ES2600321T3 - Medios para la regeneración del hígado - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende células madre adiposas humanas para su uso en un método para la regeneración del hígado, que comprende administrar dichas células madre en el hígado mediante infusión o inyección intrahepática, en la que las células madre adiposas no están embebidas en una matriz que consiste en un polímero, seleccionado de un biopolímero y un polímero sintético, que forma un gel tridimensional.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Medios para la regeneracion del hngado

La presente invencion se refiere a medios para el tratamiento de la enfermedad hepatica aguda y cronica. En particular, se refiere a una composicion que comprende celulas madre adiposas humanas para la prevencion, mejora o tratamiento de la enfermedad hepatica aguda o cronica. Ademas, la divulgacion abarca un kit que comprende dicha composicion y, opcionalmente, medios para aislar celulas madre adiposas y/o medios para la administracion de celulas madre adiposas.

La enfermedad hepatica cronica se caracteriza por la destruccion progresiva del tejido hepatico a lo largo del tiempo. En esta categona se incluyen varias enfermedades del hngado, como cirrosis y fibrosis, siendo esta ultima a menudo precursora de la cirrosis.

La cirrosis es el resultado de la enfermedad hepatica aguda y cronica y se caracteriza por la sustitucion de tejido hepatico por el tejido cicatricial fibrotico y nodulos regenerativos que conducen a una perdida progresiva de la funcion hepatica. La fibrosis y la regeneracion nodular tiene como resultado la perdida de la arquitectura lobular microscopica normal del tngado. La fibrosis representa el crecimiento de tejido cicatricial que resulta de, por ejemplo, infeccion, inflamacion, lesion e incluso la curacion. Con el tiempo, el tejido cicatricial fibrotico reemplaza lentamente al tejido hepatico funcional normal que tiene como resultado una cantidad decreciente del flujo sangumeo al hngado dejando al hngado incapaz del procesamiento completo de nutrientes, hormonas, farmacos y sustancias toxicas que se encuentran en el torrente sangumeo. Las causas mas comunes de la cirrosis incluyen el alcoholismo, las infecciones virales por hepatitis C, la ingestion de toxinas y el hngado graso, pero tambien existen otras muchas causas posibles.

La infeccion cronica por el virus de la hepatitis C y la esteatohepatitis no alcoholica son las dos principales causas de enfermedad hepatica cronica en los Estados Unidos y se estima que afecta a entre tres y cinco millones de personas. Una preocupacion creciente es el continuo aumento del numero de ciudadanos de Estados Unidos, que actualmente asciende a mas de 30 millones, con obesidad y smdrome metabolico que tienen enfermedad del hngado graso no alcoholica, de los que aproximadamente el 10 por ciento desarrollara con el tiempo esteatohepatitis no alcoholica. Otras complicaciones corporales son una consecuencia de una perdida de la funcion hepatica. La complicacion mas comun de la cirrosis es una afeccion conocida como ascitis, una acumulacion de lfquido en la cavidad peritoneal, que puede conducir a un mayor riesgo de peritonitis bacteriana espontanea, posiblemente provocando la muerte prematura del paciente. Otras complicaciones potencialmente mortales de la cirrosis incluyen la encefalopatfa hepatica, una anomalfa neuropsicotica que se produce cuando las sustancias toxicas de la sangre que normalmente son eliminadas por el hngado impiden el correcto funcionamiento de las celulas cerebrales. Sin embargo, otra complicacion potencialmente mortal de la cirrosis incluye virus esofagicos o venas submucosas muy dilatadas en el esofago que son susceptibles de hemorragias.

Una vez que se ha producido en el hngado cirrosis o fibrosis, esta se considera generalmente irreversible. Por el contrario, el tratamiento convencional se centra en la prevencion de cualquier otra progresion de la cirrosis en el hngado y la mitigacion de las complicaciones que pueden surgir de la cirrosis. En etapas mas avanzadas de la cirrosis, el unico tratamiento conocido convencionalmente es un trasplante de hngado. La American Liver Foundation estima que mas de 300.000 personas en los Estados Unidos son hospitalizadas cada ano como consecuencia de la cirrosis del hngado. Asimismo, se estima que 18.000 personas necesitan un trasplante de hngado. En Alemania, el numero de trasplantes hepaticos fue de 5.083 en 2010, aunque aproximadamente unos 2.000 pacientes necesitan un trasplante de hngado.

El trasplante de celulas de hngado es un procedimiento emergente, que implica la infusion de una suspension de celulas hepaticas en el sistema portal del destinatario. Su objetivo es una recuperacion de la funcion hepatica del receptor como consecuencia de injerto y la repoblacion del parenquima enfermo. Sin embargo, debido a que el suministro de hepatocitos humanos maduros para el trasplante es todavfa limitado, de hecho, mas o menos tan limitado como la disponibilidad de todo el hngado, la investigacion tambien tiene como objetivo la obtencion de celulas trasplantables de otras fuentes, tales como celulas progenitoras y celulas madre, por ejemplo, de origen embrionario o adulto, que podnan ser expandibles, por ejemplo, in vitro, y capaces de diferenciarse en hepatocitos maduros funcionales, especialmente in vivo despues del trasplante. En consecuencia, existe una gran necesidad de desarrollar medios que sean utiles en el tratamiento de varias enfermedades o afecciones asociadas con enfermedades asociadas al hngado, particularmente dados los tratamientos inadecuados actualmente disponibles para la mayona de estos trastornos.

Por lo tanto, el problema tecnico subyacente de la presente invencion podna ser considerado como la provision de medios y metodos que cumplan las necesidades anteriormente mencionadas. Este problema tecnico se ha resuelto mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y en la presente memoria expuesta a continuacion.

El objetivo de los inventores de este estudio era evaluar la posibilidad de trasplante de celulas madre con el fin de regenerar el hngado, en particular en el campo de las enfermedades cronicas del hngado, ampliar las opciones

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

terapeuticas actualmente limitadas y por lo tanto mejorar la calidad de vida y supervivencia global de los pacientes afectados. Por lo tanto, se analizo la integracion de las celulas madre adiposas en el tejido hepatico enfermo y su capacidad para retomar las funciones espedficas del hngado. De acuerdo con ello, se establecio en ratas un dano hepatico cronico con ubicacion predominantemente periportal, un patron comparable al observado en la hepatitis viral, que es la causa mas frecuente de insuficiencia hepatica cronica [Jung et al. 2000, Scand J Gastroenterol 35, 969].

Para este fin se uso alcohol alflico que induce un dano predominantemente periportal con un pico que ocurre 48 horas despues de la inyeccion. En este experimento pudo observarse una alta variacion en el grado de necrosis de rata a rata, lobulo a lobulo y de corte a corte lo que es concordante con los resultados de otros estudios que utilizan el sistema de modelo de rata. Sin embargo, los inventores pudieron mostrar con sus experimentos que la inyeccion de celulas madre adiposas en el hngado danado despues de una hepatectoirna de 2/3 conduce a una restauracion significativamente mayor y mas temprana de la funcion del hngado en comparacion con el grupo control no tratado con celulas. Esto podna demostrarse por unos niveles mayores de albumina y de protema total. Es importante destacar que los inventores no observaron ningun efecto secundario negativo de la terapia celular, sobre todo la ausencia de formacion de tumores.

Sorprendentemente, las celulas madre inyectadas se pudieron encontrar desde la semana 1 hasta mas de 8 semanas despues de la cirugfa en cortes histologicos migrando desde el centro del lobulo hasta la periferia. No se observaron reacciones de compensacion de las celulas madre destruidas por los macrofagos, no observandose partfculas superparamagneticas de oxido de hierro (SPIO) en los macrofagos.

Tambien, en este experimento, los niveles de hierro mas bajos en los animales tratados con celulas 3 semanas despues de la cirugfa puede ser interpretado como una regeneracion mas rapida debido a las celulas madre inyectadas. Ademas, es poco probable que exista un gran recambio de las celulas madre marcadas con SPIO, ya que esto cabna esperar que condujese a un aumento de los niveles de hierro.

Por ultimo, los inventores han observado que la forma de administracion de las MSC en el hngado tiene un impacto en su distribucion y funcion en el parenquima hepatico. En este estudio, las celulas madre adiposas inyectadas directamente en el lobulo hepatico lateral restante migran desde una ubicacion inicialmente central en el lobulo hasta su periferia y se podfan encontrar hasta 8 semanas despues de la inyeccion. Esta observacion es de hecho sorprendente, ya que en otros estudios las celulas madre fueron inyectados a traves de la vena de la cola de los ratones (Banas et al. 2009, Hepatology 24, 70) o en el bazo (Aurich et al. 2009, Gut 58, 570), sin embargo, estos estudios no informan de resultados tan exitosos como los obtenidos por los presentes inventores. Aun mas, se suspendio incluso un estudio clmico en el cual se administraron celulas del estroma derivadas de tejido adiposo por via arterial intrahepatica (
http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01062750: Clinical Trials.gov Identificador: NTC01062750). Por lo tanto, es evidente que la forma de administracion es importante para una implantacion exitosa de las celulas madre, en particular, las celulas madre adiposas.

El documento WO200727689 divulga el trasplante de celulas madre adiposas a traves de inyeccion intrahepatica tras la encapsulacion.

Debe tenerse en cuenta que, como se usa en la presente memoria, las formas singulares “un”, “una" y “el”, “la” incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a “un anticuerpo” incluye uno o mas de tales anticuerpos diferentes y la referencia a “el metodo” incluye la referencia a etapas y metodos equivalentes conocidos por los expertos normales en la tecnica que podnan ser modificados o sustituidos por los metodos descritos en la presente memoria.

A menos que se indique lo contrario, la expresion “al menos” que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a todos los elementos de la serie. Los expertos en la tecnica reconoceran, o seran capaces de determinar usando no mas que la experimentacion de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones espedficas de la invencion descritas en la presente memoria.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, se entendera que implican la inclusion de un numero entero indicado o etapa o grupo de numeros enteros o etapas pero no la exclusion de cualquier otro numero entero o etapa o grupo de numero entero o etapa. Cuando se utiliza en la presente memoria, la expresion “que comprende” puede ser sustituida por la expresion “que contiene” o a veces, cuando se utiliza en la presente memoria por la expresion “que tiene”.

Cuando se usa en la presente memoria “que consiste en” excluye cualquier elemento, etapa, o ingrediente no especificado en el elemento de la reivindicacion. Cuando se utiliza en la presente memoria, “que consiste esencialmente en” no excluye materiales o etapas que no afectan materialmente a las caractensticas basicas y novedosas de la reclamacion. En cada caso en la presente memoria cualquiera de las expresiones “que comprende”, “que consiste esencialmente en” y “que consiste en” pueden ser sustituidos por cualquiera de las otras dos expresiones.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino conjuncion “y/o” entre varios elementos citados se entiende que incluye tanto las opciones individuals como combinadas. Por ejemplo, cuando dos elementos estan unidos por “y/o”, una primera opcion se refiere a la aplicabilidad del primer elemento sin el segundo. Una segunda opcion se refiere a la aplicabilidad del segundo elemento sin el primero. Una tercera opcion se refiere a la aplicabilidad de los elementos primero y segundo juntos. Cualquiera de estas opciones se entiende que entran dentro del significado y, por tanto, satisfacen el requisito de la expresion “y/o”, como se usa en la presente memoria. La aplicabilidad simultanea de mas de una de las opciones tambien se entiende que entra dentro del significado y, por tanto, satisface el requisito de la expresion “y/o” como se usa en la presente memoria.

En el texto de esta memoria descriptiva se citan varios documentos. Cada uno de los documentos citados en la presente memoria (incluyendo todas las patentes, solicitudes de patentes, publicaciones cientfficas, las especificaciones del fabricante, instrucciones, etc.), supra o infra, se incorporan por referencia en su totalidad. Nada en la presente memoria debe interpretarse como una admision de que la invencion no tiene derecho a antedatar dicha divulgacion en virtud de la invencion anterior.

Dados los hallazgos de los presentes inventores, la presente invencion se refiere a que comprende celulas madre adiposas humanas para la regeneracion del hngado (incluyendo tejido de hngado y/o regeneracion de las celulas del hngado). En la presente memoria, cuando se administran celulas madre adiposas “para”, por ejemplo, la regeneracion del hngado, se quiere decir que las celulas madre adiposas son “para su uso en un metodo para”, por ejemplo, la regeneracion del hngado. De acuerdo con ello, la presente invencion se refiere tambien a un metodo de regeneracion del hngado en un sujeto en necesidad del mismo que comprende la administracion de celulas madre adiposas a dicho sujeto, preferiblemente en una cantidad que es suficiente para regenerar el hngado.

Debido a las afecciones medicas que danan el hngado, en particular las descritas en la presente memoria en el contexto de la enfermedad hepatica cronica o aguda, surge la necesidad de regeneracion del hngado. El dano del hngado puede ser causado por cualquiera de las afecciones medicas descritas en la presente memoria en el contexto de la enfermedad hepatica aguda o cronica. La regeneracion del tngado es, sin embargo, tambien es importante despues de la cirugfa del hngado (incluyendo resectoirna del hngado, en particular resectoirna parcial del hngado), por ejemplo, cuando se elimina un tumor del hngado. No solo por el exito de la implantacion de celulas madre en el hngado danado, sino tambien por la reseccion de 2/3 del hngado, los presentes inventores demostraron que la composicion de la presente invencion es util para la regeneracion del hngado.

