ES2599781T3

ES2599781T3 - Péptidos antienvejecimiento activadores del proteasoma y composiciones que los contienen

Info

Publication number: ES2599781T3
Application number: ES10715912.1T
Authority: ES
Inventors: Claude Dal Farra; Nouha Domloge; Jean-Marie Botto
Original assignee: ISP Investments LLC
Current assignee: ISP Investments LLC
Priority date: 2009-04-02
Filing date: 2010-04-01
Publication date: 2017-02-03
Anticipated expiration: 2030-04-01
Also published as: WO2010112710A2; CN102428095B; FR2944018B1; JP2012522757A; EP2414381B1; CN102428095A; JP5728466B2; US8530622B2; EP2414381A2; WO2010112710A3; FR2944018A1; US20120040912A1

Abstract

Compuesto peptídico de la siguiente fórmula general (I): R1 - X1 - X2 -Asp - Cys - Arg - X3 -X4 - (AA)p - R2 En la cual, X1 representa un ácido aspártico, un ácido glutámico, una serina, una treonina, o es igual a cero, X2 representa una arginina, una leucina, una isoleucina, o es igual a cero, X3 representa una arginina, una lisina, o es igual a cero, X4 representa una arginina, una prolina, una histidina, una lisina, o es igual a cero, AA representa un aminoácido cualquiera salvo cisteína, o uno de sus derivados, y p es un número entero comprendido entre 0 y 2, R1 representa la función amina primaria del aminoácido N-terminal, libre o sustituida por un grupo protector que puede seleccionarse de entre un grupo acetilo, un grupo benzoílo, un grupo tosilo o un grupo benciloxicarbonilo, R2 representa el grupo hidroxilo de la función carboxilo del aminoácido C-terminal, libre o sustituida por un grupo protector que puede seleccionarse de entre una cadena alquilo de C1 a C20, o un grupo NH2, NHY o NYY en el que Y representa una cadena alquilo de C1 a C4, estando constituida dicha secuencia de formula general (I) por 3 a 9 residuos de aminoácidos, pudiendo comprender dicha secuencia de fórmula general (I) sustituciones de los aminoácidos X1, X2, X3, y X4 por otros aminoácidos químicamente equivalentes, donde se excluye el péptido EDCR, Seq. ID. n.º 119 de WO 2007131774.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

como, por ejemplo, las rugosidades superficiales de la capa córnea, además de toda modificación interna de la piel que no se traduce sistemáticamente en un aspecto exterior modificado como, por ejemplo, el adelgazamiento de la dermis. Por «fotoenvejecimiento» se entiende el envejecimiento prematuro de la piel causado por la exposición prolongada y acumulativa al sol.

5 [0041] Por tanto, la presente invención se refiere al uso de una composición para tratar o prevenir las arrugas, las arrugas profundas y gruesas, las pequeñas arrugas, las grietas, la distensión de los tejidos cutáneos y subcutáneos, la pérdida de elasticidad cutánea y la atonía, la pérdida de firmeza y tonicidad y la atrofia dérmica. Asimismo, dicha composición según la invención permite activar la renovación celular y limpiar las

10 células en profundidad.

[0042] Otro objeto de la invención se refiere al uso de una composición según la invención para proteger la piel contra las agresiones debidas a los rayos UV. Por último, la invención se refiere al uso de una composición que comprende el compuesto peptídico para aumentar la actividad del proteasoma y mejorar la degradación por

15 medio del proteasoma de las proteínas dañadas.

[0043] Un último objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento de tratamiento cosmético caracterizado por que se aplica tópicamente en la piel o las faneras a tratar, una composición que comprende una cantidad eficaz de compuesto peptídico según la invención para prevenir y/o tratar los signos cutáneos del 20 envejecimiento y del fotoenvejecimiento. Asimismo, dicho procedimiento de tratamiento cosmético se caracteriza por que la composición se aplica antes de dormir de modo que se limpien las células y la piel durante el ciclo de renovación celular. En efecto, durante la noche, la piel favorece las funciones de renovación así como los procesos metabólicos de síntesis. En consecuencia, la aplicación de la composición tal como se reivindica, al respetar el ritmo biológico de la piel permite obtener un efecto rejuvenecedor, estimulando la renovación celular,

25 y regenerador.

