calculan los valores de la CE50. En los Ejemplos se describen ensayos ejemplares de este tipo con mayor detalle.
En general, se describen en el presente documento compuestos activos que inhiben la ruta de la JAK quinasa con una CI50 en el intervalo de aproximadamente 1 mM o menos, como se mide en los ensayos descritos en el presente documento. Por supuesto, los expertos en la materia apreciaran que los compuestos que presentan menores CI50, (en el orden, por ejemplo, de 100 pM, 75 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM o incluso menor) pueden ser particularmente utiles en aplicaciones terapeuticas. En los casos en donde se desee una actividad especlfica para un tipo celular particular, se puede ensayar la actividad del compuesto con el tipo celular deseado y contraexplorar para una carencia de actividad frente a otros tipos celulares. El grado deseado de “inactividad” en tales contraexploraciones, o la proportion deseada de actividad frente a inactividad, puede variar para distintas situaciones y se puede seleccionar por el usuario.
Ademas, normalmente los compuestos activos inhiben en linfocitos B la expresion de CD23 estimulada por IL-4, con una CI50 en el intervalo de aproximadamente 20 pM o menos, normalmente en el intervalo de aproximadamente 10 pM, 1 pM, 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM o incluso menos. Un ensayo adecuado que puede utilizarse es el ensayo descrito en los Ejemplos, “Ensayo para la llnea de linfocitos B Ramos estimulada con IL-4". En determinadas realizaciones, los compuestos activos de la presente invencion pueden tener en el ensayo descrito en los Ejemplos una CI50 de menos de o igual a 5 pM, mayor de 5 pM pero menor de 20 pM, mayor de 20 pM, o mayor de 20 pM pero menor de 50 pM.
Ademas, los compuestos activos normalmente inhiben la expresion de la expresion de ICAM1 (CD54) inducida por IFN.gamma en celulas U937 o A549 con una CI50 en el intervalo de aproximadamente 20 pM o menor, normalmente en el intervalo de aproximadamente 10 pM, 1 pM, 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM o incluso mas bajo. La CI50 frente a la expresion de ICAM (CD54) en celulas estimuladas con IFN.gamma se puede determinar con un ensayo celular funcional en la llnea celular A549 o la U937 aislada. Los ensayos adecuados que pueden utilizarse son los ensayos descritos en los Ejemplos, "La llnea epitelial A549 estimulada con IFNy" y "Ensayo de FACS de ICAM1 por IFN.gamma en U937", respectivamente. En determinadas realizaciones, en los ensayos descritos en los Ejemplos los compuestos activos de la presente invencion tienen una CI50 de menos de o igual a 20 pM, mas grande de 20 pM o mas grande de 20 pM pero menor de 50 pM.
d. Composiciones y metodos de administration
La presente invencion proporciona adicionalmente composiciones que comprenden uno o mas compuestos de formula (I) o una sal, ester o profarmaco farmaceuticamente aceptable del mismo, y un transportador o diluyente farmaceuticamente aceptable. Se apreciara que los compuestos de formula (I) en la presente invencion, se pueden derivatizar en grupos funcionales para proporcionar derivados de profarmaco que sean capaces de convertirse de nuevo a los compuestos parentales in vivo. Los ejemplos de tales profarmacos incluyen los derivados ester
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fisiologicamente aceptables y metabolicamente inestables, tales como metoximetil esteres, metiltiometil esteres o pivaloiloximetil esteres obtenidos de un grupo hidroxilo del compuesto o un residuo carbamoilo obtenido de un grupo amino del compuesto. De forma adicional, cualquiera de los equivalentes fisiologicamente aceptable de los compuestos de formula (I) similares a esteres o carbamatos metabolicamente inestables, que tienen la capacidad de producir los compuestos parentales de formula (I) in vivo, estan dentro del ambito de la presente invencion.
Como se utiliza en el presente documento, la expresion “sales farmaceuticamente aceptables” se refiere a cualquier sal de adicion de acido o base cuyos contraiones no son toxicos para el paciente en las dosis farmaceuticas de las sales. Los hospedadores de sales farmaceuticamente aceptables son bien conocidos en el campo farmaceutico. Si se utilizan en estas composiciones las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la presente invencion, las sales preferentemente se obtienen de acidos y bases inorganicos u organicos. Entre tales sales acidas estan incluidas las siguientes: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, sulfonato de benceno, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canfor sulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, lucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromohidrato, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, undecanoato, hidroacidos (por ejemplo, clorhidratos y bromohidratos), sulfatos, fosfatos, nitratos, sulfamatos, malonatos, salicilatos, metilen-bis-b-hidroxinaftoatos, gentisatos, isetionatos, di-p-toluoiltartratos, etanosulfonatos, ciclohexilsulfamatos, quinatos y similares. Las sales de adicion de bases farmaceuticamente aceptables incluyen, sin limitation, las obtenidas de alcali o de bases metalicas alcalinoterreas o bases organicas convencionales, tales como trietilamina, piridina, piperidina, morfolina, N-metilmorfolina, sales de amonio, sales metalicas de alcalinas, tales como sales de sodio y potasio, sales metalicas alcalinoterreas, tales como sales de calcio y magnesio, sales con bases organicas, tales como sales de diciclohexilamina, N-metil-D-glucamina y sales con aminoacidos tales como arginina, lisina, etcetera.
Ademas, los grupos que contienen nitrogeno basicos pueden cuaternizarse con agentes del tipo haluros de alquilo inferiores, tales como cloruros de metilo, etilo, propilo y butilo, bromuros y yoduros; dialquilsulfatos, tales como dimetil, dietil, dibutil y diamilsulfatos, haluros de cadena larga, tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo; haluros de aralquilo, tales como bromuros de bencilo y fenetilo, y otros. Los productos solubles en agua o aceite o dispersables se obtienen de este modo.
Los compuestos utilizados en las composiciones y metodos de la presente invencion tambien se pueden modificar adicionando funcionalidades apropiadas para potenciar propiedades biologicas selectivas. Tales modificaciones son conocidas en la tecnica e incluyen las que aumentan la penetration biologica en un dado sistema biologico (por ejemplo, sangre, sistema linfatico, sistema nervioso central, etc.), aumentan la disponibilidad oral, aumentan la solubilidad para permitir la administration mediante inyeccion, alteran el metabolismo y alteran la tasa de excretion.
Las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden fabricar por metodos bien conocidos en la tecnica tales como granulation, mezclado, disolucion, encapsulado, liofilizacion o procesos de emulsification convencionales, entre otros. Las composiciones pueden producirse en diversas formas, incluyendo granulos, precipitados o partlculas, polvos, incluyendo polvos liofilizados, secados por rotation o por pulverization, polvos amorfos, comprimidos, capsulas, jarabes, supositorios, inyecciones, emulsiones, elixires, suspensiones o soluciones. Las formulaciones pueden de forma opcional contener estabilizadores, modificadores del pH, tensioactivos, modificadores de la biodisponibilidad y combinaciones de estos.
La expresion "forma farmaceutica unitaria" se refiere a unidades flsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mamlferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de farmaco, calculada para producir el inicio, tolerabilidad y/o los efectos terapeuticos deseados, en asociacion con un excipiente farmaceutico adecuado (por ejemplo, una ampolla). Ademas, se pueden preparar composiciones mas concentradas, a partir de las cuales despues se pueden producir composiciones farmaceuticas unitarias mas diluidas. Las composiciones mas concentradas contendran as! sustancialmente mas de, por ejemplo, al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas veces la cantidad de uno o mas inhibidores de syk y/o JAK.
Los metodos para preparar tales formas farmaceuticas son conocidos para los expertos en la materia (vease, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)). Ademas, se pueden preparar las sales farmaceuticamente aceptables de los inhibidores de syk y/o JAK de la presente invencion (por ejemplo, sales de adicion de acido) e incluirlas en las composiciones utilizando procedimientos convencionales conocidos para los expertos en la materia de la qulmica organica sintetica y que se describen, por ejemplo, en J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 4a Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992).
Las composiciones normalmente incluyen un transportador o excipiente farmaceutico convencional y pueden incluir adicionalmente otros agentes curativos, transportadores, adyuvantes, diluyentes, potenciadores de la penetracion tisular, solubilizantes y similares. Preferentemente, la composition contendra aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 90 %, preferentemente aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 75 %, mas preferentemente aproximadamente el 0,1 % al 50 %, todavla mas preferentemente aproximadamente el 0,1 % al
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10 % en peso de uno o mas inhibidores de syk y/o JAK, con lo restante consistiendo en transportadores y/o excipientes farmaceuticos adecuados. Los excipientes apropiados pueden adaptarse para la composicion particular y la via de administracion por metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, citado anteriormente.
Los vehlculos farmaceuticamente aceptables que pueden utilizarse en estas composiciones incluyen intercambiadores ionicos, alumina, estearato de aluminio, lecitina, protelnas de suero, tales como seroalbumina humana, sustancias tamponadoras, tales como fosfatos, glicina, acido sorbico, sorbato de potasio, mezclas de glicerido parciales de acidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato de hidrogeno de disodico, fosfato de hidrogeno potasico, cloruro de sodio, sales de cinc, sllice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, pollmeros de bloque polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.
Los ejemplos de excipientes adecuados incluyen, pero sin limitation, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arabiga, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, solution salina, jarabe, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y acidos poliacrllicos tales como carbopoles. Las composiciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes de humectacion; agentes emulsionantes; agentes de suspension; agentes conservantes tales como metil-, etil- y propil-hidroxi-benzoatos; agentes para ajustar el pH tales como acidos y bases inorganicos y organicos; agentes edulcorantes y agentes saborizantes.
La administracion de una composicion que comprende uno o mas inhibidores de syk y/o JAK con uno o mas excipientes farmaceuticos adecuados segun sea ventajoso, se puede llevar a cabo a traves de cualquiera de los modos aceptados de administracion. Por lo tanto, la administracion puede ser, por ejemplo, oral, topica, intravenosa, subcutanea, transcutanea, transdermica, intramuscular, intraarticular, parenteral, intraarteriola, intradermica, intraventricular, intracraneal, intraperitoneal, intralesional, intranasal, rectal, vaginal, mediante inhalation o a traves de un deposito implantado. El termino "parenteral", como se utiliza en el presente documento, incluye inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepatica, intralesional e intracraneal o tecnicas de infusion. Preferentemente, las composiciones se administran por via oral o intravenosa. Las formulaciones de la invention se pueden designar como de action corta, de liberation rapida o de action prolongada. Aun mas, los compuestos pueden administrarse por medios locales antes que sistemicos, tales como la administracion (por ejemplo, inyeccion) como una formulation de liberacion sostenida. De acuerdo con una realization representativa, las composiciones de la presente invencion se formulan para la administracion farmaceutica a un mamlfero, preferentemente un ser humano.
Las composiciones de la presente invencion que contienen uno o mas inhibidores de syk y/o JAK se pueden administrar de forma repetida, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o mas veces, o la composicion se puede administrar mediante infusion continua. Los sitios de administracion adecuados incluyen, pero sin limitacion, en la piel, bronquial, gastrointestinal, anal, vaginal, el ojo y el oldo. Las formulaciones pueden tomar forma de polvo solido, semisolido, liofilizado, o formas farmaceuticas llquidas, tales como, por ejemplo, comprimidos, plldoras, capsulas, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retention, cremas, pomadas, lociones, geles, aerosoles o similares, preferentemente en formas farmaceuticas unitarias adecuadas para la administracion simple de dosificaciones precisas.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden estar en cualquier forma farmaceutica oralmente aceptable, incluyendo comprimidos, capsulas, obleas, emulsiones, suspensiones, soluciones, jarabes, elixires, pulverizaciones, bolos, pastillas para chupar, polvos, granulos y formulaciones de liberacion sostenida. Los excipientes adecuados para la administracion oral incluyen calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. En el caso de comprimidos para el uso oral, los transportadores que se utilizan normalmente incluyen lactosa y almidon de malz. Tambien se anaden normalmente agentes de lubrication, tales como estearato de magnesio. Para una formula en capsula, los diluyentes utiles incluyen lactosa y almidon de malz seco. Cuando se necesitan suspensiones acuosas para el uso oral, el principio activo se combina con agentes emulsionantes y de suspension. Si se desea, tambien se pueden anadir determinados agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes.
En algunas realizaciones, las composiciones toman la forma de una plldora, comprimido o capsula y, por lo tanto, la composicion puede contener, junto con uno o mas inhibidores de syk y/o JAK, un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato de dicalcio y similares; un disgregante tal como almidon o derivados del mismo; un lubricante tal como estearato de magnesio y similares; y/o un aglutinante tal como un almidon, goma arabiga, polivinilpirrolidona, gelatina, celulosa y derivados de los mismos. Un comprimido puede prepararse mediante cualquier proceso de compresion o de moldeado conocido para los expertos en la materia. Los comprimidos compactados pueden prepararse compactando en una maquina adecuada los inhibidores de syk y/o JAK en una forma fluida, por ejemplo, un polvo o granulos, mezclados de forma opcional con ingredientes accesorios, por ejemplo, agentes aglutinantes, lubricantes, diluyentes, disgregantes o de dispersion. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando en una maquina adecuada una mezcla de los inhibidores de syk y/o JAK en polvo con cualquier transportador adecuado.
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Como alternativa, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden estar en la forma de supositorios para la administracion rectal. Estos pueden prepararse mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que esta solido a temperatura ambiente pero llquido a la temperatura del recto, y por lo tanto se fundira en el recto para liberar el farmaco. Tales materiales incluyen manteca de cacao, cera de abeja, polietilenglicol (PEG), grasa dura y/o cocoglicerido hidrogenado. Las composiciones adecuadas para la administracion rectal pueden tambien comprender una unidad de enema rectal que contenga uno o mas inhibidores de syk y/o JAK y vehlculos farmaceuticamente aceptables (por ejemplo, etanol acuoso al 50 % o una solucion salina acuosa) que sean fisiologicamente compatibles con el recto y/o el colon. La unidad de enema rectal contiene una punta aplicadora protegida por una cubierta inerte, preferentemente compuesta de polietileno, lubricada con un lubricante tal como vaselina blanca y preferentemente protegida por una valvula de una via para prevenir el reflujo de la formula dispensada. Ademas, la unidad de enema rectal tiene el largo suficiente, preferentemente de 5,8 cm, para insertarla en el colon a traves del ano.
Las composiciones llquidas se pueden preparar disolviendo o dispersando uno o mas inhibidores de syk y/o JAK y, opcionalmente, uno o mas adyuvantes farmaceuticamente aceptables en un transportador tal como, por ejemplo, solucion salina acuosa, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y similares, para formar una solucion o suspension, por ejemplo, para la administracion oral, topica o intravenosa. Las formulaciones farmaceuticas se pueden preparar como suspensiones o soluciones llquidas utilizando un llquido esteril, tal como aceite, agua, alcohol y combinaciones de los mismos. Se pueden anadir para la administracion oral o parenteral tensioactivos, agentes de suspension o agentes emulsionantes farmaceuticamente adecuados. Las suspensiones pueden incluir aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de sesamo, aceite de semilla de algodon, aceite de malz y aceite de oliva. La preparacion de suspension puede contener tambien esteres de acidos grasos, tales como etiloleato, miristato de isopropilo, gliceridos de acidos grasos y gliceridos de acidos grasos acetilados. Las formulaciones de la suspension pueden incluir alcoholes, tales como etanol, alcohol isopropllico, hexadecil alcohol, glicerol y propilenglicol. Los eteres, tales como poli(etilenglicol), hidrocarburos de petroleo, tales como aceite mineral y vaselina y agua, tambien pueden utilizarse en las formulaciones de suspension.
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion tambien pueden estar en una forma topica, especialmente cuando la diana del tratamiento incluye zonas u organos facilmente accesibles mediante la aplicacion topica, incluyendo enfermedades del ojo, la piel o del tracto intestinal inferior. Las formulaciones topicas adecuadas se preparan facilmente para cada una de estas areas u organos. Para la administracion topica, la composicion que contiene uno o mas inhibidores de syk y/o JAK puede estar en la forma de emulsiones, lociones, geles, espumas, cremas, gelatinas, soluciones, suspensiones, pomadas y parches transdermicos.
La aplicacion topica para el tracto intestinal inferior se puede efectuar en una formulacion de supositorio rectal (vease mas arriba) o en una formulacion de enema adecuada. Ademas pueden utilizarse parches topicos transdermicos. Para aplicaciones topicas, las composiciones farmaceuticas se pueden formular en una pomada adecuada que contenga el principio activo suspendido o disuelto en uno o mas transportadores. Los transportadores para la administracion topica de los compuestos de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, aceite mineral, vaselina llquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Como alternativa, las composiciones farmaceuticas se pueden formular en una locion o crema adecuada que contenga los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o mas transportadores farmaceuticamente aceptables. Los transportadores adecuados incluyen aceite mineral, monoestearato de sorbitan, polisorbato 60, esteres de cetilo, ceras, alcohol cetllico, 2-octildodecanol, alcohol bencllico y agua.
Ademas, las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden administrar mediante aerosol o inhalacion nasal. Para el suministro por inhalacion, las composiciones se pueden suministrar como un polvo seco o en forma llquida a traves de un nebulizador. Tales composiciones se preparan de acuerdo con las tecnicas conocidas en la tecnica de formulacion farmaceutica y se pueden preparar como soluciones en solucion salina, empleando alcohol bencllico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorcion para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o de dispersion convencionales.
Para el uso oftalmico, las composiciones farmaceuticas se pueden formular como suspensiones micronizadas en solucion salina isotonica esteril con pH ajustado o, preferentemente, como soluciones en solucion salina esteril con pH ajustado isotonica, con o sin un conservante, tal como cloruro de benzalconio. Como alternativa, para usos oftalmicos, las composiciones farmaceuticas pueden formularse en una pomada, tal como vaselina.
Para la administracion parenteral, las composiciones pueden estar en la forma de soluciones inyectables esteriles y polvos envasados esteriles. Preferentemente, las soluciones inyectables se formulan en un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5.
Las formas inyectables esteriles de las composiciones de la presente invencion pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con las tecnicas conocidas en la tecnica, utilizando agentes de dispersion o humectantes y agentes de suspension adecuados. Ademas, la preparacion inyectable esteril puede ser una solucion o suspension inyectable esteril en un diluyente o disolvente no toxico parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solucion en 1,3-butanodiol. Entre los vehlculos y disolventes aceptables que
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pueden emplearse estan el agua, la solucion de Ringer y la solucion de cloruro de sodio isotonica. Ademas, se emplean de forma convencional como un disolvente o medio de suspension aceites no volatiles esteriles. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite no volatil suave incluyendo mono o digliceridos sinteticos. Son utiles en la preparacion de inyectables los acidos grasos, tales como acido oleico y sus derivados de glicerido, como lo son los aceites farmaceuticamente aceptables naturales, tales como el aceite de oliva o el aceite de ricino, en especial en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones en aceite pueden contener tambien un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, tal como carboximetil celulosa o agentes de dispersion similares que se utilizan comunmente en la formulacion de formas farmaceuticas farmaceuticamente aceptables, incluyendo emulsiones y suspensiones. Tambien pueden utilizarse para los fines de formulacion otros tensioactivos usados comunmente, tales como Tweens, Spans u otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se utilizan comunmente en la fabricacion de formas farmaceuticas solidas, llquidas u otras farmaceuticamente aceptables. Los compuestos pueden formularse para la administracion parenteral mediante inyeccion tal como inyeccion por bolo o infusion continua. Una forma farmaceutica unitaria para inyeccion puede estar en ampollas o en recipientes de multidosis.
Las composiciones de la presente invencion tambien pueden proporcionarse en una forma liofilizada. Tales composiciones pueden incluir un tampon, por ejemplo, bicarbonato, para la reconstitucion antes de la administracion, o el tampon puede estar incluido en la composicion liofilizada para la reconstruccion con, por ejemplo, agua. La composicion liofilizada puede adicionalmente comprender un vasoconstrictor adecuado, por ejemplo, epinefrina. La composicion liofilizada puede proporcionarse en una jeringa, de forma opcional envasada en combinacion con el tampon para la reconstitucion, de forma tal que la composicion reconstituida pueda administrarse de forma inmediata a un paciente.
Cualquiera de las formas farmaceuticas anteriores que contienen cantidades eficaces, estan dentro de los llmites de la experimentacion habitual y dentro del ambito de la invencion. Una dosis terapeuticamente eficaz puede variar dependiendo de la via de administracion y de la forma farmaceutica. El compuesto o compuestos representativos de la invencion es una formulacion que presenta un alto Indice terapeutico. El Indice terapeutico es la proporcion de dosis entre los efectos toxico y terapeutico, que puede expresarse como la proporcion entre la DL50 y la DE50. La DL50 es la dosis letal para el 50 % de la poblacion y la DE50 es la dosis terapeuticamente eficaz en el 50 % de la poblacion. La DL50 y la DE50 se determinan mediante procedimientos farmaceuticos convencionales en cultivos celulares animales o en animales experimentales.
Ademas de las formas farmaceuticas representativas descritas anteriormente, los excipientes y transportadores farmaceuticamente aceptables y las formas farmaceuticas son en general conocidas para los expertos en la materia y estan incluidos en la invencion. Deberla entenderse que una dosificacion y regimen de tratamiento especlficos para cualquier paciente particular dependeran de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto especlfico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente, y el tiempo de administracion, tasa de excrecion, combinacion de farmacos, juicio del facultativo responsable y la gravedad de la enfermedad particular a tratar. La cantidad de compuesto activo (o compuestos activos) tambien dependera del compuesto particular y otros agentes terapeuticos en la composicion, si estan presentes.
e. Metodos de uso
La invencion proporciona metodos para la inhibicion o disminucion de la actividad de syk y/o JAK, as! como se proporcionan compuestos como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento o la mejora de un estado, slntoma, afeccion, trastorno o enfermedad asociado con syk y/o JAK en un paciente que lo necesite (por ejemplo, humano o no humano). En una realizacion, el estado, slntoma, afeccion, trastorno o enfermedad asociado con syk y/o JAK esta mediado, al menos en parte, por la actividad de syk y/o JAK quinasa. En realizaciones mas especlficas, la presente invencion proporciona compuestos como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una afeccion o trastorno mediado, al menos en parte, por la actividad de syk y/o jAk quinasa, tal como una enfermedad cardiovascular, enfermedad inflamatoria o enfermedad autoinmunitaria.
En una realizacion, la invencion proporciona compuestos para su uso en la prevencion o el tratamiento de una afeccion en un mamlfero, caracterizada por trombosis no deseada, que comprende la etapa de administrar al mamlfero una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la presente invencion. Tales afecciones incluyen, pero sin limitacion, reestenosis, slndrome coronario agudo, infarto de miocardio, angina inestable, angina refractaria, trombosis coronaria oclusiva que se presenta despues de la terapia trombolltica o despues de la angioplastia coronaria, un slndrome cerebrovascular mediado de forma trombotica, ictus embolico, ictus trombotico, ataques isquemicos transitorios, trombosis venosa, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, coagulopatla, coagulacion intravascular diseminada, purpura trombocitopenica trombotica, tromboangitis obliterante, enfermedad trombotica asociada con trombocitopenia inducida por heparina, complicaciones tromboticas asociadas con la circulacion extracorporea, complicaciones tromboticas asociadas con la instrumentacion tal como el cateterismo cardiaco u otro cateterismo intravascular, globo de contrapulsacion aortica, estent coronario o valvula cardiaca, afecciones que necesiten el ajuste de dispositivos protesicos, y similares.
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En una realizacion adicional, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento de la trombosis, purpura trombocltica inmunitaria, trombocitopenia inducida por heparina, cardiomiopatla dilatada, enfermedad de celulas falciformes, aterosclerosis, infarto de miocardio, inflamacion vascular, angina inestable o slndromes coronarios agudos.
En otra realizacion, la presente invencion tambien proporciona compuestos para su uso en el tratamiento de alergia, asma, artritis reumatoide, enfermedad mediada por linfocitos B tales como linfomas no Hodgkin, slndrome antifosfolipldico, lupus, psoriasis, esclerosis multiple, nefropatla terminal o leucemia linfocltica cronica.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento de la anemia hemolltica o purpura trombocitopenica inmunitaria.