El termino “hngado” cuando se usa en la presente memoria incluye todo el organo del hngado o partes del mismo, el tejido hepatico y/o celulas del hngado.

Cuando se usa en la presente memoria “regeneracion del hngado” incluye generacion de novo de celulas del hngado, el tejido del hngado y todo el organo del hngado a partir de celulas madre adiposas. “Regeneracion del hngado” tambien incluye la activacion/estimulacion de las celulas del hngado que son capaces de reparar la estructura del hngado y/o repoblar el parenquima hepatico. La regeneracion de hngado se puede determinar/observar por la funcion del hngado, en particular mediante la medicion de los distintos parametros hepaticos descritos en la presente memoria tales como los descritos en el Ejemplo 6.4 y/o mediante el analisis de la expresion de los ARN espedficos de hepatocitos, tales como AFP (alfa fetoprotema), CK19 (citoqueratina), CK7, CX43 (conexina) (tfpico de hepatocitos precoces diferenciados) y/o CYP3A4 (citocromo), PCK1 (fosfoenolpiruvato carboxiquinasa), CPS (carbamil fosfato sintetasa), CK18, CX32, CD26, ALB, TFN (transferrina) (tfpico de hepatocitos diferenciados tardfos); vease la Figura 3 en Aurich et al. 2009, Gut 58, 570). Como alternativa, o ademas, la regeneracion del hngado puede ser evaluada por la histologfa de una muestra de hngado que se pueden obtener, por ejemplo, por biopsia. Tambien, como alternativa o ademas, la regeneracion del hngado se puede evaluar por inmunofluorescencia de glucogeno o CK19.

En un aspecto preferido, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende celulas madre adiposas humanas para la prevencion, mejora o tratamiento de la enfermedad hepatica aguda o cronica. Dicha composicion es por lo tanto para su uso en la prevencion, mejora o tratamiento de la enfermedad hepatica aguda o cronica. Ademas, dicha composicion es para su uso en un metodo para la prevencion, mejora o tratamiento de la enfermedad hepatica aguda o cronica que comprende la administracion de dicha composicion a un sujeto en necesidad del mismo.

El termino “composicion”, como se usa en la presente memoria significa una composicion que comprende celulas madre adiposas humanas que se pueden utilizar para la prevencion, mejora, o tratamiento de la enfermedad hepatica aguda o cronica. Por lo tanto, en una realizacion preferida de la presente invencion, la composicion de la invencion esta destinada a aplicaciones terapeuticas, por ejemplo, para la ingeniena de tejidos y la terapia celular. Una persona experta apreciara que la composicion detallada en la presente memoria puede implicar el uso de progenitores de las celulas madre adiposas humanas, celulas madre adiposas humanas en su forma no diferenciada o diferenciada, celulas madre adiposas humanas modificadas geneticamente, lmeas celulares de las mismas, poblaciones celulares que comprenden tales, asf como la progenie de las mismas, incluyendo la progenie diferenciada o no diferenciada o derivados modificados geneticamente de los mismos. Como se senalo anteriormente, estas celulas se pueden utilizar, por ejemplo, para terapias de reemplazo celular, en las que se injerta el hngado enfermo y se repuebla por las celulas madre adiposas para recuperar la funcion hepatica del receptor. Las

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

celulas se pueden administrar a un tejido de interes, preferiblemente tejido del hngado, en un sujeto para complementar las celulas que funcionan o reemplazar celulas, que han perdido la funcion. Preferiblemente, dicho sujeto es un ser humano. Como alternativa, tambien se contemplan las celulas madre adiposas humanas diferenciadas, en el que se afslan las celulas madre adiposas humanas, diferenciadas en presencia de factores de diferenciacion y/o crecimiento in vitro y se administran a un sujeto, como se detalla en la presente memoria. Los estados patologicos o las deficiencias tipificadas por la perdida de masa y/o funcion hepatica, y que podnan beneficiarse de las celulas madre adiposas humanas como se describe en la presente memoria incluyen enfermedades del hngado (hepaticas) agudas o cronicas.

La expresion “celula madre” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una celula progenitora capaz de auto-renovacion, es decir, que puede proliferar sin diferenciacion, por lo que la progenie de una celula madre o al menos parte de la misma retiene de manera sustancial el fenotipo no especializado o relativamente menos especializado, el potencial de diferenciacion y la competencia de proliferacion de la celula madre. La expresion abarca celulas madre capaces de auto-renovacion sustancialmente ilimitada, es decir, en las que la capacidad de la progenie o parte de la misma de seguir proliferando sustancialmente no se reduce en comparacion a la celula madre, asf como las celulas madre que muestran auto-renovacion limitada, es decir, en las que la capacidad de la progenie o parte de la misma de seguir proliferando se reduce manifiestamente en comparacion con la celula madre.

Un experto en la materia sabe que las propiedades anteriores se refieren en general al comportamiento in vivo de las celulas progenitoras y madre, y puede ser en condiciones apropiadas por completo o al menos en parte replicadas in vitro y/o ex vivo.

Basandose en la capacidad de dar lugar a diversos tipos de celulas, una celula progenitora o celula madre puede ser generalmente descrita como totipotente, pluripotente, multipotente o unipotente. Una unica celula “totipotente” se define como capaz de crecer, es decir, de desarrollarse, y dar lugar a un organismo completo. Una celula madre “pluripotente” no es capaz de crecer para dar lugar a un organismo completo, sino que es capaz de dar lugar a tipos de celulas procedentes de las tres capas germinales, es decir, mesodermo, endodermo y ectodermo, y puede ser capaz de dar lugar a todos los tipos de celulas de un organismo. Una celula “multipotentes” es capaz de dar lugar a al menos un tipo de celula de cada uno de dos o mas organos o tejidos de un organismo, en el que dichos tipos de celulas pueden proceder de la misma o de diferentes capas germinales, pero no es capaz de dar lugar a todos los tipos celulares de un organismo. Una celula “unipotente” es capaz de diferenciarse en celulas de un solo linaje de celulas.

En consecuencia, la expresion “celula madre adiposa” tal como se utiliza en la presente memoria denota un tipo de celula multipotente derivada originalmente de tejido adiposo. El experto en la tecnica apreciara que la composicion detallada en la presente memoria puede implicar el uso del progenitor de las celulas madre adiposas humanas, las celulas madre adiposas humanas en su forma no diferenciada o en una forma diferenciada, las celulas madre adiposas humanas modificadas geneticamente, las lmeas celulares de las mismas, las poblaciones de celulas que comprenden tales, asf como la progenie de las mismas, incluyendo la progenie diferenciada o no diferenciada o derivados modificados geneticamente de las mismas. Por ejemplo, las celulas madre adiposas incluyen, sin limitarse a, las celulas del estroma vascular derivadas de tejido adiposo, que son celulas precursoras/progenitoras. Las celulas madre adiposas tambien incluyen preadipocitos o celulas intersticiales derivadas de tejido adiposo, celulas madre derivadas de tejido adiposo, celulas madre de grasa, celulas progenitoras endoteliales, celulas madre hematopoyeticas o celulas madre mesenquimales.

La expresion “tejido adiposo”, como se usa en la presente memoria significa el tejido adiposo o grasa corporal o deposito de grasa, que es el tejido conectivo laxo compuesto por, entre otras cosas, adipocitos y celulas madre adiposas.

Sin estar ligado por la teona, se supone que las celulas madre adiposas se convierten en preadipocitos, los cuales se convierten a continuacion en adipocitos. En consecuencia, el tejido adiposo comprende celulas madre, preadipocitos y/o adipocitos. Tambien puede comprender lipoblastos. En los seres humanos, el tejido adiposo se encuentra, por ejemplo, debajo de la piel, alrededor de los organos internos, en la medula osea y en el tejido mamario.

El tejido adiposo se encuentra en lugares espedficos, que se denominan “depositos adiposos”. El tejido adiposo contiene varios tipos de celulas, siendo el mayor porcentaje de celulas adipocitos que contienen gotitas de grasa. Otros tipos de celulas incluyen fibroblastos, macrofagos, celulas endoteliales y celulas madre adiposas. Las celulas madre adiposas pueden prepararse y cultivarse de acuerdo con metodos convencionales. Por ejemplo, las celulas madre adiposas se pueden aislar mediante el troceado/trituracion mecanica de, por ejemplo, lobulos de grasa y/o tejido graso, seguido por la digestion enzimatica, tal como con colagenasa. El tejido graso o los lobulos de grasa puede, por ejemplo, aislarse y/o separarse de los tejidos adiposos mediante liposuccion, precipitacion, tratamiento con una enzima, tal como la colagenasa y eliminacion del sobrenadante, tal de eritrocitos mediante centrifugacion, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2005/042730. El aislamiento de los tejidos adiposos, el cultivo y la diferenciacion de las celulas madre adiposas tambien se muestran en los siguientes ejemplos. Se prefiere ademas, que la celula madre adiposa como se define en la presente memoria sea una celula madre adiposa humana, es decir derivada de un ser humano. Las celulas madre adiposas en la composicion o kit de la invencion se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

pueden usar solas o en combinacion con otras celulas madre mesenquimales, tales como, por ejemplo, celulas precursoras endoteliales.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresion “celula aislada” se refiere generalmente a una celula que no esta asociada con una o mas celulas o uno o mas componentes celulares con los que esta asociada la celula in vivo. Por ejemplo, una celula aislada puede haber sido eliminada de su entorno nativo, o puede resultar de la propagacion, por ejemplo, de la propagacion ex vivo, de una celula que ha sido eliminada de su entorno nativo. Preferiblemente, la celula madre adiposa tal como se usa en la presente memoria es una celula madre adiposa aislada. Por ejemplo, las celulas madre adiposas se pueden aislar a partir de tejido adiposo, por ejemplo, de tejido adiposo subcutaneo o peritoneal, u otros tejidos adecuados que comprenden celulas madre adiposas. Preferiblemente, las celulas madre adiposas se afslan de un ser humano.

La expresion “in vitro’’ como se usa en la presente memoria indica, fuera, o externo al cuerpo de un animal o preferiblemente el cuerpo de un ser humano. La expresion “in vitro’’ como se usa en la presente memoria debena entenderse como que incluye “ex vivo". La expresion “ex vivo" se refiere generalmente a tejidos o celulas que se extraen del cuerpo de un animal o de un ser humano y que se mantienen o propagan fuera del cuerpo, por ej., en un recipiente de cultivo.

La expresion “poblacion celular” como se usa en la presente memoria generalmente se refiere a una agrupacion de celulas. A menos que se indique lo contrario, la expresion se refiere a una agrupacion de celulas que consiste en o que comprende celulas madre adiposas aisladas como se define en la presente memoria. Una poblacion de celulas puede consistir en celulas que tienen un fenotipo comun o puede comprender al menos una fraccion de celulas que tienen un fenotipo comun. Las celulas se dice que tienen un fenotipo comun cuando son sustancialmente similares o identicas en una o mas caractensticas demostrables, incluyendo pero sin limitarse a. la apariencia morfologica, la presencia, ausencia o nivel de expresion de determinados componentes o productos celulares, por ejemplo, ARN, protemas , marcadores espedficos de celulas u otras sustancias, actividad de ciertas vfas bioqmmicas, capacidad de proliferacion y/o cinetica, potencial de diferenciacion y/o respuesta a las senales de diferenciacion o comportamiento durante el cultivo in vitro, por ejemplo, la adherencia, la no adherencia, el crecimiento en monocapa, la cinetica de proliferacion o similares. Por tanto, tales caractensticas demostrables pueden definir una poblacion de celulas o una fraccion de la misma.

Cuando en la presente memoria se dice que una poblacion es “heterogenea”, esto indica generalmente una poblacion de celulas que comprende dos o mas celulas o fracciones de celulas que no tienen un fenotipo comun, por ejemplo, una poblacion de celulas que comprende celulas de dos o mas tipos diferentes de celulas. A modo de ejemplo y no de limitacion, una poblacion heterogenea de celulas puede ser aislada a partir de tejido adiposo o grasa corporal o deposito de grasa y puede comprender diversos tipos de celulas incluyendo pero sin limitarse a celulas madre adiposas, fibroblastos, macrofagos y celulas endoteliales.

Cuando una poblacion de celulas se dice en la presente memoria que es homogenea, esta consiste en celulas que tienen un fenotipo comun. Una poblacion de celulas de la que se dice en la presente memoria que es “sustancialmente homogenea” comprende una mayona sustancial de celulas que tienen un fenotipo comun. Una poblacion de celulas “sustancialmente homogenea” puede comprender al menos 70 %, al menos 80 %, preferiblemente al menos 90 %, al menos 95 % o incluso al menos 99 % de celulas que tienen un fenotipo comun, tal como el fenotipo que se refiere espedficamente a, por ejemplo, el fenotipo de las celulas madre adiposas humanas como se ha definido en la presente memoria o progenitores de celulas madre adiposas humanas como se define en la presente memoria. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion “sustancialmente homogeneo” engloba tambien una poblacion homogenea.

La expresion “poblacion de celulas que comprende celulas madre adiposas humanas o progenitoras de las mismas” se refiere a una poblacion de celulas como se define en la presente memoria que comprende al menos un progenitor o celulas madre adiposas humanas y generalmente una fraccion de celulas progenitoras o celulas madre adiposas humanas, como se define en la presente memoria. Por lo general, el progenitor o las celulas madre adiposas humanas de dicha fraccion pueden tener un fenotipo comun.

