ES2601145T3 - Beta-glucosidasa BGL6 y ácidos nucleicos que codifican la misma - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido aislado derivado de una fuente fúngica, dicho polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que tiene actividad de ß-glucosidasa donde dicho polinucleótido aislado se selecciona de entre el grupo consistente en: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido BGL6 que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO:2; (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido BGL6 que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO:2; (c) una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido BGL6 que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO:2; (d) una secuencia de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido BGL6 que tiene la secuencia de aminoácidos presentada como SEQ ID NO:2; y (e) una secuencia de ácido nucleico presentada como SEQ ID NO:3 o el complemento de la misma.
Description
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DESCRIPCION
Beta-glucosidasa BGL6 y acidos nucleicos que codifican la misma Apoyo gubernamental
[0001] Partes de este trabajo fueron financiadas por el subcontrato n.° ZCO-30017-01 con el Laboratorio Nacional de Energia Renovable de EE.UU. segun el contrato principal n.° DE-AC36-99GC310337 con el Departamento de Energia de los EE.UU.
Campo
[0002] La presente exposicion se refiere a secuencias de acido nucleico bgl6 aisladas que codifican polipeptidos que tienen actividad de beta-glucosidasa. La exposicion se refiere tambien a constructos de acido nucleico, vectores y celulas huesped que comprenden las secuencias de acido nucleico asi como a metodos para la produccion de polipeptidos de BGL6 recombinantes.
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Antecedentes
[0004] La celulosa y la hemicelulosa son los materiales vegetales mas abundantes producidos mediante fotosintesis. Pueden ser degradados y utilizados como fuente de energia por numerosos microorganismos, incluyendo bacterias, levaduras y hongos, que producen enzimas extracelulares capaces de hidrolizar los sustratos polimericos en azucares monomericos (Aro et al, 2001). Puesto que se acercan los limites de los recursos no renovables, el potencial de la celulosa para convertirse en un importante recurso de energia renovable es enorme (Krishna et al., 2001). La utilizacion efectiva de la celulosa a traves de procesos biologicos es un enfoque para superar la escasez de alimentos, piensos y combustibles (Ohmiya et al., 1997).
[0005] Las celulasas son enzimas que hidrolizan celulosa (enlaces beta-1,4-glucano o beta D-glucosidicos) dando lugar a la formacion de glucosa, celobiosa, celooligosacaridos y similares. Las celulasas se han divido tradicionalmente en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG"), exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH") y beta-glucosidasas ([beta] -D-glucosido glucohidrolasa; EC 3.2.1.21) ("BG"). (Knowles et al., 1987; Schulein, 1988). Las endoglucanasas actuan principalmente en las partes amorfas de la fibra de celulosa, mientras que las celobiohidrolasas son tambien capaces de degradar celulosa cristalina (Nevalainen y Penttila, 1995). De esta manera, es necesaria la presencia de una celobiohidrolasa en un sistema de celulasas para la solubilizacion eficaz de la celulosa cristalina (Suurnakki, et al. 2000). La beta-glucosidasa actua para liberar unidades de D-glucosa a partir de celobiosa, celooligosacaridos y otros glucosidos (Freer, 1993).
[0006] Se sabe que las celulasas son producidas por un gran numero de bacterias, levaduras y hongos. Algunos hongos producen un sistema de celulasas completo capaz de degradar formas cristalinas de celulosa, de manera que las celulasas se producen facilmente en grandes cantidades a traves de la fermentacion. Los hongos filamentosos desempenan un papel especial, puesto que muchas levaduras, tales como Saccharomyces cerevisiae, carecen de la capacidad para hidrolizar celulosa. Vease, p. ej., Aro et al., 2001; Aubert et al., 1988; Wood et al., 1988 y Coughlan, et al..
[0007] Las clasificaciones de las celulasas fungicas de CBH, EG y BG se pueden ampliar adicionalmente para incluir multiples componentes dentro de cada clasificacion. Por ejemplo, se han aislado multiples CBH, EG y BG de una variedad de fuentes fungicas, incluyendo Trichoderma reesei que contiene genes conocidos para 2 CBH, es decir, CBH I y CBH II, al menos 5 EG, es decir, EG I, EG II, EG III, EGIV y EGV y al menos 2 Bg, es decir, BG1 y BG2.
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[0008] Con el fin de convertir de manera eficaz la celulosa cristalina en glucosa, se necesita el sistema de celulasas completo que comprende componentes de cada una de las clasificaciones CBH, EG y BG, con componentes aislados menos eficaces en la hidrolisis de celulosa cristalina (Filho et al., 1996). Se ha observado una relacion sinergica entre componentes de celulasa de diferentes clasificaciones. En concreto, las celulasas de tipo EG y las celulasas de tipo CBH interactuan sinergicamente para degradar celulosa de manera mas eficiente. Vease, por ejemplo, Wood, 1985.
[0009] Las celulasas se conocen en la tecnica por ser utiles en el tratamiento de tejidos con el fin de mejorar la capacidad de limpieza de las composiciones detergentes, para el uso como agente suavizante, para mejorar el tacto y la apariencia de los tejidos de algodon, y similares (Kumar et al., 1997).
[0010] Se han descrito composiciones detergentes que contienen celulasa con rendimiento de limpieza mejorado (Patente estadounidense n.° 4 435 307; solicitudes GB n.° 2 095 275 y 2 094 826) y para su utilizacion en el tratamiento de telas para mejorar el tacto y la apariencia del tejido (Patentes estadounidenses n.° 5 648 263, 5 691 178, y 5 776 757; solicitud GB n.° 1 358 599; The Shizuoka Prefectural Hamamatsu Textile Industrial Research Institute Report, Vol. 24, pp. 54-61, 1986).
[0011] Por lo tanto, las celulasas producidas en hongos y bacterias han recibido una atencion significativa. En concreto, se ha demostrado que la fermentacion de Trichoderma spp. (p. ej., Trichoderma longibrachiatum o Trichoderma reesei) produce un sistema de celulasas completo capaz de degradar formas cristalinas de la celulosa. La patente estadounidense n.° 5 475 101 describe la purificacion y la clonacion molecular de una enzima particularmente util designada EGIII que se deriva de Trichoderma longibrachiatum.
[0012] Foreman P. et al. (2003), J. Biol. Chem., vol. 278, n.° 34, pp. 31988-31997 describe la secuenciacion parcial de mas de 5100 clones de ADNc de T. reesei aleatorios. Se identificaron doce secuencias que codificaban enzimas previamente desconocidas que probablemente funcionan en la degradacion de biomasa. Los analisis de los niveles de expresion de las micromatrices indicaron que varias de las secuencias se sobreexpresaron de manera coordinada en una cepa que producia celulasa en exceso.
[0013] WO99/46362 hace referencia a la modificacion genetica de un microbio para mejorar su produccion de una enzima, beta-glucosidasa. Se comunica la transformacion con un constructo que comprende un promotor, una senal de secrecion de xilanasa y una region de codificacion de beta-glucosidasa madura para aumentar la cantidad de beta-glucosidasa producida con relacion a los microbios no transformados.
[0014] US6184018 describe una p-glucosidasa de Orpinomyces sp. PC2, secuencias de nucleotidos que codifican la proteina madura y la proteina precursora y metodos para la produccion recombinante de la p- glucosidasa.
[0015] US6022725 describe un proceso para la expresion de p-glucosidasa extracelular en un hongo filamentoso mediante la expresion de una secuencia de ADN fungica que codifica una p-glucosidasa mejorada, delecionada o alterada en un microorganismo huesped recombinante. Tambien se describen las composiciones de celulasas fungicas recombinantes que contienen una expresion mejorada, delecionada o alterada de p-glucosidasa.
[0016] Aunque las composiciones de celulasas se han descrito anteriormente, se siguen necesitando composiciones de celulasas nuevas y mejoradas para utilizarse en detergentes domesticos, composiciones para lavado a la piedra o detergentes para ropa, etc. Son de especial interes las celulasas que muestran resistencia a los surfactantes (p. ej., alquilsulfonatos lineales, LAS (por sus siglas en ingles)), rendimiento mejorado en condiciones de estres termico, capacidad celulolitica aumentada o disminuida y/o alto nivel de expresion in vitro.
Sumario
[0017] En el presente documento se describen una proteina de celulasa aislada, identificada en el presente documento como BGL6 y acidos nucleicos que codifican BGL6.
[0018] En un aspecto, las proteinas o polipeptidos de BGL6 comprenden una secuencia que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o mas de identidad de secuencia con la secuencia presentada como SEQ ID NO:2.
[0019] Un aspecto relacionado incluye (i) fragmentos de BGL6, preferiblemente al menos aproximadamente 20100 aminoacidos de largo, mas preferiblemente aproximadamente 100-200 aminoacidos de largo y (ii) una composicion farmaceutica que comprende BGL6. En varios modos de realizacion, el fragmento corresponde con el dominio N-terminal de BGL6 o el dominio C-terminal de BGL6.
[0020] Otro aspecto incluye un polinucleotido aislado que tiene una secuencia que codifica BGL6, una secuencia complementaria a la secuencia de codificacion de bgl6 y una composicion que comprende el polinucleotido. El polinucleotido puede ser ARNm, ADN, ADNc, ADN genomico o un antisentido analogo de los mismos.
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[0021] Un polinucleotido de bgl6 puede comprender una molecula de acido nucleico aislada que se hibrida al complemento del acido nucleico presentado como SEQ ID NO: 1 en condiciones de moderada a alta restriccion, donde la molecula de acido nucleico codifica un polipeptido BGL6 que muestra actividad de beta-glucosidasa.
[0022] El polinucleotido puede codificar una proteina BGL6 que tenga al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o mas de identidad de secuencia con la secuencia presentada como SEQ ID NO:1. En un modo de realizacion especifico, el polinucleotido comprende una secuencia sustancialmente identica a la SEQ ID NO:1. Tambien se contemplan fragmentos del polinucleotido, preferiblemente al menos aproximadamente 15-30 nucleotidos de largo.
[0023] Se describen los vectores de expresion recombinantes que contienen una secuencia de acido nucleico que codifica BGL6 o un fragmento o variante de corte y empalme de los mismos, operativamente unidos a elementos reguladores eficaces para la expresion de la proteina en un huesped seleccionado. Un aspecto relacionado incluye una celula huesped que contiene el vector.
[0024] Se incluye un metodo para la produccion de BGL6 mediante tecnicas recombinantes, cultivando celulas huesped procariotas o eucariotas recombinantes que comprenden una secuencia de acidos nucleicos que codifica BGL6 en condiciones eficaces para promover la expresion de la proteina incluida, y la posterior recuperacion de la proteina de la celula huesped o del medio de cultivo celular.
[0025] Otro aspecto proporciona una composicion enzimatica util en la conversion de celulosa a etanol. En un modo de realizacion preferido, la composicion enzimatica comprende BGL6. La composicion puede comprender ademas enzimas de celulasa adicionales tales como endoglucanasas y/o celobiohidrolasas. La composicion puede enriquecerse en BGL6.
[0026] Otro aspecto adicional incluye un anticuerpo especificamente inmunorreactivo con BGL6.
[0027] Los metodos analiticos para la deteccion de los acidos nucleicos bg/6 y las proteinas BGL6 tambien forman parte de la exposicion.
Breve descripcion de las figuras
[0028]
La Figura 1 es una representacion monocatenaria de la secuencia de acidos nucleicos (SEQ ID NO:1), de la bgl6 de T. reesei, donde la secuencia no codificante se indica como subrayada.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoacidos prevista (SEQ ID NO:2) basada en la secuencia de nucleotidos proporcionada en la Figura 1, donde se utiliza el primer codon de inicio.
La Figura 3 muestra la secuencia de aminoacidos prevista (SEQ ID NO:4) basada en la secuencia de nucleotidos proporcionada en la Figura 1, donde se utiliza el segundo codon de inicio.
La Figura 4 es la secuencia de codificacion bgl6, donde los dos codones de inicio alternativos estan subrayados.
Descripcion detallada
I. Definiciones.
[0029] A menos que se indique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que tendrian para un experto en la materia de la presente invencion. Se dirige a los profesionales en concreto a Sambrook et al., 1989, y Ausubel FM et al., 1993, para definiciones y terminos de la tecnica. Ha de entenderse que la presente invencion no esta limitada a la metodologia, los protocolos y los reactivos concretos descritos, puesto que estos pueden variar.
[0030] El termino "polipeptido" como se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto formado por una sola cadena de residuos de aminoacidos unidos por enlaces peptidicos. El termino “proteina” como se utiliza en el presente documento puede ser sinonimo del termino “polipeptido” o puede referirse, ademas, a un compuesto de dos o mas polipeptidos.
[0031] El termino “molecula de acido nucleico” incluye moleculas de ARN, ADN y ADNc. Se entendera que, como resultado de la degeneracion del codigo genetico, se puede producir una multitud de secuencias de nucleotidos que codifican una proteina determinada, tal como BGL6. La presente invencion contempla todas las posibles variantes de secuencias de nucleotidos, que codifican BGL6, las cuales son todas posibles debido a la degeneracion del codigo genetico.
[0032] Un constructo o secuencia de acido nucleico “heterologa” tiene una parte de la secuencia que no es nativa a la celula en la que se expresa. Heterologa, con respecto a una secuencia de control, se refiere a una secuencia de control (es decir, promotor o potenciador) que no sirve por naturaleza para regular el mismo gen cuya expresion esta regulando actualmente. En general, las secuencias de acidos nucleicos heterologas no son
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endogenas a la celula o parte del genoma en el que estan presentes y se han anadido a la celula mediante infeccion, transfeccion, transformacion, microinyeccion, electroporacion o similar. Un constructo de acido nucleico “heterologo” puede contener una combinacion de secuencia de control/secuencia de codificacion de ADN que sea la misma que, o diferente a, una combinacion de secuencia de control/secuencia de codificacion de ADN encontrada en la celula nativa.
[0033] Como se utiliza en el presente documento, el termino "vector" se refiere a un constructo de acido nucleico disenado para la transferencia entre celulas huesped diferentes. Un "vector de expresion" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterologo en una celula extrana. Muchos vectores de expresion procariotas y eucariotas estan comercialmente disponibles. La seleccion de vectores de expresion adecuados esta dentro del conocimiento de los expertos en la materia.
[0034] Por consiguiente, un “casete de expresion” o “vector de expresion” es un constructo de acido nucleico generado de forma recombinante o sintetica, con una serie de elementos de acido nucleico especificados que permiten la transcripcion de un acido nucleico concreto en una celula diana. El casete de expresion recombinante se puede incorporar en un plasmido, cromosoma, ADN mitocondrial, ADN plastidial, virus, o fragmento de acido nucleico. Normalmente, la parte del casete de expresion recombinante de un vector de expresion incluye, entre otras secuencias, una secuencia de acido nucleico a transcribir y un promotor.
[0035] Como se utiliza en el presente documento, el termino “plasmido” se refiere a un constructo de ADN bicatenario circular utilizado como un vector de clonacion y que forma un elemento genetico autorreplicante extracromosomico en muchas bacterias y algunos eucariotas.
[0036] Como se utiliza en el presente documento, el termino “secuencia de nucleotidos que codifica un marcador seleccionable” se refiere a una secuencia de nucleotidos que es capaz de expresion en celulas y donde la expresion del marcador seleccionable confiere a las celulas que contienen el gen expresado la capacidad de crecer en presencia de un agente selectivo correspondiente, o en condiciones de crecimiento selectivo correspondientes.
[0037] Como se utiliza en el presente documento, el termino “promotor” se refiere a una secuencia de acido nucleico que sirve para dirigir la transcripcion de un gen secuencia abajo. El promotor sera en general adecuado para la celula huesped en la que se esta expresando el gen diana. El promotor junto con otras secuencias de acido nucleico reguladoras de la transcripcion y la traduccion (tambien denominadas “secuencias de control”) son necesarios para expresar un gen determinado. En general, las secuencias reguladoras de la transcripcion y la traduccion incluyen, pero sin caracter limitativo, secuencias promotoras, sitios de union al ribosoma, secuencias de inicio y de detencion de la transcripcion, secuencias de inicio y detencion de la traduccion y secuencias potenciadoras o activadoras.