Los compuestos descritos en el presente documento son tambien inhibidores potentes y/o selectivos de las JAK quinasas. Como consecuencia de esta actividad, los compuestos pueden utilizarse en una diversidad de contextos in vitro, in vivo y ex vivo, para regular o inhibir la actividad JAK quinasa, las cascadas de serialization en las que las JAK quinasas desempenan un papel y las respuestas biologicas efectuadas por tales cascadas de senalizacion. Por ejemplo, en una realizacion, los compuestos se pueden utilizar para inhibir a la JAK quinasa, ya sea in vitro o in vivo, en practicamente cualquier tipo celular que exprese la JAK quinasa, tal como en celulas hematopoyeticas en las que, por ejemplo, JAK3 se expresa de forma predominante. Tambien pueden utilizarse para regular las cascadas de transduction de senales en las que desempenan un papel las JAK quinasas, en particular JAK3. Tales cascadas de transduction de senales dependientes de JAK incluyen, pero sin limitation, las cascadas de senalizacion de los receptores de citocinas que implican a la cadena gamma comun, tales como, por ejemplo, las cascadas de senalizacion de los receptores de IL-4, IL-7, IL-5, IL-9, IL-15 e IL-21 o IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-l5 e IL-21. Ademas, los compuestos pueden utilizarse in vitro o in vivo para regular, y en particular para inhibir, las respuestas celulares o biologicas afectadas por tales cascadas de transduccion de senales dependientes de JAK. Tales respuestas celulares o biologicas incluyen, pero sin limitacion, la regulation positiva de IL-4/ramos CD23 y la proliferation de linfocitos T mediada por IL-2. Notablemente, los compuestos pueden utilizarse para inhibir las jAk quinasas in vivo, como una estrategia terapeutica orientada el tratamiento o prevention de enfermedades mediadas, ya sea por completo o en parte, por una actividad JAK quinasa (denominada en el presente documento como "enfermedades mediadas por la JAK quinasa"). Los ejemplos no limitativos de enfermedades mediadas por la JAK quinasa que pueden tratarse o prevenirse con los compuestos incluyen, pero sin limitacion, los siguientes: alergias; asma; enfermedades autoinmunitarias tales como rechazo de trasplantes (por ejemplo, rinon, corazon, pulmon, hlgado, pancreas, piel, intestino delgado, intestino grueso, reaction del hospedador contra el injerto (RHCI) y reaction del injerto contra al hospedador (RICH), artritis reumatoide y esclerosis lateral amiotrofia; enfermedades autoinmunitarias mediadas por linfocitos T tales como esclerosis multiple, psoriasis y slndrome de Sjogren; enfermedades inflamatorias del Tipo II tales como inflamacion vascular (incluyendo vasculitis, arteritis, aterosclerosis y enfermedad arterial coronaria); enfermedades del sistema nervioso central tales como ictus; enfermedades pulmonares tales como bronquitis obliterante e hipertension pulmonar primaria; reacciones de hipersensibilidad del Tipo IV solida retardada; y canceres hematologicos tales como leucemia y linfomas.
Los ejemplos de enfermedades que estan mediadas al menos en parte por JAK quinasas, que pueden tratarse o prevenirse de acuerdo con los metodos incluyen, pero sin limitacion, alergias, asma, enfermedades autoinmunitarias tales como rechazo de trasplante (por ejemplo, rinon, corazon, pulmon, hlgado, pancreas, piel, reaccion del hospedador contra el injerto (RHCI), etc.), artritis reumatoide y esclerosis lateral amiotrofica, esclerosis multiple, psoriasis y slndrome de Sjogren, enfermedad inflamatoria del Tipo II tal como inflamacion vascular (incluyendo vasculitis, arteritis, aterosclerosis y enfermedad arterial coronaria) u otras enfermedades inflamatorias tales como osteoartritis, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal idiopatica, slndrome del intestino irritable, colon irritable, mala cicatrization (por ejemplo, esclerodermia, fibrosis aumentada, queloides, cicatrices posquirurgicas, fibrosis pulmonar, espasmos vasculares, migrana, lesion por reperfusion y posinfarto de miocardio), complejo o slndrome de las mucosas secas, enfermedades del sistema nervioso central tales como ictus, enfermedades pulmonares tales como bronquitis obliterante y primaria, e hipertension pulmonar primaria, hipersensibilidad del Tipo IV retardada o mediada por celulas y canceres solidos y hematologicos tales como leucemias y linfomas.
Tambien se describe un metodo para la inhibition de una JAK quinasa, que comprende poner en contacto la JAK quinasa con una cantidad de un compuesto eficaz para inhibir una actividad de la jAk quinasa, en donde el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion. El metodo puede llevarse a cabo in vivo.
Tambien se describe un metodo para la inhibicion de una actividad de una JAK quinasa, que comprende poner en contacto in vitro una JAK3 quinasa con una cantidad de un compuesto eficaz para inhibir una actividad de la JAK quinasa, en donde el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion.
En una realizacion especlfica, los compuestos pueden utilizarse para tratar y/o prevenir el rechazo en receptores de trasplantes de organos y/o tejidos (es decir, tratar y/o prevenir el rechazo de aloinjerto). Los aloinjertos pueden rechazarse a traves de una reaccion inmunitaria mediada por celulas o humoral del receptor frente a antlgenos del trasplante (histocompabilidad) presentes en las membranas de las celulas del donante. Los antlgenos mas fuertes
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estan dirigidos por un complejo de locus geneticos llamados antlgenos leucocitarios humanos del grupo A (HLA). Junto con los antlgenos de los grupos sangulneos ABO, son los principales antlgenos de trasplante detectables en los seres humanos.
El rechazo despues del trasplante en general puede dividirse en tres categorlas: hiperagudo que se produce horas a dlas despues del trasplante; agudo, que se produce dlas a meses despues del trasplante y cronico, que se produce meses a anos despues del trasplante.
El rechazo hiperagudo esta provocado principalmente por la produccion de anticuerpos del hospedador que atacan al tejido del injerto. En una reaccion de rechazo hiperagudo, se observan anticuerpos en la vasculatura del trasplante muy pronto despues del trasplante. Poco despues, se produce la coagulacion vascular, conduciendo a isquemia, eventual necrosis y muerte. El infarto de injerto no es sensible a terapias inmunosupresoras conocidas. Debido a que los antlgenos del HLA se pueden identificar in vitro, la exploracion pretrasplante se utiliza para reducir de forma significativa el rechazo hiperagudo. Como consecuencia de esta exploracion, el rechazo hiperagudo es relativamente poco comun hoy en dla.
Se piensa que el rechazo agudo esta mediado por la acumulacion de celulas antigenicas especlficas en el tejido del injerto. La reaccion inmunitaria mediada por linfocitos T frente a estos antlgenos (es decir, RHCI o RICH) es el mecanismo principal del rechazo agudo. La acumulacion de estas celulas conduce al dano del tejido del injerto. Se cree que estan implicados en el proceso tanto los linfocitos T auxiliares CD4+ como los linfocitos T citotoxicos CD8+ y que las celulas dendrlticas del donante y el hospedador presentan el antlgeno. Los linfocitos T auxiliares CD4+ ayudan a incorporar otras celulas efectoras, tales como macrofagos y eosinofilos, al injerto. Tambien esta implicado el acceso a cascadas de transduccion de senales de activacion de linfocitos T (por ejemplo, cascadas de CD28, CD40L y CD2).
El rechazo agudo mediado por celulas puede revertirse en muchos casos intensificando la inmunoterapia. Despues de la reversion satisfactoria, los elementos gravemente danados del injerto se curan mediante fibrosis y el resto del injerto aparece normal. Despues de la resolucion del rechazo agudo, las dosificaciones de los farmacos inmunosupresores se pueden reducir a niveles muy bajos.
El rechazo cronico, que es un problema particular en trasplantes de rinon, a menudo progresa de forma insidiosa a pesar de la terapia inmunosupresora aumentada. Se piensa que es debido, en gran parte, a la hipersensibilidad de Tipo IV mediada por celulas. El perfil patologico difiere del rechazo agudo. Esta principalmente implicado el endotelio arterial, con extensa proliferacion que puede ocluir de forma graduar la luz del vaso, conduciendo a isquemia, fibrosis, una Intima engrosada y cambios ateroscleroticos. El rechazo cronico principalmente se debe a la obliteration progresiva de la vasculatura del injerto y se asemeja a un proceso vasculltico lento.
En la hipersensibilidad de tipo IV, los linfocitos T citotoxicos CD8 y los linfocitos T auxiliares CD4 reconocen el antlgeno sintetizado intracelular o extracelular cuando esta formando complejo con, respectivamente, moleculas del MHC de Clase I o Clase II. Los macrofagos funcionan como celulas presentadoras de antlgeno y liberan IL-1, lo que promueve la proliferacion de los linfocitos T auxiliares. Los linfocitos T auxiliares liberan interferon gamma e IL-2, que juntos regulan las reacciones de hiperactividad retrasada mediada por la activacion de macrofagos y la inmunidad mediada por linfocitos T. En el caso del trasplante de organos, los linfocitos T citotoxicos destruyen las celulas del injerto en contacto.
Dado que la JAK quinasas desempenan un papel crltico en la activacion de linfocitos T, los compuestos descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar y/o prevenir muchos aspectos del rechazo de trasplantes, y son particularmente utiles en el tratamiento y/o la prevention de las reacciones de rechazo que estan mediadas, al menos en parte, por linfocitos T, tales como RHCI o RICH. Los compuestos tambien pueden utilizarse para tratar y/o prevenir el rechazo cronico en receptores de trasplante y, en particular, en receptores de trasplante de rinon. El compuesto tambien puede administrarse a un tejido o un organo antes del trasplante del tejido u organo en el receptor del trasplante.
En otra realization, la presente invention proporciona compuestos para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos T, que comprende administrar a un paciente que padece tal enfermedad autoinmunitaria una cantidad de un compuesto eficaz para tratar la enfermedad autoinmunitaria en la que el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion. En determinadas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria es esclerosis multiple (EM), psoriasis o slndrome de Sjogran. Tal enfermedad autoinmunitaria incluye, pero sin limitation, las enfermedades autoinmunitarias que se designan con frecuencia como trastornos autoinmunitarios de un unico organo o de unico tipo celular y las enfermedades autoinmunitarias que con frecuencia se designan como que implican trastorno autoinmunitario sistemico. Los ejemplos no limitativos de enfermedades designadas con frecuencia como trastornos autoinmunitarios de un unico organo unico o de un unico tipo celular incluyen; tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolltica autoinmunitaria, gastritis atrofica autoinmunitaria de anemia perniciosa, encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, enfermedad de Goodpasture, trombocitopenia autoinmunitaria, oftalmia simpatica, miastenia grave, enfermedad de Grave, cirrosis biliar primaria, hepatitis agresiva cronica, colitis ulcerosa y glomerulopatla membranosa. Los ejemplos no limitativos de enfermedades designadas
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con frecuencia como que implican trastorno autoinmunitario sistemico incluyen: lupus eritematoso sistemico, artritis reumatoide, slndrome Sjogren, slndrome de Reiter, polimiositis-dermatomiositis, esclerosis sistemica, poliarteritis nodular, esclerosis multiple y penfigo vesicular. Las enfermedades autoinmunitarias adicionales, que pueden ser basadas en linfocitos beta (humorales) o basadas en linfocitos T, incluyen slndrome de Cogan, espondilitis anquilosante, granumolatosis de Wegener, alopecia autoinmunitaria, diabetes de Tipo I o de inicio juvenil, y tiroiditis.
Los tipos de enfermedades autoinmunitarias que pueden tratarse o prevenirse con tales profarmacos en general incluyen los trastornos que implican lesion tisular que se produce como resultado de una respuesta humoral y/o mediada por celulas contra inmunogenos o antlgenos de origen endogeno y/o exogeno. Tales enfermedades con frecuencia se denominan como enfermedades que implican reacciones de hipersensibilidad no anafilactica (es decir, de Tipo II, Tipo III y/o Tipo IV).
Las reacciones de hipersensibilidad de Tipo I en general son el resultado de la liberacion de principios farmacologicamente activos, tales como histamina, a partir de mastocitos y/o basofilos despues del contacto con un antlgeno exogeno especlfico. Como se menciono anteriormente, tales reacciones de Tipo I desempenan un papel en numerosas enfermedades, que incluyen asma alergica, rinitis alergica, etc.
Las reacciones de hipersensibilidad de Tipo II (tambien denominadas como reacciones de hipersensibilidad citotoxicas, citollticas dependiente del complemento o estimuladoras de celulas) resultan cuando las inmunoglobulinas reaccionan con componentes antigenicos de celulas o tejidos, o con un antlgeno o hapteno que se ha acoplado de forma Intima con celulas o tejidos. Las enfermedades que estan asociadas comunmente con las reacciones de hipersensibilidad de Tipo II incluyen, pero sin limitacion, anemia hemolltica autoinmunitaria, eritroblastosis fetal y enfermedad de Goodpasture.
Las reacciones de hipersensibilidad de Tipo III (tambien denominadas como reacciones de hipersensibilidad complejas toxicas, complejas solubles o complejas inmunitarias) son el resultado de la deposition en vasos o en tejidos de complejos antlgeno-inmunoglobulina circulantes solubles, acompanado de reacciones inflamatorias agudas en el sitio de deposito de los complejos inmunitarios. Los ejemplos no limitativos de enfermedades de reaction de Tipo III prototlpicas incluyen la reaction de Arthus, artritis reumatoide, enfermedad del suero, lupus eritematoso sistemico, determinados tipos de glomerulonefritis, esclerosis multiple y penfigo vesicular.
Las reacciones de hipersensibilidad de Tipo IV (con frecuencia llamadas reacciones de hipersensibilidad celular, mediadas por celula, retrasada o del tipo tuberculina) estan provocadas por linfocitos T sensibilizados que son el resultado del contacto con un antlgeno especlfico. Los ejemplos no limitativos de enfermedades citadas como que implican reacciones de Tipo IV son la dermatitis por contacto y el rechazo de aloinjerto.
Las enfermedades autoinmunitarias asociadas con cualquiera de las reacciones de hipersensibilidad no anafilactica pueden tratarse o prevenirse con los profarmacos de acuerdo con la formula estructural (I) y (Ia). En particular, los compuestos descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar o prevenir las enfermedades autoinmunitarias caracterizadas de forma frecuente como trastornos autoinmunitarios de un unico organo o de un unico tipo celular que incluyen, pero sin limitacion: tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolltica autoinmunitaria, gastritis atrofica autoinmunitaria de anemia perniciosa, encefalomielitis autoinmunitaria, orquitis autoinmunitaria, enfermedad de Goodpasture, trombocitopenia autoinmunitaria, oftalmia simpatica, miastenia grave, enfermedad de Graves, cirrosis biliar primaria, hepatitis agresiva cronica, colitis ulcerosa y glomerulopatla membranosa, as! como las enfermedades autoinmunitarias caracterizadas con frecuencia como que implican trastorno inmunitario sistemico, que incluyen, pero sin limitacion: lupus eritematoso sistemico (LES), artritis reumatoide, slndrome Sjogren, slndrome de Reiter, polimiositis-dermatomiositis, esclerosis sistemica, poliarteritis nodular, esclerosis multiple y penfigo vesicular.
Un experto en la materia apreciara que muchas de las enfermedades autoinmunitarias enumeradas anteriormente estan asociadas con slntomas graves, la mejora de las cuales proporciona un beneficio terapeutico significativo, incluso en los casos en donde la enfermedad autoinmunitaria subyacente podrla no mejorarse.
Un compuesto descrito en el presente documento para su uso en terapia puede aplicarse solo, o puede aplicarse en combination con o complementario a otras terapias inmunosupresoras comunes, tales como, por ejemplo, las siguientes: mercaptopurina; corticosteroides tales como prednisona; metilprednisolona y prednisolona; agentes alquilantes tales como ciclofosfamida; inhibidores de la calcineurina tales como ciclosporina, sirolimus y tacrolimus; inhibidores de la inosina monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) tales como micofenolato, micofenolato de mofetilo y azatioprina; y agentes designados para suprimir la inmunidad celular mientras dejan la respuesta inmunologica humoral del receptor intacta, incluyendo diversos anticuerpos (por ejemplo, globulina antilinfocitos (GAL), globulina antitimocitos (GAT), anticuerpos monoclonales anti linfocitos (OKT3)) e irradiation. Estos diversos agentes pueden utilizarse de acuerdo con sus dosificaciones convencionales o comunes, como se especifica en la information de prescription que acompana las formas de los farmacos disponibles de forma comercial (vease tambien: la informacion de prescripcion en la Edition de 2006 de The Physician's Desk Reference). La azatioprina esta actualmente disponible de Salix Pharmaceuticals, Inc., bajo el nombre comercial AZASAN; la mercaptopurina esta disponible actualmente de Gate Pharmaceuticals, Inc., bajo el nombre comercial PURINETHOL; la prednisona y la
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prednisolona estan disponibles actualmente de Roxane Laboratories, Inc.; la metil prednisolona esta disponible actualmente de Pfizer; sirolimus (rapamicina) esta disponible actualmente de Wyeth-Ayerst bajo el nombre comercial RAPAMUNE; tacrolimus esta disponible actualmente de Fujisawa bajo el nombre comercial PROGRAF; la ciclosporina esta disponible actualmente de Novartis bajo el nombre comercial SANDIMMUNE y de Abbott bajo el nombre comercial GENGRAF; los inhibidores de la iMPDH tales como el micofenolato de mofetilo y el acido micofenolico estan disponibles actualmente de Roche bajo el nombre comercial CELLCEPT y de Novartis bajo el nombre comercial MYFORTIC; la azatioprina esta disponible actualmente de Glaxo Smith Kline bajo el nombre comercial IMURAN y los anticuerpos estan disponibles actualmente de Ortho Biotech bajo el nombre comercial ORTHOCLONE, de Novartis, bajo el nombre comercial SIMULECT (basiliximab), y de Roche bajo el nombre comercial ZENAPAX (daclizumab).
En otra realizacion, los compuestos podrlan administrarse ya sea en combinacion o de forma complementaria con un inhibidor de una syk quinasa. La syk quinasa es una tirosina quinasa conocida por desempenar un papel crltico en la senalizacion del receptor Fcy, as! como en otras cascadas de senalizacion, tales como las que implican la senalizacion del receptor de linfocitos B (Turner et al., (2000), Immunology Today 21: 148-154) y las integrinas beta (1), beta (2) y beta (3) en neutrofilos (Mocsai et al., (2002), Immunity 16: 547-558). Por ejemplo, la syk quinasa desempena un papel esencial en la senalizacion del receptor de IgE de alta afinidad en mastocitos, que conduce a la activacion y posterior liberation de multiples mediadores qulmicos que desencadenan ataques alergicos. Sin embargo, a diferencia de las JAK quinasas, que ayudan a regular las rutas implicadas en las reacciones de hipersensibilidad de Tipo IV retrasada o mediada por celulas, la syk quinasa ayuda a regular las rutas implicadas en las reacciones de hipersensibilidad inmediata de Tipo I mediada por IgE. Determinados compuestos que afectan la ruta de syk pueden o no afectar las rutas de JAK.
Los compuestos inhibidores de syk adecuados se describen, por ejemplo, en los documentos n.° de Ser. 10/355.543 presentado el 31 de enero de 2003 (n.° de publication 2004/0029902); WO 03/063794; n.° de Ser. 10/631.029 presentado el 29 de julio de 2003; WO 2004/014382; n.° de Ser. 10/903.263 presentado el 30 de julio de 2004; PCT/LTS2004/24716 presentado el 30 de julio de 2004 (WO005/016893); n.° de Ser. 10/903.870 presentado el 30 de julio de 2004; PCT/LTS2004/24920 presentado el 30 de julio de 2004; n.° de Ser. 60/630.808 presentado el 24 de noviembre de 2004; n.° de Ser. 60/645.424 presentado el 19 de enero de 2005 y n.° de Ser. 60/654.620, presentado el 18 de febrero de 2005.
Los compuestos descritos en el presente documento e inhibidores de syk podrlan utilizarse solos o en combinacion con uno o mas tratamientos del rechazo de trasplante convencionales, como se describe anteriormente.
En una realizacion especlfica, los compuestos pueden utilizarse para tratar o prevenir estas enfermedades en pacientes que de forma inicial sean no sensibles (resistentes), o que se hayan hecho no sensibles, al tratamiento con un compuesto inhibidor de syk o uno de los otros tratamientos actuales para la enfermedad particular. Ademas, los compuestos podrlan utilizarse en combinacion con otros compuestos inhibidores de syk en pacientes que son resistentes o no sensibles a compuestos para syk. Se proporcionan mas adelante los compuestos inhibidores de syk adecuados con los que pueden administrarse los compuestos.
En otra realizacion, la presente invention proporciona compuestos para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria mediada por linfocitos T, que comprende administrar a un paciente que padece tal enfermedad autoinmunitaria una cantidad de un compuesto eficaz para tratar la enfermedad inmunitaria, en la que el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion, como se describe en el presente documento, y el compuesto se administra en combinacion con, o de forma complementaria a, un compuesto que inhibe la syk quinasa con una CI50 en el intervalo de al menos 10 pM.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevention del rechazo de trasplante de aloinjerto en un receptor del trasplante, que comprende administrar al receptor del trasplante una cantidad de un compuesto eficaz para tratar o prevenir el rechazo, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion, como se describe en el presente documento. En una realizacion adicional, el compuesto se administra a un tejido o un organo antes del trasplante del tejido u organo en el receptor del trasplante.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevencion del rechazo de trasplante de aloinjerto en un receptor de trasplante, en el que el rechazo es rechazo agudo, que
comprende administrar al receptor del trasplante una cantidad de un compuesto eficaz para tratar o prevenir el
rechazo, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevencion del rechazo de trasplante de aloinjerto en un receptor de trasplante, en el que el rechazo es rechazo cronico, que
comprende administrar al receptor del trasplante una cantidad de un compuesto eficaz para tratar o prevenir el
rechazo, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion.
En otra realizacion, la invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevencion del rechazo de trasplante de aloinjerto en un receptor de trasplante, en el que el rechazo esta mediado por RHCI o RICH, que
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comprende administrar al receptor del trasplante una cantidad de un compuesto eficaz para tratar o prevenir el rechazo, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion, como se describe en el presente documento.
En otra realizacion, la invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevencion del rechazo de trasplante de aloinjerto en un receptor de trasplante, en el que el trasplante de aloinjerto se selecciona de un rinon, un corazon, un hlgado y un pulmon, que comprende administrar al receptor del trasplante una cantidad de un compuesto eficaz para tratar o prevenir el rechazo, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion, como se describe en el presente documento.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevencion del rechazo de trasplante de aloinjerto en un receptor de trasplante, en el que el trasplante de aloinjerto se selecciona de un rinon, un corazon, un hlgado y un pulmon, que comprende administrar al receptor del trasplante una cantidad de un compuesto eficaz para tratar o prevenir el rechazo, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion, como se describe en el presente documento, en que el compuesto se administra en combinacion con, o de forma complementaria a, otro inmunosupresor.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevencion del rechazo de trasplante de aloinjerto en un receptor de trasplante, en que el trasplante de aloinjerto se selecciona de un rinon, un corazon, un hlgado y un pulmon, que comprende administrar al receptor del trasplante una cantidad de un compuesto eficaz para tratar o prevenir el rechazo, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion, como se describe en el presente documento, en que el compuesto se administra en combinacion con, o de forma complementaria a, otro inmunosupresor en que el inmunosupresor se selecciona de ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, un inhibidor de la IMPDH, micofenolato, micofenolato de mofetilo, un anticuerpo anti linfocitos T y OKT3.
Los compuestos descritos en el presente documento son moderadores de citocina de la senalizacion de IL-4. En consecuencia, los compuestos podrlan enlentecer la respuesta de las reacciones de hipersensibilidad de Tipo I. Por lo tanto, en una realizacion especlfica, los compuestos podrlan utilizarse para tratar tales reacciones y, por lo tanto, las enfermedades asociadas con, mediadas por, o provocadas por tales reacciones de hipersensibilidad (por ejemplo, alergias) de forma profilactica. Por ejemplo, una persona que padece alergia podrla tomar uno o mas de los compuestos selectivos para JAK descritos en el presente documento, antes de la exposicion prevista a alergenos, para retrasar el inicio o progreso de, o eliminar del todo, una respuesta alergenica.
Cuando se utilizan para tratar o prevenir tales enfermedades, los compuestos se pueden administrar individualmente, como mezclas de uno o mas compuestos, o en mezcla o combinacion con otros agentes utiles para tratar tales enfermedades y/o los slntomas asociados con tales enfermedades. Los compuestos tambien pueden administrarse en mezcla o en combinacion con agentes utiles para tratar otros trastornos o dolencias, tales como esteroides, estabilizadores de membrana, inhibidores de la 5-lipoxigenasa (5LO), inhibidores de la slntesis y del receptor de leucotrienos, inhibidores del cambio de isotipo de IgE o de la slntesis de IgE, cambio de isotipo de IgG o slntesis de IgG, beta-agonistas, inhibidores de la triptasa, aspirina, inhibidores de la cicloxigenasa (COX), metotrexato, farmacos anti TNF, anticuerpo anti CD20, inhibidores de PD4, inhibidores de p38, inhibidores de PDE4 y antihistaminas, por nombrar algunos. Los compuestos se pueden administrar per se en forma de profarmacos o como composiciones farmaceuticas que comprenden un compuesto activo o profarmaco.