[0044] Los siguientes ejemplos describen y demuestran la eficacia de compuestos peptídicos tal y como se describen según la invención, pero no deben interpretarse como una limitación de la presente invención.

30 Ejemplo 1: Validación del modelo de los queratinocitos envejecidos: inmunoblot de las proteínas ubiquitinadas y del proteasoma 20S en queratinocitos envejecidos

Proceso de envejecimiento de queratinocitos en cultivo

35 [0045] Células NHK, Normal Human Keratinocytes o queratinocitos humanos normales, se aíslan a partir de biopsias de piel humana. Estas células se mantienen en cultivo en un medio especial queratinocito-SFM (Invitrogen) a 37 °C en una atmósfera húmeda de 5 % CO2. Se obtienen células NHK envejecidas efectuando una serie de subcultivos repetidos. En resumen, las células se siembran en matraces de 75 cm2, de baja densidad y se ponen en cultivo de 5 a 10 días entre dos pases. Las células se tratan, o no, con el principio activo

40 mediante la adición del activo directamente en el medio de cultivo 3 veces por semana. A continuación, estas células se mantienen en dichas condiciones durante 45 días.

Inmunoblot de las proteínas ubiquitinadas y del proteasoma 20S en queratinocitos envejecidos

45 [0046] Con el fin de validar nuestro modelo, es conveniente demostrar primero que en queratinocitos en cultivo envejecidos experimentalmente, la tasa de expresión de las proteínas ubiquitinadas, así como la tasa de proteasoma 20S, conforme a la literatura, disminuían con el paso del tiempo. La tasa de expresión de dichas proteínas se ha evaluado por medio de la técnica del inmunoblot. La técnica del inmunoblot (o western blotting) es un método semicuantitativo que permite calcular la tasa de proteínas estudiadas en las células, es decir, la

50 tasa de las proteínas ubiquitinadas por un anticuerpo específico de la ubiquitina (DAKO), así como la tasa de proteasoma 20S por un anticuerpo específico del proteasoma (CALBIOCHEM).

Protocolo

55 [0047] Los queratinocitos envejecidos se ponen en cultivo en matraces de 75 cm2 a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene 5 % de CO2 durante 10, 20, 30 y 40 días. Las células no son tratadas el día del experimento. Se enjuagan y después se separan del soporte con ayuda de un tampón de extracción (20 mM TRIS, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,2 % Triton X10) en presencia de una mezcla de inhibidores de proteasas (Sigma). Las proteínas extraídas de este modo se centrifugan a 4 °C a 10 000 rpm durante 10 minutos antes de

60 cuantificarse por medio del kit de cuantificación de proteínas por BCA (Pierce). Los lisados celulares se mezclan con un tampón de desnaturalización y se someten a una electroforesis SDS PAGE. El gel utilizado es un Nupage 4-12 % (Invitrogen). Las proteínas se transfieren finalmente a una membrana de nitrocelulosa (Pal corporation). Las membranas se saturan en PBS 5 % leche, 0,1 % Tween 20, 2 horas a temperatura ambiente, y después se incuban a 4 °C toda la noche con un anticuerpo primario.

[0048] Para el estudio de las proteínas ubiquitinadas, el anticuerpo primario es un anticuerpo de conejo antiubiquitina utilizado a una dilución 1/500 (DAKO).

[0049] Para el estudio del proteasoma 20S, el anticuerpo primario es un anticuerpo de ratón anti-proteasoma 5 20S utilizado a una dilución 1/1000 (CALBIOCHEM).

