ES2601237T3 - Composiciones y métodos para realizar hibridaciones sin desnaturalización - Google Patents

Abstract

Método de hibridación de secuencias de ácido nucleico in situ en una muestra en un portaobjetos sin una etapa de desnaturalización y en un sistema automatizado que comprende: - proporcionar una primera secuencia de ácido nucleico, - proporcionar una segunda secuencia de ácido nucleico, - proporcionar una composición de hibridación que comprende una cantidad eficaz de al menos un disolvente aprótico polar, y - combinar las secuencias de ácido nucleico primera y segunda y la composición de hibridación en el sistema automatizado durante al menos un periodo de tiempo suficiente para hibridar las secuencias de ácido nucleico primera y segunda, en el que el disolvente aprótico polar no es dimetilsulfóxido (DMSO).

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y metodos para realizar hibridaciones sin desnaturalizacion

Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional estadounidense n.° 61/265.966, presentada el 2 de diciembre de 2009.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos para eliminar la etapa de desnaturalizacion de aplicaciones de hibridacion. En una realizacion, la presente invencion puede usarse para el examen molecular in vivo, in vitro e in situ de ADN y ARN. En particular, la invencion puede usarse para el examen molecular de ADN y ARN en los campos de citologfa, histoiogfa y biologfa molecular. En otras realizaciones, la presente invencion puede usarse para aplicaciones de hibridacion in situ (ISH).

Fondo y descripcion

Las moleculas de acido nucleico bicatenarias (es decir, ADN (acido desoxirribonucleico), ADN/ARN (acido ribonucleico) y ARN/ARN) se asocian en una configuracion helicoidal doble. Esta estructura de doble helice se estabiliza mediante puentes de hidrogeno entre bases en cadenas opuestas cuando las bases se aparean de una manera particular (A+T/U o G+C) y uniones hidrofobas entre bases apiladas. El apareamiento de bases complementarias (hibridacion) es fundamental para todos los procesos que implican acido nucleico.

En un ejemplo de hibridacion basico, se disenan cebadores o sondas de acido nucleico para unirse, o “hibridarse”, con un acido nucleico diana, por ejemplo, ADN o ARN en una muestra. Un tipo de aplicacion de hibridacion, hibridacion in situ (ISH), incluye hibridacion a una diana en una muestra en la que la muestra puede estar in vivo, in situ, o por ejemplo, fijada o adherida a un portaobjetos de vidrio. Las sondas pueden marcarse para hacer posible la identificacion del hnbrido sonda-diana mediante el uso de un microscopio/escaner de fluorescencia o campo brillante. Tales sondas marcadas pueden usarse, por ejemplo, para detectar anomalfas geneticas en una secuencia diana, proporcionando informacion valiosa sobre, por ejemplo, trastornos prenatales, cancer, y otras enfermedades geneticas o infecciosas.

Con el fin de que las sondas o los cebadores se unan al acido nucleico diana en la muestra, deben separarse las cadenas complementarias del acido nucleico. Esta etapa de separacion de cadenas, denominada “desnaturalizacion”, normalmente requiere condiciones agresivas para alterar los puentes de hidrogeno y las uniones hidrofobas en la doble helice. Una vez que se han separado las cadenas complementarias de acido nucleico, una etapa de “renaturalizacion” o “reapareamiento” permite que los cebadores o sondas se unan al acido nucleico diana en la muestra. Esta etapa tambien se denomina en ocasiones etapa de “hibridacion”.

Los experimentos de hibridacion tradicionales, tales como ensayos de ISH, usan altas temperaturas (por ejemplo, de 95°C a 100°C) y/o disoluciones que contienen formamida para desnaturalizar acido nucleico bicatenario. Sin embargo, estos metodos tienen inconvenientes significativos.

Por ejemplo, el calor puede destruir la estructura del propio acido nucleico porque los enlaces fosfodiester pueden romperse a altas temperaturas, lo que lleva a un conjunto de acidos nucleicos monocatenarios rotos. Ademas, el calor puede llevar a complicaciones cuando se usan pequenos volumenes, puesto que la evaporacion de los tampones acuosos es diffcil de controlar.

A menudo se usan disoluciones que contienen formamida para superar algunos de los problemas asociados con la desnaturalizacion por calor. La formamida rompe los pares de bases desplazando de forma flexible y uniforme las moleculas de hidrato unidas y produciendo la “formamidacion” de los sitios de union de Watson-Crick. Por tanto, la formamida tiene un efecto desestabilizante sobre los acidos nucleicos bicatenarios y analogos, permitiendo que se produzca desnaturalizacion a temperaturas inferiores. Sin embargo, aunque formamida disminuye la temperatura de fusion (Tm) del acido nucleico bicatenario, tambien prolonga significativamente el tiempo de renaturalizacion, en comparacion con disoluciones acuosas de desnaturalizacion sin formamida.

Ademas, la formamida tiene desventajas mas alla de un tiempo de procesamiento largo. La formamida es un material toxico, peligroso, sometido a estrictas normas para su uso y eliminacion. Ademas, el uso de una alta concentracion de formamida parece producir la destruccion morfologica de la estructura celular, nuclear y/o cromosomica.

Por tanto, existe la necesidad de superar los inconvenientes asociados con la etapa de desnaturalizacion de aplicaciones de hibridacion. Al abordar esta necesidad, la presente invencion proporciona varias posibles ventajas con respecto a las aplicaciones de hibridacion de la tecnica anterior, tales como tiempos de hibridacion mas rapidos, temperaturas de hibridacion inferiores y disolventes de hibridacion menos toxicos.

Sumario de la invencion

Un objeto de la presente invencion es proporcionar metodos que dan como resultado aplicaciones de hibridacion

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que tienen al menos una de las siguientes ventajas con respecto a las aplicaciones de hibridacion de la tecnica anterior: menor fondo, menor evaporacion de reactivo, conservacion de la morfologfa de la muestra, procedimiento mas sencillo, procedimiento mas rapido, automatizacion mas facil y reactivos mas seguros. La presente invencion logra estos objetivos eliminando la etapa de desnaturalizacion.

Por consiguiente, un aspecto de la invencion se refiere a un metodo de hibridacion de secuencias de acido nucleico in situ en una muestra en un portaobjetos sin una etapa de desnaturalizacion y en un sistema automatizado que comprende:

- proporcionar una primera secuencia de acido nucleico,

- proporcionar una segunda secuencia de acido nucleico,

- proporcionar una composicion de hibridacion que comprende una cantidad eficaz de al menos un disolvente aprotico polar, y

- combinar las secuencias de acido nucleico primera y segunda y la composicion de hibridacion en el sistema automatizado durante al menos un periodo de tiempo suficiente para hibridar las secuencias de acido nucleico primera y segunda,

en el que el disolvente aprotico polar no es dimetilsulfoxido (DMSO).

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un metodo de hibridacion de secuencias de acido nucleico in situ en una muestra en un portaobjetos sin una etapa de desnaturalizacion y en un sistema automatizado que comprende:

- proporcionar una primera secuencia de acido nucleico, y

- aplicar una composicion de hibridacion que comprende una segunda secuencia de acido nucleico y una cantidad eficaz de al menos un disolvente aprotico polar durante al menos un periodo de tiempo suficiente para hibridar las secuencias de acido nucleico primera y segunda,

en el que el disolvente aprotico polar no es dimetilsulfoxido (DMSO).

Los metodos de la invencion pueden aplicarse a cualquier tecnica de hibridacion. Los metodos de la invencion tambien pueden aplicase a cualquier sistema molecular que se hibride o se una usando apareamiento de bases, tal como, por ejemplo, ADN, ARN, ANP, ANB, y analogos sinteticos y naturales de los mismos.

El metodo de hibridacion de acidos nucleicos de la presente invencion puede usarse para el analisis in vivo o in vitro de ADN genomico, cromosomas, fragmentos cromosomicos, genes y aberraciones cromosomicas tales como translocaciones, deleciones, amplificaciones, inserciones, mutaciones o inversiones asociadas con un estado normal o una enfermedad. Ademas, los metodos son utiles para la deteccion de agentes infecciosos asf como de cambios en los niveles de expresion de ARN, por ejemplo, ARNm y su ADN complementario (ADNc).

Otros usos incluyen el analisis in vivo, in vitro o in situ de ARN mensajero (ARNm), ARN viral, ADN viral, ARN de interferencia pequeno (ARNip), ARN nuclear pequeno (ARNnp), ARN no codificante (ARNnc, por ejemplo, ARNt y ARNr), ARN de transferencia-mensajero (ARNtm), micro ARN (miARN), ARN de interaccion con piwi (ARNpi), ArN no codificante largo, ARN nucleolar pequeno (ARNnup), ARN antisentido, ARN bicatenario (ARNbc), metilaciones y otras modificaciones de bases, polimorfismos de un solo nucleotido (SNP), variaciones en el numero de copias (VNC) y acidos nucleicos marcados con, por ejemplo, radioisotopos, moleculas fluorescentes, biotina, digoxigenina (DIG) o antfgenos, solos o en combinacion con acidos nucleicos no marcados.

El metodo de hibridacion de acidos nucleicos de la presente invencion es util para analisis in vivo, in vitro o in situ de acidos nucleicos usando tecnicas tales como PCR, PCR in situ, transferencia de tipo Northern, transferencia de tipo Southern, citometrta de flujo, autorradiograffa, microscopfa de fluorescencia, quimioluminiscencia,

inmunohistoqmmica, cariotipo virtual, ensayo genetico, microalineamiento de ADN (por ejemplo, hibridacion genomica comparativa - alineamiento (CGH-alineamiento), perfil de expresion genetica, Gene ID, sondas tipo Tiling array, electroforesis en gel, electroforesis capilar, e hibridaciones in situ tales como FISH, SISH, CISH. En una realizacion, los metodos de la invencion son utiles para aplicaciones de hibridaciones de acidos nucleicos, con la condicion de que tales aplicaciones no incluyan amplificacion del acido nucleico tal como, por ejemplo, mediante PCR, PCR in situ, etc.

Los metodos de la invencion pueden usarse en muestras in vitro e in vivo tales como frotis de medula osea, frotis de sangre, preparaciones tisulares incluidas en parafina, muestras tisulares disociadas enzimaticamente, medula osea, amniocitos, preparaciones de citospina, huellas, etc.

La invencion proporciona metodos para hibridar al menos una molecula con una diana in situ en una muestra en un portaobjetos sin una etapa de desnaturalizacion y en un sistema automatizado. En determinadas realizaciones, el metodo de la invencion reduce significativamente los niveles de fondo sin necesidad de agentes de bloqueo, y sin

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necesidad de hibridacion durante la noche en tampones que contienen formamida. Por tanto, la invencion puede eliminar, por ejemplo, el uso de, o reducir la dependencia de formamida. Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente invencion supera el problema de toxicidad principal y la etapa de renaturalizacion prolongada asociada con el uso de ensayos de hibridacion tradicionales con formamida.