En otra realizacion, la invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevencion de una reaccion de hipersensibilidad de Tipo IV, que comprende administrar a un sujeto una cantidad de un compuesto eficaz para tratar o prevenir la reaccion de hipersensibilidad, en el que el compuesto se selecciona de compuestos de la presente invencion, como se describe en el presente documento.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevencion de una reaccion de hipersensibilidad de Tipo IV, que se practica de forma profilactica, que comprende administrar a un sujeto una cantidad de un compuesto eficaz para tratar o prevenir la reaccion de hipersensibilidad, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la presente invencion, como se describe en el presente documento, y se administra antes de la exposicion a un alergeno.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en la inhibicion de una cascada de transduccion de senal en que la JAK3 quinasa desempena un papel, que comprende poner en contacto con un compuesto una celula que expresa un receptor implicado en tal cascada de senalizacion, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la presente invencion, como se describe en el presente documento.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevencion de una enfermedad mediada por la JAK quinasa, que comprende administrar a un sujeto una cantidad de compuesto eficaz para tratar o prevenir la enfermedad mediada por la JAK quinasa, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la presente invencion, como se describe en el presente documento.
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En otra realizacion, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevention de una enfermedad mediada por la JAK quinasa, en que la enfermedad mediada por JAK es RHCI o RICH, que comprende administrar a un sujeto una cantidad de compuesto eficaz para tratar o prevenir la enfermedad mediada por la JAK quinasa, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la presente invencion, como se describe en el presente documento.
En otra realizacion, la presente invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevencion de una enfermedad mediada por la JAK quinasa, en que la enfermedad mediada por JAK es rechazo de aloinjerto agudo, que comprende administrar a un sujeto una cantidad de compuesto eficaz para tratar o prevenir la enfermedad mediada por la JAK quinasa, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion, como se describe en el presente documento.
En otra realizacion, la invencion proporciona compuestos para su uso en el tratamiento o prevencion de una enfermedad mediada por la syk y/o jAk quinasa, en que la enfermedad mediada por JAK es rechazo de aloinjerto cronico, que comprende administrar a un sujeto una cantidad de compuesto eficaz para tratar o prevenir la enfermedad mediada por la JAK quinasa, en el que el compuesto se selecciona de los compuestos de la invencion, como se describe en el presente documento.
Los compuestos activos de la invencion normalmente presentan la ruta de syk y/o JAK/Stat. La actividad de un compuesto especificado como un inhibidor de una syk y/o JAK quinasa se puede evaluar in vitro o in vivo. En algunas realizaciones, la actividad de un compuesto especificado se puede analizar en un ensayo celular.
"Trastorno proliferativo celular" se refiere a un trastorno caracterizado por la proliferation anomala de celulas. Un trastorno proliferativo no implica ninguna limitation con respecto a la velocidad de crecimiento celular, sino que simplemente indica la perdida de los controles normales que afectan al crecimiento y la division celular. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las celulas de un trastorno proliferativo pueden tener las mismas velocidades de division celular que las celulas normales, pero no responden a las senales que limitan tal crecimiento. Dentro del ambito de “trastorno proliferativo celular” esta la neoplasia o tumor, que es un crecimiento anomalo de tejido. Cancer se refiere a cualquiera de las diversas neoplasias malignas caracterizadas por la proliferacion de celulas que tienen la capacidad de invadir el tejido circundante y/o de producir metastasis en nuevos sitios de colonization.
En general, los trastornos proliferativos celulares que son tratables con los compuestos divulgados en el presente documento se relacionan con cualquier trastorno caracterizado por proliferacion celular anormal. Estos incluyen diversos tumores y canceres, benignos o malignos, metastasicos o no metastasicos. Las propiedades especlficas de los canceres, tales como invasividad de tejidos o metastasis, pueden tomarse como objetivo utilizando los compuestos descritos en el presente documento. Los trastornos proliferativos celulares incluyen una diversidad de canceres, que incluyen, entre otros, cancer de ovario, cancer renal, cancer gastrointestinal, cancer de rinon, cancer de vejiga, cancer de pancreas, carcinoma escamoso de pulmon y adenocarcinoma.
En algunas realizaciones, el trastorno proliferativo celular tratado es una neoplasia hematopoyetica, que es el crecimiento anormal de celulas del sistema hematopoyetico. Los canceres hematopoyeticos pueden tener sus orlgenes en celulas madre pluripotentes, celulas progenitoras multipotentes, celulas progenitoras comprometidas oligopotentes, celulas precursoras y celulas diferenciadas de forma terminal implicadas en hematopoyesis. Se cree que algunos canceres hematologicos surgen a partir de celulas madre hematopoyeticas, que tienen la capacidad de autorrenovacion. Por ejemplo, las celulas que tienen la capacidad de desarrollar subtipos especlficos de leucemia mieloide aguda (LMA) (Cynthia K. Hahn, Kenneth N. Ross, Rose M. Kakoza, Steven Karr, Jinyan Du, Shao-E Ong, Todd R. Golub, Kimberly Stegmaier, Syk is a new target for LMA differentiation, Blood, 2007, 110, Resumen 209) despues del trasplante presentan marcadores de superficie celular de celulas madre hematopoyeticas, implicando a las celulas madre hematopoyeticas como la fuente de celulas leucemicas. Los blastocitos que no tienen un marcador celular caracterlstico de celulas madre hematopoyeticas parecen no tener la capacidad de establecer tumores despues del trasplante (Blaire et al., 1997, Blood 89: 3104-3112). El origen en celulas madre de determinados canceres hematologicos tambien encuentra apoyo en la observation de que pueden encontrarse anormalidades cromosomicas especlficas asociadas con tipos particulares de leucemia en celulas normales del linaje hematopoyetico as! como en blastocitos leucemicos. Por ejemplo, la translocation reclproca t(9q34;22q11), asociada con aproximadamente el 95 % de las leucemias mielogenas cronicas, parece estar presente en celulas del linaje mieloide, eritroide y linfoide, lo que sugiere que la anormalidad cromosomica se origina en celulas madre hematopoyeticas. Un subgrupo de celulas en determinados tipos de LMC presenta el fenotipo del marcador celular de las celulas madre hematopoyeticas.
Aunque las neoplasias hematopoyeticas a menudo se originan a partir de celulas madre, las celulas progenitoras comprometidas o las celulas diferenciadas de forma mas terminal de un linaje del desarrollo tambien pueden ser la fuente de algunas leucemias. Por ejemplo, la expresion forzada de la protelna de fusion Bcr/Abl (asociada con la leucemia mielogena cronica) en celulas progenitoras mieloides o progenitoras de granulocito/macrofago comunes produce una afeccion similar a la leucemia. Ademas, algunas anormalidades cromosomicas asociadas con subtipos de leucemia no se encuentran en la poblacion celular con un fenotipo marcador de celulas madre hematopoyeticas, pero se encuentran en una poblacion celular que presenta marcadores de un estado mas diferenciado de la ruta
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hematopoyetica (Turhan et al., 1995, Blood 85: 2154-2161). Por lo tanto, aunque las celulas progenitoras comprometidas y otras celulas diferenciadas pueden tener solo un potencial limitado para la division celular, las celulas leucemicas pueden haber adquirido la capacidad de crecer de forma no regulada, en algunos casos mimetizando las caracterlsticas de autorrenovacion de las celulas madres hematopoyeticas (Passegue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100: 11842-9).
En algunas realizaciones, la neoplasia hematopoyetica tratada es una neoplasia linfoide, donde las celulas anomalas derivan de, y/o presentan, el fenotipo caracterlstico de celulas del linaje linfoide. Las neoplasias linfoides pueden subdividirse en neoplasias de linfocitos B, neoplasias de linfocitos T y NK, y linfoma de Hodgkin. Las neoplasias de linfocitos B pueden subdividirse adicionalmente en neoplasia de linfocitos B precursores y neoplasia de linfocitos B maduros/perifericos. Las neoplasias de linfocitos B ejemplares son leucemias/linfomas linfoblasticas B precursoras (leucemia linfoblastica aguda de linfocitos B precursores) mientras que las neoplasias de linfocitos B maduros/perifericos ejemplares son la leucemia linfocltica cronicoa/linfoma linfocltico pequeno de linfocitos B, leucemia prolinfocltica de linfocitos B, linfoma linfoplasmacltico, linfoma de linfocitos B de la zona esplenica marginal, tricoleucemia, mieloma/plasmocitoma de celulas plasmaticas, linfoma de linfocitos B de la zona marginal extranodular del tipo MALT, linfoma de linfocitos B de la zona marginal nodular, linfoma folicular, linfoma de celulas del manto, linfoma de linfocitos B grandes difuso, linfoma de linfocitos B grandes del mediastino, linfoma de derrame primario y linfoma de Burkitt/leucemia de celulas Burkitt. Las neoplasias de linfocitos T y linfocitos Nk se subdividen adicionalmente en neoplasia de linfocitos T precursores y neoplasias de linfocitos T maduros (perifericos). Las neoplasias de linfocitos T precursores ejemplares son el linfoma/leucemia de T linfoblasticos precursores (leucemia linfoblastica aguda de linfocitos T precursores) mientras que las neoplasias de linfocitos T maduros (perifericos) ejemplares son la leucemia prolinfocltica de linfocitos T, leucemia linfocltica granular de linfocitos T, leucemia de linfocitos NK agresiva, linfoma/leucemia de linfocitos T del adulto (HTLV-1), linfoma de linfocitos NK/T extranodular, del tipo nasal, linfoma de linfocitos T del tipo enteropatla, linfoma de linfocitos T gamma-delta hepatosplenico, linfoma de linfocitos T similar a paniculitis subcutanea, micosis fungoide/sindrome de Sezary, linfoma anaplasico de celulas grandes, de celulas T/nulas, del tipo cutaneo primario, linfoma de linfocitos T periferico no caracterizado de otra forma, linfoma de linfocitos T angioinmunoblastico, linfoma anaplasico de celulas grandes, de celulas T/nulas de tipo sistemico primario. El tercer miembro de neoplasias linfoides es el linfoma de Hodgkin, tambien denominado como enfermedad de Hodgkin. El diagnostico ejemplar de esta clase que puede tratarse con los compuestos incluye, entre otros, linfoma de Hodgkin predominante en linfocitos nodular y diversas formas clasicas de la enfermedad de Hodgkin, cuyos miembros ejemplares son el linfoma de Hodgkin con esclerosis nodular (grados 1 y 2), el linfoma de Hodgkin clasico rico en linfocitos, el linfoma de Hodgkin de celularidad mixta y el linfoma de Hodgkin de empobrecimiento de linfocitos. En diversas realizaciones, cualquiera de las neoplasias linfoides que estan asociadas con la actividad anormal de JAK se puede tratar con los compuestos inhibidores de syk y/o JAK.
En algunas realizaciones, la neoplasia hematopoyetica tratada es una neoplasia mieloide. Este grupo comprende una clase grande de trastornos proliferativos celulares o que presentan el fenotipo caracterlstico de las celulas del linaje mieloide. Las neoplasias mieloides se pueden subdividir en enfermedades mieloproliferativas, enfermedades mielodisplasicas/mieloproliferativas, slndromes mielodisplasicos y leucemias mieloides agudas. Las enfermedades mieloproliferativas ejemplares son la leucemia mielogena cronica (por ejemplo, leucemia neutrofllica cronica con cromosoma Filadelfia positivo (t(9;22)(qq34;q11)), leucemia eosinofllica cronica/slndrome hipereosinofllico, mielofibrosis idiopatica cronica, policitemia verdadera y trombocitemia esencial. Los trastornos mielodisplasicos/mieloproliferativos ejemplares son la leucemia mielomonocltica cronica, leucemia mielogena cronica atlpica y leucemia mielomonocltica juvenil. Los slndromes mielodisplasicos ejemplares son anemia refractaria, con sideroblastos en anillo y sin sideroblastos en anillo, citopenia refractaria (slndrome mielodisplasico) con displasia de multilinaje, anemia refractaria (slndrome mielodisplasico) con blastos en exceso, slndrome 5q y slndrome mielodisplasico. En diversas realizaciones, cualquiera de las neoplasias mieloides que estan asociadas con actividad anormal de syk y/o JAK se puede tratar con los compuestos inhibidores de syk y/o JAK.
En algunas realizaciones, los compuestos se pueden utilizar para tratar leucemias mieloides agudas (LMA), que representan una gran clase de neoplasias mieloides que tienen su propia subdivision de trastornos. Estas subdivisiones incluyen, entre otras, las LMA con translocaciones citogeneticas recurrentes, LMA con displasia multilinaje y otras LMA no categorizadas de otra forma. Las LMA ejemplares con translocaciones citogeneticas recurrentes incluyen, entre otras, LMA con t(8;21)(q22;q22), LMA1(cBF-alfa)/ETO, leucemia promielocltica aguda (LMA con t(15;17)(q22;q11-12) y variantes, PML/RAR-alfa), LMA con eosinofilos de la medula osea anormales (inv(16)(p13q22) o t(16;16)(p13;q11), CBFb/MYH11X), y LMA con anormalidades 11q23 (MLL). Las LMA con displasia de multilinaje ejemplares son las que estan asociadas con o sin slndrome mielodisplasico anterior. Otras leucemias mieloides agudas no clasificadas dentro de algun grupo definible incluyen, LMA mlnimamente diferenciada, LMA sin maduracion, LMA con maduracion, leucemia mielomonocltica aguda, leucemia monocltica aguda, leucemia eritroide aguda, leucemia megacariocltica aguda, leucemia basofllica aguda y panmielosis aguda con mielofibrosis.
"Tratar" dentro del contexto de la invencion significa un alivio de los slntomas asociados con un trastorno o enfermedad, o detener la progresion adicional o el empeoramiento de los slntomas, o la prevencion o profilaxis de la enfermedad o trastorno.
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El termino "mamifero" incluye organismos que expresan syk y/o JAK. Los ejemplos de mamlferos incluyen ratones, ratas, vacas, ovejas, cerdos, cabras, caballos, osos, monos, perros, gatos y, preferentemente, seres humanos. Tambien se incluyen en esta definicion los organismos transgenicos que expresan syk y/o JAK.
La invencion proporciona compuestos como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal, comprendiendo dicho uso administrar a un mamifero o animal no humano una cantidad eficaz de un compuesto o composicion descrito en el presente documento. Como se usa en el presente documento, “cantidad eficaz” de un compuesto o composicion de la invencion incluye las cantidades que antagonizan o inhiben syk y/o JAK. Una cantidad que antagoniza o inhibe a syk y/o JAK es detectable, por ejemplo, por cualquier ensayo que tiene la capacidad de determinar la actividad de syk y/o JAK, incluyendo el descrito a continuacion como un metodo de analisis ilustrativo. Las cantidades eficaces tambien pueden incluir las cantidades que alivian los slntomas de un trastorno asociado con syk y/o JAK tratable mediante la inhibicion de syk y/o JAK. Por consiguiente, "antagonistas de syk" o "antagonistas de JAK" incluyen compuestos que interaction con syk o JAK, respectivamente, y modulan, por ejemplo, inhiben o disminuyen, la capacidad de un segundo compuesto, por ejemplo otro ligando de syk o JAK, para interactuar con la syk o JAK, respectivamente. Los compuestos de union a syk o JAK son preferentemente antagonistas de syk o JAK, respectivamente. Las expresiones "compuestos de union a syk " y "compuestos de union a JAK " (por ejemplo, que presenta afinidad de union al receptor) incluyen los compuestos que interaction con syk o JAK dando como resultado la modulacion de la actividad de syk o JAK, respectivamente. Los compuestos de union a syk y/o JAK pueden identificarse utilizando un metodo in vitro (por ejemplo, basado en celulas o no basado en celulas) o in vivo. A continuacion se proporciona una descripcion de los metodos in vitro.
La cantidad de compuesto presente, cuando se utiliza como se describe en el presente documento o en composiciones como se describe en el presente documento, deberla ser suficiente para provocar una disminucion detectable en la gravedad del trastorno, como se mide por cualquiera de los ensayos descritos en los ejemplos. La cantidad del modulador de syk y/o JAK necesaria dependera de la eficacia del modulador para el tipo celular dado y el periodo de tiempo necesario para tratar el trastorno. En determinadas realizaciones, las composiciones de la presente invencion pueden comprender adicionalmente otro agente terapeutico. Cuando se utiliza un segundo agente, el segundo agente puede administrarse ya sea como una forma farmaceutica separada o como parte de una forma farmaceutica unitaria con los compuestos o composiciones de la presente invencion. Aunque uno o mas de los compuestos de la invencion se pueden utilizar en una aplicacion de monoterapia para tratar un trastorno, enfermedad o slntoma, tambien pueden utilizarse en terapia de combinacion, en donde el uso de un compuesto o composicion de la invencion (agente terapeutico) se combina con el uso de uno o mas de otros agentes terapeuticos, para el tratamiento de los mismos y/o de otros tipos de trastornos, slntomas y enfermedades. La terapia de combinacion incluye la administracion de dos o mas agentes terapeuticos de forma simultanea o secuencial. Los agentes se pueden administrar en cualquier orden. Como alternativa, los multiples agentes terapeuticos se pueden combinar en una unica composicion que se puede administrar al paciente. Por ejemplo, una unica composicion farmaceutica podrla comprender el compuesto o la sal, ester o profarmaco farmaceuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la formula I, otro agente terapeutico (por ejemplo, metotrexato) o una sal, ester o profarmaco farmaceuticamente aceptable del mismo, y un excipiente o transportador farmaceuticamente aceptable.
La invencion comprende un compuesto que tiene la formula I. Tambien se describe un metodo para preparar un compuesto de la invencion y un metodo para preparar una composicion farmaceutica de al menos un compuesto de la invencion en al menos un transportador o excipiente farmaceuticamente aceptable. La invencion tambien proporciona un compuesto como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una diversidad de trastornos, slntomas y enfermedades (por ejemplo, inflamatoria, autoinmunitaria, neurologica, neurodegenerativa, oncologica y cardiovascular), tal como AR, osteoartritis, enfermedad del intestino irritable EII, asma, enfermedad pulmonar obstructiva cronica EPOC y EM. Los compuestos de la invencion y sus sales y/o composiciones neutras farmaceuticamente aceptables, se pueden formular junto a un excipiente o transportador farmaceuticamente aceptable y la composicion resultante se puede administrar a mamiferos in vivo, tal como hombres, mujeres y animales, para tratar una diversidad de trastornos, sintomas y enfermedades. Ademas, los compuestos de la invencion se pueden utilizar para preparar un medicamento que sea util para el tratamiento de una diversidad de trastornos, sintomas y enfermedades.
Todos los compuestos de la presente invencion son inhibidores potentes de las syk y/o JAK quinasas, presentando las CI50 en el ensayo respectivo en el intervalo de menos de 5 pM, con la mayoria estando en el intervalo de nanomolar, y varios en el de subnanomolar. En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invencion pueden ser inhibidores de syk/JAK “duales” en el aspecto que inhiben en algun grado tanto a syk como a JAK quinasa. En otras realizaciones, los compuestos de la presente invencion pueden inhibir de forma selectiva a la syk quinasa, pero no inhiben de forma apreciable a una o mas JAK quinasas. En otras realizaciones, los compuestos de la presente invencion pueden inhibir de forma selectiva a JAK quinasa, pero no inhiben de forma apreciable una o mas syk quinasas.
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f. Kits
Todavla otro aspecto de la presente invencion es proporcionar un kit que comprende recipientes separados en un unico envase, en el que los compuestos, composiciones y/o sales de los mismos, farmaceuticos de la invencion, se usan, por lo tanto, en combinacion con transportadores farmaceuticamente aceptables para tratar estados, trastornos, slntomas y enfermedades en donde syk y/o JAK desempenan un papel.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invencion reivindicada.
Los materiales de partida y reactivos usados en la preparation de estos compuestos se encuentran por lo general disponibles a partir de proveedores comerciales, tales como Aldrich Chemical Co., o se preparan mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica siguiendo los procedimientos expuestos en referencias tales como Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis; Wiley & Sons: Nueva York, 1967-2004, Volumenes 1-22; Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Elsevier Science Publishers, 1989, Volumenes 1-5 y Suplementos; y Organic Reactions, Wiley & Sons: Nueva York, 2005, Volumenes 1-65.
Si se desea, los materiales de partida y intermedios de los esquemas de las reacciones de slntesis pueden aislarse y purificarse mediante tecnicas convencionales que incluyen, pero sin limitation, filtration, destilacion, cristalizacion, cromatografla y similares. Dichos materiales pueden caracterizarse mediante medios convencionales, INCLUYENDO constantes flsicas y datos espectrales.
A menos que se especifique otra cosa, las reacciones descritas en el presente documento se realizan preferiblemente en una atmosfera inerte a presion atmosferica y a un intervalo de temperaturas de reaction de aproximadamente -78 °C a aproximadamente 150 °C, mas preferiblemente de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 125 °C, y mas preferiblemente y convenientemente a temperatura ambiente, por ejemplo, de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 75 °C
Con referencia a los siguientes ejemplos, los compuestos de la presente invencion se sintetizaron usando los metodos descritos el presente documento, u otros metodos, que se conocen bien en la tecnica.
Los compuestos y/o intermedios pueden caracterizarse por cromatografla llquida de alto rendimiento (HPLC) usando una sistema de cromatografla Waters Alliance con un modulo de separation 2695 (Milford, Mass.). Las columnas anallticas pueden ser columnas C-18 SpeedROD RP-18E de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). Como alternativa, la caracterizacion puede realizarse usando un sistema Waters Unity (UPLC) con columnas Waters Acquity UPLC BEH C-18 2,1 mm x 15 mm. Puede usarse un gradiente de elucion, tlpicamente partiendo de acetonitrilo al 5 %/agua al 95 % y continuando hasta acetonitrilo al 95 % durante un periodo de 5 minutos para el sistema Alliance y 1 minuto para el sistema Acquity. Todos los disolventes pueden contener acido trifluoroacetico al 0,1 % (TFA). Los compuestos pueden detectarse por absorcion de luz ultravioleta (UV) a 220 nm o 254 nm. Los disolventes de HPLC pueden ser de EMD Chemicals, Inc. (Gibbstown, NJ). En algunos casos, la pureza puede evaluarse por cromatografla de capa fina (TLC) usando placas de vidrio con respaldo de gel de sllice, tales como, por ejemplo, placas EMD de gel de sllice 60 2,5 cm x 7,5 cm. Los resultados por TLC pueden detectarse facilmente de forma visual bajo luz ultravioleta, o empleando tecnicas ya conocidas de vapor de yodo y otras diversas tecnicas de tincion.
Los analisis de espectrometria de masas pueden realizarse en uno de dos instrumentos Agilent 1100 serie LCMS con acetonitrilo/agua como fase movil. Un sistema puede usar TFA como el modificador y medir en modo de ion positivo [indicado como MH+, (M+1) o (M+H)+] y el otro puede usar acido formico o acetato amonico y medir tanto en modo de ion positivo [indicado como MH+, (M+1) o (M+H)+] como negativo [indicado como M-, (M-1) o (M-H)-].
El analisis de resonancia magnetica nuclear (RMN) puede realizarse en algunos de los compuestos con un Varian 400 MHz RMN (Palo Alto, Calif.). La referencia espectral puede ser TMS o el desplazamiento qulmico conocido del disolvente.
La pureza de algunos de los compuestos de la invencion puede evaluarse mediante analisis elementales (Robertson Microlit, Madison, NJ.).
Los puntos de fusion pueden determinarse en un aparato de Laboratory Devices Mel-Temp (Holliston, Mass.).
Las separaciones preparativas pueden realizarse segun sea necesario, usando un sistema de cromatografla Sql6x o Sg100c y columnas de gel de sllice rellenadas previamente, todo adquirido en Teledyne Isco, (Lincoln, NE). Como alternativa, los compuestos e intermedios pueden purificarse por cromatografla en columna ultrarrapida usando material de relleno de gel de sllice (malla 230-400), o por HPLc usando una columna de fase inversa C-18. Los disolventes tlpicos empleados para los sistemas Isco y la cromatografla en columna ultrarrapida pueden ser diclorometano, metanol, acetato de etilo, hexano, acetona, hidroxiamina acuosa y trietil amina. Los disolventes tlpicos empleados para la HPLC de fase inversa pueden ser de concentraciones variables de acetonitrilo y agua con
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acido trifluoroacetico al 0,1 %. Metodos generales
Los siguientes esquemas de reaccion sinteticos son simplemente ilustrativos de algunos metodos mediante los cuales pueden sintetizarse los compuestos de la presente invencion, y pueden hacerse diversas modificaciones a estos esquemas de reaccion sinteticos y se sugeriran a un experto en la tecnica que haga referencia a la divulgacion contenida en esta solicitud.
