ES2600527B1 - Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias - Google Patents

Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias Download PDF

Info

Publication number
ES2600527B1
ES2600527B1 ES201530995A ES201530995A ES2600527B1 ES 2600527 B1 ES2600527 B1 ES 2600527B1 ES 201530995 A ES201530995 A ES 201530995A ES 201530995 A ES201530995 A ES 201530995A ES 2600527 B1 ES2600527 B1 ES 2600527B1
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
biosensor
sulphite
food samples
determination
sulfite
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
ES201530995A
Other languages
English (en)
Other versions
ES2600527A1 (es
Inventor
Roberto GONZÁLEZ RIOJA
Sonia MAZA DEL RÍO
Sandra SALLERES ALONSO
Arrate JAUREGUIBEITIA CAYROLS
Irune GONZALEZ URQUIDI
Alai ARANTZAMENDI EGIGUREN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biolan Microbiosensores SL
Original Assignee
Biolan Microbiosensores SL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biolan Microbiosensores SL filed Critical Biolan Microbiosensores SL
Priority to ES201530995A priority Critical patent/ES2600527B1/es
Priority to PCT/ES2016/070279 priority patent/WO2017005947A1/es
Priority to EP16820885.8A priority patent/EP3321670B1/en
Priority to US15/742,282 priority patent/US20180201970A1/en
Priority to ES16820885T priority patent/ES2817053T3/es
Publication of ES2600527A1 publication Critical patent/ES2600527A1/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2600527B1 publication Critical patent/ES2600527B1/es
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/40—Apparatus specially designed for the use of free, immobilised, or carrier-bound enzymes, e.g. apparatus containing a fluidised bed of immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias.#El sistema utiliza un biosensor amperométrico que comprende un sistema bi-enzimático; un electrodo de trabajo; un contra-electrodo; y un electrodo de referencia.#El sistema bi-enzimático está compuesto por las enzimas sulfito oxidasa humana y peroxidasa; y la inmovilización de las enzimas en el electrodo de trabajo se lleva a cabo mediante simple retención física. La mezcla de las enzimas se mezcla a su vez con un mediador químico.#El método comprende las fases de aplicación de una muestra al biosensor amperométrico; cambio de corriente eléctrica al entrar en contacto con el analito a detectar; y medir amperométricamente dicha corriente eléctrica en soluciones con agitación continua, utilizando un potencial constante.