Una divulgacion de la solicitud es una composicion o disolucion para su uso en aplicaciones de hibridacion. Las composiciones para su uso segun esta divulgacion incluyen una composicion acuosa que comprende al menos una secuencia de acido nucleico y al menos un disolvente aprotico polar en una cantidad eficaz para desnaturalizar secuencias de nucleotidos bicatenarios. Una cantidad eficaz para desnaturalizar secuencias de nucleotidos bicatenarios es una cantidad que permite la hibridacion. Por ejemplo, una manera de someter a prueba si la cantidad de disolvente aprotico polar es eficaz para permitir la hibridacion es determinar si el disolvente aprotico polar, cuando se usa en las composiciones y los metodos de hibridacion descritos en el presente documento, tal como en el ejemplo 1, produce una senal detectable y/o un producto de acido nucleico amplificado.

Los ejemplos no limitativos de cantidades eficaces de disolventes aproticos polares incluyen, por ejemplo, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 95% (v/v). En algunas realizaciones, la concentracion de disolvente aprotico polar es del 5% al 60% (v/v). En otras realizaciones, la concentracion de disolvente aprotico polar es del 10% al 60% (v/v). Todavfa en otras realizaciones, la concentracion de disolvente aprotico polar es del 30% al 50% (v/v). Tambien son adecuadas concentraciones del 1% al 5%, del 5% al 10%, del 10%, del 10% al 20%, del 20% al 30%, del 30% al 40%, del 40% al 50% o del 50% al 60% (v/v). En algunas realizaciones, el disolvente aprotico polar estara presente a una concentracion del 0,1%, el 0,25%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4% o el 5% (v/v). En otras realizaciones, el disolvente aprotico polar estara presente a una concentracion del 7%, el 7,5%, el 8%, el 8,5%, el 9%, el 9,5%, el 10%, el 10,5%, el 11%, el 11,5%, el 12%, el 12,5%, el 13%, el 13,5%, el 14%, el 14,5%, el 15%, el 15,5%, el 16%, el 16,5%, el 17%, el 17,5%, el 18%, el 18,5%, el 19%, el 19,5% o el 20% (v/v).

La solicitud da a conocer la composicion acuosa que comprende un disolvente aprotico polar que tiene toxicidad reducida. Por ejemplo, una composicion menos toxica que las disoluciones tradicionales usadas en aplicaciones de hibridacion puede comprender una composicion con la condicion de que la composicion no contenga formamida, o con la condicion de que la composicion contenga menos del 50%, o menos del 25%, o menos del 10%, o menos del 5%, o menos del 2%, o menos del 1%, o menos del 0,5%, o menos del 0,1%, o menos del 0,05%, o menos del 0,01% de formamida. Una composicion menos toxica tambien puede comprender, en una divulgacion, una composicion con la condicion de que la composicion no contenga dimetilsulfoxido (DMSO), o con la condicion de que la composicion contenga menos del 10%, el 5%, el 2%, o menos del 1%, o menos del 0,5%, o menos del 0,1%, o menos del 0,05%, o menos del 0,01% de DMSO.

En una realizacion de la invencion, los disolventes aproticos polares adecuados para su uso en la invencion pueden seleccionarse basandose en sus parametros de solubilidad de Hansen. Por ejemplo, los disolventes aproticos polares adecuados pueden tener un parametro de solubilidad en dispersion de entre 17,7 y 22,0 MPa1/2, un parametro de solubilidad polar de entre 13 y 23 MPa1/2 y un parametro de solubilidad por puente de hidrogeno de entre 3 y 13 MPa1/2

Segun una realizacion de la presente invencion, los disolventes aproticos polares adecuados para su uso en la invencion son compuestos dclicos. Un compuesto crolico tiene una estructura de base dclica. Los ejemplos incluyen los compuestos dclicos dados a conocer en el presente documento. En otras realizaciones, el disolvente aprotico polar puede elegirse de las formulas 1-4 a continuacion:

Formula 1 Formula 2 Formula 3 Formula 4

imagen1

Segun otra realizacion de la invencion, los disolventes aproticos polares adecuados para su uso en la invencion pueden elegirse de la formula 5 a continuacion:

Formula 5

imagen2

donde X es opcional y si esta presente, se elige de O o S; donde Z es opcional y si esta presente, se elige de O o S;

donde A y B son independientemente O o N o S o parte del alquildiilo o una amina primaria; 5 donde R es alquildiilo; y donde Y es O o S o C.

En las formulas 6-9 a continuacion se facilitan ejemplos de disolventes aproticos polares adecuados segun la formula 5:

Formula 6

Formula 7

Formula 8 Formula 9

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imagen3

donde:

X no existe A, B y Z son O Y es C; y

R es etano-1,2-dnlo

donde:

Z y X son O;

A y B forman parte del alquildnlo;

Y es S; y

R es butano-1,4-dnlo;

donde:

X no existe;

A forma parte del alquildnlo;

Y es C;

B y Z son O; y R es propano-1,3-dnlo;

donde:

X no existe;

A forma parte del alquildiilo;

Y es C;

B es metilamina;

Z es O; y

R es propano-1,3-dnlo

Aun segun otra realizacion de la invencion, el disolvente aprotico polar tiene funcionalidad lactona, sulfona, nitrilo, sulfito o carbonato. Tales compuestos se distinguen por sus constantes dielectricas relativamente altas, altos momentos dipolares y solubilidad en agua.

Segun otra realizacion de la invencion, el disolvente aprotico polar que tiene funcionalidad lactona es y-butirolactona 15 (GBL), el disolvente aprotico polar que tiene funcionalidad sulfona es sulfolano (SL), el disolvente aprotico polar que tiene funcionalidad nitrilo es acetonitrilo (AN), el disolvente aprotico polar que tiene funcionalidad sulfito es sulfito de glicol/sulfito de etileno (GS) y el disolvente aprotico polar que tiene funcionalidad carbonato es carbonato de etileno (EC), carbonato de propileno (PC) o tiocarbonato de etileno (ETC). Aun en otro aspecto de la invencion, las composiciones y los metodos de la invencion comprenden un disolvente aprotico polar, con la condicion de que el 20 disolvente aprotico polar no sea acetonitrilo (AN) ni sulfolano (SL). En una realizacion, se proporciona una cantidad de energfa suficiente para hibridar los acidos nucleicos primero y segundo.

En una realizacion, la primera secuencia de acido nucleico esta en una muestra biologica. En otra realizacion, la muestra biologica es una muestra de citologfa o histolog^a.

En una realizacion, la primera secuencia de acido nucleico es una secuencia monocatenaria y la segunda secuencia 25 de acido nucleico es una secuencia bicatenaria. En otra realizacion, la primera secuencia de acido nucleico es una secuencia bicatenaria en una muestra biologica y la segunda secuencia de acido nucleico es una secuencia monocatenaria. Aun en otra realizacion, ambas secuencias de acido nucleico primera y segunda son bicatenarias. Aun en otra realizacion, ambas secuencias de acido nucleico primera y segunda son monocatenarias.

Un aspecto adicional de la invencion comprende un metodo en el que la etapa de proporcionar una cantidad de 30 energfa suficiente para desnaturalizar los acidos nucleicos implica una etapa de calentamiento realizada mediante el uso de microondas, banos calientes, placas calientes, hilo termico, elemento de Peltier, calentamiento por induccion o lamparas termicas.

Segun una divulgacion adicional de la solicitud, la invencion se refiere al uso de una composicion que comprende entre el 1 y el 95% (v/v) de al menos un disolvente aprotico polar en ensayos de hibridacion.

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Aun segun otra divulgacion de la solicitud, la invencion se refiere al uso de una composicion que comprende una composicion acuosa tal como se describe en el presente documento para su uso en ensayos de hibridacion.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 representa el transcurso de tiempo tipico para la deteccion de locus individual con sondas de FISH marcadas primarias en cortes tisulares incluidos en parafina fijadas con formaldehndo (muestras histologicas). Las barras representan un ensayo de hibridacion realizado usando una disolucion tradicional (parte superior) y el transcurso de tiempo tfpico para un ensayo de hibridacion realizado usando una composicion de la invencion (parte inferior). La primera barra a la izquierda en cada transcurso de tiempo representa la etapa de desparafinacion; la segunda barra representa la etapa de pretratamiento termico; la tercera barra representa la etapa de digestion; la cuarta barra representa las etapas de desnaturalizacion e hibridacion; la quinta barra representa la etapa de lavado en condiciones de rigurosidad; y la sexta barra representa la etapa de montaje.

La figura 2 representa el transcurso de tiempo tfpico para la deteccion de locus individual con sondas de FISH marcadas primarias en muestras citologicas. Las barras representan un ensayo de hibridacion realizado usando una disolucion tradicional (parte superior) y el transcurso de tiempo tfpico para un ensayo de hibridacion realizado usando una composicion de la invencion (parte inferior). La primera barra a la izquierda en cada transcurso de tiempo representa la etapa de fijacion; la segunda barra representa las etapas de desnaturalizacion e hibridacion; la tercera barra representa la etapa de lavado en condiciones de rigurosidad; y la cuarta barra representa la etapa de montaje.

Descripcion detallada

A. Definiciones

En el contexto de la presente invencion los siguientes terminos han de entenderse tal como sigue:

“Muestra biologica” ha de entenderse como cualquier muestra in vivo, in vitro o in situ de una o mas celulas o fragmentos de celula. Esta puede ser, por ejemplo, un organismo unicelular o multicelular, corte tisular, muestra citologica, extension cromosomica, secuencias de acido nucleico purificadas, secuencias de acido nucleico obtenidas artificialmente logradas, por ejemplo, mediante un sistema con base biologica o mediante smtesis qmmica, microalineamiento u otra forma de chip de acido nucleico. En una realizacion, una muestra es una muestra de mairnfero, tal como, por ejemplo, una muestra humana, murina, de rata, felina o canina.