Ejemplo 1. 2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclobutilamino)pirimidin-5-carboxamida 1
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Etapa 1: A una solucion en agitacion de acido carboxilico 1.1 (85 g, 540 mmol) en cloruro de tionilo (425 ml) se le anadio lentamente piridina (8,5 ml, 0,11 mmol). La reaccion se agito a 75 °C durante una noche, momento en el que se concentro y se seco al vacfo para dar un polvo de color amarillo claro que se uso inmediatamente en la siguiente etapa.
Etapa 2: El solido de color amarillo de la etapa anterior se diluyo lentamente con 750 ml de etanol y se calento a reflujo durante una noche. El dfa siguiente se determino que la reaccion estaba completa por HPLC y despues se enfrio en un bano de hielo, y el solido filtrado y se lavo con eter dietflico proporcionando el ester etflico deseado (1.3) en forma de un polvo blanquecino (91 g, 87 % en dos etapas). MS encontrado para C7H8N2O4 como (M+H)+185,0.
Etapa 3: El ester 1.3 (22 g, 120 mmol) se disolvio en oxicloruro de fosforo (60 ml, 600 mmol) y la mezcla se trato con N,N-dietilanilina (27 ml, 167 mmol) y la mezcla se calento a 105 °C hasta que se determino que la reaccion estaba completa por HPLC. Despues, se enfrio a ta y se anadio lentamente a 1 l de hielo picado dando como resultado la formacion de un precipitado de color beige que se recogio por filtracion y se seco al vacfo proporcionando el dicloruro deseado (1.4) en forma de un polvo de color amarillo claro (22,5 g, 85 %). 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 5 9,13 (s, 1H), 4,37 (c, 2H), 1,32 (t, 3H).
Etapa 4: Se disolvio dicloropirimidina 1,4 (5,9 g, 27 mmol) en acetonitrilo (50 ml), se trato secuencialmente con diisopropilamina (5,2 ml, 30 mmol) seguido de ciclobutil amina (1,9 g, 27 mmol) y se agito a ta hasta que todo el material de partida se habfa consumido. Despues, la mezcla de reaccion se diluyo con agua hasta un volumen total de 150 ml y el precipitado se recogio por filtracion proporcionando el producto deseado en forma de un solido de color amarillo claro (6,02 g, 87 %). rH RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 5 8,60 (S, 1H), 8,48 (d, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,29 (c, 2H), 2,30 (m, 2H), 2,04 (m, 2H), 1,73 (m, 2H), 1,30 (t, 3H).
Etapa 5: Se diluyo ester etflico 1.5 (6,02 g, 24 mmol) con 1,4-dioxano (26 ml) seguido de hidroxido de litio acuoso (1,0 M, 26 ml, 26 mmol) y se agito a ta hasta que todo el material de partida se habfa convertido para dar el acido carboxilico. Despues, la reaccion se diluyo con agua hasta un volumen total de 100 ml y se acidifico a pH = 2 con HCl 6 M. Despues, la suspension resultante se filtro y se seco por aspiracion dando 3,51 g del acido carboxilico (64 %). 1H RMN (DMSO-da, 400 MHz): 5 8,64 (d, 1H), 8,74 (s, 1H), 4,50 (m, 1H), 2,31 (m, 2H), 2,03 (m, 2H), 1,72 (m,
2H).
Etapa 6: Se disolvio acido carboxllico 1.6 (3,15 g, 15 mmol) se disolvio en N,N-dimetilformamida (70 ml) y se trato
con HOBt (3,13 g, 23 mmol) y EDC (4,4 g, 23 mmol). Despues de agitar durante aprox. 25 min se anadio amoniaco
5 (0,5 M en 1,4-dioxano, 72 ml, 36 mmol) y la reaccion se agito durante una noche. A la siguientes manana, la
reaccion se diluyo con agua para dar un volumen total de 500 ml y el producto deseado se recogio por filtracion proporcionando 3,62 g (74 %) de un solido de color beige claro. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 5 9,30 (d, 1H), 8,54
(s, 1H), 8,15 (d, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,74 (d, 1H), 7,64 (m, 2H), 7,51 (t, 1H), 3,77 (m, 1H), 1,79 (m, 2H), 1,74 (m, 2H),
1,53 (m, 1H), 1,41 (m, 1H).
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Etapa 7: Se diluyeron benzotriazolil eter 1.7 (50 mg, 0,17 mmol), 1-(4-(4-aminofenil)piperazin-1-il)etanona (preparada de 1-acetilpiperazina y 4-fluoronitrobenzo en dos etapas) (45 mg, 0,20 mmol) y acido p-toluenosulfonico (30 mg, 0,17 mmol) con 1,4-dioxano (5 ml) y se agito a 120 °C hasta que todo el material de partida se habla consumido. La reaccion se enfrio a ta, se diluyo con agua y se purifico directamente por HPLC preparativa proporcionando el 15 producto deseado, 1, despues de la liofilizacion. MS encontrado para C21H27N7O2 como (M+H)+410,2.
El siguiente compuesto se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1 con el reactivo A en lugar de ciclobutilamina en la Etapa 4.
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Tabla 6
Ej. n.°
Estructura Reactivo A PM MS Nombre
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X ^ A "-NH O n-O-nh, H ciclopropilamina 395,4 67 396 2-(4-(4-acetilpiperazin-1- il)fenilamino)-4- (ciclopropilamino)pirimidin-5- carboxamida
4
., .NH 0 ANANJ ! H ciclopentilamina 423,5 21 424 2-(4-(4-acetilpiperazin-1- il)fenilamino)-4-(ciclopentilamino) pirimidin-5-carboxamida
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_ ^OH ° ay H3C^N^i ^'’'nh 0 AnanJ H trans-2-hidroxi ciclopropilamina racemica 439,5 2 440,5 2-(4-(4-acetilpiperazin-1- il)fenilamino)-4-((1 R)-2- hidroxiciclopentilamino)pirimidin-5- carboxamida
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Ejemplo de referenda 32. 2,4-bis(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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Etapa 1: El Compuesto 1.4 (Ejemplo 1, 1,05 g, 4,8 mmol) se disolvio en 40 ml de acetonitrilo. A este se le anadio tiometoxido sodico (0,74 g, 10,5 mmol). Se agito durante una noche, se diluyo con acetato de etilo, se lavo con salmuera tres veces, se seco y se concentro al vacio. Despues, se puso en 20 ml de dioxano y 10 ml de agua. A esto se le anadieron 500 mg de LiOH hidrato. La mezcla se agito durante 4 horas. A la mezcla se le anadio HCl 1 N hasta que el pH alcanzo 3. Se concentro y se extrajo con acetato de etilo tres veces. Las fases organicas se combinaron, se secaron y se concentraron al vacio para proporcionar un solido de color blanco. Despues, este solido se disolvio en 30 ml de DMF seca. A este se le anadieron clorhidrato de EDC (1,10 g, 5,7 mmol) y HOBt (0,77 g, 5,7 mmol). La mezcla se agito durante 30 min, y a esta se le anadio amoniaco (solution 0,5 N comercial en dioxano, 29 ml, 14,5 mmol). La mezcla se agito durante una noche, se concentro al vacio, se diluyo con acetato de etilo, se lavo con salmuera tres veces, se seco y se concentro al vacio para dar el compuesto en bruto 30,1. MS encontrado para C7H9N3OS2 como (M+H)+ 216,1.
Etapa 2: El Compuesto en bruto 30.1 (42 mg, 0,20 mmol) se disolvio en 4 ml de NMP. A este se le anadio MCPBA (133 mg, 0,50 mmol). Se agito a TA durante 1 hora. A este se le anadieron 1-(4-(4-aminofenil)piperazin-1-il)etanona (175 mg, 0,80 mmol) y DIEA (140 pi, 0,80 mmol). Despues, la mezcla se agito en un bano a 120 °C durante 90 min. Despues, la mezcla se sometio a HPLC preparativa de fase inversa para aislar el compuesto del titulo. MS encontrado para C29H35N9O3 como (M+H)+ 558,2.
Ejemplo de referencia 33. 4-(1H-indazol-6-ilamino)-2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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Etapa 3: Se disolvio dicloropirimidina 1.4 (vease el Ejemplo 1; 1,04 g, 4,7 mmol) en NMP (30 ml) y se agito en un bano de hielo. A esto se le anadieron 6-aminoindazol 31.1 (690 mg, 5,2 mmol) y despues gota a gota etildiisopropilamina (DIEA, 1,64 ml, 9,4 mmol). La mezcla se agito durante 40 minutos, y a esta se le anadio tiometoxido sodico (660 mg, 9,4 mmol). La mezcla se agito durante una noche, se diluyo con acetato de etilo, se lavo con salmuera tres veces, y se concentro al vacio para dar el compuesto en bruto 31.2 en forma de un solido de color pardo claro con rendimiento cuantitativo. MS encontrado para C15H15N5O2S como (M+H)+330,1.
Etapa 4: Se disolvio ester etilico 31.2 (4,7 mmol) en 60 ml de THF.hidroxido de litio hidrato (236 mg, 5,6 mmol) y
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20 ml de agua. La mezcla se agito durante una noche y a esta se le anadio cuidadosamente una solucion 1 N HCl hasta que el pH alcanzo 2. La mezcla se concentro al vado para retirar THF. El solido de color blanco se formo y se aislo usando un embudo de Buchner. Se lavo con agua y se seco en un horno de vado para dar el compuesto 3l.3 (1,14 g, 81 %) en forma de un solido de color blanco. MS encontrado para C13H11NsO2S como (M+H)+302,1.
Etapa 5: Se disolvio acido carboxflico 31.3 (1,14 g, 3,8 mmol) en 30 ml de DMF. A esto se le anadieron clorhidrato de EDC (1,09 g, 5,7 mmol) y HOBt hidrato (770 mg, 5,7 mmol). La mezcla se agito a TA durante 1 hora. Despues a esta se le anadio amoniaco (solucion 0,5 N comercial en dioxano, 22 ml, 11,4 mmol). La mezcla se agito durante 2 horas. Despues, se concentro al vado y se recogio en agua y acetato de etilo. La fase organica se separo y se lavo con salmuera cuatro veces. Despues, la fase organica se seco sobre MgSO4 y se concentro al vado para proporcionar el compuesto 31.4 en forma de un solido de color amarillo claro (820 mg, 72 %). MS encontrado para C13H12N6OS como (M+H)+301,1.
Etapa 6: El Compuesto 31.4 (36 mg, 0,12 mmol) se disolvio en 3 ml de NMP. A este se le anadio MCPBA (puro al 65 %, 48 mg, 0,18 mmol). Se agito a TA durante 30 minutos. Despues, a esto se le anadieron 1-(4-(4- aminofenil)piperazin-1-il)etanona (53 mg, 0,24 mmol) y pTSA (21 mg, 0,12 mmol). La mezcla se agito durante 90 minutos en un bano de 120 °C. Despues, esta mezcla se sometio a HPLC preparativa para aislar el compuesto del trtulo 31. MS encontrado para C24H25NgO2 como (M+H)+ 472,2.
Ejemplo 34. 2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)-3-clorofenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1 con ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina en la Etapa 4. La smtesis de la cloropiperazinilanilina se realizo por cloracion del intermedio nitropiperazinilo, sintetizado de manera similar a la descrita en el Ejemplo 36, con NCS, seguido de reduccion usando platino sulfurado. MS encontrado para C2qH24N7O2CI como (M+H)+ 430,0. UV: A = 290
Ejemplo 35. 2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)-3-clorofenilamino)-4-(ciclobutilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 32. MS encontrado para C21H26N7O2CI como (M+H)+444,0. UV: A = 211,290
Ejemplo 36. 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-propionilpiperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1 con ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina. La piperazinilanilina se sintetizo a partir de Boc piperazina y 4-fluoronitrobenceno, seguido de desproteccion usando HCl en dioxano y acilacion usando cloruro de propionilo, y finalmente hidrogenacion usando Pd/C. MS encontrado para C2iH27N7O2 como (M+H)+410,3. 1H RMN (CD3OD, 400 MHz): 5 8,22 (s, 1H), 7,49 (s ancho, 2H), 7,06 (d, 2H), 3,73 (m, 4H), 3,22 (m, 4H), 2,47 c, 2H), 3,03 (m, 1H), 1,12 (t, 3H), 0,90 (m, 2H), 0,70 (m, 2H).
Ejemplo 37. 2-(4-(4-(ciclopropanocarbonil)piperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 36 con cloruro de ciclopropilcarbonilo en lugar de cloruro de propionilo. MS encontrado para C22H27N7O2 como (M+H)+422,4. 1H RMN (CD3OD, 400 MHz): 5 8,22 (s, 1H), 7,45 (s ancho, 2H), 7,08 (d, 2H), 3,93 (m, 4H), 3,73 (m, 4H), 3,02 (m, 1H), 2,01 (m, 1H), 0,88 (m, 6H), 0,69 (m, 2H). UV: A = 203, 273.
Ejemplo 39. 2-(4-(4-acetil-2-oxopiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1 con ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina en la Etapa 4. La oxopiperazinil anilina se sintetizo a partir de 4-nitroiodobenceno y 4- Boc-2-oxopiperidina usando condiciones catalizadas con yoduro de cobre/dimetiletilendiamina. Despues, el grupo Boc se elimino usando HCl en dioxano, la amina resultante se acilo usando cloruro de acetilo, y finalmente el grupo nitro se redujo usando hidrogeno y Pd/C. MS encontrado para C20H23N7O3 como (M+H)+410,2. UV: A = 275.
Ejemplo 40. 2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)-3-fluorofenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1 con ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina en la Etapa 4. La anilina se sintetizo a partir de la carboxil azida correspondiente por calentamiento en agua/DMF. La azida se sintetizo ultimamente a partir de acido 3,4-difluorobenzoico. MS encontrado para C20H24N7O2F como (M+H)+414,2. UV: A = 293.
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Ejemplo 41. 2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-((1s,4s)-4-aminociclohexilamino)pirimidin-5-carboxamida
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A una mezcla de trans-4-aminociclohexanol (2,07 g, 13,6 mmol) y NaHCO3 (3,50 g, 41,7 mmol) en H2O (20 ml) a temperatura ambiente, se le anadio una solucion de cloroformiato de bencilo (1,92 ml, 13,6 mmol) en dioxano (15 ml). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 20 h. El precipitado de color blanco se recogio en forma de (1R,4R)-4-hidroxiciclohexilcarbamato de bencilo (3,37 g).
A una suspension de (1R,4R)-4-hidroxiciclohexilcarbamato de bencilo (1,14 g, 4,58 mmol) y trietilamina (1,30 ml, 9,34 mmol) en CH2O2 (15 ml) a temperatura ambiente, se anadio cloruro de metanosulfonilo (0,425 ml, 5,49 mmol). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 20 h. Se anadio mas cantidad de cloruro de metanosulfonilo (0,425 ml, 5,49 mmol) y trietilamina (1,00 ml). La agitacion se continuo durante 48 h. La solucion de reaccion se lavo con NaHCO3 al 5 %, y despues con HCl 1 N. La fase organica se separo, se seco sobre Na2SO4, se concentro al vaclo para dar metanosulfonato de (1R,4R)-4-(benciloxicarbonil)ciclohexilo en forma de un solido (1,13 g).
Una mezcla de metanosulfonato de (1R,4R)-4-(benciloxicarbonil)ciclohexilo (1,13 g, 3,46 mmol) y NaN3 (0,674 g, 10,4 mmol) en DMF (10 ml) se agito a 100 °C durante 20 h. Se anadieron agua y EtOAc. La fase organica se separo, se lavo con agua, se seco sobre Na2SO4, se concentro al vaclo para dar (1s,4s)-4-azidociclohexilcarbamato de bencilo (0,819 g).
A una solucion de (1s,4s)-4-azidociclohexilcarbamato de bencilo (0,410 g, 1,50 mmol) en THF (8 ml) y H2O (0,100 ml, 5,56 mmol) a temperatura ambiente, se le anadio Ph3P (0,590 g, 2,25 mmol). La solucion se agito a 70 °C durante 20 h. Se anadieron EtOAc y HCl 1 N. La fase acuosa se separo, se lavo con EtOAc. Despues, se acidifico con NaOH 5 N a pH 12. El producto de amina libre se extrajo con EtOAc. La solucion de EtOAc se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vaclo para dar (1s,4s)-4-aminociclohexilcarbamato de bencilo (0,270 g).
Una mezcla de 2,4-dicloropirimidin-5-carboxilato de etilo (0,241 g, 1,09 mmol), (1s,4s)-4-aminociclohexilcarbamato de bencilo (0,270 g, 1,09 mmol) y trietilamina (0,300 ml, 2,16 mmol) en CH3CN (10 ml) se agito a temperatura ambiente durante 20 h. Se anadieron agua y EtOAc. La fase organica se separo, se lavo con HCl 1 N, despues con NaHCO3 al 5 %, se seco sobre Na2SO4, y se concentro al vaclo para dar 4-((1s,4s)-4- (benciloxicarbonil)ciclohexilamino)-2-cloropirimidin-5-carboxilato de etilo (0,458 g).
A una solucion de 4-((1s,4s)-4-(benciloxicarbonil)ciclohexilamino)-2-cloropirimidin-5-carboxilato de etilo (0,458 g, 1,06 mmol) en THF (5 ml) se le anadio LiOH ac. 1 N (1,16 ml, 1,16 mmol). Despues de agitarse durante 3 h, se le anadio agua (10 ml). La solucion se acidifico con HCl 1 N (2 ml) a pH 1-2. El producto se extrajo con EtOAc. La
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solucion de EtOAc se lavo con salmuera, se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vacfo para dar acido 4-((1s,4s)-4- (benciloxicarbonil)ciclohexilamino)-2-cloropirimidin-5-carbox[lico en forma de un solido (0,409 g).
A una solucion de acido 4-((1s,4s)-4-(benciloxicarbonil)ciclohexilamino)-2-cloropirimidin-5-carboxflico (0,409 g, 1,01 mmol) y HOBt (0,232 g, 1,52 mmol) en DMF (5 ml) se le anadio EDC (0,291 g, 1,52 mmol). Despues de agitarse durante 2 h, se anadio NH3 (0,5 M en dioxano, 6,0 ml, 3,00 mmol). La mezcla se agito durante 20 h. Se anadieron agua y EtOAc. La fase organica se separo, se lavo con HCl 1 N, despues con NaHCO3 al 5 %, se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vacfo para dar (1s,4s)-4-(2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-iloxi)-5-carbamoilpirimidin-4- ilamino)ciclohexilcarbamato de bencilo en forma de un solido (0,440 g).
Una mezcla de (1s,4s)-4-(2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-iloxi)-5-carbamoilpirimidin-4-ilamino)ciclohexilcarbamato de bencilo (0,220 g, 0,438 mmol), 1-(4-(4-aminofenil)piperazin-1-il)etanona (0,192 g, 0,877 mmol) y pTsOH monohidrato (0,083 g, 0,437 mmol) en dioxano (4 ml) se agito a 100 °C durante 3 h. Despues, la mezcla se purifico por HPLC para dar (1s,4s)-4-(2-(4-(4-acetilpiperazin-1 -il)fenilamino)-5-carbamoilpirimidin-4-ilamino)ciclohexilcarbamato de bencilo (0,123 g).
Una mezcla de (1 s,4s)-4-(2-(4-(4-acetilpiperazin-1 -il)fenilamino)-5-carbamoilpirimidin-4-ilamino)ciclohexilcarbamato de bencilo (0,123 g, 0,21 mmol) y Pd-C (10 %, 40 mg) en MeOH (5 ml, que contenfa tres gotas de HCl 6 N), se hidrogeno en un globo de H2 durante 4 h. La mezcla se filtro a traves de celite, y el filtrado se concentro al vacfo para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido. MS 453,45 (M+H).
Ejemplo de referencia 42. 2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(piperidin-4-ilmetilamino)pirimidin-5-carboxamida
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Una mezcla de 2,4-dicloropirimidin-5-carboxilato de etilo (0,221 g, 1,00 mmol), clorhidrato de 1-Boc-4- aminometilpiperidina (0,251 g, 1,00 mmol) y trietilamina (0,556 ml, 4,00 mmol) en CH3CN (10 ml) se agito a temperatura ambiente durante 20 h. Se anadieron agua y EtOAc. La fase organica se separo, se lavo con HCl 1 N, despues con NaHCO3 al 5 %, se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vacfo para dar 4-((1-(terc- butoxicarbonil)piperidin-4-il)metilamino)-2-cloropirimidin-5-carboxilato de etilo (0,390 g).
A una solucion de 4-((1-(terc-butoxicarbonil)piperidin-4-il)metilamino)-2-cloropirimidin-5-carboxilato de etilo (0,390 g, 0,979 mmol) en THF (5 ml) se le anadio LiOH ac. 1 N (1,10 ml, 1,10 mmol). Despues de agitarse durante 20 h, se anadio agua (10 ml). La solucion se acidifico con HCl 1 N (2 ml) a pH 1-2. El producto se extrajo con EtOAc. La solucion de EtOAc se lavo con salmuera, se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vacfo para dar acido 4-((1-(terc- butoxicarbonil)piperidin-4-il)metilamino)-2-cloropirimidin-5-carboxflico en forma de un solido (0,353 g).
A una solucion de acido 4-((1-(terc-butoxicarbonil)piperidin-4-il)metilamino)-2-cloropirimidin-5-carboxflico (0,353 g, 0,953 mmol) y HOBt (0,219 g, 1,43 mmol) en DMF (5 ml) se le anadio EDC (0,274 g, 1,43 mmol). Despues de agitarse durante 1 h, se anadio NH3 (0,5 M en dioxano, 5,5 ml, 2,75 mmol). La mezcla se agito durante 20 h. Se anadieron agua y EtOAc. La fase organica se separo, se lavo con HCl 1 N, despues con NaHCO3 al 5 %, se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vacfo para dar 4-((2-(1H-benzo [d] [1,2,3]triazol-1-iloxi)-5-carbamoilpirimidin-4- ilamino)metil)piperidin-1-carboxilato de terc-butilo en forma de un solido (0,410 g).
Una mezcla de 4-((2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-iloxi)-5-carbamoilpirimidin-4-ilamino)metil)piperidin-1-carboxilato de terc-butilo (0,205 g, 0,438 mmol), 1-(4-(4-aminofenil)piperazin-1-il)etanona (0,192 g, 0,877 mmol) y pTsOH
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monohidrato (0,166 g, 0,874 mmol) en dioxano (4 ml) se agito a 100 °C durante 3 h. Despues, la mezcla se purifico por HPLC para dar 4-((2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-5-carbamoilpirimidin-4-ilamino)metil)piperidin-1- carboxilato de terc-butilo (0,105 g).
Una solucion de 4-((2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-5-carbamoilpirimidin-4-ilamino)metil)piperidin-1-carboxilato de terc-butilo (0,105 g, 0,190 mmol) en TFA (2 ml) se agito a temperatura ambiente durante 4 h. El TFA se retiro al vacio. El residuo se purifico por HPLC para dar el compuesto del titulo (90 mg). MS 453,41 (M+H).
Ejemplo de referencia 48. 2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(piperidin-3-ilmetilamino)pirimidin-5-carboxamida
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Una mezcla de 2,4-dicloropirimidin-5-carboxilato de etilo (0,221 g, 1,00 mmol), 3-aminometil-1-N-CBz-piperidina (0,248 g, 1,00 mmol) y trietilamina (0,300 ml, 2,15 mmol) en CH3CN (10 ml) se agito a temperatura ambiente durante 20 h. Se anadieron agua y EtOAc. La fase organica se separo, se lavo con HCl 1 N, despues con NaHCO3 al 5 %, se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vacio para dar 4-((1-(benciloxicarbonil)piperidin-3-il)metilamino)-2- cloropirimidin-5-carboxilato de etilo (0,382 g).
A una solucion de 4-((1-(benciloxicarbonil)piperidin-3-il)metilamino)-2-cloropirimidin-5-carboxilato de etilo (0,382 g, 0,88 mmol) en THF (5 ml) se le anadio LiOH ac. 1 N (1,00 ml, 1,00 mmol). Despues de agitarse durante 20 h, se anadio agua (10 ml). La solucion se acidifico con HCl 1 N (2 ml) a pH 1-2. El producto se extrajo con EtOAc. La solucion de EtOAc se lavo con salmuera, se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vacio para dar acido 4-((1- (benciloxicarbonil)piperidin-3-il)metilamino)-2-cloropirimidin-5-carboxilico (0,350 g).