[0050] La incubación con el anticuerpo primario viene seguida de una incubación con un anticuerpo secundario anti-conejo IgG-peroxidasa (IMMUNOTECH) diluido 1/1000 en el caso de las proteínas ubiquitinadas, o con un anticuerpo secundario anti-ratón IgG-peroxidasa (IMMUNOTECH) diluido 1/1000 en el caso del proteasoma. La

10 revelación se efectúa por medio de un sustrato quimioluminiscente. La evaluación de las proteínas expresadas en las células se efectúa gracias al programa informático Chemiimager (Alpha Innotech Corporation USA). La cantidad de las proteínas estudiadas se expresa en porcentaje de intensidad luminosa en comparación con la condición control en el tiempo 0 del experimento.

15 Resultados: [0051]

Inmunoblot de las proteínas ubiquitinadas en queratinocitos en el transcurso del envejecimiento: 20

Intensidad (%): Experimento 1

No tratadas 10 días: 100 %

No tratadas 20 días: 71 %

No tratadas 30 días: 64 %

No tratadas 50 días: 56 %

Inmunoblot del proteasoma 20S en queratinocitos en el transcurso del envejecimiento

Intensidad (%): Experimento 1

No tratadas 10 días: 100 %

No tratadas 20 días: 94 %

No tratadas 30 días: 47 %

No tratadas 50 días: 54 %

25 Conclusión:

[0052] Por tanto, hemos demostrado en nuestro sistema de envejecimiento experimental que la tasa de proteínas ubiquitinadas disminuía con el tiempo y, de manera proporcional al tiempo de cultivo, al cabo de 40

30 días se registra una disminución de en torno al 56 % con respecto al tiempo 0. Del mismo modo, hemos demostrado en nuestro sistema de envejecimiento experimental que la tasa de proteasoma 20S disminuía con el tiempo y, de manera proporcional al tiempo de cultivo, al cabo de 40 días se registra una disminución de en torno al 54 % con respecto al tiempo 0.

35 [0053] Estos 2 experimentos nos permiten concluir que el envejecimiento experimental llevado a cabo en el laboratorio es un buen modelo de estudio del envejecimiento en las células en cultivo. Este modelo podrá ser utilizado, pues, en experimentos posteriores para demostrar la actividad y la eficacia de nuestro activo.

Ejemplo 2: Demostración del efecto activador del activo en la medida de la actividad enzimática del 40 proteasoma 20S en queratinocitos envejecidos mantenidos en cultivo

[0054] Queratinocitos envejecidos experimentalmente mantenidos en cultivo durante 15 días son tratados con 1 % de nuestro péptido SEQ ID n.° 1. Se estudian entonces las actividades enzimáticas del proteasoma 20S. En efecto, el proteasoma 20S es la subunidad responsable de la hidrólisis enzimática. Pueden estudiarse tres

45 actividades enzimáticas: la actividad tipo tripsina, tipo quimotripsina y peptidilglutamil-péptido hidrolasa (PGPH). Nos proponemos estudiar estas actividades por una cuantificación enzimática específica de cada actividad.

Protocolo

[0055] Los queratinocitos envejecidos se mantienen en cultivo durante 15 días. El tratamiento de las células se efectúa mediante la adición de una solución al 1 % de nuestro péptido SEQ ID n°1 directamente en el medio, que se renueva 3 veces por semana durante el tiempo que dura el experimento.

5 [0056] La cuantificación de cada actividad se ha establecido usando sustratos específicos marcados con un compuesto fluorescente: el 7-amido-4-metilcumarina (AMC).Tras la escisión, el AMC cuya longitud de onda de excitación es de 350 nm, se realiza la lectura de la fluorescencia a 440 nm. La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de fluorocromo obtenido y, en consecuencia, esta cantidad es proporcional a la cantidad de sustrato hidrolizado.

10 [0057] El péptido sintético Boc-Leu-Arg-Arg-AMC es específico de la actividad trípsica. El péptido sintético Suc-Leu-Leu-Val-Try-AMC es específico de la actividad quimotrípsica. El péptido sintético Z-Leu-Leu-Glu-AMC es específico de la actividad peptidilglutamilpéptido hidrolasa. Estos péptidos han sido suministrados y marcados por SIGMA ALDRICH, Saint-Louis, MI, EE. UU.