“Acido nucleico”, “cadena de acido nucleico” y “secuencia de acido nucleico” significan cualquier elemento que se una o se hibride usando apareamiento de bases incluyendo oligomeros o polfmeros que tienen una estructura principal formada de analogos de nucleotidos y/o acido nucleico que se producen de manera natural que comprenden nucleobases no convencionales y/o estructuras principales no convencionales (por ejemplo, un acido nucleico peptfdico (ANP) o acido nucleico bloqueado (ANB)), o cualquier forma derivatizada de un acido nucleico.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “acido nucleico peptidico” o “ANP” significa un polfmero sintetico que tiene una estructura principal de poliamida con nucleobases colgantes (que se producen de manera natural y modificadas) incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de los segmentos de oligomero o polfmero a los que se hace referencia o se reivindican como acidos nucleicos peptfdicos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 5.539.082, 5.527.675, 5.623.049, 5.714.331, 5.718.262, 5.736.336, 5.773.571, 5.766.855, 5.786.461, 5.837.459, 5.891.625, 5.972.610, 5.986.053, 6.107.470, 6.201.103, 6.228.982 y 6.357.163, en el documento WO96/04000, o en cualquiera de las referencias citadas en los mismos. La nucleobase colgante, tal como, por ejemplo, una base de purina o pirimidina en el ANP puede conectarse a la estructura principal a traves de un ligador tal como, por ejemplo, uno de los ligadores ensenados en el documento PCT/US02/30573 o en cualquiera de las referencias citadas en el mismo. En una realizacion, el ANP tiene una estructura principal de N-(2-aminoetil)- glicina). Los ANP pueden sintetizarse (y opcionalmente marcarse) tal como se ensena en el documento PCT/US02/30573 o en cualquiera de las referencias citadas en el mismo. Los ANP se hibridan estrechamente, y con alta especificidad de secuencia, con ADN y ARN, puesto que la estructura principal del ANP no esta cargada. Por tanto, las sondas de ANP cortas pueden mostrar especificidad comparable con sondas de ADN o ARN mas largas. Las sondas de ANP tambien pueden mostrar mayor especificidad en la union a ADN o ARN complementario.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “acido nucleico bloqueado” o “ANB” significa un oligomero o polfmero que comprende al menos una o mas subunidades de ANB. Tal como se usa en el presente documento, el termino “subunidad de ANB” significa un ribonucleotido que contiene un puente de metileno que conecta el oxfgeno en 2' de la ribosa con el carbono en 4'. Vease en general, Kurreck, Eur. J. Biochem., 270:1628-44 (2003).

Los ejemplos de acidos nucleicos y analogos de acido nucleico tambien incluyen polfmeros de monomeros de nucleotidos, incluyendo desoxirribonucleotidos (ADN) mono y bicatenarios, ribonucleotidos (ARN), formas a- anomericas de los mismos, analogos sinteticos y naturales de los mismos y similares. La cadena de acido nucleico puede estar compuesta en su totalidad por desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, acidos nucleicos peptfdicos (ANP), acidos nucleicos bloqueados (ANB), analogos sinteticos o naturales de los mismos, o mezclas de los mismos. Puede usarse ADN, ARN u otros acidos nucleicos tal como se define en el presente documento en el

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metodo y las composiciones de la invencion.

“Disolvente aprotico polar” se refiere a un disolvente organico que tiene un momento dipolar de aproximadamente 2 unidades Debye o mas, una solubilidad en agua de al menos aproximadamente el 5% (volumen) a o cerca de temperature ambiente, es decir, aproximadamente a 20°C, y que no experimenta intercambio de hidrogeno significativo a aproximadamente pH neutro, es decir, en el intervalo de 5 a 9, o en el intervalo 6 a 8. Los disolventes aproticos polares incluyen los definidos segun los parametros de solubilidad de Hansen comentados a continuacion.

“Alquildnlo” se refiere a un radical hidrocarbonado de cadena lineal o dclico, ramificado, saturado o insaturado que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la retirada de un atomo de hidrogeno de cada uno de dos atomos de carbono diferentes de un alcano, alqueno o alquino original.

“Disolucion acuosa” ha de entenderse como una disolucion que contiene agua, incluso cantidades pequenas de agua. Por ejemplo, una disolucion que contiene un 1% agua ha de entenderse como una disolucion acuosa.

“Aplicacion de hibridacion”, “ensayo de hibridacion”, “experimento de hibridacion”, “procedimiento de hibridacion”, “tecnica de hibridacion”, “metodo de hibridacion”, etc. ha de entenderse que se refieren a cualquier procedimiento que implica hibridacion de acidos nucleicos. A menos que se especifique otra cosa, los terminos “hibridacion” y “etapa de hibridacion” ha de entenderse que se refieren a la etapa de reapareamiento del procedimiento de hibridacion asf como a la etapa de desnaturalizacion (si esta presente).

“Composicion de hibridacion” se refiere a una disolucion acuosa de la invencion para realizar un procedimiento de hibridacion, por ejemplo, para unir una sonda a una secuencia de acido nucleico. Las composiciones de hibridacion pueden comprender, por ejemplo, al menos un disolvente aprotico polar, al menos una secuencia de acido nucleico y una disolucion de hibridacion. Las composiciones de hibridacion no comprenden enzimas ni otros componentes, tales como desoxinucleosido trifosfatos (dNTP), para amplificar acidos nucleicos en una muestra biologica.

“Disolucion de hibridacion” se refiere a una disolucion acuosa para su uso en una composicion de hibridacion de la invencion. Las disoluciones de hibridacion se comentan en detalle a continuacion y pueden comprender, por ejemplo, agentes tamponantes, agentes acelerantes, agentes quelantes, sales, detergentes y agentes de bloqueo.

“Composicion de PCR” se refiere a una disolucion acuosa de la invencion para realizar un procedimiento de hibridacion para amplificar una secuencia de acido nucleico. Las composiciones de PCR pueden comprender, por ejemplo, al menos un disolvente aprotico polar, al menos una enzima para amplificar acidos nucleicos, un conjunto de cebadores de oligonucleotido de acido nucleico, una mezcla de dNTP y una disolucion de PCR.

“Disolucion de PCR” se refiere a una disolucion acuosa para su uso en una composicion de PCR de la invencion. Las disoluciones de PCR pueden comprender por ejemplo, agentes tamponantes, agentes acelerantes, agentes quelantes, sales y detergentes.

“Parametros de solubilidad de Hansen” y “HSP” se refieren a los siguientes parametros de energfa de cohesion (solubilidad): (1) el parametro de solubilidad en dispersion (8d, “parametro D”), que mide interacciones no polares derivadas de fuerzas atomicas; (2) el parametro de solubilidad polar (8p, “parametro P”), que mide interacciones de dipolo permanente-dipolo permanente; y (3) el parametro de solubilidad por puente de hidrogeno (8h, “parametro H”), que mide intercambio de electrones. Los parametros de solubilidad de Hansen se definen adicionalmente a continuacion.

“Secuencias repetitivas” ha de entenderse que se refieren a los componentes de reapareamiento rapido (aproximadamente el 25%) y/o de reapareamiento intermedio (aproximadamente el 30%) de genomas de mairnferos. Los componentes de reapareamiento rapido contienen secuencias altamente repetitivas pequenas (de algunos nucleotidos de longitud) encontradas habitualmente en tandem (por ejemplo, ADN satelite), mientras que los componentes de reapareamiento intermedio contienen ADN repetitivo intercalado. Las secuencias repetidas intercaladas se clasifican o bien como SINE (secuencias repetidas intercaladas cortas) o bien como LINE (secuencias repetidas intercaladas largas), clasificandose ambas como retrotransposones en primates. Las SINE y las LINE incluyen, pero no se limitan a, repeticiones de Alu, repeticiones de Kpn, repeticiones de dinucleotido, repeticiones de trinucleotido, repeticiones de tetranucleotido, repeticiones de pentanucleotido y repeticiones de hexanucleotido. Las repeticiones de Alu constituyen la mayoria de las SINE humanas y se caracterizan por una secuencia consenso de aproximadamente 280 a 300 pb que consiste en dos secuencias similares dispuestas como un dfmero de cabeza-cola. Ademas de las SINE y las LINE, tambien existen secuencias de repeticion en telomeros de cromosomas en los extremos terminales de los cromosomas y centromeros de cromosomas, que contienen distintas secuencias de repeticion que existen solo en la region central de un cromosoma. Sin embargo, a diferencia de las SINE y las LINE, que estan dispersas aleatoriamente por todo el genoma, las secuencias de repeticion de telomeros y centromeres se localizan dentro de una region determinada del cromosoma.

“No toxico” y “toxicidad reducida” se definen con respecto al etiquetado de toxicidad de la formamida segun la “Directiva 1999/45/CE del Parlamento Europeo y del Consejo de 31 de mayo de 1999 acerca de la aproximacion de las leyes, normativas y disposiciones administrativas de los estados miembros en relacion a la clasificacion, envasado y etiquetado de preparaciones peligrosas” (ecb.jrc.it/legislation/1999L0045EC.pdf) (“Directiva”). Segun la

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Directiva, la toxicidad se define usando el siguiente orden de clasificacion: T+ “muy toxico”; T “toxico”, C “corrosivo”, Xn “nocivo”, Xi “irritante.” Las frases de riesgo (“frases R”) describen los riesgos de la toxicidad clasificada. La formamida se enumera como T (toxica) y R61 (puede producir dano en el nino no nacido). Todos los productos qmmicos siguientes se clasifican como menos toxicos que la formamida: acetonitrilo (Xn, R11, R20, R21, R22, R36); sulfolano (Xn, R22); y-butirolactona (Xn, R22, R32); y carbonato de etileno (Xi, R36, R37, R38). En el momento de presentar esta solicitud, tritiocarbonato de etileno y sulfito de glicol no aparecen etiquetados en la actualidad.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos “desnaturalizacion a temperatura reducida” y “desnaturalizacion a baja temperatura” se refieren a desnaturalizaciones realizadas por debajo de aproximadamente 82°C.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos “temperatura ambiente” y “TA” se refieren a de aproximadamente 20°C a aproximadamente 25°C, a menos que se establezca otra cosa.

B. Seleccion de disolvente

Los disolventes aproticos polares adecuados para su uso en la invencion pueden seleccionarse basandose en sus parametros de solubilidad de Hansen. Se conocen en la tecnica metodos para determinar y/o calcular experimentalmente los HSP para un disolvente, y se han notificado HSP para mas de 1200 productos qmmicos.

Por ejemplo, el parametro D puede calcularse con precision razonable basandose en el mdice de refraccion, o puede deducirse a partir de diagramas comparandolo con disolventes conocidos de tamano, forma y composicion similares tras establecer una temperatura y volumen molar cnticos. El parametro P puede estimarse a partir de momentos dipolares conocidos (vease, por ejemplo, McClellan A.L., Tables of Experimental Dipole Moments (W.H. Freeman 1963)) usando la ecuacion 1:

Ecuacion 1: 8p = 37,4(momento dipolar)/V1/2

donde V es el volumen molar. No hay ecuaciones para calcular el parametro H. En cambio, el parametro H se determina habitualmente basandose en contribuciones de grupo.