A una solucion de acido 4-((1-(benciloxicarbonil)piperidin-3-il)metilamino)-2-cloropirimidin-5-carboxilico (0,350 g, 0,87 mmol) y HOBt (0,200 g, 1,31 mmol) en DMF (5 ml) se le anadio EDC (0,250 g, 1,30 mmol). Despues de agitarse durante 1 h, se anadio NH3 (0,5 M en dioxano, 6,0 ml, 3,0 mmol). La mezcla se agito durante 20 h. Se anadieron agua y EtOAc. La fase organica se separo, se lavo con HCl 1 N, despues con NaHCO3 al 5 %, se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vacio para dar 3-((2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-iloxi)-5-carbamoilpirimidin-4- ilamino)metil)piperidin-1-carboxilato de bencilo (0,404 g).
Una mezcla de 3-((2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-iloxi)-5-carbamoilpirimidin-4-ilamino)metil)piperidin-1-carboxilato de bencilo (0,404 g, 0,805 mmol), 1-(4-(4-aminofenil)piperazin-1-il)etanona (0,220 g, 1,00 mmol) y pTsOH monohidrato (0,167 g, 0,879 mmol) en dioxano (8 ml) se agito a 100 °C durante 3 h. Despues, la mezcla se purifico por HPLC para dar 3-((2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-5-carbamoilpirimidin-4-ilamino)metil)piperidin-1-carboxilato de bencilo 45 (0,270 g).
Una mezcla de 3-((2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-5-carbamoilpirimidin-4-ilamino)metil)piperidin-1-carboxilato de bencilo (90 mg, 0,15 mmol) y Pd-C (10 %, 30 mg) en MeOH (10 ml, que contenia 4 gotas de HCl 6 N) se hidrogeno en un globo de H2 durante 4 h. La mezcla se filtro a traves de celite. El filtrado se concentro al vacio para dar el compuesto del titulo 46 (56 mg). MS 453,45 (M+H).
Ejemplo de referencia 51. (S)-2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(1-hidroxipropan-2-ilamino)pirimidin-5- carboxamida
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Etapa 1: La conversion de dicloropirimida 1.4 en tiometilo 49.1 se realizo usando un procedimiento similar al descrito en Synthesis and evaluation of 2-{[2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl]amino)pyrimidine-5-carboxamide derivatives como 5 novel STAT6 inhibitors. Nagashima, Shinya; Yokota, Masaki; Nakai, Ei-ichi; Kuromitsu, Sadao; Ohga, Keiko; Takeuchi, Makoto; Tsukamoto, Shin-ichi; Ohta, Mitsuaki. Institute for Drug Discovery Research, Astellas Pharm Inc., Yodogawa-ku, Osaka, Japan. Bioorganic & Medicinal Chemistry (2007), 15(2), 1044-1055.
Las Etapas 2 - 4 se realizaron usando procedimientos similares a los descritos en el Ejemplo 1.
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Etapa 5: El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 25, Etapa 2. MS encontrado para C20H27N7O3 como (M+H)+414,4.
Ejemplo 55 2-(4-(4-acetil-2-carbamoilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida 15
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1, usando ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina y acido piperazincarboxflico Boc protegido en lugar de acetilpiperazina. 20 MS encontrado para C21H26N8O3 como (M+H)+439,4.
Ejemplo 56. (R)-2-(4-(4-acetil-3-metilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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Ejemplo 61. 2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(1-carbamoilciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1. MS encontrado para C21H26N8O3 como (M+H)+439,3.
Ejemplo 63. 2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-((1R,2R)-2-carbamoilciclopentilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 51 usando una amina preparada usando el procedimiento de An Efficient Route to Either Enantiomer of trans-2- Aminocyclopentanecarboxylic Acid. LePlae, P. R.; Umezawa, N.; Lee, H.-S.; Gellman, S. H. J. Org. Chem.; (Note); 2001; 66(16); 5629-5632. MS encontrado para C23H30N8O3 como (M+H)+467,4. UV: A = 202,258.
Ejemplo 64. 2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(-2-trans-fenilciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
imagen44
El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 51. MS encontrado para C26H29N7O2 como (M+H)+ 472,3.
Ejemplo 70. 2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-((1R,3R)-3-carbamoilciclopentilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 51 usando un acido (1,R, 3R)-3-aminociclopentanocarboxllico Boc protegido derivado de amina. MS encontrado para C23H30N8O3 como (M+H)+467,4.
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Ejemplo 74. (R)-2-(4-(4-acetil-2-metilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 usando ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina. MS encontrado para C21H27N7O2 como (M+H)+ 410,4. UV: A = 209,265.
Ejemplo 93. 2-(6-(4-acetilpiperazin-1-il)piridin-3-ilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un intermedio sintetizado como se ha descrito en el Esquema 1 con ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina, y 1-(4-(5-aminopiridin-2-il)piperazin-1-il)etanona (preparada a partir de 1-acetilpiperazina y 2-cloro-5-nitropiridina en dos etapas). MS encontrado para Ci9H24NsO2 como (M+H)+ 397,0. 1H RMN (CD3OD, 400 MHz): 5 8,62 (s, 1H), 8,41 (s, 1H), 8,08 (s ancho, 1H), 7,17 (d, 1H) 3,64 - 3,78 (m, 8H), 2,98 (n, 1H), 2,15 (s, 3H), 0,96 (m, 2H), 0,70 (m, 2H).
Ejemplo 96. 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(1-(metilsulfonil)-1,2,3,6-tetrahidropiridin-4-il)fenilamino)pirimidin-5- carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 usando ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina. MS encontrado para C20H24N6O3S como (M+H)+ 429,3.
Ejemplo 97. 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(1-(metilsulfonil)piperidin-4-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 usando ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina. MS encontrado para C20H26N6O3 como (M+H)+ 431,3.
Ejemplo 99. 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(metilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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Ejemplo 100a. 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(etilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1, usando ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina. MS encontrado para C20H27N7O3S como (M+H)+ 446,2. 1H RMN (CD3OD, 400 MHz): 5 8,37 (s, 1H), 7,59 (s ancho, 2H), 7,09 (d, 2H), 3,45 (m, 4H), 3,50 (m, 4H), 3,12 (c, 2H), 3,07 (m, 1H), 1,35 (t, 3H), 0,93 (m, 2H), 0,73 (m, 2H). UV: A = 275.
Ejemplo 100b. 4-(ciclobutilamino)-2-(4-(4-(metilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
imagen52
El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1. MS encontrado para C20H27N7O3S como (M+H)+446,0.
Ejemplo 113. 2-(4-(1-acetilpiperidin-4-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 usando ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina. MS encontrado para C21H26N6O2 como (M+H)+ 395,3.
Ejemplo 114. (ciclopropilamino)-2-(4-(4-(pirrolidin-1-carbonil)piperidin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 usando ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina y una anilina obtenida a partir de 4-fluoronitrobenceno e isonipecotato de etilo. mS encontrado para C24H30N7O2 como (M+H)+450,3. UV: A = 271.
Ejemplo 115. 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(piperidin-1-carbonil)piperidin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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Ejemplo 116. 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(morfolin-4-carbonil)piperidin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 usando ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina y una anilina obtenida a partir de 4-fluoronitrobenceno e isonipecotato de etilo. mS encontrado para C24H31N7O3 como (M+H)+466,3. UV: A = 201,230, 285.
Ejemplo 117. 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(ciclopropilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1. MS encontrado para C21H27N7O3S como (M+H)+458,2. UV: A = 201,231,282.
Ejemplo 118. 2-(4-(4-acetil-1,4-diazepan-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1. MS encontrado para C21H27N7O2 como (M+H)+410,2. UV: A = 234, 258.
Ejemplo 119. 2-(4-(4-acetamidopiperidin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 usando una anilina obtenida a partir de 4-Boc aminopiperidina y 4-fluoronitrobenceno que se convirtio en el acetilo despues de desproteccion Boc, despues el grupo nitro se redujo para dar la anilina usando hidrogenacion. MS encontrado para C21H27N7O2 como (M+H)+ 410,2.
Ejemplo 120. 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(2-oxopiridin-1(2H)-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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Ejemplo 121.4-(ciclopropilamino)-2-(4-dioxotiomorfolinofenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1. MS encontrado para C18H22N6O2S como (M+H)+ 403,2.
Ejemplo 122. 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(2-metoxietil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 usando ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina y una anilina obtenida a partir de 4-fluoronitrobenceno y 1- metoxietilpiperazina en dos etapas. MS encontrado para C21H29N7O2 como (M+H)+ 412,0.
Ejemplo 124. 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(N-metilacetamido)piperidin-1 -il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
H
H
El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 usando ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina y una anilina descrita previamente con la metilacion del grupo N-acetilo (CH3I, Cs2CO3, DMF) realizandose antes de la etapa de reduccion nitro. MS encontrado para C22H29N7O2 como (M+H)+424,2
Ejemplo 135. 2-(4-(4-(aminometil)piperidin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 con ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina. MS encontrado para C20H27N7O como (M+H)+ 382,5.
Ejemplo de referencia 151. 4-(1-metil-1H-indol-4-ilamino)-2-(4-(2-(pirrolidin-1-il)etoxi)fenilamino)pirimidin-5- carboxamida
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Etapa 1: A una solution de 2,4-dicloropirimidin-5-carboxilato de etilo (328 mg, 1,48 mmol) y 1-metil-1H-indol-4-amina (260 mg, 1,78 mmol) en CH3CN (6 ml) a temperatura ambiente, se ale anadio DIEA (0,4 ml, 2,22 mmol). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 24 h. Se anadio agua (15 ml) para inducir la precipitation. El precipitado se recogio y se seco al vacfo para dar 2-cloro-4-(1-metil-1H-indol-4-ilamino) pirimidin-5-carboxilato de etilo en forma de un solido.
Etapa 2: A una solution de 2-cloro-4-(1-metil-1H-indol-4-ilamino) pirimidin-5-carboxilato de etilo (en bruto de la etapa 1) en THF (4 ml), se le anadio LioH ac. 1 N (2,25 ml, 2,25 mmol). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante una noche. Tras la acidification de la mezcla con HCl 1 N, se retiraron por precipitation solidos de color blanco, que se recogieron, y se secaron al vacfo para dar acido 2-cloro-4-(1-metil-1H-indol-4-ilamino)pirimidin-5- carboxflico (325 mg). MS 303,3, 305,3 (M+H, patron Cl)
Etapa 3: A una solution de acido 2-cloro-4-(1-metil-1H-indol-4-ilamino)pirimidin-5-carboxflico (325 mg, 1,08 mmol) y HOBt (198 mg, 1,29 mmol) en DMF (4 ml) se le anadio EDC (248 mg, 1,29 mmol). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 1,5 h. Se anadio amoniaco (0,5 M en dioxano, 8,00 ml, 4,00 mmol). Se agito a temperatura ambiente durante una noche. Se anadieron agua y EtOAc. La fase organica se separo, se lavo con HCl 1 N, despues con NaHCO3 al 5 %, se seco sobre Na2SO4 y se concentro al vacfo para dar 2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1- iloxi)-4-(1-metil-1H-indol-4-ilamino)pirimidin-5-carboxamida (378 mg). MS 401,4 (M+H)
Etapa 4: A una solution de 2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-iloxi)-4-(1-metil-1H-indol-4-ilamino)pirimidin-5-carboxamida (62 mg, 0,15 mmol) en NMP (1 ml) se le anadieron 4-(2-(pirrolidin-1-il)etoxi)anilina (31 mg, 0,15 mmol) y acido p- toluenosulfonico hidrato (28 mg, 0,15 mmol). Se calento a 100 °C durante 4 h, y se purifico por HPLC preparativa para dar 4-(1-metil-1H-indol-4-ilamino)-2-(4-(2-(pirrolidin-1-il)etoxi)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida (32 mg). MS encontrado para C26H29N7O2 como (M+H)+ 472,4. UV: A = 216,9, 257,0.
Ejemplo 189. 2-(4-(1 -acetil-1,2,3,6-tetrahidropiridin-4-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 con ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina. MS encontrado para C21H24N6O2 como (M+H)+ 393,3.
Ejemplo 190. (R)-4-(ciclopropilamino)-2-(4-(2-(metoximetil)pirrolidin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 con ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina y usando una anilina preparada en dos etapas a partir de 4-fluoronitrobenceno y (R)-2- metoximetilpirrolidina. MS encontrado para C20H26N6O2 como (M+H)+383,3.
Ejemplo 191. (S)-4-(ciclopropilamino)-2-(4-(2-(metoximetil)pirrolidin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 190 usando (S)-2- metoximetilpirrolidina en lugar del isomero (R). MS encontrado para C20H26N6O2 como (M+H)+383,3. 1H RMN (CD3OD, 400 MHz): 5 8,21 (s, 1H), 7,38 (s ancho, 2H), 6,78 (d, 2H), 3,89 (m, 1H), 3,49 (m, 2H), 3,33 (s, 3H), 3,18 (m, 2H), 3,03 (m, 1H), 2,03 (m, 4H), 0,93 (m, 2H), 0,72 (m, 2H).
Ejemplo 196 4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(metilsulfonil)-1,4-diazepan-1 -il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida
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El compuesto anterior se preparo usando un procedimiento similar al descrito en el Esquema 1 con ciclopropilamina en lugar de ciclobutilamina y una anilina obtenida a partir de homopiperazina Boc protegida y 4-fluoronitrobenceno. MS encontrado para C20H27N7O3S como (M+H)+ 446,2.
Ejemplo 332
Este ejemplo ilustra los metodos para la evaluacion de los compuestos de la invencion, junto con los resultados obtenidos para tales ensayos. Las actividades de syk in vitro e in vivo de los compuestos de la invencion se pueden determinar mediante diversos procedimientos conocidos en la tecnica, tales como una prueba para su capacidad de inhibir la actividad de syk en plasma humano. Las potentes afinidades para la inhibition de syk humana mostradas por los compuestos de la invencion, se puede medir mediante un valor de CI50 (en nM). El valor de la CI50 es la concentration (en nM) del compuesto necesaria para proporcionar el 50 % de inhibicion de la actividad proteolftica de syk humana. Cuanto menor es el valor CI50, mas activo (potente) es un compuesto para inhibir la actividad de syk.
Un ensayo in vitro para detectar y medir la actividad de inhibicion frente a syk es como sigue:
Inhibicion de la actividad de fosforilacion de tirosinas de syk
La potencia de las moleculas candidatas para inhibir la actividad de fosforilacion de tirosinas de syk se evalua midiendo la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la fosforilacion de tirosinas mediada por syk de un sustrato especffico de syk.
La actividad de fosforilacion de tirosinas de SYK se mide utilizando la Tecnologfa LANCE™ desarrollada por Perkin Elmer Life and Analytical Sciences (Boston, MA). LANCE™ se refiere a aplicaciones de fluorometrfa homogenea resuelta en el tiempo utilizando tecnicas tales como el ensayo de transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) (para los procedimientos vease en general la Nota de Aplicacion de Perkin Elmer - How to Optimize a Tyrosina Kinase Assay Using Time Resolved Fluorescence-Based LANCE
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Detection, w
www.perkinelmer.com/lifesciences). El principio del ensayo implica la deteccion de un sustrato fosforilado utilizando transferencia de energia de un anticuerpo marcado con europio fosfoespecifico a estreptavidina-aloficocianina como receptor.
Para analizar la capacidad de las moleculas candidatas para inhibir la actividad de fosforilacion de tirosinas de SYK, las moleculas se reconstituyen en DMSO al 30 % y se diluyen en serie 1:3 con la dilucion final conteniendo DMSO en ausencia de la molecula candidata. La concentracion final de DMSO en el ensayo es del 3 %. Los ensayos de quinasa se realizan como una reaccion en dos partes. La primera reaccion es una reaccion de quinasa y que comprende una molecula candidata, enzima SYK recombinante activa de longitud completa (Millipore, CA) y sustrato especifico de SYK marcado con biotina, biotina-DEEDYESP-OH. La segunda reaccion implica la finalizacion de la reaccion de quinasa y la adicion simultanea de los reactivos de deteccion- reactivo antifosfotirosina marcado con europio (Eu-W1024-PY100, Perkin Elmer, Boston, MA) y reactivo de deteccion estreptavidina-aloficocianina (SA- APC, Prozyme, CA). La reaccion de quinasa se realiza en una placa de microtitulacion de 96 pocillos de fondo en U negra. El volumen de reaccion final es de 50 pl y contiene una concentracion final de enzima SYK activa 1 nM, sustrato de SYK 550 nM y ATP 100 pM diluido en un tampon que contiene Tris 50 mM pH 7,5, MgCh 5 mM y DTT 1 mM. Se permite que la reaccion transcurra durante 1 hora a temperatura ambiente. El tampon de interrupcion de la reaccion contiene Tris 100 mM pH 7,5, NaCl2 300 mM, EDTA 20 mM, Brij35 al 0,02 % y BsA al 0,5 %. Los reactivos de deteccion se anaden a la mezcla de reaccion a las siguientes diluciones. - 1:500 para Eu-W1024-PY100 y 1:250 para SA-APC. La reaccion de quinasa se termina mediante la adicion de 50 pl de tampon de interrupcion conteniendo los reactivos de deteccion. Se permite que la deteccion transcurra durante 1 h a temperatura ambiente. La deteccion del sustrato fosforilado en ausencia y presencia de inhibidores se mide en el instrumento de TR-FRET, Analyst HT (Molecular Probes, Sunnyvale, CA) y la condicion para las medidas se prepara utilizando CriterionHost Release 2.0 (Molecular Probes, Sunnyvale, CA). Los ajustes utilizados son como sigue: excitacion 360 nm, emision 665 - 7.5 nm, divisor de rayos 350 nm 50/50, destello 100 pulsos, retraso 60 us, integration 400 us, altura 2 mm. La inhibition de la actividad tirosina quinasa de SYK se calcula como la respuesta maxima observada con inhibidor, en comparacion con la de sin inhibidor. Las CI50 se obtienen mediante analisis de regresion no lineal.
Se utilizo fosfo-citometna de flujo intracelular para analizar la inhibicion del compuesto sobre la actividad de Syk en las lineas celulares de linfoma no Hodgkin Ramos y SUDHL-6 intactas. Se alicuotaron 10x106 celulas en fase de crecimiento logaritmico; la Syk quinasa se activa incubando las celulas durante 10 minutos con anticuerpo especifico para receptor de linfocitos B 3 pg/ml. Inmediatamente despues, las celulas se fijan en paraformaldehido al 1 % durante 5 minutos a temperatura ambiente, se lavan en solution salina tamponada con fosfato y despues se permeabilizan mediante la incubation durante 2 horas en metanol enfriado en hielo. Las celulas se lavan otra vez en solucion salina tamponada con fosfato, despues se incuban durante 30 minutos con anticuerpo especifico para Erk (Y204) y BLNK (Y84) fosforiladas, que son indicadores de la actividad Syk quinasa, y Syk (Y352) fosforilada, como una medida de la actividad quinasa de la familia Src. Todos los anticuerpos utilizados se adquieren de BD Pharmingen (San Jose, CA). Despues de la incubacion con los anticuerpos, las celulas se lavan otra vez y se someten a citometna de flujo. En la Tabla 1 se muestran los datos representativos detallando la inhibicion de la serialization del receptor de linfocitos B mediante los compuestos, como intervalos de CI50.
Tambien se evaluaron los efectos antiproliferativos de los compuestos sobre las lineas de linfocitos B de linfoma no Hodgkin SUDHL-4, SUDHL-6 y Toledo. Para el crecimiento y supervivencia SUDHL-4 y SUDHL-6 necesitan la senalizacion del receptor de linfocitos B, aunque la linea celular Toledo (que sirve aqui como control negativo) no. Las celulas se alicuotaron en cada pocillo de la placa de 96 pocillos y se incubaron con concentraciones crecientes de compuesto durante 72 horas, tras lo cual se determino la supervivencia y proliferation celular utilizando el ensayo MTT (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) siguiendo los protocolos suministrados por el fabricante. Los datos se detallan en la Tabla 2 como valores de CI50 mas o menos las desviaciones tipicas, a partir de 5 o 6 experimentos independientes.
La induction de apoptosis en las lineas de linfocitos B de linfoma no Hodgkin SUDHL-4, SUDHL-6 y Toledo, se evaluo midiendo el marcador de apoptosis Caspasa 3. Las celulas se incubaron con el compuesto a 1, 3 o 10 pM durante 24, 48 y 72 horas. Al acabar cada punto de tiempo, las celulas se procesaron para analisis de citometna de flujo utilizando el kit de Anticuerpo Monoclonal Anti Caspasa 3 Activa de Conejo y los protocolos relacionados (BD Pharmingen). En las Tablas 3A y 3B se presentan los datos de dos experimentos independientes, que representan el porcentaje de celulas totales que experimentan apoptosis despues de la incubacion con los compuestos en las condiciones indicadas.
La actividad de Syk no solo es necesaria para la senalizacion, proliferacion y supervivencia de los linfocitos T, como se muestra, sino que tambien es critica para la activation celular despues del entrecruzamiento del receptor de linfocitos B. La activacion de linfocitos B conduce a la expresion en la superficie celular aumentada de varias proteinas implicadas en senalizacion celular, presentation antigenica y adhesion. Entre estas, para determinar el estado de activacion de los linfocitos B se miden comunmente CD80, CD86 y CD69. Por lo tanto, se alicuotaron linfocitos B de raton primarios aislados de bazo y se incubaron con concentraciones crecientes del compuesto (0,05 a 2 pM) en presencia de IgD anti raton en cabra (eBiosciences, Inc., San Diego, CA) durante 20 horas para entrecruzar el receptor de linfocitos B. Despues, las celulas se lavaron e incubaron durante 30 minutos en hielo con anticuerpos especificos para los marcadores de activacion celular CD80, CD86 y CD69. Los linfocitos B se
identificaron en la poblacion agrupada tinendo con el marcador de linfocitos B CD45RO. Todos los anticuerpos se adquirieron en BD Pharmingen. La Tabla 4 representa el intervalo de CI5o en que los compuestos inhibieron la activacion inducida del receptor de linfocitos B, de linfocitos B primarios de raton.
5 En la Tabla a continuation, se proporciona la actividad en los ensayos de Syk y/o Jak como sigue: +++++ = CI50 < 0,0010 pM; ++++ = 0,0010 pM < CI50 < 0,010 pM, +++ = 0,010 pM < CI50 < 0,10 pM, ++ = 0,10 pM < CI50 < 1 pM, + = CI50 > 1 pM.
Tabla 7:
Ejemplo
UV PM MH+ CI50 de Syk
1
409,49 410,0 410,2 + + +
3
395,47 396,0 396.3 396.4 + + +
ES (+) MS M+H=396
4
423,52 424 + +
34
429,91 430,0, 432,0 + + +
35
443,94 444,0, 446,0 + + +
36
256, 249,5 409,49 410.3 420,2 420.4 ES(+) MS [M+1]=410 Ms Turbo Spray [M+1]=410 + + +
37
421,51 422,4 + + +
39
409,45 410,2 + +
40
413,46 414,2 + + +
41
452,56 453,45 + + + +
55
438,49 439,4 + + +
56
409,49 410,4 + + +
63
466,55 467,4 + +
64
471,57 472,3 + +
70
466,55 467,4 + + +
93
396,46 397 + +
96
428,52 429,3 (M+1) + + +
97
430,53 431,3 (M+1) + + +
99
431,52 432,0 432,2 ES (+) MS [M+1]=432 ES(+) MS [M+H]=432 MS Turbo Spray [M+1]=432 MS Turbo Spray [M+1]=432 + + +
100
445,55 426(M+H) 446 446,2 446,2(M+H) 446,4 ES(+) MS [M+1]=446 MS Turbo Spray [M+1]=446 + + +
113
394,48 395,3 (M+1) + + +
114
449,56 450,3 + +
115
463,59 464,3 + +
116
465,56 466,3 + +
117
457,56 458,2 + + +
118
409,49 410,2 + + +
119
409,49 410,2 + +
120
362,39 363,2 + +
121
402,48 403,2 + + +
122
411,51 M+1=412 + +
5
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15
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25
30
35
40
45
50
55
Ejemplo
UV PM MH+ CI50 de Syk
124
423,52 424,2 + + +
135
381,48 382,5 (M+1) + + +
189
392,46 393,3 (M+1) + + +
191
382,47 383,3 + +
196
445,55 446,2 + + +
Inhibicion de la funcion de plaquetas mediada por GPVI In Vitro
La capacidad de las moleculas candidatas para inhibir las funciones de las plaquetas mediadas por syk, se analizo midiendo la inhibicion de la movilizacion de calcio o la agregacion de plaquetas humanas inducida por el agonista Calvuxina especlfico de GPV. La movilizacion de calcio se evalua en plaquetas humanas lavadas en un formato de microtitulacion de 96 pocillos. La agregacion se evalua en un ensayo de microtitulacion de 96 pocillos (veanse, en general, los procedimientos en Jantzen, H. M. et al. (1999) Thromb. Hemost. 81: 111-117) o en agregometrla de transmitancia luminosa de cubeta convencional, utilizando plasma rico en plaquetas humano (PRP).