Description

SISTEMA PARA MEDIR SULFITO EN MUESTRAS ALIMENTARIAS MEDIANTE BIOSENSOR; MÉTODO PARA LA DETERMINACiÓN DE SULFITO EN MUESTRAS ALIMENTARIAS UTILIZANDO EL CITADO BIOSENSOR; y USO DEL CITADO BIOSENSOR PARA MEDIR LOS VALORES DE SULFITO EN MUESTRAS ALIMENTARIAS
ESTADO DEL ARTE
Los sulfitos son aditivos alimentarios con propiedades antioxidantes y antimicrobianas que se utilizan en la industria alimentaria para mejorar la calidad, la apariencia y extender la vida útil de los alimentos y bebidas. En los crustáceos, los sulfitos se aplican después de la cosecha y durante todo el proceso de producción para evitar la melanosis. La adición de sulfitos inhibe la formación de manchas negras causadas por la oxidación enzimática de los monofenoles a melanina. La melanosis no tiene incidencia en el sabor de los crustáceos y no es perjudicial para los consumidores. Sin embargo, dichas manchas pueden afectar drásticamente la aceptabilidad del consumidor de los productos y disminuir significativamente su valor de mercado.
La legislación comunitaria sobre aditivos alimentarios se basa en el principio de que sólo los aditivos que están autorizados explícitamente se pueden utilizar. La mayoría de los aditivos alimentarios sólo se pueden usar en cantidades limitadas en determinados productos alimenticios y se enumeran en el Reglamento N° 1129/2011 , que modifica la CE nO 1333/2008. Este Reglamento enumera los aditivos alimentarios con niveles máximos permitidos diferentes de quantum satis. Para crustáceos y cefalópodos frescos y congelados la concentración máxima de sulfito (E220-E228) admitida es de 150 mg/kg.
Por otra parte, la Comisión del Codex Alimentarius nombra a los sulfitos como alérgenos prioritarios e indica que el control de la utilización de sulfito es importante para proteger a los consumidores sensibles al sulfito.
En alimentos y bebidas, el sulfito se encuentra unido reversiblemente en forma de aductos con compuestos carbonilo e hidroxisulfonados. Estos aductos son estables a bajo e intermedio pH y se disocian completamente a sulfito libre por encima de pH 9. A las formas libre y reversible de sulfito unido se las refiere como sulfito total. Tanto en forma libre como total, ambos son de interés para la industria alimentaria.
Un punto crítico de control en el procesamiento de crustáceos se establece para garantizar que el producto final no contiene una excesiva concentración de sulfito. Los límites críticos deben establecerse en todo el proceso para asegurar que el producto final cumple con los límites regulatorios y la supervisión periódica de la eficacia del tratamiento y los controles deben ser requeridos. Por lo tanto, la monitorización de sulfito debe ser una parte integral de un programa de la Firma de Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP).
El HACCP necesita ser rápido y conveniente para ser aplicado diariamente, pero los métodos actuales para la determinación de sulfito son complicados, consumen mucho tiempo y son subjetivos.
Dichos métodos tales como tiras de prueba, métodos enzimáticos o métodos basados en la valoración tienen grandes limitaciones, falsos positivos, y poca reproducibilidad y exactitud.
El método Monier-Williams optimizado (AOAC 962.16) ha sido ampliamente utilizado para determinar la concentración de sulfitos tola les en los productos alimenticios. Sin embargo, este método conlleva mucho tiempo de análisis, mano de obra, requiere personal técnico y muestra falsos positivos.
Por lo tanto, uno de los grandes retos de la industria de los crustáceos es lograr un sistema altamente sensible, rápido y portátil para la determinación de sulfito en crustáceos a fin de evitar que los productos contaminados lleguen al mercado. Los biosensores enzimáticos son soluciones adecuadas que se aplicarán para la determinación de los sulfitos en los alimentos, más concretamente en los crustáceos , como herramientas de costo simples, precisas, y rápidas.
OBJETO DE LA INVENCiÓN