Las caracterizaciones del HSP se visualizan convenientemente usando una representacion esferica, con el HSP de un disolvente de referencia adecuado determinado experimentalmente en el centro de la esfera. El radio de la esfera (R) indica la variacion tolerable maxima del HSP del disolvente de referencia que todavfa permite que tenga lugar una “buena” interaccion. Los disolventes buenos estan dentro de la esfera y los malos estan fuera. La distancia, Ra, entre dos disolventes basada en sus valores de HSP respectivos puede determinarse usando la ecuacion 2:

Ecuacion 2: (Ra)2 = 4(8d1-8d2)2 + (8p1-8p2)2(8h1-8h2)2

donde el subrndice 1 indica la muestra de referencia, el subrndice 2 indica el producto qmmico de prueba, y todos los valores se dan en MPa1/2 La buena solubilidad requiere que Ra sea menor que el radio determinado experimentalmente de la esfera de solubilidad Ro. La diferencia de energfa relativa entre dos disolventes, es decir, el numero RED, puede calcularse tomando la razon de Ra con respecto a Ro, tal como se muestra en la ecuacion 3.

Ecuacion 3: RED = Ra/Ro

Los numeros RED menores de 1,0 indican alta afinidad; los numeros RED iguales o proximos a 1,0 indican condiciones lfmite; y los numeros RED progresivamente superiores indican afinidades progresivamente inferiores.

En algunas realizaciones, los parametros D de los disolventes aproticos polares de la invencion son de entre 17,7 y 22,0 MPa1/2 Tales parametros D relativamente altos estan asociados generalmente con disolventes que tienen estructuras dclicas y/o estructuras con azufre o halogenos. No es probable que los compuestos lineales esten entre los disolventes aproticos polares mas adecuados para su uso en la invencion, pero pueden considerarse si sus parametros P y H estan dentro de los intervalos comentados a continuacion. Puesto que el parametro D se multiplica por 4 en la ecuacion 2, los lfmites son la mitad de Ro. Ademas, debe observase que valores de D de aproximadamente 21 o superiores a menudo son caractensticos de un solido.

En algunas realizaciones, los parametros P de los disolventes aproticos polares de la invencion son de entre 13 y 23 MPa172. Tales parametros P excepcionalmente altos estan asociados generalmente con disolventes que tienen un alto momento dipolar y presumiblemente tambien un volumen molecular relativamente bajo. Por ejemplo, para V cerca de 60 cc/mol, el momento dipolar debe ser de entre 4,5 y 3,1. Para V cerca de 90 cc/mol, el momento dipolar debe ser de entre 5,6 y 3,9.

En algunas realizaciones, los parametros H de los disolventes aproticos polares de la invencion son de entre 3 y 13 MPa172. Generalmente, los disolventes aproticos polares que tienen un grupo alcohol no son utiles en las composiciones y los metodos de la invencion, puesto que los parametros H de tales disolventes senan demasiado altos.

El volumen molar del disolvente aprotico polar tambien puede ser relevante, puesto que entra en la evaluacion de los

tres parametros de solubilidad de Hansen. A medida que el volumen molar se hace mas pequeno, los Kquidos tienen a evaporarse rapidamente. A medida que el volumen molar se hace mas grande, los lfquidos tienden a entrar en la region solida en el intervalo de los parametros D y P enumerados anteriormente. Por tanto, los disolventes aproticos polares de la invencion estan bastante proximos al lfmite Kquido/solido en el espacio de HSP.

5 En algunas realizaciones, los disolventes aproticos polares de la invencion tienen funcionalidad lactona, sulfona, nitrilo, sulfito y/o carbonato. Tales compuestos se distinguen por sus constantes dielectricas relativamente altas, altos momentos dipolares y solubilidad en agua. Un disolvente aprotico polar con funcionalidad lactona a modo de ejemplo es y-butirolactona (GBL), un disolvente aprotico polar con funcionalidad sulfona a modo de ejemplo es sulfolano (SL; sulfuro-dioxido de tetrametileno), un disolvente aprotico polar con funcionalidad nitrilo a modo de 10 ejemplo es acetonitrilo (AN), un disolvente aprotico polar con funcionalidad sulfito a modo de ejemplo es sulfito de glicol/sulfito de etileno (GS) y los disolventes aproticos polares con funcionalidad carbonato a modo de ejemplo son carbonato de etileno (EC), carbonato de propileno (PC) o tritiocarbonato de etileno (ETC). A continuacion se facilitan las estructuras de estos disolventes a modo de ejemplo y en la tabla 1 se facilitan sus parametros de solubilidad de Hansen, numeros RED y volumenes molares.

imagen4

h3c

carbonato de

sulfito de glicol y-butirolactona sulfolano tritiocarbonato carbonato de

etileno

de etileno propileno

15 Tabla 1

D P H RED Volumen molar (cm3/mol)

Correlacion (Ro=3,9)

19,57 19,11 7,71 - -

GBL

19,0 16,6 7,4 0,712 76,5

PC

20,0 18,0 4,1 0,993 85,2

SL

20,3 18,2 10,9 0,929 95,7

EC

19,4 21,7 5,1 0,946 66,0

ETC

n/d n/d n/d n/d n/d

GS

20,0 15,9 5,1 n/d 75,1

n/d = no disponible

Otros disolventes aproticos polares adecuados que pueden usarse en la invencion son compuestos dclicos tales como, por ejemplo, g-caprolactona. Ademas, tambien pueden ser adecuadas para su uso en la invencion pirrolidinonas sustituidas y estructuras relacionadas con nitrogeno en un anillo de 5 o 6 miembros, y estructuras 20 crolicas con dos grupos nitrilo, o un bromo y un grupo nitrilo. Por ejemplo, la N-metilpirrodinona (mostrada a

continuacion puede ser un disolvente aprotico polar adecuado para su uso en los metodos y composiciones de la invencion.

imagen5

Otros disolventes aproticos polares adecuados pueden contener un grupo uretano en anillo (NHCOO-). Sin 25 embargo, no todos estos compuestos son adecuados, puesto que la 1,3-dimetil-2-imidazolidinona no produce senales cuando se usa en las composiciones de hibridacion de la invencion. Un experto en la tecnica puede examinar los compuestos utiles en las composiciones y los metodos de la invencion tal como se describe en el presente documento. Los productos qmmicos a modo de ejemplo que pueden ser adecuados para su uso en la invencion se exponen en las tablas 2 y 3 a continuacion.

30 Tabla 2

Disolvente

D P H

Acetanilida

20,6 13,3 12,4

N-Acetilpirrolidona

17,8 13,1 8,3

4-Aminopiridina

20,4 16,1 12,9

Benzamida

21,2 14,7 11,2

Benzimidazol

20,6 14,9 11,0

1,2,3-Benzotriazol

18,7 15,6 12,4

Dioxido de butadieno

18,3 14,4 6,2

Carbonato de 2,3-butileno

18,0 16,8 3,1

(Epsilon) Caprolactona

19,7 15,0 7,4

Anfndrido cloro-maleico

20,4 17,3 11,5

2-Clorociclohexanona

18,5 13,0 5,1

Cloronitrometano

17,4 13,5 5,5

Anfndrido citraconico

19,2 17,0 11,2

Crotonolactona

19,0 19,8 9,6

Ciclopentanona

17,8 11,9 5,2

Ciclopropilnitrilo

18,6 16,2 5,7

Sulfato de dimetilo

17,7 17,0 9,7

Dimetilsulfona

19,0 19,4 12,3

1,2-Dinitrobenceno

20,6 22,7 5,4

2,4-Dinitrotolueno

20,0 13,1 4,9

Difenilsulfona

21,1 14,4 3,4

1,2-Dinitrobenceno

20,6 22,7 5,4

2,4-Dinitrotolueno

20,0 13,1 4,9

Epsilon-Caprolactama

19,4 13,8 3,9

Cloruro de etanosulfonilo

17,7 14,9 6,8

N-etil-2-pirrolidona

18,0 12,0 7,0

N-formil-piperidina

18,7 10,6 7,8

Furfural

18,6 14,9 5,1

2-Furonitrilo

18,4 15,0 8,2

Isoxazol

18,8 13,4 11,2

Anfndrido maleico

20,2 18,1 12,6

Malononitrilo

17,7 18,4 6,7

4-Metoxi-benzonitrilo

19,4 16,7 5,4

1-Metoxi-2-nitrobenceno

19,6 16,3 5,5

1-Metil-imidazol

19,7 15,6 11,2

3-Metil-isoxazol

19,4 14,8 11,8

N-Metil-2-pirrolidona

18,0 12,3 7,2

N-oxido de N-metil-morfolina

19,0 16,1 10,2

Metil-fenil-sulfona

20,0 16,9 7,8

Metil-sulfolano

19,4 17,4 5,3

4-Toluenosulfonato de metilo

19,6 15,3 3,8

3-Nitroanilina

21,2 18,7 10,3

2-Nitrotiofeno

19,7 16,2 8,2

2,10-Fenantrenoquinona

20,3 17,1 4,8

Anfndrido ftalico

20,6 20,1 10,1

1,3-Propanosulfona

18,4 16,0 9,0

Beta-Propiolactona

19,7 18,2 10,3

2-Pirrolidona

19,4 17,4 11,3

Sacarina

21,0 13,9 8,8

Succinonitrilo

17,9 16,2 7,9

Sulfanilamida

20,0 19,5 10,7

Sulfonano

20,3 18,2 10,9

2,2,6,6-Tetraclorociclohexanona

19,5 14,0 6,3

Tetrametilensulfoxido

18,2 11,0 9,1

Tiazol

20,5 18,8 10,8

3,3,3-Tricloropropeno

17,7 15,5 3,4

1, 1,2-T ricloropropeno

17,7 15,7 3,4

1,2,3-Tricloropropeno

17,8 15,7 3,4

Carbonato de vinileno

17,3 18,1 9,6

La tabla 2 expone una lista a modo de ejemplo de posibles productos qmmicos para su uso en las composiciones y los metodos de la invencion basandose en sus parametros de solubilidad de Hansen. Naturalmente otros compuestos tambien cumplen estos requisitos tales como, por ejemplo, los expuestos en la tabla 3.