La expresion “celula progenitora” se refiere generalmente a una celula no especializada o relativamente menos especializada y competente para la proliferacion, la cual o la progenie de la cual puede dar lugar a al menos un tipo de celulas relativamente mas especializadas. A modo de ejemplo y no de limitacion, una celula progenitora puede dar lugar a descendientes que pueden diferenciarse a lo largo de uno o mas linajes para producir celulas relativamente cada vez mas especializadas, en el que dichos descendientes y o celulas cada vez relativamente mas especializadas se convirtieron ellas mismas en celulas progenitoras, o incluso para producir celulas terminalmente diferenciadas, es decir, celulas completamente especializadas, que pueden ser post-mitoticas. La expresion tambien abarca celulas madre tal como se define en la presente memoria.

Se dice que una celula progenitora “da lugar” a otra celula relativamente mas especializada cuando, por medio de ejemplo y no de limitacion, la celula progenitora se diferencia para convertirse en la otra celulas sin sufrir primero division celular, o la otra celula se produce despues de una o mas rondas de division celular y/o diferenciacion de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

celula progenitora o de la progenie de la misma.

El termino “tratar” o “tratamiento” tal como se utiliza en la presente memoria denota la mejora o incluso la eliminacion de uno o mas smtomas asociados con una enfermedad hepatica aguda o cronica tal como se define en la presente memoria, mediante la administracion de una composicion de la invencion que comprende celulas madre adiposas humanas a un sujeto en necesidad del mismo, o usando el kit de la invencion.

El termino “mejora” como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier mejora del estado patologico de un paciente que tiene una enfermedad hepatica aguda o cronica especificada en la presente memoria, mediante la administracion de una composicion de la invencion que comprende celulas madre adiposas humanas a un sujeto en necesidad del mismo, o utilizando el kit de la invencion. Esta mejora tambien puede ser considerada como una ralentizacion o parada de la progresion de la enfermedad de un paciente que tiene una enfermedad aguda o cronica del hngado establecida en la presente memoria.

El termino “prevencion”, como se usa en la presente memoria significa la prevencion de la aparicion o reaparicion de una enfermedad hepatica tal como se especifica en la presente memoria, mediante la administracion de una composicion de la invencion que comprende celulas madre adiposas humanas a un sujeto en necesidad del mismo o utilizando el kit de la invencion.

Mediante el uso de la composicion o kit de la invencion que comprende las celulas madre adiposas descritas en la presente memoria, se puede lograr ventajosamente la regeneracion del fngado, la curacion acelerada despues de la reseccion parcial del hngado, la recuperacion acelerada o aumentada de la funcion hepatica en la insuficiencia hepatica, o un menor riesgo de aparicion de disfunciones hepaticas o insuficiencia hepatica o un efecto reducido de enfermedades metabolicas. Al mismo tiempo, los efectos adversos se reducen al mmimo, en comparacion con las terapias convencionales, tales como el trasplante de hngado.

La expresion “enfermedad hepatica”, como se usa en la presente memoria se refiere a un trastorno hepatico. En general, una enfermedad hepatica puede ser causada por cualquier afeccion que tenga como resultado la alteracion de la integridad morfologica y/o funcional del hngado de un cuerpo. La etiologfa y el tratamiento de las enfermedades del hngado se describen, por ejemplo, en Oxford Textbook of Medicine (Warrell, Oxford Textbook of Medicine) David A. Warrell, Timothy M. Cox, John D. Firth, Oxford University Press, EE.UU.; 5 edicion (22 de julio de 2010) Johns Hopkins Internal Medicine Board Review 2010-2011: Certification and Recertification: Expert Consult - Internet e Impreso (Redonda Miller, Bimal Ashar MD, Stephen Sisson, Johns Hopkins Hospital Mosby; 3a edicion (2 de marzo de 2010).

La expresion “enfermedad hepatica aguda” como se usa en la presente memoria significa la aparicion de complicaciones graves rapidamente despues de los primeros smtomas de la enfermedad hepatica, como ictericia, e indica que el hngado ha sufrido danos. Las complicaciones son, por ejemplo, la encefalopatfa hepatica y la alteracion de la smtesis de protemas, tal como se mide, por ejemplo, por los niveles de la albumina serica y el tiempo de protrombina en la sangre. La clasificacion de 1993 define hiperaguda dentro del plazo de 1 semana, aguda como 828 dfas y subaguda como 4-12 semanas (Williams et al. 1993, Lancet 342, 273). Refleja el hecho de que el ritmo de evolucion de la enfermedad influye fuertemente en el pronostico. La etiologfa subyacente es otro factor determinante significativo del resultado (Grady 2005, Postgrad Med J 81, 148). La “insuficiencia hepatica aguda” se produce cuando el hngado pierde rapidamente su capacidad para funcionar. La insuficiencia hepatica aguda es una enfermedad multisistemica compleja que evoluciona rapidamente despues de una lesion devastadora para el hngado que conduce al desarrollo de encefalopatfa. Aunque, mas comunmente, la insuficiencia hepatica se desarrolla lentamente durante el transcurso de los anos, en la insuficiencia hepatica aguda, la insuficiencia hepatica se desarrolla en cuestion de dfas. La etiologfa subyacente y el ritmo de progresion influyen fuertemente en la evolucion clmica. Las causas mas comunes son, por ejemplo, el paracetamol, las reacciones farmacologicas idiosincrasicas, la hepatitis B y la hepatitis seronegativa, amatoxinas o falotoxinas, ambas de las especies Amanita.

La expresion “enfermedad hepatica cronica” como se usa en la presente memoria denota un proceso patologico del hngado que consiste en la destruccion progresiva y la regeneracion del parenquima hepatico que conduce a fibrosis y cirrosis. Las causas de las enfermedades hepaticas cronicas pueden ser cualquier afeccion que tiene como resultado la degradacion gradual y renovacion de las celulas de los tejidos con el hngado de un cuerpo. Este proceso da lugar generalmente a fibrosis o cirrosis y puede ser potencialmente mortal en los casos de insuficiencia hepatica cronica. La clasificacion de las fuentes de las enfermedades hepaticas cronicas se dividen en cinco grupos: (i) causas virales como la hepatitis B y C o el citomegalovirus o el virus de Epstein Barr, (ii) causas metabolicas tales como hemocromatosis, enfermedad de hngado graso no alcoholica o enfermedad de Wilson, (iii) causas relacionadas con una respuesta autoinmunitaria tales como hepatitis cronica autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria o colangitis esclerosante primaria, (iv) causas relacionadas con toxinas tales como enfermedad hepatica alcoholica o nitrofurantoma, amiodarona, o metotrexato y (v) otras causas diversas, tales como insuficiencia cardfaca derecha. Sin embargo, la principal causa de enfermedad hepatica cronica es el uso excesivo de alcohol, lo que lleva a la cirrosis y la hepatitis. Por lo tanto, el grupo de mayor riesgo son las personas que son propensas al abuso de alcohol. Los smtomas asociados con la enfermedad hepatica cronica dependen del nivel de degeneracion en el hngado.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las etapas iniciales son generalmente asintomaticas y solo pueden ser detectadas por pruebas medicas espedficas como se define en la presente memoria. Las enfermedades hepaticas que hayan evolucionado a hepatitis pueden ser reconocidas por confusion mental, ictericia severa, problemas de coagulacion de la sangre o hemorragia intestinal. Aquellos casos que han llegado al nivel de la cirrosis pueden ser detectados por lo siguiente: problemas neurologicos, crecimiento de la mama en el hombre, contracciones de Dupuytren, perdida de cabello, insuficiencia renal, enrojecimiento de las palmas, falta de apetito, encogimiento testicular, debilidad, perdida de peso, picazon, calculos biliares y ascitis. La cirrosis se considera como una posible etapa final de muchas enfermedades hepaticas y se produce cuando el tejido hepatico sano se dana y se sustituye por tejido cicatricial. El proceso de sustitucion no sucede a la vez, sino que tiene lugar durante un penodo gradual de tiempo. El nuevo tejido cicatrizado impide la regeneracion o curacion de las celulas del tngado. A medida que el tejido cicatricial se extiende, el tngado pierde la capacidad de funcionar. Alrededor del 10 % de todos los bebedores extremos eventualmente llegan a la etapa de cirrosis. Se cree que la cirrosis se alcanza generalmente despues de diez anos de consumo excesivo de alcohol o mas. Desafortunadamente, una vez que un paciente ha sufrido danos en el tngado, este dano no es reversible. Sin embargo, la composicion y kit de la invencion comprende celulas madre adiposas humanas que se pueden utilizar ventajosamente para la mejora o tratamiento de las enfermedades hepaticas agudas o cronicas.

El termino “sujeto” como se usa en la presente memoria incluye un mairnfero tal como una rata, cerdo, ganado vacuno, caballo, oveja, particularmente un ser humano.

Usando un modelo de un dano hepatico toxico cronico en ratas, los inventores han investigado la capacidad del tejido hepatico enfermo para integrar celulas madre adiposas trasplantadas. Mediante la administracion intraperitoneal repetitiva de retrorsina y alcohol alflico, se inhibio la proliferacion de hepatocitos endogenos y se genero necrosis hepatica. Histologicamente, el dano hepatico debido a alcohol alflico es periportal y se asemeja a la insuficiencia hepatica viral que es la causa mas frecuente de esta insuficiencia organica en humanos. Para simular una reduccion en el tejido hepatico funcional y estimular la regeneracion, se realizo una hepatectoirna de dos tercios. Las celulas madre adiposas humanas se inyectaron directamente en el lobulo de tngado restante. Como se menciono en otra parte en la presente memoria, la administracion directa de celulas madre adiposas resulto ser decisiva para una implantacion exitosa y la regeneracion del tngado. De hecho, la tecnica anterior tal como Banas et al., Loc. cit., ensena la administracion de celulas madre adiposas a traves de la vena de la cola de los ratones. Se administro ciclosporina para lograr la inmunotolerancia hacia las celulas madre alogenicas. Cada semana despues de la cirugfa, se extrajeron muestras de sangre para determinar varios valores sangumeos hepaticos. Dos, cuatro, seis, ocho y doce semanas despues de la cirugfa, los animales se sacrificaron y se analizaron cortes histologicos. Los inventores encontraron que las celulas madre adiposas humanas habfan provocado un aumento importante de los niveles de albumina y de protema total despues de la operacion. Las celulas trasplantadas se podfan encontrar hasta ocho semanas despues de la cirugfa en cortes histologicos migrando desde el centro del lobulo hasta la periferia. No habfa eliminacion de las celulas madre adiposas humanas por los macrofagos. Una vez mas, este exito se contrapone a la tecnica anterior, tal como Banas et al., loc. cit., que no pudo observar celulas madre en el tngado. Por el contrario, estos autores observaron que las celulas madre estan, por ejemplo, en el conducto biliar, lo que es una indicacion de que las celulas madre o bien no alcanzan el tngado o fueron eliminadas del tngado. Los datos de la invencion demuestran que el uso terapeutico de celulas madre adiposas humanas ofrece una alternativa interesante al trasplante de hepatocitos o del organo del tngado en pacientes con insuficiencia hepatica severa, particularmente a la luz del hecho de que la cirrosis hepatica es la causa mas importante de insuficiencia hepatica cronica en los seres humanos y en vista de la persistencia de la falta de donantes de organos y los riesgos concomitantes en alotrasplantes.

En suma, en contraste con la tecnica anterior, tal como Banas, loc. cit., los presentes inventores observaron la supervivencia a largo plazo de las celulas madre asf como la proliferacion y por lo tanto la regeneracion del tngado. Por lo tanto, sin pretender imponer ninguna teona, la via de administracion de las celulas madre adiposas parece jugar un papel importante. Esto tambien puede ser derivable de un estudio clmico que se interrumpio. En particular, un ensayo clmico (identificador NCT01062750 “Terapia de regeneracion hepatica por administracion arterial intrahepatica de tejido adiposo autologo derivado de celulas del estroma”. En este ensayo se administraron celulas madre adiposas a los pacientes a traves de cateterismo arterial intrahepatico. Sin embargo, aparentemente no se tuvo exito en pacientes con cirrosis hepatica. Por lo tanto, de nuevo la via de administracion aplicada en este estudio es diferente de la ruta escogida por los presentes inventores y los presentes inventores tuvieron exito.