El objeto del invento es un sistema para medir sulfito en muestras alimentarias, de forma simple y rapida mediante la utilización de un biosensor amperométrico enzimatico. Dicho sistema es bienzimatico compuesto por dos enzimas: sulfito oxidasa humana (EC 1.3.8.1) y peroxidasa, con simple retención física sobre una base conductora , de una alícuota liquida de estas enzimas mediante una membrana de dialisis junto con un mediador químico.
También es objeto del invento el biosensor enzimático, para la determinación de sulfito en muestras alimentarias.
También es objeto del invento el método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor.
También es objeto del invento el uso del sistema descrito, para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias.
Particularmente, las muestras alimentarias son crustaceos.
También es objeto del invento el dispositivo de medida resultante, que ha demostrado satisfactoria selectividad y estabilidad al sulfito como sustrato en matrices tales como los crustáceos.
Hoy en día no existe un biosensor comercial de sulfito aplicado a la industria agroalimentaria y ninguna enzima comercial está disponible.
5 El sistema objeto del invento ofrece unos resultados tanto o más fiables que el método de referencia (Monier-Williams) hoy utilizado, pero con unas características/particularidades ventajosas respecto a él que se reflejan de forma resumida en la siguiente tabla:
Método Monier-Williams optimizado (AOAC 962.16)
Objeto del invento
Procedimiento
Destilación ácida seguida de valoración Oxidación enzimática del sulfito, detección amperométrica
Tiempo de análisis
1 hora 3 Minutos
Simplicidad
Baja Media
Interpretación
Comparación con los estándares al comienzo de la valoración Resultado en pantalla
Limitación
Cuantificación limitada Calibración diaria
DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS
Para comprender mejor el objeto de la invención, se representa en las figuras adjuntas una forma
10 preferente de realización, susceptible de cambios accesorios que no desvirtúen su fundamento. En este caso:
La figura 1 representa el esquema de reacción para la determinación de sulfito.
La figura 2 representa la curva de calibrado para ver el rango de respuesta del biosensor al sulfito.
DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN
15 La presente invención preconiza un sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; un método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y el uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias.
Particularmente, las muestras alimentarias son crustáceos.
El biosensor utilizado es un biosensor amperométrico que comprende un sistema bi-enzimático; que está compuesto por dos enzimas: sulfito oxidasa humana (EC 1.3.8.1) y peroxidasa.
El citado biosensor amperométrico se compone de un sustrato, un electrodo de trabajo, un contra-electrodo y un electrodo de referencia. Preferiblemente, el biosensor se compone de un electrodo de trabajo de oro, un contra-electrodo de acero inoxidable y de un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata (Ag/AgCI).
Las enzimas se depositan en la superficie del electrodo de trabajo con simple retención física. Antes de depositarlas, sobre la superficie del electrodo de trabajo se deposita el mediador químico que puede comprender mediadores tales como Azul de Metileno, Azul de Meldola, Tetratiafulvaleno, Ferricianuro y Ferroceno, disueltos en solventes orgánicos tales como isopropanol, propanol, metanol y cloroformo. Preferiblemente, el mediador químico es Ferroceno disuelto en isopropanol.
El método objeto del invento comprende las fases de
a) aplicación de una muestra al biosensor amperométrico;
b) cambio de corriente eléctrica al entrar en contacto con el analito a detectar; y
c) medir amperométricamente dicha corriente eléctrica en soluciones con agitación continua, utilizando un potencial constante.
Antes de depositar las enzimas en el electrodo de trabajo, éstas se disuelven en un tampón carbonato/bicarbonato y/o CAPS y/o CAPSO 0,1 M en un rango de pHs de 8,0-11 ,1, siendo el pH óptimo de 10. Para dicha preparación, se trabaja con relaciones sulfito oxidasa:peroxidasa de 1 :1, 1:2, 1:3 y 1:4 en términos de unidades enzimáticas, siendo la relaci ón óptima 1:3.
A su vez, dicha combinación bi-enzimática comprende una solución de secado compuesta por trehalosa y/o glutamato sódico en el rango de 10-40%, siendo el valor óptimo del 30%.
