ES2600353T3 - Procedimiento de fabricación de cerveza con ahorro de energía - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para preparar una bebida a base de cebada con bajos niveles de uno o más sabores indeseables y/o precursores de los mismos, donde el procedimiento implica un ingreso reducido de energía, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (i) suministro de una planta de cebada o una parte de la misma, donde dicha planta de cebada comprende: (a) una primera mutación que produce una pérdida total de lipoxigenasa (LOX)-1 funcional; y (b) una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional; y (c) una tercera mutación que produce una pérdida total de S-adenosilmetionina:metionina S-metiltransferasa funcional (MMT); (ii) opcionalmente malteado de al menos parte de dicha cebada, obteniendo así cebada malteada; (iii) maceración de dicha cebada y/o cebada malteada y opcionalmente adjuntos adicionales, obteniendo así un mosto; (iv) calentamiento de dicho mosto opcionalmente en presencia de ingrediente(s) adicional(es), donde como máximo el 4% del volumen de mosto se evapora, obteniendo así mosto calentado; (v) procesamiento de dicho mosto calentado en una bebida; preparando así la bebida a base de cebada con bajos niveles de uno o más sabores indeseables y/o precursores de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de fabricación de cerveza con ahorro de energía
CAMPO DE LA INVENCIÓN 5
La presente invención se refiere a procedimientos con ahorro de energía para preparar bebidas a base de cebada, por ejemplo bebidas a base de malta, tales como cerveza.La invención más adicionalmente se refiere a plantas de cebada útiles en los procedimientos desvelados. En particular, la invención describe plantas de cebada con rasgos combinados de lipooxigenasa-1-nula (LOX-1-nula), lipooxigenasa-2-nula (LOX-2-nula) y S-10 adenosilmetionina:metionina S-metiltransferasa-nula (también denominada S-metionina-nula (Met)- S-metiltransferasa o MMT-nula) en una planta, es decir, una planta de cebada con LOX-1 nula-LOX-2 nula-MMT nula (en la presente memoria descriptiva también denominada intercambiablemente doble-LOX nula-MMT nula), lo cual es particularmente útil para los procedimientos con ahorro de energía para preparar bebidas a base de cebada descritas en la presente memoria descriptiva. 15
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Instalación para malteado y cervecería
20
La cebada − Hordeum vulgare, L. − es un cereal diploide que se cultiva ampliamente en diferentes climas para la producción de comidas y bebidas. Las bebidas a base de dicha planta son producidas en grandes cantidades, empleando procedimientos con elevado consumo de energía, por ejemplo, en las instalaciones para malteado y cervecerías para secado en horno y operaciones de cocción del mosto, respectivamente.
25
El malteado normalmente implica el remojo de los granos de cebada para promover la germinación, seguido del secado en horno a elevadas temperaturas, lo cual hace que el proceso sea particularmente consumidor de energía. Los objetivos principales del secado en horno incluyen: (i) terminación de la germinación; (ii) secado de los granos de cebada germinados; (iii) desnaturalización de enzimas, particularmente enzimas lipasa y LOX en cebada de tipo salvaje; y (iv) conversión de los precursores de sulfuro de dimetilo (DMS) (DMSP), que principalmente consisten en 30 S-metil-Met (SMM), en DMS volátil [después del secado en horno de una malta pálida normal, el contenido de DMSP es en promedio 4 ppm en peso seco (ver Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin, pp. 158-162)]. Ciertas actividades de enzima son preservadas durante el secado en horno (por ejemplo, amilasa, proteasa, etc.).
En la cervecería, se consumen en términos generales, aproximadamente la mitad de la energía en el proceso de 35 elaboración, que corresponde a una carga de energía en el rango de 48000−83000 kJ/hL (Modern brewhouse technology, Brauwelt International 2004, p. 410-412). La mayoría de la energía es consumida en el proceso de cocción del mosto, el objetivo del cual es, en general, proporcionar: (i) coagulación de proteínas; (ii) inactivación de enzimas; (iii) esterilización del mosto; (iv) extracción de compuestos de lúpulo; (v) isomerización de α-ácidos; y (vi) evaporación de compuestos volátiles no deseados, por ejemplo, los sabores sulfuroso y rancio de DMS y trans-2-40 nonenal (T2N), respectivamente.
El mosto es tradicionalmente hervido durante al menos 50−60 min para permitir una evaporación global de al menos 10−15% (ver Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin, Chapter 11), pero actualmente a menudo es mejorada mediante medios tecnológicos hasta 6−8%. También se ha intentado reducir el consumo de energía aún 45 más, por ejemplo, mediante minimización de la evaporación hasta tan sólo 3−4%, combinado con un proceso de remoción que extrae compuestos volátiles no deseados dentro de vapor de agua inyectado (véase, por ejemplo, Bonacchelli y col., 2007). Se piensa que los niveles de compuestos volátiles, no deseados, en mosto hacen difícil reducir adicionalmente, o incluso eliminar, la evaporación.
50
T2N
El T2N − un alquenal C9 volátil con un punto de ebullición de 88ºC − fue caracterizado en 1970 como la molécula que confiere el sabor a cartón en la cerveza (Jamieson and Gheluwe, 1970). Dado que el nivel del umbral de sabor para T2N en humanos es extremadamente bajo, previamente determinado como estando alrededor de 0,7 nM o 0,1 ppb 55 (Meilgaard, 1975), los productos con incluso niveles mínimos del aldehído son percibidos como envejecidos. Sin embargo, los niveles de T2N son generalmente muy bajos en cerveza fresca (Lermusieau y col., 1999), lo que indica que los procesos durante el envejecimiento promueven la liberación de T2N libre a partir de los correspondientes aductos (Nyborg y col., 1999). Una observación posterior reveló la correlación entre el potencial de T2N del mosto y
el T2N libre formado después del almacenamiento del producto (Kuroda y col., 2005).
El secado en horno y la cocción del mosto representan etapas de procesamiento separadas que pueden ser blanco para la manipulación con el fin de alcanzar niveles reducidos de T2N en bebidas a base de cebada. Mientras que el secado en horno a elevadas temperaturas confiere inactivación de las enzimas implicadas en la formación de T2N, 5 tales como lipasas y LOXs (véase, por ejemplo, Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin, p. 162), el T2N libre también puede ser eliminado mediante cocción del mosto.
El grano de cebada contiene tres enzimas LOX − conocidas como LOX-1, LOX-2, y LOX-3 (van Mechelen y col., 1999). La actividad principal de LOX-1 cataliza la formación de ácido 9-hidroperoxi octadecadienoico (9-HPODE; ver 10 FIG. 1A para una vista parcial de la ruta de LOX) − un precursor de tanto T2N como ácidos trihidroxi octadecenoicos (THAs) − a partir de ácido linoleico. LOX-2 principalmente cataliza la conversión de ácido linoleico a 13-HPODE, el cual es adicionalmente metabolizado a hexanal, un aldehído C6 con un umbral de sabor elevado ∼0,4-ppm (Meilgaard, supra). Dada la muy pequeña actividad de LOX-2 para la formación de 9-HPODE, varios informes han mostrado que el T2N es producido mediante una ruta bioquímica que implica la conversión de ácido linoleico a 9-15 HPODE, inicialmente catalizada por LOX-1, seguida de escisión de 9-HPODE a través de acción de 9-hidroperóxido liasa (ver, por ejemplo, Kuroda y col., 2003, 2005; Noodermeer y col., 2001).
Con respecto a las propiedades anteriormente mencionadas de LOX-1, dicha enzima es un blanco útil para la inactivación en los esfuerzos para disminuir los niveles de T2N en productos a base de cebada, actualmente 20 sustanciados mediante las siguientes dos observaciones: (i) Kuroda y col. (2005) sugirieron una correlación entre la actividad de LOX-1 y el potencial de T2N en el mosto, principalmente porque LOX-2 ha sido considerada inferior con respecto a la formación del potencial de T2N en dicho mosto. Sin embargo, parece no haber correlación entre la actividad global de LOX en malta y el potencial de T2N en el mosto; (ii) se han descrito procedimientos para obtener actividad reducida de LOX-1 en cebada. 25
Varias plantas de cebada diferentes han sido desarrolladas que comparten la propiedad de actividad de LOX-1 parcialmente o totalmente reducida. Por ejemplo, los granos de cebada y las plantas de cebada que tienen una baja actividad de LOX-1 fueron desveladas en la Solicitud PCT WO 02/053721 de Douma, A.C. y col., mientras que WO 2005/087934 de Breddam, K. y col. está centrada en dos mutantes de cebada diferentes deficientes en actividad de 30 LOX-1 − una mutante de sitio de splicing y una mutante con un codón de terminación traduccional prematuro. Además, EP 1609866 de Hirota, N. y col. describió una planta de cebada sin actividad de LOX-1, la cual fue identificada mediante relevamiento de una colección de variedades autóctonas de cebada.
DMS 35
En bebidas a base de cebada − como también en muchos vegetales y alimentos, incluyendo té, cacao, leche, vinos, bebidas espirituosas (tales como ron), maíz dulce, y numerosos vegetales cocidos − el DMS agrega notas prominentes de aroma y sabor al producto. Dependiendo del tipo de cerveza, los niveles de DMS típicamente pueden alcanzar 150 ppb (150 µg/l), contribuyendo dicho compuesto a sabores no deseables de "vegetal cocido" o 40 "tipo repollo”. En este aspecto, no es solo importante que el umbral sensorial esté alrededor de 30-45 µg/l (Meilgaard, 1982), sino también que el sabor derivado del DMS permanezca sin notarse a niveles <10 ppb.
Las anteriormente mencionadas etapas de procesamiento de secado en horno y cocción de mosto en la producción de cerveza influyen en los niveles de DMS en bebidas a base de cebada, principalmente porque ambos dichos 45 procesos pueden inducir conversión química de SMM a DMS (véase, por ejemplo, Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin, p. 160). Debido al punto de ebullición del último compuesto de solamente 37-38ºC, una parte mayoritaria del DMS simplemente se evaporará a la atmósfera. Sin embargo, cuando la duración o el vigor de la cocción de mosto es inadecuado para convertir SMM residual, el DMS puede continuar formándose a medida que el mosto se enfría − con alta probabilidad de transferirse a la cerveza. 50
El SMM representa casi toda, posiblemente toda, la reserva de DMSP en granos de cebada que germinan, sintetizado por la acción de componentes funcionales del ciclo de SMM (FIG. 1B). Aquí, el MMT cataliza la transferencia de un grupo metilo a partir S-adenosil-Met (AdoMet) a Met, formando SMM. El último compuesto puede a su vez servir como donador de metilo para la síntesis de Met a partir de homocisteína (Hcy), una reacción 55 catalizada por la enzima Hcy-S-metiltransferasa (HMT).
En la literatura científica, se ha considerado como una oportunidad regular la síntesis de SMM utilizando, por ejemplo, tecnología antisentido (McElroy y Jacobsen, 1995). Sin embargo, no se proveyó de ninguna guía sobre
genes diana relevantes para antisentido. A pesar de ello, se esperaba que la posibilidad de un resultado positivo fuera cuestionable dado que grandes reducciones en los niveles de SMM podrían ser dañinas para el crecimiento y desarrollo de la cebada. Soluciones alternativas para obtener un nivel de SMM más bajo no fueron discutidas por McElroy y Jacobsen (supra). Y además, como se discute en detalle a continuación en la presente memoria descriptiva, las tecnologías antisentido no han sido exitosamente aplicadas en cebada para abolir completamente la 5 expresión génica.
Se han desarrollado procedimientos tecnológicos para reducir el nivel de DMS en cerveza. Así, el documento AU 38578/93 describe un procedimiento para reducir niveles de DMS en malta, que comprende tratamiento con vapor de dicha malta. En la solicitud de patente US 2006/0057684 de Bisgaard-Frantzen, H. y col. se describen 10 procedimientos de fabricación de cerveza que comprenden tratamiento de maceración con calor a >70ºC. Y en la Patente US No. 5,242,694 de Reuther, H. se muestran procedimientos para preparar cerveza baja en carbohidratos, donde los procedimientos comprenden ebullición prolongada de mosto seguida de lavado de dicho mosto con dióxido de carbono (CO2). Sin embargo, todos los tratamientos anteriormente mencionados son conocidos porque consumen elevados niveles de energía, posiblemente alterando las características de la malta o del mosto. 15
Plantas mutantes de cebada
Desafortunadamente, no hay procedimientos disponibles para preparar plantas transgénicas de cebada que carezcan por completo de la expresión de una dada proteína. En general para cebada, la aplicación de técnicas de 20 antisentido conducen a plantas transgénicas que aún expresan algo de la proteína en cuestión (ver por ejemplo Robbins y col. 1998; Stahl y col., 2004; Hansen y col., 2007). Además, no se han desarrollado para el uso en plantas de cebada procedimientos efectivos para preparar mutaciones específicas utilizando ARN/ADN quimérico o mutagenia sitio-dirigida. En línea con esto, y a pesar de los intensos esfuerzos, los inventores de la presente solicitud siguen sin estar en conocimiento de ningún ejemplo publicado sobre direccionamiento exitoso de genes 25 dirigido por oligonucleótidos en cebada. A pesar de no haber sido emprendido en cebada, Iida y Terada (2005) muestran que el direccionamiento de genes dirigido por oligonucleótidos ha sido ensayado en maíz, tabaco y arroz − pero en todos los casos con el gen resistente a herbicida acetolactato sintasa (ALS) como diana. De acuerdo con la conclusión de Iida y Terada (supra), aún queda por establecerse si la anteriormente mencionada estrategia, con las modificaciones apropiadas, es aplicable a genes distintos de aquellos directamente seleccionables, tales como los 30 genes ALS. A pesar de no estar aún sustanciada, la mutagenia dirigida utilizando nucleasas de dedo de zinc representa otra herramienta que podría potencialmente permitir futuras investigaciones en biología vegetal básica o modificaciones en plantas de cultivo (Durai y col., 2005; Tzfira y White, 2005; Kumar y col., 2006). También en este caso, sin embargo, la mutagenia no ha sido emprendida ni aplicada con éxito en cebada.
35
No obstante, los mutantes de cebada pueden ser preparados mediante mutagenia al azar utilizando radiación o tratamiento químico, tal como incubando granos durante 12 h hasta durante una noche, con una solución de azida de sodio (NaN3). Un ejemplo se refiere a granos de cebada mutagenizados a través del uso de NaN3, y posteriormente analizados en busca de niveles elevados de fosfato libre en un esfuerzo por detectar mutantes con bajo fitato (Rasmussen y Hatzack, 1998); se identificaron un total de 10 mutantes de 2000 granos analizados. A 40 pesar de estar lejos de lo siempre posible, encontrar un mutante particular después de tratamiento con NaN3 es dependiente de la persistencia y de un procedimiento de relevamiento efectivo.
Sustentabilidad
45
En un mundo que busca soluciones para sus desafíos en energía, medioambiente y alimentos, un foco de la sociedad es limitar o reducir las concentraciones atmosféricas de CO2 especialmente enfocándose en las emisiones de CO2 de los sistemas industriales. La principal razón es que un incremento en la concentración de un gas de invernadero ocasiona un cambio en el balance de energía de la Tierra, siendo el CO2 el contribuyente único más grande. Como consecuencia de la preocupación mundial acerca del cambio climático, y también basado en 50 razonamientos y restricciones económicas, las fábricas de cerveza pueden ser una parte activa utilizando energía tan eficientemente como sea posible, y reduciendo las emisiones de gases de invernadero de las operaciones más efectivamente. Hasta ahora, el punto focal ha estado en medios tecnológicos para solucionar los temas anteriormente mencionados sobre sustentabilidad.
55
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Los procedimientos de tratamiento con calor han sido descritos para la reducción de la actividad de LOX y de los niveles DMS de DMS. Dicho tratamiento fue generalmente llevado a cabo durante el malteado y/o la preparación del
mosto, significando que se permitía que los productos de la actividad de LOX se acumularan en la cebada hasta que se llevaba a cabo el tratamiento con calor. El análisis de la cebada reveló que cantidades significativas de productos de la actividad de LOX estaban presentes en la cebada, incluso antes del malteado (Wackerbauer y Meyna, 2002). Es evidente que los procedimientos de tratamiento con calor son altamente consumidores de energía.
5
En particular, la invención proporciona procedimientos para preparar una bebida a base de cebada con bajos niveles de uno o más sabores indeseables y precursores de los mismos (particularmente bajos niveles de DMS y T2N y precursores de los mismos), donde el procedimiento implica una entrada de energía reducida, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
10
(i) proporcionar una planta de cebada, o parte de la misma, donde dicha planta de cebada comprende:
(a) una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional; y
(b) una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional; y
(c) una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT funcional;
(ii) opcionalmente maltear al menos parte de dicha cebada, obteniendo así cebada malteada; 15
(iii) macerar dicha cebada y/o cebada malteada y opcionalmente adjuntos adicionales, obteniendo así un mosto;
(iv) calentar dicho mosto opcionalmente en presencia de ingrediente(s) adicional(es), donde como máximo el 4% del volumen del mosto es evaporado, obteniendo así mosto calentado;
(v) procesar dicho mosto calentado como una bebida;
preparando así una bebida derivada de cebada con bajos niveles de uno o más sabores indeseables y precursores 20 de los mismos.
Es también un objeto de la presente invención proporcionar plantas de cebada adecuadas para el uso en los procedimientos descritos. Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar plantas de cebada agronómicamente útiles que comprenden los tres rasgos diferentes, es decir, una planta de cebada LOX-1 nula-25 LOX-2 nula-MMT nula (en la presente memoria descriptiva también denominada "doble-LOX nula-MMT nula"). La selección de una planta de cebada útil se refiere no solamente al vigor de la planta, sino también a la falta combinada de las actividades enzimáticas LOX-1, LOX-2 y MMT, utilizando ensayos bioquímicos tal como se describe en detalle en la presente memoria descriptiva a continuación. Las plantas de cebada de acuerdo con la presente invención pueden ser introducidas dentro de un esquema de mejoramiento (breeding) adecuado, tal como 30 autopolinización, retrocruzamiento, cruzamiento con poblaciones, y similares.
Un modo para acelerar el proceso de mejoramiento de plantas comprende la multiplicación inicial de mutantes generadas mediante aplicación de cultivo de tejidos y técnicas de regeneración. Como se describe en el Ejemplo 3 y se muestra esquemáticamente en la FIG. 3, un esquema tradicional de mejoramiento de cebada fue empleado para 35 generar una planta de cebada con un rasgo de doble-LOX nula-MMT nula a partir de una planta de cebada doble-LOX-nula y una planta MMT-nula. Por lo tanto, otro aspecto es proporcionar células, las cuales al crecer y diferenciarse producen plantas de cebada que tienen el rasgo de doble-LOX nula-MMT nula. Por ejemplo, el mejoramiento puede implicar cruzamientos tradicionales, preparación de plantas haploides dobles derivadas de anteras fértiles, utilizando el cultivo de tejido tal como cultivo de anteras o cultivos de microesporas. 40
La presente invención desvela que la entrada de energía reducida para el secado en horno es alcanzable a través de la aplicación de granos con LOX-nula, porque no hay necesidad de inactivar la enzima LOX endógena. La mutante con doble-LOX nula-MMT nula descrita por la presente invención puede ser utilizada para la producción de material de partida que carezca de las correspondientes actividades de enzima, para preparar la mutante de interés 45 para alcanzar un consumo de energía más bajo durante el secado en horno en la instalación para malteado, pero también en la cervecería debido a la entrada reducida de calor durante la cocción del mosto.
Desde un punto de vista de la calidad de la cerveza o bebida, existe también una necesidad de un material de partida con doble-LOX nula-MMT nula, con el fin de eliminar funcionalmente o reducir drásticamente los niveles de 50 T2N y DMS en los productos.
Además de las propiedades potenciales anteriormente mencionadas de una malta con doble-LOX nula-MMT nula, una cebada correspondiente podría ser útil para la producción de cerveza de cebada con bajo sabor indeseable, definida aquí como cerveza producida a través de la omisión del proceso de malteado, pero en su lugar proporcionar 55 una maceración que consiste en numerosas enzimas externas (por ejemplo, Ondea Pro, una mezcla de enzimas producida por Novozymes). Como se trata en la presente memoria descriptiva a continuación en el Ejemplo 7, fue sorprendente para los inventores de la presente encontrar que el mosto producido mediante maceración de material de partida de cebada no malteada con doble-LOX nula-MMT nula contenía muy bajos niveles de sabores indeseables de T2N y DMS, mientras que a partir de cebada de tipo salvaje era sorprendentemente alta en niveles 60
de DMS a pesar de que los granos de cebada no habían sido sometidos a germinación. En consecuencia, algunos precursores de DMS (DMSP) deben estar presentes en el grano de cebada seco, maduro − una propiedad nueva, aún no descrita, la cual es explorada en productos de cerveza de la presente solicitud. En consecuencia, los granos con doble-LOX nula-MMT nula son útiles en la producción de mosto y cerveza fabricados con cebada con el fin de minimizar los niveles de T2N y DMS en productos de cerveza frescos y envejecidos. 5
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 presenta vistas simplificadas de las rutas bioquímicas de cebada que conducen a la formación de T2N (A), y SMM (B). Las enzimas ausentes en la cebada con Triple-Nula están resaltadas en recuadros negros. Las 10 abreviaturas de las enzimas son aquellas definidas en la presente solicitud. La FIG. 1B muestra componentes seleccionados del ciclo de SMM en el cual el SMM es sintetizado mediante transferencia de metilo desde S-adenosilmetionina (SAM) a metionina (Met), catalizada por la enzima Met-S-metiltransferasa (MMT). El SMM puede a su vez servir como donador de metilo para la síntesis de Met a partir de homocisteína (Hcy), en una reacción catalizada por la enzima Hcy-S-metiltransferasa (HMT). La ilustración muestra cómo las reacciones esencialmente 15 irreversibles están conectadas. Cada vuelta del ciclo es infructuoso dado que consume y después regenera dos Mets mientras que convierte ATP a adenosina, PPi y Pi (no mostrado).
La FIG. 2 muestra los resultados de experimentos de HPLC para verificar el fenotipo MMT-nulo de la Mutante 8063 y la Mutante 14018. (A) Un ejemplo de la separación basada en HPLC de un extracto a partir de brotes del cv. 20 Prestige, que muestra la elución de ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), asparagina (Asn), serina (Ser) y SMM. Fluorescencia de extractos de brotes de cebada derivatizados con OPA fueron excitados a 340 nm y la emisión fue medida a 450 nm. (B) Separación basada en HPLC de extractos a partir de las mutantes indicadas y cv Sebastian tipo salvaje. La separación de componentes en un extracto mutante proveyó un cromatograma sin picos específicos de SMM. 25
La FIG. 3 ilustra el flujo de trabajo a partir del cruzamiento de plantas de cebada con LOX-1−nula-LOX-2-nula (doble-LOX-nula) y MMT-nula con cebada Triple-Nula.
La FIG. 4 resalta las actividades de LOX en muestras derivadas a partir de las plantas indicadas. Los resultados de 30 las determinaciones de actividad de LOX total en granos de cebada maduros se muestran con barras grises, mientras que aquellos en negro indican las actividades de LOX-2 en embriones en germinación. Se observaron muy bajas actividades de LOX tanto en plantas LOX-1 nula-LOX-2 nula como en Triple-Nula.
La FIG. 5 ilustra que las plantas Triple-Nulas germinadas no pueden sintetizar SMM (panel superior en el cual el pico 35 correspondiente está ausente en el cromatograma de UPLC), mientras que dicho compuesto es fácilmente detectable como un pico de cromatograma correspondiente en un extracto de cebada germinada de tipo salvaje, cv. Quench (panel inferior). Se indican las posiciones de elución de los aminoácidos seleccionados.
La FIG. 6 detalla gráficamente el flujo de trabajo de micro-malteados y micro-maceraciones (A), además de aquellos 40 de malteados, maceraciones y fabricaciones de cerveza piloto, de granos a partir de cebada de tipo salvaje (B) y la mutante Triple-Nula (C). El flujo de muestras individuales (marcadas en recuadros grises) está ilustrado con flechas. Productos de partida, intermediarios y finales están marcados en tipo de fuente negrita arriba de la lista; los procesos están en tipo de fuente cursiva. En (A), los números en cursivas debajo de la lista de flujo se refieren a puntos de muestreo para la determinación de niveles de T2N libre y sus precursores (2 y 4), y DMSP y DMS (1, 2, 45 3), donde el punto 4 de medición representa mosto calentado, enfriado. Para micro-maceración de harina de cebada, las muestras fueron medidas en los puntos de medición 2, 3 y 4. En (B) y (C), los niveles de DMSP, DMS, precursor de T2N y T2N libre fueron determinados en todos los puntos de muestreo.
La FIG. 7 muestra que la cerveza hecha de malta Triple-Nula genera alrededor de cuatro veces más espuma de 50 cerveza que aquella de una cerveza elaborada sobre malta de cv. Quench tipo salvaje − independientemente de la cocción de mosto presurizada o normal.
La FIG. 8 proporciona un ejemplo sobre cómo pueden ser propagados los granos de cebada mutagenizados con NaN3. Los granos de la generación M0 crecen como plantas que desarrollan granos de generación M1. Estos 55 pueden ser sembrados para el desarrollo de plantas M1, las cuales producen nuevos granos de generación M2. Después, las plantas M2 crecen y establecen granos de generación M3. Los granos de generación M3 pueden dejarse germinar, por ejemplo para el análisis de coleóptilos de plantas M3 germinadas. Además, las flores derivadas a partir de granos de plantas M3 pueden ser utilizadas en cruzamientos con líneas de cebada o cultivares para obtener plantas de generación M4. Una figura similar se presenta como FIG. 1A en la solicitud de patente PCT 60
WO 2005/087934 de Breddam, K. y col.
La FIG. 9 muestra una vista simplificada, esquemática, de un proceso de producción de cerveza preferido, que incluye remojar el grano de cebada (1), malteado (2), secado en horno (3), molienda de la malta seca (4), maceración (5), filtración (6), cocción de mosto en presencia de lúpulos agregados (7), fermentación en presencia de 5 levadura (8), maduración de la cerveza (9), filtración de la cerveza (10), envasado, tal como el envasado en botellas, latas, o similares (11), y etiquetado (12). Los procesos individuales pueden ser agrupados en secciones que comprenden la producción de malta (1-3), producción de mosto (4-7), fermentación (8-9), y la preparación de la cerveza terminada (10-12). A pesar de que se ilustra un procedimiento preferido, pueden ser concebidos otros procedimientos que omitan algunas de las etapas detalladas (la filtración puede, por ejemplo, ser omitida, o pueden 10 no agregarse los lúpulos − o pueden agregarse etapas adicionales, tales como adición de adjuntos, azúcares, jarabes, o carbonato).
La FIG. 10 ilustra cómo identificar fragmentos de ADN derivados de LOX-1-nula en cerveza (mezcla que comprende 50% de LOX-1-nula) y muestras de mosto (Triple- Nula) producidas utilizando materiales de partida LOX-1-nulos, 15 pero no en cerveza producida utilizando harina de una mezcla de malta normal y cebada de tipo salvaje (Tuborg). Se indica el volumen del molde de la amplificación por PCR concluyente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
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Definiciones
En la descripción, figuras, y tablas que siguen, se utilizan distintos términos. Con el fin de proporcionar las especificaciones y reivindicaciones, que incluyen el alcance que será dado a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones: 25
Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "un/una" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el cual es utilizado.
El término “rasgo agronómico" describe un rasgo fenotípico o genético de una planta que contribuye al desempeño o 30 valor económico de dicha planta. Dichos rasgos incluyen resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, resistencia a virus, resistencia a nematodos, tolerancia a sequía, tolerancia a elevada salinidad, rendimiento, altura de la planta, días hasta madurez, graduación de granos (es decir, fraccionamiento del tamaño de grano), contenido de nitrógeno en grano y similares.
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El término "cebada" en referencia al proceso de preparación de bebidas a base de cebada, tal como cerveza, particularmente cuando es utilizado para describir el proceso de malteado, significa granos de cebada. En todos los otros casos, a menos que se especifique de otro modo, "cebada" significa la planta de cebada (Hordeum vulgare, L.), que incluye cualquier línea o cultivar o variedad de mejoramiento, mientras que parte de una planta de cebada puede ser cualquier parte de una planta de cebada, por ejemplo, cualquier tejido o células. 40
En el proceso de “elaboración de cerveza de cebada”, el mosto es preparado mediante incubación de un extracto de una cebada no malteada con una mezcla de enzimas que hidrolizan los componentes de la cebada. Un mosto producido mediante elaboración de cerveza de cebada puede ser denominado "mosto de cebada", o mosto “elaborado con cebada”. 45
Por "resistencia a enfermedad" se entiende que las plantas evitan síntomas de enfermedad, los cuales son el resultado de las interacciones planta-patógeno. De este modo, se evita que los patógenos causen enfermedades en la planta y los síntomas de enfermedad asociados. Alternativamente, los síntomas de enfermedad causados por el patógeno son minimizados o reducidos, o incluso evitados. 50
“DMSP" tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva es una abreviatura para el precursor de DMS o para potencial de DMS, es decir, las moléculas que pueden ser convertidas a DMS durante la producción de bebidas. SMM representa la mayor parte de, si no todo, el DMSP. El nivel de DMSP está definido en la presente memoria descriptiva como la cantidad de DMS que puede ser generada a partir de DMSP en el material vegetal especificado, 55 o el producto del mismo, mediante ebullición en condiciones alcalinas durante 1 h. Tal como se define en la presente memoria descriptiva, 1 ppb de DMSP puede ser convertida en 1 ppb de DMS.
Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término “doble LOX-nula" se refiere a una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional y una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 60
funcional. Por lo tanto, una "planta de cebada con doble LOX-nula" es una planta de cebada que comprende una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional y una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional. Similarmente, los "granos con doble LOX-nula" son granos que tienen una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional y una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional. 5
El término “doble-LOX nula-MMT nula" se refiere a una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional y una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional y una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT funcional. Por lo tanto, una "planta de cebada con doble-LOX nula-MMT nula" es una planta de cebada que comprende una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional y una 10 segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional y una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT funcional. Similarmente, los "granos con doble-LOX nula-MMT nula" son granos que tienen una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional y una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional y una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT funcional. Un ejemplo de doble-LOX nula-MMT nula útil se denomina "Triple-Nula" y se describe en los Ejemplos de la presente a 15 continuación.
Una planta de "cereal", como se define en la presente memoria descriptiva, es un miembro de la familia de plantas Graminae, cultivada principalmente por sus semillas o granos que contienen almidón. Las plantas de cereal incluyen, pero no están limitadas a, cebada (Hordeum), trigo (Triticum), arroz (Oryza), maíz (Zea), centeno (Secale), avena 20 (Avena), sorgo (Sorghum), y Triticale, un híbrido de centeno−trigo.
Por "codificante" o "codificado/a", en el contexto de un ácido nucleico especificado, se quiere decir que comprende la información para traducción en la proteína especificada. Un ácido nucleico o polinucleótido que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducibles, por ejemplo, intrones, dentro de regiones traducidas del ácido 25 nucleico, o puede carecer de dichas secuencias no traducibles intervinientes, por ejemplo, en ADNc. La información mediante la cual una proteína es codificada está especificada mediante el uso de codones.
Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "expresión" en el contexto de ácidos nucleicos deberá entenderse como la transcripción y acumulación de ARNm sentido o ARN antisentido derivados a partir de un 30 fragmento de ácido nucleico. "Expresión" utilizada en el contexto de proteínas se refiere a la traducción de ARNm a polipéptido.
El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; este incluye regiones que preceden y continúan a la región codificante (promotor y terminador). Más aún, los genes vegetales 35 generalmente consisten en exones interrumpidos por intrones. Después de la transcripción a ARN, los intrones son removidos mediante splicing para generar un ARN mensajero maduro (ARNm). Los “sitios de splicing” entre exones e intrones están típicamente determinados mediante secuencias consenso que actúan como señales de splicing para el procesos de splicing, que consiste en una deleción del intrón desde el transcripto de ARN primario y una unión o fusión de los extremos del ARN remanente sobre cada lado del intrón cortado. En algunos casos, esquemas 40 de splicing alternativos o diferentes pueden generar diferentes proteínas a partir de la misma elongación única de ADN. Un gen nativo puede ser referido como un "gen endógeno".
Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "heterólogo" en referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se origina a partir de una especie foránea, o, si es de la misma especie, está sustancialmente 45 modificado a partir de su forma nativa en composición y/o locus genómico mediante intervención humana deliberada.
El término "germinación" como se utiliza en la presente memoria descriptiva significa el comienzo de o retorno al crecimiento mediante un grano de cebada en diversas composiciones, tales como suelo normal tal como se 50 encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, un embrión en germinación es un embrión que está atravesando la germinación. La germinación también puede tener lugar en el suelo de macetas ubicadas en cámaras de crecimiento y similares, o por ejemplo puede tener lugar sobre papel de filtro ubicado en placas de Petri estándar de laboratorio o durante malteado (por ejemplo, en tanques para remojo o cajas de germinación de la fabrica de malteado). La germinación es generalmente comprendida como incluyendo hidratación de los granos, hinchazón de los granos e 55 inducción del crecimiento del embrión. Los factores ambientales que afectan a la germinación incluyen humedad, temperatura y nivel de oxígeno. Se observa desarrollo de raíz y brote.
El término "grano" está definido comprendiendo la cariopsis del cereal, también definida como semilla interna, lema y pálea. En la mayoría de las variedades de cebada, lema y pálea se adhieren a la cariopsis y son parte del grano 60
después de la trilla.Sin embargo, también ocurren variedades de cebada desnuda. En éstas, la cariopsis está libre de lema y pálea y se trilla libre como en trigo. Los términos "grano" y "pepita" son utilizados intercambiablemente en la presente memoria descriptiva.
“Desarrollo del grano” se refiere al período que comienza con la fertilización del huevo cigoto por una célula de 5 polen. Durante la fertilización las reservas metabólicas − por ejemplo, azúcares, oligosacáridos, almidón, fenólicos, aminoácidos, y proteínas − son depositadas, con o sin direccionamiento a vacuola, en diversos tejidos en el endospermo del grano (pepita), testa, aleurona, y escutelo, conduciendo así al agrandamiento del grano (pepita), relleno del grano (pepita), y culminando con la desecación del grano (pepita).
