ES2600882T3 - Procedimiento de clasificación del cáncer de endometrio - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de clasificación del tipo de cáncer de endometrio como un cáncer de endometrio inducido por la activación del receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR2) en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la exploración in vitro de una mutación de receptor en un FGFR2 en una muestra biológica que contiene células del cáncer de endometrio, en el que la mutación del FGFR2 se asocia con activación del receptor FGFR2 que aumenta el nivel de actividad de la ruta de transducción de la señal de FGFR2 en comparación con un control, y clasificar el tipo de cáncer de endometrio como un cáncer de endometrio inducido por la activación del FGFR2 tras detectar una mutación de activación del FGFR2 en las células de cáncer de endometrio, en el que la mutación es una sustitución de un aminoácido del FGFR2 que se selecciona de entre el grupo que consiste en: (a) una mutación de S por W en la posición 252 de SEQ ID NOS: 2 o 3; (b) una mutación de K por R en la posición 310 de SEQ ID NOS: 2 o 3; (c) una mutación de A por T en la posición 315 de SEQ ID NO: 3; (d) una mutación de S por C en la posición 373 de SEQ ID NO: 2 o la posición 372 de SEQ ID NO: 3; (e) una mutación de Y por C en la posición 376 de SEQ ID NO: 2 o la posición 375 de SEQ ID NO: 3; (f) una mutación de C por R en la posición 383 de SEQ ID NO: 2 o la posición 382 de SEQ ID NO: 3; (g) una mutación de M por R en la posición 392 de SEQ ID NO: 2 o la posición 391 de SEQ ID NO: 3; (h) una mutación de I por V en la posición 548 de SEQ ID NO: 2 o la posición 547 de SEQ ID NO: 3; (i) una mutación de N por K en la posición 550 de SEQ ID NO: 2 o la posición 549 de SEQ ID NO: 3; o (j) una mutación de K por E en la posición 660 de SEQ ID NO: 2 o la posición 659 de SEQ ID NO: 3, o la mutación es una sustitución en un nucleótido que se selecciona de entre el grupo que consiste en: (i) una mutación de A por G en la posición 929 de SEQ ID NO: 1; (ii) una mutación de T por G en la posición 1650 de SEQ ID NO: 1; (iii) una mutación de C por G en la posición 755 de SEQ ID NO: 1; (iv) una mutación de T por A en la posición 1650 de SEQ ID NO: 1; (v) una mutación de A por G en la posición 1127 de SEQ ID NO: 1; (vi) una mutación de C por G en la posición 1118 de SEQ ID NO: 1; (vii) una mutación de T por C en la posición 1147 de SEQ ID NO: 1; (vii) una mutación de T por G en la posición 1175 de SEQ ID NO: 1; (ix) una mutación de A por G en la posición 1642 de SEQ ID NO: 1; (x) una mutación de A por G en la posición 1978 de SEQ ID NO: 1.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

DESCRIPCION

Procedimiento de clasificacion del cancer de endometrio Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a procedimientos y kits para diagnosticar, clasificar, y tratar el cancer de endometrio.

Antecedentes de la invencion

El cancer de endometrio es el trastorno maligno del tracto reproductor femenino que se diagnostica mas comunmente en los Estados Unidos. Se estima que se diagnosticanan 39.080 nuevos casos de cancer de cuerpo uterino y que morinan 7.400 mujeres en 2007 por esta enfermedad en los Estados Unidos (Jemal A, Siegel R, Ward E, Murray T, Xu J, Thun MJ. CA Cancer J Clin 2007 Ene-Feb; 57(1):43-66). La mayona de mujeres que presentan un cancer de endometrio se curan quirurgicamente con una histerectoirna; sin embargo, aproximadamente el 15 % de las mujeres presentan tumores persistentes o recurrentes que son refractarios a las quimioterapias actuales. Para estas mujeres con un estadio avanzado, progresivo o de enfermedad recurrente, la supervivencia es baja ya que no hay terapias adyuvantes que hayan probado su eficacia. La supervivencia media tras la recurrencia es de diez meses (Jereczek- Fossa B, Badzio A, Jassem J., Int J Gynecol Cancer 1999 Jul; 9(4):285-94) y la supervivencia a los cinco anos para las pacientes que tienen recurrencia es solo del 13 % (Creutzberg CL, van Putten WL, Koper PC, y col., Lancet 2000 Abr 22; 355(9213):1404-11).

Los carcinomas malignos a menudo presentan mutaciones en multiples oncogenes y genes supresores del tumor, presentan alteraciones en la expresion de cientos de genes, y contienen distintas anormalidades cromosomicas. A pesar de esta complejidad genomica, se ha demostrado que dirigiendose a anormalidades moleculares espedficas se produce una rapida regresion de los tumores humanos, tal como se ha visto con los inhibidores de tirosina cinasa Imatinib (Gleevec) y Gefitinib (Iressa). Para explicar este fenomeno, Bernard Weinstein introdujo la expresion “adiccion oncogenica”. El propuso que el circuito de senalizacion de una celula tumoral se reprograma en presencia de una actividad oncogenica de manera que la celula tumoral depende de esta actividad oncogenica para la supervivencia y crecimiento celular (Weinstein IB. Science 2002 Jul 5; 297(5578):63-4). Ademas, los datos experimentales y clmicos apoyan este concepto de adiccion oncogenica, y ademas, sugieren que pueden estar implicados en la adiccion oncogenica multiples mecanismos de activacion oncogenica, que incluyen la mutacion, reordenacion, y sobre-expresion (Weinstein Ib, Joe AK., Nat Clin Pract Oncol 2006 Ago; 3(8):448-57).

Se ha informado de una variedad de defectos geneticos somaticos en el carcinoma de endometrio. Los carcinomas de endometrio endometrioides representan aproximadamente el 80 % de los canceres uterinos. Se caracterizan por una alta frecuencia de mutaciones inactivadoras de PTEN (26-80%), mutaciones activadoras KRAS2 (13-26%) y mutaciones de p-catenina de ganancia de funcion (25-38%) (Hecht JL, Mutter GL., J Clin Oncol 2006 Oct 10; 24(29):4783-91, Shiozawa T, Konishi I., Int J Clin Oncol 2006 Feb; 11(1):13-21). Se ha informado de mutaciones de ganancia de funcion de la lmea germinal en FGFR1, 2 y 3 en una variedad de smdromes de craneosinostosis y smdromes de condrodisplasia. Las correlaciones genotipo/fenotipo en esos trastornos son complejas, con mas de 14 smdromes clmicos asociados con mutaciones en uno de los tres receptores y varios smdromes clmicos, por ejemplo, el smdrome de Pfeiffer y Crouzon asociado con mutaciones en diferentes receptores (Passos-Bueno MR, Wilcox WR, Jabs EW, Sertie AL, Alonso LG y Kitoh H. (1999), Hum Mutat 14: 115-125, Wilkie AO, Patey SJ, Kan SH, van den Ouweland AM y Hamel BC. (2002), Am J Med Genet 112: 266-278).

Aunque se han hecho muchos progresos en el entendimiento de la base biologica del cancer y en su diagnostico y tratamiento, sigue siendo una de las causas principales de muerte en los Estados Unidos. Las dificultades inherentes al diagnostico y el tratamiento del cancer incluyen entre otras cosas, la existencia de muchos subgrupos diferentes de cancer y la variacion concomitante en las estrategias apropiadas de tratamiento para maximizar la probabilidad de un resultado positivo para el paciente. Ademas, hay un amplio intervalo de subgrupos de cancer de endometrio y variaciones en la progresion de la enfermedad. Para tratar apropiadamente el cancer de endometrio y para maximizar las oportunidades de un tratamiento satisfactorio es importante que se identifique el tipo o subtipo de cancer de endometrio lo antes posible.

Por lo tanto, existe actualmente la necesidad de un procedimiento para detectar y clasificar el cancer de endometrio con el fin de seleccionar el regimen de tratamiento optimo y apropiado. Una vez detectado y clasificado, existe la necesidad adicional de procedimientos mejorados para tratar el cancer de endometrio basandose en el tipo de cancer de endometrio para maximizar las oportunidades de un tratamiento satisfactorio o para inhibir la recurrencia de la enfermedad en el sujeto.

Sumario de la invencion

La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas. Identificando y correlacionando las mutaciones de activacion del receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR2) con el cancer de endometrio, los inventores proporcionan en el presente documento herramientas utiles para diagnosticar, clasificar, y tratar el cancer de endometrio en un sujeto.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Asf, la invencion proporciona:

1. Un procedimiento de clasificacion del tipo de cancer de endometrio como un cancer de endometrio inducido

por la activacion del receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR2) en un sujeto, comprendiendo el

procedimiento la exploracion in vitro de una mutacion de receptor en un FGFR2 en una muestra biologica que contiene celulas del cancer de endometrio, en el que la mutacion del FGFR2 se asocia con activacion del receptor FGFR2 que aumenta el nivel de actividad de la ruta de transduccion de la senal de FGFR2 en comparacion con un control, y clasificar el tipo de cancer de endometrio como un cancer de endometrio inducido por la activacion del FGFR2 al detectar una mutacion de activacion del FGFR2 en las celulas de cancer de endometrio, en el que la mutacion es una sustitucion de un aminoacido del FGFR2 que se selecciona de entre el grupo que consiste en:

(a) una mutacion de S por W en la posicion 252 de SEQ ID NO: 2 o 3;

(b) una mutacion de K por R en la posicion 310 de SEQ ID NO: 2 o 3;

(c) una mutacion de A por T en la posicion 315 de SEQ ID NO: 3;

(d) una mutacion de S por C en la posicion 373 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 372 de SEQ ID NO: 3;

(e) una mutacion de Y por C en la posicion 376 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 375 de SEQ ID NO: 3;

(f) una mutacion de C por R en la posicion 383 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 382 de SEQ ID NO: 3;

(g) una mutacion de M por R en la posicion 392 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 391 de SEQ ID NO: 3;

(h) una mutacion de I por V en la posicion 548 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 547 de SEQ ID NO: 3;

(i) una mutacion de N por K en la posicion 550 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 549 de SEQ ID NO: 3; o

(j) una mutacion de K por E en la posicion 660 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 659 de SEQ ID NO: 3,

o la mutacion es una sustitucion en un nucleotido que se selecciona de entre el grupo que consiste en:

(i) una mutacion de A por G en la posicion 929 de SEQ ID NO: 1;

(ii) una mutacion de T por G en la posicion 1650 de SEQ ID NO: 1;

(iii) una mutacion de C por G en la posicion 755 de SEQ ID NO: 1;

(iv) una mutacion de T por A en la posicion 1650 de SEQ ID NO: 1;

(v) una mutacion de A por G en la posicion 1127 de SEQ ID NO: 1;

(vi) una mutacion de C por G en la posicion 1118 de SEQ ID NO: 1;

(vii) una mutacion de T por C en la posicion 1147 de SEQ ID NO: 1;

(vii) una mutacion de T por G en la posicion 1175 de SEQ ID NO: 1;

(ix) una mutacion de A por G en la posicion 1642 de SEQ ID NO: 1;

(x) una mutacion de A por G en la posicion 1978 de SEQ ID NO: 1.

2. El procedimiento del parrafo 1, en el que cuando la mutacion de FGFR2 es una sustitucion de un nucleotido, la sustitucion en un nucleotido se explora en el ADN, ARN y/o ADNc genomicos.

3. El procedimiento del parrafo 1, en el que se detectan al menos dos mutaciones de activacion de receptor del FGFR2 en las celulas del cancer de endometrio.

4. El procedimiento del parrafo 1, en el que tambien se detecta una mutacion inactivadora de PTEN en la muestra biologica.

5. El procedimiento del parrafo 1, en el que se utiliza la clasificacion para desarrollar un tratamiento para un sujeto que tiene un cancer de endometrio.

6. El procedimiento del parrafo 1, en el que la mutacion da como resultado un aumento de la union al ligando, una afinidad promiscua por el ligando, dimerizacion constitutiva del receptor, reciclado deficiente con retraso de la degradacion, o activacion de cinasas, activando de esta manera el receptor FGFR2.

7. El procedimiento del parrafo 1, en el que el cancer es un subtipo histologico endometrioide.

8. El procedimiento del parrafo 1, en el que el sujeto es un ser humano y el FGFR2 es un mutante constitutivamente activo.

Preferentemente, la etapa de deteccion comprende la exploracion en la muestra biologica de al menos una mutacion de nucleotidos de FGFR2 en al menos un acido nucleico del ADN, ARN o ADNc genomico. En ciertas realizaciones la mutacion de activacion da como resultado al menos una sustitucion de aminoacidos en FGFR2.

Tambien se describen en el presente documento pero no se reivindican explfcitamente las mutaciones de activacion de FGFR2 que incluyen al menos una mutacion que se selecciona de entre el grupo que consiste en: una mutacion en la union entre los dominios tipo inmunoglobulina (Ig) II y III (por ejemplo, una mutacion de S por W, F o L en la posicion 252; una mutacion de P por R en la posicion 253; una mutacion de P por L en la posicion 263; una mutacion de S por P en la posicion 267, todas ellas de SEQ ID NO: 2 o 3); una mutacion en el dominio Ig III (por ejemplo, una mutacion de F por V en la posicion 276; una mutacion de C por Y o F en la posicion 278; y una mutacion de Y por C en la posicion 281; un mutacion de I por S en la posicion 288; una mutacion de Q por P en la posicion 289; y una mutacion

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

de Y por C, G o R en la posicion 290; una mutacion de K por E en la posicion 292; una mutacion de D por A en la posicion 321; una mutacion de Y por C en la posicion 328; todas ellas de SEQ ID NO: 2 o 3); una mutacion en la union entre el dominio Ig III y el dominio transmembrana (TM) (por ejemplo, una mutacion en S por C o T en la posicion 354 o 353; una mutacion V por F en la posicion 359 o 358; una mutacion de A por S en la posicion 362 o 361; una mutacion de S por C en la posicion 371; una mutacion de Y por C en la posicion 374; todas ellas de SEQ ID NO: 2 o 3, respectivamente); una mutacion del dominio TM (por ejemplo, una mutacion de G por R en la posicion 380 o 379; una mutacion de G por R en las posiciones 384 o 383; todas ellas en SEQ ID NO: 2 o 3, respectivamente); una mutacion en la union entre el dominio TM y el dominio tirosina cinasa I (por ejemplo, una mutacion de corte y empalme IVS10+2A > C); una mutacion en el dominio tirosina cinasa I (por ejemplo, una mutacion I por V en la posicion 538 o 537; una mutacion de N por K en la posicion 540; una mutacion de N por H en la posicion 549 o 548; una mutacion de E por G en la posicion 565 o 564; todas ellas en SEQ ID NO: 2 o 3, respectivamente); o una mutacion en el dominio tirosina cinasa II (por ejemplo una mutacion de K por R en la posicion 641 o 640; una mutacion de K por E en la posicion 650 o 649; una mutacion de K por N en la posicion 659 o 658; una mutacion de G por E en la posicion 663 o 662; una mutacion de R por G en la posicion 678 o 677, todas ellas en SEQ ID NO: 2 o 3, respectivamente; una mutacion de la fase de lectura producida por la eliminacion de los nucleotidos C y T en la posicion 2290-91 de SEQ ID NO: 1). Otros ejemplos de mutaciones de activacion preferidas del dominio Ig III incluyen por ejemplo una mutacion de N por I en la posicion 331; una mutacion de A por P en la posicion 337; una mutacion de G por P o R en la posicion 338; una mutacion de Y por C o H en la posicion 340; una mutacion de T por P en la posicion 341; una mutacion de C por F, G, R, S, W o Y en la posicion 342; una mutacion de A por G o P en la posicion 344; una mutacion de S por C en la posicion 347; una mutacion de S por C en la posicion 351, todas ellas en SEQ ID NO: 2, y las mutaciones equivalentes en SEQ ID NO: 3. Es importante senalar que se pueden detectar mas de una mutacion de activacion de FGFR2 en una muestra biologica, por ejemplo, se detectan al menos dos mutaciones de activacion de receptor de FGFR2 en ciertas realizaciones.

El cancer de endometrio que se detecta puede ser de cualquier subtipo, por ejemplo, de los subtipos histologicos, seroso, mucinoso, y endometrioide. En una realizacion preferida, sin embargo, el cancer que se detecta es del subtipo histologico endometrioide.

Tambien se describe en el presente documento pero no se reivindica explfcitamente un procedimiento de diagnostico o clasificacion del cancer de endometrio en un sujeto, que comprende la evaluacion del nivel de actividad de una ruta de transduccion de la senal de FGFR2 en un sujeto de ensayo y compararlo con el nivel de actividad de un sujeto de control, en el que el aumento de actividad de la ruta de FGFR2 en el sujeto de ensayo en comparacion con el sujeto de control es indicativo de cancer de endometrio. El nivel de actividad de la ruta puede evaluarse, por ejemplo, por la evaluacion del aumento en el nivel de expresion o actividad de una protema FGFR2. De manera alternativa, el nivel de expresion o actividad puede evaluarse, por ejemplo, determinando la cantidad de ARNm que codifica el FGFR2, preferentemente un FGFR2 mutado que da como resultado la activacion del receptor. Por ejemplo, el cancer de endometrio se asocia con la sobre-expresion de FGFR2 debido a la amplificacion genomica, y el ensayo se disena espedficamente para detectar la sobre-expresion de FGFR2.