Inhibicion de la movilizacion de calcio en plaquetas mediada por Convulxina In Vitro
La inhibicion de la movilizacion de calcio inducida por Convulxina se determino en plaquetas humanas lavadas, utilizando el kit de ensayo FLIRP Calcium 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Para la preparacion de plaquetas lavadas, se recogio sangre venosa humana de voluntarios libres de farmaco sanos en ACD (citrato de sodio 85 mM, glucosa 111 mM, acido cltrico 71,4 mM) que contenla PGI2 (1,25 ml de ACD conteniendo PGI2 0,2 |jM final; PGI2 procedla de Sigma, St. Louis, MO). El plasma rico en plaquetas (PRP) se prepara mediante centrifugacion a 160 X g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las plaquetas lavadas se prepararon centrifugando PRP durante 10 minutos a 730 g y resuspendiendo el sedimento de plaquetas en CGS (citrato de sodio 13 mM, glucosa 30 mM, NaCl 120 mM; 2 ml de CGS/10 ml de volumen de sangre original). Tras la incubacion a 37 °C durante 15 minutos, las plaquetas se recogen mediante centrifugacion a 730 g durante 10 minutos y se resuspenden a una concentracion de 3 X 108 plaquetas/ml en tampon de Hepes-Tyrode (Hepes 10 mM, NaCl 138 mM, glucosa 5,5 mM, KCl 2,9 mM, NaHCO3 12 mM, pH 7,4). Esta suspension de plaquetas se mantiene >45 minutos a temperatura ambiente antes de su uso en los ensayos de movilizacion de calcio.
Para los experimentos de movilizacion de calcio en placas de 96 pocillos, se incubaron volumenes equivalentes de 3 X 108 plaquetas lavadas/ml con volumenes equivalentes del Reactivo de Ensayo Calcio-3 A resuspendido en Solucion Salina Balanceada de Hank 1 X, pH 7,4, tampon Hepes 20 mM. El volumen total de reaccion de 0,2 ml/pocillo incluye la mezcla de plaquetas lavadas 1,5 x 108/ml/reactivo de Ensayo Calcio-3 A, Eptifibatida 10 jM (Millennium Pharmaceuticals Inc, Cambridge, MA), diluciones en serie (1:3) de los compuestos de prueba en DMSO al 0,75 %. Se anade solo DMSO a 1 pocillo de cada conjunto de 8 para permitir una lectura de movilizacion de calcio maxima. Tras 20 minutos de preincubacion a temperatura ambiente se carga el lector de microplacas de 96 pocillos en la FlexStation (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif). Las condiciones experimentales de FlexStation para medir la movilizacion de calcio se ajustan utilizando SOFTMax Pro. Los parametros utilizados se detallan a continuacion. Modo de los parametros del ensayo de fluorescencia: flex, excitacion 485 nM, 525 nM con un llmite de 515 nM; parametros- sensibilidad de TFS- 6, alto de pipeta 230 jl, tiempo de lectura 2 minutos y 40 segundos, intervalos de lectura 2 segundos, temperatura-23-25 °C. Tras 18 segundos de lectura basal, la movilizacion de calcio se inicia mediante la adicion de Convulxina a una concentracion final de 125 ng/ml. La inhibicion de la movilizacion de calcio se calculo como la respuesta maxima observada con inhibidor, en comparacion con la de sin inhibidor. Las CI50 se obtuvieron mediante analisis de la regresion no lineal.
Inhibicion de la agregacion de plaquetas mediada por Convulxina In Vitro
Para la preparacion de plasma rico en plaquetas humano para los ensayos de agregacion, se recogio sangre venosa humana de voluntarios libres de farmaco sanos, en citrato de sodio al 0,38 % (0,013 M, pH 7,0 final). Se prepara plasma rico en plaquetas (PRP) mediante centrifugacion de sangre entera a 160 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente. La capa de PRP se retira, se transfiere a un tubo nuevo y se ajusta el recuento de plaquetas, si es ventajoso, para conseguir una concentracion de plaquetas de ~3 x 108 plaquetas/ml utilizando plasma pobre en plaquetas (PPP). El PPP se preparar mediante centrifugacion de la muestra de sangre restante (despues de retirar el PRP) durante 20 minutos a 800 x g. Despues, puede utilizarse la preparacion de PRP para los ensayos de agregacion en placas de 96 pocillos o en agregometrla de cubeta convencional.
La inhibicion de la agregacion inducida por Convulxina se determina en placas de microtitulacion de fondo plano de 96 pocillos, utilizando un agitador de placas de microtitulacion y un lector de placas, similar al procedimiento descrito en Frantantoni et al., Am. J. Clin. Pathol. 94, 613 (1990). Todas las etapas se realizan a temperatura ambiente. Para la agregacion en placas de 96 pocillos utilizando plasma rico en plaquetas (PRP), el volumen de reaccion total de 0,2 ml/pocillo incluye 190 jl de PRP (~3 x 108 plaquetas/ml, vease anteriormente), y 5 jl de dilucion en serie de los compuestos de prueba en DMSO al 30 % o tampon (para los pocillos de control). Despues de 20 minutos de
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preincubacion a temperatura ambiente, se anaden a cada pocillo 5 pi de agonista Convulxina 320 ng/ml para dar una concentracion final de Convulxina 8 ng/ml. Despues, las placas se agitan durante 5 min en un agitador de placas de microtitulacion y se obtiene la lectura de 5 minutos en el lector de placas de microtitulacion (Softmax, Molecular Devices, Menlo Park, Calif.). La agregacion se calcula a partir de la reduccion de la DO a 650 nm a t=5 minutos. Las CI50 se obtienen mediante analisis de regresion no lineal.
La inhibicion de la agregacion inducida por Convulxina tambien se determino para los ensayos de agregacion de transmitancia luminosa en cubeta, se prepararon diluciones en serie (1:2) del compuesto de prueba en DMSO al 30 % en una placa de fondo en V de 96 pocillos (la concentracion de DMSO final en la cubeta fue del 0,3 %). El compuesto de prueba (5 pl de diluciones en serie en DMSO) se preincubo con PRP durante 20 minutos, antes del inicio de las reacciones de agregacion, que se realizan en un agregometro ChronoLog mediante la adicion de agonista (Convulxina 125-250 ng/ml) a 495 pl de PRP, a 37 °C. La reaccion de agregacion se registra durante 4 m, y el grado maximo de agregacion se determina por la diferencia del grado de agregacion basal en comparacion con la agregacion maxima que se produce durante el periodo de 4 minutos del ensayo. La inhibicion de la agregacion se calculo como la agregacion maxima observada con inhibidor, en comparacion con la de sin inhibidor. Las CI50 se obtuvieron mediante analisis de regresion no lineal.
En las Tablas 1-5 se proporcionan los ejemplos de compuestos y sus valores de CI50 de syk y PRP.
Ensayo de flujo de calcio en celulas Ramos inducido por entrecruzamiento del BCR
3 o 4 dlas antes de los experimentos se subcultivan celulas Ramos (2G6.4C10, linfoma de Burkitt, Numero de Artlculo de la ATCC: CRL-1923) a 5 x 105 celulas/ml en medio recien preparado. Las celulas se recogen y resuspenden en medio fresco a 8 x 106 celulas/ml antes de la carga de colorante. Se anade un volumen equivalente de colorante de carga de Calcio 3 (Molecular Device) y se mezcla en la suspension celular. Las celulas de carga se dispensan en una placa de 96 pocillos y se incuban 30 m. Despues, se anaden los compuestos en las celulas cargadas con colorante y se incuba durante otros 30 m. Se centrifuga a 1000 rpm durante 3 min antes de la medida de fluorescencia en FlexStation. La estimulacion del BCR se efectua mediante la adicion de anticuerpo 5 pg/ml (fragmento F(ab')2 anti IgM humana de burro AffiniPure, Jackson ImmunoResearch Laboratories).
Ensayo de flujo de calcio en celulas Jurkat inducido por el entrecruzamiento del TCR
El protocolo es muy similar al de flujo de calcio de linfocitos B como se describe en la seccion anterior. Las unicas diferencias son que los linfocitos T (clon E6-1, leucemia de linfocitos T aguda, Numero de Artlculo de la ATCC: Tib-152) y el anti CD3 humano (anti CD3 humano purificado para calidad funcional, clon OKT3, eBioscience, n.° 16-0037) reemplazan a los linfocitos B y al anti IgM humana. La densidad celular se mantiene igual pero el anticuerpo se utiliza a una concentracion de 100 ng/ml.
Secrecion de IL-2 en celulas Jurkat inducida por el entrecruzamiento del TCR
Los procedimientos de propagacion de celulas Jurkat y de incubacion del compuesto son los mismos que los descritos en el ensayo de flujo de calcio de Jurkat en la seccion anterior. El anticuerpo (anti CD3, OKT3) se recubre en una placa nueva (sin celulas) a 100 ng/pocillo. Las celulas se suspenden a 8 x 106 celulas/ml y se incuban con los compuestos durante 30 min en una placa separada. Al final de la incubacion, las celulas se transfieren a la placa recubierta con anticuerpo y se incuban durante 16 horas. Para la medicion de IL-2 despues de la incubacion, se utilizan 100 pl de medio de celulas despues de la incubacion. El nivel de IL-2 se determina utilizando un kit de ELISA de IL-2 (kit de ELISA de IL-2 humana II, BD Bioscience, n.°. 550611).
Ejemplo 333 Exploracion de Upstate KinaseProfiler™ de Millipore
Este ensayo es una medicion directa del efecto del compuesto sobre la actividad catalltica de JAK3. Se obtuvo de celulas de insecto la secuencia (resto 781 - extremo C) de la JAK3 humana purificada (GenBank AF513860). La hidrolisis catalltica del ATP se mide utilizando un metodo de union de filtro radiometrico. La incubacion de la quinasa con 33[P]ATP y sustrato conduce a la incorporation de 33[P] en el sustrato, que despues puede separarse de los otros componentes de la reaccion mediante filtration. Los ensayos se realizaron utilizando ATP 10 pM y ausencia o presencia de compuesto 1, 0,3 o 0,1 pM. La actividad se expreso como % de inhibicion del control.
Tabla 8: inhibicion (%) de la actividad catalftica de JAK3 por el compuesto a 1, 0,3 o 0,1 pM, como se determino por ___________________________Millipore utilizando su ensayo KinaseProfiler.___________________________
Compuesto
Concentracion ( pM)
1 pM
0,3 pM 0,1 pM
l ^ h3c n^i nh o XW'" H
98 96 97
i° A h3c" Ah o H
100 84 ND
ND: no determinado
Ejemplo 334 Exploration Ambit KinomeScan 5
Este ensayo es un ensayo de union de competition, dependiente de sitio de ATP, en el que las quinasas humanas de interes se fusionan a una etiqueta patentada (bacteriofago T7). La cantidad de quinasa unida a un ligando dirigido a sitio activo inmovilizado se mide en presencia y ausencia del compuesto de prueba. Los ensayos de JAK de Ambit utilizan dominios de quinasa y no las protefnas de longitud completa. El dominio utilizado para la union de JAK1 es el 10 pseudodominio quinasa mientras que el de la union a JAK3 es el dominio catalftico (Mazen W Karaman, Sanna Herrgard, Daniel K Treiber, et al. A Quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity. Nature Biotechnology, 2008, Volumen 26, n.° 1, Pagina 127-132).
Tabla 9a: Valores de KD (nM) para la inhibicion por la union del compuesto de JAK1 y JAK3 a ligando inmovilizado ______________________________en el ensayo KinomeScan de Ambit._____________________________
Compuesto
JAK1 JAK3
° A h3c"°^A^ NH 0 W' H Referencia
6,7 2,9
O^NHCH3 |A AH 9 n^A^nh2 H Referencia
11 3
A H3C" ^NH 0 AxA”"- H
4,7 2,7
O^NH2 fi Ah ? ^"XXIJ NH2 N N H Referencia
14 4,1
Tabla 9b Potencia y especificidad de la inhibicion de las quinasas (CI50 en nM)
Compuesto
Syk Jak 1 Jak 2 Jak 3
EJEMPLO 99
15 6,7 3,2 0,8
P420-89
31 6,2 2,0 0,6
5
Tabla 10: Inhibicion de las cinasas en Kd (nM) (Ambit Panel)
N N H %o A, H3C' "N'A nh 0 H o^nh2 H
Referencia Referencia
JAK1 (Dom. Quin. 1)
6,7 4,7 14
JAK2 (Dom. Quin. 2)
5,1 5,1 10
JAK3 (Dom. Quin. 2)
2,9 2,7 4,1
Syk
98 4,5 9,4
5
10
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30
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50
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Ejemplo 335 ensayo celular de JAK3/STAT6
La estimulacion de linfocitos B Ramos por interleucina 4 (IL4) conduce a la senalizacion a traves de JAK1/JAK3, lo que da como resultado la fosforilacion de STAT6 (transductores de senal y activadores de la transcripcion). El efecto de los compuestos sobre la inhibicion de JAK3 y/o JAK1 se puede evaluar midiendo la cantidad de STAT6 fosforilada. Esto se realiza mediante transferencia de Western utilizando un anticuerpo especlfico fosfo-STAT6.
Los linfocitos B Ramos se suspenden en medio RPMI tamponado con Hepes 10 mM (2 x 107 celulas/ml). Las celulas (90 pl) se incubaron con 10 pl de interleucina 4 (R & D Systems Inc, n.° de cat. 204-IL; concentracion final: 0,33 pg/ml) 3,3 pg/ml. Las incubaciones fueron durante 10 min a 37 °C en ausencia o presencia de 2 pl de compuesto diluido en DMSO al 30 %. Las reacciones se finalizaron mediante la adicion de un volumen equivalente de tampon de lisis 2x (TRIS-HCl 100 mM pH 8,0, Triton-X-100 al 2 %, EDTA 5 mM, NaCl 250 mM, glicerol al 20 %, PMSF 1,25 mM, ortovanadato de sodio 5 mM, p-glicerofosfato 5 mM, coctel inhibidor de proteasas de EDTA mini completo (Sigma)).
Las muestras se incubaron con 1 pl de la nucleasa benzonasa (Novagen, n.° de cat. 71205-3) durante 1 hora, a temperatura ambiente y despues se anadieron 50 pl de tampon de carga 5x (TRIS 330 mM pH 6,8, SDS al 9,5 %, glicerol al 34 %, azul de bromofenol al 0,01 %, beta-mercaptoetanol al 10 %).
Los lisados celulares (15 pl) se sometieron a SDS-PAGE (geles de TRIS-glicina al 4-12 % Novex, Invitrogen) en condiciones reductoras, seguido de electro-transferencia a membranas de nitrocelulosa. Despues, las membranas se incubaron en tampon de bloqueo Zymed (Invitrogen) durante 1 h a temperatura ambiente (TA), despues una noche a 4 °C con el anticuerpo primario anti fosfotirosina-STAT6 (Cell Signaling Technology, n.° de cat. 9364) 1:500 en tampon de bloqueo Zymed. A continuation de 5 x 10 min lavados con solution salina tamponada con Tris, NP40 al 0.25 % (TBSN), las transferencias se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en presencia del anticuerpo secundario anti conejo en burro conjugado a HRP (Amersham Biosciences, n.° de cat. NA934V) 1:10.000 en tampon de bloqueo Zymed. Despues de 4 x 10 min lavados con TBSN, las transferencias se visualizaron por ECL (Pierce Western Lightening, Perkin Elmer n.° de cat. NEL101). Para determinar el contenido total de p3, las transferencias se separaron, se lavaron 4 x con TBSN, y se resondearon con anticuerpo C3A 1:2000 en tampon de bloqueo durante una noche a 4 °C. Despues de 4 x 10 min lavados con TBSN, las transferencias se incubaron con el anticuerpo secundario anti raton en cabra 1:10.000 en tampon de bloqueo, se lavaron 4 veces mas con TBSN y se expusieron al reactivo Western Lightening. Los niveles de estimulacion por encima del fondo y el grado de inhibicion del compuesto se determinan por densitometrla.
Ejemplo 336 Ensayo de inhibicion de la actividad de la JAK quinasa para la llnea de linfocitos B Ramos estimulada con iL-4
Estos ejemplos ilustran los metodos para evaluar las actividades de JAK quinasa humana de los compuestos de la invention in vitro e in vivo, que se pueden determinar mediante diversos procedimientos conocidos en la tecnica, tales como una prueba de su capacidad para inhibir la actividad de la JAK quinasa de plasma humana. Las potentes afinidades para la inhibicion de la JAK quinasa humana presentadas por los compuestos de la invencion se pueden medir mediante un valor CI50 (en nM). El valor CI50 es la concentracion (en nM) del compuesto necesaria para proporcionar el 50 % de inhibicion de la actividad de JAK quinasa humana. Cuanto menor es el valor de CI50, mas activo (potente) es un compuesto para la inhibicion de la actividad de la JAK quinasa.
Un ensayo in vitro para la detection y medicion de la actividad de inhibicion frente a la JAK quinasa es como sigue:
La actividad de los compuestos para las JAK quinasas se confirma en ensayos celulares disenado para analizar la inhibicion de JAK. Brevemente, la inhibicion de JAK se analiza en linfocitos T Ramos humanos activados con la citocina interleucina-4 (IL-4). Veinte a 24 horas posestimulacion, las celulas se tinen para la regulation positiva de CD23 y se analizan mediante FACS. La estimulacion de los linfocitos B con IL-4 conduce a la activation de la ruta JAK/sTaT a traves de la fosforilacion de la JAK quinasas JAK1 y JAK3, que a su vez fosforilan y activan los factores de transcripcion STAT-5 y STAT-6. STAT-5 activado regula de forma positiva el receptor de IgE (CD23) de baja afinidad.
Para el ensayo, se cultivan linfocitos B Ramos humanos (ATCC, n.° de catalogo CRL-1596) en medio RPMI 1640 (Cellgro, n.° de catalogo 10-040-CM) conteniendo suero fetal bovino al 10 % (JRH, n.° de catalogo 12106-500M) de acuerdo con el protocolo de propagation suministrado con las celulas, y se mantienen a una densidad de aproximadamente 3,5 X 105 celulas/ml. El dla antes del ensayo, las celulas se diluyen hasta 3,5 X 105 celulas/ml para asegurar que estan en la fase de crecimiento logarltmico. Las celulas se centrifugan y resuspenden en medio RPMI 1640 (Cellgro, MediaTech, Inc., Herndon, Va., n.° de cat. 10-040-CM) conteniendo suero fetal bovino (SFB) al 5-10 %, inactivado por calor (JRH Biosciences, Inc, Lenexa, Kans., n.° de cat. 12106-500M) de acuerdo con el protocolo de propagacion de la ATCC. Las celulas se mantienen a una densidad de 3,5 X 104-5 celulas/ml. El dla antes del experimento, los linfocitos B Ramos se diluyen hasta 3,5 X 105 celulas/ml para asegurar que estan en una fase de crecimiento logarltmico y se dispensan allcuotas en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Las celulas se incuban con el compuesto de prueba (disuelto en DMSO) o en DMSO (control) durante 1 h a 37 °C y
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despues se estimulan con IL-4 (Pepotech, n.° de catalogo 200-04) durante 20-24 horas (la concentration final es 50 unidades/ml).
Las celulas se centrifugan y resuspenden en RPMI con suero al 5 %. Se utilizan 5X104 celulas por punto en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Las celulas se preincuban con compuesto o con control de vehlculo de DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., n.° de cat. D2650) durante 1 hora en una incubador a 37 °C. Despues, las celulas se estimulan con IL-4 (Peprotech Inc., Rocky Hill, N.J., n.° de cat. 200-04) a una concentracion final de 50 unidades/ml durante 20-24 horas. Despues, las celulas se centrifugan y se tinen con anti CD23-PE (BD Pharmingen, San Diego, Calif., n.° de cat. 555711) y se analizan mediante FACS. La detection se realiza utilizando un citometro de flujo BD LSR I System, adquirido en Becton Dickinson Biosciences de San Jose, Calif.
La proliferation se mide utilizando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo.RTM. (Promega), que determina el numero de celulas viables en cultivo a base de la cuantificacion del ATP presente, como un indicador de las celulas metabolicamente activas. El sustrato se descongela y se deja que llegue a temperatura ambiente. Despues de mezclar el reactivo Cell Titer-Glo y el diluyente juntos, se anaden 100 pl a cada pocillo. Las placas se mezclan en un agitador orbital durante dos minutos para inducir la lisis, y se incuban a temperatura ambiente durante diez minutos adicionales para permitir que se equilibre la senal. La deteccion se realiza utilizando un contador de multimarca Wallac Victor2 1420 adquirido en Perkin Elmer, Shelton, Conn.
En el dla dos, las celulas A549 se preincuban con un compuesto de prueba de 2,4-pirimidindiamina o DMSO (control) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., n.° de catalogo D2650) durante 1 hora. Despues, las celulas se estimulan con IFNy (75 ng/ml) (Peprotech Inc., Rocky Hill, N.J., n.° de cat. 300-02) y se deja incubando durante 24 horas. El intervalo de dosis de compuesto de prueba final es 30 pM a 14 nM en 200 pl de medio F12K conteniendo SFB al 5 %, DMSO al 0,3 %.
En el dla tres, el medio celular se retira y las celulas se lavan con 200 pl de PBS (solution salina tamponada con fosfato). Se trata cada pocillo con tripsina para disociar las celulas, despues se neutraliza mediante la adicion de 200 pl de medio F12K completo. Las celulas se sedimentan y se tinen con un anticuerpo anti ICAM-1 (CD54) humana en raton conjugado a APC (BD Pharmingen, San Diego, Calif., n.° de catalogo 559771) durante 20 minutos a 4 °C. Las celulas se lavan con tampon FACS (PBS + SFB al 2 %) enfriado en hielo y la expresion en superficie de ICAM-1 se analiza mediante citometrla de flujo. La deteccion se realiza utilizando un citometro de flujo BD LSR I System, adquirido en BD Biosciences de San Jose, Calif. Los eventos se seleccionan por la dispersion en vivo y se calcula la media geometrica (programa informatico CellQuest version 3.3 de Becton-Dickinson, Franklin Lakes, N.J.). Las medias geometricas se representan frente a la concentracion de compuesto para generar una curva de dosis-respuesta.
Ejemplo 337: Inhibition de la transduction de senal mediada por Syk a traves del receptor de linfocitos B en llneas celulares de linfoma no Hodgkin
Las celulas se pretrataron durante 1 hora con o sin compuesto (0,02 a 2 uM) antes de la estimulacion de la serialization del receptor de linfocitos B mediante la incubation de celulas con anticuerpo anti mu 3 pg/ml durante 10 minutos a 37 °C. El flujo de Ca2+ se midio utilizando el colorante de carga Calcio 3 y la FlexStation (Molecular Device). La senalizacion del receptor de linfocitos B se ensayo mediante fosfo-citometrla de flujo intracelular, siguiendo protocolos suministrados por BD Pharmingen (San Jose, CA). La activation de Syk se midio mediante la induction de la fosforilacion de tirosinas de BLNK en la position de aminoacido 84 (pBLNK Y84) y la induction de la fosforilacion de tirosinas de ERK1/2 en la posicion de aminoacido 204 (pERK Y204). La activacion del miembro de la familia Src Lyn se midio mediante la induccion de la fosforilacion de tirosinas de Syk en la posicion de aminoacido 352 (pSyk y352). Los datos se presentan como las CI50 pM. Cada compuesto inhibio de forma eficaz el flujo de Ca2+ inducido por el receptor de linfocitos B y la activacion de Syk, pero no al miembro de la familia Src Lyn.
Ejemplo 338: la inhibicion de Syk ejerce un efecto antiproliferativo sobre llneas celulares de linfoma no Hodgkin.
Las celulas se incubaron con concentraciones crecientes de cada compuesto, despues se evaluo a las 72 horas la extension de la proliferacion utilizando el ensayo MTT (empresa, ciudad, pals) siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante. Los datos se presentan como valores de CI50 pM, que representan la media mas/menos la desviacion tlpica de 5 o 6 experimentos independientes. Cada compuesto inhibio la proliferacion de las llneas celulares SUDHL-4 y -6, que dependen de Syk para las senales de supervivencia y crecimiento, en el intervalo de pM bajo. Las celulas Toledo, que no necesitan Syk, fueron notablemente menos sensibles a los efectos antiproliferativos de la inhibicion de Syk.