Otras ventajas de los medios de la presente invencion se pueden resumir brevemente como sigue: el tejido adiposo humano como una fuente potencial de celulas madre adiposas esta disponible casi de forma ubicua. Las celulas madre adiposas son faciles de aislar tal y como se describe en la presente memoria. Por otra parte, la recoleccion de tejido adiposo por, por ejemplo, liposuccion generalmente no causa graves danos en el sujeto. Las celulas madre adiposas no sobreviven mucho mas tiempo en el cultivo y tienen una actividad de proliferacion mayor en comparacion con las celulas madre derivadas de medula osea (BMSC). Ademas, las BMSC han demostrado ser un componente crucial en el desarrollo de la fibrosis hepatica durante la lesion hepatica, presumiblemente debido a la mediacion de la interleucina-10 (Lan et al. 2008, Transpl Int 21, 58192). Por el contrario, los inventores no vieron evidencia de un aumento de la fibrosis hepatica en ratas tratadas con celulas madre adiposas. Las celulas madre adiposas pueden ser cultivadas o crioconservadas. Ademas, las celulas madre adiposas se pueden utilizar en forma diferenciada o no diferenciada o (pre)diferenciada o se pueden utilizar en forma modificada geneticamente, aunque

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

se prefiere la forma no diferenciada. Ventajosamente, las celulas madre adiposas tal como se describe en la presente memoria pueden ser utilizados para (i) la regeneracion del tngado enfermo, (ii) la curacion acelerada despues de la reseccion parcial del tngado, (iii) la recuperacion acelerada o aumento de la funcion del tngado en la insuficiencia hepatica, (iv) la mediacion de un riesgo reducido de la ocurrencia de insuficiencia hepatica y/o (v) conferir un efecto reducido de los trastornos metabolicos. Al mismo tiempo, los efectos secundarios negativos se reducen al mmimo mediante el tratamiento de las enfermedades hepaticas con celulas madre adiposas en comparacion con las terapias convencionales, tales como el trasplante de tngado. Por ejemplo, las celulas madre adiposas autologas tal como se definen en la presente memoria se pueden usar para tratar la enfermedad hepatica de un paciente, evitando de este modo una respuesta inmunitaria contra las celulas madre terapeuticas. En vista de lo anterior, las celulas madre adiposas representan una manera mas facil, mas eficiente y mas segura que el trasplante del organo entero para curar a los pacientes que sufren enfermedad hepatica. Sin limitarse a la teona, los beneficios funcionales de las celulas madre adiposas pueden ser debido al apoyo funcional de las celulas trasplantadas o inyectadas. Tampoco se excluye la fusion con los hepatocitos del receptor. Del mismo modo, es posible el soporte y la activacion de celulas progenitoras endogenas.

Un problema en relacion con el uso terapeutico de las celulas madre adiposas humanas o progenitoras de las mismas es la cantidad de celulas necesarias para lograr un efecto optimo. La dosificacion para la administracion puede ser variable, puede incluir una administracion inicial seguida de administraciones posteriores, y puede ser comprobada por el tecnico experto haciendo uso de la presente divulgacion. Generalmente, la dosis o pauta administrada proporcionara una cantidad terapeuticamente eficaz de las celulas, es decir, se lograra el efecto y el rendimiento local o sistemico deseado. En estudios en humanos de celulas de medula osea mononucleares autologas, se han usado dosis empmcas que vanan de 1 a 4 *107 celulas con resultados alentadores. Sin embargo, diferentes escenarios pueden requerir la optimizacion de la cantidad de celulas madre adiposas humanas o sus progenitoras administradas, por lo tanto la cantidad de celulas a administrar variara para el sujeto que esta siendo tratado. En una realizacion preferida, se pueden administrar a un sujeto humano entre 102 a 109 o entre 103 a 109 o entre 104 a 109, tal como entre 104 y 108 o entre 105 y 107 , por ejemplo, aproximadamente 1*105, aproximadamente 5*105, aproximadamente 1*106, aproximadamente 2*10, aproximadamente 5*106, aproximadamente 1*107 o aproximadamente 2*107, aproximadamente 3*107, aproximadamente 4*107, aproximadamente 5*107, aproximadamente 6*107, aproximadamente 7*107, aproximadamente 8*107, aproximadamente 9*107 o aproximadamente 1*108 celulas. Incluso mas preferido, el numero de celulas madre adiposas que se administra al paciente es suficiente para repoblar al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, o 25 % o mas, tal como 30, 35, 40, 45, 50 % o incluso mas, tal como mas del 50 % de la masa hepatica del paciente. Sin embargo, la determinacion precisa de una dosis terapeuticamente eficaz puede basarse en factores individuales para cada paciente, incluyendo su tamano, edad, el alcance del dano tisular y la cantidad de tiempo desde que se produjo el dano y se puede determinar facilmente por los expertos en la tecnica a partir de esta divulgacion y del conocimiento en la tecnica.

Preferiblemente, la pureza de las celulas madre adiposas humanas o progenitoras de las mismas o de una poblacion celular que comprende dichas celulas para la administracion puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 55 %, aproximadamente 55 a aproximadamente 60 %, y aproximadamente 65 a aproximadamente 70 %. Mas preferiblemente, la pureza puede ser de aproximadamente 70 a aproximadamente 75 %, aproximadamente 75 a aproximadamente 80 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 85 % y lo mas preferiblemente, la pureza puede ser de aproximadamente 85 a aproximadamente 90 %, aproximadamente 90 % a aproximadamente 95 % y aproximadamente 95 % a aproximadamente 100 %. La pureza de las celulas madre adiposas se puede determinar, por ejemplo, segun el perfil de marcador de superficie celular expuesto en la presente memoria dentro de una poblacion celular. Para la determinacion de la pureza de las celulas madre adiposas, por ejemplo, se puede llevar a cabo el analisis FACS. Las dosis se pueden ajustar facilmente por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, una menor pureza puede requerir un aumento en la dosis.

El experto en la tecnica puede determinar facilmente la cantidad de celulas y los aditivos, vetnculos y/o portador opcionales en las composiciones de la invencion. Generalmente, cualquier aditivo (ademas de la celula o celulas progenitoras activas o celula o celulas madre adiposas y/o citocina o citocinas, pueden estar presentes en una cantidad de 0,001 a 50 % (p/p o p/v) en solucion salina tamponada con fosfato y el principio activo pueden estar generalmente presente en el orden de microgramos a miligramos, tal como aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 5 % (p/p o p/v), preferiblemente de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1 %, lo mas preferiblemente de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,05 % o de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 20 %, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 % y lo mas preferiblemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5 %.

Cuando se administra una composicion terapeutica de la presente invencion, por lo general, se puede formular en una forma de dosificacion unitaria inyectable o trasplantable (por ejemplo, solucion, suspension, dispersion, emulsion). Las formulaciones farmaceuticas adecuadas para inyeccion incluyen soluciones acuosas esteriles y dispersiones. Como se usa en la presente memoria, las soluciones o dispersiones incluyen un vetnculo o diluyente farmaceuticamente aceptable en el que las celulas madre adiposas permanecen viables tal como suero o medio de cultivo, por ejemplo, como se describe en la presente memoria. El vetnculo puede ser un disolvente farmaceuticamente aceptable o dispersion que contiene el medio, por ejemplo, agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol lfquido y similares) y mezclas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

adecuadas de los mismos.

Ademas, pueden anadirse varios aditivos que potencian la estabilidad, esterilidad e isotonicidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevencion de la accion de microorganismos se puede asegurar mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, penicilina, estreptomicina, y similares.

En muchos casos, sera aconsejable incluir agentes isotonicos para asegurar la viabilidad de las celulas, por ejemplo, azucares, cloruro de sodio y similares. La isotonicidad deseada de la composicion de esta invencion puede lograrse usando cloruro de sodio u otros agentes farmaceuticamente aceptables tales como dextrosa, acido borico, tartrato de sodio, propilenglicol u otros solutos inorganicos u organicos. El cloruro de sodio es particularmente preferido para tampones que contienen iones de sodio.

Para aumentar potencialmente la supervivencia celular al introducir el progenitor o las celulas madre o la progenie diferenciada de interes en sujeto en necesidad de las mismas, puede incorporarse o integrar dichas celulas en un biomaterial, que comprende preferiblemente una matriz, que comprende, por ejemplo, un biopolfmero o polfmero sintetico. Ejemplos de biopolfmeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, fibronectina, fibrina, fibrinogeno, trombina, colageno, proteoglicanos, quitosano, alginato y acido hialuronico. Un ejemplo de un polfmero sintetico es el polietilenglicol. Este podna ser con o sin citocinas, factores de crecimiento, factores de diferenciacion o construcciones de expresion de acidos nucleicos, etc. Tales polfmeros podnan estar, por ejemplo, en suspension o podnan formar un gel tridimensional con las celulas embebidas en su interior. Tales polfmeros pueden ser preferiblemente biodegradables. Las combinaciones de diferentes polfmeros tambien se incluyen en algunas realizaciones preferidas de la divulgacion.

La absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Segun la presente invencion, sin embargo, cualquier vehmulo, diluyente, o aditivo utilizado tendna que ser compatible con el progenitor o las celulas madre adiposas.

Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar mediante la incorporacion de las celulas madre adiposas utilizadas en la practica de la presente invencion en la cantidad requerida del disolvente apropiado con diversas cantidades de los otros componentes, segun se desee.

Tales composiciones pueden ademas mezclarse con un vehmulo, diluyente o excipiente adecuado tal como agua esteril, solucion salina fisiologica, glucosa, dextrosa, o similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, aditivos gelificantes o promotores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes y similares, dependiendo de la via de administracion y de la preparacion deseada.

Los textos estandar, tales como “Remington's pharmaceutical science”, 17a edicion, 1985, que se incorporan aqrn por referencia, pueden consultarse para preparar preparaciones adecuadas, sin experimentacion indebida.

La viscosidad de la composicion de la invencion, si se desea, puede mantenerse al nivel seleccionado utilizando un agente espesante farmaceuticamente aceptable. La metilcelulosa se prefiere debido a que es facil y economicamente disponible y es facil de trabajar. Otros agentes espesantes adecuados incluyen, por ejemplo, goma de xantano, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carbomero y similares. La concentracion preferida del espesante dependera del agente seleccionado. La cuestion es usar una cantidad que logre la viscosidad seleccionada. Las composiciones viscosas se preparan normalmente a partir de soluciones mediante la adicion de tales agentes espesantes.

La presente invencion tambien se refiere a medios para la prevencion, mejora o tratamiento de la enfermedad hepatica aguda o cronica, que comprenden la administracion de celulas madre adiposas humanas en su forma no diferenciada o en una forma diferenciada, o un progenitor de celulas madre adiposas humanas, lmeas celulares del mismo o poblaciones de celulas que comprenden tales, celulas madre adiposas humanas no diferenciadas o diferenciadas, opcionalmente modificadas geneticamente, a un sujeto, especialmente humano, en necesidad de tal tratamiento. Tal administracion es generalmente en una cantidad terapeuticamente eficaz, es decir, en general una cantidad que proporciona un efecto y rendimiento local o sistemico deseado. En otra realizacion preferida, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende celulas madre adiposas humanas en su forma no diferenciada o en una forma diferenciada, o un progenitor de celulas madre adiposas humanas, lmeas celulares del mismo o poblaciones de celulas que comprenden tales, celulas madre adiposas humanas no diferenciadas o diferenciadas, opcionalmente modificadas geneticamente. Preferiblemente, la composicion farmaceutica es para el tratamiento, la mejora o la prevencion de la enfermedad hepatica aguda o cronica tal como se define en la presente memoria. A modo de ejemplo y no de limitacion, tales celulas se pueden administrar ventajosamente por medio de inyeccion, que abarca tambien la administracion a traves de cateter, o el implante, por ejemplo, inyeccion localizada, inyeccion sistemica, inyeccion intraesplenica, inyeccion en una vena portal, inyeccion en el conducto hepatico, por ejemplo, debajo de la capsula hepatica, administracion parenteral, inyeccion intrauterina en un embrion o un feto,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

infusion o inyeccion intrahepatica, infusion o inyeccion intraperitoneal, trasplante de biomaterial que comprende dichas celulas, o por puncion del hngado o el parenquima hepatico. La celula madre adiposa tal como se define en la presente memoria se administra mediante una administracion seleccionada de infusion o inyeccion intrahepatica. La administracion puede, en otra realizacion preferida, ser apoyada por tecnicas de imagen como la ecograffa, la tomograffa por resonancia magnetica o la tomograffa computarizada. Las celulas se pueden proporcionar como una suspension de celulas en cualquier medio de conservacion, que contiene preferiblemente albumina humana, despues del procedimiento de aislamiento o despues de la descongelacion despues de la crioconservacion.

En una realizacion preferida de la composicion de la invencion, dicha enfermedad hepatica aguda o cronica se selecciona de entre la perdida de la funcion hepatica, isquemia, fibrosis y/o cirrosis.

En otra realizacion preferida de la composicion de la invencion, la enfermedad hepatica aguda o cronica se selecciona del grupo que consiste en: isquemia hepatica, fibrosis hepatica, cirrosis hepatica, insuficiencia hepatica aguda, enfermedad hepatica alcoholica, deficiencia de alfa-1-antitripsina, hepatitis autoinmunitaria, obstruccion del conducto biliar, insuficiencia hepatica cronica, hepatitis cronica, cirrosis, enfermedad hepatica colestasica, enfermedad qmstica del hngado, agrandamiento del hngado, hngado graso, galactosemia, calculos biliares, smdrome de Gilbert, hemocromatosis, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, adenoma de hngado, cancer de tngado, hemangioma de tngado, nodulo hepatico (hiperplasia nodular focal), hepatitis neonatal, enfermedad hepatica no alcoholica, esteatohepatitis no alcoholica, infeccion parasitaria, porfiria, trombosis de la vena porta, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, smdrome de Reye, sarcoidosis, esteatohepatitis, hepatitis toxica, tirosinemia, enfermedad de almacenamiento de glucogeno tipo I, hepatitis viral, enfermedad de Wilson, dano hepatico inducido por medicamentos, dano hepatico inducido por una toxina, o cualquier combinacion de los mismos. Ademas, la composicion y kit de la invencion son especialmente adecuados para la mejora o tratamiento de trastornos hepaticos adquiridos debido a infecciones virales o insuficiencia hepatica debido a la perdida de celulas o tejido del hngado, tales como los causados, por ejemplo, por lesion o cirugfa.