Tambien se describe en el presente documento pero no se reivindica explfcitamente un kit para el diagnostico o clasificacion del cancer de endometrio que comprende un oligonucleotido que se hibrida espedficamente con o es adyacente al sitio de la mutacion de un gen FGFR2 que da como resultado un aumento de actividad de la protema FGFR2 codificada por el gen, y las instrucciones de uso en el diagnostico de un cancer de endometrio. El sitio de la mutacion, puede comprender, por ejemplo, un nucleotido que se selecciona de entre el grupo que consiste en los nucleotidos 755, 929, 943, 1118, 1147, 1642, 1650, 1978 y 2290-91 de SEQ ID NO: 1 y los nucleotidos equivalentes de SEQ ID NO: 7. En una realizacion preferida, el kit comprende al menos una sonda que comprende el sitio de la mutacion.

Tambien se describe en el presente documento pero no se reivindica explfcitamente un kit para diagnosticar o clasificar el cancer de endometrio, que comprende un anticuerpo que reconoce espedficamente una mutacion en una protema FGFR2, e instrucciones de uso. Opcionalmente la mutacion da como resultado un aumento de actividad en comparacion con una protema FGFR2 no mutada, tal como la de SEQ ID NO: 2 y 3. Preferentemente, el anticuerpo se dirige contra una mutacion espedfica de la protema FGFR2 que se selecciona de entre el grupo que consiste en una mutacion en la union entre los dominios tipo inmunoglobulina II y III; una mutacion en el dominio Ig III; una mutacion en la union entre el dominio Ig III y el dominio transmembrana (TM); una mutacion en el dominio TM; una mutacion en la union entre el dominio TM y el dominio tirosina cinasa I; una mutacion en el dominio tirosina cinasa I o una mutacion en el dominio tirosina cinasa II. Mas preferentemente el anticuerpo se dirige a una mutacion que se selecciona de entre el grupo que consiste en: (a) una mutacion de S por W en la posicion 252 de SEQ ID NO: 2 (NP_075259.2) o 3 (NP_000132.1); (b) una mutacion de K por R en la posicion 310 de SEQ ID NOS: 2 o 3; (c) una mutacion de A por T en la posicion 315 de SEQ ID NO: 3; (d) una mutacion de S por C en la posicion 373 de SeQ ID NO: 2 o la posicion 372 de SEQ ID NO: 3; (e) una mutacion de Y por C en la posicion 376 de SEQ ID NO:2 o la posicion 375 de sEq ID NO: 3; (f) una mutacion de C por R en la posicion 383 de sEq ID NO: 2 o la posicion 382 de SEQ ID NO:3; (g) una mutacion de M por R en la posicion 392 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 391 de SEQ ID NO: 3; (h) una mutacion de I por V en la posicion 548 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 547 de SEQ ID NO: 3; (i) una mutacion de N por K en la posicion 550 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 549 de SeQ ID NO: 3; o (j) una mutacion de K por E en la posicion 660 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 659 de SEQ ID NO: 3.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Tambien se describe en el presente documento pero no se reivindica expKcitamente un procedimiento de tratamiento de un cancer o pre-cancer de endometrio en un sujeto. Preferentemente el sujeto es un ser humano afectado por un cancer de endometrio (por ejemplo, de los subtipos histologicos, seroso, mucinoso, y endometrioide). El procedimiento comprende preferentemente la administracion de una cantidad eficaz de un inhibidor de FGFR2 con un velmculo farmaceuticamente aceptable al sujeto que tiene un cancer o un pre-cancer de endometrio que se caracteriza por la activacion de FGFR2, por ejemplo, una forma de FGFR2 mutada que es activa constitutivamente de manera independiente del ligando o dependiente del ligando, en el que el inhibidor de FGFR2 inhibe la expresion o actividad de FGFR2, inhibiendo eficazmente de esta manera el crecimiento o proliferacion del cancer de endometrio en el sujeto. El inhibidor de FGFR2 preferentemente induce detencion del ciclo celular y/o apoptosis de las celulas del cancer de endometrio. El inhibidor de FGFR2 se puede administrar al sujeto despues del tratamiento quirurgico del cancer de endometrio para inhibir la recurrencia del cancer de endometrio tras la cirugfa. El inhibidor FGFR2 se puede administrar a los pacientes con cancer de endometrio persistente o recurrente que no sea posible eliminar quirurgicamente.

El inhibidor de FGFR2 que se utiliza puede inhibir la expresion de un gen FGFR2 o un producto de expresion FGFR2. El agente puede ser un acido nucleico FGFR2 antisentido, preferentemente un acido nucleico antisentido que se hibride con un segmento de SEQ ID NO: 1 que comprenda al menos una sustitucion de nucleotido que se selecciona de entre una sustitucion de A por G en la posicion 929; una sustitucion de T por G en la posicion 1650; una sustitucion de C por G en la posicion 755; una sustitucion de T por A o G en la posicion 1650; una sustitucion de A por G en la posicion 1127; una sustitucion de C por G en la posicion 1175; una sustitucion de A por G en la posicion 1642; una sustitucion de A por G en la posicion 1978; un intron 10A>C+2; o una eliminacion de CT en las posiciones 2290-91, y las sustituciones equivalentes de SEQ ID NO: 7.

El inhibidor de FGFR2 puede inhibir la actividad de FGFR2 bloqueando el dominio FGFR2. Por ejemplo, el inhibidor FGFR2 es un anticuerpo inhibidor anti-FGFR2 dirigido contra la region del engarce entre los dominios tipo inmunoglobulina (Ig) II y III de FGFR2; el dominio Ig III de FGFR2; la union entre el dominio Ig III y el dominio transmembrana (TM) de FGFR2; el dominio TM; la union entre el dominio TM y el dominio tirosina cinasa I de FGFR2; el dominio tirosina cinasa I de FGFR2, o el dominio tirosina cinasa II de FGFR2. Por ejemplo, el inhibidor de FGFR2 interfiere con el plegamiento de FGFR2, la estructura tridimensional de FGFR2, la union al ligando, o la union al sustrato, por ejemplo, ATP.

Ejemplos preferidos del inhibidor de FGFR2 incluyen un anticuerpo que reconoce espedficamente una secuencia de aminoacidos de FGFR2 que comprende mutaciones que se seleccionan de entre las siguientes: (a) una mutacion de S por W en la posicion 252 de SEQ ID NO: 2 (NP_075259.2) o 3 (NP_000132.1); (b) una mutacion de K por R en la posicion 310 de SEQ ID NO: 2 o 3; (c) una mutacion de A por T en la posicion 315 de SEQ ID NO: 3; (d) una mutacion de S por C en la posicion 373 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 372 de SeQ ID NO: 3; (e) una mutacion de Y por C en la posicion 376 de SeQ ID NO: 2 o la posicion 375 de SEQ ID NO: 3; (f) una mutacion de C por R en la posicion 383 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 382 de SeQ ID NO: 3; (g) una mutacion de M por R en la posicion 392 de SeQ ID NO: 2 o la posicion 391 de SEQ ID NO: 3; (h) una mutacion de I por V en la posicion 548 de sEq ID NO: 2 o la posicion 547 de SEQ ID NO: 3; (i) una mutacion de N por K en la posicion 550 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 549 de SEQ ID NO: 3; o (j) una mutacion de K por E en la posicion 660 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 659 de SEQ ID NO: 3. El anticuerpo se puede dirigir contra una mutacion de S por W en la posicion 252 de SEQ ID NO: 2 o 3. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado, tal como un anticuerpo monoclonal.

El inhibidor de FGFR2 puede ser un ARN inhibidor pequeno (ARNip), un ARN horquillado pequeno (ARNhp), o una ribozima. El inhibidor de FGFR2 puede ser un ARNhp, preferentemente un ARNhp que se dirige al exon 2 de FGFR2 (SEQ ID NO: 4) y/o el exon 15 de FGFR2 (SEQ ID NO: 5), o el inhibidor FGFR2 puede ser PD173074.

La invencion permite a un usuario clasificar apropiadamente el tipo de cancer de endometrio de manera que pueda utilizar un tratamiento apropiado y espedfico basandose en el tipo de cancer de endometrio que tiene el sujeto. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende ademas la determinacion de si la mutacion de FGFR2 induce la activacion del FGFR2.

Breve descripcion de los dibujos

Las FIG. 1A-E muestra los resultados de la cafda de FGFR2 mediada por ARNhp en celulas AN3CA y MFE296, que da como resultado la muerte de las celulas del cancer de endometrio. La FIG. 1A y 1B muestran el efecto del ARNhp de FGFR2 sobre la proliferacion de las celulas de endometrio cancerosas. Se realizo la transduccion en las celulas AN3CA (FIG. 1A) o MFE296 (FIG. 1B) con un vector vado, no silenciante, o dos construcciones de ARNhp de FGFR2 independientes dirigidas a dos exones diferentes de FGFR2 (X2 o X15) y el efecto sobre la proliferacion celular que se evaluo utilizando el ensayo SRB. El tratamiento con ARNhp de FGFR2 suprimfa la proliferacion de ambas lmeas celulares. El control ARNhp no silenciante no tema efecto sobre la proliferacion celular. FIG. 1C. Efecto de cafda de FGFR2 sobre la activacion de ERK1/2 y AKT. Despues de la transduccion con ARNhp, se privaron de suero las celulas AN3CA en un 0,2 % de FBS durante 18 horas o se mantuvieron en medio de cultivo completo que contema un 10 % de FBS. Se recolectaron los lisados y se analizaron por transferencia de Western en cuanto a la expresion de FGFR2 y la activacion de ERK1/2 y AKT. La cafda de FGFR2 daba como resultado la reduccion de activacion de ERK1/2 en FBS al 0,2 % y al 10 %, una modesta reduccion de la fosforilacion en AKT en FBS al 10 %, y no tema efecto sobre la activacion de AKT en FBS al 0,2 %. FIG. 1D. Muerte celular despues de la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

cafda de FGFR2. Se transfectaron celulas AN3CA con ARNip no silenciante (NS) de control o ARNip de FGFR2 X2 utilizando el reactivo de transfeccion Lipofectamina 2000. 48 horas despues de la transfeccion, se recolectaron las celulas, se tineron con 500 ng/ml de Anexina V-FITC y 1 [mu]g/ml de yoduro de propidio, y se analizo en cuanto a las celulas positivas a Anexina-FITC por citometna de flujo. La cafda de FGFR2 daba como resultado un aumento de celulas positivas a Anexina V, lo que indicaba apoptosis. Se analizaron 30 |jg de protema total de los lisados por analisis de transferencia de Western para confirmar la cafda de FGFR2. Esta cafda se consiguio mas con las construcciones de ARNip que con las de ARNhp ya que en esta ultima tambien se expresaba GFP, que tiene un espectro de emision que se solapa con FITC. La FlG. 1E muestra la expresion de PTEN en lmeas celulares de cancer de endometrio. Los lisados celulares de cancer de endometrio se recolectaron y evaluaron por analisis de transferencia de Western en cuanto a la expresion de PTEN.

FIG. 2A-B. Las celulas del cancer de endometrio que expresan FGFR2 activado son sensibles a PD173074, un inhibidor pan-FGFR. Curvas de respuesta a la dosis de seis lmeas celulares de cancer de endometrio. La viabilidad celular con el ensayo SRB se midio 72 horas despues de la adicion de PD173074. Las celulas AN3CA y MFE296 portaban la mutacion N550K de FGFR2. HEC1A, Ishikawa, KLE, y RL952 son de origen natural para FgFR2. El PD173074 tiene un profundo efecto negativo sobre la viabilidad celular de las lmeas celulares que expresan FGFR2 mutante en comparacion con las que expresan el FGFR2 de tipo silvestre. Valores de CI50 de PD173074: AN3CA = 61,7 nM; MFE296 = 284,3 nM; HEC1A > 3000 nM; Ishikawa = 2920,7 nM; KLE > 1000 nM; RL952 > 1000 nM. La FIG. 2B muestra el estado de activacion de PLCg despues del tratamiento con PD 173074.

Las celulas se privaron de suero en FBS al 0,2% durante 18 horas, y luego se trataron con concentraciones crecientes de PD173074 durante tres horas. Los lisados se recolectaron y se evaluaron por analisis de transferencia de Western en cuanto a la activacion de PLCg. La FIG. 2C muestra la proliferacion celular en ausencia de y en respuesta a FGF2. La mutacion N550K del dominio cinasa de FGFR2 constitutivamente activa da como resultado un aumento en la proliferacion por encima del que induda el receptor de tipo silvestre (TS) tanto en ausencia (- FGF2) como en presencia (+FGF2) de ligando FGF2 exogeno. Estos datos sugieren que aunque la mutacion N550K es constitutivamente activa, tambien necesita un ligando para la actividad completa.

FIG. 3A-B. La inhibicion del FGFR2 por medio de PD 173074 induce la muerte celular y la detencion del ciclo celular en las celulas del cancer de endometrio con FGFR2 activado. (FIG. 3A) La tincion con Anexina revela la muerte celular de celulas AN3CA despues del tratamiento con el inhibidor pan-FGFR, PD 173074. Las celulas AN3CA que se colocaron en placas a una densidad de 5 x 105 celulas/pocillo se trataron con DMSO (vehmulo control) o 1 jM de PD173074. 48, 72, o 96 horas mas tarde, se recolectaron las celulas, se tineron con 500 ng/ml de anexina-FITc y 1 ug/ml de yoduro de propidio, y se analizaron por triplicado en cuanto a celulas positivas a anexina por citometna de flujo. Las celulas tratadas con PD173074 mostraban un aumento de tincion de Anexina-V en comparacion con las celulas tratadas solo con DMSO, lo que indicaba apoptosis. (FIG. 3B) El PD173074 da lugar a la detencion del ciclo celular G1 en celulas AN3CA. Las celulas se colocaron en placas por triplicado en placas de 6 pocillos y se trataron con 1 jM de PD173074. Se midio el ciclo celular por tincion con yoduro de propidio y citometna de flujo 72 h despues de la adicion de PD173074.

FIG. 4. Estado de activacion de moleculas de senalizacion claves despues del tratamiento con concentraciones crecientes de PD173074. Las celulas se trataron con concentraciones crecientes de PD173074 en FBS al 10% durante 3 horas. Se recolectaron los lisados y se evaluaron por analisis de transferencia de western en cuanto a la activacion de ERK1/2, AKT, STAT3, y p38. El tratamiento con PD173074 daba como resultado la supresion de la

activacion de ERK1/2, una modesta supresion de fosforilacion de AKT, pero no tema efecto sobre la activacion de

STAT3/5, o p38 en celulas AN3CA y MFE296. El PD173074 no tema efecto sobre la activacion de ERK1/2, AKT, STAT3, o p38 en celulas HEC1A.

FIG. 5A-B. Estado de activacion de moleculas de senalizacion claves durante el tiempo posterior al tratamiento con PD173074. (FIG. 5A) Las celulas se trataron con 1 jM de PD173074 en FBS al 10 % durante los tiempos indicados de 0 a 72 horas. Se recolectaron los lisados y se evaluaron por analisis de transferencia de Western en cuanto a la activacion de ERK1/2, AKT, STAT3, y p38. El tratamiento con PD173074 daba como resultado la supresion de la

activacion de ERK1/2 y la supresion parcial de la fosforilacion de AKT, pero no tema efecto sobre la activacion de

STAT3 o p38 en celulas AN3CA y MFE296. El PD173074 no tema efecto sobre la activacion de ERK1/2, AKT, STAT3 o p38 en celulas HEC1A. (FIG. 5B) Las celulas se privaron en FBS al 0,2 % durante una noche y luego se trataron con 1 jM de PD173074 en FBS al 0,2 % durante los tiempos indicados de 0 a 72 horas. Se recolectaron los lisados y se evaluaron por analisis de transferencia de Western en cuanto a la activacion de ERK1/2, AKT, STAT3, y p38. El tratamiento con PD173074 daba como resultado la supresion de la activacion de ERK1/2 y una modesta supresion de la fosforilacion de AKT en celulas AN3CA y MFE296. El PD 173074 no tema efecto de activacion de ERK1/2 o AKT en celulas HEC1A.

La FIG. 6 es una representacion esquematica de las mutaciones de FGFR2. La mutacion FGFR2 se mapea en dominios funcionales. Las mutaciones somaticas identificadas en canceres de endometrio primarios y lmeas celulares se presentan por encima de la representacion esquematica de la protema y se numeran con respecto a FGFR2b (SEQ ID NO: 2; NP_075259.2). Las mutaciones de la lmea germinal se asocian con una variedad de smdromes craneosinostosis y se numeran con respecto a FGFR2c (SEQ ID NO: 3; NP_000132.1). Cuatro mutaciones somaticas de FGFR2 de endometrio, de las que no se habfa informado anteriormente en la lmea germinal, tienen un cambio sin sentido identico al informado en la posicion paraloga de FGFR3c en una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

condrodisplasia esqueletica (indicada con **). Las nuevas mutaciones estan subrayadas. a La mutacion IVS10+2A >C probablemente da como resultado un aumento relativo en la proporcion de la forma de corte y empalme +VT. b FS se refiere a una eliminacion de 2 pb CT en 2290-91 que da como resultado un cambio de la fase de lectura y un truncado prematuro.