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Tabla 3

Producto qmmico (momento dipolar)

RED Punto de fusion, °C

Carbonato de cloroetileno (4,02)

0,92 -

2-Oxazolidinona (5,07)

0,48 86-89

2-Imidazol

1,49 90-91

1,5-Dimetiltetrazol (5,3)

~1,5 70-72

N-Etiltetrazol (5,46)

~1,5

Sulfuro-dioxido de trimetileno (4,49)

- -

Sulfito de trimetileno (3,63)

-

1,3-Dimetil-5-tetrazol (4,02)

- -

Piridazina (3,97)

1,16 -8

2-Tiouracilo (4,21)

- -

N-Metilimidazol (6,2)

1,28 -

1-Nitroso-2-pirrolidinona

-1,37 -

Fosfinato de etil-etilo (3,51)

- -

5-Ciano-2-tiouracilo (5,19)

- -

4H-Piran-4-tiona (4,08)

1,35 32-34

4H-Piran-4-ona = gamma-pirona (4,08)

1,49 Punto de ebullicion (PB) 80

2-Nitrofurano (4,41)

1,14 29

Alfa-Bromo-tetronato de metilo (6,24)

- -

Oxido de tetrahidrotiapirano (4,19)

1,75 60-64

Picolinonitrilo (2-cianopiridina) (5,23)

0,40 26-28 (PB 212-215)

Nitrobencimidazol (6,0)

0,52 207-209

Isatina (5,76)

- 193-195

N-fenil-sidnona (6,55)

- -

Sulfato de glicol (etilenglicol) Nota: no soluble al 40%

- 99°C

Algunos de los productos qmmicos enumerados en las tablas 2 y 3 se han usado en aplicaciones de hibridacion y/o PCR en la tecnica anterior (por ejemplo, el dimetilsulfoxido (DMSO) se ha usado en aplicaciones de hibridacion y PCR, y el sulfolano (SL), el acetonitrilo (AN), la 2-pirrolidona, la g-caprolactama y el etilenglicol se han usado en aplicaciones de PCR). Tal como se establecio anteriormente, el disolvente aprotico polar en la invencion no es DMSO. En algunas realizaciones, el disolvente aprotico polar no es sulfolano, acetonitrilo, 2-pirrolidona, g- caprolactama ni etilenglicol. Sin embargo, la mayona de los disolventes aproticos polares no se han usado en aplicaciones de hibridacion de la tecnica anterior. Ademas, aun cuando tales compuestos se hubieran usado, la tecnica anterior no reconoda que pudieran usarse ventajosamente para disminuir las temperaturas de desnaturalizacion ni para eliminar la etapa de desnaturalizacion de las aplicaciones de hibridacion, tal como se da a conocer en esta solicitud.

Ademas, no todos los productos qmmicos enumerados en las tablas 2 y 3 son adecuados para su uso en las composiciones y los metodos de la invencion. Por ejemplo, aunque los parametros de solubilidad de Hansen (HSP) del DMSO caen dentro de los intervalos enumerados anteriormente, el DMSO no funciona para eliminar la etapa de desnaturalizacion en los metodos de la invencion. Sin embargo, esta completamente dentro de las competencias del experto habitual examinar compuestos adecuados usando las orientaciones proporcionadas en el presente documento incluyendo someter a prueba un compuesto en uno de los ejemplos proporcionados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los disolventes aproticos polares adecuados tendran HSP dentro de los intervalos enumerados anteriormente y una estructura mostrada en las formulas 1-9 anteriormente.

Disolventes aproticos polares mostrados a modo de ejemplo adicionales adecuados para su uso en los metodos de la invencion incluyen delta-valerolactona (2-piperidona), gamma-valerolactona, sulfoleno (butadienosulfona), pentametilenosulfona, y 1,2-dioxan-2-ona.

En algunas realizaciones, el disolvente aprotico polar se elige de carbonato de etileno, sulfolano, gamma- butirolactona y carbonato de propileno. En otras realizaciones, el disolvente aprotico polar se elige de carbonato de etileno, sulfolano, gamma-butirolactona, carbonato de propileno, tritiocarbonato de etileno, sulfito de glicol/sulfito de etileno, delta-valerolactama (2-piperidona) y 1-oxido de tetrahidrotiofeno. Aun en otras realizaciones, el disolvente aprotico polar se elige de carbonato de etileno, sulfolano, gamma-butirolactona, carbonato de propileno, tritiocarbonato de etileno, sulfito de glicol/sulfito de etileno, delta-valerolactama (2-piperidona), 2-pirrolidona, 1-oxido de tetrahidrotiofeno, pentametilensulfona y 1,2-dioxan-2-ona.

C. Composiciones, tampones y disoluciones

(1) Disoluciones de hibridacion

Se conocen en la tecnica disoluciones de hibridacion tradicionales. Tales disoluciones pueden comprender, por

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ejemplo, agentes tamponantes, agentes acelerantes, agentes quelantes, sales, detergentes y agentes de bloqueo.

Por ejemplo, los agentes tamponantes pueden incluir SSC, HEPES, SSPE, PIPES, TMAC, TRIS, SET, acido cftrico, un tampon fosfato, tal como, por ejemplo, fosfato de potasio o pirofosfato de sodio, etc. Los agentes tamponantes pueden estar presentes a concentraciones de desde 0,01x hasta 50x, tal como, por ejemplo, 0,01x, 0,1x, 0,5x, 1x, 2x, 5x, 10x, 15x, 20x, 25x, 30x, 35x, 40x, 45x o 50x. Normalmente, los agentes tamponantes estan presentes a concentraciones de desde 0,1x hasta 10x.

Los agentes acelerantes pueden incluir polfmeros tales como FICOLL, PVP, heparina, sulfato de dextrano, protemas tales como BSA, glicoles tales como etilenglicol, glicerol, 1,3 propanodiol, propilenglicol o dietilenglicol, combinaciones de los mismos tales como disolucion de Dernhardt y BLOTTO, y disolventes organicos tales como formamida, dimetilformamida, etc. El agente acelerante puede estar presente a concentraciones de desde el 1% hasta el 80% o del 0,1x al 10x, tal como, por ejemplo, el 0,1% (o 0,1x), el 0,2% (o 0,2x), el 0,5% (o 0,5x), el 1% (o 1x), el 2% (o 2x), el 5% (o 5x), el 10% (o 10x), el 15% (o 15x), el 20% (o 20x), el 25% (o 25x), el 30% (o 30x), el 40% (o 40x), el 50% (o 50x), el 60% (o 60x), el 70% (o 70x), o el 80% (o 80x). Normalmente, la formamida esta presente a concentraciones de desde el 25% hasta el 75%, tal como el 25%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70% o el 75%, mientras que el sulfato de dextrano y el glicol estan presentes a concentraciones de desde el 5% hasta el 10%, tal como el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9% o el 10%.

Los agentes quelantes pueden incluir EDTA, EGTA, etc. Los agentes quelantes pueden estar presentes a concentraciones de desde 0,1 mM hasta 10 mM, tal como 0,1 mM, 0,2 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM o 10 mM. Normalmente, los agentes quelantes estan presentes a concentraciones de desde 0,5 mM hasta 5 mM, tal como 0,5 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 2,5 mM, 3 mM, 3,5 mM, 4 mM, 4,5 mM o 5 mM.

Las sales pueden incluir cloruro de sodio, fosfato de sodio, fosfato de magnesio, etc. Las sales pueden estar presentes a concentraciones de desde 1 mM hasta 750 mM, tal como 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM,

50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM o 750 mM. Normalmente, las sales estan presentes a concentraciones de desde 10 mM hasta 500 mM, tal como 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM o 500 mM.

Los detergentes pueden incluir Tween, SDS, Triton, CHAPS, acido desoxicolico, etc. El detergente puede estar presente a concentraciones de desde el 0,001% hasta el 10%, tal como, por ejemplo, el 0,0001, el 0,01, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10%. Normalmente, los detergentes estan presentes a concentraciones de desde el 0,01% hasta el 1%, tal como el 0,01%, el 0,02%, el 0,03%, el 0,05%, el 0,1%, el 0,2%, el 0,3%, el 0,4%, el 0,5%, el 0,6%, el 0,7%, el 0,8%, el 0,9% o el 1%.

Los agentes de bloqueo de acido nucleico pueden incluir, ARNt de levadura, ADN homopolimerico, ADN de esperma de salmon desnaturalizado, ADN de esperma de arenque, ADN humano total, ADN de COT1, etc. Los acidos nucleicos de bloqueo pueden estar presentes a concentraciones de 0,05 mg/ml a 100 mg/ml. Sin embargo, las composiciones y los metodos de la invencion muestran sorprendentemente niveles de fondo reducidos significativamente sin necesidad de agentes de bloqueo, y sin necesidad de hibridacion durante la noche en tampones que contienen formamida.

Existe una gran variacion en la bibliograffa respecto a las disoluciones de hibridacion tradicionales. Por ejemplo, una disolucion de hibridacion tradicional puede comprender SSC 5x o 6x, EDTA 0,01 M, disolucion de Dernhardt 5x, SDS al 0,5% y ADN de esperma de salmon desnaturalizado, sometido a cizalladura 100 mg/ml. Otra disolucion de hibridacion tradicional puede comprender HEPES 50 mM, NaCl 0,5 M y EDTA 0,2 mM. Una disolucion de hibridacion tfpica para FISH en muestras biologicas para la deteccion de ARN puede comprender, por ejemplo, SSC 2x, sulfato de dextrano al 10%, complejo de vanadilo-ribonucleosido 2 mM, formamida al 50%, BSA libre de ARN al 0,02% y ARNt de E. coli 1 mg/ml. Una disolucion de hibridacion tfpica para FISH en muestras biologicas para deteccion de ADN puede comprender, por ejemplo, SSC 2x, sulfato de dextrano al 10%, formamida al 50%, y por ejemplo, ADN de esperma de salmon 0,3 mg/ml o ADN de COT1 0,1 mg/ml. Otras disoluciones de hibridacion tfpicas pueden comprender formamida al 40%, sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, Alu-ANP (AnP de bloqueo) o ADN de COT-1, y en algunos casos ADN humano total 0,1 pg/pl (THD).

Las composiciones de la invencion pueden comprender una disolucion de hibridacion que comprende cualquiera de los componentes de las disoluciones de hibridacion tradicionales citados anteriormente en combinacion con al menos un disolvente aprotico polar. Los componentes tradicionales pueden estar presentes a las mismas concentraciones tal como se usa en las disoluciones de hibridacion tradicionales, o pueden estar presentes a concentraciones superiores o inferiores, o pueden omitirse completamente.

Por ejemplo, si las composiciones de la invencion comprenden sales tales como NaCl y/o tampon fosfato, las sales pueden estar presentes a concentraciones de 0-1200 mM de NaCl y/o 0-200 mM de tampon fosfato. En algunas realizaciones, las concentraciones de sales pueden ser de, por ejemplo, NaCl 300 mM y/o tampon fosfato 5 mM, o NaCl 600 mM y/o tampon fosfato 10 mM.