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El término “pérdida total de … funcional" se refiere a la falta de una dada actividad enzimática. Por lo tanto, una planta de cebada con una pérdida total de LOX-1 y LOX- 2 funcional es una planta de cebada sin actividades detectables de LOX-1 y LOX-2. En el contexto de la presente invención, las actividades de LOX-1 y LOX-2 están determinadas mediante un procedimiento de ensayo que determina la formación de 9- HPODE y 13-HPODE a partir de ácido linoleico, aun cuando las enzimas LOX-1 y LOX-2 pueden tener otras actividades. Preferentemente, la 15 formación de 9-HPODE y 13-HPODE a partir de ácido linoleico se determina tal como se describe en el Ejemplo 4 de la patente internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860), véase más adelante. La actividad debería ser determinada utilizando extractos de proteína de embriones germinados. En el contexto de la presente invención, la generación de un pico de cromatograma que corresponde a menos del 5%, preferentemente menos del 3% del pico de 9-HPODE del estándar mostrado en la FIG. 5A de la patente internacional 20 PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860), y/o un pico que corresponde a menos del 5%, preferentemente menos del 3% del pico de 13-HPODE del estándar mostrado en la FIG. 5A de la patente internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860), cuando se utiliza ácido linoleico como sustrato, es considerado como actividad no detectable de LOX-1 y LOX-2, cuando se utiliza el ensayo descrito en el Ejemplo 4 de la patente internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860), véase más 25 adelante. Los enfoques moleculares para obtener una pérdida total de LOX funcional comprenden la generación de mutaciones que causan una ausencia total de transcriptos para dicha enzima, total ausencia de la enzima codificada correspondiente, o mutaciones que inactivan totalmente la enzima codificada. Similarmente, una planta de cebada con "pérdida total de MMT funcional" se refiere a la falta de la actividad enzimática MMT, es decir, una planta de cebada sin actividad de MMT detectable cuando se utiliza el ensayo descrito en el Ejemplo 2 de la presente, a 30 continuación. Alternativamente, la actividad de MMT de una planta de cebada es determinada aislando el ADNc de MMT de dicha cebada y determinando si la proteína codificada por dicho ADNc es capaz de catalizar la transferencia de un grupo metilo desde SAM a Met, formando así SMM.
El término “actividad de LOX-1" se refiere a la actividad enzimática de la enzima LOX-1 de la cebada. 35 Particularmente, en el contexto de la presente invención, "actividad de LOX-1" es la dioxigenación catalizada por enzima de ácido linoleico a 9- HPODE, y en un grado mucho menor 13-HPODE. Aunque la enzima LOX-1 es capaz de catalizar otras reacciones, para los efectos de determinar la actividad de LOX-1 de acuerdo con la presente invención, solamente las actividades de formación de 9- y 13- HPODE deberían ser consideradas. La FIG. 1A detalla la ruta bioquímica donde el ácido linoleico es convertido en 9-HPODE. 40
El término “actividad de LOX-2" se refiere a la actividad enzimática de la enzima LOX-2 de la cebada. Particularmente, en el contexto de la presente invención, "actividad de LOX-2" es la dioxigenación catalizada por enzima de ácido linoleico a 13- HPODE, y en un grado mucho menor 9-HPODE. Aunque la enzima LOX-2 es capaz de catalizar otras reacciones, para los efectos de determinar la actividad de LOX-2 de acuerdo con la presente 45 invención, solamente las actividades de formación de 13- y 9- HPODE deberían ser consideradas. La FIG. 1A detalla la ruta bioquímica donde el ácido linoleico es convertido en 13-HPODE.
El término “bebida de malta" y el término “bebida a base de malta” se refieren a bebidas preparadas utilizando malta, preferentemente bebidas preparadas mediante un procedimiento que incluye una etapa de incubación de malta con 50 agua caliente. Los términos se utilizan indistintamente en la presente memoria descriptiva. Las bebidas de malta pueden ser, por ejemplo, cerveza o maltinas. La cerveza de la presente solicitud puede también ser producida utilizando "elaboración de cerveza de cebada" (ver definición anteriormente mencionada).
El término “bebida de malta fermentada" se refiere a bebidas de malta, las cuales han sido fermentadas, es decir, 55 incubadas con levadura.
“Malteado" es una forma especial de germinación de los granos de cebada que tiene lugar en condiciones ambientales controladas − incluyendo, pero no limitadas a, tanques de remojo y cajas de germinación de la fábrica de malteado. De acuerdo con el proceso de la presente invención, el malteado comienza a ocurrir durante y/o después 60
de que los granos de cebada han sido remojados. El proceso de malteado puede ser frenado mediante secado de los granos de cebada, por ejemplo, en un proceso de secado en horno. El secado en horno es normalmente llevado a cabo a temperaturas elevadas, pero una ventaja de la presente invención es que el secado en horno puede ser llevado a cabo a temperaturas inferiores. En caso de que la malta no haya sido secada en horno, se la denomina "malta verde". Se entiende que una composición de malta preparada a partir de cebada con doble-LOX nula-MMT 5 nula comprende malta con doble-LOX nula-MMT nula, tal como malta pura con doble-LOX nula-MMT nula, o cualquier mezcla de malta que comprenda malta con doble-LOX nula-MMT nula. Preferentemente, dicha composición es preparada solamente a partir de malta con doble-LOX nula-MMT nula. La malta puede ser procesada, por ejemplo, mediante molienda y por lo tanto ser referida como “malta molida” o “harina”.
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La “maceración" es la incubación de malta molida en agua. La maceración es preferentemente llevada a cabo a una temperatura específica, y en un volumen específico de agua. La temperatura y el volumen de agua son de importancia, dado que afectan a la tasa de disminución de actividad de enzima derivada a partir de la malta, y por lo tanto, especialmente la cantidad de hidrólisis de almidón que puede ocurrir; la acción de proteasas también puede ser de importancia. La maceración puede ocurrir en presencia de adjuntos, lo cual se entiende que comprende 15 cualquier fuente de carbohidratos distinta de la malta, tal como, pero no limitada a, cebada (incluyendo por ejemplo, cebada con doble-LOX nula-MMT nula), jarabes de cebada, o maíz, o arroz − ya sea como granos enteros o como productos procesados como polvos, jarabes o almidón. Todos los adjuntos anteriormente mencionados pueden ser utilizados principalmente como una fuente adicional de extracto (los jarabes son típicamente dosificados durante la cocción del mosto). Los requerimientos para el procesamiento del adjunto en la cervecería dependen del estado y 20 tipo de adjunto utilizado, y en particular de las temperaturas de gelatinización y licuefacción del almidón. Si la temperatura de gelatinización está por encima de aquella de la sacarificación normal de la malta, entonces el almidón es gelatinizado y licuado antes de la adición al macerado.
El término “actividad de MMT” se refiere a la actividad enzimática de la enzima metionina S-metiltransferasa de la 25 cebada. En el contexto de la presente invención, "actividad de MMT" es la metilación catalizada por MMT en el átomo de azufre de Met para rendir SMM. Aunque la enzima MMT puede ser capaz de catalizar otras reacciones, para los efectos de determinar la actividad de MMT de acuerdo con la presente invención, solamente la actividad de formación de SMM debería ser considerada. La FIG. 1B detalla las reacciones bioquímicas donde Met es convertido a SMM mediante metilación. 30
Las "mutaciones" incluyen deleciones, inserciones, sustituciones, transversiones, y mutaciones puntuales en las regiones codificantes y no codificantes de un gen. Las deleciones pueden ser del gen entero, o de solamente una porción del gen, donde la región no codificante preferentemente es la región promotora, o la región terminadora o intrones. Las mutaciones puntuales pueden importar cambios de una base o un par de bases, y pueden resultar en 35 codones de terminación, mutaciones por cambio de marco o sustituciones de aminoácidos. Con referencia a la FIG. 8 de la presente − la cual presenta una vista sobre cómo los granos de cebada mutada pueden ser propagados en un programa de mejoramiento − los granos de la generación M3, y los granos directamente propagados a partir de los mismos, o de cualquier generación posterior, incluyendo las plantas de los mismos, pueden ser denominados "mutantes de partida". Además, aún con referencia a la FIG. 8 de la presente, el término “línea de mejoramiento" se 40 refiere a granos de la generación M4, y cualquier generación posterior, incluyendo las plantas de los mismos, las cuales pueden ser el resultado de un cruzamiento con una planta cultivar, o el resultado de un cruzamiento con otra línea de mejoramiento con un rasgo separado, específico.
El término “LOX-nula" se refiere a la presencia de una mutación en un gen que codifica LOX, que causa una pérdida 45 total de función de la enzima LOX codificada (ya sea LOX-1 o LOX-2 o ambas LOX-1 y LOX-2). Las mutaciones que generan codones de terminación prematura (sin sentido) en un gen que codifica LOX representan solamente un mecanismo mediante el cual se puede obtener la pérdida total de LOX funcional. Los enfoques moleculares para obtener pérdida total de LOX funcional comprenden la generación de mutaciones que causan una ausencia total de transcriptos para dicha enzima, o mutaciones que causan inactivación total de la enzima codificada. "LOX-nula" con 50 referencia a una planta se refiere a una planta que tiene una mutación que produce una pérdida total de la enzima LOX funcional.
Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "MMT-nula" se refiere a una pérdida total de la enzima S-adenosilmetionina:metionina S-metiltransferasa funcional (también denominada enzima metionina S-metil 55 transferasa). Por lo tanto, una "planta de cebada con MMT-nula" es una planta de cebada que comprende una mutación en el gen que codifica MMT que produce una pérdida total de MMT funcional. Similarmente, los granos con "MMT-nula" son granos que comprenden una mutación en el gen que codifica MMT, que produce una pérdida total de MMT funcional.
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“Operativamente unido” es una expresión utilizada para hacer referencia a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico en un único polinucleótido, de modo que la función de uno está afectado por el otro. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de aquella secuencia codificante, es decir que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor. Las secuencias codificantes pueden estar operativamente ligadas a secuencias reguladoras en orientación sentido o 5 antisentido.
"PCR" o "reacción en cadena de la polimerasa” es bien conocida por aquellos expertos en el arte como una técnica utilizada para la amplificación de segmentos específicos de ADN (Pat. de EEUU Nos. 4.683.195 y 4.800.159 de Mullis, K.B. y col.). 10
“Planta" o "material vegetal" incluye cultivos de células de plantas, protoplastos de plantas, y tejidos de células de plantas a partir de los cuales se pueden regenerar plantas de cebada − incluyendo callos de plantas, y células de plantas que están intactos en plantas, o partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, flores, granos, hojas, raíces, puntas de raíces, anteras, o cualquier parte o producto de una planta. El material vegetal puede en 15 una realización ser células de plantas a partir de las cuales no se pueden regenerar plantas de cebada.
Por el término “producto vegetal" se quiere decir un producto que resulta a partir del procesamiento de una planta o material vegetal. Dicho producto vegetal puede, por lo tanto, ser malta, mosto, una bebida fermentada o no fermentada, un alimento, o un producto alimenticio. 20
Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "recombinante" en referencia a una proteína es una proteína que se origina a partir de una especie foránea, o, si es de la misma especie, está sustancialmente modificada a partir de su forma nativa en composición mediante intervención humana deliberada.
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Un "panel de especialistas en degustación de cerveza" dentro del significado de la presente solicitud es un panel de especialistas intensivamente entrenados en la degustación y descripción de los sabores de la cerveza, con especial foco en aldehídos, sabor a papel, sabor a viejo, ésteres, alcoholes superiores, ácidos grasos y componentes sulfurosos. A pesar de que existen diversas herramientas analíticas para evaluar componentes del sabor, la significancia relativa de los componentes activos del sabor es difícil de examinar analíticamente. Sin embargo, 30 dichas propiedades complejas, pueden ser evaluadas mediante especialistas en degustación. Su continuo entrenamiento incluye la degustación y evaluación de muestras estándar de cerveza.
Por el término “sitio de splicing” se quiere decir las zonas entre exones e intrones de un gen. Por lo tanto, un sitio de splicing puede ser el límite que va desde el exón hacia el intrón (denominado un “sitio donador”), o el límite que 35 separa intrón de exón (denominado “sitio aceptor”). Un sitio de splicing en plantas típicamente comprende secuencias consenso. El extremo 5' de un intrón, en general, consiste en un dinucleótido GT conservado (GU en el ARNm), y el extremo 3' de un intrón normalmente consiste en un dinucleótido AG conservado. El sitio de splicing 5' de un intrón por lo tanto comprende el extremo 5' de un intrón, y el sitio de splicing 3' comprende el extremo 3' de un intrón. Preferentemente, dentro del contexto de la presente invención, el sitio de splicing de un intrón es, o bien el 40 sitio de splicing 5' que consiste en los dinucleótidos más 5' del intrón (el cual en general es GT), o bien el sitio de splicing 3' que consiste en los dinucleótidos más 3' del intrón (el cual en general es AG).
A menos que se indique de otro modo, "T2N" significa trans-2-nonenal (T2N) en la forma libre. T2N es a veces también denominado como 2-E-nonenal. 45
Por el término "potencial de T2N" se describen las sustancias químicas que tienen la capacidad de liberar T2N, o de ser convertidas en T2N, en una o más reacciones. En el presente contexto, el potencial de T2N está definido como la concentración de T2N liberada dentro de una solución, por ejemplo, mosto o cerveza, durante la incubación durante 2 h a 100ºC, pH 4,0. En términos prácticos, la concentración inicial de T2N es determinada, después de lo 50 cual la solución es incubada durante 2h a 100ºC, pH 4,0, seguido de la determinación de la concentración de T2N. La diferencia entre la concentración inicial y final de T2N se denota como el potencial de T2N. El tratamiento térmico, acídico ocasiona la liberación de T2N a partir del potencial de T2N, por ejemplo, a partir de “aductos de T2N", el último término, utilizado para describir T2N conjugado a una o más sustancias, incluyendo, pero no limitado a proteína(s), sulfito, restos celulares, paredes celulares, o similares. En general, los aductos de T2N per se no son 55 detectados por los humanos como sabores indeseables. Sin embargo, el T2N liberado a partir de dichos aductos de T2N puede dar origen a un sabor indeseable.
“Cultivo de tejido" indica una composición que comprende células aisladas de la misma o de diferentes tipos, o una colección de dichas células organizadas como partes de una planta − incluyendo, por ejemplo, protoplastos, callos, 60
embriones, polen, anteras y similares.
Como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "transgénico/a" incluye la referencia a una célula que ha sido modificada mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo, o que la célula está derivada de una célula así modificada. Por lo tanto, por ejemplo, células transgénicas expresan genes que no son encontrados en una forma 5 idéntica dentro de la forma nativa de la célula, o expresan genes nativos que son de otro modo anormalmente expresados, sub-expresados, o no expresados en absoluto como resultado de la intervención humana deliberada. El término "transgénico/a" como se utiliza en la presente memoria descriptiva en referencia a plantas, particularmente plantas de cebada, no abarca la alteración de la célula mediante procedimientos de mejoramiento/cultivo tradicional de plantas − por ejemplo, mutagenia basada en NaN3, o mediante eventos que ocurren naturalmente sin la invención 10 humana deliberada.
“Cebada salvaje", Hordeum vulgare ssp. spontaneum, es considerada el progenitor de las formas cultivadas contemporáneas de la cebada. La transición de la cebada desde un estado salvaje a uno cultivado se piensa que ha coincidido con la domesticación de la planta como “variedades autóctonas de cebada”. Estas son genéticamente 15 más cercanamente relacionadas con los cultivares modernos que la cebada salvaje.
El término cebada "tipo salvaje" se refiere a una planta de cebada generada convencionalmente. Preferentemente, el término se refiere a la planta de cebada a partir de la cual las plantas de cebada de la presente invención han sido derivadas, es decir, las plantas parentales. Los granos de cebada de tipo salvaje están generalmente disponibles de, 20 por ejemplo, compañías semilleras como "cultivares" o "variedades" − es decir, aquellos granos genéticamente similares que están listados por organizaciones nacionales de mejoramiento de plantas. A pesar de la disponibilidad de varios cultivares de cebada con LOX-1-nula (por ejemplo, cvs. Chamonix y Charmay), pero, para los fines de un mejor entendimiento de la presente invención, todas las plantas con LOX-1-nula, LOX-2-nula, doble LOX-nula y doble LOX nula−MMT nula, son consideradas en la presente memoria descriptiva plantas mutantes, y no plantas de 25 tipo salvaje. Las notaciones "cultivar" y "variedad" son utilizadas intercambiablemente en la presente memoria descriptiva.
Por el término "mosto" se quiere decir un extracto líquido de malta, tal como malta molida, o malta verde, o malta verde molida. En la elaboración de la cebada, el mosto puede también ser preparado incubando un extracto de 30 cebada no malteada con una mezcla de enzimas que hidrolizan los componentes de la cebada. Además de dichos extractos derivados de malta o de cebada, el extracto liquido puede ser preparado a partir de malta y componentes adicionales, tales como material adicional que contiene almidón parcialmente convertido en azúcares fermentables. El mosto es en general obtenido mediante maceración, opcionalmente seguido de "asperjado", en un proceso de extracción de azúcares residuales y otros compuestos a partir de cebadillas después de la maceración con agua 35 caliente. El asperjado es típicamente llevado a cabo en una cuba filtro, un filtro de maceración, u otro aparato que permita la separación del agua extraída de la cebadilla. El mosto obtenido después de la maceración es generalmente referido como “primer mosto”, mientras que el mosto obtenido después del asperjado es generalmente referido como el “segundo mosto”. Si no está especificado, el término mosto puede ser el primer mosto, el segundo mosto, o una combinación de ambos. Durante la producción convencional de cerveza, el mosto se hierve junto con 40 lúpulos, no obstante la presente invención proporciona procedimientos para reducir el hervido o evitar el hervido del mosto. El mosto sin lúpulos, también puede ser referido como “mosto dulce”, mientras que el mosto hervido/calentado con lúpulos puede ser referido como “mosto hervido”.
Procedimientos para preparar una bebida a base de cebada 45
La presente invención se refiere a procedimientos para preparar una bebida a base de cebada con bajos niveles de sabores indeseables y de precursores de los mismos, donde los procedimientos implican reducido aporte de energía. Los sabores indeseables se describen a continuación, pero preferentemente los sabores indeseables son de T2N y DMS. Los procedimientos implican el uso de una planta de cebada, la cual preferentemente es una planta 50 de cebada con doble LOX nula-MMT nula. Tales plantas de cebada se describen en mayor detalle en la presente memoria descriptiva más adelante.
De acuerdo con la presente invención, el procedimiento en general comprende una etapa de malteado de dicha planta de cebada con doble LOX nula-MMT nula, aunque en algunas realizaciones de la invención, la bebida a base 55 de cebada es preparada utilizando cebada no malteada. El malteado se describe en mayor detalle en la sección “Malteado” en la presente memoria descriptiva más adelante.
El procedimiento comprende además una etapa de preparación de mosto mediante el macerado de una cebada con doble LOX nula-MMT nula o una malta con doble LOX nula-MMT nula o una mezcla de las mismas – opcionalmente 60
en presencia de adjuntos adicionales. La maceración se describe en mayor detalle en la sección “Maceración” en la presente memoria descriptiva más adelante.
El procedimiento también comprende una etapa de calentar dicho mosto opcionalmente en presencia de ingrediente(s) adicional(es), donde como máximo 4%, por ejemplo como máximo 2% del volumen de mosto es 5 evaporado, obteniendo de este modo mosto calentado. Esta etapa se describe en mayor detalle en la sección "Mosto Caliente".
Finalmente, el procedimiento comprende procesar mosto calentado en una bebida. Esta parte del procedimiento se describe en mayor detalle en la sección “Preparación de bebidas” en la presente memoria descriptiva más adelante. 10
Malteado
Mediante el término “malteado” se debe entender la germinación de granos de cebada remojados en un proceso que tiene lugar en condiciones ambientales controladas – por ejemplo, como se ilustra en la FIG. 9, etapas 2 y 3 − 15 seguido de una etapa de secado. Dicha etapa de secado puede ser preferentemente secado en horno de los granos germinados a temperaturas elevadas.
Antes del secado, los granos de cebada remojados y germinados son referidos como “malta verde”, la cual puede también representar un producto de planta de acuerdo con la presente invención. Esta secuencia de eventos de 20 malteado anteriormente mencionados es importante para la síntesis de numerosas enzimas que ocasionan la modificación del grano, procesos que despolimerizan principalmente las paredes celulares del endospermo muerto para movilizar los nutrientes del grano y activar otras despolimerasas. En el proceso de secado posterior, se generan sabor y color debido a reacciones químicas de amarronado (browning).
25
El malteado es un proceso con un elevado consumo de energía. Debido a la necesidad de elevada temperatura, en particular el secado en horno es también un proceso que consume energía. Hay diversos objetivos para el secado en horno, incluyendo en particular: (i) secado de los granos de cebada germinados; (ii) detención de la germinación; (iii) desnaturalización de lipoxigenasas con el fin de disminuir los niveles de T2N y de T2N potencial; y (iv) la generación de DMS a partir de precursores y la remoción de DMS con el fin de disminuir los niveles de DMS 30 potencial y de DMS.
De acuerdo con la presente invención, el secado en horno puede ser llevado a cabo a baja temperatura, y aún conseguir los objetivos anteriormente mencionados. Mediante el empleo de una planta de cebada con pérdida de LOX-1 y LOX-2 funcional no hay requerimiento de desnaturalización de lipoxigenasas. Mediante el empleo de una 35 planta de cebada con pérdida de MMT funcional, no hay requerimiento de disminución de los niveles de DMS y DMS potencial, debido a que dichos niveles son mínimos en tales plantas de cebada. En consecuencia, los granos de cebada pueden ser secados y la germinación puede ser detenida incluso a bajas temperaturas.
Así, el malteado de acuerdo con la presente invención preferentemente comprende las etapas de: 40
(a) remojar cebada con doble LOX nula-MMT nula;
(b) germinar dicha cebada; y
(c) secar dicha cebada, preferentemente mediante secado en horno.
45
El remojado puede ser llevado a cabo mediante cualquier procedimiento convencional conocido para un experto en la materia. Un ejemplo no limitativo implica remojar a una temperatura en el rango de 10 a 25ºC alternando condiciones en seco y en húmedo. Durante el remojado, por ejemplo, la cebada puede ser incubada húmeda en el rango de 30 min a 3 h seguido de incubación en seco durante 30 min a 3 h y opcionalmente repetir dicho esquema de incubación 2 a 5 veces. El contenido final de agua después del remojado puede, por ejemplo, estar en el rango 50 de 40 a 50%.
La germinación puede ser llevada a cabo mediante cualquier procedimiento convencional conocido para una persona experta. Un ejemplo no limitativo implica la germinación a una temperatura en el rango de 10 a 25ºC, opcionalmente con cambio de temperatura en el rango de 1 a 4 h. 55
Un ejemplo no limitativo de un esquema de remojado y germinación adecuados está diagramado en el Ejemplo 9 en la presente memoria descriptiva, más adelante.
El secado en horno puede ser llevado a cabo a temperaturas convencionales, tales como al menos 75ºC, por 60
ejemplo en el rango 80 a 90ºC, tal como en el rango de 80 a 85ºC. En consecuencia, la malta puede, por ejemplo ser producida mediante cualquiera de los procedimientos descritos por Briggs y col. (1981) y por Hough y col. (1982). Sin embargo, cualquier otro procedimiento adecuado para producir malta puede ser también utilizado con la presente invención, tal como los procedimientos para la producción de maltas especializadas, incluyendo pero no limitados a, procedimientos de tostado de la malta. Ejemplos no limitantes se describen en los Ejemplos 6 y 8 y 9. 5
Preferentemente, sin embargo, dicho secado en horno es llevado a cabo a una baja temperatura, más preferentemente a una temperatura por debajo de 80ºC, aún más preferentemente a una temperatura por debajo de 75ºC, tal como a una temperatura por debajo de 70ºC, por ejemplo a una temperatura por debajo de 65ºC, tal como a una temperatura por debajo de 60ºC, por ejemplo a una temperatura por debajo de 55ºC, tal como a una 10 temperatura por debajo de 50ºC, por ejemplo a una temperatura por debajo de 45ºC, tal como a una temperatura por debajo de 41ºC. Así, se prefiere que la temperatura no se eleve por encima de 80ºC, preferentemente no se eleve por encima de 75ºC en ningún momento durante el secado en horno.
Con el fin de secar suficientemente los granos de cebada germinados, el tiempo de secado en horno puede 15 aumentar si dicho secado es llevado a cabo a una baja temperatura. Preferentemente, el secado en horno es llevado a cabo durante un tiempo suficiente para reducir el contenido de agua de los granos geminados a menos del 10%, preferentemente a menos del 8%, más preferentemente a menos del 6%. Así, a una temperatura de secado en horno convencional de 85ºC, el tiempo de horno puede estar en el rango de 1 a 3 h, mientras que el horneado a una temperatura en el rango de 70 a 80ºC puede requerir un tiempo de horneado en el rango de 1 a 10 h; el horneado a 20 una temperatura en el rango de 50 a 70ºC puede requerir un tiempo de horneado en el rango de 3 a 50 h, mientras que el horneado a una temperatura por debajo de 50ºC, por ejemplo en el rango de 40 a 50ºC, puede requerir un tiempo de horneado de más de 40 h, tal como en el rango de 40 a 60 h, por ejemplo en el rango de 45 a 52 h, tal como 48 h.
25
En un aspecto, la invención también se refiere a composiciones de malta preparadas a partir de granos de cebada con doble LOX nula-MMT nula mediante malteado, preferentemente mediante malteado como se describe en la presente memoria descriptiva directamente precedentemente.
Dichas composiciones de malta comprenden bajos niveles de T2N y T2N potencial aun cuando se preparen a las 30 bajas temperaturas de horneado como se describió precedentemente. En particular, dichas composiciones de malta comprenden bajos niveles de T2N potencial (y precursores de T2N).
Se ha descrito que la actividad de LOX en granos de cebada puede reducirse mediante procesos de empapado, donde la cebada puede ser sometida a elevadas temperaturas y/o tratamiento con ácido láctico. Sin embargo, tales 35 procesos de empapado son también consumidores de energía. Adicionalmente, tal tratamiento puede tener otros efectos adversos, tal como reducir actividades enzimáticas deseables, por ejemplo, actividad de fitasa. Adicionalmente, tal tratamiento solamente reduce la actividad de LOX desde el punto en que es asumido el tratamiento de calor y por lo tanto sin efecto sobre la acumulación anterior de productos derivados de la actividad de LOX. 40
En una realización de acuerdo con la invención, los productos de plantas son preparados utilizando un procedimiento, donde, los granos de cebada no son sometidos a empapado a una temperatura de al menos 70ºC. Se prefiere también que los productos de plantas de acuerdo con la invención sean preparados utilizando un procedimiento, donde los granos de cebada no son sometidos a empapado a una temperatura de al menos 57ºC en 45 presencia de ácido láctico.
Se prefiere que dichas composiciones de malta comprendan menos de 60%, preferentemente menos de 50%, más preferentemente menos de 40%, aún más preferentemente menos de 30%, por ejemplo menos de 20% de T2N comparado con una composición de malta preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, 50 preferentemente a partir de cv. Power o a partir de cv. Quench o a partir de cv. Rosalina.
Se prefiere adicionalmente que dichas composiciones de malta − aun cuando secadas en horno a una temperatura en el rango de 70 a 80ºC − comprendan menos de 60%, preferentemente menos de 50%, más preferentemente menos de 40%, aun más preferentemente menos de 30%, más preferentemente menos de 20% de T2N comparado 55 con una composición preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir de cv. Power o a partir de cv. Quench o a partir de cv. Rosalina.
Se prefiere adicionalmente que dichas composiciones de malta − aun cuando secadas en horno a una temperatura en el rango de 50 a 70ºC − comprendan menos de 60%, preferentemente menos de 50%, más preferentemente 60
menos de 40%, aun más preferentemente menos de 30%, más preferentemente menos de 20% de T2N comparado con una composición preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir de cv. Power o a partir de cv. Quench o a partir de cv. Rosalina.
Es aún más preferido que dichas composiciones de malta − aun cuando secadas en horno a una temperatura en el 5 rango de 40 a 50ºC − comprendan menos de 60%, preferentemente menos de 50%, más preferentemente menos de 40%, aun más preferentemente menos de 30%, más preferentemente menos de 20% de T2N comparado con una composición preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir de cv. Power o a partir de cv. Quench o a partir de cv. Rosalina.
10
En adición a los bajos niveles de T2N y T2N potencial, la malta de acuerdo con la invención también comprende bajos niveles de DMS y de precursor de DMS, aun cuando esté preparada a las bajas temperaturas de horneado descritas precedentemente.
De un modo interesante, DMS es un compuesto bastante volátil con un punto de ebullición de 37ºC−38ºC (Imashuku, 15 supra), y durante la producción de malta, por ejemplo durante el secado en horno, la composición es generalmente sometida a calor, tal que cantidades sustanciales de DMS se evaporan. Sin embargo, durante el enfriado de una composición normal de malta, se puede generar más DMS a partir de precursores de DMS (DMSP). Una de las principales ventajas de la presente invención es que no se genera o se genera muy pequeña cantidad de DMSP (en particular SMM) en la composición de malta. 20
Han sido descritos procedimientos para reducir la concentración de DMS. Muchos de estos procedimientos dependen de un tratamiento de calor de la malta altamente consumidor de energía. Dicho tratamiento puede ser simplemente calentar la malta, por ejemplo durante el secado en horno o puede implicar la volatilización y/o remoción de DMS libre mediante la aplicación de vapor de agua. Así, el tratamiento con vapor de agua de la malta 25 puede reducir los niveles de DMS libre en la malta, pero nuevamente representa un proceso con elevado consumo de energía. Más aún, estos procedimientos principalmente reducen el nivel de DMS libre en la malta, con solo un pequeño efecto en el nivel de SMM. En una realización, las composiciones de malta de la invención han sido sometidas solamente a un limitado tratamiento que implica volatilizar y remover DMS libre con vapor de agua, o alternativamente no han sido sometidas a tratamiento que involucre volatilización y remoción de DMS libre utilizando 30 vapor de agua durante el secado en horno.
En una realización, se prefiere que la malta de acuerdo con la invención no haya sido tratada con sal bromato, tal como bromato de potasio o bromato de calcio.
35
Las composiciones de malta de la invención preferentemente comprenden como máximo 3, preferentemente como máximo 2, más preferentemente como máximo 1, aún más preferentemente como máximo 0,5, tal como como máximo 0,2 µg/g de DMS libre. Adicionalmente, se prefiere que las composiciones de malta de la invención preferentemente comprendan como máximo 2, preferentemente como máximo 1, más preferentemente como máximo 0,5 µg/g, aún más preferentemente como máximo 0,2 µg/g de DMSP. La concentración de DMSP, el cual 40 preferentemente puede ser SMM, es aquí y en toda otra parte de este documento indicada como la concentración de DMS, que puede ser liberado a partir de dicho DMSP.
Se prefiere además que dichas composiciones de malta − aun cuando secadas en horno a una temperatura en el rango de 70 a 80ºC − comprenden como máximo 2, preferentemente como máximo 1, más preferentemente como 45 máximo 0,5 µg/g, aún más preferentemente como máximo 0,2 µg/g de DMSP (preferentemente SMM).
Se prefiere además que dichas composiciones de malta − aun cuando secadas en horno a una temperatura en el rango de 50 a 70ºC − comprenden como máximo 2, preferentemente como máximo 1, más preferentemente como máximo 0,5 µg/g, aún más preferentemente como máximo 0,2 µg/g de DMSP (preferentemente SMM). 50
Se prefiere además que dichas composiciones de malta − aun cuando secadas en horno a una temperatura en el rango de 40 a 50ºC − comprenden como máximo 2, preferentemente como máximo 1, más preferentemente como máximo 0,5 µg/g, aún más preferentemente como máximo 0,2 µg/g de DMSP (preferentemente SMM).
55
En otro aspecto la descripción se refiere a composiciones de malta verde que comprenden como máximo 5000, más preferentemente como máximo 2500, aún más preferentemente como máximo 1000, aún más preferentemente como máximo 500, aún más preferentemente como máximo 250, por ejemplo como máximo 150 ppb de DMSP. Se prefiere también que dichas composiciones de malta verde comprendan como máximo 200, preferentemente como máximo 150, más preferentemente como máximo 100, aún más preferentemente como máximo 50, tal como como 60
máximo 25 ppb de DMS libre.
Aunque el uso principal de la malta es para la producción de bebidas, ella puede ser también utilizada en otros procesos industriales, por ejemplo como una fuente de enzimas en la industria de la panificación, en la industria alimenticia como un agente saborizante o colorante, por ejemplo en la forma de malta o harina de malta o 5 indirectamente como un jarabe de malta, etc. Así, el producto de planta de acuerdo con la invención puede ser cualquiera de los productos precedentemente mencionados.
En otro aspecto, los productos de planta de acuerdo con la invención comprenden, o aún más consisten en jarabe, tal como jarabe de cebada, o un jarabe de malta de cebada. El producto de planta puede ser también un extracto de 10 cebada o malta.
La malta puede ser procesada adicionalmente, por ejemplo mediante molienda. Así, el producto de planta de acuerdo con la invención puede ser cualquier tipo de malta, tal como malta no procesada o malta molida, tal como harina. La malta molida y la harina de la misma comprende componentes químicos de la malta y células muertas 15 que carecen de la capacidad de re-germinar.
Preferentemente la molienda es llevada a cabo en estado seco, es decir la malta es molida mientras se seca. De este modo, se prefiere que la malta no sea molida bajo agua.
20
Maceración
El procedimiento de acuerdo con la invención comprende una etapa de producir mosto macerando cebada y/o malta con doble LOX nula-MMT nula y opcionalmente adjuntos adicionales. Dicha etapa de maceración puede también comprender opcionalmente el asperjado, y en consecuencia dicha etapa de maceración puede ser una etapa de 25 maceración que incluye una etapa de asperjado o una etapa de maceración que excluye una etapa de asperjado.
En general, la producción de mosto es iniciada mediante la molienda de la malta con doble LOX nula-MMT nula y/o de la cebada con doble LOX nula-MMT nula. Si se añaden adjuntos adicionales, estos pueden estar también molidos dependiendo de su naturaleza. Si el adjunto es un cereal, puede por ejemplo estar molido, mientras que los jarabes, 30 azúcares y similares no estarán molidos generalmente. La molienda facilitará el acceso del agua a las partículas de grano en la fase de maceración. Durante la maceración puede continuar la despolimerización enzimática de los sustratos iniciada durante el malteado.
En la FIG. 9, las etapas 4 a 6 ilustran un procedimiento común para la preparación de mosto a partir de malta. En 35 general, el mosto es preparado combinando e incubando malta molida y agua, es decir, en un proceso de maceración. Durante la maceración, la composición de malta/líquido puede ser suplementada con composiciones de adjunto ricas en carbohidratos adicionales, por ejemplo adjuntos de cebada molida, maíz o arroz. Los adjuntos de cereal no malteado usualmente contienen pocas enzimas o no activas, lo que hace importante suplementar con malta o enzimas exógenas para proporcionar las enzimas necesarias para la despolimerización de polisacáridos, 40 etc.
Durante la maceración, la malta molida con doble LOX nula-MMT nula y la cebada molida con doble LOX nula-MMT nula − y opcionalmente adjuntos adicionales son incubados con una fracción líquida, tal como agua. La temperatura de incubación es en general mantenida constante (macerado isotérmico), o aumentada gradualmente, por ejemplo 45 aumentada de un modo secuencial. En cualquier caso, las sustancias solubles en la malta/cebada/adjuntos son liberadas dentro de dicha fracción líquida. Una posterior filtración proporciona separación de mosto y partículas residuales sólidas, significando las últimas el “grano gastado”. El mosto así obtenido puede ser designado “primer mosto”. Puede agregarse líquido adicional, tal como agua, puede ser agregado a los granos gastados durante un proceso indicado como asperjado. Después del asperjado, puede obtenerse un “segundo mosto”. Pueden 50 prepararse mostos adicionales repitiendo el procedimiento. Ejemplos no limitantes de procedimientos adecuados para la preparación de mosto son descritos por Briggs y col. (supra) y Hough y col. (supra).