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas

La invencion se describira ahora en referencia a las realizaciones preferidas de la invencion.

La invencion, en parte, se basa en el descubrimiento de que las mutaciones en el receptor FGFR2 que inducen la activacion del receptor se pueden utilizar para detectar y clasificar eficazmente el cancer o pre-cancer de endometrio en un sujeto. La presente invencion se basa ademas en el descubrimiento de que la inhibicion del gen FGFR2 o sus productos de expresion es eficaz en el tratamiento del cancer de endometrio.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “cancer de endometrio” engloba todas las formas y subtipos de la enfermedad, incluyendo, por ejemplo, los subtipos histologicos, seroso, mucinoso, y endometrioide. El cancer de endometrio es un cancer que comienza en el endometrio, el revestimiento del utero (matriz).

En el contexto de la presente invencion, el gen FGFR2 engloba un gen, preferentemente de origen humano, una secuencia de nucleotidos codificante que se expone en SEQ ID NO: 1, 7, o las homologas que incluyen las variantes alelicas y ortologas. La protema FGFR2 engloba una protema, tambien preferentemente de origen humano, que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o 3, o las homologas, que incluyen las ortologas de las mismas. La FIG. 6 muestra los dominios funcionales de los dominios FGFR2 de la protema FGFR2 y las mutaciones de FGFR2 mapeadas en relacion con los dominios funcionales. El FGFR2 es una glucoprotema que pertenece a una familia de receptores relacionados estructuralmente con la tirosina cinasa (FGFR 1-4) que estan codificados por cuatro genes diferentes. El FGFR2 es una glucoprotema compuesta por tres dominios tipo inmunoglobulina (Ig) extracelulares, un dominio transmembrana, y un dominio tirosina cinasa dividido. El corte y empalme alternativo en el dominio Ig III es un determinante primario de ambos patrones de redundancia y especificidad en la union y senalizacion FGF/FGFR. Este evento de corte y empalme es espedfico del tejido y da lugar a las isoformas de receptor IHb y IIIc para FGFR1-FGFR3 que poseen distintas especificidades de ligando (Mohammadi M, Olsen SK e Ibrahimi OA. (2005), Cytokine Growth Factor Rev 16: 107-137, Ornitz DM e Itoh N. (2001). Genome Biol 2: REVIEWS3005). Para el FGFR2, las celulas de linaje epitelial solamente expresan la isoforma “IIIb” codificada por el exon 8 (FGFR2b; SEQ ID NO: 2, NP_07529.2), mientras que las celulas derivadas del mesenquima solamente expresan la isoforma “IIIc” que utiliza el exon 9 (FGFR2c; SEQ ID NO: 3; NP_000132.1) (Scotet E y Houssaint E. (1995). Biochim Biophys Acta 1264: 238-242). La isoforma FGFR2b se une predominantemente a FGF1, FGF3, FGF7 y FGF10, mientras que FGFR2c no se une a FGF7 y FGF10 pero se une a FGF1, FGF2, FGF4, FGF6, y FGF8 con alta afinidad (Ibrahimi OA, Zhang F, Eliseenkova AV, Itoh N, Linhardt RJ y Mohammadi M. (2004), Hum MoI Genet 13: 2313-2324).

Un “aumento de actividad” o una “mutacion de activacion” de FGFR2 en un sujeto o una muestra biologica de ensayo se refiere a una actividad total de FGFR2 mas alta en el sujeto o la muestra biologica de ensayo en comparacion con un control, por ejemplo, un sujeto sano, o una muestra de referencia. Preferentemente, aunque no necesariamente, la actividad es al menos un 10 %, mas preferentemente al menos un 50 %, mas preferentemente al menos un 100 %, y mucho mas preferentemente al menos un 150% mayor en el sujeto o la muestra de ensayo que en el control. El aumento de actividad, por ejemplo, puede ser el resultado de un aumento de la actividad basal de FGFR2, la estimulacion prolongada, el retraso de la degradacion, o la sobre-expresion, por ejemplo, debido a una mayor union al ligando, una union al ligando promiscua o inapropiada, una dimerizacion constitutiva del receptor, un reciclado deficiente que da como resultado un aumento de la senalizacion, retraso de la degradacion, o activacion de cinasas.

Un mayor nivel de expresion de FGFR2 puede ser el resultado, por ejemplo, de una mutacion en una region no codificante de un gen FGFR2 o una mutacion en un gen codificante o no codificante implicado en la transcripcion o traduccion de FGFR2. El nivel de expresion de FGFR2 se puede determinar, por ejemplo, comparando el ARNm FGFR2 o el nivel de protema FGFR2 en un sujeto de ensayo con comparacion con un control, por ejemplo, comparando el tumor con el endometrio normal (por ejemplo, una muestra de endometrio normal adyacente). “Variantes conservadoras de funcion” son en las que se ha cambiado un determinado resto de aminoacido de una protema o enzima sin alterar la conformacion y funcion completas del polipeptido, que incluye, pero no se limita a, sustitucion de un aminoacido por uno que tenga propiedades similares (tales como, por ejemplo, polaridad, potencial de enlaces hidrogeno, acido, basico, hidrofobia, aromatico, y similares). Los aminoacidos con propiedades similares se conocen bien en la tecnica. Por ejemplo, la arginina, histidina y lisina son aminoacidos hidrofilos basicos y pueden intercambiarse. De manera similar, la isoleucina, un aminoacido hidrofobo, puede sustituirse por leucina, metionina o valina. Se espera que dichos cambios tengan poco o ningun efecto sobre el peso molecular aparente o el punto isoelectrico de la protema o el polipeptido.

Los aminoacidos distintos de los indicados como conservados pueden ser diferentes en una protema o enzima de manera que el porcentaje de similitud de secuencia proteica o de aminoacidos entre dos protemas cualquiera con funcion similar puede variar y puede ser, por ejemplo, desde un 70 % a un 99 % como se determina de acuerdo a un esquema de alineamiento tal como el Procedimiento Cluster, en el que la similitud se basa en el algoritmo MEGALIGN. Una “variante” incluye tambien un polipeptido o enzima que tiene una identidad de aminoacidos de al menos un 60 %

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

segun se determina por el algoritmo BLAST o FASTA, preferentemente al menos de un 75 %, mas preferentemente al menos un 85 %, e incluso mas preferentemente al menos un 90 %, y mas preferentemente al menos un 95 %, y que tiene las mismas propiedades o funciones, o sustancialmente similares, que la protema o enzima nativa o parental con la que se compara. Una variante particular es una variante “con ganancia de funcion”, que significa una variante de polipeptido en el que el cambio de al menos un resto de aminoacido determinado en una protema o enzima mejora una funcion espedfica del polipeptido, incluyendo, pero sin limitarse a la actividad proteica. El cambio de un resto de aminoacido puede ser la sustitucion de un aminoacido por uno con propiedades similares.

Como se utiliza en el presente documento, los terminos “homologo” y “similar” se refiere a la relacion entre las protemas que poseen un “origen evolutivo comun”, incluyendo las protemas de superfamilias (por ejemplo, la superfamilia de las inmunoglobulinas) y protemas homologas de diferentes especies. Dichas protemas (y sus genes codificantes) tienen una homologfa de secuencia, como se refleja en su similitud de secuencia, en terminos de porcentaje de similitud o por la presencia de restos o motivos espedficos en posiciones conservadas.

Dos secuencias de ADN son “sustancialmente homologas o similares” cuando al menos aproximadamente el 80 %, y mas preferentemente al menos aproximadamente el 90 % (o al menos el 95 %) de los nucleotidos coinciden en tramos definidos de las secuencias de aDn, como se determina por los algoritmos de comparacion de secuencias, tales como, BLAST, FASTA, DNA Strider, etc.

Los terminos “mutante” y “mutacion” significan cualquier cambio detectable en el material genetico, por ejemplo, en el ADN, o cualquier proceso, mecanismo, o resultado de dicho cambio. Cuando se compara con un material de control, se puede hacer referencia a dicho cambio como una “anormalidad”. Esto incluye las mutaciones geneticas, en las que se altera la estructura (por ejemplo, la secuencia de ADN) de un gen, surge un gen o ADN a partir de un proceso de mutacion, y cualquier producto de expresion (por ejemplo, una protema) que expresa un gen o secuencia de ADN modificados. El termino “variante” puede utilizarse tambien para indicar un gen, secuencia de ADN, enzima, celula, etc. que se han modificado o alterado, es decir, cualquier tipo de mutante.

Como se utiliza en el presente documento, “oligonucleotidos espedficos de secuencia” se refiere a grupos de oligonucleotidos relacionados que se pueden utilizar para detectar variaciones o mutaciones espedficas en el gen FGFR2, preferentemente una mutacion de activacion de FGFR2.

Una “sonda” se refiere a un acido nucleico u oligonucleotido que forma una estructura Idbrida con una secuencia en una region diana debido a la complementariedad de al menos una secuencia de la sonda con una secuencia en la protema diana del sujeto.

Como se describe en el presente documento, acidos nucleicos antisentido (que incluyen las ribozimas), que se pueden utilizar para inhibir la expresion de FGFR2. Un “acido nucleico antisentido” es preferentemente una molecula de acido nucleico de cadena sencilla que, al hibridarse en condiciones citoplasmaticas con bases complementarias en una molecula de ADN o ARN, inhibe el papel de estos ultimos. Si el ARN es una transcripcion de ARN mensajero, el acido nucleico es una contra-transcripcion o un acido nucleico interferente complementario del ARNm. Como se utiliza actualmente, “antisentido” incluye ampliamente interacciones ARN-ARN, interacciones ARN-ADN, ribozimas, complejos silenciadores inducidos por ARN, y detencion mediada por RNasa-H. Las moleculas de acido nucleico antisentido puede codificarlas un gen recombinante para la expresion en una celula (por ejemplo, la Pat. de EE. UU. N° 5.814.500; Pat. de EE. UU. N° 5.811.234), o de manera alternativa se pueden preparar sinteticamente (por ejemplo, Pat. de EE. UU. N° 5.780.607). Los oligonucleotidos sinteticos son adecuados para su uso antisentido.

PROCEDIMIENTOS DIAGNOSTICOS

De acuerdo con la presente invencion que se define en las reivindicaciones adjuntas, las mutaciones del receptor FGFR2 que inducen la activacion del receptor, incluyendo la sobre-expresion y la degradacion retardada, se pueden detectar para diagnosticar o clasificar el cancer o pre-cancer de endometrio en un sujeto. Como se utiliza en el presente documento, un “sujeto” es un mairnfero humano o no humano, por ejemplo, un primate, vaca, caballo, cerdo, oveja, cabra, perro, gato, o roedor, que tenga probabilidad de desarrollar un cancer de endometrio. En todas las realizaciones se prefieren los sujetos humanos. Preferentemente el sujeto es un ser humano que es sospechoso de tener un cancer de endometrio, que se ha diagnosticado que tiene un cancer de endometrio, o que tiene una historia familiar de cancer de endometrio. Los procedimientos para identificar sujetos sospechosos de tener un cancer de endometrio pueden incluir la exploracion ffsica, el historial medico familiar del sujeto, la historia medica del sujeto, una biopsia de endometrio, o varias tecnologfas de imagen tales como ultrasonograffa, tomograffa computarizada, imagen de resonancia magnetica, espectroscopia de resonancia magnetica, o tomograffa de emision de positrones. El procedimiento de diagnostico para el cancer de endometrio y la planificacion clmica de los diagnosticos de cancer de endometrio son bien conocidos por el experto en la tecnica medica.

En consecuencia, los procedimientos de diagnostico pueden comprender por ejemplo, la deteccion de una mutacion en el gen FGFR2, en el que la mutacion da como resultado un aumento de la actividad del receptor FGFR2. La mutacion de FGFR2 puede afectar especialmente a una region codificante del gen FGFR2, tal como, por ejemplo, una mutacion en el dominio Ig II o Ig III del gen FGFR2. La mutacion puede ser una mutacion sin sentido, preferentemente una mutacion sin sentido que de como resultado una sustitucion, o una eliminacion en el acido

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

nucleico, o una combinacion de ambas. Preferentemente, la mutacion da como resultado una, y a veces mas, sustituciones o eliminaciones de aminoacidos, por ejemplo, vease la Tabla 2 posteriormente.

Como se define en las reivindicaciones adjuntas la invencion engloba la deteccion de una mutacion en la protema FGFR2, en particular una mutacion que da como resultado un aumento de la actividad de la protema FGFR2. Tambien se describe en el presente documento pero no se reivindica explfcitamente al menos una mutacion en FGFR2 que se selecciona de entre el grupo que consiste en: una mutacion en la union entre los dominios tipo inmunoglobulina (Ig) II y III; una mutacion en el dominio Ig III, una mutacion en la union entre el dominio Ig III y el dominio transmembrana (TM); una mutacion en el dominio TM, una mutacion en la union entre el dominio TM y el dominio tirosina cinasa I; una mutacion en el dominio tirosina cinasa I, o una mutacion en el dominio tirosina cinasa II. La mutacion puede inducir una sustitucion de aminoacidos en FGFR2, por ejemplo, la mutacion puede consistir en una eliminacion de nucleotidos C y T en la posicion 2290-91 de SEQ ID NO: 1 (Nm-02297.2); SEQ ID NO: 7; o una mutacion de corte y empalme IVSl0+2A>C.

Tfpicamente, una mutacion de activacion del receptor FGFR2 que se detecta aumenta la activacion del receptor, por ejemplo, por aumento de la union al ligando, alteracion de la afinidad al ligando (promiscua), dimerizacion constitutiva del receptor, degradacion retardada, reciclado deficiente desde la membrana celular, sobre-expresion, o activacion de cinasas, activando de esta manera el receptor FGFR2.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “diagnostico” se refiere a la identificacion de la enfermedad en cualquier estadio de su desarrollo, y tambien incluye la determinacion de una predisposicion de un sujeto para desarrollar la enfermedad o la recafda.

La expresion “muestra biologica” se refiere a cualquier fuente celular a partir de la cual se pueda obtener ADN. Preferentemente la muestra biologica se obtiene del area del utero o cerca de la misma para asegurar que estan presentes las celulas de revestimiento del utero en la muestra biologica. En una realizacion, la muestra biologica esta en forma de sangre, por ejemplo, sangre uterina de perdidas menstruales o post menopausicas.

Tambien se describe en el presente documento pero no se reivindica explfcitamente un procedimiento para diagnosticar un cancer de endometrio en un sujeto que comprende la evaluacion del nivel de expresion, degradacion retardada o actividad de la protema FGFR2 en celulas de endometrio de un sujeto de ensayo y compararlos con el nivel de expresion o actividad en celulas de endometrio de un sujeto de control, en el que el aumento de la expresion y/o actividad de la protema FGFR2 en el sujeto de ensayo en comparacion con el sujeto de control es indicativo de cancer o pre-cancer de endometrio.

El nivel de expresion o degradacion retardada de FGFR2 puede evaluarse determinando la cantidad de ARNm que codifica la protema FGFR2 en una muestra biologica, o determinando la concentracion de protema FGFR2 en una muestra biologica. El nivel de actividad de FGFR2 se puede evaluar determinando el nivel de actividad del flujo de senalizacion en una ruta de senalizacion FGFR2, por ejemplo, midiendo la actividad de FGFR2 en una muestra o un sujeto, como se describe en el presente documento.

Ensayos basados en acido nucleico

De acuerdo con la invencion, se pueden detectar las formas mutadas de los acidos nucleicos FGFR2, es decir, en el ADN FGFR2 o sus transcripciones, asf como la expresion mal regulada, por ejemplo, la sobre-expresion, de FGFR2 u otros componentes de una ruta FGFR2 por una variedad de procedimientos adecuados. Se pueden emplear procedimientos convencionales para analizar y secuenciar el acido nucleico contenido en una muestra biologica y para diagnosticar un trastorno genetico, y muchas de las estrategias para el analisis genotfpico las conocen los expertos en la tecnica.

En una realizacion preferida, la determinacion de mutaciones en el gen FGFR2 engloba el uso de secuencias de acido nucleico tal como oligonucleotidos espedficos, para detectar mutaciones en el ADN o ARNm FGFR2 genomico en una muestra biologica. Dichos oligonucleotidos pueden hibridarse espedficamente con un sitio de mutacion, o con una region adyacente al sitio de mutacion presente en un acido nucleico FGFR2. Se pueden emplear tambien cebadores que permitan la amplificacion de todo o parte del FGFR2. De manera alternativa, o en combinacion con dichas tecnicas, se puede aplicar la secuenciacion de oligonucleotidos descrita en el presente documento o la que conozca el experto en la tecnica para detectar las mutaciones FGFR2.

Un experto en la tecnica puede utilizar sondas de hibridacion en solucion y en realizaciones que empleen procedimientos en fase solida. En realizaciones que implican procedimientos de fase solida, el acido nucleico de ensayo se adsorbe o se fija de alguna manera a una matriz o la superficie seleccionada. El acido nucleico de cadena sencilla fijado se somete entonces a una hibridacion espedfica con sondas seleccionadas.

