ES2599010T3 - Receptores de linfocitos T con alta afinidad por el VIH - Google Patents

Abstract

Un receptor de linfocitos T (TCR) que comprende la región variable de la cadena alfa del TCR de la Fig 1a y la región variable de la cadena beta del TCR de la Fig 1b.

Description

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un enlace disulfuro entre la primera y segunda cadena y siendo dicho enlace disulfuro un enlace que no tiene equivalente en los receptores de linfocitos T αβ nativos.

En las formas scTCR anteriores, la secuencia enlazadora puede conectar el extremo C terminal del primer segmento con el extremo N terminal del segundo segmento y puede tener la fórmula -PGGG-(SGGGG)n-P-en la que n es 5 o 6 y P es prolina, G es glicina y S es serina.

-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P (SEQ ID NO: 17)

-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P (SEQ ID NO: 18)

Una forma de dTCR adecuado de los TCR de la presente invención comprende un primer polipéptido en el que una secuencia que corresponde a una secuencia de la región variable de la cadena α del TCR está fusionada con el extremo N terminal de una secuencia que corresponde a una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena α del TCR y un segundo polipéptido en el que una secuencia que corresponde a una secuencia de la región variable de la cadena β del TCR está fusionada con el extremo N terminal de una secuencia que corresponde a una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena β del TCR, estando el primer y segundo polipéptidos unidos por un enlace disulfuro que no tiene equivalente en los receptores de linfocitos T αβ nativos.

El primer polipéptido puede comprender una secuencia de la región variable de la cadena α del TCR fusionada con el extremo N terminal de una secuencia que corresponde a una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena α del TCR y un segundo polipéptido en el que una secuencia que corresponde a una secuencia de la región variable de la cadena β del TCR está fusionada con el extremo N terminal de una secuencia que corresponde a una secuencia extracelular del dominio constante de la cadena β del TCR, estando el primer y segundo polipéptidos unidos por un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína sustituidos por Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01 o su equivalente no humano. (“TRAC” etc. y toda la nomenclatura utilizada en la presente memoria es la utilizada en T cell receptor Factsbook, (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 52-8).

La forma dTCR o scTCR de los TCR de la invención puede tener secuencias de aminoácidos que correspondes a las secuencias del dominio constante extracelular del TCR αβ humano y de la región variable, y un enlace disulfuro puede enlazar restos de aminoácidos de dichas secuencias del dominio constante, no teniendo este enlace disulfuro ningún equivalente en los TCR nativos. El enlace disulfuro está entre los residuos de cisteína que corresponden a los residuos de aminoácidos cuyos átomos de carbono β están a menos de 0,6 nm de distancia en los TCR nativos, por ejemplo, entre los residuos de cisteína sustituidos por Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01 o su equivalente no humano. Otros sitios donde se pueden introducir cisteínas para formar el enlace disulfuro son los siguientes residuos en el exón 1 de TRAC*01 para la cadena α del TCR y TRBC1*01 o TRBC2*01 para la cadena β del TCR:

Cadena α del TCR

Cadena β del TCR Separación del carbono β nativo (nm)

Thr 45 Tyr 10 Thr 45 Ser 15

Ser 77 Ser 17 Asp 59 Glu 15 0,533 0,359 0,560 0,59

Además del enlace disulfuro no nativo mencionado anteriormente, la forma dTCR o scTCR de los TCR de la invención puede incluir un enlace disulfuro entre los residuos correspondientes a los conectados por un enlace disulfuro en los TCR nativos.

La forma dTCR o scTCR de los TCR de la invención preferiblemente no contiene una secuencia que corresponde a secuencias transmembrana o citoplasmáticas de los TCR nativos.

Los TCR de la invención se unen fuertemente al complejo SLYNTVATL-HLA-A2*0201. Estos TCR también se unen a variantes naturales alteradas, pero todavía útiles de SLYNTVATL derivadas de Gag del VIH cuando se carga en HLA-A*0201. Las variantes de SLYNTVATL que han sido aisladas de pacientes con SIDA incluyen las siguientes: (Sewell et al., (1997) Eur J Immunol. 27: 2323-2329):

SLFNTVATL SLFNTVAVL SLSNTVATL SSFNTVATL SLLNTVATL SLYNTIATL SLYNTIAVL SLFNTIATL SLFNTIAVL SLFNFVATL

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limitan a lo siguiente:

-(CH2)n

5 en la que n = 2 a 5

-(CH2)3NHCO(CH2)2

Un complejo de TCR en el que se encuentra un radical espaciador divalente de alquileno entre la cadena 10 polialquilenglicol y su punto de unión a un TCR del complejo proporciona una realización adicional del presente aspecto.

Se describe un complejo de TCR en el cual la cadena polialquilenglicol comprende por lo menos dos unidades repetitivas de polietilenglicol.

15 Existen varios proveedores comerciales de polímeros hidrófilos unidos, directamente o por medio de un espaciador, a grupos químicos reactivos que se pueden usar en la presente invención. Estos proveedores incluyen Nektar Therapeutics (CA, EE.UU.), NOF Corporation (Japón), SunBio (Corea del Sur) y Enzon Pharmaceuticals (NJ, EE.UU.).