[0058] Las células se separan del soporte en un tampón de extracción. Después, son sonicadas durante 1

15 minuto a 4 °C, y después centrifugadas a 15 000 g durante 30 minutos a 4 °C. La cuantificación de las proteínas se lleva a cabo por el kit BCA (Pierce). Tras la incubación del lisado celular con el sustrato sintético específico de la actividad estudiada, se lee la fluorescencia en el espectrofotómetro Sinergy (BIOTEK, Vermont, EE. UU.) a 440 nm.

Resultados

20 [0059] Constatamos que para las 3 actividades estudiadas, el péptido SEQ ID n.º 1 ha permitido aumentar la actividad enzimática del proteasoma 20S. La actividad de tipo tripsina aumenta en un 155,3 % tras el tratamiento por el activo, la actividad de tipo quimotripsina aumenta en un 130 % y se registra un aumento de un 144,6 % para la actividad peptidilglutamil-péptido hidrolasa.

Conclusiones

25 [0060] El péptido SEQ ID n.º 1 utilizado a 1 % en queratinocitos envejecidos experimentalmente en cultivo permite aumentar las actividades enzimáticas específicas del proteasoma 20S.

[0061] El experimento se ha realizado varias veces, y ha podido realizarse una prueba estadística (prueba estadística t de Student). El aumento de las actividades es significativo para el estudio de la actividad de tipo

30 tripsina, de tipo quimotripsina (p = 0,033 y p = 0,0477, respectivamente) y altamente significativo para la actividad peptidilglutamil-péptido hidrolasa (p = 0,00053).

Ejemplo 3: Demostración del efecto antienvejecimiento del activo en queratinocitos envejecidos en cultivo

35 [0062] Se ha realizado un estudio del efecto antienvejecimiento del activo mediante la evaluación de la expresión de la proteína beta-galactosidasa en queratinocitos envejecidos experimentalmente en cultivo. En efecto, la actividad beta-galactosidasa se conoce por estar presente en las células senescentes, mientras que no encontramos actividad galactosidasa en las células pre-senescentes, quiescentes o inmortales.

40 Protocolo

[0063] Queratinocitos envejecidos experimentalmente en Labteck 8 pocillos se ponen en cultivo y se mantienen durante 20 días en presencia o no de 1 % de péptido SEQ ID n.º 1. El tratamiento se lleva a cabo 3 veces por

45 semana por adición directa en el medio.

[0064] Células no tratadas se mantienen en cultivo durante el mismo tiempo del experimento y sirven de control. El día del marcado, las células se lavan, se fijan en una mezcla de 2 % glutaraldehído -2 % formaldehído durante 3 minutos. A continuación, las células se enjuagan y se aplica 300 µl de 5-bromo-4-cloro-3 indolil ß-D

50 galactosidasa, comúnmente llamado X-gal (sustrato de la beta-galactosidasa). La incubación se efectúa durante 24 horas en la incubadora de CO2, y después las células se enjuagan y la Labteck se monta rápidamente en un medio adecuado. La observación se efectúa con microscopio de transmisión. El principio es simple: cuando las células son senescentes y contienen la beta-galactosidasa, el sustrato X-gal se escinde en un producto azul insoluble. La actividad beta-galactosidasa se evidencia por una coloración de las células azules. Cuantas más

55 células azules haya, mayor el número de células senescentes.

Resultados/Conclusiones:

[0065] Constatamos que, en presencia del activo, la actividad beta-galactosidasa se reduce en gran medida en las células tratadas en comparación con las células no tratadas.

[0066] En consecuencia, el activo permite demostrar un efecto antienvejecimiento en queratinocitos en cultivo 5 envejecidos experimentalmente durante 20 días de cultivo.