En otra realizacion, un experto en la tecnica puede utilizar oligonucleotidos cebadores en una tecnica de amplificacion, tal como PCR o PCR inversa (“reaccion en cadena de la polimerasa inversa”), para amplificar espedficamente el ADN o ARNm diana, respectivamente, que potencialmente esta en la muestra biologica.

Los oligonucleotidos utiles incluyen cebadores que permiten la amplificacion de exones FGFR2.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

La presente invencion se dirige mas particularmente a un procedimiento in vitro que comprende las etapas de: a) poner en contacto una muestra biologica que contiene ADN con oligonucleotidos espedficos que permiten la amplificacion de todo o parte del gen FGFR2, haciendo accesible el ADN contenido en la muestra, si es apropiado, para la hibridacion, y en condiciones que permitan una hibridacion de los cebadores con el ADN contenido en la muestra biologica; b) amplificar dicho ADN; c) detectar los productos de la amplificacion; d) comparar los productos amplificados obtenidos con los productos amplificados obtenidos con una muestra biologica de control normal, y de esta manera detectar una posible anormalidad en el gen FGFR2. En ciertas realizaciones, el ADN de una muestra biologica se secuencia directamente sin necesidad de amplificacion. En estas realizaciones, el ADN secuenciado se compara con una secuencia de control para detectar posibles anormalidades en el gen FGFR2.

El procedimiento de la invencion tambien se puede aplicar a la deteccion de una anormalidad en la transcripcion del gen FGFR2, por ejemplo, amplificando los ARNm contenidos en una muestra biologica, por ejemplo, por RT-PCR.

Por lo tanto, otro sujeto de la presente invencion es un procedimiento in vitro como se ha definido anteriormente que comprende las etapas de: a) producir un ADNc a partir de un ARNm contenido en la muestra biologica; b) poner en contacto dicho ADNc con oligonucleotidos espedficos que permitan la amplificacion de todas o parte de las transcripciones del gen FGFR2, en condiciones que permitan una hibridacion de los cebadores con dicho ADNc; c) amplificar dicho ADNc; d) detectar los productos de la amplificacion; e) comparar los productos amplificados que se obtienen con los productos amplificados obtenidos con una muestra biologica de control normal, y de esta manera detectar una posible anormalidad en la transcripcion del gen FGFR2.

Un control puede ser cualquier muestra de control de endometrio normal conocida por los expertos en la tecnica, por ejemplo, una muestra de endometrio adyacente normal o un ADN normal, que se obtiene de la sangre o de una torunda bucal.

Para los analisis de ARN, la muestra biologica puede ser de cualquier fuente de celulas, como se ha descrito anteriormente, tal como un tejido de biopsia, a partir del que se afsla el ARN utilizando procedimientos convencionales bien conocidos por el experto en la tecnica, tal como extraccion en tiocianato de guanidio-fenol- cloroformo (Chomocyznski y col., Anal. Biochem., 1987,162:156). El ARN aislado se somete entonces a transcripcion inversa acoplada y amplificacion por reaccion en cadena de la polimerasa (RT-PCR), utilizando oligonucleotidos cebadores espedficos que son espedficos para un sitio seleccionado. Las condiciones para la hibridacion del cebador se escogen para asegurar la transcripcion inversa y amplificacion; por lo tanto la aparicion de un producto de amplificacion es diagnostica de la presencia de una variacion genetica en particular. En otra realizacion, el ARN se transcribe inversamente y se amplifica, despues de lo cual las secuencias amplificadas se identifican, por ejemplo, por secuenciacion directa. En otra realizacion mas, se puede clonar y secuenciar el ADNc obtenido a partir del ARN para identificar una mutacion. Los acidos nucleicos FGFR2 descritos en el presente documento tambien se pueden utilizar como sondas, por ejemplo, en ensayos terapeuticos y diagnosticos. Por ejemplo, la presente invencion proporciona una sonda que comprende un oligonucleotido sustancialmente purificado, cuyo oligonucleotido comprende una region que tiene una secuencia de nucleotido que es capaz de hibridarse espedficamente a una region de un gen FGFR2 que se diferencia del gen de tipo silvestre (SEQ iD NO: 1 y 7), por ejemplo, una region mutante o polimorfica. Dichas sondas se pueden utilizar entonces para detectar espedficamente cual es la mutacion del gen FGFR2 presente en una muestra extrafda del sujeto. La region mutante o polimorfica se puede localizar en las secuencias del promotor, exon, o intron del gen FGFR2.

Las sondas particularmente preferidas tienen un numero de nucleotidos suficiente para permitir la hibridacion espedfica a la secuencia de nucleotido diana. Por lo tanto, las sondas de longitudes adecuadas que se basan en SEQ ID NO: 1-3 y complementarias a las secuencias mutantes que se proporcionan en el presente documento las pueden construir y ensayar un experto en la tecnica para que tengan un nivel apropiado de especificidad dependiendo de la aplicacion que se pretenda. Cuando la secuencia de nucleotido diana esta presente en un fragmento de ADN grande, tal como un fragmento de ADN genomico de varias decenas o cientos de kilobases, el tamano de la sonda puede ser mas largo para proporcionar una hibridacion suficientemente espedfica, en comparacion con una sonda que se utiliza para detectar una secuencia diana que esta presente en un fragmento mas corto de ADN. Por ejemplo, en algunos procedimientos de diagnostico se puede amplificar primero una parte del gen FGFR2 y asf aislarse del resto del ADN cromosomico y luego se hibrida con una sonda. En dicha situacion, una sonda mas corta proporcionara probablemente suficiente especificidad de hibridacion. Por ejemplo, una sonda que tiene una secuencia de nucleotidos de aproximadamente 10 nucleotidos puede ser suficiente, aunque se prefieren las sondas de aproximadamente 15 nucleotidos, incluso mas preferentemente de 20 nucleotidos.

En una realizacion preferida, la sonda o cebador comprende ademas un marcador unido a ellos, que preferentemente es capaz de ser detectado. El marcador se puede seleccionar, por ejemplo, de entre radioisotopos, compuestos fluorescentes, enzimas, y cofactores enzimaticos.

El acido nucleico aislado, el cual se utiliza, por ejemplo, como una sonda o un cebador, se puede modificar, de manera que se vuelva mas estable. Las moleculas de acido nucleico ejemplares que estan modificadas incluyen analogos de AdN fosforoamidato, fosfotioato y metilfosfonato (vease tambien las Pat. de EE. UU. N° 5.176.996; 5.264.564; y 5.256.775). En otra realizacion mas, se pueden utilizar tecnicas de HPLC o la HPLC desnaturalizante (DHPLC) para analizar los acidos nucleicos FGFR2. La DHPLC se desarrollo cuando se observo que, cuando se llevaba a cabo el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

analisis HPLC a una temperature parcialmente desnaturalizante, es dedr, una temperature suficiente para desnaturalizar un hetroduplex en el sitio de no coincidencia de un par de bases, se podfan separar los homoduplex de los heteroduplex que ternan la misma longitud de pares de bases (Hayward-Lester, y col., Genome Research, 1995, 5:494; Underhill, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 193; Doris, y col., DHPLC Workshop, 1997, Stanford University). Por lo tanto, el uso de DHPLC se aplico para la deteccion de mutaciones (Underhill, y col., Genome Research, 1997, 7:996; Liu, y col., Nucleic Acid Res., 1998, 26; 1396). La DHPLC puede separar un hetroduplex que se diferencia solo en un par de bases. La “cromatograffa de polinucleotido de ion coincidente” (MIPC), o la “cromatograffa de polinucleotido de ion coincidente” desnaturalizante (DMIPC) como se describen en las Pat. de EE. UU. N° 6.287.822 o 6.024.878, son procedimientos de separacion que pueden ser utiles tambien en conexion con la presente invencion.

De manera alternativa, se puede utilizar un procedimiento DGGE (Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante), o el procedimiento SSCP (Polimorfismo de conformacion de cadena sencilla) para detectar una anormalidad en el gen FGFR2. El DGGE es un procedimiento para redisolver dos fragmentos de ADN de longitudes identicas basandose en las diferencias de secuencia de solo un unico cambio de pares de bases, utilizando una electroforesis a traves de un gel que contiene concentraciones variables de desnaturalizante (Guldberg y col., Nuc. Acids Res. 1994, 22:880). El SSCP es un procedimiento para detectar diferencias de secuencia entre dos ADN, que comprende la hibridacion de las dos especies con deteccion posterior de no coincidencias por electroforesis en gel (Ravnik-Glavac y col., Hum. Mol. Genet. 1994,3:801). Tambien se puede utilizar la “Escision HOT”, un procedimiento para detectar diferencias de secuencia entre dos ADN, comprende la hibridacion de dos especies con deteccion de no coincidencias posterior por escision qmmica (Cotton, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85:4397). Dichos procedimientos se continuan preferentemente con una secuenciacion directa. De manera ventajosa, se puede utilizar un procedimiento RT-PCR para detectar anormalidades en la transcripcion FGFR2, ya que permite visualizar las consecuencias de una mutacion de corte y empalmetal como el salto de exon o un corte y empalme aberrante debido a la activacion de un sitio cnptico. Preferentemente este procedimiento se continua tambien con una secuenciacion directa.

Tambien se pueden implementar ventajosamente tecnicas que utilizan micromatrices, preferentemente tecnicas de micromatrices que permiten una exploracion de alto rendimiento, para detectar una anormalidad en el gen FGFR2 o para ensayar la expresion del gen FGFR2 o el gen de otro componente de la ruta FGFR2 que de como resultado un aumento de la senalizacion como se describe en el presente documento. Las micromatrices se pueden disenar de manera que el mismo grupo de oligonucleotidos identicos se una a al menos dos regiones seleccionadas de la matriz por separado, de manera que se pueda comparar facilmente una muestra normal, que se pone en contacto con una de dichas regiones seleccionadas de la matriz, contra una muestra de control, que se pone en contacto con otra de dichas regiones seleccionadas. Estas matrices evitan la mezcla de la muestra normal y la muestra de ensayo, utilizando conducciones de microflmdica. Las tecnicas de micromatrices utiles incluyen las que desarrolla Nanogen, Inc (San Diego, Calif.) y las que desarrolla Affymetrix. Sin embargo, todos los tipos de micromatrices, tambien llamados “chips geneticos” o “chips de ADN”, se pueden adaptar para la identificacion de mutaciones. Dichas micromatrices se conocen bien en la tecnica.

El soporte solido al que se unen los oligonucleotidos se puede fabricar de cristal, silicona, plastico (por ejemplo, polipropileno, nilon), poliacrilamida, nitrocelulosa, u otros materiales. Un procedimiento para unir los acidos nucleicos a una superficie es imprimiendolos en placas de cristal, como describe en general Schena y col., Science 1995, 270:457470. Este procedimiento es especialmente util para preparar micromatrices de ADNc. Vease tambien DeRisi y col., Nature Genetics 1996, 14:457-460; Shalon y col., Genome Res. 1996, 6:639- 645; y Schena y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 93:10539-11286.

Se pueden utilizar tambien otros procedimientos para fabricar micromatrices, por ejemplo, por enmascaramiento (Maskos y Southern, Nuc. Acids Res. 1992, 20:1679-1684). Principalmente, se podna utilizar cualquier tipo de matriz, por ejemplo, transferencias puntuales en una membrana de hibridacion de nilon (vease Sambrook y col., Molecular Cloning A Laboratory Manual (2a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), aunque, como apreciaran los expertos en la tecnica, se preferiran las matrices muy pequenas debido a que los volumenes de hibridacion seran mas pequenos. Para estos ensayos se escogen condiciones de hibridacion de acidos nucleicos y lavado de manera que los oligonucleotidos unidos se “unan espedficamente” o se “hibriden espedficamente” con al menos una parte del gen FGFR2 presente en la muestra ensayada, es decir, la sonda se hibrida, forma un duplex o se une al locus FGFR2 con una secuencia de acido nucleico complementaria pero no se hibrida con un sitio que tenga una secuencia de acido nucleico no complementaria. Como se utiliza en el presente documento, una secuencia de polinucleotido se considera complementaria de otra cuando, si el polinucleotido mas corto es menor o igual a 25 bases, no hay faltas de coincidencias utilizando las reglas de emparejamiento de bases convencional, o si el polinucleotido mas corto es mayor de 25 bases, no tiene mas de un 5 % de falta de coincidencias. Preferentemente, los polinucleotidos son perfectamente complementarios (no hay falta de coincidencia). Se puede demostrar facilmente que las condiciones de hibridacion dan como resultado una hibridacion espedfica llevando a cabo un ensayo de hibridacion que incluye los controles negativos (vease, por ejemplo, Shalon y col., supra, y Chee y col., Science 1996,274:610-614).

Estan disponibles una variedad de procedimientos para la deteccion y analisis de los eventos de hibridacion. Dependiendo del grupo indicador (fluoroforo, enzima, radioisotopo, etc.) que se utilice para marcar la sonda de ADN, se llevan a cabo la deteccion y el analisis de manera fluorimetrica, colorimetrica o por autorradiograffa. Observando y midiendo la radiacion emitida, tal como la radiacion fluorescente o una emision de parffculas, se puede obtener la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

informacion sobre los eventos de hibridacion.

Cuando se utilizan las sondas marcadas fluorescentemente, las emisiones de fluorescencia en cada sitio de la matriz de transcripcion se pueden detectar preferentemente por exploracion con microscop^a laser confocal. En una realizacion, se lleva a cabo una exploracion por separado, utilizando la lmea de excitacion apropiada, para cada uno de los dos fluoroforos que se utilicen. De manera alternativa, se puede utilizar un laser que permita la iluminacion simultanea de los espedmenes con las longitudes de onda espedficas de los dos fluoroforos y se pueden analizar las emisiones de los dos fluoroforos simultaneamente (vease Shalon y col. Genome Res. 1996, 6:639-695).

Ensayos basados en protemas

Como alternativa al analisis de acidos nucleicos FGFR2, se puede evaluar el FGFR2 basandose en las mutaciones en la protema, o la produccion mal regulada, por ejemplo, sobre-produccion, de la protema.

En realizaciones preferidas, se detecta el FGFR2 por inmunoensayo. Por ejemplo, la transferencia de Western permite la deteccion de una variante espedfica, o la presencia o ausencia de FGFR2. En particular, un inmunoensayo puede detectar una secuencia de aminoacidos espedfica (de tipo silvestre o mutante) en una protema FGFR2. Tambien se pueden utilizar otros formatos de inmunoensayo en lugar de la transferencia de Western, como se describe posteriormente por la produccion de anticuerpo. Uno de estos es el ensayo ELISA.

En los ensayos ELISA, se inmoviliza un anticuerpo contra FGFR2, un fragmento epitopico de FGFR2, en una superficie seleccionada, por ejemplo, una superficie capaz de unirse a protemas tales como pocillos de poliestireno de una placa de microtitulacion. Tras el lavado para eliminar los polipeptidos adsorbidos incompletamente, se puede unir una protema no espedfica tal como una solucion de albumina serica bovina (BSA) a una superficie seleccionada. Esto permite bloquear los sitios de adsorcion no espedfica sobre la superficie inmovilizada y permite por tanto reducir el fondo producido por las uniones no espedficas de antisuero en la superficie. La superficie inmovilizada se pone en contacto con una muestra, que se va a ensayar de manera conductiva a la formacion de complejos inmunitarios (antigeno/anticuerpo). Esto puede incluir la dilucion de la muestra con diluyentes, tales como las soluciones de BSA, gamma globulina bovina (BGG) y/o solucion salina tampon fosfato/Tween. La muestra se deja incubando durante 2 a 4 horas, a temperaturas entre aproximadamente 24 a 37 grados C. Despues de la incubacion, la superficie que se pone en contacto con la muestra se lava para retirar el material que no forme inmunocomplejos. El procedimiento de lavado puede incluir lavar con una solucion, tal como PBS/Tween o tampon de borato. Despues de la formacion de inmunocomplejos espedficos entre la muestra de ensayo y el anticuerpo unido, y el lavado posterior, se puede determinar si se produjo e incluso la cantidad de formacion inmunocomplejos sometiendo el inmunocomplejo a un segundo anticuerpo contra los mutantes FGFR2, que reconozca un epftopo mutado en la protema. Para proporcionar los medios de deteccion, el segundo anticuerpo puede tener una actividad asociada tal como una actividad enzimatica que generara, por ejemplo, el desarrollo de un color al incubarlo con un sustrato cromogenico apropiado. La cuantificacion se puede conseguir entonces midiendo el grado de generacion de color utilizando, por ejemplo, un espectro visible en un espectrofotometro.

Tfpicamente el anticuerpo de deteccion se conjuga con una enzima tal como la peroxidasa y la protema se detecta por la adicion de un sustrato de cromoforo peroxidasa soluble tal como el tetrametilbencidina seguido por 1 M de acido sulfurico. La concentracion de la protema de ensayo se determina por comparacion con curvas de referencia.

Estos protocolos se detallan en Current Protocols in Molecular Biology, V. 2 Ch. 11 y Antibodies, a Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) pp 579-593.