Por lo tanto, en otra realizacion preferida, las celulas madre adiposas humanas, los progenitores de celulas madre adiposas humanas, las lmeas celulares de los mismos o poblaciones de celulas que comprenden tales, celulas madre adiposas humanas no diferenciadas o diferenciadas, opcionalmente modificadas geneticamente como se detalla en la presente memoria, son para su uso en terapia y/o uso de las mismas para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades hepaticas agudas o cronicas. Tales enfermedades pueden incluir trastornos que afectan al tejido hepatico. Las enfermedades que afectan la viabilidad y/o la funcion hepatocffica se contemplan espedficamente, y pueden representar, por ejemplo, defectos congenitos, enfermedades hepaticas adquiridas, danos hepaticos inducidos por terapia, el efecto de una afeccion patologica, el efecto de un traumatismo, efectos toxicos o infecciones virales. Se contemplan espedficamente las enfermedades hepaticas que figuran en la presente memoria descriptiva. La administracion de las celulas madre adiposas humanas de acuerdo con la invencion puede conducir a la reconstitucion y/o regeneracion del tejido hepatico en el sujeto y/o al alivio de los smtomas de una enfermedad hepatica tal como se describe en la presente memoria. Mas espedficamente, mediante el uso de la composicion o kit de la invencion que comprende las celulas madre adiposas descritas en la presente memoria, se puede lograr la regeneracion del hngado, la curacion acelerada despues de la reseccion parcial del hngado, la recuperacion acelerada o aumentada de la funcion hepatica en la insuficiencia hepatica, o un menor riesgo de aparicion de disfunciones hepaticas o insuficiencia hepatica o un efecto reducido de enfermedades metabolicas. Las celulas se administran de una manera que permita su injerto y migracion al sitio de tejido deseado y reconstituir o regenerar la zona funcionalmente deficiente en el hngado.

En una realizacion preferida de la composicion de la invencion, la celula madre adiposa se afsla a partir de tejido adiposo humano o de cualquier otra fuente adecuada que comprende celulas madre adiposas.

El aislamiento de celulas madre adiposas es bien conocido en la tecnica y se especifica mas detalladamente en la presente memoria. Por ejemplo, las celulas madre adiposas se pueden aislar a partir de tejido adiposo subcutaneo o peritoneal, u otro tejido humano adecuado.

En una realizacion preferida adicional de la composicion de la invencion, la celula madre adiposa es una celula madre adiposa autologa, heterologa o xenologa.

El termino “autologa” en referencia a una celula madre adiposa como se usa en la presente memoria significa que la celula madre adiposa se deriva de la misma persona. En esta realizacion preferida, la presente invencion contempla ventajosamente la utilizacion del propio tejido de un paciente, tal como el tejido adiposo u otro tejido adecuado para aislar las celulas madre adiposas humanas o los progenitores de las celulas madre adiposas humanas. Tales celulas senan autologas para el paciente y podnan ser administradas facilmente al paciente, sin provocar una respuesta inmunitaria y/o sin correr el riesgo de transmision de un agente causal de una enfermedad como el VIH o el VHC. Por otra parte, si el paciente es portador de un defecto genetico subyacente a una patologfa particular, tal defecto podna ser evitado mediante la manipulacion genetica de las celulas madre adiposas obtenidas. En otra realizacion preferida, las celulas madre adiposas humanas o los progenitores de las celulas madre adiposas humanas se pueden aislar a partir de tejido que no es del propio paciente. En este caso, las celulas madre adiposas son celulas madre adiposas heterologas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El termino “heterologa”, como se usa en la presente memoria indica que la celula madre adiposa se deriva de otro individuo. Cuando se contempla la administracion de tales celulas a un paciente, puede ser preferible que el tejido sometido a un metodo para obtener la celula madre adiposa o su progenitor se seleccione de tal manera que se maximice, al menos dentro de los lfmites posibles, la compatibilidad del tejido entre el paciente y las celulas administradas, reduciendo asf la posibilidad de rechazo de las celulas administradas por el sistema inmunitario del paciente. Si las celulas se derivan de una fuente heterologa, es decir, no autologa, se puede administrar inmunosupresion concomitante, por ejemplo, usando agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina o FK506.

El termino “xenologa” como se usa en la presente memoria indica que la celula madre adiposa se deriva de una especie distinta del individuo al que esta destinado la celula madre adiposa a administrar. Por ejemplo, una celula madre adiposa puede aislarse de cerdos y administrarse a un ser humano.

En una realizacion preferida adicional de la composicion de la invencion, la celula madre adiposa es una celula madre mesenquimal.

La expresion “celula madre mesenquimal” como se usa en la presente memoria indica celulas madre multipotentes capaces de diferenciarse en celulas mesenquimales, tales como adipocitos, osteoblastos y condrocitos, aunque tambien miocitos, neuronas, celulas endoteliales, astrocitos y celulas epiteliales. Aunque se describio por primera vez en la medula osea de adultos normales, las celulas madre mesenquimales pueden tambien obtenerse de otras fuentes, tales como sangre del cordon umbilical, de la dermis o pulpa dental, medula osea y tejido adiposo. La definicion de las celulas madre mesenquimales en la presente memoria requiere criterios mmimos, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, adherencia plastica, potencial de diferenciacion multiple, expresion de marcadores de la superficie celular tales como CD105 y la falta de expresion de CD14, CD34 y CD45 (Pittenger et al. 1999, Science 284, 143).

En una realizacion preferida de la composicion de la invencion, la celula madre mesenquimal es positiva para los marcadores de superficie celular CD13, CD29, CD49a, CD63, CD73, CD90, CD105 y/o CD166 y/o negativa para los marcadores de superficie celular CD31, CD34, CD44, CD45 y/o CD106.

Como se expone en mas detalle en otra parte en la presente memoria, las celulas madre mesenquimales son celulas madre multipotentes que pueden diferenciarse en una variedad de tipos de celulas. Las celulas madre mesenquimales se pueden aislar facilmente y/o no muestran una fuerte tendencia a la degeneracion. En esta realizacion, la celula madre mesenquimal se caracteriza ademas por un perfil de marcador de la superficie celular espedfico. El termino “positivo para” como se usa en la presente memoria con respecto a marcadores de la superficie celular significa que, en una poblacion de celulas, mas de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o todas las celulas expresan dicho marcador. El termino “negativo para” como se usa en la presente memoria con respecto a marcadores de la superficie celular significa que, en una poblacion de celulas, menos de 20 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o ninguna de las celulas expresan dicho marcador. La expresion de los marcadores de la superficie celular se puede determinar, por ejemplo, por citometna de flujo, inmunohistoqmmica, ELISA, RT-PCR, transferencia de Northern o Western, para un marcador o marcadores de la superficie celular espedficos utilizando los metodos convencionales descritos en la tecnica.

En otra realizacion preferida de la composicion de la invencion, la celula madre adiposa es una celula madre mesenquimal no diferenciada, una celula madre mesenquimal diferenciada o una celula madre mesenquimal modificada geneticamente.

De acuerdo con esta realizacion, la celula madre adiposa puede ser una celula madre mesenquimal (CMM) indiferenciada, es decir, no diferenciada, una celula madre mesenquimal (pre)diferenciada o una celula madre mesenquimal modificada geneticamente. La celula mesenquimal se puede administrar en la composicion o kit de la invencion en un estado no diferenciado, por ejemplo, directamente despues de su aislamiento a partir de tejido adiposo. Se ha observado que la CMM indiferenciada es menos receptiva al estres oxidativo que los hepatocitos derivados de la CMM y, por lo tanto, tiene mas probabilidades de sobrevivir a la fase hipoxica inicial despues del trasplante (Kuo et al. 2008, 134 Gastroenterology, 2111). Ademas, el uso de celulas madre adiposas indiferenciadas es menos costoso, supone menos etapas de manipulacion y componentes de cultivo, con lo cual existe menos riesgo de contaminaciones e implica menos perdida de tiempo en el cultivo celular con la consiguiente posibilidad de iniciar rapidamente la terapia de urgencia.

En otra realizacion, la celula madre mesenquimal aislada se puede diferenciar o pre-diferenciar in vitro, antes de ser administrada al paciente que tiene una enfermedad hepatica. Mediante el uso de las celulas madre adiposas (pre)diferenciadas, la integracion de dichas celulas madre en el hngado enfermo y/o el reemplazo de las celulas hepaticas no funcionales puede ser mas eficiente. Por ejemplo, las celulas madre adiposas pueden someterse a diferenciacion adipogenica, osteogenica o hepatogenica eligiendo las condiciones de cultivo celular apropiadas, como se ejemplifica en los siguientes ejemplos; vease tambien Aurich et al., loc. cit

Ademas, las celulas madre adiposas no diferenciadas o (pre) diferenciadas pueden modificarse geneticamente, si es necesario, con el fin de compensar, por ejemplo, un defecto genetico en las celulas hepaticas de un paciente; vease,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

por ejemplo, el documento EP 2281875. Se describen metodos de transferencia genica para pacientes humanos, por ejemplo, en Alaee et al. (2011) Genetic vaccines and therapy; 9:4; Sellner et al. (2011) Leukemia & lymphoma; 52(3): 483-90; Grez (2011) Mol Ther; 19(1):28-35.

Los terminos “diferenciacion”, “diferenciar” o sus derivados, como se utiliza en la presente memoria indican el proceso por el cual una celula no especializada o relativamente menos especializada se convierte en relativamente mas especializada. En el contexto de la ontogenia de la celula, el adjetivo “diferenciada” es un termino relativo. Por lo tanto, una “celula diferenciada” es una celula que ha progresado mas en una cierta via de desarrollo que la celula con la que se esta comparando. Una celula diferenciada puede ser, por ejemplo, una celula terminalmente diferenciada, es decir, una celula totalmente especializada que lleva a cabo funciones especializadas en diversos tejidos y organos de un organismo, y que puede ser, o no post-mitotica. En otro ejemplo, una celula diferenciada puede ser tambien una celula progenitora dentro de un linaje de diferenciacion, que puede proliferar y/o diferenciarse mas.

De manera similar, una celula es “relativamente mas especializada” si ha progresado mas en una cierta via de desarrollo que la celula con la que se esta comparando, considerandose por consiguiente esta ultima “no especializado” o “relativamente menos especializada”. Una celula relativamente mas especializada puede diferir de la celula no especializada o relativamente menos especializada en una o mas caractensticas fenotfpicas demostrables, tales como, por ejemplo, la presencia, ausencia o nivel de expresion de componentes o productos celulares particulares, por ejemplo, ARN, protemas, marcadores celulares espedficos u otras sustancias, actividad de ciertas vfas bioqmmicas, aspecto morfologico, capacidad y/o cinetica de proliferacion, potencial de diferenciacion y/o respuesta a las senales de diferenciacion, etc., en las que tales caractensticas significan una mayor progresion de la celula relativamente mas especializada en la via de desarrollo.

Ejemplos no limitantes de diferenciacion pueden incluir, por ejemplo, el cambio de una celula madre pluripotente en un tipo dado de progenitor o celula madre multipotente, el cambio de un progenitor o celula madre multipotente en un tipo dado de progenitor o celula madre unipotente o el cambio de un progenitor o celula madre unipotente en tipos de celulas mas especializadas o a en celulas terminalmente especializadas dentro de un linaje de celulas dado. La diferenciacion de una celula no especializada o menos especializada en una celula mas especializada puede producirse por la aparicion de celulas con un grado intermedio de especializacion. Por ejemplo, las celulas madre mesenquimales aisladas pueden diferenciarse in vitro a adipocitos, hepatocitos u osteoblastos mediante el uso de factores de crecimiento y diferenciacion y componentes de cultivo celular adecuados (“Adipose-Derived Stem Cells - Methods and Protocols” Jeffrey M. Gimble and Bruce A Bunnell (Editors), Methods in Molecular Biology 702, Springer Protocols 2011; Lee et al. (2004) Hepatology 40(6): 1275-84). Por ejemplo, la diferenciacion adipogenica de las celulas madre adiposas puede ser inducida por el uso alternado de medio basal tal como FCS/DMEM 5 % suplementado con mezcla IDI, es decir, 3-isobutil-1-metilxantina 500 |jM, dexametasona 1 |jM, indometacina 1 |jM, durante 2 dfas, seguido de medio basal mas 10 jig/ml de insulina durante 1 dfa, como se describe en los siguientes ejemplos. El ciclo de induccion se repite 3 veces. La diferenciacion adipogenica se puede analizar utilizando cuantificacion con aceite rojo. La induccion osteogenica se puede iniciar cambiando el medio por DMEM que contiene FCS 5 %, suplementado con L-ascorbato-2-fosfato 50 jiM, dexametasona 0,1 jiM y p-glicerofosfato disodico 10 jiM. La deposicion de calcio puede ser demostrada histoqmmicamente mediante tincion con rojo de alizarina tal como se describe en los ejemplos adjuntos.