Se ha descrito que la actividad de LOX puede ser reducida mediante tratamiento con calor de las enzimas y que los niveles de DMS pueden ser reducidos mediante tratamiento con calor. También, se ha descrito que el mosto puede 55 ser tratado con calor para reducir la actividad de LOX y reducir los niveles de DMS y/o que la maceración puede ser llevada a cabo a temperaturas elevadas para alcanzar el mismo objetivo. Sin embargo, el tratamiento con calor puede tener efectos adversos, tales como reducir otras actividades enzimáticas y el tratamiento con calor es además consumidor de energía. Adicionalmente, el tratamiento con calor solo reduce la actividad de lipoxigenasa y los niveles de DMS desde el punto de vista de cuándo es asumido el tratamiento con calor y entonces no afecta la 60
acumulación previa de productos derivados de la actividad de LOX y de precursores de DMS.
En consecuencia, en una realización se prepara un mosto utilizando un procedimiento cuando la temperatura de macerado inicial no excede los 70ºC, preferentemente no excede 69ºC, así por ejemplo la temperatura de macerado inicial puede estar en el rango de 30ºC a 69ºC, tal como en el rango de 35ºC a 69ºC, por ejemplo en el rango de 5 35ºC a 65ºC, tal como en el rango de 35ºC a 55°C, por ejemplo en el rango de 35ºC a 45ºC, tal como aproximadamente 40ºC. Se prefiere también que el mosto de acuerdo con la invención no ha sido sometido a temperaturas de 70ºC o superior durante más de 25 min, preferentemente no más de 20 min, y que el mosto no ha sido sometido a temperaturas de 78ºC o más, durante más de 20 min, preferentemente no más de 15 min, más preferentemente no más de 10 min durante la maceración. Si las temperaturas de maceración son demasiado 10 elevadas, esta propiedad afectará las actividades enzimáticas en el macerado y pueden reducir, o aún abolir, actividades enzimáticas deseables, lo cual resultará en una cualidad alterada del mosto. Se prefiere adicionalmente que el mosto de acuerdo con la invención no haya sido sometido a temperaturas de 65ºC o superiores durante más de 100 min, preferentemente no más de 90 min, más preferentemente no más de 80 min, aún más preferentemente no más de 70 min durante la maceración. 15
En una realización preferida, la temperatura durante la maceración no excede 80ºC, preferentemente no excede 78ºC.
Un ejemplo no limitativo de una maceración adecuada es: 20
(1) macerar a una temperatura en el rango de 35-45ºC, tal como aproximadamente 40ºC, en el rango de 10 a 30 min, tal como aproximadamente 20 min;
(2) calentar a una temperatura en el rango de 60 a 70ºC, preferentemente en el rango de 60 a 65ºC, tal como aproximadamente 65ºC, en el rango de 30 a 90 min, preferentemente en el rango de 45 a 75 min, tal como 25 aproximadamente 60 min;
(3) calentar a una temperatura en el rango de 70 a 80ºC, preferentemente en el rango de 75 a 78ºC, tal como aproximadamente 78ºC, en el rango de 5 a 15 min, tal como aproximadamente 10 min.
Otro ejemplo no limitativo de maceración adecuada es: 30
(4) macerar a una temperatura en el rango de 55-65ºC, tal como aproximadamente 60ºC, en el rango de 10 a 30 min, tal como aproximadamente 20 min;
(5) calentar a una temperatura en el rango de 60 a 70ºC, preferentemente en el rango de 60 a 65ºC, tal como aproximadamente 65ºC, en el rango de 30 a 90 min, preferentemente en el rango de 45 a 75 min, tal como 35 aproximadamente 60 min;
(6) calentar a una temperatura en el rango de 70 a 80ºC, preferentemente en el rango de 75 a 78ºC, tal como aproximadamente 78ºC, en el rango de 5 a 15 min, tal como aproximadamente 10 min.
Como se mencionó precedentemente, la composición de mosto puede ser preparada mediante la maceración de 40 plantas de cebada con doble LOX nula-MMT nula, o partes de las mismas, tal como granos no malteados con doble LOX nula-MMT nula, en particular granos no malteados con doble LOX nula-MMT nula molidos, o partes de los mismos. Los granos de cebada no malteados carecen o contienen solo una limitada cantidad de enzimas beneficiosas para la producción de mosto, tal como enzimas capaces de degradar paredes celulares o enzimas capaces de despolimerizar almidón a azúcares. Así, en la realización de la invención donde se utiliza doble LOX 45 nula-MMT nula no malteada para macerar, se prefiere que se agreguen al macerado una o más enzimas externas adecuadas para la fabricación de cerveza. Enzimas adecuadas pueden ser lipasas, enzimas que degradan almidón (por ejemplo amilasas), glucanasas, [preferentemente (1-4)- y/o (1-3,1-4)-β-glucanasa], y/o xilanasas (tal como arabinoxilanasa), y/o proteasas, o mezclas de enzimas que comprenden una o más de las enzimas anteriormente mencionadas, por ejemplo Cereflo, Ultraflo, o Ondea Pro (Novozymes). Un procedimiento para producir una bebida 50 a partir de mosto preparado a partir de cebada no malteada pueden ser también referido como “fabricación de cerveza de cebada“ y la composición de mosto del mismo como “mosto de cebada”, o mosto de "fabricación de cerveza de cebada”.
La composición de mosto puede ser también preparada mediante el uso de una mezcla de plantas de cebada 55 malteada o no malteada con doble LOX nula-MMT nula, o partes de las mismas, en cuyo caso una o más enzimas adecuadas pueden ser agregadas durante la preparación. Más específicamente, la cebada de la invención puede utilizarse junto con malta en cualquier combinación para la maceración – con o sin enzimas externas para fabricar cerveza - tal como, pero no limitado a, las proporciones de cebada:malta = aproximadamente 100: 0, o aproximadamente 75:25, o aproximadamente 50:50, o aproximadamente 25:75. 60
En otra realización de la invención, se prefiere que no se agreguen enzimas externas, en particular que no se agreguen proteasas externas, y/o celulasas externas, y/o α-amilasas externas y/o β-amilasa externas y/o α-amilasa maltogénica externa, antes o durante la maceración.
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El mosto obtenido después de la maceración puede también ser referido como “mosto dulce”. En procedimientos convencionales, el mosto dulce es hervido con o sin lúpulo, el que puede ser referido como mosto hervido.
El término "aproximadamente" como se utiliza en la presente memoria descriptiva significa ±10%, preferentemente ±5%, aún más preferentemente ±2%. 10
Calentamiento del mosto
El procedimiento para preparar una bebida a base de cebada de acuerdo con la presente invención implica una etapa de calentar el mosto obtenido después de la etapa de maceración descrita en la presente memoria descriptiva 15 anteriormente en la sección “Maceración”.
Es una ventaja de la presente invención que las bebidas a base de cebada con bajos niveles de sabores indeseables y precursores de los mismos − en particular T2N y DMS y precursores de los mismos − pueden ser preparadas sin el requerimiento de extenso calentamiento del mosto. 20
En la fabricación de cerveza convencional, el mosto es generalmente hervido durante una extensa longitud de tiempo. El hervido del mosto tiene diversos objetivos, en particular: (i) inactivación de enzimas; (ii) coagulación de proteína; (iii) esterilización del mosto; (iv) extracción de compuestos del lúpulo; (v) isomerización de α-ácidos; (vi) conversión de DMSP a DMS; y (vii) evaporación de DMS y T2N. 25
Varios de estos objetivos pueden alcanzarse sin cocción extendida. Así, la esterilización solo requiere un breve hervido o calentamiento. La extracción de compuestos de lúpulo puede ser también hecha durante un breve hervido o calentamiento. Los α-ácidos pre-isomerizados están disponibles comercialmente y pueden ser agregados al mosto. 30
Empleando una planta de cebada con pérdida funcional de LOX-1 y LOX-2 no hay un requerimiento de desnaturalización de LOXs. Adicionalmente, el requerimiento de reducción de los niveles de T2N es también abolido mediante el empleo de plantas de cebada con pérdida de LOX-1 y LOX-2 funcionales. Empleando una planta de cebada con pérdida de MMT funcional, no hay tampoco un requerimiento de disminuir los niveles de DMS y DMS 35 potencial, dado que dicho niveles son ínfimos en tales plantas de cebada. Adicionalmente, los granos de cebada pueden ser secados y la germinación puede ser detenida aún a bajas temperaturas.
Se ha intentado reducir el consumo de energía durante la cocción del mosto mediante diversos medios, por ejemplo reduciendo la evaporación hasta tan sólo 3% combinado con un proceso de depuración (stripping) extrayendo 40 compuestos volátiles no deseados dentro de vapor de agua. Sin embargo, la generación de vapor de agua es también un proceso que consume energía.
Se ha intentado también preparar mosto sin la clásica cocción del mosto. Sin embargo, estos procedimientos en general utilizan temperaturas elevadas de hasta 95ºC durante la maceración así como la extracción del mosto con 45 vapor de agua, considerados así procesos con elevado consumo de energía.
El presente procedimiento proporciona la posibilidad de evaporación reducida, y preferentemente aun en ausencia de un proceso de depuración con vapor de agua. Así, de acuerdo con los procedimientos de la presente invención el mosto es calentado de un modo que es evaporado como máximo 4%, preferentemente como máximo 3%, aún más 50 preferentemente como máximo 2%, aún más preferentemente como máximo 1,5%, aún más preferentemente como máximo 1%, aún más preferentemente como máximo 0,5%, aún más preferentemente como máximo 0,1%, tal como como máximo 0,01% del volumen de mosto. Aún más preferentemente la evaporación reducida anteriormente mencionada es llevada a cabo en ausencia de tratamiento con vapor del mosto. Se prefiere también que la evaporación reducida anteriormente mencionada sea llevada a cabo en ausencia de depuración del mosto, por 55 ejemplo con vapor de agua.
La evaporación reducida puede ser alcanzada calentando mosto en un contenedor esencialmente cerrado o preferentemente en un contenedor cerrado.
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Se prefiere además que no se lleve a cabo una evaporación extensiva del líquido en cualquiera de las otras etapas del procedimiento. Una realización preferida de la presente invención en consecuencia se refiere a procedimientos para preparar bebidas a base de cebada con bajos niveles de uno o más sabores indeseables y precursores de los mismos (preferentemente T2N y DMS y precursores de los mismos), donde el procedimiento implica un reducido aporte de energía, comprendiendo el procedimiento las etapas de: 5
(i) proporcionar una planta de cebada o parte de la misma, donde dicha planta de cebada comprende:
(a) una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional; y
(b) una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional; y
(c) una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT funcional; 10
(ii) opcionalmente maltear al menos parte de dicha cebada, obteniendo de este modo cebada malteada;
(iii) macerar dicha cebada y/o cebada malteada y opcionalmente adjuntos adicionales, obteniendo así un mosto;
(iv) calentar dicho mosto opcionalmente en presencia de ingrediente(s) adicional(es);
(v) procesar dicho mosto calentado hasta una bebida;
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donde como máximo 4%, por ejemplo como máximo 3%, tal como como máximo 2%, por ejemplo como máximo 1,5%, tal como como máximo 1% del volumen de líquido es evaporado durante el procedimiento después de completar la etapa (ii), o aún después de completar la etapa (iv) anterior, preparando de este modo una bebida derivada de cebada con bajos niveles de uno o más sabores indeseables y precursores de los mismos.
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Se prefiere que la etapa (iv) descrita en la presente memoria descriptiva anteriormente sea llevada a cabo con el mosto en un contenedor esencialmente cerrado, tal como un contenedor cerrado.
Preferentemente el líquido/mosto/bebida es calentado a una temperatura por encima de 80ºC durante como máximo 30 min, más preferentemente durante como máximo 20 min, preparando de este modo una bebida derivada de 25 cebada con bajos niveles de uno o más sabores indeseables y precursores de los mismos.
Preferentemente, dicho líquido/mosto/bebida es calentado a una temperatura en el rango de 80 a 99,8ºC, preferentemente a una temperatura en el rango de 80 a 99,5ºC, tal como una temperatura de 80 a 99ºC, aún más preferentemente a una temperatura en el rango de 90 a 99ºC, aún más preferentemente a una temperatura en el 30 rango de 95 a 99ºC durante como máximo 30 min, preferentemente como máximo 20 min, tal como en el rango de 10 a 30 min, por ejemplo en el rango de 10 a 20 min durante dicho procedimiento.
El primer, segundo y demás mostos pueden ser combinados, y posteriormente sometidos a calentamiento o cada clase individual o mosto puede ser calentado. De acuerdo con los procedimientos de la invención, el mosto no debe 35 ser necesariamente hervido. El mosto no hervido, tanto un primer mosto puro o un mosto combinado, es también referido como "mosto dulce"; después de hervido puede ser referido como “mosto hervido”. Si el mosto está destinado a ser utilizado en la producción de cerveza, el lúpulo es frecuentemente agregado antes de ebullición.
En los procedimientos de fabricación de cerveza tradicionales, el mosto es hervido durante un largo tiempo, en 40 general en el rango de 60 min a 120 min, con el fin de evaporar al menos 5% y algunas veces aún hasta el 25% del volumen del mosto. Sin embargo, el hervido extendido es indeseable por un número de otras razones, por ejemplo debido a que un hervido extendido requiere un pronunciado suministro de energía.
De acuerdo con la presente invención, mosto con bajos niveles de T2N, T2N potencial, DMS y DMSP puede ser 45 producido a partir de cebada con doble LOX nula-MMT nula aún con hervido extendido. Así, el mosto es hervido preferentemente durante como máximo 30 min, más preferentemente durante como máximo 15 min, aún más preferentemente durante como máximo 10 min, aún más preferentemente durante como máximo 5 min, aún más preferentemente durante como máximo 1 min, aún más preferentemente el mosto no es hervido en absoluto. Se prefiere además que después de completarse la etapa ii) del procedimiento de acuerdo con la invención el 50 líquido/mosto/bebida sea hervido durante como máximo 30 min, más preferentemente durante como máximo 15 min, aún más preferentemente durante como máximo 10 min, aún más preferentemente durante como máximo 5 min, aún más preferentemente durante como máximo 1 min, aún más preferentemente el líquido/mosto/bebida no es hervido en absoluto. Preferentemente, el calentamiento del mosto es llevado a cabo en un contenedor esencialmente cerrado, preferentemente en un contenedor cerrado. 55
En este contexto el término “hervir” significa llevar el líquido o el mosto o la bebida a una temperatura a la cual el agua se evapora. En consecuencia, a presión normal hervir significa llevar el líquido acuoso, tal como mosto a 100ºC o levemente por encima.
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Así se prefiere entonces que el mosto sea mantenido a una temperatura de al menos 100ºC durante como máximo 30 min, más preferentemente durante como máximo 15 min, aún más preferentemente durante como máximo 10 min, aún más preferentemente durante como máximo 5 min, aún más preferentemente durante como máximo 1 min, aún más preferentemente el mosto no es calentado a una temperatura de al menos 100ºC en absoluto. Adicionalmente, se prefiere que después de completarse la etapa (ii) del procedimiento de acuerdo con la invención 5 el líquido/mosto/bebida sea mantenido a una temperatura de al menos 100ºC durante como máximo como máximo 30 min, más preferentemente durante como máximo 15 min, aún más preferentemente durante como máximo 10 min, aún más preferentemente durante como máximo 5 min, aún más preferentemente durante como máximo 1 min, aún más preferentemente el líquido/mosto/bebida no es calentado a una temperatura de al menos 100ºC.
10
Es también preferido que el procedimiento completo de preparación de bebidas a base de cebada de acuerdo con la invención en ningún momento implique calentar a una temperatura de más de 99,8ºC, preferentemente 99,5ºC, aún más preferentemente 99ºC.
Preferentemente el procedimiento puede comprender una etapa de calentar mosto a una temperatura de como 15 máximo 99,8ºC, tal como como máximo 99,5ºC, por ejemplo como máximo 99ºC, tal como como máximo 98ºC durante una limitada cantidad de tiempo. Dicha limitada cantidad de tiempo es preferentemente como máximo 30 min, más preferentemente como máximo 15 min, aún más preferentemente como máximo 10 min.
Por lo tanto, se prefiere que el mosto sea calentado a una temperatura por encima de 80ºC, preferentemente en el 20 rango de 80 a 99,8ºC, tal como en el rango de 80 a 99,5ºC, por ejemplo en el rango de 80 a 99ºC, aún más preferentemente a una temperatura en el rango de 90 a 99ºC, aún más preferentemente a una temperatura en el rango de 95 a 99ºC durante como máximo 30 min, preferentemente como máximo 20 min, tal como en el rango de 10 a 30 min, por ejemplo durante un rango de 10 a 20 min.
25
Además, se prefiere que el mosto no esté sometido a (por ejemplo lavado con CO2) posteriormente a hervir el mosto y antes de la fermentación.
Mosto
30
En otro aspecto, la descripción se refiere a tipos de productos de plantas, los cuales son composiciones de mosto. Dichas composiciones de mosto son preferentemente preparadas partir de composiciones de malta derivadas de granos con doble LOX nula-MMT nula. Dichas maltas pueden ser preparadas a partir de granos con doble LOX nula-MMT nula, o mezclas que comprenden otros granos también. La descripción también se refiere a composiciones de mosto preparadas utilizando cebada con doble LOX nula-MMT nula, o partes de la misma, tal como malta verde, 35 sola o mezclada con otros componentes.
Las composiciones de mosto son preferentemente preparadas mediante maceración como se describió en la presente memoria descriptiva anteriormente en la sección “Maceración”. Adicionalmente, las composiciones de mosto pueden haber sido calentadas como se describe en la presente memoria descriptiva precedentemente en la 40 sección “Calentamiento del mosto”.
Se prefiere que dichas composiciones de mosto preferentemente comprendan menos de 60%, más preferentemente menos de 50%, aún más preferentemente menos de 40% de T2N potencial comparado con una composición de mosto preparada del mismo modo a partir de una cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o 45 cv. Rosalina.
Dicho mosto puede ser el primero, y/o el segundo, y/o mostos siguientes y/o mezclas de los mismos. La composición de mosto puede ser mosto dulce, mosto calentado, o una mezcla de los mismos. El mosto calentado es preferentemente calentado como se describió en la sección "Calentamiento del mosto" en la presente memoria 50 descriptiva anteriormente. La composición de mosto puede ser también mosto de cebada. En general, una composición de mosto contiene un elevado contenido de nitrógeno de amina y carbohidratos fermentables, siendo los últimos principalmente maltosa.
El mosto puede ser mosto dulce en una realización, es decir mosto que no ha sido sometido a tratamiento de calor. 55 Dicho mosto dulce preferentemente comprende menos de 60%, más preferentemente menos de 50% de T2N potencial comparado con una composición de mosto preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o cv. Rosalina. Si dicho mosto ha sido preparado a partir de malta que fue secada en horno (kiln) a bajas temperaturas el mismo puede aún comprender menos T2N potencial. Así en realizaciones donde dicho mosto dulce ha sido preparado a partir de malta, la que ha sido secada en horno (kiln) a 60
una temperatura en el rango de 50 a 70ºC, entonces dicho mosto dulce puede comprender preferentemente menos de 50%, aún más preferentemente menos de 45%, tal como menos de 40% de T2N potencial comparado con una composición de mosto preparado del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power. En realizaciones donde dicho mosto dulce ha sido preparado a partir de malta, la cual ha sido secada en horno a una temperatura en el rango de 40 a 50ºC, entonces dicho mosto dulce puede comprender preferentemente 5 menos de 50%, aún más preferentemente menos de 40%, aún más preferentemente menos de 30% de T2N potencial comparado con una composición de mosto preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Quench o cv. Rosalina.
Dicho mosto dulce preferentemente comprende también bajos niveles de DMSP, preferentemente menos de 150 10 µg/l, más preferentemente menos de 100 µg/l, aún más preferentemente menos de 50 µg/l, aún más preferentemente menos de 30 µg/l, aún más preferentemente menos de 20 µg/l, aún más preferentemente menos de 15 µg/l de DMSP (preferentemente SMM). Aún si dicho mosto ha sido preparado a partir de malta que fue secada en horno a bajas temperaturas el mismo aún comprende bajos niveles de DMSP. Así en realizaciones donde dicho mosto dulce ha sido preparado a partir de malta, la cual ha sido secada en horno a una temperatura en el rango de 15 50 a 70ºC, entonces dicho mosto dulce puede comprender preferentemente menos de 150 µg/l, más preferentemente menos de 100 µg/l, aún más preferentemente menos de 50 µg/l, aún más preferentemente menos de 30 µg/l, aún más preferentemente menos de 20 µg/l, aún más preferentemente menos de 15 µg/l de DMSP. En realizaciones donde dicho mosto dulce ha sido preparado a partir de malta, la cual ha sido secada en horno a una temperatura en el rango de 40 a 50ºC, entonces dicho mosto dulce puede comprender preferentemente menos de 20 150 µg/l, más preferentemente menos de 100 µg/l, aún más preferentemente menos de 50 µg/l, aún más preferentemente menos de 30 µg/l, aún más preferentemente menos de 20 µg/l, aún más preferentemente menos de 15 µg/l de DMSP.
Preferentemente, dicho mosto dulce también comprende bajos niveles de DMS, preferentemente menos de 90 µg/l, 25 aún más preferentemente menos de 50 µg/l, aún más preferentemente menos de 30 µg/l, aún más preferentemente menos de 20 µg/l de DMS.
El mosto puede ser también mosto que ha sido tratado con calor por un tiempo corto, tal como a una temperatura en el rango de 95 a 99,8ºC o en el rango de 95 a 99ºC durante un rango de 10 a 30 min. En este caso dicho mosto 30 comprende preferentemente como máximo 60%, más preferentemente como máximo 50%, aún más preferentemente como máximo 45%, más preferentemente como máximo 40% de T2N potencial comparado con una composición de mosto preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o cv Rosalina. Dicho mosto también preferentemente comprende como máximo 150 µg/l, más preferentemente menos de 100 µg/l, aún más preferentemente menos de 50 µg/l, aún más preferentemente menos 35 de 30 µg/l, aún más preferentemente menos de 20 µg/l, aún más preferentemente menos de 15 µg/l de DMSP. Dicho mosto también preferentemente comprende lo sumo 150 µg/l, más preferentemente menos de 100 µg/l, aún más preferentemente menos de 50 µg/l, aún más preferentemente menos de 30 µg/l, aún más preferentemente menos de 20 µg/l de DMS.
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El mosto puede ser también mosto calentado (preferentemente calentado como se describe en la presente memoria descriptiva anteriormente en la sección “Calentamiento del mosto”) en cuyo caso el mosto preferentemente comprende como máximo 60%, más preferentemente como máximo 50%, aún más preferentemente como máximo 40% de T2N potencial comparado con una composición de mosto preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power. 45
Dicho mosto calentado preferentemente también comprende bajos niveles de DMSP, preferentemente menos de 150 µg/l, más preferentemente menos de 100 µg/l, aún más preferentemente menos de 50 µg/l, aún más preferentemente menos de 30 µg/l, aún más preferentemente menos de 20 µg/l, aún más preferentemente menos de 15 µg/l de DMSP. En realizaciones donde dicho mosto enfriado ha sido preparado a partir de malta, la cual ha 50 sido secada en horno a una temperatura en el rango de 50 a 70ºC, entonces dicho mosto dulce puede comprender preferentemente menos de 150 µg/l, más preferentemente menos de 100 µg/l, aún más preferentemente menos de 50 µg/l, aún más preferentemente menos de 30 µg/l, aún más preferentemente menos de 20 µg/l, aún más preferentemente menos de 15 µg/l de DMSP. Aún en realizaciones en dicho mosto enfriado ha sido preparado a partir de malta, la cual ha sido secada en horno a una temperatura en el rango de 40 a 50ºC, entonces dicho mosto 55 dulce puede preferentemente comprender menos de 150 µg/l, más preferentemente menos de 100 µg/l, aún más preferentemente menos de 50 µg/l, aún más preferentemente menos de 30 µg/l, aún más preferentemente menos de 20 µg/l, aún más preferentemente menos de 15 µg/l de DMSP. Dicho mosto calentado preferentemente también comprende bajos niveles de DMS, preferentemente menos de 30 µg/l, más preferentemente menos de 20 µg/l de DMSP. 60
El mosto puede ser también mosto calentado (preferentemente calentado como se describe en la presente memoria descriptiva anteriormente en la sección “Calentamiento del mosto”), el cual posteriormente ha sido enfriado (referido aquí también como mosto enfriado) en cuyo caso el mosto preferentemente comprende como máximo 60%, más preferentemente como máximo 50%, aún más preferentemente como máximo 40% de T2N potencial comparado con 5 una composición de mosto preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o cv. Rosalina. En realizaciones donde dicho mosto enfriado ha sido preparado a partir de malta, la cual ha sido secada en horno a una temperatura en el rango de 40 a 50ºC, entonces dicho mosto dulce puede preferentemente comprender menos de 50%, aún más preferentemente menos de 40%, aún más preferentemente menos de 30% de T2N potencial comparado con una composición de mosto preparada del mismo modo a partir de 10 cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o cv. Rosalina.
Dicho mosto enfriado preferentemente también comprende bajos niveles de DMSP, preferentemente menos de 90 µg/l, aún más preferentemente menos de 50 µg/l, aún más preferentemente menos de 30 µg/l, aún más preferentemente menos de 20 µg/l, aún más preferentemente menos de 15 µg/l DMSP. Dicho mosto enfriado 15 preferentemente también comprende bajos niveles de DMS, preferentemente menos de 90 µg/l, aún más preferentemente menos de 50 µg/l, aún más preferentemente menos de 30 µg/l, aún más preferentemente menos de 20 µg/l de DMS.
En una realización específica la composición de mosto es un mosto de cebada, tal como mosto de cebada 20 calentado, es decir mosto preparado incubando granos no malteados con doble LOX nula-MMT nula (y preferentemente molidos) con agua, preferentemente mediante macerado y asperjado. Tal mosto de cebada está caracterizado por extremadamente bajos niveles de T2N y T2N potencial. Se prefiere que dicho mosto de cebada comprenda menos de 50%, más preferentemente menos de 40%, aún más preferentemente menos de 30% de T2N potencial comparado con una composición de mosto de cebada preparada del mismo modo a partir de cebada de 25 tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power. Es también preferido que dicho mosto de cebada preferentemente comprenda menos de 50%, más preferentemente menos de 40%, aún más preferentemente menos de 30% de precursor de T2N comparado con una composición de mosto de cebada preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o cv. Quench o cv. Rosalina.
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Bebidas
La presente invención se refiere a bebidas a base de cebada preparadas a partir de cebada con doble LOX nula-MMT nula. Dichas bebidas pueden en una realización preferida ser bebidas de malta, aún más preferido bebidas fermentadas, tal como bebidas de malta fermentada, preferentemente bebidas alcohólicas, tal como cerveza, donde 35 dicha bebida es preparada utilizando cebada con doble LOX nula-MMT nula, o partes de la misma. Entonces, en una realización preferida de la invención, la bebida se prepara preferentemente mediante fermentación de cebada con doble LOX nula-MMT nula, o partes de la misma, o extractos de la misma, por ejemplo por fermentación de mosto a partir de malta con doble LOX nula-MMT nula, sola o en combinación con otros ingredientes.
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En una realización preferida de la invención, la bebida anteriormente mencionada es preparada mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
(i) proporcionar una planta de cebada o parte de la misma, donde dicha planta de cebada comprende:
(a) una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional; y 45
(b) una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional; y
(c) una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT funcional;
(ii) opcionalmente maltear al menos parte de dicha cebada, obteniendo de este modo cebada malteada;
(iii) macerar dicha cebada y/o cebada malteada y opcionalmente adjuntos adicionales, obteniendo de este modo un mosto; 50
(iv) calentar dicho mosto opcionalmente en presencia de ingrediente(s) adicional(es), donde como máximo el 4% del volumen de mosto es evaporado, obteniendo de este modo mosto calentado;
(v) procesar dicho mosto calentado hasta una bebida.
Sin embargo, en otra realización la invención se refiere a cualquier bebida a base de cebada preparada a partir de 55 cebada con doble LOX nula-MMT nula. Así, la invención también se refiere a bebidas a base de cebada preparadas a partir de cebada con doble LOX nula-MMT nula utilizando procedimientos convencionales, tales como procedimientos convencionales de fabricación de cerveza.
En algunas realizaciones, la bebida es una bebida no fermentada, por ejemplo mosto, preferentemente mosto 60
preparado a partir de malta doble LOX nula-MMT nula.
También está comprendido dentro de la presente invención que dicha bebida sea preparada a partir de plantas de cebada no malteadas, preferentemente plantas de cebada no malteadas con doble LOX nula-MMT nula, o partes de las mismas, por ejemplo mediante la fabricación de cerveza de cebada. 5
La bebida puede ser una bebida no alcohólica, tal como cerveza no alcohólica u otros tipos de bebidas no alcohólicas, tales como bebidas de malta no alcohólicas, tal como maltina.
Preferentemente, sin embargo, dicha bebida es preparada a partir de una composición de malta preparada a partir 10 de granos de cebada con doble LOX nula-MMT nula. Más preferentemente, dicha bebida es cerveza. Esta puede ser cualquier tipo de cerveza conocida por una persona experta en el arte. En una realización, la cerveza, por ejemplo una cerveza lager. La cerveza es preferentemente fabricada utilizando una composición de malta que comprende germinar cebada con doble LOX nula-MMT nula, más preferentemente dicha cerveza es fabricada utilizando una composición de malta preparada exclusivamente a partir de cebada germinada, con doble LOX nula-MMT nula. La 15 composición de malta, sin embargo, puede también comprender otros componentes, por ejemplo otros cereales germinados o no germinados, tales como cebada de tipo salvaje, cebada con doble LOX nula-MMT nula, trigo y/o centeno, o materias primas no germinadas que comprenden azúcares, o composiciones derivadas de materias primas malteadas o no malteadas, incluyendo composiciones de jarabe. Preferentemente, sin embargo, toda cebada, tal como cebada totalmente malteada y/o no malteada y/o germinada y/o no germinada utilizada para la 20 preparación de dicha cerveza es preferentemente cebada con doble LOX nula-MMT nula.
Por lo tanto, la invención también se refiere a procedimientos de producción de una bebida que comprende las etapas de:
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(i) proporcionar una composición de malta que comprende granos germinados con doble LOX nula-MMT nula;
(ii) procesar dicha composición de malta hasta una bebida.
En una realización preferida, la bebida de acuerdo con la invención es cerveza que ha sido producida a partir de mosto preparado a partir de malta horneada (kilned) (preferentemente preparada como se describió en la presente 30 memoria descriptiva anteriormente en la sección “Malteado”), más preferentemente mediante la maceración de dicha malta horneada (preferentemente como se describió en la presente memoria descriptiva anteriormente en la sección "Maceración"), donde dicha maceración puede también contener una etapa de asperjado. Adicionalmente, dicho mosto ha sido preferentemente calentado como se describió en la presente memoria descriptiva anteriormente en la sección “Calentamiento del mosto”, aunque en ciertas realizaciones, el mosto puede ser calentado de un modo 35 convencional mediante ebullición. La cerveza así producida puede ser también referida como “malteada” en la presente memoria descriptiva. Sin embargo, la bebida de acuerdo con las invención puede ser también preparada a partir de mosto de cebada. Tal cerveza es también referida como “cerveza de cebada”.
En términos generales, las bebidas alcohólicas −tal como cerveza− pueden ser fabricadas a partir de granos de 40 cebada malteados y/o no malteados. La malta, en adición al lúpulo y levadura, contribuye al sabor y color de la cerveza. Adicionalmente, la malta funciona como una fuente de azúcar fermentable y enzimas. Una representación esquemática de un proceso general de producción de cerveza se muestra en la FIG. 9, mientras que descripciones detalladas de ejemplos de procedimientos adecuados para maltear y fabricar cerveza pueden encontrarse, por ejemplo, en publicaciones de Briggs y col. (1981) y Hough y col. (1982). Están disponibles numerosos, regularmente 45 actualizados, procedimientos para el análisis de cebada, malta y productos de cerveza, por ejemplo, pero sin limitarse a, American Association of Cereal Chemists (1995), American Society of Brewing Chemists (1992), European Brewery Convention (1998), e Institute of Brewing (1997). Es reconocido que muchos procedimientos específicos son empleados para una dada fabricación de cerveza, con las más significativas variaciones relacionadas con las preferencias de los consumidores locales. Cualquiera de tales procedimientos de producción de 50 cerveza puede ser utilizado en la presente invención.
La primera etapa de producción de cerveza a partir de mosto preferentemente implica calentar dicho mosto como se describió en la presente memoria descriptiva anteriormente, seguido de una posterior fase de enfriado del mosto y opcionalmente descanso en remolino (whirpool rest). Después de ser enfriado, el mosto es transferido a tanques de 55 fermentación que contienen levadura. Preferentemente, dicha levadura es levadura para fabricación de cerveza, Saccharomyces carlsbergensis. El mosto fermentará durante un período de tiempo adecuado, en general en el rango de 1 a 100 días. Durante los diversos procesos de fermentación a lo largo de los días, el azúcar es convertido en alcohol y CO2 concomitantemente con el desarrollo de algunas sustancias saborizantes.
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Posteriormente, la cerveza puede ser adicionalmente procesada, por ejemplo enfriada. También puede ser filtrada y/o estacionada (lagered) −un proceso que desarrolla un agradable aroma y menos sabor a levadura. También pueden agregarse aditivos. Adicionalmente, puede agregarse CO2. Finalmente, la cerveza puede ser pasterizada y/o filtrada, antes de ser envasada (por ejemplo embotellada o enlatada). En una realización preferida, la bebida comprende menos de 70%, preferentemente menos de 60%, más preferentemente menos de 50% de T2N potencial 5 comparada con el T2N potencial de una bebida preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o cv. Quench o cv. Rosalina. Se prefiere también que las bebidas de acuerdo con la invención comprendan como máximo 2 ppb, más preferentemente como máximo 1,5 ppb de T2N potencial si el °P en el extracto original sobre el cual se basa la bebida está ajustado en el rango de 10 a 12°P, más preferentemente a 11°P. 10
En una realización preferida, la bebida comprende menos de 70%, preferentemente menos de 60%, más preferentemente menos de 50% de precursor de T2N comparado con los precursores de T2N de una bebida preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o cv. Quench o cv. Rosalina. Se prefiere también que las bebidas de acuerdo con la invención comprendan como máximo 2 ppb, 15 más preferentemente como máximo 1,5 ppb de precursor de T2N si el °P en el extracto original sobre el cual está basada la bebida está ajustado en el rango de 10 a 12°P, más preferentemente a 11°P.
Dicha bebida -preferentemente cerveza− también comprende menos de 10 ppb de DMS.
20
En una realización específica, la bebida es cerveza de cebada, la cual comprende menos de 60%, preferentemente menos de 50% de T2N potencial comparado con el T2N potencial de una cerveza de cebada preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o Quench.