De manera alternativa, se puede utilizar un ensayo bioqmmico para detectar la expresion, o acumulacion de FGFR2, por ejemplo, detectando la presencia o ausencia de una banda en las muestras analizadas por electroforesis en gel de poliacrilamida; por la presencia o ausencia de un pico cromatografico en las muestras analizadas por uno cualquiera de los distintos procedimientos de cromatograffa lfquida de altas prestaciones, incluyendo de fase inversa, de intercambio ionico, de permeabilidad en gel; por la presencia o ausencia de FGFR2 por cromatograffa o electroforesis capilar analftica, o cualquier otra tecnica bioqmmica cuantitativa o cualitativa que se conozca en la tecnica. Los inmunoensayos que se trataron anteriormente implican la utilizacion de anticuerpos dirigidos contra la protema FGFR2 o fragmentos de la misma. La produccion de dichos anticuerpos se describe posteriormente.

Anticuerpos anti-FGFR2

Dichos anticuerpos incluyen pero no se limitan a anticuerpos policlonales, monoclonales, quimericos, de cadena unica, fragmentos Fab, bibliotecas de expresion de Fab, y por ejemplo, anticuerpos humanizados.

Se pueden utilizar varios procedimientos conocidos en la tecnica para la produccion de anticuerpos policlonales o monoclonales contra polipeptidos FGFR2 o derivados o analogos de los mismos. Para la produccion de anticuerpos, se pueden inmunizar distintos animales huesped por inyeccion con el polipeptido antigenico, que incluyen pero no se limitan a conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc.

Para la preparacion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los polipeptidos FGFR2, se puede utilizar cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo por lmeas celulares continuas en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

cultivo. Estas incluyen pero no se limitan a la tecnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (Nature 256:495- 497, 1975), asf como la tecnica del trioma, la tecnica del hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor y col., Immunology Today 4:72, 1983; Cote y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030, 1983), y la tecnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985). En una realizacion adicional de la invencion, los anticuerpos monoclonales se pueden producir en animales libres de germenes (Publicacion de Patente Internacional N° WO 89/12690, publicada el 28 de Dic de 1989).

Las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos de cadena sencilla (Pat. de EE. N° 5.476.786 y 5.132.405 de Huston; Pat de EE. UU. N° 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla espedfica del polipeptido FGFR2. Ademas, estos genes se pueden suministrar para su expresion in vivo. Las tecnicas descritas para la construccion de bibliotecas de expresion Fab (Huse y col., Science 246:1275-1281, 1989) se pueden utilizar para permitir una rapida y facil identificacion de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada por un polipeptido FGFR2, o sus derivados u analogos.

Los fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molecula de anticuerpo se puede generar por tecnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen pero no limitan a: el fragmento F(ab')2 que se puede producir por digestion con pepsina de la molecula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que se pueden generar por la reduccion de puentes disulfuro del fragmento F(ab')2, y los fragmentos Fab se pueden generar tratando la molecula de anticuerpo con papama y un agente reductor.

En la produccion de anticuerpos, se puede conseguir la exploracion del anticuerpo deseado por tecnicas conocidas en la tecnica, por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas), inmunoensayos “sandwich”, ensayos inmunorradiometricos, reacciones de precipitina por difusion en gel, ensayos de aglutinacion in situ (utilizando oro coloidal, marcadores enzimaticos o radioisotopos, por ejemplo), transferencias de western, reacciones de precipitacion, ensayos de aglutinacion (por ejemplo, ensayos de aglutinacion en gel, ensayos de hemaglutinacion), ensayos de fijacion del anticuerpo, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de protema A, y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realizacion, la union de los anticuerpos se detecta detectando un marcador en el anticuerpo primario. En otra realizacion, el anticuerpo primario se detecta detectando la union con un anticuerpo secundario o reactivo contra el anticuerpo primario. En una realizacion mas, el anticuerpo secundario esta marcado. Se conocen muchos medios en la tecnica para detectar la union en un inmunoensayo y estan en el ambito de la presente invencion.

Kits de diagnostico

Tambien se describen en el presente documento pero no explfcitamente en las reivindicaciones kits para la determinacion de la secuencia con el gen FGFR2 en un sujeto para diagnosticar o clasificar el cancer de endometrio. Los kits comprenden un medio para determinar la secuencia de las posiciones variantes, y puede incluir opcionalmente datos para el analisis de mutaciones. Los medios para la determinacion de la secuencia pueden comprender reactivos inmunologicos y basados en acidos nucleicos adecuados. Preferentemente, los kits comprenden tambien tampones adecuados, reactivos de control, si es apropiado, y direcciones para determinar la secuencia en una posicion variante y para diagnosticar o clasificar el cancer de endometrio en un sujeto.

Kits diagnosticos basados en acido nucleico

Como se define en las reivindicaciones, la invencion proporciona procedimientos basados en acido nucleico para detectar variaciones geneticas de FGFR2 en una muestra biologica. La secuencia en posiciones particulares del gen FGFR2 se determina utilizando cualquier medio adecuado conocido en la tecnica, incluyendo sin limitacion una o mas hibridaciones con sondas espedficas para la amplificacion por PCR, fragmentacion de restriccion, secuenciacion directa, SSCP, y otras tecnicas conocidas en la tecnica.

Los kits de diagnostico incluyen los siguientes componentes: a) Sonda de ADN: La sonda de ADN se puede pre- marcar, de manera alternativa la sonda de ADN puede estar sin marcar y los ingredientes para el marcado pueden incluirse en el kit en envases separados; y b) Reactivos de hibridacion: El kit tambien puede contener otros reactivos y materiales envasados adecuadamente necesarios para el protocolo de secuenciacion en particular, incluyendo matrices en fase solida, si fueran aplicables, y referencias.

En otra realizacion, los kits de diagnostico incluyen: a) cebadores de determinacion de secuencia: Los cebadores de secuenciacion se pueden pre-marcar o pueden contener un resto de purificacion por afinidad o union; y b) Reactivos de determinacion de secuencia: El kit puede contener otros reactivos y materiales envasados adecuadamente y para el protocolo de secuenciacion particular.

El kit puede comprender un panel de cebadores de secuenciacion, cuyas secuencias se corresponden con secuencias adyacentes a las posiciones variantes.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Kits de diagnostico basado en anticuerpos

Como se define en las reivindicaciones la invencion tambien proporciona procedimientos basados en anticuerpos para detectar las protemas FGFR2 mutantes (o de tipo silvestre) en una muestra biologica. Los procedimientos comprenden las etapas de: (i) poner en contacto una muestra con una o mas preparaciones de anticuerpo, en las que cada una de las preparaciones de anticuerpo es espedfica para el FGFR2 mutante (o de tipo silvestre) en condiciones en las que se pueda formar un complejo antigeno-anticuerpo estable entre el anticuerpo y el FGFR2 de la muestra biologica; y (ii) detectar cualquier complejo antigeno-anticuerpo que se forme en la etapa (i) utilizando cualquier medio adecuado conocido en la tecnica, en el que la deteccion de un complejo indica la presencia de FGFR2 mutante (o de tipo silvestre).

Tfpicamente, los inmunoensayos utilizan un anticuerpo marcado o un componente antigenico marcado (por ejemplo, que compita con el antigeno de la muestra por la union al anticuerpo). Los marcadores adecuados incluyen sin limitacion, moleculas basadas en enzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas o colorantes. Tambien se conocen ensayos que amplifican las senales de la sonda, tales como, por ejemplo, los que utilizan biotina y avidina, e inmunoensayos marcados con una enzima, tales como los ensayos ELISA.

Los kits de diagnostico incluyen tipicamente uno o mas de los siguientes componentes:

(i) Anticuerpos espedficos de FGFR2: Los anticuerpos se pueden pre-marcar; de manera alternativa, el anticuerpo puede estar sin marcar y los ingredientes para marcar se pueden incluir en el kit en envases separados, o se proporciona un anticuerpo secundario marcado; y

(ii) Componentes de reaccion: El kit puede contener tambien otros reactivos y materiales envasados adecuadamente necesarios para el protocolo del inmunoensayo particular, que incluye matrices de fase solida, si fueran aplicables, y referencias.

Los kits a los que se ha hecho referencia anteriormente preferentemente incluyen instrucciones para llevar a cabo y leer el ensayo para diagnosticar o clasificar el cancer de endometrio. Ademas, los kits de diagnostico se adaptan a su realizacion de alto rendimiento y/o automatica.

Procedimientos para tratar el cancer de endometrio

Tambien se describe en el presente documento pero no se reivindica explfcitamente un procedimiento para tratar el cancer de endometrio que se caracterice por la activacion de FGFR2. El procedimiento de tratamiento comprende preferentemente la inhibicion de la actividad de FGFR2 en un sujeto. En general, el procedimiento comprende la administracion a un paciente que necesita dicho tratamiento de una cantidad eficaz de un agente que module la expresion o actividad de FGFR2, con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Por ejemplo, el agente terapeutico puede ser un acido nucleico FGFR2 antisentido, un anticuerpo inhibidor intracelular anti-FGFR2 o un inhibidor de molecula pequena.

Las composiciones de tratamiento comprenden, como agente de principio activo un inhibidor de FGFR2. Ejemplos de inhibidores adecuados incluyen los inhibidores que inhiben la smtesis de ADN FGFR2 y sus productos de expresion (por ejemplo, ARN o protema FGFR2). El inhibidor puede ser un inhibidor de FGFR2 de molecula pequena, por ejemplo, PD173074. Se puede utilizar un ARN de interferencia, en el que el inhibidor es un reactivo que inhibe la smtesis y/o traduccion de ARN, por ejemplo, un ARN inhibidor pequeno (ARNip), un ARN horquillado pequeno (ARNhp), un microARN (miARN), o una ribozima.

El inhibidor puede comprender anticuerpos dirigidos contra FGFR2, preferentemente un FGFR2 mutado, y particularmente contra al menos un dominio Ig del mismo. Preferentemente los anticuerpos son espedficos para una region de engarce entre los dominios Ig II e Ig III de FGFR2, por ejemplo, contra la mutacion S252W. En general, los anticuerpos preferidos son monoclonales, y particularmente anticuerpos modificados de manera que no induzcan reacciones inmunogenicas en un sujeto humano (por ejemplo, anticuerpos humanizados). Los anticuerpos que bloquean la actividad de FGFR2 se pueden producir y seleccionar de acuerdo con cualquier procedimiento bien conocido por un experto en la tecnica, tal como los que se describen anteriormente en el contexto de las aplicaciones diagnosticas.

Los anticuerpos intracelulares (a los que se hace referencia a veces como “intracuerpos”) se han utilizado para regular la actividad de protemas intracelulares en varios sistemas (vease, Gene Ther. 1997, 4:11; Chen y col., Hum. Gene Ther. 1994, 5:595), por ejemplo, infecciones vmcas (Marasco y col., Hum. Gene Ther. 1998, 9:1627) y otras enfermedades infecciosas (Rondon y col., Annu. Rev. Microbiol. 1997, 51:257), y oncogenes tales como p21 (Cardinale y col., FEBS Lett. 1998, 439:197-202; Cochet y col., Cancer Res. 1998, 58: 1170-6), myb (Kasono y col., Biochem Biophys Res Commun.1998, 251:124-30), erbB-2 (Graus-Porta y col., MoI Cell Biol. 1995, 15:1182-91), etc. Esta tecnologfa se puede adaptar para inhibir la actividad de FGFR2 por expresion de un anticuerpo intracelular anti- FGFR2.

Otros inhibidores que senan adecuados incluyen oligonucleotidos antisentido dirigidos contra FGFR2, mas preferentemente una isoforma de FGFR2 mutada. Los vectores que comprenden una secuencia que codifica un

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

acido nucleico antisentido de acuerdo con la invencion se pueden administrar por cualquier procedimiento conocido, tal como los procedimientos para terapia genetica disponibles en la tecnica. Para revisiones generales de los procedimientos de terapia genetica, vease, Goldspiel y col., Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 1991, 3:87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1993, 32:573-596; Mulligan, Science 1993, 260:926-932; y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 1993, 62: 191-217; May, TIBTECH 1993, 11:155-215. Los procedimientos conocidos comunmente en la tecnica de tecnologfa de ADN recombinante que se pueden utilizar se describen en Ausubel y col., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en los Capftulos 12 y 13, Dracopoli y col., (eds.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.

El termino “tratamiento” como se utiliza en el presente documento es intervenir terapeuticamente en el desarrollo o progresion de un cancer de endometrio en un sujeto. El termino “tratamiento” tambien engloba la prevencion del desarrollo o la recurrencia de un cancer de endometrio en un sujeto al que se ha diagnosticado que tiene una mutacion de activacion de FGFR2 conocida.

La expresion “cantidad terapeuticamente eficaz” se utiliza en el presente documento para significar una cantidad o dosis suficiente para modular, por ejemplo, disminuir el nivel de actividad de FGFR2, por ejemplo, aproximadamente un 10 por ciento, preferentemente aproximadamente un 50 por ciento, y mas preferentemente aproximadamente un 90 por ciento. Preferentemente, una cantidad terapeuticamente eficaz puede mejorar, o presentar un deficit clmicamente significativo de, la actividad, funcion y respuesta del sujeto. De manera alternativa, una cantidad terapeuticamente eficaz es suficiente para causar una mejona en una afeccion clmicamente significativa en el sujeto.

El inhibidor de FGFR2 inhibe la actividad o expresion de FGFR2 y se formula ventajosamente en una composicion farmaceutica, con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Esta sustancia puede llamarse entonces principio activo o agente terapeutico contra el cancer de endometrio.

La concentracion o cantidad del principio activo depende de la dosificacion y el regimen de administracion deseados, como se trata posteriormente. Los intervalos de dosis adecuados dependen mucho del inhibidor de FGFR2 que se utilice, pero puede incluir, con fines solo ejemplares, desde aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por dfa.

Las composiciones farmaceuticas pueden incluir tambien otros compuestos biologicamente activos. La frase “farmaceuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que son tolerables fisiologicamente y no producen tipicamente una alergia o reaccion inapropiada similar, tal como molestias gastricas, mareos y similares, cuando se administran a un ser humano. Preferentemente, como se utiliza en el presente documento, la expresion “farmaceuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o estatal o que esta en una lista de la Farmacopea de EE. UU. u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. El termino “vehmulo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehfculo con el que se administra el compuesto. Dichos vehfculos farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua o aceites, incluyendo los de origen del petroleo, animal, vegetal o sintetico, tales como aceite de mam, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. El agua o soluciones acuosas, soluciones salinas y solucion acuosas de dextrosa y glicerol se emplean preferentemente como vehmulos, particularmente para soluciones inyectables. Los vehfculos farmaceuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin.

Las composiciones farmaceuticas se pueden introducir por via parenteral, transmucosa, por ejemplo, via oral (per os), nasal, vaginal, o rectal, o por via transdermica. Las vfas parenterales incluyen la administracion intravenosa, intra-arteriolar, intramuscular, intradermica, subcutanea, intraperitoneal, intraventricular e intracraneal. Puede ser ventajoso dirigirse directamente al utero, por ejemplo, por administracion directa al utero o revestimiento del utero. Se puede suministrar un compuesto terapeutico en un sistema de liberacion controlada. Por ejemplo, se puede administrar un polipeptido utilizando una infusion intravenosa con una bomba continua, en una matriz de polfmero tal como acido polilactico/glutamico (PLGA), un aglomerado que contiene una mezcla de colesterol y el principio activo (SilasticR.TM.; Dow Coming, Midland, Mich.; vease la Pat. de EE. UU. N° 5.554.601) implantado subcutaneamente, una bomba osmotica implantable, un parche transdermico, liposomas, u otros modos de administracion.

Se proporcionan ejemplos de la invencion, y se entiende que son solo ejemplares, y no limitan el ambito de la invencion o las reivindicaciones adjuntas. Un experto habituado en la tecnica apreciara que la invencion puede practicarse de cualquier manera de acuerdo con las reivindicaciones y la divulgacion del presente documento.

Ejemplo 1

Deteccion de mutaciones activadoras de FGFR2. Los hallazgos de los inventores muestran que la activacion y sobre-expresion de FGFR2 tiene un papel en la tumorigenesis de endometrio. El exon 8 tiene tres nucleotidos mas que el exon 9, mientras que la isoforma FGFR2b tiene un codon mas que la isoforma FGFR2c. Tambien se proporciona especificidad de senalizacion por la expresion tisular espedfica de receptores, ligandos y proteoglicanos de sulfato de heparina (Allen y col., 2001; Fiore, 2001). Debido a las diferencias de longitud de las isoformas “b” y “c” de FGFR2, todas las mutaciones se numeran con respecto a la isoforma FGFR2b (SEQ ID NO: 2; NP_075259.2)

que se expresa epitelialmente. Para las que se producen corriente abajo del exon 8 los inventores proporcionan en el presente documento la mutacion equivalente numerada con respecto a la isoforma FGFR2c (SEQ ID NO: 3; NP_000132.1) entre parentesis y en la Tabla 2. La variante N550K (N549K) identificada en las dos lmeas celulares de endometrio probablemente daba como resultado la activacion del receptor como los cambios sin sentido de la 5 lmea germinal identicos o similares que se habfan informado en FGFR2 y FGFR3 en pacientes con smdrome de

Crouzon (Kan y col., 2002) e hipocondroplasia (Bellus y col., 1995) (FIG. 1).