[0038] “Gen quimerico” o “constructo de acido nucleico heterologo”, como se define en el presente documento, se refiere a un gen no nativo (es decir, uno que se ha introducido en un huesped) que puede estar compuesto por partes de genes diferentes, incluyendo elementos reguladores. Un constructo de gen quimerico para la transformacion de una celula huesped se compone normalmente de una region reguladora de la transcripcion (promotor) operativamente unida a una secuencia de codificacion de proteina heterologa o, en un gen quimerico marcador seleccionable, a un gen marcador seleccionable que codifica una proteina que confiere resistencia a los antibioticos a las celulas transformadas. Un gen quimerico tipico, para la transformacion en una celula huesped, incluye una region reguladora de la transcripcion que es constitutiva o inducible, una secuencia de codificacion de proteina y una secuencia de terminacion. Un constructo de gen quimerico puede incluir tambien una segunda secuencia de ADN que codifica un peptido senal si se desea la secrecion de la proteina diana.
[0039] Un acido nucleico esta “operativamente unido” cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, el ADN que codifica un lider secretor esta operativamente unido al ADN para un polipeptido si se expresa como una preproteina que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor o potenciador esta operativamente unido a una secuencia de codificacion si afecta a la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union al ribosoma esta operativamente unido a una secuencia de codificacion si esta colocado de manera que facilite la traduccion. En general, “operativamente unido” significa que las secuencias de ADN que estan unidas son contiguas, y, en el caso de un lider secretor, contiguas y en el marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La union se consigue mediante ligadura en sitios de restriccion convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores oligonucleotidos sinteticos, ligadores o cebadores para PCR se utilizan de conformidad con la practica convencional.
[0040] Como se utiliza en el presente documento, el termino "gen" significa el segmento de ADN que participa en la produccion de una cadena de polipeptidos, que puede o no incluir regiones anteriores y posteriores a la region de codificacion, p. ej., secuencias 5' no traducidas (5' UTR) o secuencias “lider” y secuencias 3' UTR o secuencias “trailer”, asi como secuencias intercaladas (intrones) entre los segmentos de codificacion individuales (exones).
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[0041] En general, las moleculas de acido nucleico que codifican BGL6 o un analogo u homologo de las mismas se hibridaran, en condiciones de moderada a alta restriccion a la secuencia natural proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 1. Sin embargo, en algunos casos se emplea una secuencia de nucleotidos que codifica BGL6 que posee un uso de codon sustancialmente diferente, mientras que la proteina codificada por la secuencia de nucleotidos que codifica BGL6 tiene la secuencia de aminoacidos igual o sustancialmente igual que la proteina nativa. Por ejemplo, la secuencia de codificacion se puede modificar para facilitar la expresion mas rapida de BGL6 en un sistema concreto de expresion procariota o eucariota, de conformidad con la frecuencia con la que el huesped utiliza un codon concreto. Te'o, et al. (2000), por ejemplo, describe la optimizacion de genes para la expresion en hongos filamentosos.
[0042] Una secuencia de acido nucleico se considera “selectivamente hibridable” a una secuencia de acido nucleico de referencia si las dos secuencias se hibridan especificamente entre si en condiciones de lavado y de hibridacion de moderada a alta restriccion. Las condiciones de hibridacion se basan en la temperatura de fusion (Tf) de la sonda o del compuesto de union a acido nucleico. Por ejemplo, la “restriccion maxima” ocurre normalmente a aproximadamente Tf-5 0C (5 0C por debajo de la Tf de la sonda); la “restriccion alta” a aproximadamente 5 °C-10 °C por debajo de la Tf; la “restriccion intermedia” a aproximadamente 10 °C-20 0C por debajo de la Tf de la sonda; y la “restriccion baja” a aproximadamente 20 0C-25 0C por debajo de la Tf. Funcionalmente, las condiciones de restriccion maxima se pueden utilizar para identificar secuencias que tienen identidad estricta o identidad casi estricta con la sonda de hibridacion; mientras que las condiciones de restriccion alta se utilizan para identificar secuencias que tienen aproximadamente 80 % o mas de identidad de secuencia con la sonda.
[0043] Las condiciones de hibridacion de moderada y alta restriccion se conocen bien en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook, et al, 1989, Capitulos 9 y 11, y en Ausubel, F.M., et al, 1993, expresamente incorporado por referencia en el presente documento). Un ejemplo de condiciones de restriccion alta incluye hibridacion a aproximadamente 42 0C en formamida al 50 %, sSc 5X, solucion de Denhardt 5X, SDS al 0,5 % y 100 pg/ml de ADN portador desnaturalizado seguido del lavado dos veces en SSC 2X y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente y dos veces adicionales en SSC 0,1X y SDS al 0,5 % a 42 °C
[0044] Como se utiliza en el presente documento, el termino "recombinante", incluye referencia a una celula o vector que se ha modificado por la introduccion de una secuencia de acido nucleico heterologa o que la celula se deriva de una celula modificada de esta manera. Por lo tanto, por ejemplo, las celulas recombinantes expresan genes que no se encuentran en forma identica en la forma nativa (no recombinante) de la celula o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, se subexpresan o no se expresan en absoluto como resultado de la intervencion humana deliberada.
[0045] Como se utilizan en el presente documento, los terminos "transformada", "establemente transformada" o "transgenica" con referencia a una celula significan que la celula tiene una secuencia de acido nucleico no nativa (heterologa) integrada en su genoma o como un plasmido episomal que se mantiene a traves de multiples generaciones.
[0046] Como se utiliza en el presente documento, el termino "expresion" se refiere al proceso por el cual se produce un polipeptido basandose en la secuencia de acido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto la transcripcion como la traduccion.
[0047] El termino "introducido", en el contexto de la insercion de una secuencia de acido nucleico en una celula significa "transfeccion" o "transformacion" o "transduccion" e incluye referencia a la incorporacion de una secuencia de acido nucleico en una celula eucariota o procariota en la que la secuencia de acido nucleico puede incorporarse al genoma de la celula (por ejemplo, cromosoma, plasmido, plastido o ADN mitocondrial), convertirse en un replicon autonomo o expresarse transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectado).
[0048] Se deduce que el termino “expresion de BGL6” se refiere a la transcripcion y traduccion del gen bgl6, cuyos productos incluyen ARN precursor, ARNm, polipeptido, polipeptidos procesados tras la traduccion y derivados de los mismos, que incluyen BGL6 de especies relacionadas, tales como Trichoderma longibrachiatum (reesei), Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Hypocrea jecorina e Hypocrea schweinitzii. A modo de ejemplo, los ensayos para la expresion de BGL6 incluyen transferencia Western para proteina BGL6, analisis de transferencia Northern y ensayos de reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR, por sus siglas en ingles) para ARNm de BGL6, y ensayos de actividad de glucosidasa como se describe en Chen et al. (1992) y Herr et al. (1978).
[0049] El termino “corte y empalme alternativo” se refiere al proceso por el cual se generan multiples isoformas de polipeptido a partir de un solo gen, e implica el corte y empalme junto de exones no consecutivos durante el procesamiento de algunas, pero no todas, las transcripciones del gen. De esta manera, se puede conectar un exon concreto a cualquiera de los varios exones alternativos para formar ARN mensajeros. Los ARNm cortados y empalmados de manera alternativa producen polipeptidos (“variantes de corte y empalme”) en los que algunas partes son comunes, mientras que otras partes son diferentes.
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[0050] El termino "secuencia senal" se refiere a una secuencia de aminoacidos en la parte N-terminal de una proteina que facilita la secrecion de la forma madura de la proteina fuera de la celula. La forma madura de la proteina extracelular carece de la secuencia senal que se escinde durante el proceso de secrecion.
[0051] Por el termino “celula huesped” se entiende una celula que contiene un vector y soporta la replicacion y/o la transcripcion o la transcripcion y la traduccion (expresion) del constructo de expresion. Las celulas huesped para su uso en la presente invencion pueden ser celulas procariotas, tales como E. coli, o celulas eucariotas, tales como celulas de levaduras, plantas, insectos, anfibios o mamiferos. En general, las celulas huesped son hongos filamentosos.
[0052] El termino “hongos filamentosos” significa todos y cada uno de los hongos filamentosos reconocidos por los expertos en la materia. Se selecciona un hongo preferido del grupo consistente en Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Chrysosporium, Penicillium, Humicola, Neurospora, o formas sexuales alternativas de los mismos tales como Emericella, Hypocrea.
[0053] El termino “celooligosacarido” se refiere a grupos oligosacaridos que contienen de 2 a 8 unidades de glucosa y tienen enlaces p-1,4, p. ej., celobiosa.
[0054] El termino “celulasa” se refiere a una categoria de enzimas capaces de hidrolizar polimeros de celulosa a oligomeros de celooligosacaridos mas cortos, celobiosa y/o glucosa. Se han obtenido numerosos ejemplos de celulasas, tales como exoglucanasas, exocelobiohidrolasas, endoglucanasas y glucosidasas, a partir de organismos celuloliticos, incluyendo particularmente hongos, plantas y bacterias.
[0055] El termino “dominio de union a celulosa” como se utiliza en el presente documento se refiere a la parte de la secuencia de aminoacidos de una celulasa o una region de la enzima que interviene en la actividad de union a celulosa de una celulasa o un derivado de la misma. Los dominios de union a celulosa generalmente funcionan uniendo de manera no covalente la celulasa a la celulosa, un derivado de celulosa u otro polisacarido equivalente de la misma. Los dominios de union a celulosa permiten o facilitan la hidrolisis de fibras de celulosa por la region de nucleo catalitico estructuralmente distinto y funcionan normalmente independientes del nucleo catalitico. De esta manera, un dominio de union a celulosa no poseera la actividad hidrolitica significativa atribuible a un nucleo catalitico. Dicho de otro modo, un dominio de union a celulosa es un elemento estructural de la estructura terciaria de la proteina enzimatica de celulasa que es distinto del elemento estructural que posee actividad catalitica.
[0056] Como se utiliza en el presente documento, el termino “surfactante” se refiere a cualquier compuesto generalmente reconocido en la tecnica por tener cualidades activas de superficie. De esta manera, por ejemplo, los surfactantes comprenden surfactantes anionicos, cationicos y no ionicos, tales como los que se encuentran habitualmente en los detergentes. Los surfactantes anionicos incluyen alquilbencenosulfonatos lineales o ramificados; sulfatos de eter de alquilo o alquenilo que tienen grupos alquilo o grupos alquenilo lineales o ramificados; sulfatos de alquilo o alquenilo; olefinsulfonatos; y alcanosulfonatos. Los surfactantes anfoliticos incluyen sulfonatos de sal de amonio cuaternario y surfactantes anfoliticos de tipo betaina. Dichos surfactantes anfoliticos tienen tanto grupos de carga positiva como negativa en la misma molecula. Los surfactantes no ionicos pueden comprender eteres de polioxialquileno, asi como alcanolamidas de acidos grasos superiores o aductos de oxido de alquileno de los mismos, monoesteres de glicerina de acidos grasos, y similares.
[0057] Como se utiliza en el presente documento, el termino “tejido que contiene celulosa” se refiere a cualquier tejido cosido o no cosido, hilo o fibra de algodon o no de algodon que contienen celulosa o de algodon o no de algodon que contienen mezclas de celulosa, incluyendo celulosicos naturales y celulosicos sinteticos (tales como yute, lino, ramio, rayon y liocel).
[0058] Como se utiliza en el presente documento, el termino “tejido que contiene algodon” se refiere a tejidos cosidos o no cosidos, hilos o fibras de algodon puro o de mezclas de algodon, incluyendo tejidos de algodon tejido, prendas de punto de algodon, vaqueros de algodon, hilos de algodon, algodon en bruto y similares.
[0059] Como se utiliza en el presente documento, el termino “composicion para lavado a la piedra” se refiere a una formulacion para utilizarse en tejidos que contienen celulosa lavados a la piedra. Las composiciones para lavado a la piedra se utilizan para modificar tejidos que contienen celulosa antes de su venta, es decir, durante el proceso de fabricacion. Por el contrario, las composiciones detergentes estan destinadas a la limpieza de ropa sucia y no se utilizan durante el proceso de fabricacion.
[0060] Como se utiliza en el presente documento, el termino “composicion detergente” se refiere a una mezcla que esta destinada a utilizarse en un medio de lavado para el lavado de tejidos sucios que contienen celulosa. En el contexto de la presente invencion, tales composiciones pueden incluir, ademas de celulasas y surfactantes, enzimas hidroliticas adicionales, mejoradores, agentes blanqueadores, activadores de blanqueo, agentes azulantes y tintes fluorescentes, inhibidores del apelmazamiento, agentes enmascarantes, activadores de celulasa, antioxidantes y solubilizantes.
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[0061] Como se utiliza en el presente documento, el termino “reduccion o eliminacion de la expresion del gen bgl6’ significa que el gen bgl6 ha sido delecionado del genoma y, por tanto, no puede ser expresado por el microorganismo huesped recombinante; o que el gen bgl6 ha sido modificado de tal manera que el microorganismo huesped recombinante no produce una enzima BGL6 funcional.
[0062] El termino “bgl6 alterada” o “gen bgl6 alterado” significa que la secuencia de acido nucleico del gen se ha alterado mediante la eliminacion, adicion y/o manipulacion de la secuencia de codificacion o que la secuencia de aminoacidos de la proteina expresada se ha modificado.
[0063] Como se utiliza en el presente documento, el termino “purificar” generalmente se refiere a someter acidos nucleicos transgenicos o celulas que contienen proteinas a purificacion bioquimica y/o cromatografia en columna.
[0064] Como se utiliza en el presente documento, los terminos “activo” y “biologicamente activo” se refieren a una actividad biologica asociada a una determinada proteina, tal como la actividad enzimatica asociada a una proteasa. Se deduce que la actividad biologica de una proteina determinada se refiere a cualquier actividad biologica que los expertos en la materia atribuyen normalmente a esa proteina.
[0065] Como se utiliza en el presente documento, el termino “enriquecida” significa que la BGL6 se encuentra en una concentracion que es mayor en relacion con la concentracion de BGL6 encontrada en una composicion de celulasa fungica natural, o de origen natural.
[0066] Una composicion de celulasa fungica natural es una producida por una fuente fungica de origen natural y que comprende uno o mas componentes BG, CBH y EG, donde cada uno de estos componentes se encuentra en la proporcion producida por la fuente fungica. De esta manera, una composicion de BGL6 enriquecida tendria BGL6 en una proporcion alterada, donde la proporcion de BGL6 con respecto a otros componentes de celulasa (es decir CBH y endoglucanasas) es elevada. Esta proporcion se puede incrementar ya sea aumentando la BGL6 o disminuyendo (o eliminando) al menos algun otro componente mediante cualquier medio conocido en la tecnica.
[0067] De esta manera, como ilustracion, un sistema de celulasas de origen natural se puede purificar en componentes sustancialmente puros mediante tecnicas de separacion reconocidas publicadas en la literatura, incluyendo cromatografia de intercambio ionico a un pH adecuado, cromatografia de afinidad, exclusion de tamano y similares. Por ejemplo, en la cromatografia de intercambio ionico (normalmente cromatografia de intercambio anionico) es posible separar los componentes de celulasa mediante elucion con un gradiente de pH, o un gradiente de sal, o ambos, un gradiente de pH y de sal. La BGL6 purificada se puede anadir entonces a la solucion enzimatica dando lugar a una solucion de BGL6 enriquecida.
[0068] Las celulasas fungicas pueden contener mas de un componente BG. Los componentes diferentes generalmente tienen puntos isoelectricos diferentes que permiten su separacion mediante cromatografia de intercambio ionico y similares. En una solucion enzimatica se puede emplear un unico componente BG o una combinacion de componentes BG.