20 Los polímeros hidrófilos comercialmente disponibles unidos, directamente o por medio de un espaciador, a grupos químicos reactivos que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes:

Descripción del enlazador de PEG

Fuente de PEG Número de catálogo

Unión al monómero de TCR

5K lineal (Maleimida)

Nektar 2D2MOHO1

20K lineal (Maleimida)

Nektar 2D2MOPO1

20K lineal (Maleimida)

NOF Corporation SUNBRIGHT ME-200MA

20K ramificado (Maleimida)

NOF Corporation SUNBRIGHT GL2-200MA

30K lineal (Maleimida)

NOF Corporation SUNBRIGHT ME-300MA

40K ramificado PEG (Maleimida)

Nektar 2D3XOTO1

5K-NP lineal (para la unión de Lys)

NOF Corporation SUNBRIGHT MENP-50H

10K-NP lineal (para la unión de Lys)

NOF Corporation SUNBRIGHT MENP-10T

20K-NP lineal (para la unión de Lys)

NOF Corporation SUNBRIGHT MENP-20T

Enlazadores dímero de TCR

3,4K lineal (Maleimida)

Nektar 2D2DOFO2

5K bifurcado (Maleimida)

Nektar 2D2DOHOF

10K lineal (con enlazadores ds de ortopiridilo en lugar de maleimida)

Sunbio

20K bifurcado (Maleimida)

Nektar 2D2DOPOF

20K lineal (Maleimida)

NOF Corporation

40K bifurcado (Maleimida)

Nektar 2D3XOTOF

Multímeros de TCR de orden superior

15K, 3 brazos, Mal3 (para el trímero)

Nektar OJOONO3

20K, 4 brazos, Mal4 (para el tetrámero)

Nektar OJOOPO4

40 K, 8 brazos, Mal8 (para el octámero)

Nektar OJOOTO8

25 Se puede utilizar una amplia variedad de grupos químicos de acoplamiento para acoplar moléculas de polímero a agentes terapéuticos de proteína y péptido. La elección del grupo químico más apropiado depende en gran medida del sitio de acoplamiento deseado. Por ejemplo, se han usado los siguientes grupos químicos de acoplamiento para unir a uno o más de los extremos de moléculas de PEG (Fuente: Nektar Molecular Engineering Catalogue 2003):

30 N-maleimida Vinilsulfona Carbonato de benzotriazol Propionato de succinimidilo Butanoato de succinimidilo

35 Tio-éster

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Acetaldehídos

Acrilatos

Biotina

Aminas primarias

Como se indicó anteriormente los polímeros no basados en PEG también proporcionan enlazadores adecuados para la multimerización de los TCR de la presente invención. Por ejemplo, se pueden utilizar restos que contienen extremos de maleimida unidos por cadenas alifáticas tales como BMH y BMOE (Pierce, productos números 22330 y 22323).

Enlazadores peptídicos son la otra clase de enlazadores de TCR. Estos enlazadores están compuestos de cadenas de aminoácidos y funcionan para producir enlazadores simples o dominios de multimerización en los que pueden unirse las moléculas de TCR. El sistema de biotina/estreptavidina se ha utilizado previamente para producir tetrámeros de TCR (véase el documento WO/99/60119) para estudios de unión in vitro. Sin embargo, la estreptavidina es un polipéptido derivado de microbios y como tal no es ideal para utilizar en un agente terapéutico.

Se describe un complejo de TCR en el que los TCR están unidos por un enlazador peptídico derivado de un dominio de multimerización humano.

Existen diversas proteínas humanas que contienen un dominio de multimerización que podría ser utilizado en la producción de complejos de TCR multivalentes. Por ejemplo, el dominio de tetramerización de p53 que se ha utilizado para producir tetrámeros de fragmentos de anticuerpo scFv que exhiben una mayor persistencia en suero y una constante de disociación significativamente mayor en comparación con el fragmento scFv monomérico. (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). La hemoglobina también tiene un dominio de tetramerización que potencialmente podría ser utilizado para este tipo de aplicación.

Se describe un complejo de TCR multivalente que comprende al menos dos TCR, en el que al menos uno de dichos TCR se asocia con un agente terapéutico.

Un TCR (o complejo multivalente del mismo) de la presente invención pueden comprender alternativa o adicionalmente una cisteína reactiva en el extremo C-terminal o N-terminal de las cadenas alfa o beta de los mismos.

Uso diagnóstico y terapéutico

El TCR de la invención puede estar asociado con un agente terapéutico o resto detectable. Por ejemplo, dicho agente terapéutico o resto detectable puede estar unido covalentemente al TCR.

Dicho agente terapéutico o resto detectable puede estar unido covalentemente al extremo C-terminal de una o ambas cadenas de TCR.

El scTCR o una o ambas de las cadenas del dTCR de los TCR de la presente invención se pueden marcar con un resto detectable, por ejemplo un marcador que es adecuado para propósitos de diagnóstico. Tales TCR marcados son útiles en un método para detectar un complejo SLYNTVATL-HLA-A*0201, método que comprende poner en contacto el ligando del TCR con un TCR (o un complejo de TCR multimérico de alta afinidad) que es específico para el ligando de TCR y detectar la unión al ligando de TCR. En los complejos de TCR tetraméricos formados, por ejemplo, usando heterodímeros biotinilados, se puede utilizar estreptavidina fluorescente para proporcionar un marcador detectable. Tal tetrámero de TCR marcado con fluorescencia es adecuado para su uso en el análisis FACS, por ejemplo, para detectar células presentadoras de antígenos que llevan el complejo SLYNTVATL-HLAA*0201 para el que estos TCR de alta afinidad son específicos.