La induccion de la diferenciacion en hepatocitos o celulas similares a hepatocitos puede llevarse a cabo mediante el cultivo de celulas madre adiposas durante aproximadamente dos semanas en placas revestidas de colageno de tipo I y tratamiento con activina A 20 ng/ml y factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4) 20 ng/ml (FGF4) durante tres dfas, seguido de tratamiento con factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) 150 ng/ml, FGF1 100 ng/ml, oncostatina M 30 ng/ml, dexametasona 2x10-5 mol/l, 1 * insulina-transferrina-selenio (ITS), dimetilsulfoxido (DMSO) 1 % y nicotinamida 0,05 mmol/l durante diez dfas, y el mantenimiento en medio de cultivo de hepatocitos solo u opcionalmente, con dexametasona 10-8 mol/l y nicotinamida 0,05 mmol/l, como se detalla, por ejemplo, en Aurich et al. 2009, Gut 58, 570; Banas et al. 2008, J Gastroenterology and Hepatology 24, 70.

En consecuencia, en una realizacion preferida adicional de la composicion de la invencion, la celula madre mesenquimal diferenciada es una celula madre mesenquimal diferenciada adipogenicamente, osteogenicamente o hepatogenicamente.

La diferenciacion de las celulas madre adiposas en celulas diferenciadas adipogenicamente u osteogenicamente puede ser inducida por condiciones de cultivo celular definidas, como se indica anteriormente y se demuestra en los siguientes ejemplos. Ademas abarcada por la composicion de la invencion es la diferenciacion de celulas madre adiposas en una celula hepatogenicamente diferenciada, es decir, hepatocitos o celulas similares a hepatocitos, como se describe, por ejemplo, por Aurich et al. (Gut 2009, 58, 570). Las celulas madre adiposas pueden en una realizacion diferenciarse in vitro antes de ser administradas a un sujeto que tiene una enfermedad hepatica aguda o cronica. Preferiblemente, la celula madre adiposa a la que se hace referencia en la presente memoria se diferencia en una celula diferenciada adipogenicamente, tal como un adipocito, o en una celula diferenciada osteogenicamente, tal como un osteoblasto, o en una celula diferenciada hepatogenicamente, tal como un hepatocito, como se detalla en la presente memoria a continuacion y en Aurich et al., loc. cit. Se prefiere que dicha celula madre adiposa

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

diferenciada en una celula diferenciada adipogenicamente se caracterice por la acumulacion de gotitas de trigliceridos y/o Kpidos y/o la expresion de al menos un gen espedfico de adipocitos, tal como, sin limitacion, el gen de la lipoprotema lipasa o del receptor activado por el proliferador de peroxisomas y2 (PRARy2) o GAPDH. Tambien se prefiere que dicha celula madre adiposa diferenciada en una celula diferenciada osteogenicamente se caracterice por deposiciones de fosfato de calcio extracelular y/o la expresion de al menos un gen espedfico de osteoblastos, tal como, sin limitacion, osteonectina u osteocalcina. Preferiblemente, dicha celula madre adiposa diferenciada en un hepatocito exhibe al menos un marcador espedfico de hepatocitos, tal como, sin limitacion, albumina, CD26, CD29, HepParl, carbamoil fosfato sintetasa, triptofano 2,3-dioxigenasa, P450 tipo 3A4 (CYP3A4) , FOXA2 o el receptor de asialoglicoprotema (AGPR) y/o al menos una funcion espedfica de hepatocitos, tal como, sin limitacion, por ejemplo, formacion de urea, metabolismo de las purinas, actividad de la enzima citocromo P450, smtesis y almacenamiento de protemas, transformacion de los hidratos de carbono, smtesis de colesterol, sales biliares y fosfolfpidos, desintoxicacion, modificacion y excrecion de sustancias exogenas y endogenas, formacion y secrecion de bilis, captacion de lipoprotema de baja densidad o la smtesis y almacenamiento de glucogeno. Dichas celulas madre adiposas diferenciadas en hepatocitos son preferiblemente negativas para marcadores de celulas progenitoras de hepatocitos como CK7 o CX43. Otros marcadores y funciones espedficas de hepatocitos son bien conocidos en la tecnica (Sato et al. (2005) Blood 106(2): 756-63; Lee et al. (2004) Hepatology 40(6):1275-84.

En otra realizacion de la composicion de la divulgacion, la composicion comprende ademas una matriz en la que estan embebidas las celulas.

De acuerdo con esta realizacion, las celulas madre adiposas tal como se definen en la presente memoria estan embebidas en una matriz, que comprende, por ejemplo, un biopolfmero o polfmero sintetico, con el fin de incrementar potencialmente la supervivencia celular cuando se introducen las celulas madre en un sujeto en necesidad del mismo, por ejemplo, proporcionando una estructura tridimensional a las celulas madre adiposas. Los biopolfmeros adecuados incluyen, sin limitacion, fibronectina, fibrina, fibrinogeno, trombina, colageno y proteoglicanos. Como polfmero sintetico, se puede utilizar, por ejemplo, polietilenglicol. La matriz puede en algunas realizaciones comprender, ademas de las celulas madre adiposas, citocinas, factores de crecimiento, factores de diferenciacion o construcciones de expresion de acidos nucleicos y componentes de la matriz extracelular, etc. Tales polfmeros pueden estar, por ejemplo, en suspension o pueden formar un gel tridimensional con las celulas embebidas en su interior. Preferiblemente, tales polfmeros pueden ser biodegradables. Las combinaciones de diferentes polfmeros tambien estan abarcadas por algunas realizaciones preferidas de la invencion. En otra realizacion, la matriz comprende un hidrogel.

Preferiblemente, la matriz comprende polietilenglicol, colageno, fibrina, o una combinacion de los mismos.

En otra realizacion preferida mas de la composicion de la invencion, la composicion comprende ademas un biomaterial, sobre el que se recubren las celulas.

Preferiblemente, el biomaterial es fibronectina, fibrina, fibrinogeno, trombina, colageno, proteoglicanos, quitosano, alginato y alginato de acido hialuronico, quitosano, acido hialuronico, polietilenglicol o cualquier otro biomaterial como se describe en la presente memoria.

En otra realizacion mas de la composicion de la invencion, la composicion comprende ademas suero u otros componentes de la sangre, tales como plasma.

El plasma o el suero a menudo contienen factores y componentes celulares que son necesarios para la viabilidad celular y la expansion. El plasma se obtiene normalmente a partir de una muestra de sangre completa, que se proporciona o pone en contacto con un anticoagulante, tal como heparina, citrato o EDTA, en, o poco despues de extraer la muestra de sangre, para prevenir la coagulacion. Posteriormente, los componentes celulares de la muestra de sangre se separan del componente lfquido (plasma) por centrifugacion. El suero se puede obtener a partir de plasma mediante la eliminacion del anticoagulante y de la fibrina.

Preferiblemente, el suero es suero humano o suero humano de plasma pobre en plaquetas.

En otra realizacion preferida de la composicion de la invencion, la celula madre adiposa se administra (es para ser administrada) (i) directamente despues del aislamiento, (ii) despues del cultivo y/o la proliferacion en cultivo celular o (iii) despues de la crioconservacion.

De acuerdo con esta realizacion, la celula madre adiposa se puede utilizar para la administracion al paciente que tiene una enfermedad hepatica directamente despues del aislamiento. Las celulas madre tambien se pueden mantener en cultivo de celulas y/o propagar en condiciones que permiten el crecimiento y la duplicacion de dichas celulas sin diferenciacion. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, las que se utilizan para la obtencion de las celulas madre. Una persona experta capaz de evaluar la presencia o ausencia de diferenciacion celular podra establecer facilmente otras condiciones. Esto puede aumentar el numero de las celulas madre disponibles para el uso adicional de las mismas. Los presentes inventores han observado que las celulas madre adiposas primarias o de cualquier pase posterior podfan crioconservarse para su uso posterior, como se conoce generalmente en la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

tecnica para las celulas de mai^ero. Los presentes inventores han encontrado que las celulas madre adiposas aisladas retienen sustancialmente su capacidad de proliferacion despues de la congelacion y descongelacion. Dichas celulas se pueden almacenar como una suspension concentrada de celulas congeladas, descongeladas, como generalmente se hace en la tecnica y sembradas de nuevo en las mismas condiciones como se describe, por ejemplo, en los siguientes ejemplos. En otra realizacion, las celulas madre adiposas aisladas pueden diferenciarse en tipos celulares mas especializados, mediante el uso de condiciones de cultivo celular adecuadas, como se describe en la presente memoria.

En una realizacion preferida adicional de la composicion de la invencion, la celula madre adiposa se administra (es para ser administrada) mediante infusion/inyeccion intrahepatica, con el apoyo de tecnicas de imagen como la ecograffa, la tomograffa por resonancia magnetica o la tomograffa computarizada.

En una realizacion preferida adicional de la composicion de la invencion, el nivel de protema total y/o el nivel de albumina en el suero se incrementa, en comparacion con un sujeto no tratado.

El nivel de protema total y/o el nivel de albumina en el suero se pueden determinar por metodos descritos en la tecnica, por ejemplo a partir de sangre o suero.

En otra realizacion de la composicion de la invencion, el nivel de hierro en el suero se reduce, en comparacion con un sujeto no tratado.

El nivel de hierro en el suero se puede determinar por metodos descritos en la tecnica, por ejemplo, a partir de sangre o suero.

Las pruebas de la funcion hepatica son un grupo de analisis de sangre de bioqmmica clmica disenadas para dar informacion sobre el estado del hngado de un paciente. Los parametros medidos incluyen albumina, protema total, hierro, colinesterasa, lactato deshidrogenasa, transaminasa glutamico-oxalacetica, transaminasa glutamico-piruvica, fosfatasa alcalina, bilirrubina (directa e indirecta) y otros. Las transaminasas hepaticas (aspartato aminotransferasa (AST) y alanino aminotransferasa (ALT incluyendo GPT y AST) no son pruebas de la funcion hepatica, pero son biomarcadores del dano hepatico en un paciente con cierto grado de la funcion hepatica intacta. La mayona de las enfermedades hepaticas solo causan smtomas leves al principio, pero es vital que se puedan detectar estas enfermedades a tiempo. Esta prueba se realiza en una muestra de suero o plasma de un paciente obtenida por flebotoirna. Algunas pruebas estan asociadas con la funcionalidad (por ejemplo, albumina); algunas de ellas con la integridad celular (por ejemplo, las transaminasas) y algunas con afecciones relacionadas con la via biliar (gamma- glutamil transferasa y fosfatasa alcalina). Como es conocido para los expertos en la tecnica, varias pruebas bioqmmicas son utiles en la evaluacion y tratamiento de pacientes con disfuncion hepatica. Estas pruebas se pueden utilizar para (1) detectar la presencia de enfermedad hepatica, (2) distinguir entre diferentes tipos de trastornos hepaticos, (3) medir el grado de dano hepatico conocido y (4) seguir la respuesta al tratamiento.

Se pueden utilizar las mediciones de protema total para detectar y facilitar el diagnostico de la enfermedad hepatica. Los bajos niveles de protema total pueden sugerir un trastorno hepatico. Un nivel de protema total mas alto en el suero de un paciente que tiene una enfermedad hepatica tratada con celulas madre adiposas es indicativo de la restauracion de la funcion hepatica, en comparacion con el nivel de protema total en el suero de un paciente no tratado con la misma enfermedad hepatica.

La albumina es una protema producida espedficamente por el tngado y se puede medir de forma barata y facilmente. Es el principal constituyente de las protemas totales; la fraccion restante se llama globulina, incluyendo las inmunoglobulinas. Los niveles de albumina estan disminuidos en la enfermedad hepatica cronica, como la cirrosis. Un nivel de albumina superior en el suero de un paciente que tiene una enfermedad hepatica tratada con celulas madre adiposas indica restauracion de la funcion hepatica, en comparacion con el nivel de albumina en el suero de un paciente no tratado que tiene la misma enfermedad hepatica.

Mediante el uso de un modelo animal, los inventores pudieron demostrar en los siguientes ejemplos que la inyeccion de celulas madre adiposas en el hngado danado despues de una hepatectomna de 2/3 conduce a una restauracion significativamente mayor y mas temprana de la funcion hepatica en comparacion con el grupo control no tratado con celulas. Esto podna demostrarse por unos niveles mas altos de albumina y de protema total.

Los niveles de hierro en suero son elevados en las enfermedades hepaticas y se han utilizado como marcador de dano hepatico en el pasado. Bajos niveles de hierro en un sujeto tratado con celulas madre adiposas que tiene una enfermedad hepatica pueden ser interpretados como una regeneracion mas rapida del hngado, en comparacion con el nivel de hierro en el suero de un paciente no tratado que tiene la misma enfermedad hepatica.

Los niveles de hierro mas bajos en los animales tratados con celulas 3 semanas despues de la cirugfa pueden ser interpretados como una regeneracion mas rapida debido a las celulas madre adiposas inyectadas, como puede deducirse de los ejemplos adjuntos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La alanina transaminasa o alanina aminotransferasa (ALT), tambien llamada transaminasa glutamico-piruvica serica (SGPT), es una enzima presente en los hepatocitos y se utiliza como un marcador de la lesion hepatica. Cuando una celula se dana, esta enzima se filtra en la sangre, en la que se mide. La ALT aumenta drasticamente en el dano hepatico agudo, como la hepatitis viral o la sobredosis de paracetamol. Las elevaciones se miden a menudo en multiplos del lfmite superior de la normalidad (LSN).