Las enzimas depositadas sobre el electrodo de trabajo, se recubren mediante una membrana permeable u osmótica como las usadas en diálisis, previamente hidratada, con un peso molecular nominal límite en el rango de 5-50 kilodaltons (kDa), siendo el óptimo 6-10 kDa.
Posteriormente, para su uso, el biosensor se hidrata en la solución de medida que corresponde al tampón carbonato/bicarbonato 0,1 M en un rango de pHs de 8,0-11 ,1, siendo el pH óptimo de 10.
El esquema biocatalítico para la determinación del sulfito en crustaceos sería el siguiente:
A pH 10 todo el dióxido de azufre presente en la muestra (tanto el libre como el combinado) está en forma de S03-(forma sulfito).
La enzima sulfito oxidasa media en la oxidación del sulfito a sulfato generando peróxido de
5 hidrogeno en presencia de oxigeno. La subsecuente reducción catalítica del peróxido generado mediante la peroxidasa (HRP), es la medida indirecta del sulfito oxidado. El ferroceno se usa como mediador químico para esta última reacción enzimática, por tanto, la señal amperométrica que se usa para la lectura de este esquema de reacciones corresponde a la reducción de dicho mediador, tal y como se indica en la figura 1, que representa un esquema de reacción para la
10 determinación de sulfito.
El nivel de sulfito en una muestra se determina aplicando la muestra al biosensor y midiendo la señal de corriente a un potencial que se encuentra en el rango de O a 50 mV. Preferentemente, el voltaje de la corriente eléctrica utilizada para la determinación de sulfito es aproximadamente O mV.
15 El pH para la determinación de sulfito se encuentra en el rango de 8,0 a 11,1. Preferentemente, el pH para la determinación de sulfito es aproximadamente 10,0.
Dicho biosensor en conjunto con una cubeta de medida y un agitador es a lo que denominamos celda electroquímica que consta de los siguientes elementos:
-
Electrodo de trabajo;
20 -Contraelectrodo;
-
Electrodo de referencia;
-
Cubeta me medida; y
-
Agitador
El biosensor tiene un rango de respuesta de 50-300 ppm de sulfito; y además la respuesta lineal
25 es total en dicho rango, tal y como se muestra en la figura 2, que representa el rango de respuesta del biosensor (curva de calibrado de 50 a 300 mg/kg). De esta manera, se cubre el rango marcado por el Reglamento N° 1129/2011 , que enumera los aditivos alimentarios con niveles máximos permitidos para crustáceos y cefalópodos frescos y congelados; siendo dicho valor 150 ppm.
Se construye una recta de calibrado de 5 puntos (sin incluir el blanco), y de 3 réplicas para cada concentración. Se evalúa la linealidad comprobando el coeficiente de regresión r2 y el Factor Respuesta/Concentración.
Una vez comprobada la linealidad en el rango de 50 a 300 mg/kg, se estudia si las calibraciones
5 rutinarias realizadas por el biosensor (2 puntos) son lo suficientemente estables para garantizar la exactitu d y precisión durante la vida útil del biosensor. Para ello se realizaron 23 calibraciones con 5 biosensores distintos, de modo que se comprobó la estabilidad de la pendiente (m), del coeficiente de regresión lineal (r'). Los criterios de aceptación propuestos son los siguientes:
-
El % RSD de la pendiente no excederá del 15 %
10 -Ninguna recta tendrá un r'< 0,995 (R <0,99)
Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:
BIOSENSOR
r' PENDIENTE (m) PUNTO DE CORTE (b)
Biosensor 1
0,9986 -268451,72 -9,19
Biosensor 1
0,9998 -216795,02 -2,08
Biosensor 1
0,9997 -212064,04 -3,3
Biosensor 1
0,9997 -213370,52 -3,38
Biosensor 1
0,9999 -216305,44 -1 ,96
Biosensor 2
0,9999 -252625,28 -1 ,21
Biosensor 2
0,9997 -238793,58 -3,21
Biosensor 2
0,9997 -260319,96 -3,89
Biosensor 2
0,9999 -160476,95 -0,16
Biosensor 2
0,9998 -162145,8 1,92
Biosensor 3
0,9994 -158693,02 -3,36
Biosensor 3
0,9998 -199188,24 -2,5
Biosensor 3
0,9999 -200175,32 -1,59
Biosensor 3
0,9987 -207896,64 -6,96
Biosensor 3
0,9994 -175763,08 3,96
Biosensor 4
0,9999 -165459,56 0,9
Biosensor 4
0,9999 -241312,66 -0,55
Biosensor 4
0,9999 -224968,14 1,14
Biosensor 4
0,9999 -225537,96 -0,47
Biosensor 5
0,9998 -254172,28 -2,75
Biosensor 5
0,9998 -240394,24 -3,07
Biosensor 5