Lo siguiente que los inventores buscaron fue determinar el espectro y frecuencia de las mutaciones de activacion de FGFR2 en los canceres uterinos primarios. Se llevo a cabo la secuenciacion directa de los exones en los que se habfan identificado previamente las mutaciones activadoras de FGFR2 y FGFR3 en la lmea germinal (exones 7, 8, 10 10, 13 y 15) en 187 canceres uterinos primarios, que representaban todos los grados y estadios de tumor y los

subtipos histologicos principales de carcinoma de endometrio (Tabla 1).

Tabla 1. Demograffa de pacientes con cancer uterino, caractensticas de la enfermedad y estado de la mutacion de

FGFR2

Cohorte n= -187

Cohorte completa con Casos con mutaciones

cancer uterino n ( %) de FGFR2 n ( %)

Edad (anos) Raza

+1 LO CD CD ,1*

Blanca

150 (80) 18 (12)

Afroamericana

33 (18) 1 (3)

Otra o no especificada Histologfa

4(2) 0(0)

Endometrioide

115 (61) 18 (16)

Seroso o mezclado de seroso/endometrioide

45 (24) 1 (2)

Celulas claras

8(4) 0(0)

Adenocarcinoma no especificado de otra manera

1 (<1) 0(0)

Carcinosarcoma

17(9) 0(0)

Sarcoma del estroma uterino

1 (<1) 0(0)

Estadio I

79 (42) 9 (11)

II

16(9) 1 (6)

III

67 (36) 6(9)

IV

25 (13) 3(12)

Grado FIGO

1

49 (26) 7(14)

2

39 (21) 9 (23)

3t

99 (53) 3(3)

*Media ± desviacion estandar

tTodos los carcinomas con caractensticas serosa y de celulas claras junto con carcinosarcomas y sarcomas se

clasificaron como de grado 3

15 Se debena senalar que la A315T que se informa en ESS-1 derivado de un sarcoma del estroma de endometrio que se produce en la isoforma expresada en el mesenquima (FGFR2c) y todos los carcinosarcomas (tumores con ambos elementos, epitelial y del estroma) tambien se exploraron respecto a mutaciones en el exon 9 (NM_000141). Para un subgrupo de tumores (32 canceres de endometrio endometrioides mas 17 carcinosarcomas) se secuenciaron los exones 5-18 que englobaban el segundo y el tercer domino de inmunoglobulina (a los que se hace referencia a partir 20 de aqrn como D2 y D3), el dominio transmembrana y el dominio cinasa completo para determinar la existencia relativa de nuevas mutaciones somaticas. Ademas de las mutaciones encontradas en los exones 7, 10, 13 y 15, se identifico una mutacion adicional en esta exploracion de mutaciones mas extensa, una eliminacion de 2 pb en el exon 18. Las mutaciones se identificaron en 19 casos (un 10%). Dieciocho de 115 canceres de endometrio endometrioides (un 16%) teman mutaciones y un unico carcinoma seroso (1 de 45, un 2%) albergaba una 25 mutacion. No se apreciaron mutaciones en carcinosarcomas o canceres de celulas claras.

Tabla 2. Espectro de mutaciones de FGFR2 en canceres de endometrio primarios

Nucleotido Codon Codon

Caso ID

FGFR2ba FGFR2bb FGFR2cc Histotipo Estadio Grado Estado MSI

AN3 CAd

A929G K310R K310R endometrioide positivo

AN3 CAd

T1650G N550K N549K endometrioide positivo

MFE296

T1650G N550K N549K endometrioide negativo

ESS-1

G943Ae A315Tf sarcoma del estroma negativo

1359

C755G S252W S252W endometrioide I 2 positivo

1574

C755G S252W S252W endometrioide I 2 positivo

1492d

C755G S252W S252W endometrioide I 1 negativo

1484

C755G S252W S252W endometrioide III 3 negativo

1316

C755G S252W S252W endometrioide III 1 negativo

1792

C755G S252W S252W endometrioide III 1 positivo

1438

C755G S252W S252W seroso IV 3 negativo

1482

C755G S252W S252W endometrioide IV 2 positivo

1267

T1650A N550K N549K endometrioide II 2 positivo

1391

T1650A N550K N549K endometrioide III 2 positivo

1528

T1650G N550K N549K endometrioide IV 2 negativo

1655

A1127G Y376C Y375C endometrioide III 2 positivo

1492d

A1127G Y376C Y375C endometrioide I 1 negativo

1684

C1118G S373C S372C endometrioide I 1 positivo

1094

T1147C C383R C382R endometrioide I 1 positivo

1361

T1175G M392R M391R endometrioide I 1 positivo

1744

A1642G I548V I547V endometrioide III 2 positivo

1717

A1978G K660E K659E endometrioide I 2 negativo

1272

Intron 10 A>C+2 Cambio de la Cambio de la endometrioide I 1 negativo

1289

elim CT 2290-91 fase de fase de endometrioide I 3 positivo

lectura lectura

a Numeracion respecto a NM_022970.2 b Numeracion respecto a P_075259.2 c Numeracion respecto a NP_000132.1 d Dos mutaciones en una muestra.

e Numeracion de acuerdo con NM_000141 ya que ESS-1 se derivaba de un sarcoma del estroma que expresa la isoforma FGFR2c.

f Falta una alanina en la posicion equivalente en FGFR2b.______________________________________________

Para todas las mutaciones, se secuencio el ADN constitutivo para confirmar que la mutacion apareda somaticamente. Entre los casos endometrioides, habfa un exceso de mutaciones de FGFR2 en los casos con 5 deficiencia de reparacion de no coincidencias (11 de 49, un 22 %) en comparacion con los casos con una reparacion de no coincidencias normal (6 de 61, un 10 %), aunque esto no alcanzaba una significacion estadfstica (p = 0,10). Se debena senalar que el estado de inestabilidad microsatelite no se determino en cinco tumores. Los inventores no incluyeron la eliminacion de 2 pb en un caso de MSI positivo ya que es improbable que sea activadora y por lo tanto puede representar un testigo de mutacion. Aunque hay un exceso de mutaciones en tumores que demuestran una 10 inestabilidad microsatelite, los inventores argumentanan que estas mutaciones en FGFR2 son patogenas debido al hecho de que las mismas mutaciones se observan en tumores primarios positivos a MSI y de microsatelite estable (MSS) y que la mayona de las mutaciones son identicas a las mutaciones activadoras identificadas en la lmea germinal, una coincidencia que no se esperana si fueran mutaciones testigo asociadas con inestabilidad de microsatelite.

15 De las 11 mutaciones diferentes identificadas por los inventores, se habfa informado previamente que 7 estaban asociadas con craneosinostosis o smdromes de displasia esqueletica, una (A315T) se produda en un resto de FGFR2c en el que se habfa informado una mutacion sin sentido similar (A315S) y cuatro mutaciones eran nuevas (Figura 1). La distribucion de las mutaciones de acuerdo con el histotipo tumoral, junto con el grado y estadio del tumor que albergaba las mutaciones FGFR2 se resumen en la Tabla 2. La mutacion S252W era la mutacion 20 identificada mas comun, que se vefa en 8 tumores independientes. Esta mutacion se produce en la region del engarce entre D2 y D3, que proporciona contactos clave con el ligando FGF. Las mutaciones S252W y la P253R adyacente producen el smdrome de Apert, el mas grave de los smdromes de craneosinostosis que se caracteriza por craneosinostosis y sindactilia grave de las manos y pies (Park y col., 1995).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Una combinacion de estudios que utilizan ensayos bioqmmicos, estructurales y biologicos ha demostrado que la mutacion S252W muestra un aumento de union al ligando y promiscuidad de ligando (Ibrahimi y col., 2001; Ibrahimi y col., 2004; Yu y col., 2000). Se han llevado a cabo extensos estudios de afinidad in vitro con ambos receptores mutantes FGFR2c S252W y FGFR2b S252W demostrando que esta mutacion aumenta la afinidad de union del receptor por multiples FGF en 2-8 veces, ademas de alterar las especificidades de union al ligando atribuidas a las isoformas cortadas y empalmadas alternativamente (Ibrahimi y col., 2004).

La prevalencia de la mutacion S252W en este panel de tumores sugiere una seleccion positiva para este mutante en canceres de endometrio endometrioides. Aunque no se ha examinado la expresion de todos los ligandos FGF en el endometrio de ciclo normal y canceres de endometrio, hay varios estudios que informan de la expresion de FGF2 predominantemente en la parte basal del epitelio luminal y glandular (Moller y col., 2001; Sangha y col., 1997). Varios estudios tambien han demostrado un aumento de la expresion de FGF2 en el epitelio glandular asociado con el complejo hiperplasia y adenocarcinoma (Gold y col., 1994). Las celulas epiteliales de endometrio normalmente expresan solo la isoforma FGFR2b que no se une a FGF2, Sin embargo la adquisicion de la mutacion S252W en estas celulas sena anticipada, dando como resultado una activacion autocrina del receptor FGFR2b S252W. La mutacion S252W tambien hace posible que el receptor mutante se una a FGF9 que solamente se expresa altamente en el estroma de endometrio (Tsai y col., 2002). La prevalencia de la mutacion S252W sugiere que las diferentes isoformas FGFR2 tienen papeles importantes en la mediacion de la senalizacion en direccion epitelial- mesenquimatica en el endometrio.

Se identificaron cuatro mutaciones del dominio extracelular, K310R y A315T en las lmeas celulares y S373C (S372C) y Y376C (Y375C) en tumores primarios, esta ultima mutacion se encontro en dos tumores independientes (Figura 1, Tabla 2). Los estudios funcionales que se llevaron a cabo en estas mutaciones extracelulares en FGFR2c (o el paralogo FGFR3) daban como resultado la perdida o la ganancia de un resto de cistema adicional lo que ha demostrado que estos cambios sin sentido daban como resultado la dimerizacion constitutiva del receptor debido a la formacion de puentes disulfuro inter-moleculares mas que intra-moleculares (Naski y col., 1996). En la lmea germinal, se ha informado de mutaciones extracelulares yuxtamembrana S372C y Y375C de FGFR2c en varios individuos con smdrome de cutis gyrata de Beare-Stevenson, un smdrome de craneosinostosis con un amplio intervalo de caractensticas clmicas (Przylepa y col., 1996). Las mutaciones paralogas en FGFR3c (G370C y Y373C) tambien se asocian con una condrohiperplasia grave, displasia tanatoforica tipo I (Rousseau y col., 1996). Al igual que con la mutacion A315S, la mutacion A315T es probable que confiera en FGFR2c la capacidad de unirse a FGF10 de manera ilegftima (Ibrahimi y col., 2004).

Los inventores identificaron dos mutaciones; C383R (C382C) y M392R (M391E) en el dominio transmembrana. La mutacion C383R que identificaron los inventores es similar a la mutacion sin sentido conservadora en la posicion paraloga en FGFR3 (G380R) que se encuentra en mas del 95 % de los pacientes con acondroplasia (Shiang y col., 1994). Se ha informado que la mutacion G380R de FGFR3 aumenta la semivida del receptor y hace que el receptor sea resistente a la internalizacion inducida por el ligando (Mon-sonego-Ornan y col., 2000). Un estudio mas reciente mostraba que mientras que el receptor de tipo silvestre sufre la degradacion lisosomica tras la estimulacion por el ligando, el receptor mutante G380R se recicla de nuevo a partir de los lisosomas en la membrana plasmatica aumentando la senalizacion de FGF (Cho y col., 2004). La nueva mutacion M392R esta en dos restos proximales a la mutacion bien estudiada A391E de FGFR3 asociada con el smdrome de Crouzon con acanthosis nigricans (Meyers y col., 1995). Los analisis bioffsicos de la mutacion A391E demostraban un cambio en la energfa libre de dimerizacion del dominio transmembrana de FGFR3 consistente con la estabilizacion del dfmero (Li y col., 2006). Aunque la mutacion C382R en FGFR2c habfa demostrado previamente que daba como resultado la fosforilacion del receptor constitutivo y la transformacion de las celulas NIH3T3 (Li y col., 1997), el esclarecimiento del mecanismo exacto de la activacion del receptor por estas mutaciones de FGFR2b transmembrana sigue estando por explorar.

Ademas de las mutaciones de los dominios extracelulares y transmembrana, se identificaron cuatro mutaciones diferentes en el dominio cinasa de FGFR2. Aunque dos de estas, N550K (N549K) y K660E (K659E), no se han identificado como mutaciones de la lmea germinal en ningun smdrome de craneosinostosis, la mutacion similar N549H en FGFR2c se ha asociado con el smdrome de Crouzon (Kan y col., 2002) y se han visto mutaciones identicas en las posiciones paralogas en FGFR3 asociadas con hipocondrodisplasia (N540K) y displasia tanatoforica II (K650E) (Naski y col., 1996). Las estructuras cristalinas de las cinasas de FGFR2c mutante N549H y K650N muestran que estas mutaciones activan la cinasa por la perdida del freno molecular autoinhibidor en la region bisagra de la cinasa (M. Mohammadi, resultados no publicados).

La consecuencia patologica de la nueva mutacion de corte y empalme IVS10+2A>C es desconocida, sin embargo se ha intentado especular con que resultana en un aumento de la senalizacion del receptor. Hay un corte y empalme alternativo en la region intracelular yuxtamembrana en FGFR1-3 que da lugar a la inclusion o exclusion de dos aminoacidos, valina y treonina (VT) corriente abajo del exon 10. La mutacion IVS10+2A>C da como resultado un sitio donante GCAAGT no canonico y dado que se observa el par donante/receptor GC-AG de 15-30 x mas frecuentemente en el genoma que el par donante/receptor GA-AG (Burset y col., 2000; Chong y col., 2004) la mutacion IVS10+2A>C puede dar como resultado el aumento de la proporcion relativa de la isoforma +VT. La protema de senalizacion del adaptador FRS2 que une FGFR a las rutas mApK y PI3K se une a una secuencia en el dominio yuxtamembrana de FGFR1 murino que incluye el corte y empalme alternativo VT (Burgar y col., 2002). Por tanto, la mutacion IVS10+2A>C probablemente de como resultado un sitio donante al corte y empalme mas eficaz

que aumenta los niveles de la transcripcion +VT, que a su vez resultana en un aumento de la senalizacion mediada por FRS2a.

Se demostro que un tumor de endometrio albergaba una nueva eliminacion de 2 pb 2287-88 de CT, lo que da lugar a un cambio de la fase de lectura y un cambio de LTTNE por LTHNQParada con un truncamiento premature en el 5 codon 766, el ultimo codon del exon 18. Esta eliminacion de 2 pb puede dar como resultado un receptor FGFR2 truncado que se activa constitutivamente de manera similar a la transcripcion C3 truncada de manera similar en FGFR2 (Moffa y col., 2004) o de manera alternativa puede representar simplemente una mutacion testigo.

Dos muestras de endometrio demostraron albergar dos mutaciones, la lmea celular AN3CA con MSI positiva que albergaba N550K (N549K) y K310R y el tumor 1492 con MSI negativa que albergaba la S252W y Y376C (Y375C). El 10 descubrimiento de dos mutaciones activadoras presumiblemente dominantes en el mismo tumor era inesperado. Es interesante senalar que en cada uno de los casos hay una mutacion que se sabe que da como resultado una activacion del receptor constitutivo independiente del ligando, junto con la S252W dependiente del ligando o la K310R sin caracterizar, sugiriendo que puede existir una presion selectiva adicional para el aumento de la activacion de FGFR2 en el epitelio del endometrio.

15 Ejemplo 2

Tratamiento de cancer de endometrio por inhibicion de FGFR2 MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS Analisis de secuenciacion

El analisis de la mutacion se llevo a cabo como se habfa descrito previamente (8). Las secuencias de cebador de 20 PCR eran M13 con cola y se llevo a cabo la secuenciacion en dos direcciones. Las secuencias de cebador estan disponibles por peticion al autor.

Cultivos celulares y reactivos

La lmea celular MFE296 de endometrio humana se obtuvo en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (Salisbury, Wiltshire, RU). Las lmeas celulares de endometrio humanas AN3CA, HEC1A, Ishikawa, RL952, y KLE las 25 proporciono el Dr. Paul Goodfellow (Washington University, St. Louis, MO). Las celulas MFE296 se cultivaron en MEM suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, y penicilina-estreptomicina. Las celulas AN3CA se cultivaron en DMEM suplementado con un 10 % de FBS, aminoacidos no esenciales, 2 mM de L- glutamina, y penicilina-estreptomicina. Las celulas HEC1A se cultivaron en un 50 % de DMEM y un 50 % de RPMI 1640, suplementado con un 10 % de FBS y penicilina-estreptomicina. Las celulas Ishikawa y RLP952 se cultivaron 30 en DMEM suplementado con un 10% de FBS, aminoacidos no esenciales y penicilina-estreptomicina. Las celulas KLE se cultivaron en un 50 % de DMEM y un 50 % de medio F-12 suplementado con un 10 % de FBS y penicilina- estreptomicina. Todos los medios, FBS, y suplementos se obtuvieron en Invitrogen (Carlsbad, CA). Todas las celulas se cultivaron a 37 HC en una atmosfera humidificada que contema un 5% de CO2. El PD173074 se obtuvo en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), reconstituido con DMSO con una concentracion de reserva de 1 mM, y almacenado a 35 -20 HC. El plasmido lentivector KH1-LV fue proporcionado amablemente por la Dra. Maria S. Soengas (University of

Michigan, Ann Arbor, MI), y el paquete de plasmidos lentivmcos pNHP, pVSV-G, y pTAT fue proporcionado amablemente por el Dr. Matthew Huentelman (Translational Genomics Research Institute, Phoenix, AZ).