[0069] Cuando se emplea en soluciones enzimaticas, el componente BG se anade generalmente en una cantidad suficiente para evitar la inhibicion por la celobiosa de cualquier componente de CBH y endoglucanasa encontrados en la composicion de celulasa. La cantidad de componente BG anadida depende de la cantidad de celobiosa producida durante el proceso de sacarificacion de biomasa, que puede determinarse facilmente por el experto en la materia. Sin embargo, cuando se utiliza, el porcentaje en peso del componente de BGL6 en relacion con cualquier componente del tipo endoglucanasa o CBH presente en la composicion de celulasa es preferiblemente de aproximadamente 1, preferiblemente aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 15 o preferiblemente aproximadamente 20 por ciento en peso a preferiblemente aproximadamente 25, preferiblemente aproximadamente 30, preferiblemente aproximadamente 35, preferiblemente aproximadamente 40, preferiblemente aproximadamente 45 o preferiblemente aproximadamente 50 por ciento en peso. Ademas, los intervalos preferidos pueden ser aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 por ciento en peso, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 por ciento en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 35 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 por ciento en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 por ciento en peso, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 por ciento en
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II. Organismos diana
A. Hongos filamentosos
[0070] Los hongos filamentosos incluyen todas las formas filamentosas de la subdivision Eumycota y Oomycota. Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo que tiene una pared celular compuesta por quitina, glucano, quitosano, manano y otros polisacaridos complejos, con crecimiento vegetativo mediante elongacion hifal y catabolismo de carbono que es obligadamente aerobico.
[0071] La celula parental de hongo filamentoso puede ser una celula de una especie de, pero sin caracter limitativo, Trichoderma, p. ej., Trichoderma longibrachiatum (reesei), Trichoderma virile, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum; Penicillium sp.; Humicola sp, incluyendo Humicola insolens; Chrysosporium sp, incluyendo C. lucknowense; Gliocladium sp.; Aspergillus sp.; Fusarium sp., Neurospora sp., Hypocrea sp., y Emericella sp. Como se utiliza en el presente documento, el termino "Trichoderma" o "Trichoderma sp." se refiere a cualquier cepa fungica que ha sido previamente clasificada como Trichoderma o que esta actualmente clasificada como Trichoderma.
[0072] En un modo de realizacion preferido, la celula parental de hongo filamentoso es una celula de Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, o Aspergillus nidulans.
[0073] En otro modo de realizacion preferido, la celula parental de hongo filamentoso es una celula de Trichoderma reesei.
III. Celulasas
[0074] Las celulasas se conocen en la tecnica como enzimas que hidrolizan celulosa (enlaces beta-1,4-glucano o beta D-glucosidicos) dando lugar a la formacion de glucosa, celobiosa, celooligosacaridos y similares. Como se ha descrito anteriormente, las celulasas se han divido tradicionalmente en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG"), exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH") y beta- glucosidasas (EC 3.2.1.21) ("BG"). (Knowles et al., 1987; Schulein, 1988).
[0075] Algunos hongos producen sistemas de celulasas completos que incluyen exocelobiohidrolasas o celulasas de tipo CBH, endoglucanasas o celulasas de tipo EG y beta-glucosidasas o celulasas de tipo BG (Schulein, 1988). Sin embargo, a veces estos sistemas carecen de celulasas de tipo CBH y las celulasas bacterianas tambien incluyen normalmente pocas o ninguna celulasa de tipo CBH. Ademas, se ha demostrado que los componentes EG y los componentes CBH interactuan sinergicamente para degradar celulosa de manera mas eficiente. Vease, p. ej., Wood, 1985. Los componentes diferentes, es decir, las diversas endoglucanasas y exocelobiohidrolasas en un sistema de celulasas completo o multicomponente, generalmente tienen propiedades diferentes, tales como punto isoelectrico, peso molecular, grado de glicosilacion, especificidad de sustrato y patrones de accion enzimatica.
[0076] Se cree que las celulasas de tipo endoglucanasa hidrolizan los enlaces internos beta-1,4-glucosidicos en regiones de baja cristalinidad de la celulosa y que las celulasas de tipo exocelobiohidrolasa hidrolizan la celobiosa a partir del extremo reductor o no reductor de la celulosa. Se deduce que la accion de los componentes de endoglucanasa pueden facilitar en gran medida la accion de las exocelobiohidrolasas mediante la creacion de nuevos extremos de cadena que son reconocidos por los componentes de exocelobiohidrolasa. Ademas, se ha demostrado que las celulasas de tipo beta-glucosidasa catalizan la hidrolisis de alquil y/o aril p-D-glucosidos, tales como metil p-D-glucosido y p-nitrofenil glucosido, asi como glicosidos que contienen unicamente residuos de carbohidratos, tales como celobiosa. Esto produce glucosa como el unico producto para el microorganismo y reduce o elimina la celobiosa que inhibe las celobiohidrolasas y las endoglucanasas.
[0077] Por consiguiente, las celulasas del tipo p-glucosidasa se consideran una parte esencial del sistema de celulasa porque conducen la reaccion general a glucosa. Se ha demostrado que la expresion aumentada de la BG en T. reesei mejora la degradacion de celulosa a glucosa. Vease EP0562003. Ademas, las p-glucosidasas pueden catalizar la hidrolisis de un numero de sustratos diferentes y, por lo tanto, son utiles en una variedad de aplicaciones diferentes. Se pueden anadir algunas p-glucosidasas a las uvas durante la produccion del vino para mejorar el aroma potencial del producto de vino acabado. Otra aplicacion adicional puede ser la utilizacion de la p-glucosidasa en la fruta para mejorar el aroma de la misma. De manera alternativa, la p-glucosidasa puede utilizarse directamente en los aditivos alimenticios o en la elaboracion del vino para mejorar el sabor y el aroma.
[0078] Las celulasas tambien encuentran un numero de usos en composiciones detergentes, incluyendo la mejora de la capacidad de limpieza, como un agente suavizante y la mejora del tacto de los tejidos de algodon (Hemmpel, 1991; Tyndall, 1992; Kumar et al., 1997). Aunque el mecanismo no forma parte de la invencion, las
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propiedades suavizantes y de restauracion de color de la celulasa se han atribuido a los componentes de endoglucanasa alcalina en composiciones de celulasa, como lo demuestran las patentes estadounidenses n.° 5 648 263, 5 691 178 y 5 776 757, que exponen que las composiciones detergentes que contienen una composicion de celulasa enriquecida en un componente de endoglucanasa alcalina especificado imparten 5 restauracion de color y suavizado mejorado a las prendas tratadas en comparacion con las composiciones de celulasa no enriquecidas en dicho componente. Ademas, se ha demostrado que la utilizacion de dichos componentes de endoglucanasa alcalina en composiciones detergentes complementa los requisitos de pH de la composicion detergente (p. ej., exhibiendo actividad maxima en un pH alcalino de 7.5 a 10, como se describe en las patentes estadounidenses n.° 5 648 263, 5 691 178 y 5 776 757).
10 [0079] Tambien se ha demostrado que las composiciones de celulasa degradan tejidos que contienen algodon,
contribuyendo a una perdida de resistencia reducida en el tejido (patente estadounidense n.° 4 822 516), contribuyendo a la reticencia a utilizar composiciones de celulasa en aplicaciones detergentes comerciales. Se ha sugerido que las composiciones de celulasa que comprenden componentes de endoglucanasa presentan una perdida de resistencia reducida para tejidos que contienen algodon en comparacion con las composiciones que 15 comprenden un sistema de celulasas completo.
[0080] Tambien se ha demostrado que las celulasas son utiles en la degradacion de biomasa de celulosa en etanol (donde la celulasa degrada celulosa en glucosa y levadura u otros microbios y ademas fermenta la glucosa en etanol), en el tratamiento de pulpa mecanica (Pere et al., 1996), para su utilizacion como aditivo para alimentacion animal (WO 91/04673) y en la molienda en humedo de grano.
20 [0081] Se han descrito numerosas celulasas en la literatura cientifica, ejemplos de las cuales incluyen: de
Trichoderma reesei: Shoemaker, S. et al., Bio/Technology, 1:691-696, 1983, que da a conocer CBHI; Teeri, T. et al., Gene, 51:43-52, 1987, que da a conocer CBHII. Penttila, M. et al., Gene, 45:253-263, 1986, que da a conocer eGi; Saloheimo, M. et al., Gene, 63:11-22, 1988, que da a conocer EGlI; Okada, M. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:555-563, 1988, que da a conocer EGIII; Saloheimo, M. et al., Eur. J. Biochem., 249:584-591, 1997, 25 que da a conocer EGIV; Saloheimo, A. et al., Molecular Microbiology, 13:219-228, 1994, que da a conocer EGV; Barnett, C. C., et al., Bio/Technology, 9:562-567, 1991, que da a conocer BGL1, y Takashima, S. et al., J. Biochem., 125:728-736,1999, que da a conocer BGL2. Tambien se han descrito celulasas de especies distintas a Trichoderma, p. ej., Ooi et al., 1990, que da a conocer la secuencia de ADNc que codifica la endoglucanasa F1- CMC producida por Aspergillus aculeatus; Kawaguchi T et al., 1996, que da a conocer la clonacion y la 30 secuenciacion del ADNc que codifica la beta-glucosidasa 1 de Aspergillus aculeatus; Sakamoto et al., 1995, que da a conocer la secuencia de ADNc que codifica la endoglucanasa CMCasa-1 de Aspergillus kawachii IFO 4308; Saarilahti et al., 1990, que da a conocer una endoglucanasa de Erwinia carotovara; Spilliaert R, et al., 1994, que da a conocer la clonacion y la secuenciacion de bglA, que codifica una beta-glucanasa termoestable a partir de Rhodothermus marinu; y Halldorsdottir S et al., 1998, que da a conocer la clonacion, la secuenciacion y la 35 sobreexpresion de un gen de Rhodothermus marinus que codifica una celulasa termoestable de la familia 12 de glicosil hidrolasa. Sin embargo, todavia resulta necesaria la identificacion y caracterizacion de nuevas celulasas, con propiedades mejoradas, tales como rendimiento mejorado en condiciones de estres termico o en presencia de surfactantes, actividad especifica aumentada, patron de escision de sustrato alterado, y/o alto nivel de expresion in vitro.
40 [0082] El desarrollo de nuevas y mejoradas composiciones de celulasa que comprenden cantidades diversas de
celulasas de tipo CBH, de tipo EG y de tipo BG es de interes para utilizarse: (1) en composiciones detergentes que presentan capacidad de limpieza mejorada, funcionan como un agente suavizante y/o mejoran el tacto de los tejidos de algodon (p. ej., “lavado a la piedra” o “biopulido”); (2) en composiciones para la degradacion de pulpa de madera u otra biomasa en azucares (p. ej., para la produccion de bioetanol); y/o (3) en composiciones para 45 pienso.
IV. Metodos de identificacion de secuencias novedosas
[0083] Los marcos de lectura abiertos (ORF, por sus siglas en ingles) se analizan despues de la secuenciacion total o parcial del genoma de T. reesei o de clones de genotecas de ADNc derivadas de ARNm de T. reesei y se analizan ademas utilizando software de analisis de secuencias y mediante la determinacion de la homologia con
50 secuencias conocidas en bases de datos (publicas/privadas).
V. Acidos nucleicos bgl6 y polipeptidos BGL6.
A. Acidos nucleicos bgl6
[0084] Las moleculas de acido nucleico incluyen la secuencia de codificacion nativa, la secuencia de ADNc para bgl6 presentada en el presente documento como SEQ. ID. NO:1 y homologos de las mismas en otras especies,
55 variantes de corte y empalme y alelicas de origen natural, fragmentos de acido nucleico y derivados biologicamente activos (funcionales) de los mismos, tales como, variantes de secuencias de aminoacidos de la molecula nativa y secuencias que codifican las proteinas de fusion. El gen bgl6 tiene dos supuestos codones de
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inicio. Los dos codones de inicio estan subrayados en la Figura 4. Las secuencias se denominan colectivamente en el presente documento “secuencias de acido nucleico que codifican BGL6”.
[0085] El 1 de octubre de 2002 se llevo a cabo una busqueda Basic BLASTN (
http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST) de la base de datos de secuencias de acido nucleico no redundantes, con la secuencia del gen bgl6 presentada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), que indico que no habia secuencias que produjeran alineamientos significativos (es decir, con un valor E de 10-5 o menos).
http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST) de la base de datos de secuencias de acido nucleico no redundantes, con la secuencia del gen bgl6 presentada en la Figura 1 (SEQ ID NO:1), que indico que no habia secuencias que produjeran alineamientos significativos (es decir, con un valor E de 10-5 o menos).
[0086] Una secuencia de acido nucleico bgl6 de la presente invencion puede ser una secuencia de ADN o de ARN, derivada de ADN genomico, ADNc, ARNm o puede sintetizarse en su totalidad o en parte. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario y si es monocatenario puede ser la cadena codificante o la cadena no codificante (antisentido, complementaria). La secuencia de acido nucleico puede clonarse, por ejemplo, aislando el ADN genomico de una fuente adecuada y amplificando y clonando la secuencia de interes utilizando una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles). De manera alternativa, la secuencia de acido nucleico puede sintetizarse, por completo o en parte, especialmente donde se desea proporcionar secuencias preferidas por el huesped para la expresion optima. Por lo tanto, todo el gen estructural deseado o una parte del mismo (la parte del gen que codifica un polipeptido o proteina) puede sintetizarse utilizando codones preferidos por un huesped seleccionado.
[0087] Debido a la degeneracion inherente del codigo genetico, las secuencias de acido nucleico distintas a la forma nativa que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoacidos o una funcionalmente equivalente pueden utilizarse para clonar y/o expresar secuencias de acidos nucleicos que codifican BGL6. De esta manera, para una secuencia de acidos nucleicos determinada que codifica BGL6, se entiende que como resultado de la degeneracion del codigo genetico, puede producirse un numero de secuencias de codificacion que codifican una proteina que tiene la misma secuencia de aminoacidos. Por ejemplo, el triplete CGT codifica el aminoacido arginina. La arginina es codificada de manera alternativa por CGA, CGC, CGG, AGA y AGG. Por lo tanto, se entiende que dichas sustituciones en la region de codificacion entran dentro de las variantes de secuencia de acido nucleico cubiertas. Todas y cada una de estas variantes de secuencia pueden utilizarse de la misma manera que se describe en el presente documento para la forma nativa de una secuencia de acido nucleico que codifica BGL6.
[0088] Una “variante” de secuencia de acido nucleico que codifica BGL6 puede codificar una “variante” de secuencia de aminoacidos BGL6 que es alterada por uno o mas aminoacidos de la secuencia de polipeptidos nativa o puede truncarse por la eliminacion de uno o mas aminoacidos de cualquier extremo de la secuencia de polipeptidos, ambos incluidos. De manera similar, el termino “forma modificada de”, en relacion con BGL6, significa un derivado o forma variante de la secuencia de acido nucleico que codifica la proteina BGL6 nativa o la secuencia de aminoacidos BGL6 nativa.
[0089] De manera similar, los polinucleotidos que se puede utilizar incluyen secuencias que codifican proteinas BGL6 nativas y variantes de corte y empalme de las mismas, secuencias complementarias a la secuencia de codificacion de la proteina nativa y fragmentos novedosos de polinucleotidos que codifican BGL6. Una secuencia de acido nucleico que codifica BGL6 puede contener una o mas secuencias de intrones si es una secuencia de ADN genomico.
[0090] En un modo de realizacion general, una secuencia de nucleotidos que codifica BGL6 tiene al menos 70 %, preferiblemente 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, o mas identidad de secuencia con la secuencia de codificacion de bgrl6 presentada en el presente documento como SEQ ID NO:1.
[0091] En otro modo de realizacion, una secuencia de nucleotidos que codifica BGL6 se hibridara en condiciones de moderada a alta restriccion a una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina BGL6. En un modo de realizacion relacionado, una secuencia de nucleotidos que codifica BGL6 se hibridara en condiciones de moderada a alta restriccion a la secuencia de nucleotidos presentada como SEQ ID NO:1.