0,9992 -226618,6 -5,68
Biosensor 5
0,9989 -217246,88 -6,48
MEDIA
0,9996 -214729,35 -2,34
SD
0,0004 32738,83 3
RSD (%)
0,04 15 -
MÁXIMO
0,9999 -158693,02 3,96
MíNIMO
0,9986 -268451 ,72 -9,19
El método se considera preciso en todo el rango de trabajo, desde 50 a 300 mg/kg y en las matrices objeto de ensayo (langostino crudo y cocido), de acuerdo a los criterios de RSD HORWITZ
Durante la vida útil del biosensor. la estabilidad de las rectas de calibrado se considera adecuada.
5 La exactitud es el grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de referencia aceptado. Dicha exactitud se obtiene mediante el estudio de recuperaciones, en todo el rango de trabajo, desde 50 hasta 300 mg/kg , de modo que en cada nivel de concentración se analizan las dos matrices de estudio (langostino crudo y cocido). Se considera el método de buena exactitud si la recuperación media en todos los niveles de concentración, cumple los criterios establecidos por
10 AOAC. La siguiente tabla muestra los resultados:
PLANIFICACiÓN Y RESULTADOS
EXACTITUD
RECUPERACiÓN
VALOR DE REFERENCIA (mglkg )
MATRIZ N° Réplicas % REC. MEDIO CRITERIO Aceptación
50
LANGOSTINO CRUDO 4 84 80-110 SI
LANGOSTINO COCIDO
4
100
LANGOSTINO CRUDO 4 96 90-107 SI
LANGOSTINO COCIDO
4
200
LANGOSTINO CRUDO 4 92 90-107 SI
LANGOSTINO COCIDO
4
300
LANGOSTINO CRUDO 4 96 90-107 SI
LANGOSTINO COCIDO
4
El método se considera exacto en todo el rango de concentración, desde 50 a 300 mg/kg, en las matrices objeto de ensayo (langostino crudo y cocido), de acuerdo a los intervalos de recuperación aceptables establecidos por AOAC.
Por otra parte, se determina el grado de concordancia entre resultados de ensayos
15 independientes obtenidos en condiciones predeterminadas. Dicha precisión se suele expresar como imprecisión mediante el cálculo de desviaciones estándar relativas y/o el cociente Horrat. Para obtener la máxima imprecisión se ha considerado en todos los niveles de concentración, la máxima variabilidad de matrices (especies, productos frescos y elaborados, .. ), medidas a lo largo de la vida del biosensor, etc.
20 La siguiente tabla muestra los resultados:
Muestra
Biosensor Monier-Williams modificado Intervalo de incertidumbre Monier-Williams modificado Aceptación
1
180,9 214 166-262 Si
2
195,5 224 176-272 Si
3
216 236 184-288 Si
4
104,76 115 90-140 Si
5
112,06 128 100-156 Si
6
137,06 127 99-155 Si
7
131 ,5 117 92-142 Si
8
183,82 194 150-238 Si
9
81 96 74-118 Si
10
68 81 62-100 Si
11
156 165 130-200 Si
12
155 190 146-234 Si
13
97 121 96-146 Si
14
121 143 112-171 Si
15
120 131 103-159 Si
16
226 222 174-270 Si
17
181 241 189-293 No
18
96 122 94-150 Si
19
155 176 137-215 Si
20
117 163 128-198 No
21
127 162 127-197 Si
22
165,96 202 158-246 Si
23
124,16 154 119-189 Si
24
117,16 130 102-158 Si
25
107 135 107-163 Si
26
60,28 55 42-68 Si
27
75,28 67 51-83 Si
28
75,18 92 73-111 Si
29
294,8 337 265-409 Si
30
86,12 84 65-103 Si
31
58,16 63 50-76 Si
32
61 ,02 75 59-91 Si
33
88,02 102 80-124 Si
34
22,34 21 16-26 Si
35
41 ,58 46 35-57 Si
36
76,1 84 65-103 Si
37
132,2 166 131-201 Si
38
172,54 206 162-250 Si
39
70,6 90 71-109 Si
40
72,52 84 65-103 Si
41
65,26 75 59-91 Si
42
64,6 78 62-94 Si
43
79,84 88 69-107 Si
44 70 64 51-77 Si
El método se considera preciso en todo el rango de trabajo, desde 50 a 300 mg/kg y en las matrices objeto de ensayo (langostino crudo y cocido), de acuerdo a los criterios de RSD HORW ITZ.
Para asegurar que los resultados obtenidos son adecuados se realizó un estudio comparativo con
5 el método modificado Monier Williams para determinación de sulfitos en muestras en las que se encuentren presentes otros compuestos volátiles de azufre. Se basa en la transformación de los sulfitos en S02. El S02 es oxidado a H2S04 que finalmente es valorado con una disolución estandarizada de NaOH. El método modificado Monier Williams está basado en el método de la AOAC, Sulfurous Acid (Total) in Food, Optimized Monier-Williams Method. 990.28, pp29, 1995.
10 Este método se emplea con frecuencia en el control oficial de sulfitos en alimentos.
Para ello se analizaron un total de 44 muestras de langostinos cocidos y crudos tanto por el método de Monier-Williams modificado como por el método objeto del invento. Los resultados obtenidos se muestran en la anterior tabla.