La aspartato transaminasa o aspartato aminotransferasa (AST), tambien llamada transaminasa glutamico- oxalacetica serica (SGOT), es similar a ALT al tratarse de otra enzima asociada a las celulas del parenquima hepatico. Se utiliza como marcador de lesion hepatica ya que se eleva en el dano hepatico agudo. Sin embargo, dicha enzima esta tambien presente en los eritrocitos y en el musculo cardfaco y esqueletico y, por lo tanto, no es espedfica del tugado. La relacion entre AST y ALT a veces se utiliza para diferenciar entre las causas de dano hepatico.

Se preve que la ALT, la AST, la lactato deshidrogenasa y/o el amomaco se reduzcan despues de la administracion de las celulas madre adiposas al paciente humano que tiene una enfermedad hepatica tal como se define en la presente memoria.

La fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima presente en las celulas que recubren los conductos biliares del tugado. Los niveles de ALP en el plasma aumentaran en caso de una obstruccion del conducto biliar grande, colestasis intrahepatica o enfermedades infiltrativas del tugado. Sin embargo, la ALP tambien esta presente en el hueso y en el tejido placentario.

La bilirrubina es un producto de degradacion del grupo hemo. El tugado es responsable de la eliminacion de la sangre de la bilirrubina. La bilirrubina se absorbe en los hepatocitos, se conjugado y se secreta en la bilis, la cual se excreta en el intestino. El aumento de la bilirrubina total causa ictericia, y puede ser senal de problemas hepaticos que se reflejan como deficiencias en el metabolismo de la bilirrubina, por ejemplo, la reduccion de la absorcion en hepatocitos, el deterioro de la conjugacion de la bilirrubina y la reduccion de la secrecion de los hepatocitos de la bilirrubina. Ejemplos de ello son la cirrosis y la hepatitis viral.

Aunque razonablemente espedfica del Idgado y un marcador mas sensible del dano colestasico que la ALP, la gamma glutamil transpeptidasa (GGT) puede estar elevada con niveles incluso menores, sub-clmicos, de disfuncion hepatica. Por ejemplo, la GGT esta elevada en la toxicidad alcoholica cronica. Tambien puede ser util para identificar la causa de una elevacion aislada de la ALP.

Las pruebas de la funcion hepatica que analizan los parametros mencionados anteriormente se describen, por ejemplo, en Manizate F, Hiotis Sp, Labow D, Roayaie S, Schwartz M. Liver functional reserve estimation: state of the art and relevance for local treatments: the Western perspective. Journal of hepato-biliary-pancreatic sciences; 17(4):385-8; Martinez SM, Crespo G, Navasa M, Forns X. Noninvasive assessment of liver fibrosis. Hepatology (Baltimore, Md; 53(1):325-35; Rodriguez et al. (2010) Nutr Hosp; 25(5):712-7.

En otra realizacion mas de la composicion de la invencion, las celulas madre se pueden detectar durante al menos 4, 6, o preferiblemente 8 semanas, mas preferiblemente mas de 8 semanas despues de la infusion o del trasplante.

Como se desprende de los siguientes ejemplos, las celulas madre adiposas inyectadas migran desde una ubicacion inicialmente central en el lobulo hasta su periferia y se podfan encontrar hasta 8 semanas despues de la inyeccion.

La divulgacion tambien se refiere a una matriz implantable que comprende celulas madre adiposas humanas para la prevencion, mejora o tratamiento de la enfermedad hepatica aguda o cronica.

Las definiciones y ventajas establecidas en la presente memoria para la composicion y kit de la divulgacion se aplican mutatis mutandis a la matriz implantable. La matriz puede contener polietilenglicol, colageno, fibrina, o una combinacion de los mismos, opcionalmente con un tampon fisiologicamente aceptable.

La divulgacion ademas se refiere a una composicion en un tampon fisiologicamente compatible, que comprende: celulas madre adiposas humanas y al menos uno de (i) una sustancia semisolida o (ii) una sustancia biodegradable o (iii) suero humano, preferiblemente suero de plasma pobre en plaquetas, para la prevencion, mejora o tratamiento de la enfermedad hepatica aguda o cronica.

La sustancia semisolida o sustancia biodegradable puede ser acido hialuronico, colageno, trombina, elastina, sulfato de condroitina, albumina o una mezcla de los mismos.

Por ultimo, la divulgacion se refiere a un kit que comprende la composicion o la matriz implantable de la invencion y una hoja de instrucciones, para la prevencion, mejora o tratamiento de la enfermedad hepatica aguda o cronica. El kit puede comprender celulas madre adiposas humanas que son autologas o heterologas respecto al paciente como se describe en la presente memoria, asf como medios para el aislamiento de celulas madre adiposas y/o medios para la administracion de celulas madre adiposas tal como se describe en la presente memoria, lo mas

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

preferiblemente mediante infusion o inyeccion intrahepatica. En consecuencia, dicho kit puede contener por tanto una hoja de instrucciones que describe el metodo para aislar y/o cultivar y/o administrar las celulas madre adiposas tal como se describe en la presente memoria.

La hoja de instrucciones contiene informacion sobre la dosificacion y administracion de las celulas madre adiposas, opcionalmente con las condiciones del cultivo celular para la proliferacion y/o diferenciacion de las celulas madre adiposas. En cuanto a la matriz implantable, esta contiene informacion acerca de la implantacion de la matriz implantable.

FIGURAS

La Figura 1 muestra los resultados de FACS de las celulas madre adiposas humanas (hADSC) utilizando los marcadores de superficie celular indicados. Las celulas madre fueron positivas para CD13, CD29, CD49a, CD63, CD73, CD90, CD105 y/o CD166 y/o negativas para CD31, CD34, CD44, CD45 y/o CD106. Las celulas, por lo tanto, cumplen con los criterios de consenso mmimos para las celulas madre mesenquimales.

La Figura 2 muestra la tincion con aceite rojo para la acumulacion de triacilgliceridos intracelulares en celulas madre adiposas humanas diferenciadas adipogenicamente. Las celulas madre inducidas adipogenicamente mostraron una concentracion mas alta de aceite rojo estadfsticamente significativa que los controles no inducidos en todos los donantes.

La Figura 3 muestra la tincion con rojo de alizarina para la deposicion de calcio extracelular en las celulas madre adiposas humanas (hADSC) diferenciadas osteogenicamente. Las hADSC diferenciadas osteogenicamente mostraron una elevada deposicion de calcio extracelular, analizada con tincion de rojo de alizarina. Las celulas no inducidas no mostraban deposicion de calcio extracelular.

La Figura 4 muestra los niveles sericos de albumina, protema total, CHE (colinesterasa), GOT (transaminasa glutamico-oxaloacetica) y LDH (lactato deshidrogenasa). Las barras negras muestran los valores estandar normales, las barras rojas los valores de los animales tratados con celulas y las barras verdes los valores de animales control no tratados con celulas. Los datos se expresaron como la media ± EE. Los resultados se analizaron mediante la prueba t de Student y cuando la prueba de normalidad fallaba, con la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney. P < 0,05 fue considerado estadfsticamente significativo.

La Figura 5 muestra la tincion con azul de Prusia de celulas madre adiposas humanas marcadas con SPIO (partfculas superparamagneticas de oxido de hierro) en cortes de lobulo de hfgado de rata. a) 2 semanas despues de la inyeccion y b) 4 semanas despues de la inyeccion.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen a fin de proporcionar a los expertos ordinarios en la tecnica una exposicion y descripcion completas de como hacer y utilizar las realizaciones, y no se pretende limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invencion ni se pretende representar que los experimentos a continuacion son todos o los unicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los numeros utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero debenan tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, y la temperatura es en grados Celsius. Se utilizan abreviaturas estandar.

Ejemplo 1: Celulas

Aislamiento de celulas madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo

Despues de obtenido el consentimiento informado, se aislaron celulas del estroma mesenquimales de tejido adiposo subcutaneo recien extirpado de seis adultos (mujeres en el intervalo de 34-59, con una mediana de la edad de 39,5 anos) sometidos a cirugfa plastica electiva utilizando un procedimiento modificado de Hauner et al. (1989). En resumen, despues de la eliminacion de tejido fibroso, el tejido adiposo se lavo dos veces en BSA/PBS 1 %, se trituro y digirio enzimaticamente con colagenasa, (colagenasa CLS; 220 U/mg, Biochrom AG, Berlin, Alemania, 1,5 mg/ml, en BSA/solucion de Krebs-Ringer) 1 % durante 45 minutos bajo agitacion constante a 37 ° C. Los adipocitos maduros y el tejido conjuntivo se separaron por centrifugacion (700 x g, 7 min., TA). Las celulas sedimentadas se resuspendieron, se pasaron a traves de un filtro de malla de 100 pm (Neolab, Heidelberg, Alemania) y se lavo dos veces con BSA/PBS 1 %. Despues de la lisis de loso eritrocitos (3 minutos, cloruro de amonio 155 mM, bicarbonato de potasio 10 mM; EDTA 0,1 mM), las celulas se lavaron de nuevo dos veces y se sembraron a una densidad de 2 * 104 celulas/cm2 en medio de expansion. Despues de 12 horas, se cambio el medio para eliminar las celulas no adheridas. El medio de expansion se reemplazo cada segundo dfa.

Las celulas se cultivaron en medio de expansion (DMEM 60 % (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania)), MCDB-201 40 % (Sigma), 1 * insulina-transferrina- selenio (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania), dexametasona 10-8 M, acido

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ascorbico-2-fosfato 0,1 mM, suero de ternera fetal 2 % (Biochrom, Berlm, Alemania), penicilina 100 U/ml (Biochrom), estreptomicina 0,1 mg/ml (Biochrom), EGFhr 10 ng/ml (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania) y rhPDGF-BB 10 ng/ml (CellSystems, St. Katharinen, Alemania). El medio se intercambio cada segundo d^a. Una vez que las celulas alcanzaron 70 % de confluencia, estas fueron separadas con tripsina-EDTA 0,25 % (Biochrom, Berlin, Alemania) y se volvieron a sembrar con 3,5 * 103 celulas por cm2. Los cultivos se incubaron a 37 ° C con CO2 5 %.

Ejemplo 2: Diferenciacion adipogenica y osteogenica

Diferenciacion adipogenica

Las celulas se sembraron en medio de expansion a una densidad de 24.000 celulas/cm2 Despues de alcanzar 90 % de confluencia, la adipogenesis se indujo mediante el uso alternado de medio basal (FCS/DMEm 5 %) suplementado con mezcla IDI (3-isobutiM-metilxantina 500 pM, dexametasona 1 pM, indometacina 1 pM) durante 2 dfas, seguido de medio basal mas 10 pg/ml de insulina durante 1 dfa, como se describe en los siguientes ejemplos. El ciclo de induccion se repite 3 veces. La diferenciacion adipogenica se analizo utilizando cuantificacion con aceite rojo como se describe anteriormente [Rairnrez-Zacarias et al. 1992, Histochemistry 97, 493].

Diferenciacion osteogenica

Despues de sembrar con una densidad de 24.000 celulas/cm2, las celulas se cultivaron en medio de expansion hasta el 90 % de confluencia. La induccion osteogenica se inicio cambiando el medio por DMEM que contema FCS 5 %, suplementado con L-ascorbato-2-fosfato 50 pM, dexametasona 0,1 pM y p-glicerofosfato disodico 10 mM. La deposicion de calcio se demostro histoqmmicamente mediante tincion con rojo de alizarina tal como se describe anteriormente (Landoff (1948) Acta Orthop Scand. 1948; 17 (3-4):270-302; Wise et al. (1979) J. Biol. Chem. 54(2): 273-5. Un protocolo tfpico para la cuantificacion de calcio de CMM diferenciadas osteogenicamente es el siguiente: Las celulas se analizaron 14, 21, 35, y 42 dfas despues de la induccion de la diferenciacion. Las capas de celulas de CMM diferenciadas osteogenicamente se lavaron dos veces con PBS sin Mg2 +/Ca2 +. El Ca2+ extracelular depositado se extrajo con HCl 0,6 M mediante la incubacion de las celulas a temperatura ambiente en un agitador de placa durante 2 horas. Los extractos se centrifugaron durante 5 minutos a 15.700 x g y el contenido de Ca2+ en el sobrenadante se cuantifico por el metodo del complejo de O-cresolftalema (Fluitest Ca-CPC, Biocon, Vohl- Marienhagen, Alemania). Posteriormente las celulas extrafdas se lavaron tres veces con PBS sin Mg2+/Ca2+, se rasparon con una espatula de goma en NaOH 0,1 M/SDS 1 % y se trataron con ultrasonidos tal como se describe anteriormente. Despues de centrifugacion a 4 ° C y 8.000 * g durante 5 minutos se determino el contenido de protema de los sobrenadantes con el kit BCA (Pierce, Rockford, EE.UU.).

Un protocolo tfpico para la tincion de alizarina es como sigue: las monocapas de CMM mineralizadas se lavaron dos veces con un exceso de PBS y se fijaron con etanol al 70 % pre-refrigerado durante 1 hora a -20 ° C. Despues de una etapa breve de lavado con H2O la capa de celulas se incubo con rojo de alizarina 40 mM (pH 4,2) durante 1 minuto a temperatura ambiente. Despues de la aspiracion del colorante no incorporado, las celulas se lavaron dos veces mas con exceso de H2O y una vez con PBS antes del analisis microscopico

Ejemplo 3: Citometna de flujo

Se examinaron celulas madre adiposas humanas (hADSC) expandidas hasta el pase cuatro para determinar la expresion del marcador de superficie mediante citometna de flujo. Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales (mAb) conjugados con fluorocromos: anti-CD13-APC, anti-CD29-PE, anti-CD31-FITC, anti-CD34- FITC, anti-CD44-APC, anti-CD45-FITC, anti-CD49a-PE, anti-CD63-FITC, anti-CD73-PE, anti-CD90-APC, anti- CD105-FITC, anti-CD166-PE (todos de Becton Dickinson). Para todos los fluorocromos se incluyeron anticuerpos de isotipo.