En otra realización específica, la bebida –preferentemente cerveza– es preparada a partir de mosto calentado, el 25 cual ha sido solo tratado con calor durante un corto tiempo, tal como a una temperatura en el rango de 95 a 99,8ºC o en el rango de 95 a 99ºC durante un rango de 10 a 30 min. Preferentemente, dicho mosto calentado ha sido calentado como se describe en la presente memoria descriptiva anteriormente en la sección “Calentamiento del mosto". En realizaciones donde la bebida -preferentemente cerveza– es preparada a partir de tal mosto calentado, entonces dicha bebida –preferentemente cerveza− comprende menos de 60%, preferentemente menos de 50%, más 30 preferentemente menos de 45% de T2N potencial comparado con el T2N potencial de una cerveza preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o cv. Quench o cv. Rosalina. En esta realización, se prefiere también que dicha bebida –preferentemente cerveza− comprenda menos de 60%, preferentemente menos de 50%, más preferentemente menos de 45% de precursor de T2N comparado con los precursores de T2N de una bebida –preferentemente cerveza- preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo 35 salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o cv. Quench o cv. Rosalina. En esta realización, se prefiere también que la cerveza de acuerdo con la invención comprenda como máximo 2 ppb, más preferentemente como máximo 1,5 ppb de T2N potencial. En esta realización, se prefiere además que la cerveza de acuerdo con la invención comprenda como máximo 2 ppb, más preferentemente como máximo 1,5 ppb de precursor de T2N si el °P en el extracto original sobre el cual está basada dicha bebida es ajustado en el rango de 10 a 12°P, más preferentemente 40 a 11°P. Dicha bebida –preferentemente cerveza− también comprende menos de 10 ppb de DMS.
“Cualidades organolépticas" significa cualidades que apelan a los sentidos del gusto y del olfato humanos. Dichas cualidades son analizadas, por ejemplo, por un panel especialista en degustar cerveza. Preferentemente, dicho panel está entrenado en catar y describir sabores de cerveza, con foco especial en aldehídos, gusto a papel, gusto a 45 viejo, ésteres, alcoholes superiores, ácidos grasos y componentes sulfurosos.
En general, el panel de degustación consistirá en un rango de 3 a 30 miembros, por ejemplo en el rango de 5 a 15 miembros, preferentemente en el rango de 8 a 12 miembros. El panel de degustación puede evaluar la presencia de diversos sabores, tales como sabores indeseables a papel, oxidado, envejecido y a pan, así como sabores de 50 ésteres, de alcoholes superiores, de componentes de azufre y cuerpo de cerveza. En relación con la presente invención, se prefiere que los sabores indeseables a papel y/o a viejo sean particularmente reducidos, mientras que los sabores tales como aromático, de ésteres, alcohólicos/solventes, florales y/o de lúpulo pueden ser preferentemente aumentados en comparación con una bebida preparada a partir de cebada de tipo salvaje utilizando un procedimiento idéntico. Un procedimiento para determinar las “cualidades organolépticas” de una 55 bebida es descrita en el Ejemplo 6 en la solicitud de patente internacional WO 2005/087934. Otro procedimiento para determinar las “cualidades organolépticas” de una bebida es descrita en los Ejemplos 8 y 9 en la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860). Aún otro ejemplo se describe en la presente memoria descriptiva más adelante en el Ejemplo 9. En realizaciones preferidas, las cualidades
organolépticas estables son al menos parcialmente, un resultado de bajos niveles de T2N o T2N potencial. El sabor aromático, a éster, alcohólico/solvente, floral, y/o a lúpulo puede ser preferentemente determinado como se describe en el Ejemplo 7 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288). En una realización preferida las bebidas de la invención tienen puntajes para sabor aromático, a éster, alcohólico/solvente, floral, y/o a lúpulo como se describe en la solicitud de patente internacional 5 PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288) en la pág. 41, línea 15 a pág. 44, línea 9.
Se prefiere que las bebidas de acuerdo con la presente invención estén caracterizadas por tener un menor gusto a papel comparado con una bebida similar preparada del mismo modo a partir de una planta de cebada de tipo salvaje (preferentemente cv. Quench o cv. Rosalina) después de almacenamiento durante al menos 1 semana en el rango 10 de 30 a 40ºC, tal como aproximadamente a 37°C. Preferentemente, dicho gusto a papel es menos de 90%, más preferentemente menos de 80%, tal como menos de 70% evaluado por un panel entrenado en degustación.
Se prefiere también que las bebidas de acuerdo con la presente invención tengan un reducido sabor a papel comparado con bebidas similares preparadas a partir de cebada de tipo salvaje después del almacenamiento a 15 temperaturas elevadas. Cuando la propiedad de “sabor a papel” es determinada por un panel de degustación especializado, entrenado (como se describió precedentemente), un puntaje en una escala de 0 a 5 −en la cual 0 es ausente y 5 es extremo- se prefiere que las bebidas de la invención tengan uno, o preferentemente ambos de los siguientes puntajes para sabor a papel:
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(i) un puntaje para sabor a papel de al menos 0,5, preferentemente al menos 0,7 menor que el puntaje para sabor a papel de una bebida preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Quench o cv. Rosalina después de incubación a 37ºC durante una semana;
(ii) un puntaje para sabor a papel al menos 0,5, preferentemente al menos 0,7, más preferentemente al menos 0,8, al menos 1 más bajo que el puntaje para sabor a papel de una bebida preparada del mismo modo a partir de cebada 25 de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Power o cv. Rosalina después de la incubación a 37ºC durante dos semanas.
De manera interesante, la presente invención describe que el puntaje de sabor general de una bebida fabricada de acuerdo con la presente invención es mejorado comparada con bebidas preparadas a partir de cebada de tipo 30 salvaje. Esto puede ser parcialmente atribuido al hallazgo de que el DMS puede enmascarar ciertos sabores deseables.
En consecuencia, se prefiere que las bebidas de la presente invención tengan un puntaje de sabor general que sea al menos 1, preferentemente al menos 1,5, más preferentemente al menos 2 más alto que el puntaje de sabor de 35 una bebida preparada del mismo modo a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir del cv. Quench o cv. Rosalina, cuando dicha bebida ha sido preparada sin hervir el mosto correspondiente, preferentemente utilizando un calentamiento presurizado. Dicho puntaje de sabor deberá ser puntuado en una escala desde 1 a 9, donde 9 representa el mayor puntaje dado por un panel especialista en degustación de cerveza.
40
Se dice que una bebida tiene “cualidades organolépticas estables”, cuando dicha bebida comprende muy bajos niveles de T2N libres, aún después del almacenamiento. En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar bebidas (tal como cerveza con cualidades organolépticas estables), fabricadas utilizando una planta de cebada con doble LOX nula-MMT nula.
45
En consecuencia, se prefiere que las bebidas de la presente invención comprendan menos de 80%, preferentemente menos de 70%, más preferentemente menos de 65%, aún más preferentemente menos de 60% aún más preferentemente menos de 55% de T2N libre comparada con una bebida preparada de la misma manera a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir de un cv. Quench o un cv. Rosalina −después de almacenamiento durante al menos 1 semana, preferentemente al menos 2 semanas, más preferentemente al menos 50 3 semanas, aún más preferentemente durante al menos 4 semanas a una temperatura en el rango de 30 a 40ºC, preferentemente a 37ºC. También se prefiere que las bebidas de la invención comprendan menos de 0,025 ppb de T2N libre después de almacenamiento durante 2 semanas a 37ºC.
En otra realización específica, la bebida –preferentemente cerveza– es preparada a partir de mosto calentado, el 55 cual ha sido tratado con calor solo por un corto tiempo, tal como una temperatura en el rango de 95 a 99ºC durante un rango de 10 a 30 min. Preferentemente dicho mosto calentado ha sido calentado como se describió precedentemente en la presente memoria descriptiva en la sección "Calentamiento del mosto". En realizaciones donde la bebida −preferentemente cerveza− es preparada a partir de dicho mosto calentado, entonces dicha bebida –preferentemente cerveza− comprende menos de 80%, preferentemente menos de 70%, más preferentemente menos 60
de 65% de T2N libre comparada con una bebida preparada de la misma manera a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir de un cv. Quench o un cv. Rosalina −después de almacenamiento durante al menos 1 semana, preferentemente al menos 2 semanas, más preferentemente al menos 3 semanas, aún más preferentemente durante al menos 4 semanas a una temperatura en el rango de 30 a 40ºC, preferentemente a 37ºC.
5
En particular, se prefiere que tales bebidas –preferentemente cerveza– preparadas a partir de dicho mosto calentado comprendan muy bajos niveles de T2N, preferentemente menos de 80%, preferentemente menos de 70%, más preferentemente menos de 65% de T2N libre comparada con una bebida preparada de la misma manera a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir de un cv. Quench o un cv. Rosalina −después de almacenamiento durante 2 semanas a una temperatura en el rango de 30 a 40ºC, preferentemente a 37ºC en presencia de un nivel 10 de sulfito que no excede de 10 ppm, preferentemente un nivel de sulfito en el rango de 1 a 10 ppm, más preferentemente en el rango de 1 a 8 ppm, más preferentemente en el rango de 2 a 6 ppm, aún más preferentemente en el rango de 3 a 6 ppm de sulfito.
Es también particularmente preferido que las bebidas de acuerdo con la invención −tal como cerveza, por ejemplo 15 cerveza de cebada− comprendan muy bajos niveles de T2N, preferentemente menos de 80%, preferentemente menos de 70%, más preferentemente menos de 60%, aún más preferentemente menos de 5% de T2N libre comparada con una bebida preparada de la misma manera a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente de cv. Quench o cv. Rosalina −después de almacenamiento durante 8 semanas a 37ºC.
20
En una realización, la descripción se refiere una bebida, tal como cerveza, con bajos niveles de ciertos ácidos trihidroxi octadecenoicos (también denominados THAs), en particular una bebida con bajos niveles de 9,12,13-THA y 9,10,13-THA. Los THAs están caracterizados por un sabor amargo (Baur and Grosch, 1977; Baur y col., 1977), haciendo dichos compuestos indeseables en bebidas.
25
En consecuencia es deseable que el nivel de 9,12,13-THA y 9,10,13-THA sea tan bajo como sea posible, por ejemplo más bajo que 1,3 ppm, tal como más bajo que 1 ppm. De manera concordante, se prefiere que el nivel de 9,12,13-THA sea tan bajo como sea posible, por ejemplo más bajo que 1,3 ppm, tal como más bajo que 1 ppm. También se prefiere que el nivel de 9,10,13-THA sea tan bajo como sea posible, por ejemplo más bajo que 1,3 ppm, tal como más bajo que 1 ppm. Sin embargo, la concentración global de 9,12,13-THA y 9,10,13-THA en una bebida 30 derivada de malta −tal como cerveza− también es dependiente de la cantidad de malta utilizada para la preparación de dicha bebida específica. Así, en general, una cerveza fuerte comprenderá más 9,12,13-THA y 9,10,13-THA que una cerveza ligera, haciendo que un mayor nivel global de 9,12,13-THA y 9,10,13-THA sea aceptable en una cerveza más fuerte. De manera concordante, se prefiere que la bebida de acuerdo con la invención comprenda un menor nivel de 9,12,13-THA y 9,10,13-THA que una bebida preparada de la misma manera a partir de cebada de 35 tipo salvaje, preferentemente a partir de un cv. Power o a partir de un cv. Quench o de un cv. Rosalina. En particular, una bebida de acuerdo con la invención preferentemente tiene un nivel de 9,12,13 THA, que es como máximo 50%, preferentemente como máximo 40%, más preferentemente como máximo 30% comparado al nivel en una bebida preparada de la misma manera a partir de una cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir de un cv. Power o un cv. Rosalina. Se prefiere adicionalmente que una bebida de acuerdo con la invención tenga un nivel de 9,10,13-THA, 40 que es de como máximo 70%, preferentemente como máximo 60%, tal como como máximo 50%, por ejemplo como máximo 40% comparado al nivel en una bebida preparada de la misma manera a partir de una cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir de un cv. Power o un cv. Quench o un cv. Rosalina. Tales bebidas pueden ser preparadas utilizando cebada doble LOX nula-MMT nula.
45
En una realización, las bebidas preparadas a partir de cebada doble LOX nula-MMT nula tienen mejorada calidad en la espuma. Esto es en particular relevante cuando la bebida es una cerveza. De manera concordante, es un objeto de la invención proporcionar bebidas, tal como cerveza, con superior calidad en la espuma. Preferentemente, las bebidas de la invención producen al menos 1,5 veces más, preferentemente al menos 2 veces más, aún más preferentemente al menos 3 veces más espuma en 60 a 80 min, preferentemente en 80 min comparada con una 50 bebida preparada de la misma manera a partir de cebada de tipo salvaje, preferentemente a partir de un cv. Quench. Dicha producción de espuma está determinada como se describe en el Ejemplo 8 más adelante en la presente memoria descriptiva.
Productos de plantas 55
Es un objeto de la presente invención proporcionar productos de planta de cebada caracterizados por bajos niveles de uno o más sabores indeseables. En particular, es un objeto de la invención proporcionar productos de plantas, preferentemente productos de planta de cebada, con bajos niveles de T2N, DMS y los correspondientes precursores de los mismos. Como se describe en la invención, tales productos de plantas pueden ser ventajosamente 60
preparados a partir de cebada doble LOX nula-MMT nula. Dicho producto de plantas puede ser malta, preferentemente cualquiera de las maltas descritas precedentemente en la presente memoria descriptiva en la sección “Malteado”. El producto puede ser mosto, preferentemente cualquiera de los mostos descritos precedentemente en la presente memoria descriptiva en la sección “Mosto”; también puede ser una bebida, preferentemente cualquiera de las bebidas descritas precedentemente en la presente memoria descriptiva en la 5 sección "Bebida". Sin embargo, el producto de plantas puede ser también otros productos de plantas que están caracterizados por bajos niveles de T2N, T2N potencial, DMS y DMSP preparados a partir de plantas de cebada con doble LOX nula-MMT nula, o partes de las mismas.
La presente invención se refiere así a productos de plantas, que son composiciones que comprenden las plantas de 10 cebada descritas más adelante en la presente memoria descriptiva, o partes de las mismas, o composiciones preparadas a partir de dichas plantas de cebada, o partes de las mismas, tal como productos de plantas preparados a partir de dichas plantas de cebada, o partes de las mismas. Porque dichas plantas de cebada carecen de actividades de LOX-1, LOX-2 y MMT, las composiciones en general comprenden muy bajos niveles de sabores indeseables y sus moléculas precursoras y en particular de T2N, T2N potencial, DMS y DMSP. Se describen en la 15 presente memoria descriptiva ejemplos de productos de plantas útiles que comprenden, o están preparados a partir de, plantas de cebada que tienen una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional, una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional y una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT funcional.
20
Se prefiere que dicho producto de plantas comprenda uno o más de lo siguiente, preferentemente al menos dos de lo siguiente, aún más preferentemente todo lo siguiente:
(i) menos de 60%, aún más preferentemente menos de 50%, aún más preferentemente menos de 40%, tal como menos de 30%, preferentemente menos de 20%, más preferentemente menos de 10%, de T2N libre; 25
(ii) menos de 60%, aún más preferentemente menos de 50%, aún más preferentemente menos de 40%, tal como menos de 30%, preferentemente menos de 25% de T2N potencial;
(iii) menos de 30%, preferentemente menos de 20%, más preferentemente menos de 15%, aún más preferentemente menos de 10% de DMS;
(iv) menos de 30%, preferentemente menos de 20%, más preferentemente menos de 15%, aún más 30 preferentemente menos de 10%, tal como menos de 5%, por ejemplo menos de 2% de SMM;
(v) menos de 30%, preferentemente menos de 20%, más preferentemente menos de 15%, aún más preferentemente menos de 10% de DMSP;
comparada con un producto de plantas similar preparado de la misma manera a partir de plantas de cebada de tipo 35 salvaje, preferentemente a partir de un cv. Power o un cv. Quench o un cv. Rosalina.
La presente invención se refiere, en un aspecto, a granos de cebada que tienen una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional, una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional y una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT funcional. La presente invención también se refiere a 40 composiciones que comprenden dichos granos, y composiciones preparadas a partir de dichos granos, así como a productos de plantas preparados a partir de dichos granos.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a productos de plantas, que pueden ser composiciones de alimentos, composiciones para alimentación, y composiciones de materiales de partida para fragancias que 45 comprenden plantas de cebada doble LOX nula-MMT nula, o partes de las mismas. Las composiciones de alimentos, por ejemplo, pueden ser, pero no están limitadas a, granos de cebada malteados o no malteados, cebada molida, alimentos de cebada, pan, gachas, mezclas de cereales que comprenden cebada, productos para la salud, tales como bebidas que comprenden cebada, jarabes de cebada, y composiciones de cebada en forma de hojuelas, molidas, micronizadas o extruidas. Las composiciones para alimentación, por ejemplo, incluyen composiciones que 50 comprenden granos de cebada y/o harinas. Las composiciones para alimentación pueden por ejemplo ser puré. Las composiciones de materiales de partida para fragancias se describen más adelante en la presente memoria descriptiva.
La invención también se refiere a mezclas de varios productos de plantas de la invención. Por ejemplo, la invención 55 se refiere a una composición preparada mediante una mezcla de:
(i) una composición que comprende una planta de cebada, o una parte de la misma, que comprende una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional, una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional y una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT funcional; y 60
(ii) una composición de malta preparada a partir de granos con doble LOX nula-MMT nula.
Diversos procedimientos están disponibles para determinar si una planta de cebada o un producto de plantas, es preparado a partir de una planta de cebada que lleva mutaciones en los genes para LOX-1, LOX-2 y MMT, que causan una pérdida total de LOX-1 funcional, una pérdida total de LOX-2 funcional y una pérdida total de MMT 5 funcional, respectivamente. Los productos de plantas comprenderán, en general, al menos algo de ADN genómico de la planta utilizada para su producción. Así, la malta contendrá grandes cantidades de ADN genómico, pero incluso los extractos de cebada o malta, tal como mosto, pueden comprender ADN genómico o fragmentos del mismo de dicha cebada o malta. También las bebidas a base de malta, tal como cerveza, pueden comprender ADN genómico, o fragmentos del mismo de dicha planta. Mediante análisis de ADN en un producto de plantas, puede 10 establecerse si la planta, a partir de la cual se preparó el producto de planta, lleva mutaciones en los genes LOX-1, LOX-2 y MMT, que causan una pérdida total de LOX-1 funcional, una pérdida total de LOX-2 funcional y una pérdida total de MMT funcional. Dichas mutaciones podrían, por ejemplo ser cualquiera de las mutaciones en los genes LOX-1 y LOX-2 descritos más adelante en la presente memoria descriptiva en la sección “Pérdida de LOX funcional”. Dicha mutación en el gen MMT podría, por ejemplo ser cualquiera de las mutaciones en el gen MMT 15 descrito precedentemente en la presente memoria descriptiva en la sección “Pérdida de MMT funcional”. El ADN genómico puede ser analizado mediante cualquier procedimiento útil, tal como secuenciamiento o mediante procedimientos basados en amplificación, incluyendo procedimientos basados en PCR. Si se suponen mutaciones particulares en el gen LOX-1 y/o en el gen LOX-2 y/o en el gen MMT, entonces puede emplearse análisis de polimorfismo, por ejemplo análisis SNP. En relación con la determinación de una mutación en el gen LOX-1 y/o en el 20 gen LOX-2, un ejemplo no limitativo de análisis SNP útil está descrito en la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860) en el Ejemplo 10. En relación con la determinación de una mutación en el gen MMT, un ejemplo no limitativo de análisis SNP útil está descrito en la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288) en los Ejemplos 13 y 17. La persona experta será capaz de adaptar el análisis SNP específico descrito en estos ejemplos para uso con otras mutaciones u otros 25 materiales de partida..
Si los productos de planta mencionados precedentemente en la presente memoria descriptiva son preparados a partir de plantas de cebada, que son doble LOX nula-MMT nula, entonces la presencia vs. la ausencia de mARN LOX-1, mARN LOX-2 y mARN MMT de cebada y/o proteína LOX-1, proteína LOX-2 y proteína MMT puede también 30 ser indicativa de si dicho producto de plantas es preparado a partir de una planta de cebada doble LOX nula-MMT nula. El examen del producto de plantas puede también ser llevado a cabo mediante análisis Western Blot, u otro análisis de proteínas, o mediante RT-PCR, o mediante análisis Northern Blot, o mediante otros análisis de mARN. Tales análisis con particularmente útiles cuando el producto de plantas es malta.
35
Planta de cebada
Se describen bebidas a base de cereales. Los cereales pueden por ejemplo ser seleccionados de entre el grupo que consiste en cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz, sorgo, mijo, triticale, trigo sarraceno, mijo fonio y quinoa. Más preferentemente, el cereal es seleccionado de entre el grupo que consiste en cebada, trigo, centeno, avena, maíz y 40 arroz, más preferentemente el cereal es cebada.
En consecuencia, la invención se refiere una bebida a base de cebada y plantas de cebada útiles para preparar las bebidas de la invención.
45
La cebada es una familia de plantas. La “Cebada salvaje”, Hordeum vulgare ssp. spontaneum, es considerada el progenitor de las formas de cebada cultivadas hoy día. Se cree que la transición de la cebada desde un estado salvaje a un estado cultivado coincidió con un cambio radical de frecuencias de alelos en numerosos loci. Los alelos raros y nuevos eventos mutacionales fueron seleccionados positivamente por los agricultores que rápidamente establecieron las nuevas características en poblaciones de plantas domesticadas, denominadas “cebadas 50 autóctonas” (barley landraces). Estas son generalmente más íntimamente relacionadas a cultivares modernos que a la cebada salvaje. Hasta finales del siglo XIX, las cebadas autóctonas existieron como mezclas altamente heterogéneas de líneas endogámicas y segregados híbridos, incluyendo pocas plantas derivadas de cruces al azar en generaciones tempranas. La mayoría de las autóctonas fueron desplazadas en agriculturas avanzadas por cultivares de línea pura. Niveles intermedios o elevados de diversidad genética caracterizan las restantes 55 autóctonas. Inicialmente, los cultivares de “cebada moderna” representaron selecciones a partir de autóctonas. Estas fueron después derivadas de ciclos sucesivos de cruzamientos entre líneas puras establecidas, tal como aquellas de orígenes geográficos distintos. Finalmente, el resultado fue un marcado estrechamiento de la base genética en muchas, probablemente todas, las agriculturas avanzadas. Comparados con los autóctonos, los cultivares de cebada moderna tienen numerosas propiedades mejoradas (Nevo, 1992; von Bothmer y col., 1992), 60
por ejemplo una o más, pero no limitadas a las siguientes: (i) granos cubiertos y desnudos; (ii) dormancia de semillas; (iii) resistencia a enfermedades; (iv) tolerancia ambiental (por ejemplo a sequía o pH del suelo); (v) cantidades de lisina u otros aminoácidos; (vi) contenido de proteínas; (vii) contenido de nitrógeno; (viii) composición de carbohidratos; (ix) contenido y composición de hordeína; (x) contenido de (1-3,1-4)-β-glucano y arabinoxilano; (xi) rendimiento; (xii) rigidez de la paja; y (xiii) altura de la planta. 5
Dentro de la presente invención, el término “planta de cebada" comprende cualquier planta de cebada, tal como cebadas autóctonas o cultivares de cebada moderna. Así, la invención se refiere a cualquier planta de cebada que comprende una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional, y una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional y una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT 10 funcional. Un ejemplo de una tal planta de cebada está descrito en los Ejemplos más adelante en la presente memoria descriptiva y denominados "Triple-Nula" o "Cebada Triple-Nula".
Sin embargo, las plantas de cebada preferidas para uso en la presente invención son cultivares de cebada moderna o líneas puras. El cultivar de cebada a ser utilizado en la presente invención puede, por ejemplo, ser seleccionado 15 de entre el grupo que consiste en Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Beka, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin – choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett, Rosalina y Jersey preferentemente 20 del grupo que consiste en Haruna Nijo, Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda y Power, preferentemente del grupo que consiste en Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Beka, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin – choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato 25 golden, Haruna Nijo, Scarlett y Jersey preferentemente del grupo que consiste en Haruna Nijo, Sebastian, Tangent, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Power, Quench, NFC Tipple, Barke, Class y Vintage.
En una realización de la invención, la planta de cebada es en consecuencia, un cultivar de cebada moderna (preferentemente un cultivar seleccionado de entre el grupo de cultivares de cebada listados precedentemente en la 30 presente memoria descriptiva) que comprende una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional y una segunda mutación que produce una pérdida total de actividad LOX-2 funcional, y una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT funcional. En esta realización, se prefiere en consecuencia que la planta de cebada no sea una cebada autóctona.
35
La planta de cebada puede estar en cualquier forma adecuada. Por ejemplo, la planta de cebada de acuerdo con la invención puede ser una planta de cebada viable, una planta secada, una planta homogeneizada o un grano de cebada molido. La planta puede ser una planta madura, un embrión, un grano germinado, un grano malteado, un grano malteado molido, un grano molido o similares.
40
Las partes de las plantas de cebada pueden ser cualquier parte adecuada de la planta, tal como granos, embriones, hojas, tallos, raíces, flores o fracciones de los mismos. Una fracción puede, por ejemplo, ser una sección de un grano, embrión, hoja, tallo, raíz o flor. Las partes de plantas de cebada pueden también ser una fracción de un homogeneizado o una fracción de una planta de cebada o grano molidos.
45
En una realización, las partes de plantas de cebada pueden ser células de dicha planta de cebada, tal como células viables que pueden ser propagadas in vitro en cultivos de tejidos. En otras realizaciones, sin embargo, las partes de las plantas de cebada pueden ser células viables que no son capaces de madurar en una planta de cebada entera, es decir células que no son material reproductivo.
50
Pérdida de LOX funcional
La presente invención se refiere a plantas de cebada −o partes de la misma, o productos de plantas de la misma− que tienen una primera, una segunda mutación y una tercera mutación, donde la primera mutación conduce a una pérdida total de LOX-1 funcional, y la segunda mutación conduce a una pérdida total de LOX-2 funcional. La tercera 55 mutación conduce a una pérdida total de MMT funcional como se describe en mayor detalle en la sección "Pérdida de MMT funcional" más adelante en la presente memoria descriptiva.
La pérdida total de LOX-1 funcional y la pérdida total de LOX-2 funcional pueden independientemente estar basadas en diferentes mecanismos. Por ejemplo, la pérdida total de función de una o ambas actividades de LOX-1 y LOX-2 60
puede ser causada por mal funcionamiento de proteínas en la planta de cebada, es decir, mal funcionamiento de proteína LOX-1 y/o LOX-2, tal como proteína LOX-1 mutada sin actividad de formación de 9-HPODE detectable (donde 9-HPODE preferentemente puede ser determinada según lo descrito en el Ejemplo 4 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860), véase más adelante), y/o una proteína LOX-2 mutada sin actividad de formación de 13-HPODE detectable (donde 13-HPODE preferentemente 5 puede ser determinada según lo descrito en el Ejemplo 4 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860), véase más adelante).
La pérdida total de LOX-1 y/o LOX-2 funcional puede ser causada por la carencia de proteína LOX-1 y/o LOX-2. Aparentemente la carencia de proteína LOX-1 conducirá a la pérdida de LOX-1 funcional, y la carencia de proteína 10 LOX-2 conducirá a la pérdida total de LOX-2 funcional. En consecuencia, la planta de cebada puede preferentemente comprender nada −o sólo muy poco, más preferentemente no detectable− proteína LOX-1 y/o LOX-2. La(s) proteína(s) LOX-1 y/o LOX-2 puede(n) ser detectada(s) por cualquier medio conocido para la persona experta en el arte. Preferentemente, sin embargo, la(s) proteína(s) es(son) detectada(s) mediante técnicas donde la proteína LOX-1 es detectada mediante anticuerpos específicos de LOX-1 y LOX-2, tal como anticuerpos policlonales 15 para LOX-1 y LOX-2. Dichas técnicas pueden ser, por ejemplo, Western blotting o ELISA. Dichos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Preferentemente, sin embargo, dichos anticuerpos son de naturaleza policlonal, reconociendo varios diferentes epítopos dentro de la proteína LOX-1 y LOX-2, respectivamente. La proteína LOX-1 y/o LOX-2 pueden también ser detectadas indirectamente, por ejemplo, mediante procedimientos que determinan actividad de LOX-1, o mediante procedimientos que determinan actividad LOX-2. En una realización 20 preferida, la proteína LOX-1 es detectada utilizando los procedimientos reseñados en el Ejemplo 4 de la solicitud internacional de patente WO 2005/087934. La proteína LOX-2 puede ser detectada de una manera similar, utilizando anticuerpos que se unen a LOX-2 de cebada.
La pérdida total de función de una o ambas actividades LOX-1 y LOX-2 pueden ser el resultado de ninguna, o muy 25 pequeña, preferentemente ninguna expresión de un transcripto de LOX-1 y/o un transcripto de LOX-2. La persona experta reconocerá que la ausencia de un transcripto de LOX-1 y/o LOX-2 también dará por resultado la ausencia de una proteína LOX-1 y/o LOX-2 traducida, respectivamente. Alternativamente, la pérdida total de LOX-1 funcional y LOX-2 funcional puede también ser la expresión resultante de un transcripto aberrante de LOX-1 y/o un transcripto aberrante de LOX-2. Un transcripto aberrante de LOX-1 y/o LOX-2 puede ser causado por splicing aberrante del 30 transcripto, por ejemplo, debido a una mutación en un sitio de splicing. En consecuencia, las plantas de cebada de la invención pueden llevar una mutación en un sitio de splicing, tal como un sitio de splicing 5' o un sitio de splicing 3', por ejemplo en uno de los dos nucleótidos más 5' de un intrón, o en uno de los nucleótidos más 3' de un intrón. Un ejemplo de un mutante con splicing aberrante del transcripto de LOX-1 se describe como mutante A618 en la WO2005/087934. La expresión de transcriptos que codifican LOX-1 o LOX-2 puede, por ejemplo, ser detectada 35 mediante Northern blotting o experimentos RT-PCR.
Las mutaciones han causado la pérdida total de enzimas LOX-1 y LOX-2 funcionales de las plantas de cebada de la presente invención. En consecuencia, las plantas de cebada de la presente invención en general llevan una mutación en el gen LOX-1. Dicha mutación puede estar en las regiones reguladoras, por ejemplo dentro del 40 promotor o de intrones, o dicha mutación puede estar en la región codificante. La mutación puede ser también una deleción del gen LOX-1 o parte del mismo, tal como deleción de la región codificante completa. Similarmente, las plantas de cebada de la presente invención en general llevan una mutación en el gen LOX-2. Dicha mutación puede estar en las regiones reguladoras, por ejemplo dentro del promotor o de intrones, o dicha mutación puede estar en la región codificante. La mutación puede ser también una deleción del gen de LOX-2 o parte del mismo, tal como 45 deleción de la región codificante completa. En consecuencia, la causa de la pérdida total de enzimas LOX-1 y/o LOX-2 funcionales pueden también ser detectadas por la identificación de mutaciones en el gen que codifica LOX-1, o en el gen que codifica LOX-2. Las mutaciones en los genes que codifican LOX-1 y LOX-2 pueden, por ejemplo, ser detectadas secuenciando dichos genes. Preferentemente, después de identificar una mutación, la pérdida total de función es confirmada ensayando las actividades de LOX-1 y/o LOX-2. 50
Se entiende que el término "proteína LOX-1" cubre la longitud completa de la proteína LOX-1 de cebada como se establece en la SEQ ID NO:3 (que corresponde con WO 2005/087934), o en la SEQ ID NO:7 de WO 2005/087934, o un homólogo funcional de las mismas. El sitio activo de LOX-1 está situado en la parte del C-terminal de la enzima. En particular, se anticipa que los residuos de aminoácidos de la región que abarca 520-862, o parte de los mismos, 55 (preferentemente la región completa de aminoácidos de los nos. 520-862) son relevantes para la actividad de LOX-1. En consecuencia, en una realización, la cebada con LOX-1 nula preferentemente comprende un gen que codifica una forma mutada de LOX-1 que carece de algunos o todos los aminoácidos 520-862 de LOX-1. Dicho LOX-1 mutado puede también carecer de otros residuos aminoácidos, los cuales están presentes en el LOX-1 de tipo salvaje. 60
En consecuencia, cebada con doble LOX nula de la invención puede comprender una forma truncada de LOX-1, que no es funcional −tal como una forma truncada de N- o C-terminal. Preferentemente, dicha forma truncada comprende no más de 800, más preferentemente no más de 750, aún más preferentemente no más de 700, aún más preferentemente no más de 690, aún más preferentemente no más de 680, aún más preferentemente no más de 5 670 aminoácidos consecutivos de LOX-1, tal como no más de 665, por ejemplo no más de 650, tal como no más de 600, por ejemplo no más de 550, tal como no más de 500, por ejemplo no más de 450, tal como no más de 425, por ejemplo no más de 399 aminoácidos consecutivos de LOX-1 de SEQ ID NO:3 de WO 2005/087934. Preferentemente, dicha forma truncada comprende solamente un fragmento N-terminal de LOX-1, preferentemente como máximo los 800, más preferentemente como máximo los 750, aún más preferentemente como máximo los 10 700, aún más preferentemente como máximo los 690, aún más preferentemente como máximo los 680, aún más preferentemente como máximo los 670, aún más preferentemente como máximo los 665 aminoácidos N-terminal de la SEQ ID NO:3 de WO 2005/087934, tal como no más de 665, por ejemplo no más de 650, tal como no más de 600, por ejemplo como máximo los 550, tal como como máximo los 500, por ejemplo como máximo los 450, tal como como máximo los 425, por ejemplo como máximo los 399 aminoácidos N-terminal de la SEQ ID NO:3 de WO 15 2005/087934. En adición al fragmento de LOX-1, dicha forma truncada puede opcionalmente comprender secuencias C-terminal que no están presentes en el LOX-1 de tipo salvaje. Este puede ser en particular el caso si la forma truncada ha aparecido a partir del splicing aberrante. Preferentemente, dichas secuencias adicionales de C-terminal consisten en como máximo 50, más preferentemente como máximo 30, aún más preferentemente como máximo 10, aún más preferentemente como máximo 4, o como máximo 1 aminoácido. 20
En una realización muy preferida, la forma truncada puede consistir en aminoácidos 1−665 de la SEQ ID NO:3 de WO 2005/087934.
En una realización preferida, la planta de cebada comprende un gen que codifica LOX-1 que está transcripto en 25 ARNm, el cual comprende un codón sin sentido o un codón de terminación corriente arriba del codón de terminación del ARNm de tipo salvaje de LOX-1. Tal codón sin sentido es en la presente memoria descriptiva indicado un codón sin sentido prematuro. Preferentemente, todos los genes que codifican LOX-1 transcriptos en ARNm de dicha planta comprenden un codón sin sentido prematuro o un codón de terminación. El codón sin sentido o codón de terminación está situado preferentemente como máximo 800, más preferentemente como máximo 750, aún más 30 preferentemente como máximo 700, aún más preferentemente como máximo 690, aún más preferentemente como máximo 680, aún más preferentemente como máximo 670, aún más preferentemente como máximo 665 codones aguas abajo del codón de inicio. La secuencia de ADN genómica de tipo salvaje que codifica LOX-1 está dada en la SEQ ID NO:1 de WO 2005/087934 o la SEQ ID NO:5 de WO 2005/087934.