El estudio comparativo con el método modificado de Monier-Williams, muestra un valor de 15 fiabilidad del 95%.
Por último, se determina la vida útil del biosensor en relación a su almacenamiento y número de medidas que puede soportar. Para ello, se testan una serie de biosensores con O, 15, 30, 60 Y 90 días de secado almacenados a 3-8°C, e hidratados a día 1, 7 Y 15 tras su secado. Los resultados se muestran en la siguiente tabla :
lote calibración nO de medidas cumuladas
lote calibración nO de medidas cumuladas
lote calibración nO de medidas cumuladas
TO
Hl
IH7 I H1 5
Biosensor 1
Biosensor 1
Biosensor 1
R = 0,9996
R = 0,9999 R = 0,9999
110
105 108
T15
Hl
IH7 IH1 5
Biosensor 2
Biosensor 2
Biosensor 2
R=O,9999
R=O,9999
R=O,9998
107
110 104
T30
Hl
IH7 IH1 5
Biosensor 3
Biosensor 3
Biosensor 3
R = O, 9999
R=O,9999 R= 0,9998
104
110 120
T60
lote calibración nO de medidas cumuladas
lote calibración nO de medidas cumuladas
H1
I H7 I H15
Biosensor 4
Biosensor 4
Biosensor 4
R=0,9993
R=0,9999
R=0,9993
105
105
110
T90
H1
IH7 IH15
Biosensor 2
Biosensor 2
Biosensor 2
R=0,9999
R=0,9999
R=0,9999
115
105 108
siendo:
10= O días de almacenamiento en seco T15= 15 días de almacenamiento en seco T30= 30 días de almacenamiento en seco T60= 60 días de almacenamiento en seco T90= 90 días de almacenamiento en seco H1= 1 dia hidratado H7= 7 días hidratado H15= 15 dias hidratado
l os biosensores son capaces de aguantar un mínimo de 100 medidas en cualquiera de las condiciones anteriormente mencionadas mostrando una perfecta calibración.
EJEMPLOS DE REALIZACiÓN PREFERENTE
5 Para una mejor comprensión de la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos, descritos en detalle, que deben entenderse sin carácter limitativo del alcance de la presente invención.
Ejemplo 1. Determinación se sulfito total en gamba cruda
Limpiar y desechar el caparazón , el cefalotórax y otras partes no comestibles del exoesqueleto y
10 tracto digestivo visible. A continuación, homogeneizar la muestra con ayuda de una picadora. Pesar 2 gr del homogeneizado y mezclarlo con 18 mi de solución de extracción (tampón 0,1M CAPS pH 9,5). Agitar vigorosamente 30 segundos y aplicar ultrasonidos de alta intensidad durante 20 minutos con pulsos de 20 segundos y una amplitud del 60%; dejar atemperar antes de procede al análisis.
15 Añadir 1 mL del homogeneizado a la celda electroquímica con 10 mL de tampón 0,1M CAPS pH 9,5, con agitación constante y comenzar la medida amperométrica en el biosensor a un potencial de O mV.
Ejemplo 2. Determinación se sulfito total en langostino cocido 11
Limpiar y desechar el caparazón, el cefalotórax y otras partes no comestibles del exoesqueleto y tracto digestivo visible. A continuación, homogeneizar la muestra con ayuda de una picadora. Pesar 5 gr del homogeneizado y mezclarlo con 40 mi de solución de extracción (tampón 0,1 M CAPSO pH 10,0). Agitar vigorosamente 30 segundos y aplicar ultrasonidos de baja inlensidad
5 durante 30 minutos a 45°C; dejar atemperar antes de procede al análisis.
Añadir 1 mL del homogeneizado a la celda electroquímica con 10 mL de tampón O,1M CAPSO pH 10,0, con agitación constante y comenzar la medida amperométrica en el biosensor a un potencial de O mV.
Ejemplo 3. Determinación se sulfito total en langostino crudo
10 Limpiar y desechar el caparazón , el cefalotórax y otras partes no comestibles del exoesqueleto y tracto digestivo visible. A continuación, homogeneizar la muestra con ayuda de una picadora. Pesar 2 gr del homogeneizado y mezclarlo con 10 mi de solución de extracción (tampón 0,1 M carbonato/bicarbonato pH 10,0). Agitar vigorosamente 30 segundos y aplicar ultrasonidos de baja intensidad durante 20 minutos a 40°C; dejar atemperar antes de procede al análisis. Para eliminar
15 las trazas de muestra en suspensión, se procederá a filtrar/centrifugar la muestra antes de inyectarla en el equipo.
Añadir 1 mL del homogeneizado a la celda electroquímica con 10 mL de tampón 0,1M carbonato/bicarbonato pH 10,0, con agitación constante y comenzar la medida amperométrica en el biosensor a un potencial de O mV.