51 las composiciones de la invencion comprenden agentes acelerantes tales como sulfato de dextrano o glicol, el

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sulfato de dextrano puede estar presente a concentraciones de desde el 5% hasta el 40% y el glicol puede estar presente a concentraciones de desde el 0,1% hasta el 10%. En algunas realizaciones, la concentracion de sulfato de dextrano puede ser del 10% o del 20% y la concentracion de etilenglicol, 1,3-propanodiol, o glicerol puede ser del 1% al 10%. En algunas realizaciones, la composicion acuosa no comprende formamida como agente acelerante, o comprende formamida con la condicion de que la composicion contenga menos del 50%, o menos del 25%, o menos del 10%, o menos del 5%, o menos del 2%, o menos del 1%, o menos del 0,5%, o menos del 0,1%, o menos del 0,05%, o menos del 0,01%.

Si las composiciones de la invencion comprenden acido cftrico, las concentraciones pueden oscilar entre 1 mM y

50 mM y el pH puede oscilar entre 5,0 y 8,0. En algunas realizaciones, la concentracion de acido cftrico puede ser de 10 mM y el pH puede ser de 6,2.

Las composiciones de la invencion pueden comprender agentes que reducen la union no espedfica a, por ejemplo, la membrana celular, tal como esperma de salmon o pequenas cantidades de ADN humano total o, por ejemplo, pueden comprender agentes de bloqueo para bloquear la union de, por ejemplo, secuencias de repeticion a la diana tal como cantidades mayores de ADN humano total o ADN enriquecido en repeticiones o agentes de bloqueo espedficos tales como fragmentos y secuencias de ANP o ANB. Estos agentes pueden estar presentes a concentraciones de desde 0,01-100 |ig/|il o 0,01-100 |iM. Por ejemplo, en algunas realizaciones, estos agentes seran ADN humano total 0,1 |ig/|il o ADN no humano 0,1 |ig/|il, tal como esperma de arenque, esperma de salmon, o ADN de timo de ternero, o ANP de bloqueo 5 |iM. Sin embargo, las composiciones y los metodos de la invencion muestran sorprendentemente niveles de fondo significativamente reducidos sin necesidad de agentes de bloqueo, y sin necesidad de hibridacion durante la noche en tampones que contienen formamida.

Un aspecto de la invencion es una composicion o disolucion para su uso en hibridacion. Las composiciones para su uso en la invencion incluyen una composicion acuosa que comprende una secuencia de acido nucleico y al menos un disolvente aprotico polar en una cantidad eficaz para desnaturalizar secuencias de nucleotidos bicatenarios. Una cantidad eficaz para desnaturalizar secuencias de nucleotidos bicatenarios es una cantidad que permite la hibridacion. Por ejemplo, una manera de someter a prueba si la cantidad de disolvente aprotico polar es eficaz para permitir la hibridacion es determinar si el disolvente aprotico polar, cuando se usa en las composiciones y los metodos de hibridacion descritos en el presente documento, tal como en el ejemplo 1, produce una senal detectable y/o un producto de acido nucleico amplificado.

Los ejemplos no limitativos de cantidades eficaces de disolventes aproticos polares incluyen, por ejemplo, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 95% (v/v). En algunas realizaciones, la concentracion de disolvente aprotico polar es del 5% al 60% (v/v). En otras realizaciones, la concentracion de disolvente aprotico polar es del 10% al 60% (v/v). Todavfa en otras realizaciones, la concentracion de disolvente aprotico polar es del 30% al 50% (v/v). Tambien son adecuadas concentraciones del 1% al 5%, del 5% al 10%, del 10%, del 10% al 20%, del 20% al 30%, del 30% al 40%, del 40% al 50% o del 50% a 60% (v/v). En algunas realizaciones, el disolvente aprotico polar estara presente a una concentracion del 0,1%, el 0,25%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4% o el 5% (v/v). En otras realizaciones, el disolvente aprotico polar estara presente a una concentracion del 7%, el 7,5%, el 8%, el 8,5%, el 9%, el 9,5%, el 10%, el 10,5%, el 11%, el 11,5%, el 12%, el 12,5%, el 13%, el 13,5%, el 14%, el 14,5%, el 15%, el 15,5%, el 16%, el 16,5%, el 17%, el 17,5%, el 18%, el 18,5%, el 19%, el 19,5% o el 20% (v/v).

51 las composiciones dadas a conocer se usan en un ensayo de hibridacion, pueden comprender ademas una o mas sondas de acido nucleico. Las sondas pueden marcarse directa o indirectamente con compuestos detectables tales como enzimas, cromoforos, fluorocromos y haptenos. Las sondas de ADN pueden estar presentes a concentraciones de 0,1 a 100 ng/|il. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las sondas pueden estar presentes a concentraciones de 1 a 10 ng/|il. Las sondas de ANP pueden estar presentes a concentraciones de 0,5 a 5000 nM. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las sondas pueden estar presentes a concentraciones de 5 a 1000 nM.

En una realizacion, una composicion dada a conocer comprende una mezcla de disolvente aprotico polar al 40% (v/v) (por ejemplo, carbonato de etileno, “EC”), sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM y sonda 1-10 ng/|il. Otra composicion a modo de ejemplo comprende una mezcla de EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM, tampon fosfato 10 mM y ADN humano total 0,1 |ig/|il. Aun otra composicion a modo de ejemplo comprende EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM, acido cftrico 10 mM pH 6,2, y ADN no humano 0,1 |ig/|il (por ejemplo, esperma de arenque, esperma de salmon o timo de ternero) O formamida al 0,5% O glicol (por ejemplo, etilenglicol, 1,3 propanodiol o glicerol) al 1%. Una composicion a modo de ejemplo adicional comprende EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM, tampon citrato 10 mM pH 6,2.

(2) Disolvente(s) aprotico(s) polar(es)

Disolventes aproticos polares diferentes pueden conferir propiedades diferentes a las composiciones dadas a conocer. Por ejemplo, la eleccion del disolvente aprotico polar puede contribuir a la estabilidad de la composicion, puesto que determinados disolventes aproticos polares pueden degradarse a lo largo del tiempo. Por ejemplo, el disolvente aprotico polar, carbonato de etileno, se descompone en etilenglicol, que es una molecula relativamente estable, y dioxido de carbono, que puede interaccionar con agua para formar acido carbonico, alterando la acidez de las composiciones de la invencion. Sin querer restringirse a la teona, se cree que el cambio en el pH tras la

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descomposicion del carbonato de etileno y el dano en el ADN a partir de un largo almacenamiento hacen que las composiciones de la invencion sean menos eficaces para hibridacion. Sin embargo, la estabilidad puede mejorarse reduciendo el pH de la composicion, anadiendo acido cttrico como tampon a pH 6,2 en lugar del tampon fosfato tradicional, que se usa normalmente a aproximadamente pH 7,4, y/o anadiendo etilenglicol a concentraciones, por ejemplo, de entre el 0,1% y el 10%, o entre el 0,5% y el 5%, tal como, por ejemplo, el 1%, el 2%, el 3%, etc. Por ejemplo, con tampon citrato 10 mM, las composiciones dadas a conocer son estables a 2-8°C durante aproximadamente 8 meses. La estabilidad tambien puede mejorarse si las composiciones se almacenan a bajas temperaturas (por ejemplo, -20°C).

Ademas, determinados disolventes aproticos polares pueden hacer que las composiciones dadas a conocer se separen en sistemas de multiples fases en determinadas condiciones. Las condiciones en las que se obtienen sistemas de multiples fases pueden ser diferentes para disolventes aproticos polares diferentes. Generalmente, sin embargo, a medida que aumenta la concentracion de disolvente aprotico polar, aumenta el numero de fases. Por ejemplo, las composiciones que comprenden bajas concentraciones de carbonato de etileno (es decir, menos del 20%) pueden existir como una fase, mientras que las composiciones que comprenden concentraciones superiores de carbonato de etileno pueden separarse en dos, o incluso tres fases. Por ejemplo, las composiciones que comprenden carbonato de etileno al 15% existen como una unica fase a temperatura ambiente, mientras que las composiciones que comprenden carbonato de etileno al 40% consisten en una fase inferior viscosa (aproximadamente el 25% del volumen total) y una fase superior menos viscosa (aproximadamente el 75% del volumen total) a temperatura ambiente.

Por otra parte, algunos disolventes aproticos polares pueden existir en dos fases a temperatura ambiente incluso a bajas concentraciones. Por ejemplo, sulfolano, y-butirolactona, tritiocarbonato de etileno, sulfito de glicol y carbonato de propileno existen como dos fases a concentraciones del 10, el 15, el 20 o el 25% (sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM, tampon citrato 10 mM) a temperatura ambiente.

Tambien puede ser posible alterar el numero de fases ajustando la temperatura de las composiciones dadas a conocer. Generalmente, a medida que aumenta la temperatura, disminuye el numero de fases. Por ejemplo, a 2-8°C, las composiciones que comprenden carbonato de etileno al 40% pueden separarse en un sistema de tres fases.

Tambien puede ser posible alterar el numero de fases ajustando la concentracion de sulfato de dextrano y/o sal en la composicion. En general, disminuir la concentracion de sulfato de dextrano (la concentracion tradicional es del 10%) y/o la concentracion de sal puede reducir el numero de fases. Sin embargo, dependiendo del disolvente aprotico polar particular y de su concentracion en la composicion, pueden producirse fases unicas incluso con concentraciones superiores de sal y sulfato de dextrano. Por ejemplo, una composicion que comprende bajas cantidades de EC (por ejemplo, el 15%, el 10% o el 5%) puede funcionar bien aumentando las concentraciones de sulfato de dextrano y sal, mientras que todavfa se mantiene un sistema de una fase. En una realizacion particular, las composiciones que comprenden una sonda de ADN de gen HER2, una sonda de ANP de CEN7, EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM y tampon fosfato 10 mM se congelan a -20°C. En otras realizaciones, las composiciones son lfquidas a -20°C.

Algunos disolventes aproticos polares pueden producir senales mas fuertes en una fase u otra. Por ejemplo, el sulfito de glicol al 40% produce fuertes senales en la fase inferior y no produce senales en la fase superior. De manera similar, determinados tipos de sondas pueden producir senales mas fuertes en una fase u otra. Por ejemplo, las sondas de ANP tienden a mostrar senales mas fuertes en la fase inferior que en la fase superior.

Por consiguiente, los sistemas de multiples fases dados a conocer pueden usarse para examinar convenientemente diferentes aspectos de una muestra. Por ejemplo, un sistema de dos fases podna usarse para separar muestras marcadas con sondas de ANP a partir de muestras marcadas con sondas de ADN. Otros usos incluyen aislamiento de una fase espedfica que muestra, por ejemplo, determinadas ventajas tales como que la fase aislada puede usarse como sistema de fase unica. La sonda y/o la muestra pueden anadirse antes de, o tras el aislamiento de una fase particular.