Otra manera en la que se pueden detectar los TCR solubles de la presente invención es mediante el uso de anticuerpos específicos del TCR, en particular anticuerpos monoclonales. Hay muchos anticuerpos anti-TCR comercialmente disponibles, tales como αF1 y βF1, que reconocen los dominios constantes de las cadenas α y β, respectivamente.

Un TCR (o complejo multivalente del mismo) de la presente invención puede alternativa o adicionalmente estar asociado con (por ejemplo, covalentemente o de otro modo unido a) un agente terapéutico que puede ser, por ejemplo, un resto tóxico para su uso en la destrucción de células, o una molécula efectora inmunitaria tal como una interleucina o una citocina. Un complejo de TCR multivalente de la invención puede tener una mayor capacidad de unión para un ligando de TCR en comparación con un heterodímero de receptor de linfocitos T de tipo natural no multimérico de la invención. Por lo tanto, los complejos de TCR multivalentes de acuerdo con la invención son particularmente útiles para el seguimiento o direccionamiento a las células que presentan complejos de SLYNTVATL-HLA-A*0201 in vitro o in vivo y también son útiles como intermedios para la producción de otros complejos multivalentes de TCR que tienen tales usos. Por tanto, estos TCR o complejos de TCR multivalentes pueden proporcionarse en una formulación farmacéuticamente aceptable para su uso in vivo.

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Las secuencias de la cadena alfa del TCR contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción ClaI y SalII introducidos y esta secuencia se ligó en pEX954 (ver las Figuras 9 y 13) cortado con ClaI y XhoI.

Las secuencias de la cadena beta del TCR contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción AseI y AgeI introducidos y ligados en pEX821 (ver las Figuras 10 y 14) cortado con NdeI/AgeI.

Sitios de reconocimiento de enzimas de restricción como se introdujeron en el ADN que codifica las cadenas del TCR

ClaI-ATCGAT

SalII-GTCGAC

AseI-ATTAAT

AgeI-ACCGGT

Ligación

El ADN de la cadena alfa y beta del TCR cortado y el vector cortado se ligaron usando un kit de ligación de ADN rápido (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los plásmidos ligados se transformaron en células de E. coli cepa XL1-blue competentes y se sembraron sobre placas de LB/agar que contienen 100 mg/ml de ampicilina. Después de la incubación durante la noche a 37 °C, se seleccionaron las colonias individuales y se cultivaron en 10 ml de LB que contiene 100 mg/ml de ampicilina durante la noche a 37 °C con agitación. Los plásmidos clonados se purificaron usando un kit Miniprep (Qiagen) y el inserto se secuenció usando un secuenciador de ADN automático (Lark Technologies).

Las Figuras 5a y 5b muestran, respectivamente, las secuencias de aminoácidos extracelulares de la cadena α y β del TCR específico de Gag del VIH producidas a partir de las secuencias de ADN de las Figuras 4a y 4b.

Ejemplo 2 -Producción de variantes de alta afinidad del TCR específico de Gag del VIH unido por disulfuro soluble

El TCR específico de Gag del VIH nativo unido por disulfuro soluble producido como se describe en el Ejemplo 1 puede utilizarse como una plantilla a partir de la cual producir los TCR de la invención que tienen una mayor afinidad por el complejo SLYNTVATL (SEQ ID NO: 16)-HLA-A*0201.

La presentación en fagos es un medio por el que se pueden generar bibliotecas de variantes de TCR específico de Gag del VIH con el fin de identificar mutantes de alta afinidad. Por ejemplo, la presentación en fagos de los TCR y los métodos de cribado descritos en (Li et al, (2005) Nature Biotech 23 (3): 349-354) pueden ser adaptados y aplicados a los TCR específicos de Gag del VIH.

Las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de la cadena alfa y beta del TCR mutadas que, cuando se combinan con una cadena de TCR apropiada, demuestran una alta afinidad para el complejo SLYNTVATL-HLAA*0201, se enumeran en las Figuras 6 y 7 respectivamente. (SEQ ID Nos: 11-13 y 14-15 respectivamente). Como es conocido para los expertos en la técnica, los cambios de codón necesarios requeridos para producir estas cadenas mutadas se pueden introducir en el ADN que codifica estas cadenas por mutagénesis dirigida al sitio. (kit QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis de Stratagene)

Brevemente, esto se consigue mediante el uso de cebadores que incorporan el cambio de codón(es) deseado y los plásmidos que contienen el ADN de cadena del TCR relevante como molde para la mutagénesis:

La mutagénesis se llevó a cabo usando las siguientes condiciones: 50 ng de molde de plásmido, 1 μl de dNTP 10 mM, 5 μl de 10x tampón de ADN polimerasa Pfu como se suministra por el fabricante, 25 pmol de cebador directo, 25 pmol de cebador inverso, 1 μl de ADN polimerasa pfu en el volumen total 50 µl. Después de una etapa de desnaturalización inicial de 2 minutos a 95 °C, la reacción se sometió a 25 ciclos de desnaturalización (95 °C, 10 segundos), hibridado (55 °C 10 segundos) y elongación (72 °C, 8 mins). El producto resultante se digirió con la enzima de restricción DpnI para eliminar el plásmido del molde y se transformó en la cepa de E. coli XL1-blue. La mutagénesis se verificó mediante secuenciación.