35
En una realización preferida, la planta de cebada comprende un gen que codifica LOX-1, donde el correspondiente pre-ARNm transcripto a partir de dicho gen comprende la secuencia correspondiente a la SEQ ID NO:2 (correspondiente a la SEQ ID NO:2 de WO 2005/087934).
En una realización muy preferida, el gen que codifica LOX-1 mutante de la planta de cebada con doble LOX nula de 40 acuerdo con la invención comprende una mutación sin sentido, dicha mutación correspondiendo a una sustitución G→A en la posición 3574 de SEQ ID NO:1 (correspondiente a la SEQ ID NO: 1 de WO 2005/087934).
El término “proteína LOX-2" significa que cubre la proteína LOX-2 de cebada de longitud completa como se establece en la SEQ ID NO:5 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 45 2010/075860), o un homólogo funcional de la misma. El sitio activo de LOX-2 está situado en la parte C-terminal de LOX-2. En particular, se anticipa que los residuos de aminoácidos de la región que abarca de 515-717, o parte de los mismos, son relevantes para la actividad de LOX-2. Con base en un examen de la estructura cristalina de LOX-1 de poroto de soja, los tramos de secuencia anticipada de la hendidura del sitio activo de la enzima LOX-2 de cebada están representados por los residuos de aminoácidos 515-525 y 707-717. Una proteína LOX-2 mutada, traducida, es 50 decir una forma truncada C-terminalmente de LOX-2 de cebada con doble LOX mutante nula A689 contiene como máximo 684 residuos, y por lo tanto no tendrá el segundo tramo de secuencia de la hendidura del sitio activo − haciéndola inactiva. De acuerdo con una realización, la cebada con doble LOX nula de la invención comprende preferentemente un gen que codifica una forma mutante de LOX-2 que carece de algunos, o todos los aminoácidos 515-717 de LOX-2, preferentemente carecen de algunos o de todos de los aminoácidos 707 a 717, aún más 55 preferentemente careciendo de los aminoácidos 707-717. Dicho LOX-2 mutante puede también carecer de otros residuos de aminoácidos, los cuales están presentes en LOX-2 de tipo salvaje.
Por consiguiente, la cebada con LOX doble nula puede comprender una forma truncada de LOX-2, que no es funcional, tal como una forma truncada N-terminal o C- terminal. Preferentemente, dicha forma truncada comprende 60
no más de 800, más preferentemente no más de 750, aún más preferentemente no más de 725, aún más preferentemente no más de 700, aún más preferentemente no más de 690, aún más preferentemente no más de 684 aminoácidos consecutivos de LOX-2 de la SEQ ID NO:5 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860). Preferentemente, dicha forma truncada comprende solo un fragmento N-terminal de LOX-2. Por lo tanto, preferentemente dicha forma truncada comprende como máximo los 5 800, más preferentemente como máximo los 750, aún más preferentemente como máximo los 725, aún más preferentemente como máximo los 700, aún más preferentemente como máximo los 690, aún más preferentemente como máximo los 684 aminoácidos N-terminal de la SEQ ID NO:5 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860). En adición al fragmento de LOX-12, dicha forma truncada puede opcionalmente comprender secuencias C-terminal adicionales no presentes en LOX-2 de tipo salvaje. Este 10 puede ser en particular el caso si la forma truncada ha surgido de un splicing aberrante. Preferentemente, dichas secuencias C-terminal adicionales consisten en como máximo 50, más preferentemente como máximo 30, aún más preferentemente como máximo 10, aún más preferentemente como máximo 4, o como máximo 1 aminoácido.
En una realización muy preferida, la forma truncada puede consistir en aminoácidos 1−684 de la SEQ ID NO:5 de la 15 solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860).
En una realización preferida, la planta de cebada comprende un gen transcripto en ARNm para LOX-2, donde dicho ARNm comprende un codón sin sentido o un codón de terminación corriente arriba del codón de terminación del ARNm de LOX-2 de tipo salvaje. Tal codón sin sentido es designado en la presente memoria descriptiva como un 20 codón sin sentido prematuro. Preferentemente todos los genes transcriptos en ARNm que codifican LOX-2 de dicha planta comprenden un codón sin sentido prematuro o un codón de terminación. El codón sin sentido o codón de terminación está preferentemente situado como máximo 800, más preferentemente como máximo los 750, aún más preferentemente como máximo los 725, aún más preferentemente como máximo los 700, aún más preferentemente como máximo los 690, aún más preferentemente como máximo los 684 codones corriente abajo del codón de inicio. 25 La secuencia de ADN genómico de tipo salvaje que codifica LOX-2 está dada en la SEQ ID NO:1 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860).
En una realización muy preferida, el gen que codifica LOX-2 mutado de la planta de cebada con doble LOX nula comprende una mutación sin sentido, donde dicha mutación corresponde a una sustitución a G→A en la posición 30 2689 de la SEQ ID NO:1 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860).
La planta de cebada de acuerdo con la invención puede ser preparada mediante cualquier procedimiento adecuado conocido para la persona experta en el arte, preferentemente mediante uno de los procedimientos indicados en la 35 presente memoria descriptiva más adelante en la sección "Preparación de cebada doble LOX nula-MMT nula".
Pérdida de MMT funcional
La presente invención se refiere a plantas de cebada −o partes de las mismas, o productos de plantas de las 40 mismas− que tienen una primera, una segunda mutación y una tercera mutación, donde la primera mutación conduce a una pérdida total de LOX-1 funcional, y la segunda mutación conduce a una pérdida total de LOX-2 funcional –ambas descritas precedentemente en la presente memoria descriptiva en más detalle en la sección "Pérdida de LOX funcional". La tercera mutación conduce a una pérdida total de MMT funcional.
45
La pérdida total de un MMT funcional puedes basarse en diferentes mecanismos. Por ejemplo, la pérdida total de MMT funcional puede resultar en una proteína que funcione mal en dicha planta, es decir una enzima MMT que funciona mal, tal como una proteína MMT mutante con actividad no detectable. Por ejemplo, la proteína MMT del mutante puede ser una proteína truncada. La pérdida de actividad de MMT puede estar basada similarmente en diferentes mecanismos, por ejemplo causada por un malfuncionamiento de la proteína MMT. 50
Preferentemente, la actividad de una proteína MMT mutada es determinada por su capacidad para catalizar la transferencia de un grupo metilo desde SAM a Met, formando de este modo SMM. Esto puede, por ejemplo, ser asumido como se describe en el Ejemplo 4 en la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288). Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de una MMT mutada es obtenida 55 determinando la secuencia traducida del correspondiente ADNc de cebada aislado. Esto puede ser hecho esencialmente como se describe en el Ejemplo 8 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288). Alternativamente, el MMT mutado de una planta de cebada de la invención es obtenido mediante expresión heteróloga en un cultivo de células bacterianas como se describe en el Ejemplo 11 y el Ejemplo 12 en la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288), 60
seguido de verificación de que la proteína recombinante es inactiva como una enzima MMT.
La pérdida total de MMT funcional puede ser comprendida por la carencia de proteína MMT. La pérdida de proteína MMT conducirá a la pérdida de la función de MMT. Entonces, la planta de cebada puede no comprender o solo muy poca, preferentemente ninguna proteína MMT detectable. La presencia o ausencia de proteína MMT puede ser 5 detectada por cualquier medio conocido para la persona experta en el arte. Sin embargo, la(s) proteína(s) es(son) preferentemente analizada(s) mediante técnicas donde la proteína MMT es detectada mediante anticuerpos específicos que reconocen MMT. Dichas técnicas pueden, por ejemplo, ser Western Blotting o ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, y dichos anticuerpos específicos pueden ser monoclonales o policlonales. Preferentemente, sin embargo, dichos anticuerpos son policlonales que reconocen diversos epítopos diferentes 10 dentro de la proteína MMT. Estos pueden ser también detectados indirectamente, por ejemplo, mediante procedimientos de determinación de actividad de MMT. En consecuencia, en la invención, una planta de cebada se dice que lleva una mutación en el gen que codifica MMT, causando así una pérdida total de actividad de MMT, cuando no hay proteína MMT detectable en dicha planta. En particular, este es el caso cuando no hay proteína MMT detectable con una masa aproximada de 120 kDa, ±10%, en dicha planta de planta de cebada −preferentemente en 15 granos de dicha planta de cebada, analizada por Western Blotting.
La pérdida total de MMT funcional puede también ser un resultado de ninguna o muy poca, preferentemente ninguna transcripción de un ARNm de MMT. La persona experta reconocerá que la ausencia de un transcripto de MMT resultará también en la ausencia de proteína MMT. 20
Preferentemente, sin embargo, la pérdida total de MMT funcional es el resultado de la expresión de un transcripto de MMT aberrante. Dicho transcripto puede ser preferentemente causado por un evento de splicing de un transcripto primario, por ejemplo, debido a una mutación en un sitio de splicing. La expresión de transcriptos que codifican MMT puede, por ejemplo, ser detectada por Northern blotting, o por procedimientos RT-PCR. 25
La pérdida total de MMT funcional en las plantas de cebada de la presente invención es causada por una o más mutaciones. Así, las plantas de cebada de la presente invención, en general, llevan al menos una mutación en el gen de MMT. Dicha(s) mutación(es) pueden estar en regiones reguladoras, por ejemplo dentro del promotor, o intrones, o dicha(s) mutación(es) puede(n) estar en la región codificante de la proteína. La mutación puede ser 30 también una deleción del gen MMT o parte de la misma, por ejemplo deleción de la región codificante del gen MMT. Así, la pérdida de MMT funcional puede también ser detectada analizando mutaciones en el gen que codifica MMT. Las mutaciones en el gen que codifica MMT pueden, por ejemplo, ser detectadas secuenciando dicho gen, seguida por la comparación con la secuencia de tipo salvaje, preferentemente la secuencia de tipo salvaje del cv. Prestige dada en la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288) como SEQ ID 35 NO:3, o aquella del cv. Sebastian (SEQ ID NO:16 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)). Preferentemente, después de identificar una mutación, la pérdida de función es confirmada ensayando la actividad de MMT, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 2 o Ejemplo 4 (véase más adelante) de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288).
40
Mediante el término proteína MMT se quiere significar que cubre la proteína MMT de cebada de longitud completa como se establece en la SEQ ID NO:6 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288), o un homólogo funcional de la misma. En este contexto, un homólogo funcional es una proteína MMT con el mismo nivel de actividad de MMT, ±25%, así como aquella de la proteína MMT de cebada como se establece en la SEQ ID NO:13, donde la actividad de MMT es determinada como se describe en el Ejemplo 2 o en el 45 Ejemplo 4 (véase más adelante) de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288).
La planta de cebada que lleva una tercera mutación que causa una pérdida total de actividad de MMT puede comprender una forma de MMT truncada, no funcional, tal como una forma truncada N-terminal o C-terminal. Una 50 planta de cebada puede comprender más de una forma truncada de MMT, tal como 2, o por ejemplo 3, o tal como más de 3 diferentes formas truncadas de MMT, la cual puede resultar a partir de transcriptos con splicing en forma aberrante. Dichas formas truncadas comprenden solamente un fragmento N-terminal de MMT. En adición al fragmento N-terminal de MMT tipo salvaje, dichas formas truncadas de MMT pueden comprender secuencias C-terminal adicionales no encontradas en MMT de tipo salvaje. Dichas secuencias C- terminal adicionales, pueden por 55 ejemplo, ser secuencias intrón traducidas, tal como aquellas comprendidas en el ARNm mutante debido a splicing aberrante. Preferentemente, dichas formas de MMT comprenden como máximo los 500, más preferentemente como máximo los 450, aún más preferentemente como máximo los 400, aún más preferentemente como máximo los 350, aún más preferentemente como máximo los 320, aún más preferentemente como máximo 311, o como máximo 288 residuos aminoácidos N- terminal de la SEQ ID NO:6 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 60
(publicada como WO 2010/063288). Este es en particular el caso cuando dicha planta de cebada tiene una pérdida total de actividad de MMT. Sin embargo, la MMT puede también comprender menos, tal como no más de 300, por ejemplo no más de 250, tal como no más de 200, por ejemplo como máximo los 150, por ejemplo no más de 147, o no más de 133 aminoácidos N-terminal de la SEQ ID NO:6 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288). 5
En una realización muy preferida, la forma truncada de MMT puede consistir de los aminoácidos 1−311 o aminoácidos 1−288 de la SEQ ID NO:6 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288) y opcionalmente secuencias C-terminal adicionales no presentes en MMT de tipo salvaje. Preferentemente, dichas secuencias C-terminal consisten en como máximo 50, más preferentemente como máximo 10 30, aún más preferentemente como máximo 10, aún más preferentemente como máximo 4, o como máximo 1 aminoácido. En una realización muy preferida, la forma truncada de MMT puede ser la proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:18 (correspondiente a la SEQ ID NO:11 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288), o la SEQ ID NO:19 (correspondiente a la SEQ ID NO:13 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288), o la SEQ ID NO:20 15 (correspondiente a la SEQ ID NO:15 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)). Ninguna de las proteínas de SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 o SEQ ID NO: 20 (correspondientes respectivamente a SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:15 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288) representan enzimas MMT funcionales.
20
En otra realización muy preferida, la forma de MMT truncada puede consistir de los aminoácidos 1−147, o de los aminoácidos 1−133, de la SEQ ID NO:18 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288), y opcionalmente secuencias C-terminal adicionales no presentes en MMT de tipo salvaje. Preferentemente, dichas secuencias C-terminal adicionales consisten en como máximo 50, más preferentemente como máximo 40, aún más preferentemente como máximo 39, o como máximo 33, o como máximo 30 aminoácidos. 25 En una realización muy preferida, la forma de MMT truncada puede ser una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:22, o la SEQ ID NO:24, o la SEQ ID NO:26 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288), respectivamente. Ninguna de las proteínas de SEQ ID NO:22, o SEQ ID NO:24, o SEQ ID NO:26 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288), respectivamente, son enzimas de MMT funcional. 30
Las formas truncadas de MMT pueden, por ejemplo estar presentes en plantas de cebada que llevan una mutación en el gen de MMT, donde dicha mutación introduce un codón de terminación prematuro dando por resultado un gen que codifica las formas anteriormente mencionadas de MMT.
35
En una realización preferida, la planta de cebada comprende un gen de MMT que es transcripto en ARNm, el cual comprende algunos, pero no todos los genes de MMT de tipo salvaje con splicing juntos sin intervención (la estructura intrón−exón del gen de MMT de cebada de tipo salvaje es mostrada en la FIG. 9 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)). En una realización es en consecuencia preferido que el ARNm de MMT de la planta de cebada de acuerdo con la invención comprenda como 40 máximo exones 1, 2, 3, 4, y 5 con splicing juntos sin intervención, o por ejemplo como máximo los exones 1 y 2 con splicing juntos sin intervención. En adición a dichos exones con splicing juntos, los ARNms de MMT de la planta de cebada de acuerdo con la invención pueden comprender secuencias adicionales 3' terminal derivadas de intrones y/o exones, donde los intrones separan secuencias de exones. Ejemplos preferidos de ARNms aberrantes de MMT de plantas de cebada de acuerdo con la invención –determinado mediante RT-PCR y en consecuencia con 45 longitudes de fragmentos en bp− se ilustran en la FIG. 12 y la FIG. 16 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288). Más preferentemente, los ARNms aberrantes de plantas de cebada de acuerdo con la invención son aquellos ilustrados en la FIG. 12 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288), comprendiendo además los exones 1 y 2 en el extremo 5', o los ARNms ilustrados en la FIG. 16 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada 50 como WO 2010/063288), comprendiendo además el exón 1 en el extremo 5'.
En una realización muy preferida, la planta de cebada que lleva una tercera mutación en el gen para MMT que causa una pérdida total de MMT funcional comprende una mutación en un sitio de splicing dentro del gen MMT, que produce ARNm con splicing en forma aberrante. Más preferentemente, dicha mutación está posicionada en un intrón 55 del gen MMT, aún más preferentemente en el sitio de splicing 5’ de un intrón, tal como en el sitio de splicing 5’ del intrón 1 (el intrón que separa los exones 1 y 2), tal como en el sitio de splicing 5’ del intrón 2 (el intrón que separa los exones 2 y 3), tal como en el sitio de splicing 5’ del intrón 3 (el intrón que separa los exones 3 y 4), tal como en el sitio de splicing 5’ del intrón 4 (el intrón que separa los exones 4 y 5), tal como en el sitio de splicing 5’ del intrón 5 (el intrón que separa los exones 5 y 6), tal como en el sitio de splicing 5’ del intrón 6 (el intrón que separa los exones 6 y 60
7), lo más preferentemente en el sitio de splicing 5’ del intrón 2 o del intrón 5.
Se prefiere que dicha mutación sea una mutación G→A de la base 5’ terminal de los intrones mencionados precedentemente. Así, una mutación muy preferida es una mutación G→A de la base 5’ terminal del intrón 2, o una mutación G→A de la base más 5' del intrón 5. 5
La planta de cebada de acuerdo con la invención puede ser preparada mediante cualquier procedimiento adecuado conocido para la persona experta en el arte, preferentemente mediante el procedimiento descrito en la presente memoria descriptiva a continuación en la sección "Preparación de cebada doble LOX nula-MMT nula".
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Preparación de cebada doble LOX nula-MMT nula
La planta de cebada de acuerdo con la invención puede ser preparada mediante cualquier procedimiento adecuado conocido para la persona experta en el arte. Preferentemente, la planta de cebada de la invención es preparada mediante un procedimiento que comprende las etapas de mutagenia de plantas de cebada o partes de las mismas, 15 por ejemplo granos de cebada, seguido por el análisis y selección de plantas de cebada caracterizadas por una pérdida total de LOX-1 funcional, pérdida total de LOX-2 funcional y/o pérdida total de MMT funcional.
Las plantas de cebada de acuerdo con la invención comprenden al menos 3 mutaciones. De manera concordante, las plantas pueden ser preparadas preparando plantas de cebada separadas que comprenden solo una de las 20 mutaciones y a continuación cruzando dichas plantas de cebada para obtener una planta de cebada con las 3 mutaciones −o introduciendo sucesivamente las mutaciones dentro de una planta de cebada o mediante combinación de estos procedimientos.
En consecuencia, la planta de cebada de acuerdo con la invención puede ser preparada mediante mutagenia de una 25 planta de cebada o partes de las mismas, por ejemplo granos de cebada, seguido por el análisis y selección de plantas de cebada caracterizadas por una pérdida total de LOX-1 funcional, y mutagenia de otra planta de cebada o partes de la misma, por ejemplo granos de cebada, seguido por el análisis y selección de plantas de cebada caracterizadas por una pérdida total de LOX-2 funcional y mutagenia de aún otra planta de cebada o partes de las mismas, por ejemplo granos de cebada, seguido por el análisis y selección de plantas de cebada caracterizadas por 30 una pérdida total de MMT funcional. Las plantas de cebada seleccionadas pueden finalmente ser cruzadas en varias rondas para obtener plantas de cebada que llevan las tres mutaciones.
Alternativamente, la planta de cebada de la presente invención puede ser preparada mediante mutagenia de plantas de cebada o partes de las mismas, por ejemplo granos de cebada, seguido por el análisis y selección de plantas de 35 cebada caracterizadas por una pérdida total de XX funcional. Dichas plantas de cebada seleccionadas pueden opcionalmente ser propagadas y después estas plantas de cebada −o partes de las mismas, por ejemplo granos de cebada− pueden ser sometidas a mutagenia, seguido por el análisis y selección de plantas de cebada caracterizadas por una pérdida total de YY funcional. Dichas plantas de cebada seleccionadas, o partes de las mismas, pueden opcionalmente ser propagadas y después: 40
(i) estas plantas de cebada −o partes de las mismas, por ejemplo granos de cebada− pueden ser sometidas a mutagenia, seguido por el análisis y selección de plantas de cebada caracterizadas por una pérdida total de ZZ funcional; o
(ii) estas plantas de cebada pueden ser cruzadas con una planta de cebada caracterizadas por pérdida total de ZZ 45 funcional.
En los cruzamientos mencionados precedentemente, XX, YY y ZZ cada una indica alguna de LOX-1, LOX-2 o MMT, donde XX es diferente de YY, que es diferente de ZZ.
50
En una realización preferida, la planta de cebada puede ser preparada mediante un procedimiento que implica la mutagenia de plantas de cebada, o partes de las mismas, por ejemplo granos de cebada, donde dichas plantas de cebada ya llevan una mutación que causa una pérdida total de enzima LOX-1 funcional seguido por el análisis y selección de plantas de cebada que llevan adicionalmente una mutación que causa una pérdida total de LOX-2 funcional (es decir LOX-1 nula-LOX-2 nula, o plantas doble-LOX nula). Este procedimiento implica adicionalmente la 55 mutagenia de otras plantas de cebada, o partes de las mismas y el análisis y selección de plantas de cebada con pérdida total de MMT funcional y finalmente el cruce de estas plantas de cebada con las plantas de cebada LOX-1 nula-LOX-2 nula.
Las plantas de cebada LOX-1 nula adecuadas están, por ejemplo, descritas en la solicitud de patente internacional 60
WO 2005/087934.
Se prefiere que el procedimiento de análisis utilice embriones germinados como material de partida para la identificación de las plantas de cebada caracterizadas por una pérdida total de LOX-2 funcional. De manera interesante, se ha hallado que es menos preferible el uso de embriones maduros como material de partida para el 5 análisis de actividad LOX-2, con base en el análisis de una cantidad de 21.000 embriones maduros, que no revelaron un solo mutante de cebada LOX-2 nula.
Es un objeto de la presente descripción proporcionar procedimientos de preparación de una planta de cebada doble-LOX nula-MMT-nula que comprenden las etapas de: (i) preparar una planta de cebada doble-LOX nula; y (ii) 10 preparar una planta de cebada MMT-nula; (iii) cruzar dicha planta de cebada doble-LOX nula y dicha planta de cebada MMT-nula; (iv) seleccionar plantas de cebada doble-LOX nula-MMT nula.
La preparación de dichas plantas de cebada doble-LOX nula puede ser realizada preferentemente mediante un procedimiento que comprende las etapas de: 15
(i) proporcionar una planta de cebada, o partes de la misma, con una pérdida total de función de actividad LOX-1, tal como pérdida total de enzima LOX-1 funcional; y
(ii) someter a mutagenia dicha planta de cebada, y/o células de cebada, y/o tejido de cebada, y/o granos de cebada, y/o embriones de cebada de dicha planta de cebada, obteniendo de este modo cebada generación M0; y 20
(iii) mejorar dichas plantas mutagenizadas de cebada, granos, y/o embriones durante al menos 2 generaciones, obteniendo de este modo Mx generaciones de plantas de cebada, donde x es un entero ≥2; y
(iv) obtener embriones a partir de dichas Mx plantas de cebada; y
(v) germinar dichos embriones, y
(vi) determinar las actividades de LOX-1 y LOX-2 en dichos embriones germinados, o partes de los mismos; y 25
(vii) seleccionar plantas con una pérdida total de actividad de LOX-1 y de actividad de LOX-2 en los embriones germinados, y
(viii) analizar en cuanto a una mutación en el gen de LOX-1 y en el gen de LOX-2; y
(ix) seleccionar plantas portadoras de una mutación en el gen de LOX-1 y en el gen de LOX-2, es decir plantas con doble-LOX nula; 30
obteniendo de este modo una planta de cebada portando mutaciones en los genes para LOX-1 y LOX-2, que causa una pérdida total de LOX-1 funcional y LOX-2 funcional.
Preparar dichas plantas de cebada con MMT nula puede preferentemente ser llevado a cabo utilizando un 35 procedimiento que comprende las etapas de:
(i) mutagenizar plantas de cebada, y/o células de cebada, y/o tejido de cebada, y/o granos de cebada, y/o embriones de cebada, obteniendo de este modo cebada generación M0; y
(ii) propagar, por ejemplo mediante mejoramiento, dichas plantas de cebada, granos, y/o embriones mutagenizados 40 durante ≥2 generaciones, obteniendo de este modo plantas de cebada de Mx generaciones, donde x es un entero ≥2; y
(iii) obtener una muestra de dichas Mx plantas de cebada; y
(iv) determinar el nivel de SMM en dicha muestra, y
(v) seleccionar las plantas donde la muestra comprende menos de 10 ppb de SMM, preferentemente menos de 5 45 ppb de SMM, más preferentemente SMM no detectable; y
(vi) secuenciar al menos parte del gen de MMT; y
(vii) seleccionar plantas portadoras de una mutación en el gen de MMT.
La planta de cebada anteriormente mencionada con una pérdida total de actividad de LOX-1 puede, por ejemplo, ser 50 cualesquiera de las plantas de cebada con una pérdida total de actividad de LOX-1 descrita en WO 2005/087934, preferentemente la mutante D112, o las plantas progenie de ellas.
Las etapas de mutagenia en los procedimientos anteriormente mencionados pueden implicar material vivo mutagenizado seleccionado de entre el grupo que consiste en plantas de cebada, células de cebada, tejido de 55 cebada, granos de cebada, y embriones de cebada −preferentemente seleccionado de entre el grupo que consiste en plantas de cebada, granos de cebada, y embriones de cebada, más preferentemente granos de cebada.
La mutagenia puede ser llevada a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado. En una realización, la mutagenia es llevada a cabo incubando una planta de cebada, o una parte de la misma −por ejemplo granos de 60
cebada o células individuales a partir de cebada− con un agente de mutagenia. Dicho agente es conocido para la persona experta en el arte, incluyendo, por ejemplo, pero no limitado a, azida de sodio (NaN3), metansulfonato de etilo (EMS), azidoglicerol (AG, 3-azido-1,2-propano-diol), metil nitrosourea (MNU), y hidrazida del ácido maleico (MH).
5
En otra realización, la mutagenia es llevada a cabo mediante irradiación, por ejemplo con UV, de una planta de cebada o una parte de la misma, tal como el grano. En realizaciones preferidas, la mutagenia es llevada a cabo de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva más adelante en la sección “Mutagenia química". Un ejemplo no limitativo de un protocolo de mutagenia adecuado es dado en el Ejemplo 2 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860). 10
Se prefiere que la mutagenia sea realizada de una manera tal que la frecuencia esperada de mutantes deseada sea al menos 0,5, tal como en el rango de 0,5 a 5, por ejemplo en el rango de 0,9 a 2,3 por 10.000 granos, cuando se examina cebada de la generación M3. En una realización preferida, la mutagenia es llevada a cabo sobre granos de cebada. Los granos aplicados al mutágeno son designados como generación M0 (ver también la FIG. 8). 15
La actividad de LOX puede ser determinada en una muestra que consiste en embriones de cebada germinada, preferentemente en un extracto líquido de un embrión de cebada germinada. Dicha muestra, tal como dicho extracto puede ser preparada a partir de cualquier parte adecuada de dicho embrión germinando. En general, la muestra de cebada debe ser homogeneizada utilizando cualquier procedimiento adecuado antes de la preparación de un 20 extracto de dicha muestra y la determinación de actividad de LOX-2. En particular, se prefiere que un extracto de proteína sea preparado a partir de embrión germinando, o parte del mismo, y que la actividad de LOX sea determinada utilizando dicho extracto. La homogeneización puede, por ejemplo, ser llevada a cabo utilizando fuerzas mecánicas, por ejemplo mediante agitación o batido, tal como agitación en presencia de una perla, tal como una perla de vidrio o de arena. 25
En una realización preferida, el embrión germinado es de generación Mx, donde x es un entero ≥2; preferentemente x es un entero en el rango de 2 a 10, más preferentemente en el rango de 3 a 8. En una realización muy preferida, la actividad de LOX es determinada en embriones germinados de generación M3, o una muestra derivada de dichos embriones. En esa realización, se prefiere que los granos mutagenizados de cebada de generación M0 sean 30 crecidos para obtener plantas de cebada, los cuales son cruzados para obtener granos de generación M1. El procedimiento es repetido hasta que se dispone de granos de generación M3 (ver también la FIG. 8).
La determinación de la actividad de LOX puede ser llevada a cabo utilizando cualquier ensayo adecuado, preferentemente mediante uno de los procedimientos descritos de aquí en adelante. En particular, se prefiere que el 35 ensayo provea datos sobre la dioxigenación de ácido linoleico a 9-HPODE y 13-HPODE mediante LOX-1 y LOX-2. En general, por lo tanto, ensayar implicará las etapas de:
(i) proporcionar un extracto proteico preparado a partir de un embrión de cebada germinado o parte del mismo; y
(ii) proporcionar ácido linoleico; y 40
(iii) incubar dicho extracto proteico con dicho ácido linoleico; y
(iv) detectar la dioxigenación de ácido linoleico a 9-HPODE y 13-HPODE.
La etapa (iv) del procedimiento preferentemente comprende determinar el nivel de 9-HPODE y 13-HPODE en dichos embriones germinantes, preferentemente en un extracto proteico preparado a partir de dichos embriones 45 germinantes. La etapa puede comprender una determinación directa o indirecta de los niveles de 9-HPODE y 13-HPODE. Puede ser determinado el nivel de todos los HPODEs, en cuyo caso se prefiere que se lleven a cabo mediciones específicas de 9-HPODE y 13-HPODE para confirmación. Un procedimiento podría, por ejemplo, ser un procedimiento donde los extractos proteicos a partir de los embriones germinantes sean incubados con ácido linoleico como sustrato para la formación de 9-HPODE y 13-HPODE. Dichos HPODEs pueden después ser 50 detectados por distintos procedimientos. Un procedimiento implica la generación de un compuesto detectable, tal como un colorante. Por ejemplo el procedimiento puede ser el acoplamiento oxidativo del ácido 3-dimetilaminobenzoico y 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona en presencia de hemoglobina catalizada por los HPODEs formados para formar el colorante indamina, el cual puede ser medido a A595 utilizando un espectrofotómetro. Un ejemplo de tal procedimiento se describe en los Ejemplos 1 y 2 en la solicitud de patente 55 internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860). Utilizando este ensayo, una lectura de absorción de menos de 0,2 unidades de A595 es considerado como indicativo de la ausencia de LOX-1 y la ausencia de actividades de LOX-2. Sin embargo, un procedimiento más preciso para determinar actividades de LOX-1 y LOX-2 es incubar un extracto proteico de embriones germinantes con ácido linoleico, seguido de la determinación de los
contenidos de 9-HPODE y 13-HPODE. Los contenidos de 9-HPODE y 13-HPODE pueden, por ejemplo, ser determinados utilizando análisis basado en HPLC.
La dioxigenación de ácido linoleico a 9-HPODE y 13-HPODEs puede ser medida directamente o indirectamente. Cualquier procedimiento de detección adecuado puede ser utilizado en la presente invención. En una realización, 5 son detectados los hidroperóxidos del ácido linoleico. Los 9-HPODE y 13-HPODE pueden ser detectados directamente, por ejemplo, mediante procedimientos cromatográficos, tales como HPLC como se describe en el Ejemplo 4 en la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860), véase más adelante.
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Ciertos aspectos del procedimiento para la extracción de proteína a partir del embrión germinante para la determinación de la actividad de LOX son de gran importancia. Así, se prefiere que la proteína sea extraída utilizando un buffer ácido, preferentemente un buffer con un pH en el rango de 2 a 6, más preferentemente en el rango de 3 a 5, aún más preferentemente en el rango de 3,5 a 5, aún más preferentemente en el rango de 4 a 5, aún más preferentemente un pH de 4,5. El buffer utilizado para la extracción está preferentemente basado en un ácido 15 orgánico, más preferentemente un buffer de ácido láctico. Lo más preferentemente, el extracto de proteína es preparado utilizando un buffer de ácido láctico 100 mM, pH 4,5.
Ciertos procedimientos para la detección de plantas con LOX-1 nula y LOX-2 nula que implican hacer reaccionar 9-HPODE y 13- HPODE con un colorante, por ejemplo 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona. Preferentemente, dicho 20 colorante, por ejemplo 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona, es agregado al extracto proteico después de la adición de ácido linoleico. Preferentemente, el colorante es agregado al menos 1 min, más preferentemente al menos 5 min, aún más preferentemente al menos 10 min, tal como en el rango de 1 a 60 min, por ejemplo en el rango de 5 a 30 min, tal como en el rango de 10 a 20 min después de poner en contacto el extracto proteico con el ácido linoleico.
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Los procedimientos preferidos para seleccionar plantas de cebada de acuerdo con la invención son detallados en el Ejemplo 2 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860).
El proceso de selección puede ser ajustado para procedimientos de ensayo basados en placas de microtítulo, u otros formatos de ensayo de alto rendimiento, repetitivos, conocidos para permitir rápido análisis de muchas 30 muestras. Se prefiere que sean analizadas en cuanto a actividades LOX-1 y LOX-2 al menos 5000, tal como al menos 7500, por ejemplo al menos 10.000, tal como al menos 15.000, por ejemplo al menos 20.000, tal como al menos 25.000 plantas de cebada mutagenizadas.
La determinación de una mutación en el gen que codifica LOX-1 puede ser llevada a cabo mediante varios 35 procedimientos diferentes. Por ejemplo, el gen LOX-1 puede ser secuenciado completamente o parcialmente, y la secuencia comparada con la SEQ ID NO:1 de la WO 2005/087934 o con la SEQ ID NO:5 de la WO 2005/087934. Si se busca alguna mutación específica, puede aplicarse el análisis SNP. La persona experta en el arte será capaz de diseñar cebadores útiles para la detección de una mutación específica dada, tal como una que conduce a un codón de terminación prematuro en la secuencia codificadora para LOX-1 (por ej. cualquiera de los codones terminación 40 prematuro descritos precedentemente en la presente memoria descriptiva). Un ejemplo de cómo llevar a cabo un análisis SNP está descrita en el Ejemplo 10 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860), con cebadores que son útiles para detectar una mutación G→A en nucleótidos en posición 3474 del gen LOX-1.
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La determinación de una mutación en el gen que codifica LOX-2 puede ser llevada a cabo mediante varios procedimientos diferentes. Por ejemplo, el gen LOX-2 puede ser secuenciado completamente o parcialmente, y la secuencia comparada con la SEQ ID NO:1 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860). Si se busca una mutación específica, puede utilizarse el análisis SNP. La persona experta será capaz de diseñar cebadores útiles para la detección de una mutación específica dada, tal como una que 50 conduce a un codón de terminación prematuro en secuencia que codifica LOX-2 (por ej. cualquiera de los codones terminación prematuro descritos precedentemente en la presente memoria descriptiva). Un ejemplo de cómo llevar a cabo un análisis SNP está descrito en el Ejemplo 10 en la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860), como son los cebadores útiles para detectar una mutación G→A en la posición del nucleótido 2689 del gen para LOX-2. 55
Las etapas (viii) y (ix) del procedimiento de preparación de una planta de cebada doble LOX-nula, como se detalla precedentemente en esta sección, pueden ser llevadas cabo antes de las etapas (vi) y (vii), en cuyo caso el procedimiento comprenderá las etapas (i), (ii), (iii), (iv), (v), (viii), (ix), (vi), y (vii) en ese orden. En particular, este podría ser el caso cuando se busca una mutación específica, por ejemplo en plantas de progenie de plantas de 60
cebada ya identificadas como doble LOX-nula.