Ejemplo 4: Evaluación de la carbonilación de las proteínas en fibroblastos tratados con el activo y sometidos a rayos ultravioleta (UVB)

Protocolo:

[0067] Fibroblastos humanos normales en cultivo se siembran en cajas de diámetro 100. Cuando las células

10 alcanzan un 70 % de confluencia, las células se tratan 48 horas con el péptido de secuencia ID n.º 1 diluido a 1 % en el medio. Las células se someten a radiación UVB a 100 mj/cm2, y después se vuelven a poner 48 horas adicionales en presencia del activo. Unas cajas de control con células no tratadas con el activo pero irradiadas sirven de testigo. Las células se lavan y después se separan del soporte con ayuda de un tampón de extracción adecuado. Las proteínas extraídas de este modo se centrifugan a 4 °C a 10 000 rpm durante 10 minutos antes

15 de ser cuantificadas por el kit de cuantificación de proteínas por BCA (Pierce). La carbonilación de las proteínas se realiza por medio de una prueba basada en la inmunodetección de los grupos carbonilados previamente derivados por la 2, 4-dinitrofenilhidrazina (DNP) (SIGMA).

[0068] Según la reacción:

20 Proteína-C=O + H2N-NH-2.4DNP → Proteína-C=N-NH2.4-DNP + H2O

[0069] En resumen, se hacen reaccionar 15 µl de la muestra con 45 µl de DNP durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después, se diluye 5 µl de la mezcla en 1 ml de tampón fosfato salino y 200 µl de esta dilución se colocan en una placa de 96 pocillos durante la noche a 4 °C en presencia de 150 µl de BSA (fracción V).

25 [0070] Después de 3 lavados en tampón fosfato salino (PBS), el anticuerpo biotinilado de conejo anti-dinitrofenilo (CALBIOCHEM) se diluye 1/5000 en el tampón 0,1 % de albúmina de suero en presencia de 0,1 % de Tween 20 y se incuba en las microplacas durante 1 hora a 37 °C. Después de 3 lavados, se incuba el complejo estreptavidina-peroxidasa (DAKO) diluido 1/3000 en el tampón 0,1 % de albúmina de suero en presencia de 0,1 % de Tween 20 y se incuba en las microplacas durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de 3

30 lavados, el revelado se efectúa gracias a 200 µl de tetrametilbencidina (TMB, SIGMA) 25 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la adición de 100 µl de ácido sulfúrico 2,5 M permite detener la reacción. La lectura de la DO se realiza a 490 nm. Para convertir la DO obtenida en grupos carbonilados presentes en las muestras, se ha establecido una curva de referencia haciendo variar proporciones de 0 a 100 % de BSA oxidado.

35 Resultados:

[0071] En presencia de UVB las células no tratadas son fuertemente carboniladas y aumentan un 110 % en comparación con las células no irradiadas y no tratadas. En presencia del activo al 1 %, la tasa de carbonilación disminuye en un 34 %. El experimento se ha realizado varias veces, y ha podido realizarse una prueba estadística (prueba estadística t de Student). La disminución de la carbonilación es significativa y

40 p = 0,0298.

[0072] En conclusión, el activo permite proteger las células contra los efectos nocivos de los UV, es decir, contra

sus efectos oxidativos. El activo permite reducir más del 34 % la oxidación de las proteínas.

Ejemplo 5: Ensayo clínico

Protocolo para la evaluación clínica

45 [0073] 12 voluntarios de 29 a 56 años se aplicaron o bien un placebo o el activo peptídico de secuencia ID n.º 1 dos veces al día, mañana y noche, en una dosis de 2 mg/cm2 durante 24 días. Una evaluación clínica de los resultados ha permitido medir varios parámetros de arrugas y pequeñas arrugas.

La medida de arrugas y pequeñas arrugas se ha realizado gracias a QUANTIRIDE que es un método de evaluación que permite medir el número, longitud y profundidad de las arrugas haciendo una réplica de la piel

50 antes y después del tratamiento con ayuda de un polímero de silicona.

Los resultados se recogen en las siguientes tablas:

Claims

imagen1

imagen2