Ejemplo 3 -Expresión, replegamiento y purificación del TCR soluble

Los plásmidos de expresión que contienen la cadena α y la cadena β mutadas respectivamente como se ha preparado en los Ejemplos 1 o 2 se transformaron por separado en E. coli cepa BL21pLysS y las colonias individuales resistentes a la ampicilina se cultivaron a 37 °C en medio TYP (ampicilina 100 μg/ml) a DO600 de 0,4 antes de inducir la expresión de las proteínas con IPTG 0,5 mM. Las células se recogieron tres horas después de la inducción mediante centrifugación durante 30 minutos a 4.000 rpm en un Beckman J-6B. Los sedimentos celulares se resuspendieron en un tampón que contiene Tris-HCl 50 mM, sacarosa 25 % (p/v), EDTA Na 1 mM, Azida Na 0,1 % (p/v), DTT 10 mM, pH 8,0. Después de una etapa de congelación-descongelación durante la noche, las células

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resuspendidas se sometieron a ultrasonidos en ráfagas de 1 minuto durante un total de aproximadamente 10 minutos en un sonicador Milsonix XL2020 usando una sonda estándar de 12 mm de diámetro. Los sedimentos de los cuerpos de inclusión se recuperaron por centrifugación durante 30 minutos a 13.000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21. A continuación se llevaron a cabo tres lavados con detergente para eliminar los desechos celulares y los componentes de la membrana. Cada vez el sedimento de los cuerpos de inclusión se homogeneizó en un tampón Triton (Tris-HCI 50 mM, Triton-X100 0,5 %, NaCl 200 mM, NaEDTA 10 mM, 0,1 % (p/v) Azida Na, DTT 2 mM, pH 8,0) antes de sedimentarse por centrifugación durante 15 minutos a 13.000 rpm en un Beckman J2-21. El detergente y la sal se separó después por un lavado similar en el siguiente tampón: Tris-HCl 50 mM, EDTA Na 1 mM, Azida Na 0,1 % (p/v), DTT 2 mM, pH 8,0. Por último, los cuerpos de inclusión se dividen en alícuotas de 30 mg y se congelaron a -70 °C. El rendimiento de proteínas de los cuerpos de inclusión se cuantificó mediante solubilización con guanidina 6M-HCl y medición con un ensayo de unión a colorante de Bradford (PerBio).

Aproximadamente 30 mg de cuerpos de inclusión solubilizados de la cadena β del TCR y 60 mg de la cadena α del TCR se descongelaron de las existencias congeladas, las muestras se mezclaron a continuación y la mezcla se diluyó en 15 ml de una solución de guanidina (clorhidrato de guanidina 6M, acetato sódico 10 mM, EDTA 10 mM), para asegurar la completa desnaturalización de la cadena. La solución de guanidina que contiene las cadenas de TCR totalmente reducidas y desnaturalizadas se inyectó en 1 litro del siguiente tampón de replegamiento: Tris 100 mM pH 8,5, L-arginina 400 mM, EDTA 2 mM, glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado 0,5 mM, urea 5M, PMSF 0,2 mM. Se añadió el par redox (2-mercaptoetilamina y cistamina (hasta concentraciones finales de 6,6 mM y 3,7 mM, respectivamente) aproximadamente 5 minutos antes de la adición de las cadenas de TCR desnaturalizadas. La solución se dejó durante 5 horas ± 15 minutos. El TCR replegado se dializó en una membrana Spectrapor 1 (Spectrum; Producto N.º 132670) contra 10 l de Tris 10 mM pH 8,1 a 5 °C ± 3 °C durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el tampón de diálisis se cambió a Tris 10 mM pH 8,1 fresco (10 l) y la diálisis se continuó a 5 °C ± 3 °C durante otras 20-22 horas.

El sTCR se separó de los productos de degradación e impurezas cargando el replegamiento dializado en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ y eluyendo la proteína unida con un gradiente de NaCl 0-500 mM de más de 50 volúmenes de columna utilizando un purificador Akta (Pharmacia). Las fracciones de los picos se almacenaron a 4 °C y se analizaron por SDS-PAGE con tinción de Coomassie antes de ser agrupadas y concentradas. Por último, el sTCR se purificó y caracterizó usando una columna de filtración en gel Superdex 200HR pre-equilibrada en tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3,5 mM, Nonidet P40 0,05 %). El pico que eluye a un peso molecular relativo de aproximadamente 50 kDa se reunió y se concentró antes de caracterización por análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcore.

Ejemplo 4 -Caracterización por resonancia de plasmón de superficie Biacore de la unión del sTCR unión al pMHC específico

Se usó un biosensor de resonancia de plasmón de superficie (Biacore 3000 ™) para analizar la unión de un sTCR a su ligando péptido-MHC. Esto se facilitó facilitado mediante la producción de complejos de pMHC individuales (descritos más adelante) que se inmovilizaron en una superficie de unión recubierta con estreptavidina de un modo semi-orientado, lo que permite demostrar eficientemente la unión de un receptor de linfocitos T soluble a hasta cuatro diferentes pMHC (inmovilizados en células de flujo separadas) simultáneamente. La inyección manual del complejo HLA permite manipular fácilmente el nivel preciso de moléculas de clase I a ser inmovilizadas.