Preferentemente, la selección de plantas de cebada con pérdida total de MMT funcional comprende obtener una muestra a partir de una planta de cebada mutagenizada, preferentemente a partir de una planta de cebada mutagenizada germinante, aún más preferentemente a partir de una planta de cebada mutagenizada, que ha 5 germinado durante 4 días. Se prefiere que la muestra sea de un coleoptilo y/o una hoja primaria, preferentemente a partir de una hoja. Así, la muestra puede, por ejemplo, estar en el rango de 1 cm a 3 cm de tejido de hoja.
La muestra puede ser extraída y analizada siguiendo un protocolo multi-etapa novedosamente desarrollado, como se describe en la presente memoria descriptiva, que implica el uso sucesivo de diferentes solventes y materiales de 10 unión. En general, la muestra puede ser extraída, por ejemplo con un solvente o una mezcla de solventes, preferentemente agua y/o solventes orgánicos. El solvente orgánico puede, por ejemplo, ser un alcohol, preferentemente metanol –o el solvente orgánico puede por ejemplo ser un haluro de alquilo, preferentemente cloroformo. En una realización preferida, el solvente es una mezcla de agua, metanol y cloroformo. Dicha extracción puede ventajosamente ser llevada a cabo mientras se mezcla, por ejemplo, utilizando un agitador o un mezclador. 15 Puede agregarse un soporte sólido a la mezcla solvente/muestra –por ejemplo una cuenta, tal como una cuenta de vidrio.
En una realización preferida, la muestra de hoja precedentemente mencionada para determinación de actividad de MMT es tomada de granos generación Mx, donde x es un entero ≥2, preferentemente en el rango de 2 a 10, más 20 preferentemente en el rango de 3 a 8. En una realización muy preferida, el nivel de SMM es determinado en plantas germinadas M3, o en muestras de las mismas (tal como hojas). En dicha realización, se prefiere que granos de cebada mutagenizada de generación M0 sean hechos crecer para obtener plantas de cebada, que posteriormente son cruzadas para obtener granos de generación M1. El procedimiento es repetido hasta que están disponibles granos de generación M3 (ver FIG. 8). 25
La determinación del nivel SMM está preferentemente basada en el novedoso procedimiento descrito más adelante. De manera interesante, este procedimiento permite análisis de alto rendimiento, permitiendo identificar plantas de cebada caracterizadas por una pérdida total de MMT funcional.
30
En términos generales, el procedimiento preferentemente implica hacer reaccionar la muestra, o preferentemente un extracto de dicha muestra, preparada como se describe precedentemente, con un compuesto capaz de unirse a SMM. Se halló que el reactivo OPA (Sigma, no. cat. P7914; ver FIG. 2 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)), de aquí en adelante referido como OPA, es particularmente útil para determinar niveles de SMM. OPA reacciona, entre otros, con SMM para formar la molécula 35 referida como SMM-OPA (ver FIG. 2 de la solicitud internacional de patente PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)). La reacción preferentemente implica incubar OPA con un extracto de la muestra preparada como se describe precedentemente. Además, se prefiere agregar ácido 3-mercaptopropiónico a la mezcla de reacción. La mezcla es preferentemente mantenida en un pH alcalino, preferentemente en el rango de pH 8 a pH 11, más preferentemente en el rango de pH 9 a pH 11, aún más preferentemente en el rango de pH 9,5 a pH 10,5, tal 40 como a pH 10. La incubación es preferentemente llevada a cabo a una temperatura en el rango de 0ºC a 10ºC, preferentemente en el rango de 1ºC a 8ºC, aún más preferentemente en el rango de 2ºC a 6ºC, aún más preferentemente en el rango de 3ºC a 5ºC, tal como a 4ºC. El tiempo de incubación es preferentemente ≥10 min.
Con base en la observación de que SMM-OPA absorbe y emite luz de 340 nm y 450 nm, respectivamente, su 45 detección fue posible utilizando espectroscopia de fluorescencia. El proceso inicial de detección implica preferentemente la separación del extracto sobre una columna, preferentemente en una columna de 30 × 2 mm Gemini 3µ C18 (Phenomenex, no. cat. 00A-4439-80; Phenomenex, 2006), seguido por detección de fluorescencia utilizando un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento, preferentemente Cromatografía Líquida de Ultra Performance (sistema UPLC, Waters), diseñado para identificar y medir el nivel de fluorescencia de moléculas que 50 tienen excitación a 340 nm y emisión a 450 nm. Cuando se utiliza este procedimiento, “SMM no detectable” significa la ausencia de compuestos detectables que co-eluyen con SMM. En este contexto, un pequeño “hombro” en un pico del cromatograma es considerado un pico de artefacto. Un pequeño hombro en el lado derecho del pico Asn/Ser, ver FIG. 2, de manera concordante, no es considerado que represente un pico de SMM. Así, a modo de ejemplo, se considera que los dos cromatogramas superiores mostrados en la FIG. 2B ilustran “SMM no detectable”, mientras 55 que el cromatograma inferior en dicha figura representa la separación de una muestra que comprende SMM.
La detección de SMM puede ser realizada preferentemente como se describe en el Ejemplo 2 o Ejemplo 4. Un procedimiento preferido para seleccionar plantas de cebada de acuerdo con la invención se describe más adelante en el Ejemplo 2. El tejido para análisis es preferentemente tomado como muestra a partir de una planta de cebada 60
germinante, aún más preferentemente de una planta de cebada, que ha germinado durante 4 días. Debe notarse que el procedimiento de análisis precedentemente mencionado es particularmente útil. Antes que nada, el procedimiento analítico es novedoso. Adicionalmente, es una ventaja significativa del procedimiento precedente que es establecido para la determinación de niveles de SMM en plantas de cebada germinante, tal como hojas de plantas de cebada germinante. El tiempo de muestreo a partir de la cebada germinante hace una preparación 5 inesperadamente limpia para la detección con base en UPLC de SMM. Otras muestra, por ejemplo, muestras de mosto de granos similares como se describe precedentemente son demasiado complejas en composición, y generalmente no pueden ser utilizadas en el procedimiento de cromatografía mencionado para la determinación de niveles de SMM.
10
Posterior a la identificación de una planta de cebada que tiene menos de 10 ppb de SMM, preferentemente SMM no detectable, el correspondiente gen MMT, o parte del mismo, es típicamente secuenciado para determinar si la planta de cebada en cuestión puede ser clasificada como teniendo una mutación en el gen MMT. Entonces se seleccionan las plantas de cebada caracterizadas por tener SMM no detectable, y donde una o más bases del gen que codifica MMT son diferentes cuando se compara con la secuencia de tipo salvaje. En este contexto, la secuencia de tipo 15 salvaje es preferentemente la secuencia hallada en el correspondiente cultivar de cebada tipo salvaje, preferentemente la secuencia dada como SEQ ID NO:3 en la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288). Las mutaciones preferidas se describen precedentemente en la presente memoria descriptiva.
20
Las mutantes de cebada seleccionadas pueden ser adicionalmente propagadas, y plantas de las generaciones posteriores ser re-analizadas en cuanto a contenido de SMM. Después de selección de las plantas de cebada útiles, estas pueden ser incluidas en programas de mejoramiento que utilizan aquellos procedimientos convencionales que se describen en la presente memoria descriptiva más adelante, en la sección "Mejoramiento de plantas”
25
Una vez que se ha identificado una planta de cebada doble LOX nula-MMT nula, que contiene una mutación particular en el gen LOX-1 y una mutación particular en el gen LOX-2 y una mutación particular en el gen MMT (tal como cualquiera de las mutaciones mencionadas precedentemente), pueden generarse plantas de cebada adicionales con mutaciones idénticas generadas mediante procedimientos de mejoramiento vegetal convencionales, tales como aquellos bien conocidos para la persona experta en el arte. Por ejemplo, dicha planta de cebada doble-30 LOX nula puede ser retrocruzada con orto cultivar de cebada.
Posteriormente a la selección de plantas de cebada útiles con pérdida total de LOX-1, LOX-2 y MMT funcionales, pueden opcionalmente llevarse a cabo uno o más análisis adicionales. Por ejemplo, mutantes seleccionadas pueden ser adicionalmente propagadas, y plantas de nuevas generaciones pueden ser ensayadas en cuanto a la pérdida 35 total de LOX-1, LOX-2 y MMT funcionales.
En una realización, se prefiere que la planta de cebada doble LOX nula-MMT nula de acuerdo con la presente invención tenga una fisiología de crecimiento de la planta y desarrollo de grano similares a la de la cebada de tipo salvaje. En consecuencia se prefiere que la planta de cebada doble- LOX-1-nula-MMT-nula sea similar a la cebada 40 de tipo salvaje (preferentemente al cv. Power o cv. Quench o cv. Rosalina) con respecto a la altura de la planta, número de vástagos por planta, comienzo de la floración y/o números de granos por espiga.
Además, se prefiere que la planta de cebada doble LOX nula-MMT nula de acuerdo con la presente invención sea similar a la cebada de tipo salvaje, en particular similar al cv. Power o cv Quench con respecto a la altura de la 45 planta, fecha de espigamiento, resistencia a enfermedades, encamado, rotura de espigas, tiempo de maduración, y rendimiento. En el presente contexto debe entenderse “similar” como lo mismo ±10% en caso de números. Estos parámetros pueden ser determinados como se describe en la presente memoria descriptiva en el Ejemplo 5.
En una realización muy preferida, la planta de cebada es preparada cruzando la cebada Línea A689 (ATCC 50 Designación Depósito Patente: PTA-9640), con la cebada Línea 8063 (ATCC Designación Depósito Patente: PTA-9543) y opcionalmente seguido por mejoramiento vegetal adicional.
Se depositaron semillas de cebada Línea A689 el 4 de diciembre de 2008 bajo el nombre “Barley, Hordeum vulgare L.; Line A689” en la American Type Culture Collection (ATCC), Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, 55 VA 20110, EE.UU. (número de depósito PTA-9640).
Se depositaron semillas de cebada Línea 8063 el 13 de octubre de 2008 en la American Type Culture Collection (ATCC), Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, EE.UU. y se denominaron “Barley, Hordeum vulgare; Line 8063” (ATCC Designación Depósito Patente: PTA-9543). 60
Mutagenia química
Con el fin de generar plantas de cebada con doble LOX nula-MMT nula de acuerdo con la presente invención, se prepara un muy gran número de mutantes de cebada – típicamente en múltiples rondas – mediante cualquier 5 procedimiento de mutagenia adecuado, por ejemplo mediante el uso de mutagenia química de granos de cebada. Este procedimiento es conocido porque introduce mutaciones al azar. La mutagenia de cebada puede ser llevada a cabo utilizando cualquier agente químico mutagenizante. Sin embargo, este es preferentemente llevado a cabo tratando a los granos con NaN3, dejando que los granos que sobreviven germinen, seguido del análisis de las plantas descendientes. La generación de plantas que crecen a partir de los granos mutagenizados, referidos como 10 M0, contiene quimeras heterocigota para cualquier mutación dada. Las plantas de la progenie recolectadas después de la auto-polinización son referidas como la generación M1, en la cual una dada mutación se segrega dentro de los correspondientes heterocigotas y homocigotas (ver FIG. 8).
El tratamiento de los granos con NaN3 no es equivalente a tratar una única célula, porque los granos después del 15 tratamiento contendrán algo de células no mutantes y una variedad de células que tienen mutaciones en el ADN. Dado que las mutaciones en las líneas celulares que no conducen a la línea germinal serán perdidas, el objetivo es dirigir el mutágeno a las pocas células que se desarrollan como tejidos reproductivos que contribuyen al desarrollo de la generación M1.
20
Para evaluar la eficiencia de la mutación global, las quimeras albinas y plantas albinas pueden ser contadas en las generaciones M0 y M1. Registrar el número de mutantes como una función de las plantas que sobreviven brinda un estimado de la eficiencia de mutación, mientras que registrar el número de mutantes como una función de las semillas tratadas mide la combinación de, tanto eficiencia de mutación como muerte del grano.
25
Es sorprendente que las células tengan mecanismos de aseguramiento de la calidad virtualmente cada etapa de la expresión de genes, posiblemente para moderar los efectos de mutaciones dañinas. Un ejemplo bien estudiado en eucariotas es la degradación mediada sin sentido del ARNm, indicada como NMD, la cual evita la síntesis de proteínas prematuramente truncadas, potencialmente perjudiciales (Maquat and Carmichael, 2001; Wu y col., 2007). En la NMD, un codón de terminación es identificado como prematuro por su posición relativa a elementos des-30 estabilizantes corriente abajo. Las mutaciones que generan codones de terminación prematura (sin sentido) codones (PTCs) a veces incrementan los niveles de transcriptos alternativamente cortados y con splicing que se escapan de las mutaciones culpables, salvando así potencialmente la función de la proteína (Mendell y Dietz, 2001).
Mejoramiento vegetal 35
En una realización, el objeto es proporcionar plantas de cebada útiles agronómicamente que comprenden el rasgo doble-LOX nula-MMT-nula. El desarrollo de cultivos es a menudo un proceso prolongado y dificultoso que comienza con la introducción del nuevo rasgo. Desde una perspectiva de un mejorador vegetal, sin embargo, esta etapa casi siempre produce una planta que tiene un perfil global menos deseable de rasgos agronómicos que las variedades 40 comerciales actuales.
Además del rasgo doble-LOX nula-MMT nula, existen factores adicionales que también pueden ser considerados en el arte de generar una variedad comercial de cebada útil para malteado y/o elaboración y/o como base para bebidas, por ejemplo rendimiento y tamaño de grano, y otros parámetros que se refieren al desempeño de malteado o 45 desempeño de elaboración. Dado que muchos − si no todos − los rasgos relevantes han mostrado estar bajo control genético, la presente descripción también proporciona cultivares modernos, homocigotos, con elevado rendimiento de malteado, los cuales pueden ser preparados a partir de cruzamientos con plantas de cebada con rasgo doble-LOX nula-MMT nula que están desveladas en la presente solicitud. El mejorador de cebada experto será capaz de seleccionar y desarrollar plantas de cebada, las cuales − siguiendo los cruzamientos cebada con doble-LOX-nula 50 cebada con MMT-nula − resultarán en cultivares superiores. Alternativamente, el mejorador de cebada puede utilizar plantas de la presente invención para mutagenia adicional para generar nuevos cultivares derivados de cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula.
Un procedimiento para asegurar que el rasgo doble-LOX-nula-MMT-nula sea mantenido en las líneas de progenie 55 trata sobre el análisis SNP del gen de LOX-1, el gen de LOX-2 y el gen de MMT. Preferentemente, las actividades de LOX-1, LOX-2 y MMT también son determinadas.
Las plantas de cebada de acuerdo con la presente invención pueden ser introducidas en cualquier esquema de
mejoramiento vegetal adecuado.
Otro objeto es proporcionar plantas de cebada de elite agronómica que comprenden el rasgo doble-LOX-nula-MMT-nula. En consecuencia, esta descripción también está dirigida a procedimientos para producir una nueva planta de cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula mediante cruzamiento de una primera planta de cebada parental con una 5 segunda planta de cebada, donde la primera o segunda planta es una cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula. Adicionalmente, las plantas de cebada parentales primera y segunda pueden venir de una variedad de cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula. Por lo tanto, cualesquiera de dichos procedimientos que utilizan la variedad de cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula son parte de esta descripción: autopolinización, retrocruzamiento, cruzamiento con poblaciones, y similares. Todas las plantas producidas utilizando una variedad de cebada con doble-LOX-nula-MMT- 10 nula como parental están dentro del alcance de esta invención, incluyendo aquellas plantas desarrolladas a partir de variedades derivadas a partir de una variedad de cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula. La cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula puede también ser utilizada para transformación genética en casos tales donde ADN exógeno es introducido y expresado en la planta o tejido vegetal con doble-LOX-nula-MMT-nula.
15
Los procedimientos de retrocruzamiento pueden ser utilizados con la presente invención para introducir dentro de otro cultivar el rasgo doble-LOX-nula-MMT-nula de una planta de cebada mutada, por ejemplo del cv. Scarlett, o cv. Jersey, o cv. Quench, o cv. Rosalina, los cuales son cultivares de cebada, contemporáneos, de malteado de elevado rendimiento. En un protocolo de retrocruzamiento estándar, la variedad original de interés, i.e. la planta parental recurrente, es cruzada con una segunda variedad (planta parental no-recurrente), que lleva los genes LOX mutantes 20 de interés a ser transferidos. Las plantas de la progenie resultante con doble-LOX-nula a partir de este cruzamiento son posteriormente cruzadas con la planta parental recurrente, siendo el proceso repetido hasta que una planta de cebada es obtenida donde esencialmente todas las características especificadas por el parental recurrente son recuperadas en la planta generada − además del rasgo doble-LOX-nula-MMT-nula de la planta parental no recurrente. Finalmente, la última planta generada, retrocruzada es autopolinizada para rendir una planta de progenie 25 de mejoramiento vegetal con doble-LOX-nula-MMT-nula pura.
Una forma de acelerar el proceso de mejoramiento vegetal comprende la multiplicación inicial de mutantes generadas mediante aplicación de cultivo de tejidos y técnicas de regeneración. Por lo tanto, otro aspecto de la presente descripción es proporcionar células, las cuales al crecer y diferenciarse producen plantas de cebada que 30 tienen el rasgo doble-LOX-nula-MMT-nula. Por ejemplo, el mejoramiento puede incluir cruzamientos tradicionales, preparación de plantas derivadas de anteras fértiles o utilización de cultivos de microesporas.
Productos de la ruta de LOX
35
En diversas realizaciones, la presente descripción se refiere a plantas de cebada, y productos de las mismas, que comprenden bajos niveles de T2N y de T2N potencial. Las enzimas LOX catalizan la dioxigenación de ácidos grasos poliinsaturados con un sistema cis-1,cis-4 pentadieno. En cebada, los ácidos grasos poliinsaturados de C18 ácido linoleico (18:2∆9,12 ) y ácido α-linolénico (18:3∆9,12,15) son los sustratos principales de LOX. La ruta de la lipooxigenasa del metabolismo de ácido graso es iniciada mediante la adición de oxígeno molecular en la posición C-9 40 (mayormente catalizada por LOX-1) o en la posición C-13 (mayormente catalizada por LOX-2) de la cadena de acilo, rindiendo los correspondientes ácidos 9- y 13-HPODEs [9- y 13-hidroperoxi octadecatrienoicos (HPOTEs) son productos cuando el sustrato es acido α-linolénico, pero los HPOTEs no funcionan como precursores para T2N]. En la rama de la hidroperóxido liasa de la ruta de LOX, tanto los 9- como los 13-HPODEs pueden ser escindidos a oxoácidos y aldehídos de cadena corta (ver FIG. 1A). En particular, 9- HPODE puede ser escindido para formar cis-45 nonenal que es convertido a T2N, mientras que 13-HPODE es el precursor de 2-E-hexenal. Por lo tanto, el 13-HPODE, el producto principal de la dioxigenación catalizada por LOX-2 de ácido linoleico no fue anticipada como un componente corriente arriba en la ruta que conduce a la formación del sabor rancio de T2N.
Es reconocido que la presente descripción abarca la producción influyente de metabolitos corriente abajo de la 50 catálisis de LOX-1 y LOX-2, los cuales no son producidos como un producto directo de una reacción catalizada por LOX-1 o LOX-2, sino como resultado de una serie posterior de reacciones. Estas incluyen isomerizaciones y conversiones espontáneas, inducidas por factores, o catalizadas por enzimas. Por lo tanto, la producción de estos metabolitos corriente abajo podría ser influenciada mediante modulación de la expresión de otros componentes de la ruta, por ejemplo hidroperóxido liasa (HPL). 55
T2N y DMS y precursores de los mismos
La presente invención se refiere a procedimientos para preparar bebidas con bajos niveles de uno o más sabores indeseables y precursores de los mismos. Preferentemente, dichos sabores indeseables son de T2N y DMS y dichos 60
precursores de los mismos son el T2N potencial y DMSP, respectivamente.
Un objeto de la presente invención es por lo tanto reducir o eliminar el T2N potencial. Por lo tanto, es un objeto de la presente invención reducir la formación de precursores de T2N y aductos de aldehído. A pesar de que varias reacciones químicas relacionadas con el enranciamiento de la cerveza permanecen difíciles de elucidar, la 5 generación de T2N libre a partir del T2N potencial es reconocida como una causa principal del desarrollo de sabor rancio en productos de cerveza (Kuroda y col., supra). Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar bebidas con bajo nivel de T2N potencial, así como también bebidas con bajo nivel de precursores de T2N.
10
La mayor parte del T2N potencial es transferido desde el mosto a la cerveza terminada, en la cual el T2N libre puede ser liberado (Liégeois y col., 2002), siendo las condiciones de acidez y temperatura factores importantes en este proceso. Con referencia a la presente invención, el T2N potencial esta definido como se describe anteriormente en la presente memoria descriptiva en las definiciones. Otros procedimientos para determinar el nivel del T2N potencial también están disponibles. Con el fin de evitar confusión, el significado de "T2N potencial" en el presente contexto es 15 tal como se describe en la presente memoria descriptiva anteriormente en las definiciones. Las sustancias químicas que tienen la capacidad de liberar T2N o de ser convertidas en T2N son denominadas "precursores de T2N " en la presente memoria descriptiva, y los precursores de T2N determinados o medidos mediante procedimientos alternativos distintos del procedimiento para determinar el T2N potencial son referidos como "precursores de T2N". Los precursores de T2N pueden en particular ser determinados mediante primer tratamiento de una muestra de 20 forma tal que esencialmente todas (preferentemente todas) sus sustancias químicas, que tienen la capacidad de liberar T2N o de ser convertidas en T2N, de hecho liberen T2N y/o se conviertan en T2N, respectivamente. De allí en adelante, se determina el nivel de T2N.
Los granos de cebada de la presente invención no comprenden actividades de LOX-1 y LOX-2 además de no tener 25 actividad de MMT. Interesantemente, dichos granos de cebada contienen muy poco T2N potencial.
Las cervezas producidas utilizando granos de cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula poseerán por lo tanto no solo un muy bajo nivel de T2N, sino también un muy bajo nivel de T2N potencial. Dentro del alcance de la presente descripción están los granos de cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula, los cuales rinden productos de cerveza que 30 contienen muy bajos niveles de T2N potencial, preferentemente menos de 60%, más preferentemente menos de 50% del nivel del T2N potencial de un producto de cerveza similar producido en la misma forma a partir de cerveza de tipo salvaje (preferentemente del cv. Power).
Asimismo, se prefiere que los productos vegetales derivados de granos de cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula 35 posean un muy bajo nivel de precursores de T2N. Dentro del alcance de la presente invención hay productos vegetales preparados a partir de granos de cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula, conteniendo dichos productos vegetales menos de 60%, más preferentemente menos de 50% de precursores de T2N de un producto vegetal similar producido de la misma forma a partir de cebada tipo salvaje (preferentemente del cv. Power).
40
Es sorprendente que los valores de T2N medidos sean a menudo superiores en muestras de, y en productos a partir de, una materia prima micro-malteada, que aquellos a partir de una materia prima producida en mayor escala, por ejemplo, a partir de una muestra grande malteada a escala piloto de 30-kg. Sin embargo, los valores relativos, experimentales de T2N entre experimentos a gran y a pequeña escala son en general similares.
45
Similarmente, es sorprendente que los T2N potenciales y los precursores de T2N medidos, a menudo sean superiores en muestras de, y en productos a partir de, una materia prima micro-malteada, que aquellos a partir de una materia prima producida en mayor escala, por ejemplo a partir de una muestra grande malteada a escala piloto de 30-kg. Sin embargo, los valores relativos, experimentales de T2N potenciales entre experimentos a gran y a pequeña escala son en general similares. 50
Es también un objeto de la presente invención reducir o eliminar el DMS y el DMSP, donde el DMSP es preferentemente SMM.
La cantidad de SMM y de DMS en un producto vegetal puede ser determinada mediante cualquier procedimiento 55 adecuado. El SMM puede ser determinado como se describe en la presente memoria descriptiva anteriormente en la sección "Preparación de plantas de cebada con doble-LOX-nula-MMT-nula", donde se describe la determinación de niveles de SMM en una muestra de cebada. Por lo tanto, el SMM puede ser determinado mediante acoplamiento del mismo a un compuesto, tal como OPA, y determinando fluorescencia, por ejemplo, utilizando un sistema UPLC. Para una medición cuantitativa, se puede determinar el área del cromatograma que corresponde a un pico de SMM. 60
Para una medida más precisa, las cantidades de DMS y DMSP (tal como SMM), el último compuesto medido como DMS después de la activación, son preferentemente determinadas utilizando cromatografía gaseosa por capilaridad de alta resolución. El DMS total en muestras de mosto o cerveza esta definido en la presente memoria descriptiva como la suma cuantitativa de DMS libre y sus formas precursoras, denominadas DMSP. Utilizando esta definición, la 5 cantidad de DMSP en una muestra de mosto o cerveza puede ser determinada como la diferencia entre el DMS total (medido en la muestra hervida, preferentemente en una muestra hervida en condiciones alcalinas durante 1 h), y DMS libre (medido en una muestra no hervida). El ejemplo 4 detalla modos preferibles para medir los niveles de DMS total y libre.
10
La cantidad de DMSP y también de SMM en la presente memoria descriptiva esta dada como la concentración de DMS que puede ser liberado a partir de dicho DMSP o dicho SMM hirviendo en condiciones alcalinas durante 1 h.
EJEMPLOS
15
Los ejemplos de la presente ilustran la invención y no deberán ser considerados como limitantes para la invención.
A menos que sea indicado de otro modo, las técnicas biológicas moleculares básicas fueron llevadas a cabo para manipular ácidos nucleicos y bacterias tal como se describe en Sambrook y Russel (2001).
20
Ejemplo 1
Relevamiento de la baja actividad de LOX-2 en embriones de cebada germinantes
Material de relevamiento mejorado. Los granos recolectados a partir de plantas de cebada de la línea con LOX-1-25 nula Ca211901 − generada mediante los cruzamientos (mutante D112 con LOX-1-nula × Jersey) × Sebastian − fueron incubados con el mutágeno NaN3 de acuerdo con los detalles provistos por Kleinhofs y col. (1978). La mutante de cebada D112 con LOX-1-nula está descrita en WO 2005/087934 y depositada en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110, USA el 11 de Septiembre de 2003, bajo el número PTA-5487. 30
El procedimiento fue elegido dado que es conocido que induce mutaciones en el ADN genómico de la cebada, confiriendo finalmente sustituciones o truncaciones de residuos de aminoácidos en proteínas codificadas por el ADN mutagenizado. En los experimentos de mutagenia de la presente solicitud, se eligió propagar granos mutados de generación M1 en parcelas de campo a través de dos generaciones posteriors, rindiendo eventualmente una 35 elevada proporción de plantas homocigotas para fines de relevamiento (ver FIG. 8). Mientras que los granos de la generación M2 no fueron relevados, principalmente porque se esperaba que éstos contuvieran una relativamente elevada proporción de mutaciones puntuales heterocigotas, los granos mutantes de la generación M3 fueron utilizados como material para relevamiento, esperando 0,9−2,3 mutaciones cada 10000 granos (Kleinhofs y col., supra). 40
Sorprendentemente, los inventores de la presente encontraron que el análisis de los embriones germinantes proveía resultados de ensayo muy mejorados en comparación con los análisis de extractos de embriones maduros (tal como se describe en el Ejemplo 1 de la solicitud internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860)). Un procedimiento de relevamiento de elevado rendimiento fue por lo tanto establecido para medir la actividad de 45 LOX-2 en los embriones germinantes, incluyendo su tejido de escutelo.
Se aislaron dos embriones a partir de granos maduros de 35125 espigas de cebada (20977 líneas de generación M4 de la mutante D112 con LOX-1-nula, y 14148 líneas de generación M3 de la línea Ca211901 con LOX-1-nula), y se transfirieron a placas para almacenamiento de 96 pocillos (ABgene). La germinación de los embriones fue iniciada 50 siguiendo a la adición de 20 µl de agua a cada pocillo, el cual fue cubierto con un papel tissue Kimnett húmedo y una tapa plástica. Las placas fueron incubadas en bolsas de plástico a 20ºC durante 48 h. Después de la incubación, se extrajo la enzima LOX-2; se agregó primero a cada pocillo una perla de vidrio de 5 mm y 200 l de buffer para extracción (solución de ácido láctico 100 mM, pH 4,5), seguido de molienda durante 35 seg a una frecuencia de 27 seg-1 en un molino de laboratorio MM 300 (Retsch). Posteriormente, la placa fue centrifugada a 4000 rpm durante 10 55 min a 4ºC en una centrífuga Allegra 6R (Beckman-Coulter), para precipitar el material insoluble. La actividad de LOX-2 fue determinada básicamente como se describe para el análisis de la actividad de LOX-2 de extractos de embriones maduros (ver Ejemplo 1 en la solicitud internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860)), difiriendo solamente en el uso de solamente 30 µl de extracto por ensayo, en lugar de 40 µl.
60
Identificación de mutantes potenciales. Como se describe anteriormente, dos granos de cada una de las 35125 líneas de cebada mencionadas anteriormente, fueron analizadas en cuanto a actividad de LOX-2, con el objeto de identificar granos altamente reducidos en dicha actividad cuando son comparados con los granos con LOX-1-nula y de tipo salvaje. Se identificaron un total de 7 mutantes potenciales de partida en la generación M3 de la línea Ca211901. Estas fueron adicionalmente propagadas en el invernadero, cosechadas, y después relevadas 5 nuevamente en busca del rasgo relacionado con muy baja actividad de LOX. Finalmente, solamente una mutante de la línea Ca211901, denominada mutante A689, demostró no exhibir esencialmente actividad de LOX-2. Mediciones detalladas de la actividad total de LOX fueron llevadas a cabo con extractos de embriones germinados en los cuales la actividad de LOX era conferida casi exclusivamente por LOX-2 (Schmitt y van Mechelen, 1997). Para embriones germinados de granos M3 de la mutante A689, la actividad total de LOX − tal como se determina mediante el ensayo 10 colorimétrico de LOX − fue de 0,163 ± 5,5% U A595/embrión germinado, mientras que para la variedad madre Ca211901 con LOX-1-nula fue de 1,224 ± 3,8% U A595/embrión germinado (el valor correspondiente para la mutante de partida D112 con LOX-1-nula fue de 1,215 ± 6,0% U A595 /embrión germinado). Las semillas de la línea de cebada A689 han sido depositadas el 4 de Diciembre de 2008 con el nombre "Barley, Hordeum vulgare L.; Línea A689" en la American Type Culture Collection (ATCC), Depositario para Patentes, 10801 University Blvd., 15 Manassas, VA 20110, United States (número de depósito PTA-9640).
Se describe un análisis para HPODE en la mutante A689 en el Ejemplo 4 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860), véase más adelante.
20
Las propiedades de la mutante A689 están descritas en el Ejemplo 5 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860).
La secuenciación del gen para LOX-2 en la mutante de cebada A689 se describe en el Ejemplo 10 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860) y la Tabla 7 de la misma resume las 25 mutaciones en los genes de LOX-1 y LOX-2 de la mutante A689.
Un procedimiento para detectar la mutante A689 con doble-LOX-nula se describe en el Ejemplo 11 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860). El procedimiento es un procedimiento basado en SNP para detectar la mutación en LOX-1 y la mutación en LOX- 2. 30
Ejemplo 2
Relevamiento para mutantes de cebada con MMT-nula
35
Los granos recolectados a partir de plantas de cebada del cv. Prestige y cv. Sebastian fueron incubados separadamente con el mutágeno NaN3, siguiendo los detalles experimentales provistos por Kleinhofs y col. (1978). Este procedimiento fue elegido debido a su conocido potencial para inducir mutaciones puntuales en el ADN genómico de la cebada.
40
En los experimentos, los granos mutados de la generación M1 fueron propagados en parcelas de campo a través de dos generaciones posteriors, rindiendo finalmente una elevada proporción de plantas homocigotas de generación M3 para fines de relevamiento. Se esperaba que los granos mutados de la generación M3 contuvieran mutaciones de gen con una frecuencia de 0,9−2,3 cada 10000 granos (Kleinhofs y col., supra). Es sorprendente que los granos M2 no fueron relevados. 45
Interesantemente, la presente descripción describe un procedimiento de relevamiento rápido de elevado rendimiento para la detección de granos de cebada mutantes M3 que carezcan de actividad de MMT, proveyendo falta de síntesis de SMM detectable durante el malteado. Así, los inventores encontraron que el SMM se acumulaba principalmente en el coleóptido y la hoja primaria de la cebada germinante, y que la detección de SMM puede ser 50 llevada a cabo mediante extracción de aminoácidos a partir de tejido foliar aplastado de granos germinados de 4 días de edad, seguido de reacción de los aminoácidos extraídos con OPA para formar productos altamente fluorescentes (ver FIG. 2).
En términos prácticos, cada ensayo fue llevado a cabo mediante germinación − en una bolsa de plástico cerrada con 55 una porción de papel de filtro Whatman #1 (296 × 20,9 mm) − de dos granos de cada una de las 94 mutantes potenciales y dos plantas de tipo salvaje. El ensayo fue repetido para granos múltiples, mutantes potenciales (ver a continuación). Al comienzo de la germinación, se agregaron 25 ml de agua de red a dicha caja plástica, seguido de 15 ml adicionales de agua de red a los 2 días de la germinación. Después de 4 días de germinación, se transfirieron
1−3 cm de tejidos foliares a placas para almacenamiento (ABgene), en las cuales cada uno de los 96 pocillos de 1,2-ml contenía una perla de vidrio de 5 mm de diámetro y 500 µl de una mezcla 12:5:6 (v/v/v) de agua:metanol:cloroformo. La placa fue después agitada durante 45 seg a una frecuencia de 30 Hz en un molino de laboratorio MM 300 (Retsch). Posteriormente, la placa fue transferida a una centrífuga (Rotanta 460R, Hettich), y girada a 4000 rpm durante 15 min a temperatura ambiente para precipitar el material insoluble. Se transfirieron 10 µL 5 del sobrenadante a una placa para almacenamiento de 96 pocillos (Waters, cat no. 186002481), y se mezclaron con 200 µl de H2O y 60 µl de una solución de reacción que contiene una mezcla 15000:45 (v/v) de reactivo OPA (Sigma, cat.no. P7914):ácido 3-mercaptopropiónico (Aldrich, cat.no. M5801). La mezcla fue incubada a 4ºC durante al menos 10 min para obtener una derivatización cuantitativa de aminoácidos de la muestra con OPA. Utilizando un sistema UPLC basado en Waters equipado con un detector de fluorescencia, se separaron 2 µl de la mezcla derivatizada 10 sobre una columna de C18 Gemini de 2,1 × 30 mm de partículas de 3 µm (Phenomenex, cat.no. 00A-4439-80), utilizando elución por gradiente mezclando fase móvil A (un buffer NaH2PO4 40-mM, ajustado a pH 7,8) y fase móvil B [una solución 45:45:10 (v:v:v) de acetonitrilo:metanol:agua tal como se describe (Phenomenex, 2006). La excitación de los derivados de OPA eluídos fue a 340 nm, mientras que la emisión de luz fue medida a 450 nm. Un ejemplo de un cromatograma se muestra en la FIG. 2 para ilustrar el perfil de elución de ácido aspártico (Asp), ácido 15 glutámico (Glu), asparagina (Asn), serina (Ser) y SMM. El último compuesto fue incluido, dado que el objetivo global del proyecto fue identificar una planta de cebada que careciera de la capacidad de sintetizar SMM, es decir una planta para la cual el correspondiente pico de cromatograma fue muy pequeño o preferentemente ausente.