Diseno del ARNhp

Se disenaron dos construcciones independientes de ARNhp, que se dirigfan a dos exones diferentes de FGFR2 40 (exon 2 y exon 15), contra las siguientes secuencias: ARNhp dirigido al exon 2: TTAGTTGAGGATACCACATTA (SEQ ID NO: 4; nucleotidos 79-99, NM_022970); ARNhp dirigido al exon 15: ATGTATTCATCGAGATTTA (SEQ ID NO: 5; nucleotidos 1866-1884, NM_022970). Tambien se diseno una construccion de ARNhp no silenciante basandose en una secuencia de ARNip no silenciante de Qiagen (SEQ ID NO: 6; AATTCTCCGAACGTGTCACGT), y se utilizo como control negativo. Se hibridaron y clonaron los correspondientes oligonucleotidos en el lentivector 45 KH1-LV. El vector lentivmco KH1-LV auto-inactivador permite la expresion de secuencias cortas horquilladas bajo el control del promotor de H1 y la expresion de GFP bajo el control del promotor de ubiquitina-C humana, haciendo posible la supervision facil de la eficacia de la transduccion. Las estrategias de clonacion estan disponibles de los autores por peticion.

Produccion lentivmca

50 Se revistieron matraces de 75 cm2 con 50 mg/ml de poli-D-lisina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se sembraron las celulas HEK293FT (Invitrogen, Carlsbad, CA) con una densidad de 8x106 celulas por matraz. Al dfa siguiente, se transfectaron las celulas con 7,1 |jg de pNHP, 2,8 |jg de pVSV-G, 0,5 |jg de pTAT, y 3,5 |jg de KH1-LV utilizando el reactivo de transfeccion SuperFect (Qiagen, Valencia, CA) con una relacion 4:1 de SuperFect (jil) respecto a ADN (jig), segun el protocolo del fabricante. Los medios que conteman el virus se recolectaron a las 24 y 40 horas 55 despues, se combinaron, se filtraron a traves de un filtro Durapore de union a protemas inferiores de 0,45 mm

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

(Millipore Corporation, Billera, MA) para eliminar los restos celulares, y se hicieron almuotas de la preparacion vmica y se almacenaron a -80 DC hasta su uso.

Transduccion lentivmca

Las celulas se colocaron en placas con una densidad de 4x105 celulas por pocillo en una placa de 6 pocillos. Al dfa siguiente, las celulas se infectaron con las reservas lentivmicas en presencia de 6 pg/ml de polibrene (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El vector vacm y las infecciones con ARNhp no silenciante se utilizaron como controles para cada experimento. Se alcanzo una eficacia de transduccion mayor del 90 % en cada experimento con ARNhp, como se determino por la visualizacion eGFP (datos no mostrados).

Ensayo de inhibicion del crecimiento

Veinticuatro horas tras la infeccion, se tripsinizaron las celulas y se colocaron en placas de 96 pocillos en medio de cultivo completo con una densidad de 5.000 celulas por pocillo, por triplicado, y se evaluo la proliferacion utilizando el ensayo de sulforrodamina B (SRB) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). En los tiempos indicados, los pocillos se fijaron con un 10 % (p/vol) de acido tricloroacetico, tenido con SRB durante 30 min, y se lavaron con un 1 % (vol/vol) de acido acetico. El colorante unido a la protema se disolvio en una solucion de base Tris 10 mM, y se midio la absorbancia a 510 nm. Para los estudios farmacologicos de PD173074, las celulas se colocaron en placas en medio de cultivo completo a una densidad de 5.000 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos. Al dfa siguiente, se anadieron cantidades crecientes de PD173074 y se evaluo la proliferacion 72 horas despues utilizando el ensayo SRB.

Marcado con Anexina V-FITC de celulas apoptoticas

Se utilizo la tincion con Anexina V-FITC para medir la exposicion a fosfatidilserina en las celulas que sufren apoptosis, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BioVision, Inc. Mountain View, CA). Se alcanzo la cafda con las construcciones de ARNip mas que con ARNhp ya que este ultimo tambien expresaba GFP, que tema un solapamiento del espectro de emision con FITC. Se colocaron en placas 2,5x105 celulas por pocillo en una placa de 6 pocillos. Veinticuatro horas mas tarde, se transfectaron las celulas con 25 nM de ARNip no silenciante (NS) o ARNip FGFR2 x2 utilizando el reactivo de transfeccion Lipofectamina 2000. Se permitio que el duplex ARNip formara un complejo con la Lipofectamina 2000 durante 20 minutos a temperatura ambiente, y se llevo a cabo la transfeccion a 37 nC durante 24 horas. 48 horas tras la transfeccion, se recolectaron las celulas flotantes y unidas, se lavaron en PBS fno, se resuspendieron en el tampon de union a Anexina (10 mM de Hepes (pH 7,4), 140 mM de NaCl, 2,5 mM de CaCl2), se tineron con 500 ng/ml de Anexina V-FITC y 1 pg/ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y se analizo en cuanto a las celulas positivas a anexina utilizando un citometro de flujo ADP CyAn y el software Summit, version 4.3 (Dako Cytomation, Carpinteria, CA). Para los estudios de PD173074, se colocaron las celulas en placas con una densidad de 1x105 celulas por pocillo en una placa de 6 pocillos. 24 horas despues, se trataron las celulas con 1 pM de PD173074 o DMSO (vehmulo control), y, en el punto de tiempo indicado, se tineron con Anexina V-FITC y se analizaron por citometna de flujo.

Analisis del ciclo celular

Las celulas se colocaron en placas con una densidad de 1x105 celulas por pocillo en una placa de 6 pocillos. Al dfa siguiente, las celulas se trataron con 1 pM de PD173074 o DMSO (vehmulo control). 72 horas despues, se tineron las celulas con yoduro de Propidio como se habfa descrito {Krishan, 1975 n° 28} y se analizaron por citometna de flujo. El analisis del ciclo celular se llevo a cabo utilizando el software ModFit (Verity Software House, Inc. Topsham, ME).

Analisis de transferencia de Western

Las celulas se colocaron en placas en placas de 60 mm2 con una densidad de 2x106 celulas por placa. Al dfa siguiente, las celulas se privaron, una noche durante 18 horas, con un 0,2 % de FBS o se mantuvieron en medio de cultivo completo, y luego se incubaron con concentraciones crecientes de PD173074 durante tres horas. Las celulas se lavaron con PBS enfriado en hielo, se lisaron con tampon de cinasa [20 mM de Hepes pH 7,4, 2 mM de EGTA, un 1 % de Triton x100, un 10 % de glicerol, 1 mM de Na3VO4, 1 mM de NaF, 100 uM de AEBSF, y 1 comprimido/10 ml de Mini inhibidor completo de proteasa (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)], se sonico brevemente, y se estimaron las concentraciones de protema utilizando el reactivo Quick Start Bradford con referencias de gamma globulina bovina (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se separaron cantidades iguales de protema por SDS-PAGE en geles de gradiente del 4-12% y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinildeno (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se inmunotransfirieron las membranas con anticuerpos para AKT, ERK1/2, p38, STAT-3 y STAT-5, PLCy fosforilados y totales y PTEN total (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). La expresion de FGFR2 se detecto con el anticuerpo BekC17 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Se utilizaron anticuerpos secundarios de cabra anti-raton o anti-conejo conjugados con peroxidasa de rabano rusticano (Biomeda, Foster City, CA), seguido por tincion quimioluminiscente. Para los estudios de ARNhp, se recolectaron los lisados 48 horas despues de la transduccion con ARNhp y se procesaron como se ha descrito anteriormente.

5

10

15

20

25

Analisis estadfstico

Los analisis estadfsticos se llevaron a cabo utilizando un GraphPad Prism version 4.0 para Macintosh (GraphPad Software, San Diego, CA). Los valores de la CI50 se calcularon por el analisis de respuesta a la dosis utilizando una regresion no lineal de la respuesta sigmoidea a la dosis con pendiente variable. Los datos de apoptosis se analizaron por ANOVA de una via. Las diferencias significativas entre los grupos de tratamiento se determinaron utilizando un ensayo t de Student. Todos los valores de P se consideraban significativos cuando P<0,05. Los datos se expresaron como la media ± SE.

RESULTADOS

Patrones de las mutaciones de FGFR2, PTEN y KRAS2 en los canceres de endometrio primarios: mutacion concomitante de FGFR2 y PTEN y mutacion mutuamente excluyente de FGFR2 y KRAS2.

Debido a que las mutaciones de PTEN y KRAS2 son comunes en el cancer de endometrio endometrioide, los inventores buscaron primero determinar si la activacion de FGFR2 se produda en tumores que albergaran mutaciones de perdida de funcion en PTEN y mutaciones de ganancia de funcion en KRAS. Los inventores secuenciaron los nueve exones de PTEN y el exon uno de KRAS en 116 tumores de endometrio de los que conoda el estado de mutacion FGFR2. Debido a la cantidad limitada de ADN disponible, los inventores solo secuenciaron el exon uno de KRAS, ya que las mutaciones en el exon uno representan mas de 96 % de las mutaciones de KRAS en el cancer de endometrio endometrioide (The Catalog of Somatic Mutations in Cancer,
http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). El analisis de mutacion revelaba mutaciones de PTEN en el 70 % (82/116) de los tumores. De estos tumores con mutaciones de FGFR2, un 77% (14/18) tambien albergaban una mutacion de PTEN, demostrando que las mutaciones en FGFR2 se producen frecuentemente junto con las mutaciones en PTEN en los tumores de endometrio endometrioides. Las mutaciones en KRAS se identificaron en el 12% (15/116) de los tumores. Las mutaciones activadoras en FGFR2 y KRAS eran mutuamente excluyentes. Se senala que un tumor posefa una mutacion de cambio de fase de lectura en FGFR2 (2290-91 eliminacion de CT) y contema una mutacion de KRAS. Sin embargo, como la naturaleza patogenica de esta mutacion de FGFR2 es desconocida, los inventores concluyeron que las mutaciones activadoras en FGFR2 eran mutuamente excluyentes con las mutaciones activadoras en KRAS. Las mutaciones activadoras en PTEN se produdan junto con las mutaciones en KRAS y en FGFR2 (Tabla 3).

Caso ID

Mutacion en FGFR2 Mutacion KRAS Mutacion en PTEN Estadio Grado MS

AN3CA

p.Lys310Arg; Asn550Lys ts p.Arg130fsX4 +

MFE296

p.Asn550Lys ts ts -

1359

p.Ser252Trp ts ts I 2 +

1574

p.Ser252Trp ts p.[Gly44AlafsX7(+)Y68X] I 2 +

1492

p.Ser252Trp; Tyr376Cys ts p.Arg130Gly I 1 -

1484

p.Ser252Trp ts p.[Arg130Gly(+)F56V] III 3 -

1316

p.Ser252Trp ts p.Leu112Val III 1 -

1792

p.Ser252Trp ts ts III 1 +

1482

p.Ser252Trp ts p.Thr319X IV 2 +

1267

p.Asn550Lys ts p.Ala126Asp II 2 +

1391

p.Asn550Lys ts p.Q245X III 2 +

1528

p.Asn550Lys ts p.Arg130Gly IV 2 -

1655

p.Tyr376Cys ts p.Arg308IlefsX5 III 2 +

1684

p.Ser373Cys ts p.Arg130Gly I 1 +

1094

p.Cys383Arg ts p.Leu108-Asp109 I 1 +

1361

p.Met392Arg ts p.Thr319X I 1 +

1744

p.Ile548Val ts p.[Phe21 SerfsX2(+)K66N] III 2 +

1717

p.Lys660Glu ts p.Ser59X I 2 -

1272

c.1287+2A>C ts ts I 1 -

1289

p.Thr762fsX3 p.Gly12Asp ts I 3 +

1284

ts p.Gly12Asp p.[Arg130Gly(+)Gly 165Arg] II 1 +

1606

ts p.Gly12Asp p.Val191GlyfsX7 I 1 -

1856

ts p.Gly12Asp ts I 2 +

1411

ts p.Gly12Ala p.[Arg47Gly(+)Gly165Arg] III 2 +

1966

ts p.Gly12Ala p. [Arg 130X(+)Ala148LysfsX3] III 2 +

1393

ts p.Gly12Cys p.Ile4HisfsX5 III 2 +

1609

ts p.Gly12Cys p.Lys267ArgfsX8 I 3 +

1044

ts p.Gly12Val p.Arg130Gln III 3 +

1599

ts p.Gly12Val p.[Arg130Gly(+)Gln171X] III 2 +

1873

ts p.Gly12Val p.V290X I 1 +

1656

ts p.Gly12Val p.Gly251 ValfsX5 I 1 -

1664

ts p.Gly12Asp p.Tyr16LeufsX27 III 1 -

1287

ts p.Gly13Asp p.[H123Y(+)Ala126Ser] III 1 -

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

(continuacion)

Caso ID Mutacion en FGFR2 Mutacion KRAS______Mutacion en PTEN______Estadio Grado MS

1576_____________ts______________p.Gly13Asp___________p.Arg130Gln____________|_______2 +

Numeracion con respecto a la secuencia proteica de FGFR2 NP_075259.2; Secuencia proteica de KRAS NP_203524.1; Secuencia proteica de PTEN NP_000305.3._____________________________________________

La cafda por ARNhp de FGFR2 induce la muerte celular en las celulas del cancer de endometrio, a pesar de la inactivacion de PTEN

Debido a la existencia de mutaciones de FGFR2 activadoras en el contexto de la inactivacion de PTEN en el cancer de endometrio y el papel conocido de la ruta PI3K/AKT en la promocion de la supervivencia celular, los inventores buscaron a continuacion determinar si la inhibicion del FGFR2 podfa inducir la muerte celular en presencia de inactivacion de PTEN. El impacto de cafda por ARNhp de la expresion de FGFR2 sobre la proliferacion celular se evaluo en las celulas de cancer de endometrio AN3CA y MFE296, que albergaban ambas una mutacion activadora de FGFR2. Ademas, las AN3CA tienen mutaciones en ambos alelos PTEN y no expresan PTEN (FIG. 1E). Las MFE296, por otra parte, son de tipo silvestre para PTEN y PIK3CA (The Catalog of Somatic Mutations in Cancer,
http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic). Las celulas AN3CA y MFE296 se transdujeron lentivmcamente con dos ARNhp independientes que se dirigen a FGFR2. Se midio la proliferacion y viabilidad celular en multiples puntos de tiempo. La cafda de FGFR2 inhibfa la proliferacion celular tanto en celulas AN3CA y MFE296 (Figura 1a, B), demostrando la eficacia de dirigirse a FGFR2 activado incluso en presencia de inactivacion de PTEN. La cafda de la expresion de FGFR2 se confirmo y se examino la fosforilacion de ERK1/2 y AKT por transferencia de Western 48 horas despues de la transduccion con ARNhp. Como se muestra en la Figura 1C, ambas construcciones de ARNhp FGFR2 daban como resultado la cafda de mas del 90 % de protema FGFR2. Se apreciaba una disminucion de los niveles de fosfo-ERK1/2 en celulas AN3CA despues de la cafda de FGFR2. El efecto era mas prominente cuando las celulas se cultivaban en un 0,2 % de FBS. Sin embargo no se observo ningun cambio en la fosforilacion en AKT en la serina 473 (Figura 1C), consistente con el estado de la mutacion de PTEN de esta lmea celular.

Para confirmar que la muerte que se observaba a continuacion de la cafda de FGFR2 era debida a la induccion de apoptosis, se transfectaron las celulas AN3CA con ARNip que se dirigfa contra FGFR2 y se marcaron con Anexina V-FITC para detectar las expuestas a fosfatidilserina por citometna de flujo. Era evidente un aumento de la tincion positiva a Anexina V-FITC 48 horas despues de la transfeccion con ARNip FGFR2 en comparacion con el control de ARNip no silenciante, indicando que estas celulas sufnan apoptosis (Figura 1D). La drastica inhibicion de la viabilidad celular que se observaba despues de la cafda de FGFR2 sugiere que estas celulas pueden demostrar una adiccion oncogenica. El FGFR2 activado por lo tanto es una diana terapeutica en el cancer de endometrio.