Se replegaron in vitro moléculas de HLA-A*0201de clase I biotiniladas de cuerpos de inclusión expresados por bacterias que contienen las proteínas de la subunidad constituyente y péptido sintético, seguido por purificación y biotinilación enzimática in vitro (O'Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266:9-15). La cadena pesada de HLAA*0201 se expresó con una etiqueta de biotinilación C-terminal que sustituye a los dominios transmembrana y citoplásmico de la proteína en una construcción apropiada. Se obtuvieron niveles de expresión del cuerpo de inclusión de ~ 75 mg/litro de cultivo bacteriano. La cadena ligera de MHC o microglobulina β2 también se expresó como cuerpos de inclusión en E. coli a partir de una construcción adecuada, a un nivel de ~ 500 mg/litro de cultivo bacteriano.

Las células de E. coli se lisaron y los cuerpos de inclusión se purificaron a aproximadamente 80 % de pureza. La proteína de los cuerpos de inclusión se desnaturalizó en guanidina-HCl 6 M, Tris 50 mM pH 8,1, NaCl 100 mM, DTT 10 mM, EDTA 10 mM y se replegó a una concentración de 30 mg/litro de la cadena pesada, 30 mg/litro de β2 en LArginina-HCl 0,4 M, Tris 100 mM pH 8,1, cistamina 3,7 mM, β-cisteamina 6,6 mM, 4 mg/ml del péptido SLYNTVATL requerido para ser cargado por la molécula de HLA-A*0201, por adición de un pulso único de proteína desnaturalizada en tampón de replegamiento a <5 °C. El replegamiento se dejó hasta la terminación a 4 °C durante al menos 1 hora.

El tampón se intercambió mediante diálisis en 10 volúmenes de Tris 10 mM pH 8,1. Se necesitaron dos cambios de tampón para reducir la fuerza iónica de la solución suficientemente. A continuación, la solución de proteína se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 1,5 μm y se cargó en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ (volumen de lecho 8 ml). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-500 mM. El complejo HLA

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A*0201-péptido eluyó a aproximadamente NaCl 250 mM y se recogieron las fracciones de los picos, se añadió un cóctel de inhibidores de proteasa (Calbiochem) y las fracciones se enfriaron en hielo.

Se intercambió el tampón a las moléculas de pMHC etiquetadas por biotinilación a Tris 10 mM pH 8,1, NaCl 5 mM usando una columna de desalación rápida de Pharmacia equilibrada en el mismo tampón. Inmediatamente después de la elución, las fracciones que contienen proteínas se enfriaron en hielo y se añadió un cóctel inhibidor de la proteasa (Calbiochem). A continuación, se añadieron los reactivos de biotinilación: biotina 1 mM, ATP 5 mM (tamponado a pH 8), MgCl2 7,5 mM, y 5 µg/ml de enzima BirA (purificada de acuerdo con O'Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266:9-15). Después se dejó incubar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche.

Las moléculas de pHLA-A*0201 biotiniladas se purificaron usando cromatografía de filtración en gel. Se pre-equilibró una columna Pharmacia Superdex 75 HR 10/30 con PBS filtrado y se cargó 1 ml de la mezcla de reacción de biotinilación y la columna se desarrolló con PBS a 0,5 ml/min. Las moléculas de pHLA-A*0201 biotiniladas eluyeron como un único pico a aproximadamente 15 ml. Las fracciones que contenían proteína se agruparon, se enfriaron en hielo y se añadió cóctel de inhibidor de la proteasa. La concentración de proteína se determinó usando un ensayo de unión Coomassie (PerBio) y las alícuotas de moléculas de pHLA-A*0201 biotiniladas se almacenaron congeladas a 20 °C. La estreptavidina se inmovilizó por métodos de acoplamiento de amina estándar.

Tales complejos inmovilizados son capaces de unirse tanto a receptores de linfocitos T como al correceptor CD8αα, los cuales pueden ser inyectados en la fase soluble de unión. La unión específica de TCR se obtiene incluso a bajas concentraciones (por lo menos 40 μg/ml), lo que implica que el TCR es relativamente estable. Las propiedades de unión a pMHC del sTCR observadas son cualitativa y cuantitativamente similares si se utiliza sTCR, ya sea en la fase soluble o inmovilizada. Este es un control importante de la actividad parcial de especies solubles y también sugiere que los complejos de pMHC biotinilados son biológicamente tan activos como los complejos no biotinilados.

Las interacciones entre el sTCR específico de Gag del VIH que contiene un novedoso enlace entre cadenas y su ligando/complejo de MHC o una combinación de HLA-péptido irrelevante, cuya producción se describe anteriormente, se analizaron en un biosensor de resonancia de plasmón de superficie (SPR) Biacore 3000™. El SPR mide los cambios en el índice de refracción expresado en unidades de respuesta (RU) cerca de una superficie de sensor dentro de una pequeña celda de flujo, un principio que se puede utilizar para detectar interacciones ligando-receptor y para analizar su afinidad y parámetros cinéticos. Las células de flujo de la sonda se prepararon mediante inmovilización de los complejos individuales HLA-péptido en células de flujo separadas mediante la unión entre la biotina reticulada en β2m y estreptavidina que han sido químicamente reticuladas a la superficie activada de las células de flujo. A continuación, el ensayo se realizó haciendo pasar sTCR sobre las superficies de las diferentes células de flujo a un caudal constante, midiendo a la vez la respuesta SPR.