Un total de 10248 y 3858 granos de cebada del cv. Prestige y del cv. Sebastian, respectivamente, mutados con 20 NaN3 fueron relevados en cuanto a contenido de SMM, con el objeto de identificar aquellos altamente reducidos en dicho contenido cuando se los comparaba con los granos de tipo salvaje. Solamente 2 mutantes potenciales de la generación M3 fueron identificados, a saber, granos de la muestra no. 8063 (derivados a partir del cv. Prestige, y, de aquí en adelante, denominado Mutante 8063, una designación también utilizada para granos de generaciones posteriors), y granos de la muestra no. 14018 (derivados a partir del cv. Sebastian, y, de aquí en adelante, 25 denominado Mutante 14018, una designación también utilizada para granos de generaciones posteriors). Los granos de cada una de las mutantes fueron propagados a la generación M4, después cosechados, y finalmente re-analizados. El resultado verificó que los granos de la Mutante 8063 y de la Mutante 14018 tenían contenidos de SMM extremadamente bajos, posiblemente carecieran totalmente de SMM.
30
El análisis de Western blot ha verificado que la Mutante 8063 y la Mutante 14018 carecían de la enzima MMT (ver Ejemplo 3 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)).
Asimismo, las mediciones de actividad de MMT han verificado que la Mutante 8063 carece de actividad de MMT (ver Ejemplo 4 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)). 35
La secuenciación del gen para MMT en la mutante de cebada 8063 como se describe en el Ejemplo 9 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288) reveló una transición de bases G→A en la primera base del intrón 5 (nucleótido no. 3076 de la SEQ ID NO:8 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)). La secuenciación del gen para MMT en la mutante de 40 cebada 14018 como se describe en el Ejemplo 14 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288) reveló una transición de bases G→A en un sitio de splicing inmediatamente corriente abajo del exón 2 en la primera base del intrón 2, más específicamente en el nucleótido no. 1462.
Se ha confirmado adicionalmente que el ARNm de MMT está truncado en la mutante 8063 (ver Ejemplo 11 de la 45 solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)) y que la proteína MMT mutante codificada por dicho ARNm truncado no tiene actividad de MMT (ver Ejemplo 12 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)). También se ha confirmado que el ARNm de MMT está truncado en la mutante 14018 (ver Ejemplo 15 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)) y que la proteína MMT mutante codificada por dicho 50 ARNm truncado no tiene actividad de MMT (ver Ejemplo 16 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)).
Un procedimiento para detectar la presencia de la mutación en el gen de MMT de la mutante 8063 se describe en el Ejemplo 11 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288), y un 55 procedimiento para detectar la presencia de la mutación en el gen de MMT de la mutante 14018 se describe en el Ejemplo 17 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288).
Ejemplo 3
Cruzamientos de cebada
La FIG. 3 resume cómo la línea de cebada con doble-LOX nula-MMT nula de la presente invención fue desarrollada mediante primero cruzamiento de la línea de cebada A689 [doble LOX-nula ver solicitud de patente PCT no 5 PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860)] con la línea 8063 [MMT-nula ver Solicitud de Patente PCT No. PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288)]. Utilizando técnicas de mejoramiento estándar, las líneas doble haploides fueron desarrolladas, y propagandas en el invernadero. De éstas, las líneas con mejor desempeño con respecto al desempeño agronómico − así como también una ausencia de actividad de LOX-1 (ver Ejemplo 2 en la Patente de EE.UU. No. 7.420.105 de Breddam, K. y col.), una ausencia de actividad de LOX-2 (ver 10 Ejemplo 2 en la Solicitud PCT No. PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860), y Ejemplo 1 de la presente), así como también una ausencia de SMM y de actividad de MMT (Ejemplos 2 y 4 (véase más adelante) en la Solicitud PCT No. PCT/DK2009/050315 ((publicada como WO 2010/063288), y Ejemplo 2 de la presente) − fueron seleccionadas para propagación y análisis adicional. Estas líneas son denominadas en la presente memoria descriptiva “Triple-Nula”. En general para determinaciones de actividad de LOX, las semillas de líneas doble 15 haploides fueron cosechadas y seguidas de análisis de 12 granos para cada línea y variedades control, brindando una desviación estándar <5% para las mediciones (FIG. 4).
Ejemplo 4
20
Determinación de los niveles de SMM
Se llevó a cabo la medición de SMM esencialmente como se describe en la Solicitud PCT PCT/DK2009/050315 (publicada como WO 2010/063288). Primero, se extrajo el SMM a partir de secciones de hojas de cebada de 1-3−cm de largo que fueron ubicadas en pocillos de 1,2-ml de placas de microtítulo, en las cuales cada pocillo contenía una 25 perla de vidrio de 5 mm de diámetro y 500 µl de una mezcla 12:5:6 (v/v/v) de agua:metanol:cloroformo. La placa fue después incubada durante 45 seg en un molino de laboratorio MM 300 (Retsch), electrónicamente ajustado para agitar a una frecuencia de 30 Hz. Después de la centrifugación, se transfirieron 10 µl del sobrenadante a una placa para almacenamiento de 96 pocillos (Waters, cat no. 186002481), y se mezcló con 200 µl de agua y 60 µl de una solución de reacción que contiene una mezcla 15000:45 (v/v) de reactivo OPA (Sigma, cat. No. P7914):3-ácido 30 mercaptopropiónico (Aldrich, cat. No. M5801). La mezcla fue incubada a 4ºC durante al menos 10 min para derivatizar cuantitativamente aminoácidos de la muestra con OPA. Utilizando un sistema UPLC (Waters) equipado con un fluorómetro, se separaron 2 µl de la mezcla derivatizada en una columna C18 Gemini de 2,1 × 30 mm de partículas de 3 µm (Phenomenex, cat. No. 00A-4439-80), utilizando un buffer fosfato de Na 40 mM, ajustado a pH 7,8, y conteniendo una solución 45:45:10 (v:v:v) de acetonitrilo:metanol:agua como la fase móvil (Phenomenex 35 2006). La excitación de los derivados de OPA fue a 340 nm, mientras que la emisión de luz fue medida a 450 nm. Un ejemplo de un cromatograma se muestra en la FIG. 5 para ilustrar el perfil de elución de ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), asparagina (Asn), serina (Ser) y SMM a partir del tipo salvaje y la mutante Triple-Nula. Se observó una sorprendente falta de capacidad para sintetizar SMM para la mutante Triple-Nula.
40
Ejemplo 5
Desempeño agronómico
Los cultivares comerciales de cebada Quench y Power, así como también las plantas LOX-1-nula, MMT-nula, LOX-1 45 nula-LOX-2 nula (doble-LOX-nula), LOX-1 nula-MMT nula y Triple-Nula, fueron evaluadas en ensayos a campo para comparar sus desempeños agronómicos. Los datos fueron regularmente obtenidos para altura de la planta, fecha de espigado, resistencia a enfermedad, encamado, tiempo de maduración y rendimiento (ver Tabla 1).
Los ensayos fueron llevados a cabo de acuerdo con procedimientos estándar para ensayos a campo. En 50 consecuencia, cantidades iguales de granos de variedades comerciales y las líneas mutantes fueron sembradas en macetas de 7,88 m2 en 2 ubicaciones, cada una comprendiendo 3 replicaciones. No se observaron diferencias importantes con respecto a los rasgos agronómicos entre mutantes y las variedades comerciales. El análisis de calidad de la cebada de las diferentes líneas mutantes demostró que todos los granos cosechados poseían propiedades buenas y aceptables con respecto a malteado y elaboración de cerveza. 55
Ejemplo 6
Micro-malteados y micro-maceraciones
Instalación experimental
Se llevaron a cabo experimentos de micro malteados y micro maceraciones con las siguientes seis líneas y cultivares de cebada (FIG. 6A), el cual ilustra también el flujo de trabajo experimental descrito en la presente 5 memoria descriptiva más adelante: (1) Triple-Nula; (2) LOX-1 nula−MMT nula; (3) LOX-1 nula−LOX-2 nula (línea de cebada A689); (4) MMT- nula (línea de cebada 8063); (5) LOX-1 nula (línea de cebada D112); (6) cv. Power.
Se realizó un experimento de micro malteado con tres muestras de cebada de 225 g a partir de las líneas o cultivares anteriormente mencionados. El remojado y la germinación fueron llevados a cabo como sigue: 10
(i) remojado a 16ºC: 3 h húmedo; 21 h seco; 3 h húmedo; 21 h seco; 3 h húmedo; 21 h seco; contenido final de agua 45%;
(ii) germinación: 48-72 h a 16ºC hasta modificación >95%.
15
Después de la germinación, las tres muestras fueron sometidas a diferentes regímenes de secado (indicado como secado en horno en la FIG. 6A):
(i) 85ºC − Secar: 12,5 h comenzar a 30ºC y aumentar a 55ºC seguido de 7,5 h aumentando hasta 85ºC; 1,5 h a 85ºC;
(ii) 75ºC − Secar: 12,.5 h comenzar a 30ºC y aumentar a 55ºC seguido por 7,5 h aumentando hasta 75ºC; 1,5 h a 20 75ºC;
(iii) 40ºC − Secar: 48 h a 40ºC.
Las muestras secadas a 85ºC y a 40ºC fueron procesadas inmediatamente después de la germinación mientras las muestras restantes fueron congeladas durante 2 días, descongeladas y posteriormente secadas a 75ºC como se 25 describió anteriormente.
Se llevó cabo una micro-maceración mezclando muestras de 90 g de una malta molida con 270 ml de agua de red, seguido de incubación en botellas de 500 ml a 40ºC durante 20 min. La temperatura fue aumentada a 65ºC en 25 min, seguido de una pausa de sacarificación de 60 min de duración a 65ºC. A continuación, la temperatura fue 30 elevada a 78ºC en un lapso de 13 min antes de una fase de detención de la maceración de 10 min de duración a 78ºC. El mosto resultante fue después enfriado sobre hielo, diluido con 700 ml de agua de red enfriada con hielo y filtrada a través de un filtro plegado MN-616¼ (Macherey-Nagel). 400 ml de mosto fueron transferidos a una botella de 500 ml, tapada ajustadamente y calentada durante 60 min en un baño de agua hirviendo. Las botellas fueron dejadas en el baño de agua sin calentamiento adicional durante un período adicional de 60 min. 35
Datos de los niveles de DMSP
Para examinar cómo diversas temperaturas de horno afectan el contenido de DMSP en maltas de tipo salvaje y mutantes de la presente solicitud, los granos fueron primero micro-malteados y posteriormente separados en 40 alícuotas antes de hornear a diferentes tres temperaturas, 40°C, 75°C y 85°C.
Los granos de líneas de cebada que contienen el gen MMT de tipo salvaje fueron caracterizados por elevados niveles de DMSP en la malta final. Sin embargo, se midieron reducidos niveles a continuación de hornear a más elevadas temperaturas (Tabla 2). En contraste, notablemente, se midieron bajos niveles de DMSP en todas las 45 maltas de genotipos con MMT nula.
Los niveles de DMSP fueron después medidos en los mostos producidos a partir de las maltas anteriormente mencionadas, dando niveles de DMSP en correspondencia con aquellos medidos en las maltas. El hallazgo está en línea con los resultados previos de Dickenson y Anderson (1981),que describen una ajustada correlación entre el 50 contenido de DMSP de malta y mosto. Para todos los genotipos de MMT nula, se midieron notablemente bajos niveles de DMSP en los correspondientes mostos, independientemente de la temperatura de secado en horno con la cual fue hecha la malta.
Datos de los niveles de precursores de T2N y de T2N libre 55
Para examinar cómo diversas temperaturas de secado en horno afectan los niveles de T2N libre y de precursores de T2N, se determinaron las concentraciones de dichos compuestos en mosto dulce y mosto enfriado producido mediante micro-malteados y micro-maceraciones como se describieron precedentemente en la presente memoria descriptiva. Los resultados se muestran en la Tabla 3. 60
Para mosto de malta de tipo salvaje, la temperatura de secado en horno tuvo un notable efecto sobre la concentración de T2N y de precursores de T2N. Fue absolutamente necesaria una elevada temperatura de horneado para evitar una elevada producción de precursores de T2N cuando se utilizó una malta de tipo salvaje.
5
La temperatura de horneado tuvo menos efecto en la generación de T2N y su aducto de malta LOX-1 nula−MMT nula.
Es también notable que para los mostos de malta Triple-Nula, las concentraciones de T2N libre y sus precursores fueron bajas en todas las muestras, independientemente de la temperatura de secado en horno. 10
Ejemplo 7
Micro-maceraciones con cebada no malteada
15
Se lograron micro-maceraciones con cebada no malteada del cv. Power y Triple-Nula mezclando muestras de 90 g de cebada molida con 270 ml de agua de red así como 0,12 g de la mezcla de enzimas para fabricación de cerveza de cebada Ondea Pro (Novozymes), seguido de incubación en botellas de 500 ml a 54ºC durante 30 min. La temperatura fue incrementada a 64ºC en 10 min, seguido de una pausa de sacarificación durante 45 min de duración a 64ºC. Esto fue seguido por un incremento de 14 min a 78ºC antes de una fase de detención de la 20 maceración de 10 min de duración a dicha temperatura. Se llevaron a cabo posteriors procedimientos de enfriado, dilución, filtración y calentamiento como se describió para las micro- maceraciones (ver Ejemplo 4).
Se midieron los niveles de DMSP en los mostos producidos a partir de harinas de cebada del cv. Power y Triple-Nula (Tabla 4). Fue evidente que los contenidos de DMSP en mosto producido de cebada Triple-Nula fueron 25 marcadamente más bajos que aquellos del tipo salvaje, cv. Power. Este fue un hallazgo sorprendente ya que la cebada no se considera que contenga DMSP (Yang, B. y col.: Factors involved in the formation of two precursors of dimethylsulphide during maltear, J. Am. Soc. Brew. Chem. 56:85-92, 1998).
Como se mostró en la Solicitud de patente PCT No. PCT/DK2009/050355 (publicada como WO 2010/075860) (ver 30 FIG. 12 y Ejemplo 9 en dicha solicitud), los niveles de precursores de T2N de mostos hervidos, de fabricación de cebada y normales, fueron notoriamente bajos en las muestras de doble LOX nula. En consecuencia, se espera que una propiedad similar caracterice los mostos de cebada Triple-Nula, haciendo de la cebada Triple-Nula una materia prima premium para bebidas de fabricación de cerveza de cebada bajas en, o completamente carentes de, los sabores indeseables de T2N y DMS. 35
Ejemplo 8
Malteado y fabricación de cerveza en escala piloto
40
Instalación experimental
Los análisis en el malteado y la fabricación de cerveza con malta de Triple-Nula y del cv. Quench (malta de referencia) implicaron los siguientes pasos: (i) malteado; (ii) preparación del mosto; (iii) separación del mosto; (iv) hervido del mosto; (v) fermentación del mosto con la levadura Saccharomyces carlsbergensis; (vi) estacionado de la 45 cerveza; (vii) filtración de la cerveza brillante; y (viii) embotellado de la cerveza (ver FIG. 6B,C).
Los experimentos en el malteado fueron llevados a cabo con granos de Triple-Nula y del cv. Quench en escalas de 20 kg, realizados en una fábrica de malta como sigue:
50
(i) remojar a 16ºC: 1 h húmedo; 1 h seco; 1 h húmedo; 1 h seco; 1 h húmedo; contenido final de agua 45%;
(ii) germinar durante 120 h, comienzo a 16ºC y descendiendo a 14ºC;
(iii) secar durante 14 h, comenzando a 65ºC y aumentando a 85ºC; 3 h a 85ºC.
Para la maceración de ambos Triple-Nula y del cv. Quench (el último utilizado como referencia), se utilizaron 55 muestras de malta de 25 kg. Siguiendo a la molienda de las muestras individuales de malta, se agregó agua de red para dar volúmenes de 146 l. El comienzo de la maceración fue realizado a 40ºC durante 20 min, seguido por un ascenso de 25 min desde 40ºC a 65ºC. La pausa de sacarificación a 65ºC fue de 60 min, seguido de una fase de 13 min de calentamiento a 78ºC, y 10 min de detención de la maceración a 78ºC.
60
Una muestra de mosto del cv. Quench tipo salvaje y una de Triple-Nula fueron hervidas separadamente durante 60 min a 101ºC (dando por resultado un 6,7% de evaporación), mientras que las restantes dos muestras fueron calentadas a 98ºC durante 60 min (dando por resultado un 3,9% de evaporación). Las restantes etapas de fabricación como se refirió en la presente memoria descriptiva anteriormente –es decir filtración, separación por remolino, fermentación, estacionado y envasado en botellas de vidrio verde – se realizaron de acuerdo con prácticas 5 estándar de fabricación de cerveza.
Los niveles de DMSP y DMS fueron medidos esencialmente como se describe en Hysert y col. (1980), con la detección de azufre específico utilizando cromatografía de gas de espacio en cabeza sobre un detector de quimioluminiscencia de azufre 350B (Sievers). El muestreo del espacio en cabeza fue realizado utilizando un equipo 10 automatizado HS-40 (Perkin Elmer).
Los niveles totales de DMS, es decir, la suma de DMS y DMSP libres, en mosto y extractos de malta verde y horneada, fueron obtenidos hirviendo muestras respectivas en condiciones alcalinas durante 1h. Las muestras hervidas y no hervidas fueron después sometidas a un análisis del espacio en cabeza para la determinación de los 15 niveles de DMS. La diferencia entre DMS total (medido en las muestras hervidas) y DMS libre (medido en las muestras no hervidas) fue definido como igual a la cantidad de DMSP presente en las muestras. La cantidad de DMS libre en la cerveza fue determinada esencialmente como tal en el mosto (Hysert y col., supra).
Datos de los niveles de DMSP / DMS y precursor de T2N/ T2N libre en muestras de mosto 20
Utilizando equipamiento de fabricación de cerveza moderno, se requiere normalmente la evaporación de 6−10% del mosto con el objeto de lograr niveles de DMS satisfactorios en la correspondiente cerveza terminada, -es decir, [DMS]<50 ppb, que es el nivel de umbral de gusto humano para sabor indeseable. Con base en estos hechos, se diseñaron ensayos de fabricación de cerveza pilotos como se describe precedentemente. El objetivo era ensayar el 25 efecto del ingreso reducido de energía, tal como la no ebullición durante incubación presurizada, sobre los niveles de DMS en los mostos y en la cerveza final. De manera concordante, el desarrollo experimental incluyó una comparación con ebullición del mosto de acuerdo con condiciones estándar.
Se midieron elevados niveles de DMSP y DMS libre durante el calentamiento de los mostos del cv. Quench, con un 30 incremento en los niveles de DMS libre observados con el transcurso del tiempo en el mosto presurizado. En contraste, el mosto hervido, evaporado, acumuló menos DMS hasta el final de la ebullición, después de lo cual el DMS libre se acumulaba nuevamente. En paralelo con los resultados siguientes a las micro-maceraciones como se describe precedentemente en la presente memoria descriptiva, los mostos de malta Triple-Nula a escala piloto fueron caracterizados por extremadamente bajos niveles de DMSP y DMS libre comparados con muestras similares 35 derivadas a partir del cv. Quench (ver Tabla 5). Vale la pena notar que incluso en el mosto, dichos niveles de DMS de la malta Triple-Nula estuvieron bien por debajo del nivel de umbral de sabor de 50 ppb.
Las concentraciones de precursores de T2N y T2N libre en mosto y cerveza a partir de malta de tipo salvaje del cv. Quench y Malta Triple-Nula fueron determinadas mediante GC-MS siguiendo derivatización de carbonilos con O-40 (2,3,4,5,6-pentafluorobencil)- hidroxilamina, esencialmente como descrito por Gronqvist y col. (1993).
Se midieron elevadas concentraciones de precursores de T2N durante el calentamiento de mosto del cv. Quench, con un máximo hallado en el comienzo del tratamiento de ebullición/calor (Tabla 6). Para mosto hecho a partir de la malta Triple- Nula se hallaron niveles notablemente inferiores de precursores de T2N (aproximadamente 40% de 45 aquellos cuando se utiliza material de partida de tipo salvaje) –también con un máximo en el comienzo del tratamiento de ebullición/calor. Un régimen de calentamiento de baja energía (es decir, aplicación de un tratamiento de calor presurizado) tuvo sólo menores efectos en los niveles de precursores de T2N para ambos tipos de malta. En todas las muestras de mosto, se determinaron bajos niveles de T2N libre.
50
Es notable que el efecto beneficioso de las mutaciones LOX-1-nula y LOX-2-nula es claramente visible, incluso cuando se aplica un reducido ingreso de energía durante el calentamiento del mosto.
Datos de los niveles de DMS y precursores de T2N / T2N libre en muestras de cerveza
55
Se midió la concentración de DMS en la cerveza fresca hecha a partir de malta Triple- Nula así como a partir de malta de tipo salvaje del cv. Quench utilizando los dos regímenes diferentes de ebullición/calentamiento como se describen precedentemente en la presente memoria descriptiva. Los resultados se resumen en la Tabla 7.
La cerveza producida a partir de malta de tipo salvaje del cv. Quench utilizando un régimen de ebullición estándar 60
contiene 65 ppb de DMS, es decir, levemente por encima del umbral de sabor de 50-ppb. Utilizando un procedimiento de ahorro de energía tal como “sin ebullición a través de incubación presurizada” como se describe precedentemente en la presente memoria descriptiva con malta de tipo salvaje dio por resultado una muy elevada concentración de DMS (151 ppb) en la cerveza final.
5
En contraste, la cerveza producida a partir de la malta Triple-Nula contenía muy bajos niveles de DMS, independientemente del proceso de calentamiento.
Independientemente del procedimiento aplicado de preparación del mosto, la cerveza producida a partir de malta Triple-Nula contenía muchos menos precursores de T2N, (dando como resultado una reducción de 56 a 58%) que la 10 cerveza producida a partir de malta de tipo salvaje del cv. Quench independientemente del procedimiento de ebullición (Tabla 7).
Los niveles de T2N libre en cerveza fresca fueron bajos en las cuatro cervezas frescas ensayadas (es decir, utilizando malta del cv. Quench o Triple-Nula combinada con preparación del mosto con evaporación permitida o 15 presurizada), pero después de envejecimiento forzado durante 2 semanas a 37°C, se observó una marcada diferencia. Mientras ambas cervezas producidas a partir de malta de tipo salvaje producidas con ebullición estándar o calentamiento presurizado, contenían 0,041 ppb y 0,061 ppb de T2N, respectivamente, los valores correspondientes para cervezas producidas a partir de malta Triple-Nula fueron inferiores, es decir, reducidos a 95% y 64%, respectivamente. (Tabla 7). 20
Datos en espuma de cerveza
Se compararon cerveza fabricada en forma piloto, producida con evaporación o presurización en el calentamiento del mosto, del cv. Quench (ver FIG. 6B) y maltas Triple-Nula (ver FIG. 6C). Las cervezas fueron tomadas en el punto 25 de muestra 9 (ver FIG. 6B,C), desgasificadas durante 20 min en un baño ultrasónico antes que se agregaran 50 ml de H2O a 150 ml de cerveza. La mezcla fue vertida lentamente dentro de una torre de espuma, consistente en un tubo de vidrio de 16 cm de longitud, 7 cm de ancho (con un filtro de vidrio y conector en el fondo y en la parte superior, respectivamente). Se burbujeó gas N2, a un caudal de 400 ml/min, a través de la mezcla desde el fondo para generar espuma de cerveza. Esta fue conducida a través de un tubo y recolectada en un cono de 30 sedimentación graduado posicionado sobre una balanza.
Se registró el peso de espuma total para cada una de las cuatro cervezas a intervalos de 5 min hasta que cesó el desarrollo de espuma (FIG. 7). Los niveles de espuma fueron similares, en forma irrespectiva de los procedimientos de evaporación o presurización. Sin embargo, el desarrollo de espuma fue notablemente mejorado en aquellas 35 cervezas donde se utilizó malta Triple-Nula como materia prima.
Degustación de cerveza
Un panel de expertos catadores evaluaron las cuatro cervezas producidas (es decir utilizando malta del cv. Quench 40 o Triple-Nula combinada con preparación de mosto con evaporación permitida o presurizada), tanto cerveza fresca como después de envejecimiento forzado durante 1 y 2 semanas a 37°C (Tabla 8).
La cerveza fresca producida a partir de malta Triple-Nula obtuvo el mayor Puntaje de Sabor Total, independientemente del procedimiento de ebullición. En contraste, un Puntaje de Sabor Total levemente inferior fue 45 obtenido por la cerveza producida a partir de malta de tipo salvaje y utilizando el régimen de ebullición estándar; se la consideró “levemente DMS”. La aplicación de la técnica de calentamiento presurizada dio por resultado una cerveza con un muy bajo Puntaje de Sabor Total, y fue considerada “Fuertemente DMS”.
Después de envejecimiento forzado durante 1 o 2 semanas a 37°C las cervezas producidas a partir de malta Triple-50 Nula obtuvieron puntajes de envejecimiento total marcadamente inferiores que las cervezas producidas a partir de malta de tipo salvaje, especialmente debido a un puntaje reducido para el atributo “sabor a papel” (papery), originado a partir de bajas concentraciones del componente de envejecimiento T2N.
Ejemplo 9 55
Malteado y fabricación de cerveza en escala piloto
Disposición experimental
Los análisis de malteado y fabricación de cerveza con malta Triple-Nula (doble LOX nula-MMT nula), y cv. Rosalina (referencia de tipo salvaje), implicaron las siguientes etapas: (i) malteado; (ii) preparación de mosto; (iii) separación del mosto; (iv) ebullición del mosto; (v) fermentación del mosto con la levadura Saccharomyces carlsbergensis; (vi) estacionamiento (lagering) de la cerveza; (vii) filtración de la cerveza brillante; y (viii) embotellado de la cerveza. 5
Los experimentos de malteado fueron llevados a cabo con granos de Triple-Nula y cv. Rosalina en experimentos a gran escasa de 21 kg, en una maltería como sigue:
(i) remojado a 16ºC: 1 h húmeda; 1 h seca; 1 h húmeda; 1 h seca; 1 h húmeda; escurrido de agua durante 36 h 10 hasta un contenido de agua final de 45%;
(ii) germinación durante 120 h, partiendo a 16ºC y descendiendo hasta 14ºC;
(iii) el secado/horneado de los granos germinados fue con un programa de temperatura normal o un programa de baja temperatura en un horno piloto;
(iv) programa de secado/horneado normal, partiendo desde 45ºC con aumento hasta 85ºC durante 14 h, seguido por 15 incubación durante 2 h a 85ºC;
(v) programa de secado/horneado a baja temperatura, comenzando a 45ºC y con aumento hasta 75ºC durante 12 h, seguido por incubación durante 2 h a 75ºC.
Para maceraciones de ambos Triple-Nula y cv. Rosalina, se utilizaron muestras de malta de 34 kg. Siguiendo a la 20 molienda de las muestras individuales de malta, se agregó agua de red para dar volúmenes de 180 l. El comienzo de la maceración fue llevado cabo a 60ºC durante 20 min, seguido de un incremento de 5 min desde 60ºC a 65ºC. La pausa de sacarificación a 65ºC fue de 60 min, seguida de una fase de calentamiento durante 13 min hasta 78ºC, y 10 min de detención de la maceración a 78ºC.
25
Las muestras de mosto de cv. Rosalina tipo salvaje y de Triple-Nula fueron o bien hervidas separadamente, durante 60 min a 100ºC en un recipiente abierto (dando por resultado un 4,5% de evaporación), o bien calentadas a 99,5ºC y mantenidas a 99,5ºC durante 60 min en un recipiente cerrado (dando por resultado un 0% de evaporación).
Se prepararon seis mostos diferentes con diferentes combinaciones de cultivar, condiciones de horneado y 30 condiciones de cocción (ver Tabla 9).
Las restantes etapas de fabricación de cerveza como han sido referidas en la presente memoria descriptiva anteriormente, − es decir separación por remolino, fermentación, estacionado, filtración y envasado en botellas de vidrio verde – fueron de acuerdo con especificaciones para la práctica estándar de fabricación de cerveza. 35
Los niveles de DMSP y DMS fueron medidos como se describió precedentemente en la presente memoria descriptiva en el Ejemplo 8.
Datos de niveles de DMSP / DMS en muestras de malta 40
En una planta moderna de malteado, es normalmente requerido el secado de granos con una temperatura de curado a 85ºC durante al menos 2 h con el fin de reducir DMSP en malta a un nivel bajo – es decir menos de 4,5 mg/kg de malta – con el fin de obtener una malta a partir de la cual se pueda obtener un mosto con un nivel de DMS satisfactorio (ver más adelante). 45
Con base en estos hechos, se han diseñado ensayos piloto de malteado como se describió anteriormente. El objetivo fue ensayar el efecto de ingreso reducido de energía, tal como baja temperatura de secado, en los niveles de DMS y DMSP en las maltas, mostos y cerveza final. En consecuencia, la instalación experimental incluyó una comparación con granos secados de acuerdo con condiciones estándar. 50
En la malta preparada con cv. Rosalina utilizando secado estándar a 85ºC, el DMSP fue medido a 4,7 mg/kg de malta. En la malta de cv. Rosalina preparada con secado a 75ºC, el DMSP fue medido a 16,2 mg/kg (Tabla 10). En la malta preparada con granos de Triple-Nula, se obtuvieron niveles extremadamente bajos de DMSP, realmente por debajo del límite de detección, independientemente de la temperatura de secado. 55
Datos de niveles de DMSP / DMS en muestras de mosto
Utilizando moderna tecnología de fabricación de cerveza, normalmente se requiere al menos una hora de cocción con una evaporación de 4,5−10% del mosto con el fin de lograr niveles de DMS satisfactorios en la correspondiente 60
cerveza terminada − preferentemente [DMS]<50 ppb. Con base en estos hechos los ensayos en la fabricación de cerveza fueron diseñados como se describió anteriormente. El objetivo fue ensayar el efecto del aporte reducido de energía, tal como baja temperatura de secado de granos o tratamiento de calor sin evaporación en un recipiente cerrado, sobre los niveles de DMS en los mostos y en la cerveza final. En consecuencia, la instalación experimental incluyó una comparación con secado de grano y cocción de mosto de acuerdo con condiciones estándar. 5
Se midieron elevados niveles de DMSP y DMS libre durante el calentamiento de mostos de cv. Rosalina preparados con secado normal. Se observó un aumento en los niveles de DMS libre a lo largo del tiempo en el recipiente cerrado. En contraste, el mosto hervido, evaporado acumuló menos DMS hasta el final de la cocción, después de la cual se acumuló DMS libre nuevamente. (Tabla 11) Utilizando un secado a baja temperatura con cv. Rosalina los 10 niveles de DMSP y DMS fueron mucho más altos que con secado normal. En los tres mostos preparados con cv. Rosalina el mosto final tuvo un nivel de DMS superior a 50 ppb.
En paralelo con otros resultados descritos precedentemente en la presente memoria descriptiva, el mosto de malta Triple-Nula se caracterizó por niveles extremadamente bajos de DMSP y DMS libre comparado con muestras 15 similares derivadas a partir de un cv. Rosalina. Es destacable que aún en el mosto, dichos niveles de DMS de malta Triple-Nula estuvieron bien por debajo de 50 ppb independientemente de los regímenes de horneado y cocción.
Datos de los niveles de precursor de T2N/T2N libre en muestras de mosto
20
Las concentraciones de precursores de T2N y T2N libre en mosto y cerveza a partir de malta de tipo salvaje del cv. Rosalina y malta Triple-Nula fueron determinadas mediante GC-MS siguiendo a la derivatización de carbonilos con O-(2,3,4,5,6- pentafluorobencil)-hidroxilamina, esencialmente como descrito por Groenqvist y col. (1993).
Se midieron elevadas concentraciones de precursores de T2N en el mosto de cv. Rosalina (Tabla 12). Para mosto 25 preparado a partir de malta Triple-Nula, se hallaron particularmente menores niveles de precursores de T2N, ∼40% de aquellos cuando se utiliza una materia prima de tipo salvaje. El régimen de calentamiento de baja energía, es decir, baja temperatura de horneado o tratamiento de calor del mosto sin evaporación en un recipiente cerrado, solo tuvo un pequeño efecto en los niveles de precursores de T2N para ambos tipos de malta. En todas las muestras de mosto, se determinaron bajos niveles de T2N libre. 30
Debe notarse que el efecto beneficioso de las mutaciones LOX-1 nula y LOX-2 nula es claramente visible, incluso cuando se aplica un reducido aporte de energía.
Datos de los niveles de DMS y precursores de T2N/T2N libre en muestras de cerveza 35
Se midieron las concentraciones de DMS en cerveza fresca preparada a partir de malta Triple-Nula, así como a partir de malta de tipo salvaje del cv. Rosalina utilizando los dos diferentes regímenes de secado y cocción/calentado del grano como se describe precedentemente en la presente memoria descriptiva. Los resultados se resumen en la Tabla 13. 40
La cerveza producida utilizando un régimen de cocción estándar a partir de malta de tipo salvaje del cv. Rosalina, producida utilizando condiciones de secado estándar, contenía 117 ppb de DMS, es decir, por encima de 50 ppb. Utilizando un procedimiento con ahorro de energía, tal como “sin evaporación en un recipiente cerrado” como se describe precedentemente en la presente memoria descriptiva, con la malta de tipo salvaje dio por resultado 174 ppb 45 de DMS, es decir, una muy elevada concentración de sabores indeseables en la cerveza final,
En contraste, la cerveza producida a partir de la Malta Triple-Nula contenía muy bajos niveles de DMS, independientemente de los procedimientos de cocción y horneado.
50
Los niveles de T2N libre en cerveza fresca fueron bajos en todas las cervezas ensayadas (es decir, utilizando malta de cv. Rosalina o Triple-Nula combinada con cocción con evaporación permitida o tratamiento térmico sin evaporación en un recipiente cerrado), pero se apreció una marcada diferencia después de envejecimiento forzado durante 2 semanas a 37°C. Mientras la cerveza preparada a partir de malta de tipo salvaje producida con cocción estándar y tratamiento con calor sin evaporación en un recipiente cerrado contenía 0,055 ppb y 0,035 ppb de T2N, 55 respectivamente, los correspondientes valores para cervezas producidas a partir de malta Triple-Nula fueron marcadamente inferiores, es decir reducidos a 67% y 51%, respectivamente (ver Tabla 13).
Degustaciones de cerveza
60
Un panel degustador experto evaluó las 6 cervezas producidas (es decir utilizando malta de cv. Rosalina o Triple-Nula combinada con cocción con evaporación permitida o tratamiento con calor sin evaporación en un recipiente cerrado o secado estándar o a baja temperatura), tanto la cerveza fresca como aquella sometida a envejecimiento forzado durante 2 semanas a 37°C (Tabla 14).