Ejemplo 339: la inhibicion de Syk induce apoptosis en llneas celulares de linfoma no Hodgkin.
Los datos representan dos experimentos independientes para evaluar el efecto de la inhibicion de Syk y Syk/JAK sobre la supervivencia de llneas de linfocitos B de linfoma no Hodgkin difuso largas. Las llneas celulares SUDHL-4 y SUDHL-6 dependen para la supervivencia de la senalizacion del receptor de linfocitos B mediada por Syk, mientras que las celulas Toledo no. Las celulas se incubaron con compuestos en la concentracion y tiempos indicados; la
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induction de la apoptosis se midio mediante citometrla de flujo utilizando el kit de detection de Caspasa 3 (Sigma- Aldrich, Saint Luis, MO). Los datos se presentan como el porcentaje de celulas positivas totales para el marcador de apoptosis Caspasa 3. Como se esperaba, la inhibition de Syk dio como resultado la induccion de la apoptosis en las llneas celulares SUDHL-4 y -6, pero no en la llnea celular Toledo.
Ejemplo 340: Inhibicion de la activation de linfocitos B primarios de raton por los inhibidores de Syk
Se pretrataron esplenocitos primarios de raton durante 1 hora con concentraciones crecientes de cada compuesto (0,05-2 pM) antes de la adicion de control o de suero anti IgD de raton en cabra. La activacion de los linfocitos B inducida por anti IgD se midio 16 horas mas tarde mediante citometrla de flujo, tinendo los marcadores de activacion CD80/86 y CD69.
Ejemplo 341: Modelo de raton de trombocitopenia inmunomediada
La trombocitopenia inmunomediada esta provocada por anticuerpos dirigidos frente a glucoprotelnas de superficie de plaquetas, anticuerpos frente a complejos que contienen farmaco sobre la superficie de plaquetas o mediante celulas recubiertas de anticuerpo o inmunocomplejos que interaction con la superficie de las plaquetas. Se evalua la capacidad de los compuestos seleccionados para inhibir la elimination de plaquetas en un modelo de raton de trombocitopenia mediada por anticuerpos. En este modelo, una rapida eliminacion de plaquetas circulantes (aproximadamente el 50 %) resulta de la administration intravenosa de un anticuerpo anti GPIIb de raton en rata (clon MWReg30) (BD Biosciences, Pharmingen). Para evaluar la capacidad de inhibicion de la eliminacion de plaquetas, los compuestos se suspendieron en metilcelulosa al 0,5 % en agua y se administraron a traves de sonda oral (100 ul/raton) en un momento antes de la inyeccion del anticuerpo, cuando el compuesto alcanzarla la maxima concentration en plasma (normalmente 1 - 2 horas a base de experimentos de farmacocinetica distintos para cada compuesto individual). A las 4 y 8 horas despues de la inyeccion del anticuerpo, se obtuvieron muestras de sangre terminales de los grupos de ratones tratados con vehlculo y con el artlculo de prueba (n=5 - 10 ratones/grupo) a traves de puncion cardiaca. La sangre se anticoagulo utilizando citrato trisodico o EDTA. Se midio en un analizador hematologico el recuento de plaquetas en las muestras de sangre entera (Hemavet, Drew Scientific). La sangre restante se proceso para obtener plasma y se midieron las concentraciones de compuesto mediante espectrometrla de masas.
La eliminacion de plaquetas se determino midiendo la diferencia en el numero de plaquetas entre el grupo de tratamiento sin anticuerpo promedio y los animales a los que se administro el anticuerpo anti GPIIb de raton en rata. La inhibicion de la eliminacion de plaquetas se determino comparando la diferencia entre la eliminacion de plaquetas de los animales tratados con vehlculo y con el compuesto.
Ejemplo 342: Modelo de raton de artritis inducida por anticuerpos para colageno
La actividad inhibidora de los compuestos seleccionados se investigo en un modelo de raton de artritis inducida por anticuerpos para colageno (AIAC). La artritis inducida por colageno esta mediada por autoanticuerpos contra el colageno de tipo II y el complemento, por lo tanto la artritis se puede inducir mediante la administracion de anticuerpos policlonales o una mezcla de anticuerpos monoclonales contra el colageno de tipo II. El modelo AIAC (Chondrex, Inc., Redmond, WA) utiliza una mezcla de 4 clones que reconoce epltopos individuales agrupados dentro de un fragmento peptldico de 83 aminoacidos del colageno de tipo II. Estos epltopos comparten secuencias de aminoacidos comunes del colageno de tipo II de muchas especies distintas, que incluyen pollo, raton, rata, bovino, porcino, mono y ser humano. El modelo utiliza un coctel de anticuerpos monoclonales seguido de lipopolisacarido bacteriano (LPS) para inducir al cabo de 7 dlas una grave y consistente artritis en ratones. Este modelo se desarrollo a base de la hipotesis de que las toxinas bacterianas absorbidas a traves del tracto gastrointestinal desempenan un papel sinergico y patologico con los autoanticuerpos contra el colageno de tipo II, en el desencadenamiento de artritis en pacientes con Artritis Reumatoide.
Para estos experimentos, el coctel de anticuerpos monoclonales (n.° de Lote OC-708) se inyecto por via intravenosa a traves de la vena de la cola a una dosis de 4 mg/raton (40 mg/ml) en el dla 0, seguido de inyeccion intraperitoneal de LPS diluida en solution salina normal a una dosis de 25 ug/raton en ratones Balb/C hembra de 8 semanas de edad (Charles River, Inc.). La dosificacion de los artlculos de prueba se inicio justo antes o despues de la inyeccion IV del coctel de anticuerpos. Los compuestos se suspendieron en metilcelulosa al 0,5 % en agua y se administraron a traves de sonda oral (100 ul/raton) de forma diaria durante el estudio de 7-10 dlas. Las puntuaciones de inflamacion cllnica se obtuvieron de forma diaria. Las puntuaciones de la inhibicion de inflamacion cllnica se determinaron al final del experimento a base de la diferencia entre los ratones tratados con vehlculo y con el artlculo de prueba. Las concentraciones en plasma representan la concentracion pico a una hora despues de la ultima dosis en el dla de finalization del estudio.
Ejemplo 343: Inhibicion de la fosforilacion de Stat-6 por JAK1/3 inducida por IL-4 en linfocitos B Ramos
Se pretrataron linfocitos B Ramos durante 1 hora con concentraciones crecientes de compuesto, como se indica, antes de la adicion de IL-4. Las celulas se incubaron con IL-4 durante 10 minutos y despues se sometieron a
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citometrla de flujo intracelular para medir el porcentaje de inhibicion de Stat-6 inducido por IL-4.
Ejemplo 344: Inhibicion de la fosforilacion de Stat-6 por JAK1/3 inducida por IL-4 en linfocitos B Ramos
Se pretrataron linfocitos B Ramos durante 1 hora con concentraciones crecientes de compuesto, como se indica, antes de la adicion de IL-4. Las celulas se incubaron con IL-4 durante 10 minutos, y despues se sometieron a citometrla de flujo intracelular para medir el porcentaje de inhibicion de Stat-6 inducido por IL-4.
Ejemplo 345: Ensayo de proliferacion de linfocitos T humanos primarios estimulados con IL-2
Los linfocitos T humanos primarios obtenidos de sangre periferica y preactivados a traves de la estimulacion del receptor de linfocitos T y CD28 proliferan in vitro en respuesta a la citocina Interleucina-2 (IL-2). Esta respuesta proliferativa es dependiente de la activacion de las tirosina quinasas JAK-1 y JAK-3, que fosforilan y activan al factor de transcripcion Stat-5.
Los linfocitos T primarios humanos se preparan como sigue. Se obtiene sangre entera de un voluntario sano, se mezcla 1:1 con PBS, deposita sobre Ficoll Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J., n.° de catalogo 17-1440-03) en una proporcion de sangre/PBS:ficoll 2:1 y se centrifuga durante 30 min a 4 °C a 1750 rpm. Se recuperan los linfocitos en la interfase suero:ficoll y se lavan dos veces con 5 volumenes de PBS. Las celulas se resuspenden en medio de Yssel (Gemini Bio-products, Woodland, Calif., n.° de catalogo 400-103) conteniendo IL2 recombinante (R and D Systems, Minneapolis, Minn., n.° de catalogo 202-IL (20 pg)) 40 U/ml y se siembran en un matraz prerrecubierto con anti CD3 (BD Pharmingen, San Diego, Calif., n. de catalogo 555336) 1 pg/ml y anti CD28 (Immunotech, Beckman Coulter of Brea Calif., n.° de catalogo IM1376) 5 pg/ml. Los linfocitos T primarios se estimulan durante 3 a 4 dlas, despues se transfieren a un matraz reciente y se mantienen en RPMI con SFB al 10 % e IL-2 40 U/ml.
Los linfocitos T primarios se lavan dos veces con PBS para eliminar la IL-2 y se resuspenden en medio de Yssel a 2X106 celulas/ml. Se anaden 50 pl de suspension de celulas conteniendo IL-2 80 U/ml a cada pocillo de una placa negra de 96 pocillos de fondo plano. Para el control no estimulado, se omite IL-2 en la ultima columna de la placa. Los compuestos se diluyen en serie con dimetilsulfoxido (DMSO puro al 99,7 %, probado en cultivo celular, Sigma- Aldrich, St. Louis, Mo., N.° de catalogo D2650) desde 5 mM en diluciones en serie con factor 3, y despues se diluyen 1:250 en medio de Yssel. Se anaden 50 pl del compuesto 2X por pocillo por duplicado y se permite que las celulas proliferen durante 72 horas a 37 °C.
La proliferacion se mide utilizando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo.RTM. (Promega), que determina el numero de celulas viables en cultivos a base de la cuantificacion del ATP presente, como un indicador de celulas metabolicamente activas. El sustrato se descongela y se permite que alcance la temperatura ambiente. Despues de mezclar el reactivo de Cell Titer-Glo y el diluyente juntos, se anaden 100 pl a cada pocillo. Las placas se mezclan sobre un agitador orbital durante dos minutos para inducir la lisis y se incuban a temperatura ambiente durante diez minutos adicionales para permitir que se equilibre la senal. La deteccion se realiza utilizando un contador de multimarca Wallac Victor2 1420 adquirido en Perkin Elmer, Shelton, Conn.
Ejemplo 346. Llnea epitelial A549 estimulada con IFNy
Las celulas epiteliales de pulmon A549 regulan de forma positiva la expresion en superficie de ICAM-1 (CD54) en respuesta a una diversidad de estlmulos distintos. Por lo tanto, utilizando la expresion de ICAM-1 como lectura, se pueden evaluar en el mismo tipo celular los efectos del compuesto sobre distintas rutas de senalizacion. IFNy regula de forma positiva a ICAM-1 a traves de la activacion de la ruta JAK/Stat. En este ejemplo, se evalua la regulacion positiva de ICAM-1 por IFNy.
La llnea celular de carcinoma epitelial de pulmon A549 se origina en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo. El cultivo de rutina es con medio F12K (Mediatech Inc., Lenexa, Kans., n.° de Cat. 10-025-CV) con suero fetal bovino al 10 %, penicilina 100 U.I. y estreptomicina 100 ng/ml (medio F12k completo). Las celulas se incuban en una atmosfera humidificada de CO2 al 5 % a 37 °C. Antes del uso en el ensayo, las celulas A549 se lavan con PBS y se tratan con tripsina (Mediatech Inc., n.° de Cat. 25-052-CI) para levantar las celulas. La suspension celular con tripsina se neutraliza con medio F12K completo y se centrifuga para sedimentar las celulas. El sedimento celular se resuspende en medio F12K completo a una concentration de 2,0X105/ml. Se siembran 20.000 celulas por pocillo, en un volumen total de 100 pl, en una placa de cultivo de tejidos de fondo plano y se permite que se adhieran durante una noche.
Al segundo dla, las celulas A549 se preincuban con un compuesto de prueba de 2,4-pirimidina diamina o DMSO (control) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., n.° de catalogo D2650) durante 1 hora. Despues, las celulas se estimulan con IFNy (75 ng/ml) (Peprotech Inc., Rocky Hill, N.J., n.° de Cat. 300-02) y se permite la incubation durante 24 horas. El intervalo de dosis del compuesto de prueba final es 30 pM a 14 nM en 200 pl de medio F12K conteniendo SFB al 5 %, DMSO al 0,3 %.
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El dla tres, el medio celular se retira y las celulas se lavan con 200 |jl de PBS (solucion salina tamponada con fosfato). Cada pocillo se trata con tripsina para disociar las celulas, despues se neutraliza mediante la adicion de 200 jl de medio F12K completo. Las celulas se sedimentan y se tinen con un anticuerpo anti ICAM-1 (CD54) humano en raton conjugado a APC (BD Pharmingen, San Diego, Calif., n.° de catalogo 559771) durante 20 minutos a 4 °C. Las celulas se lavan con tampon de FACS (PBS + SFB al 2 %) enfriado en hielo y la expresion en superficie de ICAM-1 se analiza mediante citometrla de flujo. La deteccion se realiza utilizando el citometro de flujo bD LSR I System, adquirido en BD Biosciences de San Jose, California. Los sucesos se clasifican por la dispersion en vivo y se calculan las medias geometricas (programa informatico CellQuest version 3.3 de Becton-Dickinson, Franklin Lakes, N.J.). Las medias geometricas se representan frente a la concentracion de compuesto para generar una curva de dosis-respuesta.
Ejemplo 347. Ensayo de FACS de ICAM1 por IFNy en U937
Las celulas monoclticas humanas U937 regulan de forma positiva la expresion en superficie de ICAM-1 (CD54) en respuesta a una diversidad de estlmulos distintos. Por lo tanto, utilizando la expresion de ICAM-1 como lectura, se pueden evaluar en el mismo tipo celular los efectos del compuesto sobre distintas rutas de senalizacion. IFNy regula de forma positiva a ICAM-1 a traves de la activacion de la ruta JAK/Stat. En este ejemplo, se evalua la regulacion positiva de ICAM-1 mediante IFNy.
La llnea de celulas monoclticas humanas U937 se obtiene de la ATCC de Rockville, Md., numero de catalogo CRL-1593.2, y se cultiva en medio RPMI-1640 conteniendo SFT al 10 % (v/v). Las celulas U937 se crecen en RPMI al 10 %. Despues, las celulas se siembran en placa a una concentracion de 100.000 celulas por 160 jl, en placas de fondo plano de 96 pocillos. Despues, se diluyen los compuestos de prueba como sigue: el compuesto de prueba 10 mM se diluye en DMSO 1:5 (3 jl de compuesto de prueba 10 mM en 12 jl de DMSO), seguido de una dilucion en serie 1:3 del compuesto de prueba en DMSO (6 jl del compuesto de prueba diluido en serie en 12 jl de DMSO para dar diluciones con factor 3). Despues, se trasfieren 4 jl del compuesto de prueba a 76 jl de RPMi al 10 % dando como resultado una solucion 10X (compuesto de prueba 100 jM, DMSO al 5 %). Para los pocillos de control, se diluyen 4 jl de DMSO en 76 jl de RPMI al 10 %.
El ensayo se realiza por duplicado con 8 puntos (8 concentraciones en diluciones con factor 3 desde 10 jl) y con 4 pocillos solo con DMSo (pocillos de control) en condiciones estimuladas y 4 pocillos con solo DMSO en condiciones no estimuladas.
La placa de compuesto diluida se mezcla 2X utilizando un multimek (Beckman Coulter de Brea, Calif.) y despues se trasfieren 20 jl de los compuestos diluidos a la placa de 96 pocillos conteniendo 160 jl de celulas, que despues se mezclan otra vez dos veces a velocidades bajas. Despues, las celulas y los compuestos se preincuban durante 30 minutos a 37 °C con CO2 al 5 %.
La mezcla de estimulacion 10X se prepara preparando una solucion de IFNy humana 100 ng/ml en RPMI al 10 %. Despues, las celulas y el compuesto se estimulan con 20 jl de mezcla de estimulacion de IFNy para dar una concentracion final de IFNy 10 ng/ml, compuesto de prueba 10 jM y DMSO al 0,5 %. Las celulas se mantienen en condiciones para la estimulacion durante 18-24 horas a 37 °C con CO2 al 5 %.
Para la tincion las celulas se transfieren a una placa de fondo redondeado de 96 pocillos y despues se mantienen en hielo durante la duracion del procedimiento de tincion. Las celulas se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos a 4 °C, despues de lo cual el sobrenadante se retira. Despues de retirar del sobrenadante, se anade 1 jl de anticuerpo anti ICAM-1 humano en raton, conjugado a APC por 100 jl de tampon FACS. Despues, las celulas se incuban en hielo en oscuridad durante 30 minutos. Despues de la incubacion, se anaden 150 jl de tampon FACS y las celulas se centrifugan a 1000 rpm durante 5 minutos a 4 °C, despues de lo cual se retira el sobrenadante. Despues de retirar del sobrenadante, se anaden 200 jl de tampon de FACS y las celulas se resuspenden. Despues de la suspension, las celulas se centrifugan a 1000 rpm durante 5 min a 4 °C. Despues, el sobrenadante se retira antes de la resuspension de las celulas en 150 jl de tampon FACS.
La deteccion se realiza utilizando un citometro de flujo BD LSR I System, adquirido en BD Biosciences de San Jose, California. Las celulas vivas se seleccionan por dispersion en vivo y se mide la media geometrica de ICAM-APC (programa informatico CellQuest version 3.3 de Becton-Dickinson, Franklin Lakes, N.J.). Se analiza el % de celulas vivas y de expresion de ICAM-1. Los ensayos para los compuestos de prueba se llevan a cabo en paralelo con un compuesto de control de actividad conocida. Normalmente la CE50 para el compuesto de control es 40-100 nM.
Ejemplo 348. Analisis de la senalizacion de linfocitos B:
Las llneas de linfocitos B de linfoma no Hodgkin humanas SUDHL-4 (n.° ACC 495), SUDHL-6 (n.° ACC572) y Karpas-422 (n.° ACC32) se obtuvieron de DSMZ (Braunschweig, Alemania); las Toledo (n.° CRL-2631) y Ramos (n.° CRL-1596) se obtuvieron de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC; Manassas, VA). Todas las celulas se mantuvieron en medio RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con suero de ternera fetal al 10 % (ATCC) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen), y se mantuvieron a 37 °C en un incubador de cultivo de tejidos
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humidificado. Los anticuerpos utilizados en estos estudios incluyen el anticuerpo policlonal de cabra F(ab)'2 anti IgG humana (H+L) y anti IgM humana (BioSource, Camarillo, CA); el anti Syk humana de conejo, el anti fosfo-Syk (Y525/526) humana de conejo, anti fosfo-Syk (Y352) humana en conejo, anti BLNK humana, anti fosfo-BLNK (Y84) humana se obtuvieron de Cell Signaling Technologies, Inc. (Danvers, MA). Para la fosfo citometrla de flujo se obtuvieron los siguientes anticuerpos de Becton Dickinson (San Jose, CA): anti fosfo-STAT6 (Y641) humano de raton conjugado a Alexa fluor 488; anti fosfo-Zap70 (Y319)/Syk(Y352) humano de raton conjugado a ficoeritrina (PE) y anti fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) humano de raton conjugado a isotiocianato de fluorescelna (FITC).
La fosfocitometrla de flujo se realizo esencialmente como se describe en otros sitios (Irish, Czerwinski et al. Blood 108(9): 3135-42 (2006). Se estimularon 0,5x106 celulas en medio de cultivo con anticuerpo anti-p o anti-Y 1 pg/ml durante 10 minutos. La senalizacion inducida se finalizo inmediatamente despues del tiempo indicado, mediante la adicion de paraformaldehldo (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) hasta una concentracion final del 1 %. Las celulas se incubaron con paraformaldehldo durante 5 minutos a temperatura ambiente, se lavaron una vez con solucion salina tamponada con fosfato (PBS), despues se resuspendieron e incubaron durante una noche a 4 °C en metanol preenfrlado (-80 °C) (empresa, direction). Posteriormente las celulas fijadas y permeabilizadas se lavaron una vez en PBS, una segunda vez en PBS que contenla seroalbumina bovina (BSA) al 1 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y despues se tineron con los anticuerpos indicados diluidos 1:20 en PBS + BSA al 1 %. Tras 30 minutos, las celulas se lavaron una vez en PBS y se sometieron a citometrla de flujo utilizando FACS Calibur (Becton Dickinson). Para los analisis de transferencia de Western, se estimularon 106 celulas durante 30 minutos con 2 pg/ml de los anticuerpos especlficos para el BCR indicados. La senalizacion se finalizo resuspendiendo las celulas en tampon de lisis e incubando en hielo durante 1 hora. Los residuos celulares se eliminaron por centrifugation y los lisados de protelna clarificados se resolvieron en SDS-PAGE al 10 % y se sondearon con los anticuerpos indicados siguiendo las recomendaciones hechas por los fabricantes. Cuando se indica, las celulas se pretrataron durante 1 hora a 37 °C con inhibidores de Syk o con control de vehlculo (DMSO al 0,5 %) a varias concentraciones antes de la estimulacion con anticuerpo anti BCR.
Ejemplo 349. Inhibition selectiva de la actividad de Syk.
Se analizo la capacidad de los compuestos para inhibir a Syk purificada. Se encontro que P459-72 y P505-15 (dos compuestos de una serie especlfica para Syk como se muestra en la Tabla 9b) y el ejemplo 100b (de una serie con actividades inhibidoras de Syk y JAK duales) suprimen la actividad de la Syk quinasa con las CI50 de 43 nM, 6 nM y 31 nM, respectivamente. La selectividad de estos compuestos por Syk se determino explorando cada uno frente a un panel de 270 quinasas purificadas independientes a 300 nM (Millipore). Se calculo el porcentaje de inhibicion con respecto al vehlculo de control y los numeros se convirtieron a un mapa de calor; la no inhibicion se representa como verde, la mezcla creciente con rojo indica porcentaje de inhibicion creciente con el amarillo representando el 50 % de inhibicion y el rojo representando el 100 % de inhibicion (Figura 8). Como se representa en la Figura 8A, P459-72 y P505-15 fueron altamente especlficos para Syk (primera y segunda filas, respectivamente) mientras que el ejemplo 100b inhibio a multiples quinasas (tercera fila). El subconjunto de quinasas que se inhibieron en >80 % por cualquiera de los tres compuestos se muestran en la Figura 8B. El ejemplo 100b inhibio a Syk y MLK-1 (primera fila). A 300 nM, P505-15 inhibio 10 quinasas distintas (segunda fila). Cuando se reanalizo a 50 nM (aproximadamente 10x por encima de su valor CI50 de Syk de 6 nM), sin embargo, Syk no fue la unica quinasa que se mantuvo inhibida (tercera fila). P420-89 inhibio Syk, JAK2 y JAK3, junto con varias de otras quinasas (cuarta fila).
Empleando el panel Milipore de quinasas purificadas, P505-15 (CI50 = 1 nM) inhibio el 98 % de la actividad de la quinasa Syk purificada a 50 nM. Los valores de CI50 se determinaron para las quinasas que se inhibieron en >80 % a 300 nM en el panel de quinasas de Millipore.
Quinasa
CI50 (nM)
Syk(h)
1
MLK1
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Fgr(h)
81
Yes(h)
123
Flt3(h)
139
PAK5
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Lyn(h)
199
cSRC(h)
244
Lck(h)
300
En cambio, el inhibidor de multiquinasas P420-89 es mas semejante a R788 de Rigel. A 300 nM, P420-89 inhibio a Syk en el 88 %, junto con > 80 % de inhibicion de 32 quinasas adicionales. Entre estas estaban JAK 2 y 3 (inhibidas el 93 % y el 85 %, respectivamente), Flt-3 (inhibidas el 83-92 %) y cKit (inhibidas el 95-97 %), todas dianas para la manipulation terapeutica de la funcion linfocltica.
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Ejemplo 350. Ensayo de flujo de calcio e inhibicion selectiva de Syk en ilneas de linfocitos B de linfoma no Hodgkin.