Medición de la constante de unión en el equilibrio

Se prepararon diluciones en serie del sTCR específico de Gag del VIH parental o mutado y se inyectaron a una velocidad de flujo constante de 5 µl min-1 sobre dos células de flujo diferentes; una recubierta con ~ 1000 RU de complejo SLYNTVATL-HLA-A*0201 específico y la segunda recubierta con ~ 1000 RU de complejo HLA-A2-péptido no específico. La respuesta se normalizó para cada concentración utilizando la medición de la célula de control. La respuesta de datos normalizada se representó gráficamente frente a la concentración de la muestra de TCR y se ajustó a una hipérbola con el fin de calcular constante de unión en el equilibrio KD. (Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2ª Edición) 1979, Clarendon Press, Oxford).

Medición de los parámetros cinéticos

Para los TCR de alta afinidad, la KD se determinó midiendo experimentalmente la constante de velocidad de disociación, kd, y la constante de velocidad de asociación, ka. La constante en el equilibrio KD se calculó como kd/ka.

El TCR se inyectó sobre dos células diferentes, una recubierta con ~ 300 RU de complejo HLA-A2-péptido NY-ESO específico y la segunda recubierta con ~ 300 RU de complejo HLA-A2-péptido no específico. El caudal se fijó en 50 µl l/min. Generalmente se inyectaron 250 µl de TCR a una concentración de ~ 3 µM. A continuación, el tampón se hizo fluir encima hasta que la respuesta regresó a la línea base. Los parámetros cinéticos se calcularon usando el software BIAevaluation. La fase de disociación también se ajustó a una ecuación de desintegración simple que permite el cálculo de la semivida.

Resultados

La interacción entre un TCR específico de Gag del VIH nativo unido por disulfuro soluble (que consta de las cadenas del TCR α y β detalladas en las SEQ ID NO 9 y 10 respectivamente) y el complejo SLYNTVATL-HLA-A*0201 se analizó mediante los métodos anteriores y se determinó una KD de 85 nM y una constante de disociación (koff) de 2,21 x 10-2 S-1. (Véase la Figura 12 para las curvas de respuesta Biacore)

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Los TCR especificados en la siguiente tabla tienen una KD de menos de o igual a 1 µM y/o un koff de 1 x S-1 o más lento.

Secuencia del dominio variable de la cadena alfa, SEQ ID NO:

Secuencia del dominio variable de la cadena beta, SEQ ID NO:

1

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1

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1

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2

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2

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Ejemplo 5 -Producción de la proteína de fusión TCR específico de Gag del VIH de alta afinidad soluble -IL-2 humana natural.

Los métodos sustancialmente como se describe en los Ejemplos 1 a 3 se pueden utilizar para producir una proteína de fusión TCR específico de Gag del VIH de alta afinidad soluble -IL-2 humana natural. Brevemente, el ADN que codifica el enlazador deseado y la IL-2 humana natural se añaden en el extremo 3' de la secuencia de ADN de la cadena beta del TCR específico de Gag del VIH parental unido por disulfuro soluble inmediatamente antes del codón TAA (“parada”). La Figura 11 proporciona la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión que comprende una cadena beta del TCR específico de Gag del VIH parental unido por disulfuro fusionada a la IL-2 humana natural a través de una secuencia enlazadora (SEQ ID NO: 24). El enlazador y la porción de IL-2 de esta proteína de fusión se indican en cursiva. El ADN que codifica esta construcción se puede ligar a continuación en pEX821. La proteína de fusión TCR específico de Gag del VIH parental soluble – IL-2 se puede expresar a continuación mediante la combinación de esta proteína de fusión de la cadena beta con la cadena alfa del TCR específico de Gag del VIH parental unido por disulfuro soluble detallada en la Figura 5a (SEQ ID NO: 9), utilizando los métodos sustancialmente como se describe en el Ejemplo 3.

Ejemplo 6 -Expresión recombinante del TCR específico de Gag del VIH parental en la superficie de linfocitos T.

Se sintetizaron construcciones de ADN que codifican para la secuencia señal, dominios extracelular, transmembrana e intracelular de las cadenas de TCR específico de Gag del VIH parental (GeneArt, Alemania). Estas secuencias de ADN de la cadena α del TCR y de la cadena β del TCR, proporcionadas en las Figuras 15a y 15b, respectivamente, son alteradas respecto de las secuencias de ADN del TCR específico de Gag del VIH parental con el fin de mejorar los niveles de expresión de las cadenas de TCR codificadas en los linfocitos T humanos, a la vez que se mantiene la secuencia de aminoácidos nativa. Las Figuras 16a y 16b proporcionan las secuencias de aminoácidos de longitud completa codificadas por las secuencias de ADN de las Figuras 15a y 15b, respectivamente.