Las celulas fueron separadas con tripsina-EDTA 0,25 %, se incubaron con mAb conjugados directamente en tampon FACS (FCS 1 %, NaNa 0,1 % en PBS) durante 30 min en hielo, se lavaron dos veces con tampon FACS y se fijaron con paraformaldel'ndo/PBS 1 %. Las celulas se analizaron utilizando un sistema de citometna de flujo FACSCanto (Becton Dickinson). La adquisicion y el analisis de los datos se realizo con el software Diva (Becton Dickinson).

Ejemplo 4: Marcado con SPIO

Las celulas se marcaron con partfculas superparamagneticas de hierro para el rastreo in vivo. Esto no interfirio con la proliferacion o diferenciacion celular.

Ejemplo 5: Animales

Todos los estudios se llevaron a cabo siguiendo los protocolos aprobados por el Comite de Uso de Cuidado de Animales de la Universidad Ruprecht Karls de Heidelberg, Alemania, y en conformidad con los Institutos Nacionales de Salud.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Las ratas Sprague Dawley hembra con un peso de 140-200 g se adquirieron en Charles River Laboratories. Estas se mantuvieron en un ciclo automatico de 12 h de luz/oscuridad y se alimentaron con pienso estandar para ratas y agua ad libitum.

Administracion de agentes toxicos

Despues de 1 semana de aclimatacion, todas las ratas recibieron dos inyecciones intraperitoneales de retrorsina, separadas por un intervalo de 13 d^as, cada una de 30 mg/kg de peso. La retrorsina se disolvio en HCl (pH 2,5), seguido de neutralizacion con NaOH 0,1 N, como se ha descrito (Lan et al. 2008, Transpl Int 21, 58192; Kuo et al. 2008, Gastroenterology 134, 2111).

Treinta dfas despues de la segunda inyeccion, los animales recibieron 10 inyecciones repetidas de alcohol alflico cada tres dfas, cada una de 0,31-0,372 mmol/kg de peso corporal. Tres dfas despues de la ultima inyeccion de alcohol alflico, todos los animales fueron sometidos a una hepatectoirna parcial de dos tercios; vease el procedimiento quirurgico.

Procedimiento quirurgico

Tres dfas despues de la ultima inyeccion de alcohol alflico, todos los animales fueron sometidos a una hepatectomfa parcial de dos tercios (vease, por ejemplo, Gordon et al. (2000) American Journal of Pathology 156 (2): 607-19; Laconi et al. Cell Transplantation 2008; 17(12):1415-21).

Se extirpo el lobulo hepatico derecho e izquierdo medial y el lobulo hepatico lateral izquierdo, todos los demas lobulos quedaron in situ. Los animales fueron divididos aleatoriamente en dos grupos. El grupo 1 recibio 2 * 106 de CM en 200 pl de DMEM inyectadas directamente en el lobulo hepatico lateral derecho restante, el grupo 2 recibio 200 pl de DMEM. El orificio de entrada se cerro con un breve electroimpulso bipolar. Despues de un enjuague a fondo para eliminar los coagulos de sangre, se implanto una bomba osmotica (ALZET) en la cavidad abdominal para la liberacion continua de ciclosporina. La pared abdominal se cerro en 3 pasos solo con suturas. Los lobulos del hngado extirpados se fijaron en formalina para la estadificacion y el analisis histologico. El cuidado postoperatorio se administro con buprenorfina y carprofeno cada 12 horas y en caso necesario.

Concentraciones sanguineas

Se extrajo sangre a traves de la vena de la cola cada 7 dfas, comenzando desde el dfa 3 despues de la operacion para determinar las concentraciones de colinesterasa, protema total, albumina, GOT, GPT, hierro y lactato deshidrogenasa.

Ejemplo 6: Resultados

Ejemplo 6.1: Citometna de flujo

Las celulas madre adiposas humanas (hADSC) fueron positivas para los marcadores de la superficie celular CD13, CD29, CD49a, CD63, CD73, CD90, CD105 y CD166. Las hADSC fueron negativas para los marcadores de la superficie celular CD31, CD34, CD44, CD45 y CD106. Por lo tanto, las celulas cumplen los criterios de consenso mmimos para las celulas madre mesenquimales; vease la Figura 1.

Ejemplo 6.2: Aislamiento y cultivo de celulas

Diferenciacion adipogenica

Las celulas inducidas adipogenicamente mostraron una concentracion de aceite rojo mas alta estadfsticamente significativa que la de los controles no inducidos en todos los donantes; vease la Figura 2.

Diferenciacion osteogenica

Las hADSC diferenciadas osteogenicamente mostraron una elevada deposicion de calcio extracelular, se analizaron con tincion de rojo de alizarina; vease la Figura 3. Las celulas no inducidas no mostraron deposicion de calcio extracelular.

Ejemplo 6.3: Parametros de laboratorio

Antes de la primera aplicacion de retrorsina, todas las concentraciones sanguineas determinadas en los animales de experimentacion fueron concordantes con las concentraciones de base publicadas en la literatura.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ejemplo 6.4: Concentraciones sanguineas postoperatorias

Los datos se expresaron como la media ± EE. Los resultados se analizaron mediante la prueba t de Student y cuando la prueba de normalidad fallaba, con la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney. P < 0,05 fue considerado estad^sticamente significativo

Albumina

Las concentraciones postoperatorias de albumina estuvieron sistematicamente por debajo de los valores estandar. Hubo concentraciones de albumina mas altas estadfsticamente significativas en los animales tratados con celulas que en los animales control no tratados con celulas en la semana uno y dos despues de la cirugfa (p = 0,016-0,017). La albumina funciona como un buen marcador para la smtesis hepatica.

Proteina total

La proteina total fue mas elevada en los animales tratados con celulas a lo largo de todo el penodo de analisis. Los valores estandar se alcanzaron despues de la tercera semana despues de la cirugfa en los animales tratados con celulas y despues de la sexta semana en los animales de control. Las concentraciones de proteina total fueron estadfsticamente significativamente mayores en el grupo tratado con celulas en comparacion con el grupo control en la semana uno y dos despues de la cirugfa (p = 0,015-0,031).

Colinesterasa (CHE)

Las concentraciones postoperatorias de CHE estaban claramente por debajo de los valores estandar, lo que representa un marcador espedfico del hngado de una funcion hepatica y smtesis significativamente reducidas, inicialmente entre 30 y 50 %. No se alcanzo el valor estandar dentro del penodo de la investigacion. No hubo diferencia estadfsticamente significativa entre los grupos tratados con celulas y los no tratados con celulas. El grupo de control no tratado tema concentraciones mas altas de CHE que el grupo tratado con celulas. En ambos grupos las concentraciones de CHE comenzaron a aumentar lentamente 6 semanas despues de la cirugfa hasta el 75 % del valor estandar en la semana 10 despues de la cirugfa.

Lactato deshidrogenasa (LDH)

Las concentraciones postoperatorias de LDH en los animales de control permanecieron sistematicamente por debajo de los valores estandar. En los animales tratados con celulas hubo un maximo de LDH en la semana 2 despues de la cirugfa. En semanas 2, 4 final de la 5, la LDH fue estadfstica y significativamente mayor en el grupo tratado con celulas (p = 0,003-0,04).

Transaminasa glutamico-oxalacetica (GOT)

La GOT era mas elevada en los animales tratados con celulas que en los animales no tratados con celulas desde la primera hasta la octava semana despues de la cirugfa, siendo en las semanas 1 y 8 esta diferencia estadfsticamente significativa (p <0,001-0,014).

Transaminasa glutamico-piruvica (GPT)

La administracion de alcohol alflico y retrorsina condujo a una elevacion de las concentraciones de GPT antes de la cirugfa en comparacion con las concentraciones estandar. Las concentraciones postoperatorias de GPT fueron mayores en el grupo no tratado con celulas, con un maximo en la segunda semana despues de la cirugfa. No hubo diferencia estadfsticamente significativa entre los animales tratados con celulas y los no tratados con celulas. La GPT se considera que es espedfica del dgado.

Fosfatasa alcalina {.AP}

La fosfatasa alcalina estaba claramente elevada en comparacion con las concentraciones normales despues de la cirugfa hasta la semana 6. Despues de la semana 6, las concentraciones de fosfatasa alcalina fueron mayores en los animales tratados con celulas en comparacion con los animales control. No hubo una diferencia estadfstica significativa (p> 0,05).

Hierro

Las concentraciones postoperatorias de hierro estaban claramente por debajo de las concentraciones normales. Desde la semana 3 despues de la cirugfa, los animales tratados con celulas mostraron una concentracion menor de hierro que los animales control. No hubo diferencia estadfsticamente significativa entre ambos grupos (p> 0,05).

Ejemplo 6.5: Histolog^a

Las celulas migraron despues de la inyeccion desde el centro del lobulo hasta la periferia. Las celulas marcadas con SPIO se tineron con colorante azul de Prusia. No se encontraron partfculas SPIO en los macrofagos. Debido a la 5 alta intensidad de hierro del hngado, las partfculas SPIO no se pudieron detectar por resonancia magnetica. Se pudo observar una gran variacion en el grado de necrosis de una rata a, de un lobulo a otro y de un corte a otro. No se ha observado durante todo el periodo de seguimiento de 16 semanas la formacion de tumores.

Claims (19)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion que comprende celulas madre adiposas humanas para su uso en un metodo para la regeneracion del tngado, que comprende administrar dichas celulas madre en el tngado mediante infusion o inyeccion intrahepatica, en la que las celulas madre adiposas no estan embebidas en una matriz que consiste en un polfmero, seleccionado de un biopolfmero y un poKmero sintetico, que forma un gel tridimensional.
2. 2. La composicion para el uso de la reivindicacion 1 para la prevencion, mejora o tratamiento de la enfermedad hepatica aguda o cronica.
3. 3. La composicion para el uso de la reivindicacion 2, en la que la enfermedad hepatica aguda o cronica se selecciona de perdida de la funcion hepatica, isquemia, fibrosis y/o cirrosis.
4. 4. La composicion para el uso de la reivindicacion 2 o 3, en la que la enfermedad hepatica se selecciona del grupo que consiste en: isquemia hepatica, fibrosis hepatica, cirrosis hepatica, insuficiencia hepatica aguda, enfermedad hepatica alcoholica, deficiencia de alfa-1-antitripsina, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis cronica, cirrosis, enfermedad hepatica colestasica, enfermedad qmstica del tngado, tngado graso, galactosemia, calculos biliares, smdrome de Gilbert, hemocromatosis, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, cancer de tngado, hepatitis neonatal, enfermedad hepatica no alcoholica, esteatohepatitis no alcoholica, porfiria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, smdrome de Reye, sarcoidosis, esteatohepatitis, tirosinemia, enfermedad del almacenamiento del glucogeno tipo I, hepatitis vmca, enfermedad de Wilson o cualquier combinacion de las mismas.
5. 5. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la celula madre adiposa se afsla a partir de tejido adiposo humano.
6. 6. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la celula madre adiposa es una celula madre adiposa autologa, heterologa o xenologa.
7. 7. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la celula madre adiposa es una celula madre mesenquimal.
8. 8. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la celula madre mesenquimal es positiva para los marcadores de la superficie celular CD13, CD29, CD49a, CD63, CD73, CD90, CD105 y/o CD166 y/o negativas para los marcadores de la superficie celular CD31, CD34, CD44, CD45 y/o CD106.
9. 9. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la celula madre adiposa es una celula madre mesenquimal indiferenciada, una celula madre mesenquimal diferenciada o una celula madre mesenquimal modificada geneticamente.
10. 10. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la celula madre mesenquimal diferenciada es una celula madre mesenquimal diferenciada adipogenicamente, osteogenicamente o hepatogenicamente.
11. 11. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composicion se formula como una solucion, suspension, dispersion o emulsion.
12. 12. La composicion para el uso de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas un biomaterial, sobre el cual se recubren las celulas.
13. 13. La composicion para el uso de la reivindicacion 12, en la que el biomaterial es fibronectina, fibrina, fibrinogeno, trombina, colageno, proteoglicanos, quitosano, alginato y alginato de acido hialuronico, quitosano, acido hialuronico o polietilenglicol.
14. 14. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas suero o plasma.
15. 15. La composicion para el uso de la reivindicacion 14, en la que el suero es suero humano o suero humano de plasma pobre en plaquetas.
16. 16. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la celula madre adiposa se administra (i) directamente despues del aislamiento, (ii) despues del cultivo y/o la proliferacion en cultivo celular o (iii) despues de la crioconservacion.
17. 17. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el nivel de protema total y/o el nivel de albumina en el suero aumenta, en comparacion con un sujeto no tratado.
18. 18. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el nivel de hierro en el suero disminuye, en comparacion con un sujeto no tratado.
19. 19. La composicion para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las celulas madre 5 adiposas se pueden detectar durante al menos 4, 6, o preferiblemente 8 semanas despues de la infusion o el

    trasplante.