[0092] Se entiende que algunas variantes de secuencias de acidos nucleicos que codifican BGL6 pueden o no hibridarse de manera selectiva a la secuencia parental. A modo de ejemplo, en situaciones en las que la secuencia de codificacion se ha optimizado basandose en la degeneracion del codigo genetico, puede producirse una variante de secuencia de codificacion que codifica una proteina BGL6, pero no se hibrida a una secuencia de acidos nucleicos que codifican BGL6 en condiciones de moderada a alta restriccion. Esto ocurriria, por ejemplo, cuando la variante de secuencia incluye un codon diferente para cada uno de los aminoacidos codificados por el nucleotido parental.
[0093] Como entenderan de manera adicional los expertos en la materia, en algunos casos puede resultar ventajoso producir secuencias de nucleotidos que posean codones que no sean de origen natural, p. ej., inosina u otro analogo de nucleotido que no sea de origen natural. Los codones preferidos por un huesped eucariota particular pueden seleccionarse, por ejemplo, para aumentar el indice de expresion de la proteina BGL6 o para producir transcritos de ARN recombinante que tienen propiedades deseables, tales como una vida media mas larga que los transcritos producidos a partir de la secuencia de origen natural. Por consiguiente, una secuencia
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nativa de nucleotidos que codifica BGL6 puede crearse con el fin de alterar la secuencia de codificacion para una variedad de razones, incluyendo, pero sin caracter limitativo, alteraciones que modifican la clonacion, el procesamiento y/o la expresion de la proteina BGL6 por una celula.
[0094] Se prefieren particularmente las sustituciones, adiciones y deleciones de acidos nucleicos que son silenciosas de manera que no alteran las propiedades o actividades del polinucleotido o polipeptido nativo.
[0095] Las variaciones pueden realizarse utilizando metodos conocidos en la tecnica tales como mutagenesis (de sitio dirigido) mediada por oligonucleotidos y mutagenesis por PCR. La mutagenesis de sitio dirigido (Carter et al., 1986; Zoller et al., 1987), la mutagenesis por insercion de un casete (Wells et al., 1985), la mutagenesis por restriccion-seleccion (Wells et al., 1986) u otras tecnicas conocidas pueden realizarse en el ADN clonado para producir la variante de ADN que codifica polipeptido BGL6.
[0096] Sin embargo, en algunos casos puede resultar ventajoso expresar variantes de bgl6 que carezcan de las propiedades o actividades del polipeptido BGL6 o del polinucleotido bgl6 nativo. En tales casos, las formas mutantes o modificadas de la secuencia nativa de acidos nucleicos que codifican BGL6 pueden generarse utilizando tecnicas empleadas de manera rutinaria por los expertos en la materia.
B. Polipeptidos BGL6
[0097] En un modo de realizacion preferido, se describe un polipeptido BGL6 que tiene una secuencia de polipeptidos BGL6 nativa madura o completa que comprende la secuencia presentada en la Figura 2 (SEQ ID NO:2). Un polipeptido BGL6 puede ser el polipeptido BGL6 maduro, parte de una proteina de fusion o un fragmento o variante de la secuencia de polipeptido BGL6 presentada en la Figura 2 (SEQ ID NO:2).
[0098] Generalmente, un polipeptido BGL6 tiene al menos 80 % de identidad con una secuencia de aminoacidos BGL6 en toda su longitud. Son mas preferibles las secuencias de polipeptidos BGL6 que comprenden una region que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o mas de identidad de secuencia con la secuencia de polipeptidos BGL6 de la Figura 2 (SEQ ID NO:2), utilizando un programa de alineamiento de secuencias, como se detalla en el presente documento.
[0099] Normalmente, una “forma modificada de” una proteina BGL6 nativa o una “variante” de proteina BGL6 tiene una secuencia derivada que contiene al menos una sustitucion, adicion, delecion o insercion de aminoacidos, respectivamente.
[0100] En la tecnica se sabe que se pueden realizar ciertas sustituciones de aminoacidos en las secuencias de proteina sin afectar a la funcion de la proteina. En general, las sustituciones de aminoacidos conservadoras o las sustituciones de aminoacidos similares se toleran sin afectar a la funcion de la proteina. Aminoacidos similares pueden ser los que son similares en tamano y/o propiedades de carga, por ejemplo, el aspartato y el glutamato, y la isoleucina y la valina, son ambos pares de aminoacidos similares. La similitud entre los pares de aminoacidos se ha evaluado en la tecnica de numerosas maneras. Por ejemplo, Dayhoff et al. (1978), proporciona tablas de frecuencias para sustituciones de aminoacidos que pueden emplearse como una medida de similitud de aminoacidos. Las tablas de frecuencias de Dayhoff et al. se basan en comparaciones de secuencias de aminoacidos para proteinas que tienen la misma funcion de una variedad de fuentes evolutivamente diferentes.
[0101] Se consideran los fragmentos y variantes de la secuencia de polipeptidos BGL6 de la Figura 2 (SEQ ID NO:2). Un fragmento es una variante de polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que es completamente igual como parte pero no toda la secuencia de aminoacidos de los polipeptidos descritos anteriormente. Los fragmentos pueden ser “independientes” o estar comprendidos dentro de un polipeptido mas grande del cual el fragmento forma un parte o una region, mas preferiblemente como una unica region continua. Los fragmentos preferidos son fragmentos biologicamente activos que son aquellos fragmentos que median las actividades de los polipeptidos de la invencion, incluyendo aquellos con actividad similar o actividad mejorada o con una actividad reducida. Tambien se incluyen aquellos fragmentos que son antigenicos o inmunogenicos en un animal, en concreto un humano. En este aspecto, se incluyen (i) fragmentos de BGL6, preferiblemente al menos aproximadamente 20-100 aminoacidos en longitud, mas preferiblemente aproximadamente 100-200 aminoacidos en longitud, y (ii) una composicion farmaceutica que comprende BGL6. En varios modos de realizacion, el fragmento corresponde al dominio N-terminal de BGL6 o al domino C-terminal de BGL6.
[0102] Los polipeptidos BGL6 tambien incluyen polipeptidos que varian de la secuencia de polipeptidos BGL6 de la Figura 2 (SEQ ID NO:2). Estas variantes pueden ser variantes de sustitucion, de insercion o de delecion. Las variantes normalmente muestran la misma actividad biologica cualitativa que los analogos de origen natural, aunque tambien pueden seleccionarse variantes que tienen caracteristicas modificadas como se describe de manera adicional a continuacion.
[0103] Una “sustitucion” resulta del reemplazo de uno o mas nucleotidos o aminoacidos por nucleotidos o aminoacidos diferentes, respectivamente.
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[0104] Una “insercion” o “adicion” es ese cambio en una secuencia de nucleotidos o de aminoacidos que ha dado lugar a la adicion de uno o mas residuos de nucleotidos o de aminoacidos, respectivamente, en comparacion con la secuencia de origen natural.
[0105] Una “delecion” se define como un cambio en una secuencia de nucleotidos o de aminoacidos en la que uno o mas residuos de nucleotidos o de aminoacidos, respectivamente, estan ausentes.
[0106] Las sustituciones de aminoacidos son normalmente de residuos solos; las inserciones generalmente seran del orden de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 aminoacidos, aunque pueden tolerarse inserciones considerablemente mas grandes. Las deleciones varian de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 residuos, aunque en algunos casos las deleciones pueden ser mucho mas grandes.
[0107] Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier otra combinacion de las mismas puede utilizarse para llegar a un derivado final. En general, estos cambios se realizan en unos pocos aminoacidos para minimizar la alteracion de la molecula. Sin embargo, pueden tolerarse cambios mas grandes en determinadas circunstancias.
[0108] Las sustituciones de aminoacidos pueden ser el resultado del reemplazo de un aminoacido por otro aminoacido con propiedades estructurales y/o quimicas similares, tal como el reemplazo de una isoleucina por una valina, es decir, reemplazos de aminoacidos conservadores. Las inserciones o deleciones pueden opcionalmente estar en el intervalo de 1 a 5 aminoacidos.
[0109] Las sustituciones se realizan generalmente de conformidad con “sustituciones conservadoras” conocidas. Una “sustitucion conservadora” se refiere a la sustitucion de un aminoacido en una clase por un aminoacido en la misma clase, donde una clase se define por propiedades de cadena lateral de aminoacidos fisicoquimicas comunes y frecuencias de sustitucion altas en proteinas homologas encontradas en la naturaleza (como se determina, p. ej., por una matriz de intercambio de frecuencias de Dayhoff estandar o una matriz BLOSUM). (Vease generalmente, Doolittle, R.F., 1986.)
[0110] Una “sustitucion no conservadora” se refiere a la sustitucion de un aminoacido en una clase por un aminoacido de otra clase.
[0111] Las variantes de polipeptido BGL6 normalmente muestran la misma actividad biologica cualitativa que el analogo de origen natural, aunque las variantes tambien se seleccionan para modificar las caracteristicas del polipeptido BGL6, segun sea necesario. Por ejemplo, los sitios de glicosilacion, y mas en concreto uno o mas sitios de O-glicosilacion o de N-glicosilacion pueden alterarse o eliminarse. Los expertos en la materia entenderan que los cambios en los aminoacidos pueden alterar los procesos posteriores a la traduccion del polipeptido BGL6, tal como cambiar el numero o la posicion de los sitios de glicosilacion o alterar las caracteristicas de anclaje de la membrana o las caracteristicas de secrecion u otras caracteristicas de localizacion celular.
[0112] En la definicion de polipeptidos BGL6 tambien se incluyen otros polipeptidos BGL6 relacionados. Por lo tanto, las secuencias de cebador de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles) degeneradas o de sonda pueden utilizarse para encontrar otros polipeptidos relacionados. Las secuencias de cebador o de sonda utiles pueden disenarse para: toda o parte de la secuencia de polipeptidos BGL6, o secuencias fuera de la region codificante. Como se conoce de manera general en la tecnica, los cebadores PCR preferidos son de aproximadamente 15 a aproximadamente 35 nucleotidos de longitud, prefiriendose de aproximadamente 20 a aproximadamente 30, y pueden contener inosina segun sea necesario. Las condiciones para la reaccion PCR se conocen por lo general en la tecnica.
[0113] Tambien se incluyen las modificaciones covalentes de polipeptidos BGL6. Por ejemplo, se proporcionan polipeptidos BGL6 que son una proteina madura y pueden comprender aminoacidos amino o carboxilo terminal adicionales, o aminoacidos dentro del polipeptido maduro (por ejemplo, cuando la forma madura de la proteina tiene mas de una cadena de polipeptidos). Estas secuencias pueden, por ejemplo, desempenar un papel en el procesamiento de la proteina de una forma precursora a una madura, permitir el transporte de la proteina, acortar o alargar la vida media de la proteina o facilitar la manipulacion de la proteina en los ensayos o en la produccion. Como ejemplo, se cree que el presente polipeptido BGL6 novedoso es una proteina intracelular. Por lo tanto, con el fin de exportarse al medio extracelular una senal de secrecion que se elimina posteriormente puede ser deseable.
[0114] Tambien se contemplan modificaciones dirigidas a la alteracion de un sitio activo, la alteracion del pH optimo, la temperatura optima y/o la afinidad del sustrato de la enzima BGL6.
[0115] La Figura 2 muestra la secuencia de aminoacidos prevista (SEQ ID NO:2) de un polipeptido BGL6 de ejemplo basada en la secuencia de nucleotidos proporcionada en la Figura 1. El peso molecular previsto del polipeptido BGL6 codificado es 92 kDa. Ninguna secuencia que se parezca a un peptido de senal (Nielsen, H.,
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Engelbrecht, J., Brunak, S., von Heijne, G., Protein Engineering, 10:1-6, 1997) esta presente en el amino terminal de BGL6 sugiriendo que el polipeptido BGL6 no esta secretado.
[0116] Una busqueda Basic BLASTP (
http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST) de la base de datos de proteinas no redundantes, llevada a cabo el 1 de octubre de 2002 con la secuencia de aminoacidos BGL6 indico un 42 % de identidad de secuencia con el numero de acceso GenBank P07337 (precursor de beta-glucosidasa de marxianus de la variedad Kluyveromyces marxianus), 43 % de identidad de secuencia con el numero de acceso GenBank AL355920 (precursor de beta-glucosidasa de Schizosaccharomyces pombe), 38 % de identidad de secuencia con el numero de acceso GenBank AF329731 (beta-glucosidasa de Volvariella volvacea) y 38 % de identidad de secuencia con el numero de acceso GenBank AJ293760 (supuesta beta-glucosidasa de Agaricus bisporus). Las diez secuencias con la identidad mas alta pero inferior a 43 % de identidad con BGL6 se anotaron todas como beta-glucosidasas. Estas similitudes de secuencias indican que la BGL6 es un miembro de la familia 3 de glicosil hidrolasas (Henrissat, B. y Bairoch, A. (1993) Biochem. J. 293:781-788).
http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST) de la base de datos de proteinas no redundantes, llevada a cabo el 1 de octubre de 2002 con la secuencia de aminoacidos BGL6 indico un 42 % de identidad de secuencia con el numero de acceso GenBank P07337 (precursor de beta-glucosidasa de marxianus de la variedad Kluyveromyces marxianus), 43 % de identidad de secuencia con el numero de acceso GenBank AL355920 (precursor de beta-glucosidasa de Schizosaccharomyces pombe), 38 % de identidad de secuencia con el numero de acceso GenBank AF329731 (beta-glucosidasa de Volvariella volvacea) y 38 % de identidad de secuencia con el numero de acceso GenBank AJ293760 (supuesta beta-glucosidasa de Agaricus bisporus). Las diez secuencias con la identidad mas alta pero inferior a 43 % de identidad con BGL6 se anotaron todas como beta-glucosidasas. Estas similitudes de secuencias indican que la BGL6 es un miembro de la familia 3 de glicosil hidrolasas (Henrissat, B. y Bairoch, A. (1993) Biochem. J. 293:781-788).
C. Anticuerpos anti-BGL6.
[0117] La presente exposicion proporciona ademas anticuerpos anti-BGL6. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecificos o heteroconjugados.
[0118] El experto en la materia conoce metodos para la preparacion de anticuerpos policlonales. El agente inmunizante puede ser un polipeptido BGL6 o una proteina de fusion del mismo. Puede resultar util conjugar el antigeno a una proteina que se sabe que es inmunogenica en el mamifero que se esta inmunizando. El protocolo de inmunizacion puede determinarse por un experto en la materia basandose en protocolos estandar o en experimentacion rutinaria.
[0119] De manera alternativa, los anticuerpos anti-BGL6 pueden ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos por celulas inmunizadas en un animal o utilizando metodos de ADN recombinante. (Vease, p. ej., Kohler et al., 1975; la patente estadounidense N.° 4 816 567).
[0120] Un anticuerpo anti-BGL6 puede comprender ademas un anticuerpo humano o humanizado. El termino “anticuerpo humanizado” se refiere a formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) que son anticuerpos quimericos, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras secuencias de anticuerpos parciales de union al antigeno) que contienen alguna parte de la secuencia derivada de un anticuerpo no humano. En la tecnica se conocen metodos para la humanizacion de anticuerpos no humanos, como se detalla de manera adicional en Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; y Verhoeyen et al., 1988. En la tecnica tambien se conocen metodos para la produccion de anticuerpos humanos. Vease, p. ej., Jakobovits, A, et al., 1995 y Jakobovits, A, 1995.
VI. Expresion de BGL6 recombinante
[0121] Los metodos se basan en la utilizacion de celulas para expresar BGL6, sin que se requiera ningun metodo concreto de expresion de la BGL6.
[0122] Se proporcionan celulas huesped que se han transducido, transformado o transfectado con un vector de expresion que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica BGL6. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las utilizadas anteriormente para la celula huesped parental antes de la transduccion, transformacion o transfeccion y resultaran evidentes para los expertos en la materia.
[0123] En un enfoque, se transfecta una celula de hongo filamentoso o una celula de levadura con un vector de expresion que tiene un promotor o un fragmento de promotor biologicamente activo o uno o varios (por ejemplo, una serie) de los potenciadores que funciona en la linea de la celula huesped, operativamente unido a un segmento de ADN que codifica BGL6, de manera que la BGL6 se expresa en la linea celular.