Las celulas del cancer de endometrio que expresan FGFR2 activado son sensibles a PD173074, un inhibidor pan- FGFR

Se trataron seis lmeas celulares de cancer de endometrio (2 FGFR2 mutantes N550K, y 4 FGFR2 de tipo silvestre) con concentraciones crecientes de PD173074, un inhibidor de tirosina cinasa pan-FGFR. Este inhibidor demuestra una alta selectividad contra los FGFR (FGFR1, CI50=~25 nM) y VEGF (VEGFR2, CI50=~100 nM) y se ha demostrado que induce apoptosis en las celulas de mieloma con una translocacion activadora t(4;14) y mutaciones activadoras en FGFR3 (10). Como se muestra en la Figura 2A, las dos lmeas celulares de cancer de endometrio con FGFR2 mutante eran de 10-40x mas sensibles a la inhibicion con PD173074 que las lmeas celulares con el FGFR2 de tipo silvestre. La lmea AN3CA, que tema mutaciones de perdida de funcion en ambos alelos de PTEN, era la lmea celular mas sensible. La marcacion con Anexina V-FITC indicaba que ~70 % de las celulas AN3CA sufnan apoptosis 96 horas tras el tratamiento farmacologico (Figura 3A). Ademas el analisis del ciclo celular revelaba que el tratamiento con PD173074 induda la detencion de G1 de las celulas AN3CA (Figura 3B). Como se muestra en la FIG. 2C, la mutacion constitutivamente activa N550K del dominio cinasa de FGFR2 da como resultado un aumento de la proliferacion por encima de la inducida por el receptor de tipo silvestre (TS) tanto en ausencia (-FGF2) como en presencia (+FGF) de ligando FGF2 exogeno. Estos datos sugieren que aunque la mutacion N550K es constitutivamente activa, tambien necesita el ligando para una actividad completa. La lmea celular pro-B BaF3 dependiente de interleucina murina se utiliza de manera rutinaria como un sistema modelo para la evaluacion de la funcion de receptor de tirosina cinasa. Aunque la proliferacion y la supervivencia celular de BaF3 normalmente dependen de IL-3, la senalizacion del receptor de tirosina cinasa activado puede sustituirse por IL-3 para mantener la viabilidad y proliferacion celular. Se llevaron a cabo ensayos de proliferacion en ausencia de IL-3 y en presencia de 1 nM de FGF2 y 10 ug/ml de heparina y se ensayo la proliferacion tras 5 dfas utilizando el kit de Proliferacion/Citotoxicidad celular ViaLight (Lonza Rockland Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La muerte celular despues de la inhibicion pan-FGFR se asocia con inhibicion de ERK, inhibicion parcial de AKT, pero no con inhibicion de STAT3 o activacion de p38

Se ha informado que la inhibicion de la fosforilacion de ERK1/2, AKT, y STAT3/5, junto con la activacion retardada de p38, es una caractenstica comun asociada a la induccion de muerte celular en las celulas que demuestran adiccion oncogenica (17). Para determinar si el tratamiento con PD173074 daba como resultado una inhibicion similar

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

de estas rutas, se evaluaron los niveles de fosforilacion de ERK1/2, AKT, STAT3/5, y p38 por transferencia de Western en tres lmeas celulares (dos sensibles y una resistente a PD173074). La expresion de STAT5 no era detectable por transferencia de Western en estas tres lmeas celulares (datos no mostrados). Como se muestra en la Figura 4, el tratamiento con PD173074 durante tres horas daba lugar a una disminucion dependiente de la concentracion en la fosforiladon de ERK1/2 en las celulas AN3CA y MFE296. Las celulas HEC1A que expresan un FGFR2 tipo silvestre y son resistentes a PD173074, no mostraban una disminucion de la fosforilacion en ERK1/2. Estos es consistente con una activacion corriente abajo de la ruta MAPK en esta lmea celular, debido a una mutacion G12D en KRAS2 (The Catalog of Somatic Mutations in Cancer,
http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic).

El tratamiento con PD173074 tambien daba como resultado una moderada disminucion de la fosforilacion de AKT en la treonina 308 y serina 473 en celulas AN3CA y MFE296. No era evidente una disminucion de la activacion de AKT en celulas HEC1A. Extraordinariamente, el tratamiento con PD173074 no tema efecto en la fosforilacion de STAT3 o p38 en ninguna de las lmeas celulares ensayadas (Figura 4). Los inventores examinaron tambien la activacion de PLCy, ya que se habfa demostrado que los FGFR senalizaban a lo largo de esta ruta (18), no se observo ningun cambio en PCLy despues del tratamiento con PD173074 (datos no mostrados).

Aunque no era evidente ningun cambio en la activacion de STAT3 o p38 tres horas despues del tratamiento con PD173074, los modelos previos de adiccion oncogenica han demostrado que la activacion de p38 esta retardada, alcanzando el pico a las 8-24 horas despues de la inhibicion oncogenica {Sharma, 2006 n° l7}. Por lo tanto, los inventores evaluaron la activacion de ERK1/2, AKT, STAT3, y p38 en varios puntos de tiempo que variaban de 0 a 72 horas despues del tratamiento con PD173074. Consistentes con los datos presentados en la Figura 4, el tratamiento con PD173074 daba como resultado una rapida reduccion de la activacion de ERK1/2 en celulas MFE296 y AN3CA, pero no en celulas HEC1A (Figura 5A). El ERK1/2 fosforilado empieza a regresar a las 24-48 horas tras el tratamiento con PD173074 pero no habfa alcanzado la lmea base de activacion a las 72 horas. Tambien se detecto una reduccion de AKT fosforilada en celulas MFE296 y AN3CA, y era mas evidente en la treonina 308 que en la serina 473 (Figura 5A). La disminucion de la activacion de AKT se retardaba en comparacion con la rapida inhibicion de la fosforilacion de MAPK, con el mayor descenso de la fosforilacion detectado a las 8 y 24 horas despues del tratamiento con PD173074.

Extraordinariamente, no se detecto ningun cambio en la activacion de STAT3 o p38 en celulas AN3CA y MFE296 en el transcurso de tiempo (Figura 5A). Cuando se cultivaban las celulas en medios con un 0,2 % de FBS, el tratamiento con PD173074 daba como resultado una reduccion de la activacion de MAPK tanto en AN3CA y MFE296 (Figura 5B), similar a la que se observaba en medios de cultivo completos. De manera interesante, el tratamiento con PD173074 en medios con un 0,2 % de FBS daba como resultado una modesta reduccion en fosfo-AKT en la treonina 308 y una ligera reduccion en serina 473 en celulas AN3CA y MFE296. La activacion constitutiva de AKT en la lmea celular AN3CA en un 0,2 % de FBS se debe probablemente a la inactivacion en ambos alelos de PTEN; el mecanismo de la activacion constitutiva de AKT es desconocido en celulas MFE296 ya que expresan PTEN tipo silvestre y PIK3CA.

CONCLUSION

El entendimiento de la base molecular de la progresion tumoral ha dado lugar al desarrollo y exito de terapias dirigidas en una variedad de tipos de cancer {Pickering, 2008 n° 27}. Hay una evidencia cada vez mayor de que las mutaciones activadoras en los genes implicados en varias rutas de senalizacion pueden dar como resultado la “adiccion” de las celulas tumorales a estas rutas {Sharma, 2007 n° 31}. Ademas, estas mutaciones activadoras no solo sirven para identificar potenciales dianas terapeuticas sino que su presencia puede predecir la respuesta clmica a una inhibicion de la ruta {Lynch, 2004 n° 30}. Sin embargo, cada vez se vuelve mas claro que la respuesta a la inhibicion de la diana esta influenciada por el contexto molecular en que se producen estas mutaciones. Como los inventores habfan identificado previamente mutaciones activadoras en FGFR2 en ~16% de los tumores de endometrio endometrioides, los inventores buscaron investigar el contexto genetico en el que se producen las mutaciones de FGFR2 en el cancer de endometrio. Tambien buscaron evaluar el potencial terapeutico del direccionamiento hacia el FGFR2 activado investigando la consecuencia biologica de la inhibicion de FGFR2 en las celulas del cancer de endometrio que poseen mutaciones activadoras en FGFR2.

En el presente estudio, los inventores evaluaron el estado de mutacion en KRAS y PTEN de tumores de endometrio endometrioides con estado de mutacion en FGFR2 conocido. Las mutaciones activadoras en KRAS y FGFR2 no se produdan juntas en el mismo tumor, lo que es consistente con la tumorigenesis dirigida por FGFR2 por medio de la ruta MAPK. La activacion de FGFR2 se produda junto con la inactivacion de PTEN, sugiriendo que, al menos en las celulas de endometrio, el FGFR2 no media su efecto biologico a traves de PI3K/AKT. Esto esta apoyado por un informe previo en el que la estimulacion por FGF7 o FGF10 de las celulas de endometrio se produda una activacion de ERK1/2, pero no de AKT (19). Las mutaciones en PTEN y KRAS se producen en el mismo tumor, consistente con un informe previo (20).

Los inventores tambien han demostrado que la senalizacion de FGFR2 es esencial para la supervivencia y proliferacion de las lmeas celulares AN3CA y MFE296 de cancer de endometrio, lo que sugiere fuertemente una adiccion oncogenica. Esto esta apoyado por los estudios de la CI50 de PD173074 en los que los inventores demostraron que las dos lmeas celulares con FGFR2 activado eran sensibles al inhibidor pan-FGFR, PD173074. Hay que tener en cuenta que las celulas AN3CA eran las mas sensibles a PD173074 y son mutantes para PTEN. Esto es de particular importancia debido a la alta incidencia de las mutaciones PTEN en el cancer de endometrio endometrioide. Se

5

10

15

20

25

30

35

40

ha sugerido que la inactivacion de PTEN puede transferir la “adiccion oncogenica” celular de una ruta de receptor activado a una senalizacion PI3K-AKT activada constitutivamente, y de esta manera da lugar a resistencia a la inhibicion del receptor (21). Ademas, el ErbB2 que se sobre-expresa en tumores de mama con PTEN reducido o ausente son relativamente resistentes a los regfmenes de quimioterapia que contienen trastuzumab (22, 23). Hay que senalar que ademas de la perdida de PTEN, la inhibicion de FGFR2 con un inhibidor pan-FGFR induce la muerte celular y la detencion del ciclo celular en celulas AN3CA. Por lo tanto, las celulas AN3CA son todavfa adictas a la senal oncogenica de FGFR2. De manera interesante, el tratamiento con PD173074 induda una detencion del ciclo celular pero no daba como resultado un aumento de tincion con Anexina V en celulas MFE296 (datos no mostrados). Sigue por determinar si solo la detencion del ciclo celular es responsable de la eficacia del PD173074 en celulas MFE296, o si esta implicado tambien un mecanismo desconocido en la induccion de muerte celular negativa a Anexina V.

Se ha sugerido que la adiccion oncogenica que resulta de la activacion de Src, BCR-ABL y EGFR comparte una cascada de senalizacion comun, ya que la inactivacion oncogenica esta asociada con una rapida perdida de ERK, AKT y STAT3/5 fosforilados y la activacion retardada de p38 (17). Los inventores informan en el presente documento que la inhibicion de FGFR2 en medios de cultivo completos se asocia con una perdida de ERK fosforilada y una inhibicion parcial de AKT, pero no tiene efecto sobre el estado de fosforilacion de STAT3 ni de p38. El mecanismo subyacente de la adiccion al FGFR2 activado en celulas AN3CA y MFE296, por lo tanto, es distinto de otros modelos de adiccion oncogenica.

La muerte celular inducida por la inhibicion pan-FGFR con PD173074 se correlaciona con la inhibicion completa de la activacion de ERK1/2 en medios suplementados tanto con un 10 % de FBS como con un 0,2 % de FBS. De manera inesperada, debido al estado mutante de PTEN en celulas AN3CA, el tratamiento con PD173074 daba como resultado una perdida parcial de la fosforilacion de AKT en el medio que contema un 10 % de FBS. Por lo tanto, es posible que el FGFR2 medie en la fosforilacion de AKT corriente abajo de PTEN. Ademas, en queratinocitos de raton, se ha demostrado que el factor de crecimiento tipo insulina I altera la fosforilacion por medio de un mecanismo independiente de PI3K que implica la regulacion de la protema fosfatasa mediada por la protema cinasa (24). El mecanismo responsable de la disminucion de la fosforilacion de AKT que se observa despues del tratamiento con PD173074 en celulas AN3CA y MFE296 sigue por determinar. Sin embargo, la muerte celular inducida por PD173074 que se observa en las celulas AN3CA probablemente es independiente de esta desfosforilacion de AKT. Las curvas de respuesta a la concentracion que se llevan a cabo en un 0,2 % de FBS generaban una CI50 similar para las celulas AN3CA que la generada en un 10% de FBS (datos no mostrados). Como las celulas AN3CA cultivadas en un 0,2% de FBS no mostraban una desfosforilacion pronunciada de AKT, estos datos en conjunto sugieren que la desfosforilacion de AKT no es necesaria para la muerte celular inducida por PD173074 en esta lmea celular.

En resumen, los inventores han demostrado que las mutaciones de FGFR2 coinciden con la inactivacion de PTEN y que son mutuamente excluyentes con las mutaciones KRAS2 en los canceres de endometrio endometrioides primarios.

El bloqueo de la senalizacion de FGFR2 por cafda por ARNhp o el tratamiento con un inhibidor pan-FGFR, PD173074, daba como resultado la detencion del ciclo celular y la muerte celular de las lmeas celulares de cancer de endometrio que expresan FGFR2 activado. Las rutas celulares que se alteran despues de la inhibicion de FGFR2, sin embargo, eran distintas que las que se observaban despues de la inhibicion de otros oncogenes en los que se ha demostrado adiccion oncogenica. Un nuevo mecanismo de adiccion oncogenica asociada con la activacion de FGFR2 en el cancer de endometrio parece probable. Estos datos en conjunto muestran que la inhibicion del FGFR2 mutante constitutivamente activo es terapeuticamente beneficioso para los pacientes de cancer de endometrio a pesar de la frecuente inactivacion de PTEN en este tipo de cancer.

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de clasificacion del tipo de cancer de endometrio como un cancer de endometrio inducido por la activacion del receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR2) en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la exploracion in vitro de una mutacion de receptor en un FGFR2 en una muestra biologica que contiene celulas del cancer de endometrio, en el que la mutacion del FGFR2 se asocia con activacion del receptor FGFR2 que aumenta el nivel de actividad de la ruta de transduccion de la senal de FGFR2 en comparacion con un control, y clasificar el tipo de cancer de endometrio como un cancer de endometrio inducido por la activacion del FGFR2 tras detectar una mutacion de activacion del FGFR2 en las celulas de cancer de endometrio, en el que la mutacion es una sustitucion de un aminoacido del FGFR2 que se selecciona de entre el grupo que consiste en:

   (a) una mutacion de S por W en la posicion 252 de SEQ ID NOS: 2 o 3;

   (b) una mutacion de K por R en la posicion 310 de SEQ ID NOS: 2 o 3;

   (c) una mutacion de A por T en la posicion 315 de SEQ ID NO: 3;

   
   (d) una mutacion de S por C en la posicion 373 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 372 de SEQ ID NO: 3;

   
   (e) una mutacion de Y por C en la posicion 376 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 375 de SEQ ID NO: 3;

   (f) una mutacion de C por R en la posicion 383 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 382 de SEQ ID NO: 3;

   (g) una mutacion de M por R en la posicion 392 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 391 de SEQ ID NO: 3;

   
   (h) una mutacion de I por V en la posicion 548 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 547 de SEQ ID NO: 3;

   
   (i) una mutacion de N por K en la posicion 550 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 549 de SEQ ID NO: 3; o

   (j) una mutacion de K por E en la posicion 660 de SEQ ID NO: 2 o la posicion 659 de SEQ ID NO: 3,

   o la mutacion es una sustitucion en un nucleotido que se selecciona de entre el grupo que consiste en:

   (i) una mutacion de A por G en la posicion 929 de SEQ ID NO: 1;

   (ii) una mutacion de T por G en la posicion 1650 de SEQ ID NO: 1;

   (iii) una mutacion de C por G en la posicion 755 de SEQ ID NO: 1;

   (iv) una mutacion de T por A en la posicion 1650 de SEQ ID NO: 1;

   (v) una mutacion de A por G en la posicion 1127 de SEQ ID NO: 1;

   (vi) una mutacion de C por G en la posicion 1118 de SEQ ID NO: 1;

   (vii) una mutacion de T por C en la posicion 1147 de SEQ ID NO: 1;

   (vii) una mutacion de T por G en la posicion 1175 de SEQ ID NO: 1;

   (ix) una mutacion de A por G en la posicion 1642 de SEQ ID NO: 1;

   (x) una mutacion de A por G en la posicion 1978 de SEQ ID NO: 1.
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que cuando la mutacion de FGFR2 es una sustitucion en un nucleotido, la sustitucion en el nucleotido se explora en ADN, ARN y/o ADNc genomicos.
3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que se detectan al menos dos mutaciones de activacion del receptor FGFR2 en las celulas de cancer de endometrio.
4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que tambien se detecta una mutacion inactivadora de PTEN en la muestra biologica.
5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la clasificacion se utiliza para desarrollar un tratamiento para un sujeto que tiene un cancer de endometrio.
6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la mutacion da como resultado el aumento de la union al ligando, afinidad de ligando promiscua, dimerizacion constitutiva del receptor, reciclado deficiente con degradacion retardada, o activacion de cinasas, activando de esta manera el receptor FGFR2.
7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el cancer es un subtipo histologico endometrioide.
8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el sujeto es un ser humano y el FGFR2 es un mutante constitutivamente activo.