A continuación, se insertaron juntas las secuencias de ADN de la cadena α del TCR y de la cadena β de TCR en un vector de expresión Lentiviral. Este vector contiene el ADN que codifica tanto para la cadena α como para la cadena β del TCR específico de Gag del VIH parental como un único marco de lectura abierto con la secuencia de aminoácidos del factor de escisión del virus de la enfermedad de pie y boca (FMDV) 2A (LLNFDLLKLAGDVESNPG (SEQ ID NO: 31)) en el marco separando las cadenas de TCR. (De Felipe et al, Genet Vaccines Ther (2004) 2(1):13). En la traducción del ARNm se produce la cadena α del TCR con la secuencia del péptido 2A en su extremo C-terminal y la cadena β del TCR se produce como un polipéptido separado.

Los linfocitos T se transdujeron con el vector lentiviral anterior. En resumen, se estimularon los linfocitos T primarios durante 24 horas usando perlas anti-CD3/anti-CD28. Se incubó un sobrenadante de Lentivirus concentrado, que expresa los genes de TCR, con los linfocitos T estimulados para permitir la transducción viral. Las perlas de anti-CD3/anti-CD28 se retiraron a continuación y los linfocitos T transducidos se cultivaron hasta que alcanzaron un “volumen de reposo” de 200 a 300 fl.

La presentación de los TCR específicos de Gag del VIH parentales en la superficie de los linfocitos transducidos se confirmó por análisis FACS utilizando el tetrámero HLA-A*0201-SLYNTVALT PE y la co-tinción con FITC del anticuerpo monoclonal anti-CD8.

15

25

35

45

55

65

Resultados

La Figura 17b proporciona los datos de análisis FACS que demuestran la expresión con éxito del TCR específico de Gag del VIH parental en la superficie de linfocitos T CD8+ transducidos. La Figura 17a proporciona los datos del análisis FACS generados utilizando linfocitos T no transducidos de control.

Ejemplo 7 -Inhibición de la activación de CTL por TCRs específicos de Gag del VIH de alta afinidad solubles

Los siguientes ensayos se llevaron a cabo para demostrar que el TCR específico de Gag del VIH c11c6 de alta afinidad soluble era capaz de inhibir la activación de una línea de linfocitos T policlonal reactiva con SLYNTVATLHLA-*0201.

Inhibición de la activación de la línea de linfocitos T policlonal reactiva con SLYNTVATL-HLA-A*0201 OX84 en la presencia de células infectadas por VIH

El TCR específico de Gag del VIH de alta afinidad c11c6 soluble utilizado en este experimento contenía las regiones variables del dominio de la cadena alfa del TCR y de la cadena beta del TCR que se muestran en la Figura 6c (SEQ ID NO: 13) y la Figura 7b (SEQ ID NO: 15), respectivamente. Las secuencias de aminoácidos completas de las cadenas alfa y beta del TCR de este TCR soluble se proporcionan en la Figura 18a (SEQ ID NO: 29) y la Figura 18b (SEQ ID NO: 30), respectivamente.

La producción de IFN-γ y TNF-α se utilizó como lecturas de la activación de CTL.

Reactivos

Medios de ensayo R10: FCS 10 % (inactivado por calor, Gibco, número de catálogo 10108-165), RPMI 88 % 1640 (Gibco, número de catálogo 42401-018), glutamina 1 % (Gibco, número de catálogo 25030-024) y penicilina/estreptomicina 1 % (Gibco, número de catálogo 15070-063).

Péptido: (obtenido de diversas fuentes) disuelto inicialmente en DMSO (Sigma, número de catálogo D2650) a 4 mg/ml y congelado.

BD™ Cytometric Bead Array Kit, Human Th1/Th2 cytokine Kit II (BD Biosciences, San Diego, EE.UU.) contiene todos los reactivos necesarios para el ensayo.

Ensayo de activación de linfocitos T

Linfocitos T diana con infección crónica por el VIH (cepas de laboratorio HXB2 y HIV3B del VIH) se lavaron y se volvieron a suspender en medios R10. Como control, linfocitos T diana no infectados pulsados con 1 nM de péptido SLYNTVATL, durante 30 minutos a 37 °C, 5 % de CO2.

Muestras de ensayo:

25.000 linfocitos T diana infectados por el VIH en medios R10 por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U.

TCR específico de Gag del VIH c11c6 de alta afinidad 2 x 10-7 M o TCR específico de Gag del VIH parental en medios R10 por pocillo.

5.000 linfocitos de la línea de linfocitos T efectora policlonal OX84 en medios R10 por pocillo.

Controles:

Como el anterior sustituyendo los TCR solubles irrelevantes (TCR específico de HLA-A*0201-Tax y específico de HLA-A*0201-NY-ESO) o los TCR específicos de Gag del VIH de alta afinidad.

A continuación, la placa se incubó durante 4 horas a 37 °C, 5 % de CO2. El sobrenadante del cultivo se eliminó para medir los niveles de IFN-γ y TNF-α presentes utilizando el siguiente método.

Ensayo de IFN-γ y TNF-α

Se prepararon perlas citométricas BD™ recubiertas con (A) anticuerpos de captura anti-IFNγ y (b) anticuerpos de captura anti-TNFα según las instrucciones del fabricante.