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor, caracterizado porque utiliza un biosensor amperométrico que comprende: a) un sistema bi-enzimático; b) un electrodo de trabajo; e) un contra-electrodo; y d) un electrodo de referencia
  2. 2.-El biosensor de la reivindicación 1, caracterizado porque el electrodo de trabajo es oro. 3.-El biosensor de la reivindicación 1, caracterizado porque el contra-electrodo es acero inoxidable.
  3. 4.-El biosensor de la reivindicación 1, caracterizado porque el electrodo de referencia es un
    electrodo de cloruro de plata (Ag/AgCI). 5.-El biosensor de la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema bi-enzimático está compuesto por las enzimas sulfito oxidasa humana y peroxidasa.
  4. 6.-El biosensor de la reivindicación 5, caracterizado porque la inmovilización de las enzimas en el
    electrodo de trabajo se lleva a cabo mediante simple retención física. 7.-El biosensor de las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque la mezcla de las enzimas se mezcla a su vez con un mediador químico.
  5. 8.-El biosensor de la reivindicación 7, caracterizado porque el mediador químico es ferroceno
    disuelto en isopropanol. 9.-Método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el biosensor amperométrico de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende las fases de:
    a) aplicación de una muestra al biosensor amperométrico; b) cambio de corriente eléctrica al entrar en contacto con el analito a detectar; y c) medir amperométricamente dicha corriente eléctrica en soluciones con agitación continua,
    utilizando un potencial constante.
  6. 10.-El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el voltaje de la corriente eléctrica utilizada para la determinación de sulfito se encuentra en el rango de O a 50 mV.
  7. 11.-El método de la reivindicación 10, en donde el voltaje de la corriente eléctrica utilizada para la determinación de sulfito es aproximadamente O mV.
    5 12.-El método de la reivindicación 9, en donde el pH para la determinación de sulfito se encuentra en el rango de 8,0 a 11 ,1.
  8. 13.-El método de la reivindicación 12, en donde el pH para la determinación de sulfito es aproximadamente 10,0.
  9. 14.-Uso del biosensor de las reivindicaciones 1 a 7 para medir los valores de sulfito en muestras 10 alimentarias.
ES201530995A 2015-07-09 2015-07-09 Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias Expired - Fee Related ES2600527B1 (es)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201530995A ES2600527B1 (es) 2015-07-09 2015-07-09 Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias
PCT/ES2016/070279 WO2017005947A1 (es) 2015-07-09 2016-04-19 Sistema y método para medir sulfíto en muestras alimentarias mediante biosensor amperométrico y uso del biosensor.
EP16820885.8A EP3321670B1 (en) 2015-07-09 2016-04-19 System and method for measuring sulphite in food samples using an amperometric biosensor and the use of said biosensor
US15/742,282 US20180201970A1 (en) 2015-07-09 2016-04-19 System and method for measuring sulphite in food samples using an amperometric biosensor and the use of said biosensor
ES16820885T ES2817053T3 (es) 2015-07-09 2016-04-19 Sistema y método para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor amperométrico y uso de dicho biosensor