A. Constructos de acido nucleico/Vectores de expresion.
[0124] Se pueden incorporar fragmentos de polinucleotidos naturales o sinteticos que codifican BGL6 (“secuencias de acido nucleico que codifican BGL6”) en vectores o constructos de acido nucleico heterologos, capaces de la introduccion y la replicacion en una celula de levadura o de hongo filamentoso. Los vectores y metodos expuestos en el presente documento son adecuados para utilizarse en celulas huesped para la expresion de BGL6. Se puede utilizar cualquier vector siempre que sea replicable y viable en las celulas en las que se introduce. Los expertos en la materia conocen un gran numero de vectores y promotores adecuados, y estos estan disponibles comercialmente. Los vectores de clonacion y expresion tambien se describen en Sambrook et al., 1989, Ausubel FM et al., 1989, y Strathern et al., 1981. Se describen vectores de expresion adecuados para hongos en van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) En: Bennett, J.W. y Lasure, L.L. (eds.) More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pp. 396-428. La secuencia de ADN adecuada se puede insertar en un plasmido o vector (denominados colectivamente en el presente documento como “vectores”) mediante una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restriccion adecuado(s) mediante procedimientos estandar. Se considera que dichos procedimientos y los
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procedimientos de subclonacion relacionados estan dentro del alcance del conocimiento de los expertos en la materia.
[0125] Se pueden producir hongos filamentosos recombinantes que comprenden la secuencia de codificacion para BGL6 introduciendo un constructo de acido nucleico heterologo que comprende la secuencia de codificacion de BGL6 en las celulas de una cepa seleccionada de los hongos filamentosos.
[0126] Una vez que se obtiene la forma deseada de una secuencia de acido nucleico de bgl6, un homologo, variante o fragmento de la misma, se puede modificar de diversas maneras. Cuando la secuencia implica regiones flanqueantes no codificantes, las regiones flanqueantes se pueden someter a reseccion, mutagenesis, etc. De esta manera, se pueden realizar transiciones, transversiones, deleciones e inserciones en la secuencia de origen natural.
[0127] Puede insertarse una secuencia de codificacion de bgl6 seleccionada en un vector adecuado de conformidad con tecnicas recombinantes bien conocidas y utilizarse para transformar los hongos filamentosos capaces de la expresion de BGL6. Debido a la degeneracion inherente del codigo genetico, se pueden utilizar otras secuencias de acido nucleico que codifican una secuencia de aminoacidos sustancialmente igual o funcionalmente equivalente para clonar y expresar BGL6. Por lo tanto, se entiende que dichas sustituciones en la region de codificacion estan dentro de las variantes de secuencias cubiertas por la presente invencion. Se pueden utilizar todas y cada una de estas variantes de secuencia de la misma manera que se describe en el presente documento para una secuencia de acido nucleico parental que codifica BGL6.
[0128] Los constructos de acido nucleico recombinante que comprenden una o mas de las secuencias de acido nucleico que codifican BGL6 como se describe anteriormente estan incluidos. Los constructos comprenden un vector, tal como un vector viral o plasmido, en el que se ha insertado una secuencia de la invencion, en una orientacion directa o inversa.
[0129] Los constructos de acido nucleico heterologos pueden incluir la secuencia de codificacion para bgl6, o una variante, fragmento o variante de corte y empalme de la misma: (i) de manera aislada; (ii) en combinacion con secuencias de codificacion adicionales; tales como secuencias de codificacion de proteina de fusion o de peptido senal, en las que la secuencia que codifica bgl6 es la secuencia de codificacion dominante; (iii) en combinacion con secuencias no codificantes, tales como intrones y elementos de control, tales como elementos promotores y terminadores o regiones 5' y/o 3' no traducidas, eficaces para la expresion de la secuencia de codificacion en un huesped adecuado; y/o (iv) en un vector o medio huesped en el que la secuencia que codifica bgl6 es un gen heterologo.
[0130] En un aspecto, se emplea un constructo de acido nucleico heterologo para transferir una secuencia de acido nucleico que codifica BGL6 en una celula in vitro, con lineas de levadura y de hongos filamentosos establecidas preferidas. Para la produccion a largo plazo y de alto rendimiento de BGL6, se prefiere la expresion estable. Se deduce que se puede utilizar cualquier metodo efectivo para generar transformantes estables.
[0131] Los vectores adecuados estan normalmente equipados con una secuencia de acido nucleico que codifica un marcador seleccionable, sitios de insercion y elementos de control adecuados, tales como secuencias de promotor y de terminacion. El vector puede comprender secuencias reguladoras, que incluyen, por ejemplo, secuencias no codificantes, tales como intrones y elementos de control, es decir, elementos promotores y terminadores o regiones 5' y/o 3' no traducidas, eficaces para la expresion de la secuencia de codificacion en celulas huesped (y/o en un medio de celula huesped o vector en el que normalmente no se expresa una secuencia de codificacion de antigeno de proteina soluble modificada), operativamente unidas a la secuencia de codificacion. Los expertos en la materia conocen un gran numero de vectores y promotores adecuados, muchos de los cuales estan disponibles comercialmente y/o se describen en Sambrook, et al, (supra).
[0132] Promotores de ejemplo incluyen tanto promotores constitutivos como promotores inducibles, ejemplos de los cuales incluyen un promotor CMV, un promotor SV40 temprano, un promotor RSV, un promotor EF-1a, un promotor que contiene el elemento de respuesta tet (TRE, por sus siglas en ingles) en el sistema tet-on o tet-off como se describe (ClonTech y BASF), el promotor beta actina y el promotor metalotionina que se pueden regular por incremento mediante la adicion de ciertas sales de metales. Una secuencia promotora es una secuencia de ADN que es reconocida por el hongo filamentoso concreto para propositos de expresion. Esta operativamente unida a una secuencia de ADN que codifica un polipeptido de BGL6. Dicha union comprende el posicionamiento del promotor con respecto al codon de iniciacion de la secuencia de ADN que codifica el polipeptido de BGL6 en los vectores de expresion expuestos. La secuencia del promotor contiene la secuencia de control de la transcripcion y la traduccion que media en la expresion del polipeptido de BGL6. Los ejemplos incluyen los promotores de los genes que codifican glucoamilasa, alfa-amilasa, o alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, A awamori o A. oryzae; los genes gpdA o trpC de A. nidulans; los genes cbhl o trpl de Neurospora crassa; los genes que codifican proteinasa aspartica de A. niger o Rhizomucor miehei; los genes que codifican cbh1, cbh2, egl1, egl2, u otras celulasas de T. reesei.
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[0133] La eleccion del marcador seleccionable adecuado dependera de la celula huesped, y en la tecnica se conocen bien los marcadores adecuados para diferentes huespedes. Los genes marcadores seleccionables tipicos incluyen argB de A. nidulans o T. reesei, amdS de A. nidulans, pyr4 de Neurospora crassa o T. reesei, pyrG de Aspergillus niger o A. nidulans. Ejemplos adicionales de marcadores seleccionables incluyen, pero sin caracter limitativo, trpc, trpl, oliC31, niaD o leu2, que se incluyen en constructos de acido nucleico heterologo utilizados para transformar una cepa mutante tal como trp-, pyr-, leu- y similares.
[0134] Dichos marcadores seleccionables confieren a los transformantes la capacidad de utilizar un metabolito que normalmente no es metabolizado por los hongos filamentosos. Por ejemplo, el gen amdS de T. reesei que codifica la enzima acetamidasa que permite que las celulas transformantes crezcan en acetamida como una fuente de nitrogeno. El marcador seleccionable (por ejemplo, pyrG) puede restaurar la capacidad de una cepa mutante auxotrofica para crecer en un medio minimo selectivo o el marcador seleccionable (por ejemplo, olic31) puede conferir a los transformantes la capacidad de crecer en presencia de un antibiotico o farmaco inhibidor.
[0135] La secuencia de codificacion del marcador seleccionable se clona en cualquier plasmido adecuado utilizando metodos generalmente empleados en la tecnica. Ejemplos de plasmidos incluyen pUC18, pBR322 y pUC100.
[0136] La practica de la presente descripcion empleara, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologia molecular, microbiologia, ADN recombinante e inmunologia, que estan dentro de la tecnica. Dichas tecnicas se explican con detalle en la literatura. Vease, por ejemplo, Sambrook et al., 1989; Freshney, 1987; Ausubel, et al., 1993; y Coligan et al., 1991.
B. Celulas huesped y condiciones de cultivo para la produccion de BGL6 mejorada
(i) Hongos filamentosos
[0137] Se proporcionan hongos filamentosos que comprenden celulas que han sido modificadas, seleccionadas y cultivadas de manera efectiva para dar lugar a la produccion o expresion de BGL6 mejorada con respecto a los correspondientes hongos parentales no transformados.
[0138] Ejemplos de especies de hongos filamentosos parentales que se pueden tratar y/o modificar para la expresion de BGL6 mejorada incluyen, pero sin caracter limitativo, Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii; Penicillium sp., Humicola sp., incluyendo Humicola insolens; Aspergillus sp., Chrysosporium sp., Fusarium sp., Hypocrea sp., y Emericella sp.
[0139] Las celulas que expresan BGL6 se cultivan en condiciones normalmente empleadas para cultivar la linea fungica parental. Generalmente, las celulas se cultivan en un medio estandar que contiene sales fisiologicas y nutrientes, tal como se describe en Pourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988 e Ilmen, M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997. Las condiciones de cultivo tambien son estandar, por ejemplo, los cultivos se incuban a 28 0C en agitadores de cultivos o fermentadores hasta que se consiguen niveles de expresion de BGL6 deseados.
[0140] Las condiciones de cultivo preferidas para un hongo filamentoso determinado se pueden encontrar en la literatura cientifica y/o de la fuente de los hongos, tal como la American Type Culture Collection (ATCC; “
www.atcc.org/”). Despues de establecer el crecimiento fungico, las celulas se exponen a condiciones efectivas para causar o permitir la sobreexpresion de BGL6.
www.atcc.org/”). Despues de establecer el crecimiento fungico, las celulas se exponen a condiciones efectivas para causar o permitir la sobreexpresion de BGL6.
[0141] En casos en los que una secuencia que codifica BGL6 esta bajo el control de un promotor inducible, el agente inductor, por ejemplo, un azucar, una sal de metal o antibioticos, se anade al medio en una concentracion efectiva para inducir la expresion de BGL6 a alto nivel.
(ii) Levadura
[0142] Tambien se contempla la utilizacion de levadura como celula huesped para la produccion de BGL6. Varios otros genes que codifican enzimas hidroliticas se han expresado en varias cepas de la levadura S. cerevisiae. Estos incluyen secuencias que codifican dos endoglucanasas (Penttila et al., 1987), dos celobiohidrolasas (Penttila et al., 1988) y una beta-glucosidasa de Trichoderma reesei (Cummings y Fowler, 1996), una xilanasa de Aureobasidlium pullulans (Li y Ljungdahl, 1996), una alfa-amilasa de trigo (Rothstein et al., 1987), etc. Ademas, un casete del gen de celulasa que codifica la endo-[beta]-1,4-glucanasa (END1) de Butyrivibrio fibrisolvens, celobiohidrolasa (CBH1) de Phanerochaete chrysosporium, la celodextrinasa (CEL1) de Ruminococcus flavefaciens y la celobiasa de Endomyces fibrilizer (Bgl1) se expreso satisfactoriamente en una cepa de laboratorio de S. cerevisiae (Van Rensburg et al., 1998).
C. Introduccion de una secuencia de acido nucleico que codifica BGL6 en celulas huesped.
[0143] Se proporcionan celulas y composiciones celulares que han sido modificadas geneticamente para comprender una secuencia de acido nucleico que codifica BGL6 proporcionada de manera exogena. Se puede
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modificar geneticamente una celula parental o linea celular (es decir, transducirse, transformarse o transfectarse) con un vector de clonacion o un vector de expresion. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plasmido, una particular viral, un fago, etc., como se describe de manera adicional anteriormente.
[0144] Pueden emplearse varios metodos para entregar un vector de expresion en celulas in vitro. Despues de construir un vector adecuado, este se utiliza para transformar cepas de hongos o levadura. Los expertos en la materia conocen los metodos generales para la introduccion de acidos nucleicos en celulas para la expresion de secuencias de acidos nucleicos heterologas. Dichos metodos incluyen, pero sin caracter limitativo, electroporacion; microinyeccion nuclear o microinyeccion directa en celulas individuales; fusion de protoplastos bacteriana con celulas intactas; utilizacion de policationes, p. ej., polibreno o poliornitina; fusion de membrana con liposomas, transfeccion mediada por lipofeccion o lipofectamina; bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos de ADN; incubacion con precipitado de ADN-fosfato de calcio; transfeccion mediada por DEAE-Dextrano; infeccion con acidos nucleicos virales modificados; y similares.
[0145] Metodos preferidos para la introduccion de un constructo de acido nucleico heterologo (vector de expresion) en hongos filamentosos (por ejemplo, T. reesei) incluyen, pero sin caracter limitativo, la utilizacion de una pistola de genes o particulas, permeabilizacion de las paredes celulares de hongos filamentosos antes del proceso de transformacion (por ejemplo, mediante la utilizacion de altas concentraciones de alcali, por ejemplo, 0,05 M a 0,4 M de CaCl2 o acetato de litio), fusion de protoplastos o transformacion mediada por agrobacterium. Se describe un metodo de ejemplo para la transformacion de hongos filamentosos mediante el tratamiento de protoplastos o esferoplastos con polietilenglicol y CaCl2 en Campbell, E.I. et al., Curr. Genet. 16:53-56,1989 y Penttila, M. et al., Gene, 63:11-22, 1988.
[0146] Ademas, los constructos de acido nucleico heterologos que comprenden una secuencia de acido nucleico que codifica BGL6 se pueden transcribir in vitro, y el ARN resultante se puede introducir en la celula huesped mediante metodos conocidos, por ejemplo, mediante inyeccion.
[0147] Despues de la introduccion de un constructo de acido nucleico heterologo que comprende la secuencia de codificacion para bgl6, las celulas modificadas geneticamente se pueden cultivar en medios de nutrientes convencionales modificados segun convenga para activar los promotores, seleccionar los transformantes o aumentar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica BGL6. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las utilizadas anteriormente para la celula huesped seleccionada para la expresion, y resultaran evidente para los expertos en la materia.
[0148] Generalmente, se considera que la progenie de las celulas en las que se han introducido dichos constructos de acidos nucleicos heterologos comprende la secuencia de acidos nucleicos que codifica BGL6 encontrada en el constructo de acido nucleico heterologo.
[0149] Se incluyen, ademas, transformantes nuevos y utiles de hongos filamentosos tales como Trichoderma reesei para utilizarse en la produccion de composiciones de celulasa fungicas. La invencion incluye transformantes de hongos filamentosos, especialmente hongos que comprenden la secuencia que codifica bgl6, que comprenden una forma modificada de la secuencia que codifica bgl6 o la delecion de la secuencia que codifica la bgl6.
[0150] En general, se pueden diferenciar los transformantes estables de hongos filamentosos de los transformantes inestables por su indice de crecimiento mas rapido y la formacion de colonias circulares con un contorno liso en lugar de irregular en el medio de cultivo solido. De manera adicional, en algunos casos, se puede realizar una prueba de estabilidad adicional mediante el crecimiento de los transformantes en un medio solido no selectivo, la recogida de las esporas de este medio de cultivo y la determinacion del porcentaje de estas esporas que germinaran posteriormente y creceran en el medio selectivo.
VII. Analisis para secuencias codificantes de acido nucleico de BGL6 y/o expresion de proteinas.
[0151] Con el fin de evaluar la expresion de BGL6 mediante una linea celular que ha sido transformada con un constructo de acido nucleico que codifica BGL6, se pueden realizar ensayos al nivel de la proteina, al nivel del ARN o mediante la utilizacion de bioensayos funcionales concretos con respecto a la actividad y/o la produccion de glucosidasa.