A continuación se preparó una serie de tubos de ensayo que contiene las siguientes adiciones a continuación:

15

25

35

45

55

65

50 µl de perlas citométricas BD™ anti-IFNγ y anti TNFα mezcladas en diluyente de ensayo BD

50 µl de reactivo de detección PE

Seguido por:

50 µl del sobrenadante de cultivo tomado de los pocillos de ensayo de activación de linfocitos T (muestras de ensayo) O

50 µl de patrones de IFNγ y TNFα preparados en un intervalo de concentraciones por dilución en serie de patrones internos (patrones de calibración)

Los tubos fueron incubados en la oscuridad durante 3 horas antes de ser lavados con ml de tampón de lavado BD y se centrifugaron. Finalmente, las perlas se resuspendieron en 300 µl de tampón de lavado y se determinó el nivel de IFNγ y TNFα por citometría de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Inhibición de la línea de linfocitos T policlonal OX84 específica de SLYNTVATL-HLA-A*0201 en presencia de linfocitos T no infectados pulsados con péptido SLYNTVATL

Se utilizaron los mismos reactivos y métodos que los utilizados para el ensayo anterior de activación de CTL con las siguientes salvedades:

Se utilizaron 2.000 linfocitos T efectores policlonales OX84 en cada ensayo de activación de linfocitos T.

Como células diana se utilizaron linfocitos T linfoblastoides no infectados, pulsados con péptido SLYNTVATL 10-10 10-8 M.

Resultados

El TCR específico de Gag del VIH c11c6 de alta afinidad soluble inhibió fuertemente la activación de la línea de linfocitos T policlonal OX84 reactiva con SLYNTVATL-HLA-*0201 en presencia de linfocitos T infectados por el VIH, medido por la producción de IFN-γ de TNF-α. (Ver Figura 19)

[El TCR específico de Gag del VIH c11c6 de alta afinidad soluble inhibió fuertemente la activación de la línea de linfocitos T policlonal OX84 reactiva con SLYNTVATL-HLA-*0201 en presencia de linfocitos T no infectados pulsados con SLYNTVATL, medido por la producción de IFN-γ y de TNF-α. (Ver Figura 20)

Ejemplo 8 -Cuantificación de los antígenos SLYNTVATL-HLA-A*0201 en la superficie celular en linfocitos T2 pulsados con péptido mediante microscopía de fluorescencia utilizando TCR específico de Gag del VIH c11c6 de alta afinidad

Se determinó el número de antígenos SLYNTVATL-HLA-A*0201 en células linfoblastoides T2 pulsadas con péptido (en el supuesto de que una señal de fluorescencia se asocia a un único TCR marcado unido a su ligando pMHC afín en la superficie de la célula diana) por microscopía de fluorescencia de molécula única usando un TCR específico de Gag del VIH c11c6 de alta afinidad soluble. Esto fue facilitado por el uso de TCR biotinilado para dirigirse a las células cancerosas que expresan el antígeno y el posterior marcado del TCR unido a la célula mediante conjugados de estreptavidina-R-ficoeritrina (PE). Las moléculas de PE individuales fueron visualizadas posteriormente por microscopía de fluorescencia de 3 dimensiones.

Las células linfoblastoides T2 se pulsaron con el péptido SLYNTVATL derivado de Gag del VIH, o un péptido irrelevante (SLLMWITQC) en un intervalo de concentraciones (10-5 -10-10 M) durante 90 minutos a 37 °C. Después de pulsar las células, se lavaron dos veces con 500 µl de PBS. Las células se incubaron en 200 µl de solución de TCR (TCR específico de Gag del VIH c11c6 de alta afinidad 100 nM), en PBS (albúmina BSA 0,5 %) durante 30 min a temperatura ambiente. Se extrajo la solución de TCR y las células se lavaron tres veces con 500 µl de PBS. Se incubaron las células en 200 µl de solución de estreptavidina-PE (5 µg ml-1 estreptavidina-PE en PBS que contenía BSA 0,5 %) a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 min. Se eliminó la solución de estreptavidina-PE y las células se lavaron tres veces con 500 µl de PBS. Se eliminaron los medios de lavado y las células se mantuvieron en 400 µl de R10, sin rojo de fenol antes de la obtención de imágenes por microscopía de fluorescencia.

Microscopio de fluorescencia. La microscopía de fluorescencia se llevó a cabo usando un microscopio Axiovert 200M (Zeiss) con un objetivo de aceite 63x (Zeiss). Se utilizó una fuente de luz Lambda LS que contiene una lámpara de arco de xenón de 300 W (Sutter) para la iluminación, y la intensidad de la luz se redujo a niveles óptimos mediante la colocación de un filtro de densidad neutra de 0,3 y 0,6 en la trayectoria de la luz. Los espectros de excitación y emisión se separaron utilizando un conjunto de filtro TRITC/Dil (Chroma). Se obtuvieron imágenes en

tres dimensiones de las células mediante adquisición en pila z (21 planos, 1 µm de distancia). La adquisición y análisis de imágenes se realizó utilizando el software Metamorph (Universal Imaging) como se ha descrito (Irvine et al., Nature 419: p845-9 y Purbhoo et al., Nature Immunology 5: p524-30).

5 Resultados

Como se muestra en la Figura 21 se utilizó el método anterior con éxito para obtener una imagen del TCR específico de Gag del VIH c11c6 de alta afinidad unido antígenos SLYNTVATL-HLA-A*0201 en la superficie de linfocitos T2 pulsados con péptido. Estos resultados muestran que el umbral para el recuento de epítopos sobre las células

10 pulsadas con péptido SLYNTVATL usando el TCR específico de Gag del VIH c11c6 de alta afinidad es de aproximadamente 10-9 M de péptido.

Claims (1)

1. imagen1