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES201530995A ES2600527B1 (es) 2015-07-09 2015-07-09 Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2600527A1 ES2600527A1 (es) 2017-02-09
ES2600527B1 true ES2600527B1 (es) 2018-01-17

Family

ID=57685013

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES201530995A Expired - Fee Related ES2600527B1 (es) 2015-07-09 2015-07-09 Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias
ES16820885T Active ES2817053T3 (es) 2015-07-09 2016-04-19 Sistema y método para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor amperométrico y uso de dicho biosensor

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16820885T Active ES2817053T3 (es) 2015-07-09 2016-04-19 Sistema y método para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor amperométrico y uso de dicho biosensor

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20180201970A1 (es)
EP (1) EP3321670B1 (es)
ES (2) ES2600527B1 (es)
WO (1) WO2017005947A1 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115711927B (zh) * 2022-11-25 2025-02-07 大唐环境产业集团股份有限公司 一种亚硫酸盐生物传感器及其制备方法和测量方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3313178A1 (de) * 1983-04-12 1984-10-18 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur enzymatischen bestimmung von sulfit
SE9902608D0 (sv) * 1999-07-06 1999-07-06 Forskarpatent I Syd Ab Histamine detection and detector
US6673222B1 (en) * 2001-03-16 2004-01-06 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Natural Resources Biological activity probe
CN100533136C (zh) * 2002-08-13 2009-08-26 郡是株式会社 生物传感器及其制造方法
US20090061524A1 (en) * 2005-04-15 2009-03-05 Judith Rishpon Enzyme-Channeling Based Electrochemical Biosensors
US7611621B2 (en) * 2005-06-13 2009-11-03 Nova Biomedical Corporation Disposable oxygen sensor and method for correcting oxygen effect on oxidase-based analytical devices
EP2232249A4 (en) * 2007-12-13 2014-04-16 Univ Monash ELECTROCHEMICAL NANO COMPOSITE BIOSENSOR SYSTEM
ES2337328B1 (es) * 2008-07-24 2011-02-14 Inbea Biosensores, S.L. Biosensor amperometrico desechable, metodo de fabricacion del mismo ymetodo de determinacion de la presencia de analitos en alimentos.
ES2524991B2 (es) * 2013-06-12 2016-01-04 Universidad De Burgos Dispositivo electródico para la detección de sulfitos, procedimiento de fabricación y uso de dicho dispositivo

Also Published As

Publication number Publication date
ES2817053T3 (es) 2021-04-06
EP3321670A4 (en) 2019-01-02
EP3321670B1 (en) 2020-06-17
WO2017005947A1 (es) 2017-01-12
ES2600527A1 (es) 2017-02-09
EP3321670A1 (en) 2018-05-16
US20180201970A1 (en) 2018-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Heuer et al. Altered brain ion gradients following compensation for elevated CO2 are linked to behavioural alterations in a coral reef fish
Campanella et al. Biosensors for determination of total and natural antioxidant capacity of red and white wines: comparison with other spectrophotometric and fluorimetric methods
US9927389B2 (en) Electrochemical sensors for testing water
Matemadombo et al. Comparison of carbon screen-printed and disk electrodes in the detection of antioxidants using CoPc derivatives
CN103439323A (zh) 一种过氧化氢残留的快速测定方法
Yoshida et al. Bitterness evaluation of acidic pharmaceutical substances (NSAIDs) using a taste sensor
Gaber et al. Determination of benzalkonium chloride preservative in pharmaceutical formulation of eye and ear drops using new potentiometric sensors
Sezgintürk et al. Direct determination of sulfite in food samples by a biosensor based on plant tissue homogenate
US20220365076A1 (en) Marker and sensing system using the same
US10241072B2 (en) Electrochemical sensors for testing water
Campos et al. Monitoring grape ripeness using a voltammetric electronic tongue
Barbosa et al. Immobilized dye-decolorizing peroxidase (DyP) and directed evolution variants for hydrogen peroxide biosensing
ES2600527B1 (es) Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias
Lin et al. Mapping the antioxidant activity of apple peels with soft probe scanning electrochemical microscopy
Thomas et al. The use of novel optode sensor technologies for monitoring dissolved carbon dioxide and ammonia concentrations under live haul conditions
US20050011771A1 (en) Chlorite sensor
Sirca et al. A robust, state-of-the-art amperometric microbiosensor for glutamate detection
ES2643417T3 (es) Sensor y procedimiento para detectar androstenona o escatol en el olor a verraco
FR2503372A1 (fr) Procede et dispositif pour determiner l&#39;etat acide-base du sang
Jaramillo et al. Acetycholine and choline ion-selective microelectrodes
Galović et al. Application of a new potentiometric sensor for determination of anionic surfactants in wastewater
US11852638B2 (en) Calcium ion concentration measuring device
JP2005110535A (ja) 残留農薬測定方法
Campanella et al. Determination of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in milk and fresh cheese based on the inhibition of cyclooxygenase.
RU2477469C1 (ru) Способ контроля качества меда

Legal Events

Date Code Title Description
FG2A Definitive protection

Ref document number: 2600527

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: B1

Effective date: 20180117

FD2A Announcement of lapse in spain

Effective date: 20211203