[0152] En una aplicacion de ejemplo de las secuencias de proteinas y acido nucleico de bgl6 descritas en el presente documento, se disena una cepa de hongos filamentosos modificada geneticamente, por ejemplo, Trichoderma reesei, para producir una mayor cantidad de BGL6. Dichos hongos filamentosos geneticamente modificados serian utiles para producir un producto de celulasa con mayor capacidad celulolitica incrementada. En un enfoque, esto se consigue introduciendo la secuencia de codificacion para bgl6 en un huesped adecuado, por ejemplo, un hongo filamentoso, tal como Trichoderma reesei.
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[0153] Por consiguiente, se incluyen metodos para la expresion de BGL6 en un hongo filamentoso u otro huesped adecuado introduciendo un vector de expresion que contiene la secuencia de ADN que codifica BGL6 en las celulas del hongo filamentoso u otro huesped adecuado.
[0154] En otro aspecto, se incluyen metodos para la modificacion de la expresion de BGL6 en un hongo filamentoso u otro huesped adecuado. Dicha modificacion incluye una reduccion o eliminacion de la expresion, o la expresion de una forma alterada de BGL6. Una forma alterada de BGL6 puede tener una secuencia de aminoacidos alterada o una secuencia de acidos nucleicos alterada.
[0155] En general, los ensayos empleados para analizar la expresion de BGL6 incluyen, la transferencia Northern, la transferencia puntual (analisis de ADN o ARN), RT-PCR (reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) o hibridacion in situ, utilizando una sonda debidamente marcada (basada en la secuencia de codificacion de acido nucleico) y la autoradiografia y la transferencia Southern convencional.
[0156] Ademas, la produccion y/o la expresion de BGL6 puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante ensayos para la actividad, expresion y/o produccion de glucosidasa. Dichos ensayos se describen, por ejemplo, en Chen et al. (1992), Herr et al. (1978) y la patente estadounidense 6 184 018 (Li et al 2001). La capacidad de BGL6 para hidrolizar sustratos aislados solubles e insolubles puede medirse utilizando ensayos descritos en Suurnakki et al. (2000) y Ortega et al. (2001). Los sustratos utiles para los ensayos de las actividades de celobiohidrolasa, endoglucanasa o p-glucosidasa incluyen celulosa cristalina, papel de filtro, celulosa hinchada con acido fosforico, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, celooligosacaridos, metilumbeliferil lactosido, metilumbeliferil celobiosido, ortonitrofenil lactosido, paranitrofenil lactosido, ortonitrofenil celobiosido, paranitrophenyl celobiosido, ortonitrofenil glucosido, paranitrofenil glucosido, metilumbeliferil glicosido. Los tres ultimos son particularmente utiles para ensayar p-glucosidasas. Los ensayos de p-glucosidasa se conocen bien en la tecnica. Vease Cummings y Fowler (1996).
[0157] Ademas, la expresion de proteinas se puede evaluar mediante metodos inmunologicos, tales como tincion inmunohistoquimica de celulas, secciones de tejido o inmunoensayo del medio de cultivo de tejidos, por ejemplo, mediante transferencia Western o ELISA. Dichos inmunoensayos se pueden utilizar para evaluar de manera cualitativa y cuantitativa la expresion de BGL6. Los expertos en la materia conocen los detalles de tales metodos y muchos reactivos para practicar dichos metodos estan disponibles comercialmente.
[0158] Se puede utilizar una forma purificada de BGL6 para producir anticuerpos monoclonales o policlonales especificos de la proteina expresada para utilizarse en diferentes inmunoensayos. (Vease, por ejemplo, Hu et al., 1991). Ejemplos de ensayos incluyen ELISA, inmunoensayos competitivos, radioinmunoensayos, transferencia Western, ensayos de inmunofluorescencia indirecta y similares. En general, se pueden utilizar anticuerpos y/o kits disponibles comercialmente para el inmunoensayo cuantitativo del nivel de expresion de las proteinas de glucosidasa.
VIII. Aislamiento y purificacion de proteina BGL6 recombinante.
[0159] En general, una proteina BGL6 producida en un cultivo celular se secreta en el medio y se puede purificar o aislar, por ejemplo, eliminando los componentes no deseados del medio de cultivo celular. No obstante, en algunos casos, se puede producir una proteina BGL6 en una forma celular que requiere la recuperacion de un lisado celular. En tales casos, la proteina BGL6 se purifica de las celulas en las que se produjo utilizando tecnicas empleadas de forma rutinaria por los expertos en la materia. Los ejemplos incluyen, pero sin caracter limitativo, cromatografia de afinidad (Tilbeurgh et al., 1984), metodos cromatograficos de intercambio ionico (Goyal et al., 1991; Fliess et al., 1983; Bhikhabhai et al., 1984; Ellouz et al., 1987), incluyendo intercambio ionico utilizando materiales con alto poder de resolucion (Medve et al., 1998), cromatografia de interaccion hidrofoba (Tomaz y Queiroz, 1999), y separacion de dos fases (Brumbauer, et al., 1999).
[0160] Normalmente, la proteina BGL6 se fracciona para segregar proteinas que tienen propiedades seleccionadas, tales como afinidad de union a agentes de union concretos, por ejemplo, anticuerpos o receptores; o que tienen un intervalo de peso molecular seleccionado, o un intervalo de puntos isoelectricos.
[0161] Una vez se consigue la expresion de una proteina BGL6 determinada, la proteina BGL6 producida de esta manera se purifica a partir de las celulas o cultivo celular. Ejemplos de procedimientos adecuados para tal purificacion incluyen los siguientes: cromatografia en columna de afinidad de anticuerpos, cromatografia de intercambio ionico; precipitacion con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia sobre silice o sobre una resina de intercambio cationico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitacion con sulfato de amonio; y filtracion en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75. Se pueden emplear diferentes metodos de purificacion de proteinas y tales metodos se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, 1990; Scopes, 1982. La(s) etapa(s) de purificacion seleccionada(s) dependera(n), por ejemplo, de la naturaleza del proceso de produccion utilizado y de la proteina concreta producida.
IX. Utilidad de bgl6 y BGL6
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[0162] Se puede entender que el nucleotido bgl6, la proteina BGL6 y las composiciones que comprenden actividad de proteina BGL6 resultan utiles en una amplia variedad de aplicaciones, algunas de las cuales se describen a continuacion.
[0163] Las nuevas y mejoradas composiciones de celulasa que comprenden cantidades distintas de celulasas de tipo BG, de tipo EG y de tipo CBH son utiles en composiciones detergentes que muestran capacidad de limpieza mejorada, funcionan como un agente suavizante y/o mejoran el tacto de los tejidos de algodon (por ejemplo, “lavado a la piedra” o “biopulido”), en las composiciones para degradar pulpa de madera en azucares (por ejemplo, para la produccion de bioetanol), y/o en composiciones para pienso. El aislamiento y caracterizacion de la celulasa de cada tipo proporciona la capacidad para controlar los aspectos de tales composiciones.
[0164] En un enfoque preferido, la celulasa de la invencion es util en composiciones detergentes o en el tratamiento de tejidos para mejorar el tacto y la apariencia.
[0165] Las p-glucosidasas inventivas pueden utilizarse en una variedad de aplicaciones diferentes. Por ejemplo, la p-glucosidasa puede anadirse a las uvas durante la produccion del vino para mejorar el aroma potencial del producto de vino acabado. Otra aplicacion adicional puede ser la utilizacion de la p-glucosidasa en la fruta para mejorar el aroma de la misma. De manera alternativa, el producto de fermentacion recombinante aislado que contiene la p-glucosidasa mejorada puede utilizarse directamente en los aditivos alimenticios o en la elaboracion del vino para mejorar el sabor o el aroma.
[0166] Puesto que la velocidad de hidrolisis de los productos celulosicos se puede aumentar utilizando un transformante que tenga al menos una copia adicional del gen bgl6 insertado en el genoma, los productos que contienen celulosa o heteroglicanos se pueden degradar a un ritmo mas rapido y en mayor medida. Los productos fabricados con celulosa, tales como papel, algodon, panales de celulosa, y similares se pueden degradar de manera mas eficiente en un vertedero. De esta manera, el producto de la fermentacion obtenible de los transformantes o los transformantes solos se pueden utilizar en composiciones para ayudar a degradar mediante licuefaccion una variedad de productos de celulosa que se anaden a los vertederos llenos.
[0167] La sacarificacion y fermentacion por separado es un proceso por el que la celulosa presente en la biomasa, por ejemplo, rastrojos de maiz, se convierte en glucosa y, posteriormente, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol. La sacarificacion y fermentacion simultanea es un proceso por el que la celulosa presente en la biomasa, por ejemplo, rastrojos de maiz, se convierte en glucosa y, al mismo tiempo y en el mismo reactor, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol. De esta manera, en otro enfoque preferido, la celulasa de tipo glucosidasa de la invencion resulta util en la degradacion de la biomasa en etanol. La produccion de etanol a partir de las fuentes de celulosa facilmente disponibles proporciona una fuente de combustible renovable estable.
[0168] Las materias primas a base de celulosa se componen de residuos agricolas, pastos y maderas y otra biomasa de bajo valor, tal como residuos municipales (por ejemplo, papel reciclado, hierba cortada, etc.). El etanol se puede producir a partir de la fermentacion de cualquiera de estas materias primas celulosicas. Sin embargo, la celulosa debe convertirse primero en azucares antes de que pueda haber una conversion en etanol.
[0169] Se puede utilizar una gran variedad de materias primas con la p-glucosidasa inventiva y la seleccionada para utilizarse puede depender de la region en la que se realiza la conversion. Por ejemplo, en el medio oeste de Estados Unidos pueden predominar residuos agricolas tales como paja de trigo, rastrojo de maiz y bagazo, mientras que en California puede predominar la paja de arroz. Sin embargo, debe entenderse que cualquier biomasa celulosica disponible puede utilizarse en cualquier region.
[0170] Una composicion de celulasa que contiene una cantidad mejorada de p-glucosidasa resulta util en la produccion de etanol. El etanol de este proceso tambien se puede utilizar como un potenciador de octanaje o directamente como combustible en lugar de la gasolina, lo cual es ventajoso puesto que el etanol como fuente de combustible es mas ecologico que los productos derivados del petroleo. Se sabe que la utilizacion de etanol mejorara la calidad del aire y posiblemente reducira los niveles locales de ozono y el esmog. Ademas, la utilizacion de etanol en lugar de gasolina puede ser de importancia estrategica en la amortiguacion del impacto de los cambios repentinos en la energia no renovable y los suministros petroquimicos.
[0171] El etanol se puede producir a traves de procesos de sacarificacion y fermentacion a partir de biomasa celulosica tal como arboles, plantas herbaceas, residuos solidos municipales y residuos agricolas y forestales. Sin embargo, un problema importante encontrado en este proceso es la falta de p-glucosidasa en el sistema para convertir celobiosa en glucosa. Se sabe que la celobiosa actua como un inhibidor de celobiohidrolasas y endoglucanasas y, de esta manera, reduce el indice de hidrolisis para todo el sistema de celulasas. Por lo tanto, la utilizacion de actividad de p-glucosidasa aumentada para la conversion rapida de celobiosa en glucosa mejoraria considerablemente la produccion de etanol.
[0172] De esta manera, la p-glucosidasa inventiva resulta util en la hidrolisis de celulosa en sus componentes de azucar. En un modo de realizacion, se anade la p-glucosidasa a la biomasa antes de la adicion de un organismo
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fermentador. En un segundo modo de realizacion, se anade la p-glucosidasa a la biomasa al mismo tiempo que un organismo fermentador. De manera opcional, puede haber otros componentes de celulasa presentes en cualquier modo de realizacion.
[0173] En otro modo de realizacion, la materia prima celulosica se puede pretratar. El pretratamiento puede ser mediante temperatura elevada y la adicion de acido diluido, acido concentrado o una solucion de alcali diluido. La solucion de pretratamiento se anade durante un tiempo suficiente para hidrolizar al menos parcialmente los componentes de la hemicelulosa y despues neutralizarlos.
[0174] En un enfoque alternativo, se prefiere una composicion de celulasa que no contiene o es deficiente en p- glucosidasa. La delecion del gen de p-glucosidasa seria particularmente util en la preparacion de composiciones de celulasa para su utilizacion en detergentes. De manera adicional, tales composiciones son utiles para la produccion de celobiosa y otros celooligosacaridos. La delecion del gen de bgl6 de las cepas de T. reesei seria particularmente util en la preparacion de composiciones de celulasa para su utilizacion en los detergentes y en el aislamiento de celobiosa. Las enzimas de celulasa se han utilizado en una variedad de composiciones detergentes para limpiar ropa de manera enzimatica. Sin embargo, en esta tecnica se sabe que la utilizacion de enzimas de celulasa puede impartir degradacion de las fibras de celulosa en la ropa. Una posibilidad para reducir el efecto de degradacion es producir un detergente que no contenga p-glucosidasa. De esta manera, la delecion de esta proteina haria que el sistema de celulasa inhibiera los otros componentes mediante acumulacion de celobiosa. Los microorganismos modificados son particularmente adecuados para la preparacion de tales composiciones porque el gen de bgl6 puede delecionarse dejando los componentes de EG y CBH restantes dando lugar a una limpieza mejorada y beneficios suavizantes en la composicion sin efectos degradativos.
[0175] Las composiciones detergentes pueden emplear, ademas de la composicion de celulasas (independientemente del contenido de p-glucosidasa, es decir sin p-glucosidasa, sustancialmente sin p- glucosidasa, o p-glucosidasa mejorada), un surfactante, incluyendo surfactantes anionicos, no ionicos y anfoliticos, una hidrolasa, agentes mejoradores, agentes blanqueadores, agentes azulantes y tintes fluorescentes, inhibidores del apelmazamiento, solubilizantes, surfactantes cationicos y similares. Todos estos componentes se conocen en la tecnica de los detergentes. La composicion de celulasa como se describe anteriormente puede anadirse a la composicion detergente ya sea en un diluyente liquido, en granulos, en emulsiones, en geles, en pastas y similares. El experto en la materia conoce bien dichas formas. Cuando se emplea una composicion detergente solida, la composicion de celulasas se formula preferiblemente en forma de granulos. Preferiblemente, los granulos se pueden formular de manera que contengan un agente protector de celulasa. Para una exposicion mas completa, vease la patente estadounidense numero 6 162 782 titulada "Detergent compositions containing cellulase compositions deficient in CBH I type components.".
[0176] En otro modo de realizacion adicional, las composiciones detergentes tambien pueden contener niveles mejorados de beta-glucosidasa o beta-glucosidasa alterada. En este sentido, depende realmente del tipo de producto que se desea utilizar en las composiciones detergentes para proporcionar el efecto apropiado.
[0177] Preferiblemente, las composiciones de celulasas se emplean desde aproximadamente 0,00005 por ciento en peso hasta aproximadamente 5 por ciento en peso en relacion con la composicion detergente total. Mas preferiblemente, las composiciones de celulasas se emplean desde aproximadamente 0,0002 por ciento en peso hasta aproximadamente 2 por ciento en peso en relacion con la composicion detergente total.
[0178] La delecion del gen de bgl6 tambien proporcionaria la acumulacion de celobiosa en el sistema de celulasa, que se puede purificar a partir de la misma. En este sentido, la presente exposicion presenta la posibilidad de aislar celobiosa a partir de microorganismos de una manera facil y efectiva.
[0179] Partes de la secuencia de acido nucleico de bgl6 que son capaces de union a celulosa se pueden utilizar para generar proteinas de superficie quimerica bacteriana, permitiendo la inmovilizacion de toda la celula sobre filtros de celulosa u otros soportes solidos fibrosos como se describe en Lehtio et al., 2001.