Las aplicaciones de hibridacion pueden realizarse con una composicion de una fase dada a conocer, con fases individuales de las composiciones de multiples fases dadas a conocer, o con mezclas de una cualquiera o mas de las fases en una composicion de multiples fases dada a conocer. Por ejemplo, en un sistema de una fase, puede extraerse un volumen de la muestra para su uso en la hibridacion. En un sistema de multiples fases, puede extraerse un volumen de muestra de la fase de interes (por ejemplo, la fase superior, inferior o media) para su uso en la hibridacion. Alternativamente, las fases en un sistema de multiples fases pueden mezclarse antes de extraer un volumen de la muestra mezclada para su uso en la hibridacion. Sin embargo, el sistema de multiples fases puede producir tincion de fondo local fuerte e irregular en la composicion. Aunque la adicion de pequenas cantidades de formamida reducira el fondo en un sistema de una fase, tiene poco efecto en un sistema de multiples fases con altas concentraciones (por ejemplo, el 40%) de un disolvente aprotico polar. Ademas, a medida que aumenta la concentracion de formamida, se requieren concentraciones superiores de sonda y/o tiempos de hibridacion mas largos para mantener la intensidad de senal fuerte.

(3) Optimizacion para aplicaciones particulares

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Las composiciones dadas a conocer pueden variarse con el fin de optimizar los resultados para una aplicacion particular. Por ejemplo, la concentracion de disolvente aprotico polar, sal, agente acelerante, agente de bloqueo y/o iones hidrogeno (es decir pH) puede variarse con el fin de mejorar los resultados para una aplicacion particular.

Por ejemplo, la concentracion de disolvente aprotico polar puede variarse con el fin de mejorar la intensidad de senal y la tincion de fondo. Generalmente, a medida que aumenta la concentracion de disolvente aprotico polar, aumenta la intensidad de senal y disminuye la tincion de fondo. Por ejemplo, las composiciones que comprenden EC al 15% tienen a mostrar senales mas fuertes y menos fondo que las composiciones que comprenden EC al 5%. Sin embargo, la intensidad de senal puede mejorarse para composiciones que tienen bajas concentraciones de disolvente aprotico polar (por ejemplo, del 0% al 20%) si se aumentan las concentraciones de sal y/o sulfato de dextrano. Por ejemplo, pueden observarse senales fuertes con EC del 5% al 10% a medida que la concentracion de sal se eleva de aproximadamente 3 a 4 veces por encima de las concentraciones de sal tradicionales (es decir, aproximadamente NaCl 1200 mM, tampon fosfato 20 mM; las concentraciones de sal tradicionales son de aproximadamente NaCl 300 mM). Asimismo, cuando se usan concentraciones inferiores de disolvente aprotico polar, generalmente se requieren concentraciones superiores de sulfato de dextrano para mantener buena senal e intensidad de fondo.

Por consiguiente, las concentraciones de sal y sulfato de dextrano tambien pueden variarse con el fin de mejorar la intensidad de senal y la tincion de fondo. Generalmente, a medida que aumentan las concentraciones de sal y sulfato de dextrano, aumenta la intensidad de senal y disminuye el fondo. Por ejemplo, concentraciones de sal que son aproximadamente de dos a cuatro veces las concentraciones tradicionales (es decir, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM) producen senales fuertes y bajo fondo. Sorprendentemente, sin embargo, se produce hibridacion usando las composiciones de la invencion incluso en ausencia completa de sal. Las intensidades de senal pueden mejorarse en condiciones sin sal aumentando las concentraciones de agente acelerante y/o disolvente aprotico polar.

Asimismo, la intensidad de senal aumenta a medida que aumenta la concentracion de sulfato de dextrano desde el 0% hasta el 20%. Sin embargo, pueden observarse incluso buenas senales a concentraciones de sulfato de dextrano del 0%. La intensidad de senal puede mejorarse con concentraciones de sulfato de dextrano bajas aumentando las concentraciones de disolvente aprotico polar y/o de sal.

Ademas, los tipos de sondas usadas en las composiciones dadas a conocer pueden variarse para mejorar los resultados. Por ejemplo, en algunos aspectos de la invencion, combinaciones de sondas de ADN/ADN pueden mostrar menos fondo que combinaciones de sondas de ADN/ANP en las composiciones dadas a conocer o viceversa. Por otra parte, las sondas de ANP tienen a mostrar senales mas fuertes que las sondas de ADN con bajas concentraciones de sal y/o bajas concentraciones de disolvente aprotico polar. De hecho, las sondas de ANP tambien muestras senales cuando no esta presente disolvente aprotico polar, mientras que las sondas de ADN muestran senales debiles o ausencia de las mismas sin disolvente aprotico polar.

D. Aplicaciones, metodos y usos

(1) Muestras analtticas

Los metodos de la invencion pueden usarse completa o parcialmente en todos los tipos de aplicaciones de hibridacion en los campos de citologfa, histologfa o biologfa molecular. Segun una realizacion, la primera o la segunda secuencia de acido nucleico en los metodos de la invencion esta presente en una muestra biologica. Los ejemplos de tales muestras incluyen, por ejemplo, muestras tisulares, preparaciones de celulas, preparaciones de fragmentos de celulas y preparaciones de componentes celulares aislados o enriquecidos. La muestra puede originarse a partir de diversos tejidos tales como, por ejemplo, de mama, de pulmon, colorrectal, de prostata, de pulmon, de cabeza y cuello, de estomago, de pancreas, de esofago, de hngado y de vejiga, u otros tejidos relevantes y neoplasia de los mismos, cualquier suspension celular, muestra de sangre, aspiracion con aguja fina, lfquido ascftico, esputo, lavado peritoneal, lavado pulmonar, orina, heces, raspado de celulas, frotis de celulas, celulas sometidas a Cytospin o Cytoprep.

La muestra puede aislarse y procesarse usando protocolos convencionales. Por ejemplo, pueden obtenerse preparaciones de fragmentos celulares mediante homogeneizacion de celulas, tratamiento de congelacion- descongelacion o lisado celular. La muestra aislada puede tratarse de muchas formas diferentes dependiendo de la finalidad de obtencion de la muestra y dependiendo de la rutina en el centro. La muestra se trata a menudo con diversos reactivos para conservar el tejido para el analisis posterior de la muestra, alternativamente la muestra puede analizarse directamente. Ejemplos de metodos usados ampliamente para conservar muestras son fijacion con formalina seguida por inclusion en parafina y crioconservacion.

Para las extensiones en metafase, los cultivos celulares generalmente se tratan con colcemida, u otro agente de alteracion del polo del huso adecuado, para detener el ciclo celular en metafase. Entonces se fijan las celulas y se colocan sobre portaobjetos de microscopio, se tratan con formaldehndo, se lavan y se deshidratan en etanol. Entonces se anaden sondas y se analizan las muestras mediante cualquiera de las tecnicas comentadas a continuacion.

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La citolog^a implica el examen de celulas individuales y/o extensiones cromosomicas a partir de una muestra biologica. El examen citologico de una muestra comienza obteniendo una muestra de celulas, que normalmente puede realizarse mediante rascado, lavado o cepillado de una zona, como en el caso de las muestras de cuello uterino, o recogiendo lfquidos corporales, tales como los obtenidos de la cavidad toracica, la vejiga o la columna vertebral, o mediante aspiracion con aguja fina o biopsia con aguja fina, como en el caso de tumores internos. En una preparacion citologica manual convencional, la muestra se transfiere a un material de suspension lfquido y las celulas en el lfquido se transfieren entonces directamente o mediante etapas de procesamiento basadas en centrifugacion a un portaobjetos de vidrio de microscopio para su visualizacion. En una preparacion citologica automatizada tfpica, se coloca un conjunto de filtro en la suspension lfquida y el conjunto de filtro tanto dispersa las celulas como captura las celulas sobre el filtro. Entonces se retira el filtro y se coloca en contacto con un portaobjetos de microscopio. Entonces se fijan las celulas sobre el portaobjetos de microscopio antes del analisis mediante cualquiera de las tecnicas comentadas a continuacion.

En un experimento de hibridacion de ADN tradicional que usa una muestra citologica, se sumergen portaobjetos que contienen la muestra en un tampon de formaldehido, se lavan y entonces se deshidratan en etanol. Entonces se anaden las sondas y se cubre la muestra con un cubreobjetos. El portaobjetos se incuba opcionalmente a una temperatura suficiente para desnaturalizar cualquier acido nucleico bicatenario en la muestra (por ejemplo, 5 minutos a 82°C) y entonces se incuba a una temperatura suficiente para permitir la hibridacion (por ejemplo, durante la noche a 45°C). Tras la hibridacion, se retiran los cubreobjetos y se someten las muestras a un lavado en condiciones de alta rigurosidad (por ejemplo, 10 minutos a 65°C) seguido por una serie de lavados en condiciones de baja rigurosidad (por ejemplo, 2 x 3 minutos a temperatura ambiente). Entonces se deshidratan las muestras y se montan para su analisis.

En un experimento de hibridacion de ARN tradicional que usa muestras citologicas, las celulas se equilibran en formamida al 40%, SSC 1x y fosfato de sodio 10 mM durante 5 min, se incuban a 37°C durante la noche en reacciones de hibridacion que contienen 20 ng de sonda de oligonucleotido (por ejemplo, mezcla de oligonucleotidos de 50 pb marcados), SSC 1x, formamida al 40%, sulfato de dextrano al 10%, BSA al 0,4%, complejo de ribonucleotido-vanadilo 20 mM, ADN de testfculos de salmon (10 mg/ml), ARNt de E. coli (10 mg/ml) y fosfato de sodio 10 mM. Entonces se lava dos veces con SSC 4x/formamida al 40% y de nuevo dos veces con SSC 2x/formamida al 40%, ambas a 37°C, y luego con SSC 2x tres veces a temperatura ambiente. Entonces pueden detectarse por ejemplo sondas marcadas con digoxigenina usando un anticuerpo monoclonal frente a digoxigenina conjugado con Cy3. Entonces pueden detectarse por ejemplo sondas marcadas con biotina usando estreptavidina- Cy5. La deteccion puede ser mediante fluorescencia o CISH.