5
La cerveza fresca producida a partir de malta Triple-Nula obtuvo el mayor puntaje de sabor total, independientemente de los procedimientos de horneado y cocción. En contraste, se obtuvieron puntajes de sabor total mucho más bajos para la cerveza producida a partir de malta de tipo salvaje horneada a 85ºC y utilizando el régimen de cocción estándar; fue considerada “marcadamente DMS”. La aplicación de tratamiento de calor sin evaporación en un recipiente cerrado en la preparación del mosto dio por resultado una cerveza con aún más bajo 10 puntaje de sabor total, que fue considerada “fuertemente DMS”.
Después de envejecimiento forzado durante 2 semanas a 37°C, la cerveza producida con cocción normal a partir de malta Triple-Nula horneada a 85ºC tuvo puntajes de envejecimiento marcadamente inferiores que la correspondiente cerveza producida a partir de malta de tipo salvaje, especialmente debido al puntaje reducido para el atributo “sabor 15 a papel" originado de bajas concentraciones del componente de envejecimiento T2N.
Para la cerveza producida a partir de malta de tipo salvaje, la evaluación de la característica sabor rancio no fue realmente posible, principalmente debido al marcado-a-fuerte sabor indeseable a DMS.
20
Ejemplo 10
Comparaciones de THAs en cervezas elaboradas con cebada y en cerveza normal
Los THAs específicos de cerveza derivados de ácido linoleico fueron ya descritos hace varias décadas atrás (Drost y 25 col., 1974). Desde entonces, diversos informes han verificado que el contenido total de THAs en cerveza está en el rango de ∼5-12 ppm (Hamberg, 1991; y referencias en ella). Mientras 9,12,13-THA normalmente constituye el 75-85% de los THAs en la cerveza, aquel de 9,10,13-THA constituye el 15- 25%; otros isómeros se encuentran en cantidad de trazas.
30
En cervezas producidas a partir de mosto preparadas a partir de malta de cebada Triple-Nula (ver Ejemplo 9), la concentración de 9,12,13-THA fue reducida en 80-87% comparado con la cerveza control preparada a partir de malta del cv. Rosalina (Tabla 15). Para el isómero 9,10,13-THA se observó una reducción de 65-72%. Estas mediciones fueron llevadas a cabo utilizando análisis de espectrometría de masa HPLC estándar (Hamberg, supra).
35
Ejemplo 11
Amplificación de ADN derivado de la materia prima en cerveza
Donde la metodología PCR puede ser utilizada para establecer la presencia o ausencia de secuencias específicas 40 de ADN de especie en mezclas de harina de malta, la autenticación de muestras de cerveza ha sido más desafiante. En la producción de cerveza, los efectos combinados de nucleasas derivadas de materia prima, las elevadas temperaturas y las filtraciones proporcionan productos de cerveza que contienen solo bajos niveles de ADN intacto para la amplificación de fragmentos de genes de plantas. Se describe en la presente memoria descriptiva un novedoso efectivo procedimiento para la extracción y amplificación combinados de ADN en cantidad suficiente para 45 visualización.
Se ha desarrollado un novedoso protocolo de cuatro etapas para la autenticación de materia prima de muestras de cerveza. Se utilizan de un modo consecutivo los reactivos y protocolos de tres kits biomoleculares, que causan finalmente la amplificación de los fragmentos de ADN para visualización: 50
(i) extracción de ADN a partir de cerveza a través de la unión a perlas magnéticas [siguiendo las recomendaciones en las instrucciones para muestras líquidas del ADN Extraction Kit, Speciation (Tepnel Biosystems Ltd., Cat. No. 901040N)];
(ii) amplificación de ADN mediante desplazamiento isotérmico de hebra (Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification 55 Kit, GE Healthcare, Cat. No. 25-6600-30);
(iii) PCR con cebadores para la detección de mutaciones específicas de ADN, utilizando el REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix (Sigma, Cat. No. XNAP-1KT);
(iv) electroforesis en gel de agarosa para separar los productos de amplificación, seguido de marcado con bromuro de etidio para su visualización. 60
La etapa (i) anterior se refiere a la purificación de ADN a partir de alícuotas de 400-µl de las siguientes muestras:
(a) Tuborg Grøn Pilsner, producido utilizando harina de una mezcla 75%:25% de malta:cebada de tipo salvaje (Carlsberg Breweries A/S; inscripción de etiqueta 26.11.11 704); 5
(b) cerveza producida en escala piloto utilizando una mezcla que comprende 50% de malta con LOX-1 nula (Carlsberg, identificador de ensayo 2C10084);
(c) mosto no cocido de fábrica de cerveza en escala piloto utilizando maltas producidas a partir de cebada Triple-Nula (Carlsberg, identificador de ensayo 2C11001);
(d) mosto cocido en una fabrica de cerveza en escala piloto utilizando malta Triple-Nula (Carlsberg, identificador de 10 ensayo 2C11001), es decir mosto procesado a partir de aquél descrito en (c) anterior.
El ADN purificado a partir de cada una de las muestras mencionadas (a), (b), (c) y (d) fue finalmente re-suspendido en 50 µl de un buffer 10-mM Tris-EDTA, pH 7.4.
15
En la etapa (ii) anterior, alícuotas de muestra de 1-µl de ADN derivado de mosto o cerveza − purificado como se detalló en (i) − fue sometida a amplificación. El ADN fue desnaturalizado con calor brevemente y después enfriado en una muestra de buffer conteniendo hexámeros al azar que se unen de una manera no específica al ADN. Se agregó una mezcla principal conteniendo polimerasa de ADN, hexámeros al azar, nucleótidos, sales y buffers, y se llevó a cabo amplificación isotérmica a 30°C durante 2,0 h, empleando un volumen de reacción final de 20 µl. 20 Posteriormente, la polimerasa fue inactivada con calor durante una incubación de 10 min a 65°C.
Con respecto a la etapa (iii) anterior, los parámetros de las amplificaciones por PCR de 14-µl − incluyendo alícuotas de 1,0 o 4,2 µl de muestras molde preparadas como se describe en (ii) anterior, y 7 pmol de cada cebador FL820 (SEQ ID NO: 10 de WO 2010/075860 ) y FL823 (SEQ ID NO:11 de WO 2010/075860 ) para detectar la mutación de 25 LOX-1 nula; ver FIG. 18B en WO 2010/075860 de Skadhauge, B. y col. − fueron como sigue:
(i) 1 ciclo con desnaturalización a 96°C durante 2 min;
(ii) 30 ciclos con:
(a) desnaturalización a 95°C durante 1 min; 30
(b) hibridación a 68°C durante 1 min;
(c) extensión a 72°C durante 1 min
(iii) extensión final a 72°C durante 10 min
(iv) conservación
35
La etapa (iv) anterior consistió en una separación electroforética de la mezcla de PCR completa en un gel de agarosa al 2% (p/v) donde fue incorporado bromuro de etidio. A continuación de la electroforesis, el gel fue irradiado con luz UV y se tomó una fotografía (FIG. 10).
El análisis del patrón de bandas de ADN mostrado en la FIG. 10 no reveló amplificación del producto a partir de una 40 alícuota de cerveza Tuborg, un resultado esperado en tanto que la materia prima era de origen tipo salvaje, es decir no derivado de cebada con LOX-1 nula. Sin embargo, los productos de amplificación de la longitud esperada podrían ser muestras detectadas a partir de cerveza fabricada con una mezcla que comprende 50% con LOX-1 nula. Similarmente, pero más pronunciado, el marcado se obtuvo en el mosto no hervido preparado a partir de malta Triple-Nula. Posiblemente debido al daño por calor y siguiente precipitación, se amplificó menos producto de PCR en 45 la muestra de mosto hervido de materia prima Triple-Nula.
Utilizando los productos amplificados descritos anteriormente en (ii) con el par de cebadores FL1034−FL1039 (SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:8 de WO 2010/075860, respectivamente; ver también la FIG. 18 en WO 2010/075860 de Skadhauge y col.), el conjunto de cebadores 20 (SEQ ID NO:77 y SEQ ID NO:81 de WO 2010/063288), y el conjunto 50 de cebadores 21 (SEQ ID NO:78 y SEQ ID NO:82 de WO 2010/063288; ver también FIG.15 en WO 2010/063288 A2 de Knudsen y col.) en PCRs separados, pero en condiciones similares a aquellas detalladas en el presente ejemplo, se verifica si la muestra de mosto o cerveza es producida mediante el uso de una materia prima Triple-Nula.
Ejemplo 4 de PCT/DK2009/050355 (publicado como WO2010/075860) 55
Análisis basado en HPLC de HPODE en cebada germinada y micro-malteada
El análisis de los HPODE de la cebada se realizó esencialmente tal como se describe en la solicitud de patente internacional WO 2005/087934, con la salvedad de que se usaron embriones en germinación en lugar de maduros. 60
Los granos de la generación M4 se hicieron germinar durante 48 h tal como se describe en el Ejemplo 2 de PCT/DK2009/050355 (publicada como WO2010/075860). Los granos de la generación M5 se sometieron a un procedimiento de micromalteado realizado esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 6 de PCT/DK2009/050355 (publicado como WO2010/075860), pero los niveles de HPODE específicos se determinaron después de 72 h de germinación, y se omitió el procedimiento de horneado. Los niveles de HPODE 9 y 5 13 se determinaron dejando que los extractos de proteína en crudo procedentes de embriones germinantes de las generaciones M4 y M5 del mutante A689 y las muestras de control se incubaran con el ácido linoleico del sustrato. Los productos de reacción se analizaron mediante HPLC.
Los embriones germinados se diseccionaron a partir de los granos de cebada usando un escalpelo para cortar entre 10 el escutelo y el endospermo. A continuación se colocó cada muestra de 4 embriones entre dos piezas de papel de pesada, y se machacaron suavemente para producir una harina homogénea. Esta se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml; se añadieron 600 µl de un tampón de ácido láctico 200 mM, pH 4,5, y se colocó el tubo en hielo durante 10 min antes de homogeneización adicional usando un mortero de plástico (Kontes). Posteriormente, se añadieron 600 µl de H2O a cada tubo, y se centrifugaron las muestras durante 2 min a 20.000×g. Se transfirió una 15 parte alícuota de 100 µl del sobrenadante resultante a un tubo de centrífuga de 15 ml (Cellstar: nº cat.188271), para preparar el análisis de los productos de reacción después de la acción de LOX 2 ml de un tampón de fosfato de Na 100 mM, pH 6,5, que contenía 260 µM de ácido linoleico [este sustrato se preparó mezclando 10 ml de un tampón de fosfato de Na 100 mM, pH 6,5, con 100 µl de una solución de reserva de ácido linoleico 24 Mm]. Esta última se preparó mezclando primero 155 µl de ácido linoleico (correspondiente a 134 mg de ácido libre; L-1376, Sigma) y 257 20 µl de Tween-20, añadiendo después H2O hasta completar el volumen de 5 ml, seguido por la adición de 600 µl de NaOH 1 M, y cuando la solución se hizo transparente, ajustando el volumen a 20 ml con H2O. Después de una incubación de 15 min a ∼30 rpm en un rotador de tubo de sangre, se añadieron 2 ml de acetato de etilo, y se mezcló el contenido de la muestra con agitación vigorosa durante 5 s para extraer HPODE 9 y 13. A continuación se centrifugó la muestra durante 10 min a 800×g, y se transfirió 1 ml de acetato de etilo a un tubo de microcentrífuga de 25 1,5 ml, en el que se evaporó el acetato de etilo bajo una corriente de gas nitrógeno. Posteriormente, se resuspendieron los HPODE en 300 µl de metanol, y se filtraron a través de una membrana de 0,45 µm (Millex-HN filter. Millipore). El análisis del contenido de HPODE se realizó por HPLC. Se inyectó un total de 15 µl de cada muestra en un aparato de HPLC (HP 1100 Series, Hewlett Packard), equipado con una columna Symmetry C18 de 4,6 × 250 mm (Waters). La fase móvil usada fue una mezcla de 16:12:12:10:0.5 (v:v:v:v:v) de 30 agua:metanol:acetonitrilo:tetrahidrofurano:ácido trifluoroacético. El flujo de la fase móvil fue de 1 ml min-1, y la presión medida delante de la columna fue de 140 bar. La separación se realizó a 30°C. La detección de hidroperóxidos de ácido linoleico con dobles enlaces conjugados se llevó a cabo a 234 nm.
Ejemplo 4 de PCT/DK2009/050315 (publicado como WO2010/063288) 35
Medidas de actividad de MMT de Mutante 8063
La enzima MMT cataliza la transferencia de un grupo metilo desde SAM a Met, formando SMM (v. FIG. 1B de PCT/DK2009/050315 (publicado como WO2010/063288)). Usando [3H]SAM como sustrato, en el que el grupo 40 metilo se marca con tritio, es posible llevar un seguimiento de la transferencia de dicho grupo metilo por recuento por centelleo después de la eliminación del [3H]SAM restante con carbón activado. Este último compuesto se une al sustrato, pero no al producto SMM marcado y recién sintetizado (Pimenta y col., 1995). Esto permitió determinar las actividades de MMT y el contenido de SMM, el segundo determinado tal como se describe en el Ejemplo 2 de PCT/DK2009/050315 (publicado como WO2010/063288), en extractos de 15 brotes de cada uno de Mutante 8063 y 45 cv. Prestige (FIG. 4 de PCT/DK2009/050315 (publicado como WO2010/063288)). El examen de los datos verificó que el MMT catalizó la formación de SMM en granos de tipo salvaje, una propiedad que estaba ausente en los granos de la Mutante 8063.
50
Tabla 2. Niveles de DMSP en micro-malteados y micro-macerados
Tipo de cebada Descriptor de muestreo (v. FIG. 6A)
1 Malta
2 Mosto dulce 3 Mosto hervido 4 Mosto enfriado
µg/g
µg/l
Secado en horno a 40°C
Triple-Nula 0,2 8 6 −
LOX-1 nula−MMT nula
0,4 37 19 −
LOX-1 nula−LOX-2 nula
21,3 - - -
MMT nula
- - - -
LOX-1 nula
17,3 − - -
cv. Power tipo salvaje
21,3 2348 950 −
Secado en horno a 75°C
Triple-Nula 0,2 9 7 −
LOX-1 nula−MMT-nula
0,1 9 8 −
LOX-1 nula−LOX-2 nula
11,9 - - -
MMT nula
- - - -
LOX-1 nula
8,8 - - -
cv. Power tipo salvaje
7,7 1017 393 −
Secado en horno a 85°C
Triple-Nula 0,1 4 5 −
LOX-1 nula−MMT nula
0,1 7 6 −
LOX-1 nula−LOX-2 nula
5,7 656 247 −
MMT-nula
0,1 5 4 −
LOX-1 nula
6,5 684 212 −
cv. Power tipo salvaje
7,1 880 286 −
Tabla 3. Niveles de T2N y precursores de T2N (T2N pre.) en micro-malteados y micro-macerados
Tipo de cebada Descriptor de muestreo (v. FIG. 6A)
1 Malta
4 Mosto enfriado
T2N
T2N pre. T2N T2N pre.
ppb
Secado en horno a 40°C
Triple-Nula 0,0 2,3 0,1 3,6
LOX-1 nula−MMT nula
0,0 4,3 0,1 7,5
LOX-1 nula−LOX-2 nula
- - - -
MMT nula
- - - -
LOX-1 nula
- - - -
cv. Power tipo salvaje
0,1 8,3 0,4 15,7
Secado en horno a 75°C
Triple-Nula 0,1 2,3 0,2 3,3
LOX-1 nula−MMT-nula
0,1 3,1 0,2 4,9
LOX-1 nula−LOX-2 nula
- - - -
MMT nula
- - - -
LOX-1 nula
- - - -
cv. Power tipo salvaje
0,2 5,2 0,3 8,2
Secado en horno a 85°C
Triple-Nula 0,1 1,8 0,1 2,5
LOX-1 nula−MMT nula
0,1 2,1 0,1 3,1
LOX-1 nula−LOX-2 nula
0,1 1,8 0,1 2,5
MMT-nula
0,4 4,2 0,4 6,4
LOX-1 nula
0,1 2,2 0,1 6,6
cv. Power tipo salvaje
0,2 4,8 0,1 9,0
Tabla 4. Niveles de DMSP en micro-macerados
Descriptor de muestreo
Tipo de cebada
2 Mosto dulce 3 30 min mosto hervido 3 60 min mosto hervido 4 Mosto enfriado
µg/L
cv. Power tipo salvaje
10,9 12,0 6,3 3,8
Triple-Nula
0,1 0,6 0,6 0,3
imagen1
Tabla 6. Niveles de precursor de T2N (T2N pre) y de T2N libre en dos tipos de maceraciones en escala piloto.
Tipo de cebada
Descriptor de muestreo (v. FIG. 6B,C)
1
2 3 4 5 6 7 8
Malta
Calentamiento de mosto dulce con evaporación permitida (min;°C)
0; 67 22; 99 37; 101 52; 101 67; 101 82; 101 142; 90
ppb
cv. Quench tipo salvaje
T2N pre. - 3,6 4,8 4,3 4,2 3,9 3,9 3,7
T2N
- 0,3 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1
Triple-Nula
T2N pre. - 1,7 1,9 1,6 1,4 1,4 1,2 1,4
T2N
- 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Calentamiento presurizado de mosto dulce (min;°C)
0; 69 22; 99 37; 98 52; 98 67; 98 82; 98 142; 80
cv. Quench tipo salvaje
T2N pre. - 3,8 4,0 3,9 3,8 3,8 3,8 3,3
T2N
- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Triple-Nula
T2N pre. - 1,6 1,8 1,8 1,6 1,5 1,4 1,5
T2N
- 0,2 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1
Tabla 7. DMS, Precursores de T2N y T2N libre en cerveza fresca y envejecida.
Tipo de cebada
Tipo de cocción Condiciones de incubación de la cerveza
Fresca
2 semanas a 37°C
DMS (ppb)
Precursores de T2N (ppb) T2N libre (ppb) SO2 (ppm) T2N libre (ppb)
cv. Quench tipo salvaje
Calentamiento de mosto dulce con evaporación permitida 65 3,0 0,025 5 0,041
Triple-Nula
2 1,3 0,018 3 0,039
cv. Quench tipo salvaje
Calentamiento presurizado de mosto dulce 151 3,3 0,024 6 0,061
Triple-Nula
3 1,4 0,020 4 0,039
Tabla 8. Evaluación sensorial de cerveza fresca y envejecida producidas a partir de malta del cv Quench tipo salvaje y de Triple-Nula.
Tipo de cebada
Tipo de cocción Condiciones de incubación de la cerveza
Fresca
1 semana a 37°C 2 semanas a 37°C
Puntaje de sabor1
Comentarios Puntaje envejecimiento2 Puntaje sabor papel2 Puntaje envejecimiento Puntaje sabor papel
cv. Quench tipo salvaje
Calentamiento de mosto dulce con evaporación permitida 4,4 Perceptiblemente ácido Levemente oxidado Levemente DMS Levemente sulfídico Levemente estérico 3,1 2,4 2,4 2,1
Triple-Nula
4,8 Levemente sulfídico Levemente ácido graso Levemente granulado 2,1 1,6 1,9 1,3
cv. Quench tipo salvaje
Calentamiento presurizado de mosto dulce 2,8 Levemente estérico Levemente envejecido Fuertemente DMS Levemente felino Levemente granulado 3,5 2,3 3,3 2,4
Triple-Nula
4,8 Levemente granulado Levemente frutal Levemente ácido Levemente rancio 2,6 1,9 1,9 1,1
imagen2
1 En una escala de 1-9, donde 9 es lo mejor 5
2 En una escala de 0-5, donde 0 designa una cerveza fresca, y 5 una cerveza muy envejecida
3 En una escala de 0-5, donde 5 designa una cerveza con sabor extremo a papel
Tabla 9. Resumen experimental.
Secado/horneado Cocción
Nº fabricación
Cultivar Programa Temperatura de curado (°C) Recipiente Evaporación (%)
1
Rosalina Normal 85 Abierto 4,5
2
Triple-Nula Normal 85 Abierto 4,5
3
Rosalina Normal 85 Cerrado 0
4
Triple-Nula Normal 85 Cerrado 0
5
Rosalina Baja temperatura 75 Abierto 4,5
6
Triple-Nula Baja temperatura 75 Abierto 4,5
Tabla 10. DMS y DMSP en muestras de malta.
Secado/horneado DMS (mg/kg) DMSP (mg/kg)
Cultivar
Programa Temperatura de curado (°C)
Rosalina
Normal 85 4,1 4,7
Rosalina
Baja temperatura 75 2,8 16,2
Triple-Nula
Normal 85 <DL* <DL*
Triple-Nula
Baja temperatura 75 <DL* <DL*
* por debajo del límite de detección
Tabla 11. Niveles de DMSP y DMS en dos tipos de cocción en escala piloto.
Secado normal del grano a 85°C y calentamiento con evaporación permitida del mosto en recipiente abierto.
Tipo de cebada
Descriptor de la muestra (v. FIG. 6)
1
2 3 4 5 7
Calentamiento del mosto dulce (min;°C)
0; 67
22; 99 37; 100 52; 100 82; 100 142;90
µg/L
cv. Rosalina tipo salvaje
DMSP 1245 1257 882 759 415 208
DMS
212 190 102 56 31 178
Triple-Nula
DMSP traza - - - - traza
DMS
traza - - - - traza
Secado normal del grano a 85°C y calentamiento del mosto en recipiente cerrado sin evaporación.
Tipo de cebada
Descriptor de la muestra (v. FIG. 6)
1
2 3 4 5 7
Calentamiento del mosto dulce (min;°C)
0; 67
22; 99 37; 100 52; 100 82; 100 142; 90
µg/L
cv. Rosalina tipo salvaje
DMSP 1180 1061 732 576 398 274
DMS
183 227 410 412 471 709
Triple-Nula
DMSP traza - - - - traza
DMS
traza - - - - traza
Secado de grano a baja temperatura a 75°C y calentamiento del mosto con evaporación permitida en recipiente abierto.
Tipo de cebada
Descriptor de la muestra (v. FIG. 6)
1
2 3 4 5 7
Calentamiento del mosto dulce (min;°C)
0; 67
22; 99 37; 100 52; 100 82; 100 142;90
µg/L
cv. Rosalina tipo salvaje
DMSP 1825 1665 1262 1005 611 376
DMS
155 178 74 32 27 154
Triple-Nula
DMSP 11 - - - - 2
DMS
4 - - - - 4
Tabla 12. Niveles de precursores de T2N (T2N pre) y de T2N libre en mostos de escala piloto producidos utilizando regímenes variables de horneo y cocción.
Tipo de cebada
Tipo de cocción *) Al comienzo del calentamiento Mosto calentado
T2N (ppb)
T2N pre (ppb) T2N (ppb) T2N pre (ppb)
Secado normal a 85°C
cv. Rosalina tipo salvaje
Recip ab.; evap. 0,39 5,3 0,21 4,2
Triple-Nula
Recip ab.; evap. 0,24 1,8 0,08 1,8
cv. Rosalina tipo salvaje
Rec. cerr.; no evap. 0,40 5,3 0,36 4,1
Triple-Nula
Rec. cerr.; no evap. 0,28 2,2 0,11 1,8
Secado a baja temperatura a 75°C
cv. Rosalina tipo salvaje
Recip ab.; evap. 0,21 4,4 0,27 4,7
Triple-Nula
Recip ab.; evap. 0,31 1,9 0,18 1,8
*) Abreviaturas: Recipiente abierto (recip. ab.) o cerrado (recip. cerr.); no evaporación (no. evap.) o evaporación permitida (evap.)
Tabla 13. DMS y T2N libre en cerveza fresca y envejecida.
Tipo de cebada
Tipo de cocción *) DMS (ppb) T2N libre **) (ppb) SO2 (ppm) T2N libre ***) (ppb)
Secado normal a 85°C
cv. Rosalina tipo salvaje
Recip ab.; evap. 117 0,011 5 0,055
Triple-Nula
Recip ab.; evap. 1 0,011 5 0,018
cv. Rosalina tipo salvaje
Rec. cerr.; no evap. 326 0,011 5 0,035
Triple-Nula
Rec. cerr.; no evap. 2 0,012 4 0,017
Secado a baja temperatura a 75°C
cv. Rosalina tipo salvaje
Recip ab.; evap. 174 - 10 -
Triple-Nula
Recip ab.; evap 5 - 5 -
*) Abreviaturas: Recipiente abierto (recip. ab.) o cerrado (recip. cerr.); no evaporación (no. evap.) o evaporación permitida (evap.) **) En cerveza fresca ***) En cerveza incubada durante 2 semanas a 37°C
Tabla 14 Evaluación sensorial de cerveza fresca y envejecida producidas a partir de malta del cv. Rosalina tipo salvaje y de Triple-Nula.
Tipo de cebada
Tipo de cocción *) Condiciones de incubación de la cerveza
Fresca
2 semanas a 37°C
Puntaje de sabor1
Comentarios Puntaje envejecimiento2 Puntaje sabor papel3
Normal secado de granos a 85°C
cv. Rosalina tipo salvaje
Recip ab.; evap. 3,4 Levemente sulfídico
Marcadamente DMS
Triple-Nula
Recip ab.; evap. 5,7 Levemente amargo posterior 2,4 1
cv. Rosalina tipo salvaje
Rec. cerr.; no evap. 3,1 Fuertemente DMS
Triple-Nula
Rec. cerr.; no evap. 5,0 Levemente ácido 2,7 2,0
Levemente lupuloso
Levemente ácido-amargo
Levemente granulado
Secado a baja temperatura de granos a 75°C
cv. Rosalina tipo salvaje
Recip ab.; evap. 4,8 Levemente frutal Marcadamente DMS
Triple-Nula
Recip ab.; evap. 5,2 Levemente amargo 2,1 0,7
Levemente ácido
*) Abreviaturas: Recipiente abierto (recip ab) o cerrado (rec. cerr.); no evaporación (no. evap.) o evaporación permitida (evap.) 1 En una escala de 1-9, donde 9 es lo mejor 2 En una escala de 0-5, donde 0 designa una cerveza fresca, y 5 una cerveza muy envejecida 3 En una escala de 0-5, donde 5 designa una cerveza con sabor extremo a papel
Tabla 15. THA en cervezas producidas a partir de malta del cv Rosalina y mutante Triple-Nula.
Tipo de cebada
Tipo de cocción *) 9.12.13-Hodea (mg/l) 9.10.13-Hodea (mg/l) 9.12.13-Hodea/ 9.10.13-Hodea
Secado normal a 85°C
cv. Rosalina tipo salvaje
Recip ab.; evap. 3,68 0,84 4,4
Triple-Nula
Recip ab.; evap. 0,75 0,29 2,5
cv. Rosalina tipo salvaje
Rec. cerr.; no evap. 3,28 0,78 4,2
Triple-Nula
Rec. cerr.; no evap. 0,51 0,23 2,2
Secado a baja temperatura a 75°C
cv. Rosalina tipo salvaje
Recip ab.; evap. 3,77 0,8 4,7
Triple-Nula
0,49 0,22 2,2
*) Abreviaturas: Recipiente abierto (recip ab) o cerrado (rec. cerr.); no evaporación (no. evap.) o evaporación permitida (evap.)
Tabla 16 Listado de secuencias
SEQ ID NO
Corresponde a Descripción
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:1 de la solicitud de patente internacional WO2005/087934 ADNg de cebada del cv. Barke que abarca los codones inicio y terminación del gen que codifica LOX-1
SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:2 de la solicitud de patente internacional WO2005/087934 ADNg de cebada del mutante D112 que abarca la región entre los codones inicio y terminación del gen correspondiente que codifica LOX-1 del cv. Barke
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:3 de la solicitud de patente internacional WO2005/087934 Secuencia proteica de la extensión completa de la proteína LOX-1 del cv. Barke
SEQ ID NO:4
SEQ ID NO:4 de la solicitud de patente internacional WO2005/087934 Secuencia proteica de LOX-1 truncada, inactiva del mutante D112
SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:1 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050355 publicada como WO2010/075860 La secuencia de ADN genómico de tipo salvaje que codifica LOX-2 a partir del cv. Barke.
SEQ ID NO:6
SEQ ID NO:2 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050355 publicada como WO2010/075860 La secuencia del ADN genómico de LOX-2 mutante a partir de cebada mutante A689.
SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:5 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050355 publicada como WO2010/075860 La secuencia de la proteína de longitud completa de LOX-2 de cebada tipo salvaje, cv. Barke.
SEQ ID NO:8
SEQ ID NO:6 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050355 publicada como WO2010/075860 La secuencia de la proteína mutante LOX-2 que carece de actividad de LOX-2 a partir de cebada mutante A689.
SEQ ID NO:9
SEQ ID NO 3: de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 publicada como WO2010/063288 ADNg de cebada del cv. Prestige, secuencia genómica que abarca los codones inicio y terminación del gen para MMT.
SEQ ID NO:10
SEQ ID NO:8 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 publicada como WO2010/063288 ADNg de cebada del Mutante 8063, secuencia genómica para MMT que abarca los codones de inicio y terminación del gen para MMT.
SEQ ID NO:11
SEQ ID NO:16 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 publicada como WO2010/063288 ADNg de cebada del cv. Sebastian, secuencia genómica para MMT que abarca los codones de inicio y terminación del gen para MMT.
SEQ ID NO:12
SEQ ID NO:19 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 publicada como WO2010/063288 ADNg de cebada del Mutante 14018, secuencia genómica para MMT que abarca los codones de inicio y terminación del gen para MMT.
SEQ ID NO:13
SEQ ID NO:6 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 publicada como WO2010/063288 Secuencia para MMT de cebada del cv. Prestige.
SEQ ID NO:14
SEQ ID NO:18 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 publicada como WO2010/063288 Secuencia para MMT de cebada del cv. Sebastian.
SEQ ID NO:15
SEQ ID NO:22 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 publicada como WO2010/063288 Secuencia completa traducida derivada de error en splicing de ARN del Mutante 14018 de cebada.
SEQ ID NO:16
SEQ ID NO:24 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 publicada como WO2010/063288 Secuencia completa traducida derivada de error en splicing de ARN del Mutante 14018 de cebada.
SEQ ID NO:17
SEQ ID NO:26 de la solicitud de patente internacional PCT/DK2009/050315 publicada como WO2010/063288 Secuencia completa traducida derivada de error en splicing del Mutante 14018 de cebada.
REFERENCIAS CITADAS
Documentos de Patentes
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Solicitud de patente PCT, WO 02/053721 de Douma, A.C. et al.
Solicitud de patente PCT, WO 2005/087934 de Breddam, K. et al.
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Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para preparar una bebida a base de cebada con bajos niveles de uno o más sabores indeseables y/o precursores de los mismos, donde el procedimiento implica un ingreso reducido de energía, comprendiendo el procedimiento las etapas de: 5
    (i) suministro de una planta de cebada o una parte de la misma, donde dicha planta de cebada comprende:
    (a) una primera mutación que produce una pérdida total de lipoxigenasa (LOX)-1 funcional; y
    (b) una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional; y
    (c) una tercera mutación que produce una pérdida total de S-adenosilmetionina:metionina S-metiltransferasa 10 funcional (MMT);
    (ii) opcionalmente malteado de al menos parte de dicha cebada, obteniendo así cebada malteada;
    (iii) maceración de dicha cebada y/o cebada malteada y opcionalmente adjuntos adicionales, obteniendo así un mosto;
    (iv) calentamiento de dicho mosto opcionalmente en presencia de ingrediente(s) adicional(es), donde como máximo 15 el 4% del volumen de mosto se evapora, obteniendo así mosto calentado;
    (v) procesamiento de dicho mosto calentado en una bebida;
    preparando así la bebida a base de cebada con bajos niveles de uno o más sabores indeseables y/o precursores de los mismos. 20
  2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, donde la etapa (i) comprende el suministro de granos de cebada.
  3. 3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicha 25 cebada es malteada usando un procedimiento que comprende las etapas de
    a) remojo de dicha cebada;
    b) germinación de dicha cebada;
    c) secado en horno de dicha cebada 30
    y donde el secado en horno de dicha cebada se realiza a una temperatura como máximo de 80°C, más preferentemente todavía a una temperatura como máximo de 75°C, tal como a una temperatura como máximo de 70°C, por ejemplo a una temperatura como máximo de 65°C, tal como a temperatura como máximo de 60°C, por ejemplo a una temperatura como máximo de 55°C, tal como a una temperatura como máximo de 50°C, por ejemplo 35 a una temperatura como máximo de 45°C, tal como a una temperatura como máximo de 40°C.
  4. 4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho mosto se calienta a una temperatura como máximo de 99,8°C, tal como como máximo 99,5°C, por ejemplo como máximo 99°C. 40
  5. 5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la etapa v) comprende fermentación del mosto.
  6. 6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el 45 procedimiento no implica el calentamiento a una temperatura superior a 80°C durante más de 30 min, preferentemente durante más de 20 min.
  7. 7. Una planta de cebada, o una parte de la misma, donde dicha planta de cebada comprende:
    50
    a) una primera mutación que produce una pérdida total de LOX-1 funcional, y
    b) una segunda mutación que produce una pérdida total de LOX-2 funcional y
    c) una tercera mutación que produce una pérdida total de MMT funcional.
  8. 8. La planta de cebada, o una parte de la misma, de acuerdo con la reivindicación 7, donde el gen que 55 codifica LOX-1 de dicha planta comprende un codón de terminación prematuro situado como máximo 705, preferentemente como máximo 665 codones corriente abajo del codón de inicio.
  9. 9. La planta de cebada, o una parte de la misma, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, donde el gen que codifica LOX-2 de dicha planta comprende un codón de terminación prematuro situado 60
    como máximo 707, preferentemente como máximo 684 codones corriente abajo del codón de inicio.
  10. 10. La planta de cebada, o una parte de la misma, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, donde la mutación en el gen que codifica MMT es una mutación dentro del sitio de splicing 5' de un intrón, tal como una mutación G→A de base del terminal 5' de un intrón. 5
  11. 11. La planta de cebada, o una parte de la misma, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde la mutación produce un gen que codifica una forma truncada de MMT que comprende un fragmento N-terminal de MMT de tipo salvaje y opcionalmente secuencias C-terminales no encontradas en MMT de tipo salvaje, donde dicho fragmento N-terminal comprende como máximo 500, más preferentemente como máximo 450, 10 más preferentemente todavía como máximo 400, más preferentemente todavía como máximo 350, más preferentemente todavía como máximo 320, más preferentemente todavía como máximo 311, o como máximo 288 residuos de aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 13.
  12. 12. Una composición de malta que comprende una planta de cebada procesada, o una parte de la misma, 15 donde dicha planta de cebada es la planta de cebada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.
  13. 13. Una bebida a base de cebada que puede prepararse a partir de una planta de cebada, o una parte de la misma, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, donde dicha bebida contiene un nivel de sulfuro de dimetilo (DMS) inferior a 10 ppb. 20
  14. 14. La bebida de acuerdo con la reivindicación 13, donde dicha bebida se prepara mediante el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  15. 15. La bebida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, donde la bebida es cerveza. 25
  16. 16. La bebida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, donde la bebida es una bebida de malta no alcohólica.
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