[0180] Ademas, la secuencia de acidos nucleicos de bgl6 resulta util en la identificacion y caracterizacion de secuencias de acido nucleico relacionadas. Varias tecnicas utiles para determinar (predecir o confirmar) la funcion de los genes o productos genicos relacionados incluyen, pero sin caracter limitativo, (A) analisis de ADN/ARN, tal como (1) sobreexpresion, expresion ectopica y expresion en otras especies; (2) bloqueo de genes (genetica inversa, bloqueo dirigido, silenciamiento genico inducido por virus (VIGS, por sus siglas en ingles, vease Baulcombe, 1999); (3) analisis del estado de metilacion del gen, especialmente las regiones reguladoras flanqueantes; y (4) hibridacion in situ; (B) analisis de producto genico, tal como (1) expresion de proteina recombinante; (2) produccion de antisueros, (3) inmunofocalizacion; (4) ensayos bioquimicos para actividad catalitica u otra actividad; (5) estado de fosforilacion; y (6) interaccion con otras proteinas a traves de analisis de dos hibridos de levadura; (C) analisis de sistema, tal como la colocacion de un gen o producto genico en el interior de un sistema bioquimico o de transduccion de senales concreto basado en su fenotipo de sobreexpresion o mediante homologia de secuencia con genes relacionados; y (D) otros analisis que tambien pueden llevarse a cabo para determinar o confirmar la participacion del gen aislado y su producto en un sistema metabolico o de transduccion de senales concreto, y ayudar a determinar la funcion del gen.
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[0181] Las endoglucanasas y las beta-glucosidasas pueden ser responsables de la produccion de disacaridos, tales como soforosa, a partir de celooligosacaridos y glucosa mediante reacciones de transglicosilacion. Se sabe que la soforosa es un inductor de la expresion del gen de celulasa muy potente (Ilmen, M. et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306 y referencias en el mismo). De esta manera, las EG y las BGL pueden desempenar un papel importante en el proceso de induccion de la expresion del gen de celulasa. La sobreexpresion de ciertas EG o BGL en una cepa fungica puede llevar a una mayor productividad total de celulasa por esa cepa.
A. Homoloai'a con secuencias conocidas
[0182] La funcion de una secuencia de acido nucleico que codifica BGL6 relacionada puede determinarse mediante homologia con genes conocidos que tienen una funcion particular. Por ejemplo, una comparacion de la secuencia de codificacion de una molecula de acido nucleico identificada con bases de datos de secuencias de acidos nucleicos publicas se utiliza para confirmar la funcion por homologia con genes conocidos o por extension de la secuencia de acido nucleico identificada.
[0183] El termino “% de homologia” se utiliza de manera indistinta en el presente documento con el termino “% de identidad” en el presente documento y se refiere al nivel de identidad de secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos entre la secuencia de acidos nucleicos que codifica BGL6 o la secuencia de aminoacidos de BGL6, cuando se alinean utilizando un programa de alineamiento de secuencias.
[0184] Por ejemplo, como se utiliza en el presente documento, un 80 % de homologia significa lo mismo que un 80 % de identidad de secuencia determinado por un algoritmo definido y, por consiguiente, un homologo de una secuencia dada tiene mas de un 80 % de identidad de secuencia en una longitud de la secuencia dada. Niveles de identidad de secuencia de ejemplo incluyen, pero sin caracter limitativo, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o mas de identidad de secuencia con una secuencia dada, por ejemplo, la secuencia codificante para bgl6, como se describe en el presente documento.
[0185] Los programas informaticos de ejemplo que pueden utilizarse para determina la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin caracter limitativo, la serie de programas BLAST, p. ej., BLASTN, BLASTX, y TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, a disposicion del publico en Internet en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Vease tambien Altschul, et al., 1990 y Altschul, et al., 1997.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Vease tambien Altschul, et al., 1990 y Altschul, et al., 1997.
[0186] Las busquedas de secuencias se llevan a cabo normalmente utilizando el programa BLASTN cuando se evalua una secuencia de acido nucleico dada en relacion con secuencias de acido nucleico de las secuencias de ADN de GenBank y otras bases de datos publicas. Se prefiere el programa BLASTX para buscar secuencias de acidos nucleicos que se han traducido en todos los marcos de lectura frente a las secuencias de aminoacidos de las secuencias de proteinas de GenBank y otras bases de datos publicas. Tanto BLASTN como BLASTX funcionan utilizando parametros por defecto de una penalizacion por hueco abierto 11.0 y una penalizacion por hueco extendido de 1.0 y utilizan la matriz BLOSUM-62. (Vease, p.ej., Altschul, et al., 1997.)
[0187] Un alineamiento preferido de secuencias seleccionadas con el fin de determinar el “% de identidad” entre dos o mas secuencias se lleva a cabo utilizando, por ejemplo, el programa CLUSTAL-W en MacVector version 6.5, que funciona con parametros por defecto, incluyendo una penalizacion por hueco abierto de 10.0, una penalizacion por hueco extendido de 0.1 y una matriz de similitud BLOSUM 30.
[0188] En un enfoque de ejemplo, la extension de la secuencia de un acido nucleico que codifica bgl6 puede llevarse a cabo utilizando procedimientos de extension de cebador convencionales como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores de bgl6 e intermediarios de procesamiento de ARNm que puede que no se hayan transcrito de manera inversa en ADNc y/o para identificar ORF que codifican una proteina completa.
[0189] Otro aspecto adicional incluye la secuencia de nucleotidos completa o parcial de la secuencia de acidos nucleicos de bgl6 para utilizarse como una sonda. Dicha sonda puede utilizarse para identificar y clonar secuencias de acidos nucleicos homologas a partir de organismos relacionados.
[0190] El rastreo de una genoteca genomica o de ADNc con la sonda seleccionada puede llevarse a cabo utilizando procedimientos estandar tales como los descritos en Sambrook et al., (1989). Las condiciones de hibridacion, incluyendo la restriccion moderada y la restriccion alta, se proporcionan en Sambrook, et al., supra.
[0191] Las sondas o partes de las mismas tambien se pueden emplear en tecnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para la identificacion de secuencias de bgl6 estrechamente relacionadas. Cuando las secuencias de bgl6 se destinan a la utilizacion como sondas, se puede utilizar una parte concreta de una secuencia de codificacion de BGL6, por ejemplo, una parte altamente conservada de la secuencia de codificacion.
[0192] Por ejemplo, se puede utilizar una secuencia de nucleotidos de bgl6 como sonda de hibridacion para una genoteca de ADNc con el fin de aislar genes, por ejemplo, los que codifican las variantes de BGL6 de origen
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natural a partir de otras especies fungicas, bacterianas o vegetales, que tienen un nivel deseado de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de bgl6 descrita en la Figura 1 (SEQ ID NO:1). Las sondas de ejemplo tienen una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 bases.
B. Analisis de dos hibridos
[0193] Las proteinas identificadas pueden utilizarse en el sistema de dos hibridos de levadura para “capturar” proteinas de union a proteinas que son supuestas proteinas de sistema de transduccion de senales. El sistema de dos hibridos de levadura se describe en Fields y Song, Nature 340:245-246 (1989). En resumen, en un sistema de dos hibridos, una fusion de un dominio de union al ADN-bg/6 (p.ej., fusion de GAL4-bg/6) se construye y se transfecta en celulas de levadura. Puede utilizarse el gen bgl6 entero, o subregiones del gen bgl6. Se cotransfecta un segundo constructo que contiene la genoteca de ligandos potenciales fusionados al dominio de activacion del ADN. Los cotransformantes de levadura que albergan proteinas que se unen a la proteina BGL6 se identifican mediante, por ejemplo, produccion de beta-galactosidasa o luciferasa (un muestreo), o supervivencia en placas que carecen de un nutriente esencial (una seleccion), segun proceda para los vectores utilizados.
C. Analisis de micromatrices
[0194] Ademas, los analisis de micromatrices, tambien conocidos como perfiles de expresion o perfiles de transcripcion, pueden utilizarse para evaluar de manera simultanea la presencia o expresion de secuencias de ADN dadas, o cambios en la expresion de muchos genes diferentes. En un enfoque, un gran conjunto de secuencias de ADN (sondas), normalmente un conjunto amplio de marcadores de secuencia expresada, ADNc, fragmentos de ADNc u oligonucleotidos de secuencia especifica, se dispone en un soporte solido tal como un portaobjetos o una membrana de nailon. El objetivo marcado para la hibridacion en las sondas se genera aislando ARNm de tejidos inducidos y de control, marcando entonces cada grupo de ARNm directamente o mediante un intermediario de ADNc o ARNc, con un marcador distinto, normalmente un tinte fluorescente. La micromatriz se hibrida con las sondas de compuestos y la intensidad de la senal de hibridacion relativa asociada a cada localizacion en la matriz puede cuantificarse para cada tinte marcador. Las diferencias de expresion entre los estados inducidos y de control pueden medirse como una relacion de la senal de los dos tintes marcadores. (Vease Baldwin, D et al., 1999.)
[0195] El analisis de micromatrices del organismo fuente del que se derivo la bgl6 puede llevarse a cabo para facilitar la comprension de la funcion del gen identificando otros genes que se regulan de manera coordinada como consecuencia de la sobreexpresion de la bgl6. La identidad de los genes regulados coordinados puede ayudar a colocar el gen de bgl6 en un sistema concreto. De manera alternativa, dicho analisis puede utilizarse para identificar otros genes involucrados en el mismo sistema utilizando analisis de micromatrices.
[0196] Aunque la invencion se ha descrito con referencia a modos de realizacion y metodos especificos, se entendera que pueden realizarse varios cambios y modificaciones sin alejarse de la invencion como se define en las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLO 1
[0197] En un enfoque de ejemplo, un fragmento de ADNc para su utilizacion como una sonda se aisla extrayendo el ARN total de los micelios de una cepa de T. reesei que ha crecido en condiciones que se sabe que inducen la produccion de celulasa y la obtencion de la fraccion poliadenilada (polyA) del mismo. El ARN poliA se utiliza para producir un grupo de ADNc que se amplifica entonces utilizando cebadores especificos basados en la secuencia de acido nucleico de bgl6 proporcionada en el presente documento.
[0198] El ARN total se aisla de los micelios utilizando metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo como se describe en Timberlake et al., 1981; Maniatis, et al., 1989; Ausubel, et al., 1993 y Sambrook et al., 1989. Una vez aislado, se realizan las transferencias Northern para confirmar la expresion de celulasa y seleccionar un tiempo de induccion optimo para la expresion de la celulasa y el correspondiente aislamiento del ARN.
[0199] El ARN mensajero (ARNm), que tienen una cola de poli (A) en el extremo 3’, puede purificarse del ARN total utilizando metodos conocidos en la tecnica.
[0200] El ARN de T. reesei se utiliza como modelo para la RT-PCR utilizando metodos conocidos en la tecnica (Loftus, J. et al., Science, 249:915-918, 1990). Durante este procedimiento, el ARNm se transcribe de manera inversa para producir la primera cadena de ADNc. Posteriormente, el ADNc sirve como modelo para la amplificacion de la PCR de las secuencias de ADNc de bgl6 utilizando cebadores de oligonucleotidos especificos disenados de conformidad con la SEQ ID No. 1 o la SEQ ID No. 3.
- Tabla 1. Secuencias DroDorcionadas
- Descripcion
- SEQ. ID NO.
- secuencia de acidos nucleicos de ADN de bgl6 completa
- 1
- GATCACACCCCTCCCACCCTTCTCTTTTCAAGGTTGTCCCCTTCTCCCACGG CTTTATGTACTTCCCACTCTMTAATTeGCTCrTTCCATTCCAAGCCAAGCAA CATCTGTGAGCAGCTCATCCTTCCCAATATGGGCGAATGGCAGGAGCAGAT GATGGGTTTTGACGTGGAGGATGTTCTGTCTCAGCTGAGCCAAAATGAGAA GATTGCTCTCTTGTCCGGCATTGATTTCTGGCATACTTATCCCATACCAAAG TACAACGTCCCTTCAGTCCGCCTAACGGACGGTCCTAACGGCATACGAGGC ACAAAGTTTTTTGCTGGCATTCCTGCTGCCTGCCTGCCATGTGGGACGGCC CTGGCCTCTACCTGGGATAAGCAGCTGCTGAAGAAGGCTGGGAAGCTGCT iXjG A GA x uAu i oCA i CGxJaAAaGuuuiaXA^ i uC x Guo i uuu<-cwAAwAA TCAATACTCCCCGATCTCCTCTGGGGGGGCGCGGCrrCGAGTCATTTTCGG AAGATCCGTACCTGTCCGGCATCCTTGCTGCATCTATGATTCTCGGCTGTG AAAGCACAGGTGTCATCTCTGCCGTCAAACACnTGTCGCCAACGACCAGG AGCACGAGCGGCGAGCGGTCGACTGTCTCATCACCCAGCGGGCTCTCCGG GAGGTCTATCTGCGACCCTTCCAGATCGTAGCCCGAGATGCAAGGCCCGGC GCATTGATGACATCCTACAACAAGGTCAATGGCAAGCACGTCGCTGACAG CGCCGAGTTCCTTCAGGGCATTCTCCGGACTGAGTGGAATTGGGATCCTCT CATTGTCAGCGACTGGTACGGCACCTACACCACTATTGATGCCATCAAAGC CGGCCTTGATCTCGAGATGCCGGGCGTTTCACGATATCGCGGCAAATACAT CGAGTCTGCTCTGCAGGCCCGTTTGCTGAAGCAGTCCACTATCGATGAGCG CGCTCGCCGCGTGCTCAGGTTCGCCCAGAAGGCCAGCCATCTCAAGGTCTC CGAGGTAGAGCAAGGCCGTGACTTCCCAGAGGATCGCGTCCTCAACCGTC AGATCTGCGGCAGCAGCATTGTCCTACTGAAGAATGAGAACTCCATCTTAC CTCTCCCCAAGTCCGTCAAGAAGGTCGCCCTTGTTGGATCCCACGTGCGTC TACCGGCTATCTCGGGAGGAGGCAGCGCCTCTCTTGTCCCTTACTATGCCA TATCTCTATACGATGCCGTCTCTGAGGTACTAGCCGGTGCCACGATCACGC
- Descripcion
- SEQ. ID NO.