Las celulas Ramos se cultivaron (manteniendo aproximadamente 0,5 x 106 celulas/ml) en medio de cultivo 3 a 4 dlas antes de los experimentos. Las celulas se recogieron y se resuspendieron en medio recien preparado a 8x106 celulas/ml antes de la carga de colorante. Se anadio a las suspensiones celulares un volumen equivalente de colorante de carga Calcio 3 (Molecular Device, Sunneyvale, CA). Las celulas cargadas se dispensaron en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 20 minutos. Despues, los inhibidores de Syk se anadieron a las celulas cargadas y se incubaron durante otros 30 minutos. Los linfocitos B se estimularon con anticuerpo anti p 5 pg/ml. Los cambios en la concentracion de Ca2+ intracelular se midieron utilizando la FlexSTATion (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
La selectividad y potencia de la inhibicion de Syk en linfocitos B se investigo inicialmente mediante transferencia de Western, midiendo la induccion de pSyk Y525/526 y pBLNK Y84 mediada por el BCR, ambas medidas de la actividad de la Syk quinasa, y la induccion de pSyk Y352, una medida de la actividad de la Src quinasa. Los linfocitos B SUDHL-6 se estimularon con anticuerpo especlfico anti BCR durante 30 minutos en presencia o ausencia de cada uno de los inhibidores de Syk o de control de vehlculo. El tratamiento con 0,16 o 1 pM de cada compuesto redujo la autofosforilacion de Syk (Y525/526) inducida por BCR en aproximadamente el 40 % y el 60 %, respectivamente, como se estimo mediante densitometrla (datos no mostrados). Se utilizo un intervalo expandido de concentraciones para evaluar adicionalmente el efecto de estos compuestos sobre la actividad de Syk y Src quinasa inducida por el bCr. Como se muestra en la Figura 9, A-C, cada compuesto inhibio la actividad de Syk (pBLNK Y84) con valores de CI50 que varlan desde 0,16 a 1 pM, aunque no se observo efecto sobre la actividad de Scr (pSyk Y352) a tan alto como 2,5 pM.
Tambien se midio la capacidad de cada compuesto para suprimir los sucesos de senalizacion mas distantes del BCR. Las celulas se estimularon otra vez mediante el anticuerpo anti BCR en presencia o ausencia de diversas concentraciones de cada inhibidor de Syk. La induccion de pSyk Y352 se midio como un control de especificidad, mientras que la de pERK1/2 T202/Y204 se utilizo como una medida de la senalizacion dependiente de Syk mas distante (Jiang, Craxton et al. J Exp Med 188(7): 1297-306 (1998)). La Figura 12C muestra las representaciones de FACS representativos que representan el efecto del inhibidor mas especlfico y potente de Syk de los tres, P505-15, sobre la senalizacion del BCR. A 125 nM, la activacion de ERK1/2 se suprimio de forma completa, mientras que las celulas estimuladas todavla se tenlan de forma positiva para Syk Y352. Este experimento se repitio, en donde se determino el efecto de los tres compuestos sobre la actividad de Src y Syk (Figura 10A). Fueron suficientes concentraciones menores de 125 nM para suprimir la senalizacion de Syk inducida por el BCR para ERK1/2. En cambio, se necesitaron concentraciones mucho mas elevadas para provocar una supresion modesta de la actividad de Src; un efecto sobre Src que no se observo mediante transferencia de Western (Figura 9, A-C). Ninguno de estos inhibidores de Syk suprimio la fosforilacion de tirosinas de ERK1/2 inducida por PMA, lo que demuestra que estos compuestos no inhiben sucesos de senalizacion aguas abajo de la PKC.
Mientras que P459-72 y P505-15 inhiben de forma especlfica Syk en ensayos sobre purificada y celular, el ejemplo 100b demostro de forma adicional actividad frente a JAK quinasas purificadas. Se analizo la inhibicion de la senalizacion de IL-4 para STAT-6 a traves de JAK1/3 en linfocitos B para estos compuestos, una ruta de senalizacion que no necesita Syk. Los compuestos especlficos para Syk no suprimieron la senalizacion de IL4 a concentraciones tan altas como 211M. Al contrario, el ejemplo 100b si suprimio la senalizacion de IL4, con una CI50 de alrededor de 125 nM (Figura 10B).
Esto muestra que la inhibicion selectiva de Syk suprimio el flujo de Ca2+ inducido por el BCR en linfocitos B con valores de CI50 de alrededor de 100 nM. Esto sugiere que, mediante la inhibicion de Syk, estos compuestos suprimen la ruta de senalizacion bloqueando la respuesta celular.
La inhibicion selectiva de Syk es suficiente para suprimir la senalizacion del BCR sin afectar a Src (Figuras 11 y 12) o JAK (Figura 10B). De forma adicional, P505-15 y el ejemplo 100b inducen por igual la apoptosis en estas celulas (Figura 11B). Este dato demuestra que el papel de la senalizacion de Syk en la supervivencia de las llneas celulares de LNH, y demuestra que no se necesita para conseguir este efecto la inhibicion de las quinasas que no son Syk.
Ejemplo 351. Ensayos de Caspasa 3 y de proliferacion: la inhibicion de Syk altera la proliferacion y la supervivencia de las llneas de linfocitos B de linfoma no Hodgkin.
La induccion de la apoptosis se midio utilizando el kit de apoptosis de anticuerpo monoclonal para Caspasa 3 activa conjugado a PE (Becton Dickinson) siguiendo el protocolo suministrado. Las celulas se suspendieron en medio de cultivo (0,5x106 celulas/ml) y se trataron con las concentraciones indicadas de cada inhibidor de Syk o control de vehlculo durante 24, 48 o 72 horas antes del analisis de FACS. El ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazolio, un tetrazol) (empresa nombre) se utilizo como una medida de la viabilidad y crecimiento celular, siguiendo los protocolos suministrados por el fabricante. Las celulas se trataron con las concentraciones indicadas de cada inhibidor de Syk o con control de vehlculo durante 72 horas.
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Las celulas SUDHL-4 y SUDHL-6 se clasificaron de forma previa como "de tipo BCR " (Monti, Savage et al. Blood 105(5): 1851-61 (2005); Polo, Juszczynski et al. Proc Natl Acad Sci U S A 104(9): 3207-12 (2007)) y como sensibles a la inhibicion de Syk mediante R406 (Chen, Monti et al. 2008). Las llneas celulares Toledo y Karpas-422, que carecen de la expresion del BCR y de BLNK, respectivamente (Gabay, Ben-Bassat et al. Eur J Haematol 63(3): 18091 (1999); Sprangers, Feldhahn et al. Oncogene 25(36): 5056-62 (2006)), habiendose adaptado, por lo tanto, a la supervivencia independiente de las senales del BCR, fueron insensibles a R406 (Chen, Monti et al. 2008). Se analizo la proliferation de estas llneas celulares cuando se cultivaron en presencia o ausencia de diversas concentraciones de cada inhibidor de Syk durante 72 horas.
La inhibicion selectiva de Syk fue suficiente para inducir la apoptosis en llneas celulares de LNH "de tipo BCR". Las celulas se incubaron con el inhibidor 1 o 3 pM durante 72 h. Como se demuestra en la Figura 11A, las celulas SUDHL-4 y -6 experimentaron cada una apoptosis, mientras que las celulas Toledo y Karpas-422 no (Figura 11A). En experimentos repetidos, la inhibicion especlfica de Syk por P459-72 y P505-15 indujo apoptosis solo en las llneas celulares SUDHL y Ramos. En comparacion, el ejemplo 100b, que inhibe de forma potente a las Syk y JAK quinasas, indujo apoptosis en todas las llneas celulares "de tipo BCR", as! como en Karpas-422 y JJN-3, una llnea celular de mieloma multiple que carece del BCR, y la expresion de BLNK (Sprangers, Feldhahn et al. Oncogene 25(36): 5056-62 (2006)). Las celulas Toledo permanecieron insensibles a los tres compuestos (Figura 11B). En un experimento distinto, se encontro que las celulas SUDHL-6 y Toledo eran sensibles por igual a la induction de la apoptosis mediante el tratamiento de 72 h con PMA 1 pM. Estos datos demuestran la necesidad especlfica de Syk para la supervivencia de ciertas llneas celulares de LNH.
Ejemplo 352. Estudios de xenoinjerto y analisis de la concentration en tumor y plasma.
La inhibicion de Syk protege frente a la formation de tumores en un modelo de raton de xenoinjerto. Se recibieron los ratones (empresa) y se aclimataron en las instalaciones al menos tres dlas antes del uso. Las celulas Ramos (3x106) se inyectaron por via subcutanea en la zona de flanco trasero de ratones conscientes utilizando una aguja de diametro 27 en un volumen de inyeccion de menos de 0,5 ml. Despues de la inyeccion los ratones se separaron aleatoriamente en grupos de tratamiento (n = 15) y se dosificaron dos veces al dla mediante sonda oral con el vehlculo o 10, 15 o 20 mg/kg del inhibidor. Al menos una vez por semana se obtuvieron pesos corporales y se determinaron dos veces por semana mediciones por calibrador de los tumores, comenzando cuando se formaron tumores palpables, hasta la finalization del estudio. El volumen tumoral se evaluo mediante medicion con calibrador utilizando una formula [longitud maxima x ancho x alto x n6]. La dosificacion dos veces al dla de vehlculo o de inhibidor continuo hasta que el vehlculo o cualquier grupo de tratamiento presento tumores que excedlan los 1,5 gramos de tamano. En el momento de la finalizacion (5 semanas despues de la inoculation de Ramos), los ratones se anestesiaron con un coctel de ketamina. Se obtuvo una muestra de sangre a traves de puncion cardiaca para hemograma y para la determination de la concentracion en plasma, y los ratones se sometieron a eutanasia a traves de dislocation cervical. Despues, los tumores se extirparon y pesaron. Una mitad del tumor se congelo de forma instantanea en nitrogeno llquido para la determinacion de la concentracion del inhibidor en el tejido tumoral y la otra mitad se coloco en formalina tamponada al 10 % para la investigation histologica.
Se evaluo el efecto de la inhibicion de Syk sobre la formacion de tumor de Ramos en un modelo de raton de xenoinjerto. Los ratones se dosificaron dos veces al dla con P505-15 10, 15 o 20 mg/kg o control de vehlculo, comenzando el dla de inoculacion de celulas tumorales. Las mediciones con calibrador se iniciaron cuando los tumores comenzaron a formarse, aproximadamente tres semanas despues de la inoculacion del tumor, y se repitieron cada tres dlas hasta la finalizacion del estudio. El estudio se finalizo cuando los pesos tumorales comenzaron a alcanzar aproximadamente 1,5 mg, momento en el que los tumores se extirparon y pesaron. Las muestras de tumor y de plasma se sometieron a analisis farmacocinetico.
Cada muestra de tumor se homogeneizo en 3 ml de solution salina por gramo de tumor utilizando los vastagos y el motor de Kontes® Microtube Pellet Pestle® (Kimble Chase, Vineland, NJ). Se analizo en las muestras de plasma y tumor la concentracion de P505-15 utilizando un espectrometro de masas en tandem con cromatografla llquida (LC/MS/MS). Brevemente, las muestras de plasma y tumor se procesaron en una placa filtro de 96 pocillos Captiva™ (0,2 pM, Varian, Inc., Palo Alto, CA). Se precipitaron allcuotas de las muestras de plasma y de tumor homogeneizado con acetonitrilo conteniendo 200 ng/ml de:
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el patron interno. La mezcla se agito con formation de vortice y se refrigero a 4 °C durante 30 minutos para permitir la precipitation completa de las proteinas. La mezcla se filtro en una placa de recoleccion de 96 pocillos. El filtrado se inyecto en un LC/MS/MS Sciex API3000 equipado con una fuente de spray ionico turbo. P505-15 y el Compuesto A se separaron en una columna HILIC Luna Phenomenex de 5 p (4,6 x 100 mm, 5 mm; Phenomenex, Torrance, CA). Se programo durante de 1,1 minutos un gradiente de fase movil mezcla de la fase movil A al 10 % (acido formico al 0,1 % en agua) y fase movil B al 90 % (acido formico al 0,1 % en acetonitrilo al 90 %, agua al 10 %) hasta fase movil B al 65 %, seguido de un gradiente de fase movil B del 65 % al 90 % durante 0,01 minutos. Las areas pico de la m/z 394/360 del ion producto de P505-15 se midieron frente a las m/z 357/295 del ion producto del Compuesto A (patron interno) en modo de ion positivo. El intervalo analitico fue de 2 a 5000 ng/ml.
El analisis farmacocinetico revelo que en el estado estacionario, las concentraciones tumorales de P505-15 siguieron los perfiles de concentracion-tiempo vistos para plasma en los grupos de dosis 10, 15 y 20 mg/kg. Los aumentos no lineales en la Cmax, el ABC (0-8) y la Cmin tumoral se observaron a medida que se aumento la dosis, pero no se observo un aumento proporcional a la dosis en la Cmin de plasma. La Cmax media y el ABC (0-8) en plasma fue al menos 2 veces mayor que las de en tumor para todas las dosis examinadas; sin embargo, las concentraciones minimas (nadir) medias (Cmin) fueron mas elevadas en tumor que en plasma (Tabla 11A), indicando acumulacion de P505-15 en el compartimento tumoral.
Tabla 11A
Determinado a partir de plasma
Regimen de dosificacion
Tmax (h) Cmin (ng/ml) Cmax (ng/ml) ABC (0-8) (ng*h/ml)
10 mg/kg dos veces al dia
1,50 17,6 179 738
15 mg/kg dos veces al dia
1,50 26,6 343 1671
20 mg/kg dos veces al dia
4,00 39,5 570 3191
Determinado a partir de tumor
Regimen de dosificacion
Tmax (h) Cmin (ng/ml) Cmax (ng/ml) ABC (0-8) (ng*h/ml)
10 mg/kg dos veces al dia
8,00 24,5 55,2 353
15 mg/kg dos veces al dia*
4,00 67,8 163 475
20 mg/kg dos veces al dia
4,00 125 252 1453
Tabla 11B
Regimen de dosificacion
Proporcion tumor/plasma
Basado en el ABC
Basado en la Cmax Basado en la Cmin
10 mg/kg dos veces al dia
0,478 0,308 1,39
*15 mg/kg dos veces al dia
0,284 0,475 2,55
20 mg/kg dos veces al dia
0,455 0,442 3,15
Nota: las muestras de nadir (0), 1,5, 4 y 8 h se tomaron en el dia de la recogida tras la dosis de la manana (AM). La segunda dosis no se administro en el dia de la recogida; por lo tanto, los valores farmacocineticos anteriores se determinaron tras una unica dosis por la manana (AM) en el estado estacionario.
*solo una muestra de tumor estuvo disponible para el punto de tiempo de 8 h y puede haber sido un valor atipico (concentraciones tumorales a las 8 h - 608 ng/ml); por lo tanto, los parametros farmacocineticos se determinaron entre 0 y 4 h para el grupo de dosificacion de dos veces al dia de P505-15 15 mg/kg. Como resultado, el ABC (0-8) y la proportion tumor/plasma basada en el ABC para este grupo puede estar subestimada.
La diferencia entre la Cmin del plasma y del tumor se hizo mas notable a medida que se aumento la dosis, como se indica por el aumento de las proporciones tumor/plasma determinadas a partir de la Cmin (Tabla 11B). Las proporciones tumor/plasma determinadas a partir de la Cmax y el ABC (0-8) fueron similares a lo largo de diversos grupos de dosis. Las concentraciones de tumor se mantuvieron por encima de 60, 170 y 640 nM a lo largo del intervalo de dosificacion total en la fase estacionaria para P505-15 a 10, 15 y 20 mg/kg, respectivamente.
Los ratones dosificados con las tres concentraciones de P505-15 estuvieron protegidos para el crecimiento del tumor Ramos in vivo. Esto fue evidente primero a partir de las mediciones por calibrador (datos no mostrados), lo que revelo una velocidad reducida de crecimiento tumoral en presencia del inhibidor de Syk. Despues de la finalization del estudio, los ratones se sometieron a eutanasia y los tumores se extirparon y pesaron. De forma concordante con las mediciones con calibrador, se consiguio en todos los grupos de dosificacion una reduction estadisticamente significativa del promedio de peso tumoral, en comparacion con el control de vehiculo.
Ademas, se analizo la actividad del inhibidor especlfico para Syk P505-15 en un modelo de xenoinjerto de raton de tumor Ramos. En todas las concentraciones analizadas, se observaron reducciones estadlsticamente significativas del tamano tumoral en ratones dosificados dos veces al dla con P505-15. La concentracion mas baja analizada fue de 10 mg/kg, consiguiendo concentraciones tumorales variando desde 64 a 140 nM a lo largo del curso del dla. La 5 supresion del crecimiento tumoral a estas concentraciones in vivo concuerda con las concentraciones de < 125 nM que se encuentran que suprimen el flujo de Ca2+ inducido por el BCR y la serialization del BCR distante para pERK Y204 (Figuras 12). La inhibition farmacologica selectiva de Syk da como resultado efectos sobre las proliferaciones y supervivencia de las llneas celulares de LNH. Estos datos sugieren que la action selectiva sobre Syk puede tener, de manera similar, beneficio cllnico en una diversidad de trastornos proliferativos de linfocitos B.
10
Como se detalla en el presente documento, se ha implicado de forma experimental a Syk en el desarrollo, proliferation y supervivencia de los linfocitos B. Ademas, Syk esta implicado como oncogen. La expresion de Syk activa de forma constitutiva en celulas de medula osea transferidas de forma adoptiva induce leucemia en ratones, y la sobreactividad de Syk esta asociada con una diversidad de linfomas en seres humanos. Dado el papel de Syk en 15 la biologla de los linfocitos B, su inhibicion selectiva podrla ser suficiente para proporcionar beneficio cllnico en trastornos proliferativos de linfocitos B, mientras se reducen las toxicidades que puede surgir debido a la supresion de otras quinasas que no son diana.
La presente invention proporciona varias realizaciones. Es obvio que los ejemplos pueden alterarse para 20 proporcionar otras realizaciones de la presente invencion. Por lo tanto, se apreciara que las reivindicaciones adjuntas, en lugar de las realizaciones especlficas que se han representado a modo de ejemplo, definiran el ambito de la presente invencion.

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    1. Un compuesto que tiene la formula I:
    imagen1
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que:
    D1 es cicloalquilo C3-8, opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en: alquilo C1-8, amino, hidroxi, alquilcarbonilo C1-8, aminocarbonilo, alcoxicarbonilamino C1- 8, arilalcoxicarbonilamino C1-8, fenilo y heterociclil-alquileno C1-8;
    R1 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-8, amino, aminocarbonilo, hidroxilo, alcoxi C1-8, haloalquilo C1-8, alquenilo C2-8, alquinilo C2-8, oxo, ciano, alcoxicarbonilo C1-8, cicloalquilo C3-8, arilo y heterociclilo; y cada heterociclilo esta opcionalmente sustituido con 1 a 4 sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en: alquilo C1-8, halo, oxo, amino, alcoxi C1-8, alquilcarbonilo C1-8, arilalcoxicarbonilo C1-8,
    aminocarbonilo, arilalquilenocarbonilo C1-8 y alquilsulfonilo C1-8;
    Y1 se selecciona entre el grupo que consiste en
    (a) arilo; opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes, R4a, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8-alquilo C1-8, aminocarbonil-, hidroxilo, oxo, halogeno, hidroxi, alcoxi C1-8 y alquilsulfonilo C1-8;
    (b) heteroarilo, opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes, R4a, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8-alquilo C1-8, aminocarbonil-, hidroxilo, oxo, halogeno, hidroxi, alcoxi C1-8 y alquilsulfonilo C1-8;
    R es un heterociclilo o heteroarilo sustituido con al menos un grupo, R , seleccionado entre el grupo que consiste en aminoalquil C1-8-, alcoxi C1-8-alquil C1-8-, oxo-, alquilcarbonilo C1-8, cicloalquilcarbonilo C3-8,
    heterociclilcarbonilo, alquilcarbonilamino C1-8, cicloalquilcarbonilamino C3-8, heterociclilcarbonilamino,
    alquilsulfonilo C1-8, cicloalquilsulfonilo C3-8 y heterociclilsulfonilo;
    y en la que R2 esta opcionalmente sustituido adicionalmente con 1 a 2 sustituyentes, R4c, independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo C1-8, alcoxi C1-8, halo, aminocarbonilo, oxo, hidroxilo, aminoalquileno C1-8, alcoxi C1-8-alquileno C1-8, alquilcarbonilo C1-8, cicloalquilcarbonilo C3-8, heterociclilcarbonilo, alquilcarbonilamino C1-8, cicloalquilcarbonilamino C3-8, heterociclilcarbonilamino, alquilsulfonilo C1-8,
    cicloalquilsulfonilo C3-8, heterociclilsulfonilo, cicloalquilo C3-8, alquilcicloalquileno C1-8, heteroarilo; donde cicloalquilo se refiere a un grupo hidrocarburo mono o policlclico alquilo, alquenilo o alquinilo que puede formar un anillo puenteado o un anillo espiro, y que puede tener uno o mas dobles o triples enlaces.
  2. 2. El compuesto de la reivindicacion 1, en el que el resto -Y1-R2 se selecciona entre el grupo que consiste en:
    imagen2
    imagen3
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    imagen4
    Y2 es N, CH o C;
    R4a se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo Ci-s;
    cada R4c se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo Ci-s, aminocarbonil-, hidroxilo, oxo, alcoxi Ci-s y halo;
    cada R4b se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo Ci-s y heterociclilo; el sublndice p es 0, 1,2 o 3; y
    la llnea ondulada indica el punto de union al resto de la molecula.
  3. 3. El compuesto de la reivindicacion 2 que tiene la formula Idl:
    imagen5
    o un tautomero, sal o estereoisomero farmaceuticamente aceptable del mismo.
  4. 4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que: D1 es ciclopropilo.
  5. 5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que: D1 es ciclobutilo.
  6. 6. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que: D1 es ciclopentilo.
  7. 7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que: D es ciclohexilo.
    S. El compuesto de la reivindicacion 1 que tiene la formula:
    imagen6
    o
    imagen7
    o un tautomero, sal o estereoisomero farmaceuticamente aceptable del mismo.
  8. 9. El compuesto de la reivindicacion 1 seleccion entre el grupo que consiste en:
    2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclobutilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)-3-clorofenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-propionilpiperazin-1-il)fenilamino)pirirnidine-5-carboxamida;
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    2-(4-(4-(ciclopropanocarbonil)piperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    2-(4-(4-acetil-2-oxopiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    2-(4-(4-acetilpiperazin-1-il)-3-fluorofenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    2-(4-(4-acetil-2-carbamoilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    (R)-2-(4-(4-acetil-3-metilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    (R)-2-(4-(4-acetil-2-metilpiperazin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    2-(6-(4-acetilpiperazin-1-il)piridin-3-ilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    4-(ciclopropilamino)-2-(4-(1-(metilsulfonil)piperidin-4-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(metilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(etilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    4-(ciclobutilamino)-2-(4-(4-(metilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    2-(4-(1-acetilpiperidin-4-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    (ciclopropilamino)-2-(4-(4-(pirrolidin-1-carbonil)piperidin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(morfolin-4-carbonil)piperidin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(ciclopropilsulfonil)piperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    2-(4-(4-acetil-1,4-diazepan-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    2-(4-(4-acetamidopiperidin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    4-(ciclopropilamino)-2-(4-dioxotiomorfolinofenilamino)pirimidin-5-carboxamida;
    4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(2-metoxietil)piperazin-1-il)fenilamino)pirirnidine-5-carboxamida;
    4-(ciclopropilamino)-2-(4-(4-(N-metilacetamido)piperidin-1-il)fenilamino)pirimidin-5-carboxamida; y
    2-(4-(4-(aminometil)piperidin-1-il)fenilamino)-4-(ciclopropilamino)pirimidin-5-carboxamida.
  9. 10. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugla o terapia.
  10. 11. Una composicion que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en combination con un transportador o diluyente farmaceuticamente aceptable.
  11. 12. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afeccion seleccionada del grupo que consiste en enfermedad cardiovascular, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria y trastorno proliferativo celular.
  12. 13. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de:
    una enfermedad cardiovascular seleccionada del grupo que consiste en reestenosis, trombosis, purpura trombocitopenica inmunitaria, trombocitopenia inducida por heparina, cardiomiopatla dilatada, enfermedad de celulas falciformes, aterosclerosis, infarto de miocardio, inflamacion vascular, angina inestable y slndromes coronarios agudos;
    una enfermedad inflamatoria que se selecciona del grupo que consiste en alergia, asma, artritis reumatoide, enfermedades mediadas por linfocitos B tales como Linfoma no Hodgkin, slndrome antifosfolipldico, lupus, psoriasis, esclerosis multiple, nefropatla terminal y enfermedad de Crohn;
    una enfermedad autoinmunitaria seleccionada del grupo que consiste en anemia hemolltica, purpura trombocitopenica inmunitaria, esclerosis multiple, psoriasis y slndrome de Sjogren; o
    un trastorno proliferativo celular seleccionado del grupo que consiste en leucemia, un linfoma, trastornos mieloproliferativos, canceres hematologicos y mielofibrosis idiopatica cronica.
  13. 14. Un kit que comprende una composicion de la reivindicacion 11, envasado e instrucciones para su uso.
  14. 15. Un Compuesto de la reivindicacion 1, que tiene la estructura:
    imagen8
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
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