- ACGAGGTCGGTGCCTATGCCCACCAAATGCTGCCCGTCATCGACGCAATGA TCAGCAACGCCGTAATCCACTTCTACAACGACCCCATCGATGTCAAAGACA GAAAGCTCCTTGGCAGTGAGAACGTATCGTCGACATCGTTCCAGCTCATGG ATTACAACAACATCCCAACGCTCAACAAGGCCATGTTCTGGGGTACTCTCG TGGGCGAGTTTATCCCTACCGCCACGGGAATTTGGGAATTTGGCCTCAGTG TCTTTGGCACTGCCGACCTTTATATTGATAATGAGCTCGTGATTGAAAATA CAACACATCAGACGCGTGGTACCGCCTTTTTCGGAAAGGGAACGACGGAA AAAGTCGCTACCAGGAGGATGGTGGCCGGCAGCACCTACAAGCTGCGTCT CGAGTTTGGGTCTGCCAACACGACCAAGATGGAGACGACCGGTGTTGTCA ACTTTGGCGGCGGTGCCGTACACCTGGGTGCCTGTCTCAAGGTCGACCCAC AGGAGATGATTGCGCGGGCCGTCAAGGCCGCAGCCGATGCCGACTACACC ATCATCTGCACGGGACTCAGCGGCGAGTGGGAGTCTGAGGGTTTTGACCG GCCTCACATGGACCTGCCCCCTGGTGTGGACACCATGATCTCGCAAGTTCT TGACGCCGCTCCCAATGCTGTAGTCGTCAACCAGTCAGGCACCCCAGTGAC AATGAGCTGGGCTCATAAAGCAAAGGCCATTGTGCAGGCTTGGTATGGTG GTAACGAGACAGGCCACGGAATCTCCGATGTGCTCTTTGGCAACGTCAACC CGTCGGGGAAACTCTCCCTATCGTGGCCAGTCGATGTGAAGCACAACCCA GCATATCTCAACTACGCCAGCGTTGGTGGACGGGTCTTGTATGGCGAGGAT GTTTACGTTGGCTACAAGTTCTACGACAAAACGGAGAGGGAGGTTCTGTTT CCTTTTGGGCATGGCCTGTCTTACGCTACCTTCAAGCTCCCAGATTCTACCG TGAGGACGGTCCCCGAAACCTTCCACCCGGACCAGCCCACAGTAGCCATT GTCAAGATCAAGAACACGAGCAGTGTCCCGGGCGCCCAGGTCCTGCAGCT ATACATTTCGGCCCCAAACTCGCCTACACATCGCCCGGTCAAGGAGCTGCA CGGATTCGAAAAGGTGTATCTTGAAGCTGGCGAGGAGAAGGAGGTACAAA TACCCATTGACCAGTACGCTACTAGCTTCTGGGACGAGATTGAGAGCATGT GGAAGAGCGAGAGGGGCATTTATGATGTGCTTGTAGGATTCTCGAGTCAG GAAATCTCGGGCAAGGGGAAGCTGATTGTGCCTGAAACGCGATTCTGGAT GGGGCTGTAGATTCAACACGTGAGGAAAAGCGATTGCGGAAAGTACCAGA AAAGCCAAGGGAGTCAAAGGATGGGAACTTGTGTCAATAGAAGATATGCA TAGATGGGCATTCTGGGATGGTGGTTTGGCATTAATGCAAAGAAGACAAA G ATGGATGTGAT A A A AAAAAA A A A AAAAAAA
- Secuencia de aminoacidos prevista de BGL6
- 2
- MGEWQEQMMGFDVEDVLSQLSQNEKIALLSGIDFWHTYPIPKYNVPSVRLTD GPNGIRGTKFFAGIPAACLPCGTALASTWDKQLLKKAGKLLGDECIAKGAHC WLGPTINTPRSPLGGRGFESFSEDPYLSGILAASMILGCESTGVISAVKHFVAND QEHERRAVDCLITQRALREVYLRPFQIVARDARPGALMTSYNKVNGKHVADS AEFLQGILRTEWNWDPLIVSDWYGTYTTIDAIKAGLDLEMPGVSRYRGKYIES ALQARLLKQSTIDERARRVLRFAQKASHLKVSEVEQGRDFPEDRVLNRQICGS SIVLLKNENSILPLPKSVKKVALVGSHVRLPAISGGGSASLVPYYAISLYDAVSE VLAG ATITHEV GAY AHQMLP VID AMISNAVIHF YNDPIDVKDRKLLGSENVS S TSFQLMDYKNIPTLNKAMFWGTLVGEFIPTATGIWEFGLSVFGTADLYIDNEL VIENTTHQTRGTAFFGKGTTEKVATRRMVAGSTYKLRLEFGSANTTKMETTG WNFGGGAVHLGACLKVDPQEMIARAVKAAADADYTnCTGLSGEWESEGFD RPHMDLPPGVDTMISQVLDAAPNAVWNQSGTPVTMSWAHKAKAIVQAWY GGNETGHGISDVLFGNVNPSGKLSLSWPVDVKHNPAYLNYASVGGRVLYGE DVYV G YKFYDKTEREVLFPF GHGLS YATFKLPDSTVRT VPETFHPDQPTVAIV kikntssvpgaovlqlyisapnspthrpvkelhgfekvyleageekevoipido YATSFWDEIESMWKSERGIYDVLVGFSSQEISGKGKLIVPETRFWMGL
- Descripcion
- SEQ. ID NO.
- Secuencia de aminoacidos prevista de BGL6 con inicio alternative MMGFDVEDVLSQLSQNEKIALLSGIDFWHTYPIPKYNVPSVRLTDGPNGIRGT KFFAGIPAACLPCGTALASTWDKQLLKKAGKLLGDECIAKGAHCWLGPTINTP RSPLGGRGFESFSEDPYLSGILAASMILGCESTGVISAVKHFVANDQEHERRAV DCLITQRALREVYLRPFQIVARDARPGALMTSYNKVNGKHVADSAEFLQGILR TEWNWDPLIVSDWYGTYTTIDAIKAGLDLEMPGVSRYRGKYIESALQARLLK QSTIDERARRVLRFAQKASHLKV SEVEQGRDFPEDRVLNRQICGS SIVLLKNEN SILPLPKSVKKVALVGSHVRLPAISGGGSASLVPYYAISLYDAVSEVLAGATIT HEVGAYAHQMLPVIDAMISNAVIHFYNDPIDVKDRKLLGSENVSSTSFQLMDY NNIPTLNKAMFWGTLVGEFIPTATGIWEFGLSVFGTADLYIDNELVIENTTHQT RGTAFFGKGTTEKVATRRMVAGSTYKLRLEFGSANTTKMETTGWNFGGGA VHLGACLKVDPQEMIARAVKAAADADYTIICTGLSGEWESEGFDRPHMDLPP GVDTMISQVLDAAPNAVWNQSGTPVTMSWAHKAKAIVQAWYGGNETGHG ISDVLFGNVNPSGKLSLSWPVDVKHNPAYLNYASVGGRVLYGEDVYVGYKF YDKTEREVLFPFGHGLSYATFKLPDSTVRTVPETFHPDQPTVAIVKIKNTSSVP GAQVLQLYISAPNSPTHRPVKELHGFEKVYLEAGEEKEVQIPIDQYATSFWDEI ESMWKSERGIYDVLVGFSSQEISGKGKXIVPETRFWMGL
- 4
- Secuencia codificante de acido nucleico de bgl6
- 3
- ATGGGCGAATGGCAGGAGCAGATGATGGGTTTTGACGTGGAGGATGTTCT GTCTCAGCTGAGCCAAAATGAGAAGATTGCTCTCTTGTCCGGCATTGATTT CTGGCATACTTATCCCATACCAAAGTACAACGTCCCTTCAGTCCGCCTAAC GGACGGTCCTAACGGCATACGAGGCACAAAGTTTTTTGCTGGCATTCCTGC TGCCTGCCTGCCATGTGGGACGGCCCTGGCCTCTACCTGGGATAAGCAGCT GCTGAAGAAGGCTGGGAAGCTGCTCGGTGATGAGTGCATCGCAAAAGGCG CCCACTGCTGGCTGGGCCCAACAATCAATACTCCCCGATCTCCTCTGGGGG GGCGCGGCTTCGAGTCATTTTCGGAAGATCCGTACCTGTCCGGCATCCTTG CTGCATCTATGATTCTCGGCTGTGAAAGCACAGGTGTCATCTCTGCCGTCA aacactttgtcgccaacgaccaggagcacgagcggcgagcggtcgactgt CTCATCACCCAGCGGGCTCTCCGGGAGGTCTATCTGCGACCCTTCCAGATC GTAGCCCGAGATGCAAGGCCCGGCGCATTGATGACATCCTACAACAAGGT CAATGGCAAGCACGTCGCTGACAGCGCCGAGTTCCTTCAGGGCATTCTCCG GACTGAGTGGAATTGGGATCCTCTCATTGTCAGCGACTGGTACGGCACCTA CACCACTATTGATGCCATCAAAGCCGGCCTTGATCTCGAGATGCCGGGCGT TTCACGATATCGCGGCAAATACATCGAGTCTGCTCTGCAGGCCCGTTTGCT GAAGCAGTCCACTATCGATGAGCGCGCTCGCCGCGTGCTCAGGTTCGCCCA GAAGGCCAGCCATCTCAAGGTCTCCGAGGTAGAGCAAGGCCGTGACTTCC CAGAGGATCGCGTCCTCAACCGTCAGATCTGCGGCAGCAGCATTGTCCTAC TGAAGAATGAGAACTCCATCTTACCTCTCCCCAAGTCCGTCAAGAAGGTCG CCCTTGTTGGATCCCACGTGCGTCTACCGGCTATCTCGGGAGGAGGCAGCG CCTCTCTTGTCCCTTACTATGCCATATCTCTATACGATGCCGTCTCTGAGGT ACTAGCCGGTGCCACGATCACGCACGAGGTCGGTGCCTATGCCCACCAAA TGCTGCCCGTCATCGACGCAATGATCAGCAACGCCGTAATCCACTTCTACA ACGACCCCATCGATGTCAAAGACAGAAAGCTCCTTGGCAGTGAGAACGTA TCGTCGACATCGTTCCAGCTCATGGATTACAACAACATCCCAACGCTCAAC AAGGCCATGTTCTGGGGTACTCTCGTGGGCGAGTTTATCCCTACCGCCACG GGAATTTGGGAATTTGGCCTCAGTGTCTTTGGCACTGCCGACCTTTATATTG ATAATGAGCTCGTGATTGAAAATACAACACATCAGACGCGTGGTACCGCC TTTTTCGGAAAGGGAACGACGGAAAAAGTCGCTACCAGGAGGATGGTGGC CGGCAGCACCTACAAGCTGCGTCTCGAGTTTGGGTCTGCCAACACGACCAA GATGGAGACGACCGGTGTTGTCAACTTTGGCGGCGGTGCCGTACACCTGG GTGCCTGTCTCAAGGTCGACCCACAGGAGATGATTGCGCGGGCCGTCAAG GCCGCAGCCGATGCCGACTACACCATCATCTGCACGGGACTCAGCGGCGA GTGGGAGTCTGAGGGTTTTGACCGGCCTCACATGGACCTGCCCCCTGGTGT GGACACCATGATCTCGCAAGTTCTTGACGCCGCTCCCAATGCTGTAGTCGT CAACCAGTCAGGCACCCCAGTGACAATGAGCTGGGCTCATAAAGCAAAGG CCATTGTGCAGGCTTGGTATGGTGGTAACGAGACAGGCCACGGAATCTCC GATGTGCTCTTTGGCAACGTCAACCCGTCGGGGAAACTCTCCCTATCGTGG CCAGTCGATGTGAAGCACAACCCAGCATATCTCAACTACGCCAGCGTTGGT GGACGGGTCTTGTATGGCGAGGATGTTTACGTTGGCTACAAGTTCTACGAC
- Descripcion
- SEQ. ID NO.
- AAAACGGAGAGGGAGGTTCTGTTTCCTTTTGGGCATGGCCTGTCTTACGCT ACCTTCAAGCTCCCAGATTCTACCGTGAGGACGGTCCCCGAAACCTTCCAC CCGGACCAGCCCACAGTAGCCATTGTCAAGATCAAGAACACGAGCAGTGT CCCGGGCGCCCAGGTCCTGCAGCTATACATTTCGGCCCCAAACTCGCCTAC ACATCGCCCGGTCAAGGAGCTGCACGGATTCGAAAAGGTGTATCTTGAAG CTGGCGAGGAGAAGGAGGTACAAATACCCATTGACCAGTACGCTACTAGC TTCTGGGACGAGATTGAGAGCATGTGGAAGAGCGAGAGGGGCATTTATGA TGTGCTTGTAGGATTCTCGAGTCAGGAAATCTCGGGCAAGGGGAAGCTGA TTGTGCCTGAAACGCGATTCTGGATGGGGCTGTAG
Claims (21)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Un polinucleotido aislado derivado de una fuente fungica, dicho polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una enzima que tiene actividad de p-glucosidasa donde dicho polinucleotido aislado se selecciona de entre el grupo consistente en:(a) una secuencia de acido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia polipeptido BGL6 que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia presentada como SEQ ID NO:2;(b) una secuencia de acido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia polipeptido BGL6 que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia presentada como SEQ ID NO:2;(c) una secuencia de acido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia polipeptido BGL6 que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia presentada como SEQ ID NO:2;(d) una secuencia de acido nucleico que codifica o es complementaria a una secuencia polipeptido BGL6 que tiene la secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2; y(e) una secuencia de acido nucleico presentada como SEQ ID NO:3 o el complemento de la misma.
- 2. Polinucleotido aislado de la reivindicacion 1, en el que el % de identidad se calcula utilizando el programa CLUSTAL-W en MacVector version 6.5, que funciona con parametros por defecto, que incluyen una penalizacion por hueco abierto de 10,0, una penalizacion por hueco extendido de 0,1 y una matriz de similitud BLOSUM 30.
- 3. Polinucleotido aislado de la reivindicacion 1, en el que dicho polinucleotido es una molecula de ARN.
- 4. Polinucleotido aislado de la reivindicacion 2 que codifica una enzima que tiene actividad de p-glucosidasa, en el que la enzima se deriva de una fuente de Trichoderma.
- 5. Polinucleotido aislado de la reivindicacion 3, en el que la enzima se deriva de Trichoderma reesei.
- 6. Constructo de expresion que incluye una secuencia de polinucleotidos (i) que codifica un polipeptido BGL6 que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2, o (ii) que es complementaria a una secuencia de nucleotidos que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2;
- 7. Vector que incluye el constructo de expresion de la reivindicacion 6.
- 8. Vector que comprende un polinucleotido aislado de la reivindicacion 1, operativamente unido a secuencias de control reconocidas por una celula huesped transformada con el vector.
- 9. Celula huesped transformada con el vector de la reivindicacion 7.
- 10. Celula huesped transformada con el vector de la reivindicacion 8.
- 11. Celula huesped de la reivindicacion 10, que es una celula procariota.
- 12. Celula huesped de la reivindicacion 10, que es una celula eucariota.
- 13. Celula huesped recombinante procariota que comprende un polinucleotido de la reivindicacion 1.
- 14. Polipeptido BGL6 aislado con la actividad biologica de una p-glucosidasa, que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en:(a) una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2;(b) una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2;(c) una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2;(d) una secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2; y(e) un fragmento aislado de la secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2 que tiene la actividad biologica de una p-glucosidasa.
- 15. Metodo para la produccion de un polipeptido BGL6 que tiene actividad de p-glucosidasa, que comprende:(a) la transformacion de manera estable de una celula huesped con un vector de expresion que comprende un polinucleotido como se define en la reivindicacion 1;(b) el cultivo de dicha celula huesped transformada en una condicion adecuada para que dicha celula huesped produzca dicha p-glucosidasa; yque codifica un de aminoacidosque codifica un de aminoacidosque codifica un de aminoacidosque codifica un51015202530(c) la recuperacion de dicha p-glucosidasa.
- 16. Metodo de la reivindicacion 15 en el que la celula huesped es un hongo filamentoso o una celula de levadura.
- 17. Oligonucleotido antisentido complementario a la secuencia codificante bgl6 de un ARN mensajero que codifica un polipeptido BGL6 que tiene la secuencia presentada como SEQ ID NO:2, en el que tras la exposicion a una celula huesped que produce p-glucosidasa, dicho oligonucleotido reduce o inhibe la produccion de p- glucosidasa por dicha celula huesped.
- 18. Oligonucleotido antisentido de la reivindicacion 17, en el que la celula huesped es un hongo filamentoso.
- 19. Composicion detergente, comprendiendo dicha composicion un polipeptido con la actividad biologica de una p-glucosidasa seleccionada de entre el grupo consistente en:(a) una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2;(b) una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2;(c) una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2;(d) una secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2;(e) un fragmento aislado de la secuencia de aminoacidos presentada como SEQ ID NO:2 que tiene la actividad biologica de una p-glucosidasa.
- 20. Metodo para la mejora de las caracteristicas de una masa de levadura o un producto horneado hecho a partir de dicha masa que consiste esencialmente en las etapas de:(a) mezclado de al menos aproximadamente 10 ppm de una BGL6 de conformidad con la reivindicacion 14 con los ingredientes de la masa para formar una mezcla de masa, y(b) horneado de dicha mezcla de masa para formar un producto horneado.
- 21. Metodo para la mejora de las caracteristicas de una masa de pan con levadura o de una masa de panecillo con levadura o de un pan con levadura o de un panecillo con levadura que consiste esencialmente en las etapas de:(a) mezclado de al menos aproximadamente 10 ppm de una BGL6 de conformidad con la reivindicacion 14 con los ingredientes de la masa de panecillo o de pan para formar una mezcla de masa;(b) formado o moldeado de la mezcla de masa;(c) fermentacion de la mezcla de masa, y(d) horneado de la mezcla de masa para formar pan o panecillos.
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