La histologfa implica el examen de celulas en cortes finos de tejido. Para preparar una muestra de tejido para el examen histologico, se fijan fragmentos del tejido en un agente de fijacion adecuado, normalmente un aldehfdo tal como formaldetndo o glutaraldehfdo, y entonces se incluyen en cera de parafina fundida. Entonces se corta el bloque de cera que contiene la muestra de tejido en un microtomo para producir cortes finos de parafina que contienen el tejido, normalmente de desde 2 hasta 10 micrometres de grosor. Entonces se aplica el corte de muestra a un portaobjetos de microscopio, se seca al aire y se calienta para hacer que la muestra se adhiera al portaobjetos de vidrio. Entonces se disuelve la parafina residual con un disolvente adecuado, normalmente xileno, tolueno u otros. Entonces se retiran estos disolventes denominados de desparafinacion con un reactivo de tipo lavado- deshidratacion antes del analisis de la muestra mediante cualquiera de las tecnicas comentadas a continuacion. Alternativamente, pueden prepararse cortes a partir de muestras congeladas, fijarse brevemente en formalina al 10% u otro agente de fijacion adecuado, y luego infundirse con reactivo de deshidratacion antes del analisis de la muestra.

En un experimento de hibridacion de ADN tradicional que usa una muestra histologica, se cortan muestras de tejido incluidos en parafina fijados con formalina en cortes de 2-6 |im y se recogen sobre portaobjetos. La parafina se funde (por ejemplo, 30-60 minutos a 60°C) y entonces se retira (se desparafina) lavando con xileno (o un sustituto de xileno), por ejemplo, 2 x 5 minutos. Las muestras vuelven a hidratarse, se lavan y entonces se pretratan (por ejemplo, 10 minutos a 95-100°C). Se lavan los portaobjetos y luego se tratan con pepsina u otro permeabilizador adecuado, por ejemplo, 3-15 minutos a 37°C. Se lavan los portaobjetos (por ejemplo, 2 x 3 minutos), se deshidratan y se aplica una sonda. Se cubren las muestras con un cubreobjetos y se incuba opcionalmente el portaobjetos a una temperatura suficiente para desnaturalizar cualquier acido nucleico bicatenario en la muestra (por ejemplo 5 minutos a 82°C), seguido por incubacion a una temperatura suficiente para permitir la hibridacion (por ejemplo, durante la noche a 45°C). Tras la hibridacion, se retiran los cubreobjetos y se someten las muestras a lavado en condiciones de alta rigurosidad (por ejemplo, 10 minutos a 65°C) seguido por una serie de lavados en condiciones de baja rigurosidad (por ejemplo, 2 x 3 minutos a temperatura ambiente). Entonces se deshidratan las muestras y se montan para su analisis.

En un experimento de hibridacion de ARN tradicional que usa una muestra histologica, se desparafinan portaobjetos con cortes de tejido FFPE en xileno durante 2 x 5 min, se sumergen en etanol al 99% 2 x 3 min, en etanol al 96% 2 x 3 min y luego en agua pura durante 3 min. Se colocan los portaobjetos en una camara de humedad. Se anade proteinasa K y se incuban los portaobjetos a TA durante 5 min- 15 min. Se sumergen los portaobjetos en agua pura durante 2 x 3 min, se sumergen en etanol al 96% durante 10 s y se secan al aire durante 5 min. Se anaden sondas al corte tisular y se cubren con cubreobjetos. Se incuban los portaobjetos a 55°C en una camara de humedad

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durante 90 min. Tras la incubacion, se sumergen los portaobjetos en una disolucion de lavado en condiciones de rigurosidad a 55°C durante 25 min, y entonces se sumergen en TBS durante 10 s. Se incuban los portaobjetos en una camara de humedad con anticuerpos durante 30 min. Se sumergen los portaobjetos en TBS durante 2 x 3 min, luego en agua pura durante 2 x 1 min, y entonces se colocan en una camara de humedad. Entonces se incuban los portaobjetos con sustrato durante 60 min y se sumergen en agua corriente durante 5 min.

En un experimento de transferencia de tipo Northern tradicional, se desnaturaliza la muestra diana de ARN durante 10 minutos a 65°C en tampon de carga de ARN y se coloca inmediatamente en hielo. Se cargan los geles y se someten a electroforesis con tampon MOPS 1x (MOPS 10X contiene acido morfolinopropanosulfonico 200 mM, acetato de sodio 50 mM, EDTA 10 mM, pH 7,0) a 25 V durante la noche. Entonces se preequilibra el gel en SSC 20x durante 10 min y se transfiere el ARN a una membrana de nailon usando SSC 20x esteril como tampon de transferencia. Entonces se fijan los acidos nucleicos sobre la membrana usando, por ejemplo, reticulacion por UV a 120 mJ o calentamiento en estufa durante 30 min a 120°C. Entonces se lava la membrana en agua y se seca al aire. Se coloca la membrana en una bolsa de plastico sellable y se somete a prehibridacion sin sonda durante 30 min a 68°C. Se desnaturaliza la sonda durante 5 min a 100°C y se coloca inmediatamente en hielo. Se anade tampon de hibridacion (calentado previamente hasta 68°C) y se hibrida la sonda a 68°C durante la noche. Entonces se retira la membrana de la bolsa y se lava dos veces durante 5 min cada una con agitacion en un tampon de lavado en condiciones de baja rigurosidad (por ejemplo, SSC 2x, SDS al 0,1%) a temperatura ambiente. Entonces se lava la membrana dos veces durante 15 min cada una en un tampon de lavado en condiciones de alta rigurosidad calentado previamente (por ejemplo, SSC 0,1x, SDS al 0,1%) a 68°C. Entonces puede almacenarse la membrana o puede revelarse inmediatamente para la deteccion.

Pueden encontrarse ejemplos adicionales de tecnicas de hibridacion tradicionales, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) en las secciones 1.901.104, 2.108-2.117, 4.40-4.41, 7.37-7.57, 8.46-10.38, 11.7-11.8, 11.12-11.19, 11.38 y 11.45-11.57; y en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1998) en las secciones 2.9.1-2.9.6, 2.10.42.10.5, 2.10.11-2.10.16, 4.6.5-4.6.9, 4.7.2-4.7.3, 4.9.7-4.9.15, 5.9.18, 6.2-6.5, 6.3, 6.4, 6.3.3-6.4.9, 5.9.12-5.9.13, 7.0.9, 8.1.3, 14.3.1-14.3.4, 14.9, 15.0.3-15.0.4, 15.1.1-15.1.8 y 20.1.24-20.1.25.

(2) Tecnicas de hibridacion

Los metodos de la presente invencion pueden usarse completa o parcialmente en todos los tipos de tecnicas de hibridacion de acidos nucleicos conocidas en la tecnica para muestras citologicas e histologicas. Tales tecnicas incluyen, por ejemplo, hibridacion in situ (ISH), hibridacion in situ fluorescente (FISH; incluyendo FISH multicolor, FISH de fibra, etc.), hibridacion in situ cromogenica (CISH), hibridacion in situ con plata (SISH), hibridacion genomica comparativa (CGH), sondas cromosomicas y alineamientos in situ. Las composiciones dadas a conocer mejoraran la eficacia de las tecnicas de hibridacion tradicionales, por ejemplo, eliminando la necesidad de una etapa de desnaturalizacion. Se describen sondas moleculares que son adecuadas para su uso en las hibridaciones de la invencion por ejemplo, en la publicacion de patente estadounidense n.° 2005/0266459. En general, pueden prepararse sondas mediante smtesis qmmica, PCR o amplificando una secuencia de ADN espedfica mediante clonacion, insertando el ADN en un vector y amplificando en el vector un inserto en celulas huesped apropiadas. Los vectores usados comunmente incluyen plasmidos bacterianos, cosmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales derivados del fago PI (PAC) o cromosomas artificiales derivados de levaduras (YAC). Entonces se extrae el ADN amplificado y se purifica para su uso como una sonda. Se conocen en la tecnica metodos para preparar y/o sintetizar sondas, por ejemplo, tal como se da a conocer en el documento PCT/US02/30573.

En general, el tipo de sonda determina el tipo de caractenstica que puede detectarse en un ensayo de hibridacion. Por ejemplo, pueden usarse sondas de ADN nucleares o genomicas totales como sonda espedfica de especie. Las sondas cromosomicas son conjuntos de secuencias de ADN derivadas de un unico tipo de cromosoma y pueden identificar a ese tipo de cromosoma espedfico en nucleos en metafase e interfase, contar el numero de un determinado cromosoma, mostrar translocaciones o identificar fragmentos extracromosomicos de cromatina. Los diferentes tipos de cromosomas tambien tienen secuencias repetidas unicas que pueden seleccionarse como diana para la hibridacion con sonda, para detectar y contar cromosomas espedficos. Pueden usarse sondas de insercion grandes para seleccionar como diana secuencias unicas de una sola copia. Con estas sondas grandes, la eficacia de hibridacion es inversamente proporcional al tamano de la sonda. Tambien pueden usarse sondas mas pequenas para detectar aberraciones tales como deleciones, amplificaciones, inversiones, duplicaciones y aneuploidfa. Por ejemplo, pueden usarse sondas espedficas de locus coloreadas de modo diferente para detectar translocaciones a traves de hibridacion in situ de senal dividida.

En general, la capacidad para discriminar entre secuencias estrechamente relacionadas es inversamente proporcional a la longitud de la sonda de hibridacion porque disminuye la diferencia en la estabilidad termica entre el tipo silvestre y complejos mutantes a medida que aumenta la longitud de la sonda. Generalmente se requieren sondas de una longitud mayor de 10 pb para obtener la diversidad de secuencia necesaria para identificar correctamente un organismo unico o un estado clmico de interes. Por otra parte, diferencias de secuencia tan sutiles como una unica base (mutacion puntual) en oligomeros muy cortos (<10 pares de bases) pueden ser suficientes para permitir la discriminacion de la hibridacion para secuencias diana de acido nucleico en comparacion con

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secuencias no diana.

En una realizacion, al menos un conjunto de las sondas de hibridacion in situ puede comprender una o mas sondas de ANP, tal como se definio anteriormente y tal como se describe en la patente estadounidense n.° 7.105.294. Se describen metodos para sintetizar sondas de ANP en el documento PCT/US02/30573. Alternativamente, o ademas, al menos un conjunto de las sondas de hibridacion en cualquiera de las tecnicas comentadas anteriormente puede comprender una o mas sondas de acido nucleico bloqueado (ANB), tal como se describe en el documento WO99/14226. Debido a la union en puente adicional entre carbonos en 2' y 4', la estructura principal de ANB esta previamente organizada para la hibridacion. Las interacciones ANB/ADN y ANB/ARN son mas fuertes que las interacciones ADN/ADN y ADN/ARN correspondientes, tal como se indica por una temperatura de fusion superior. Por tanto, las composiciones y los metodos de la invencion, que disminuyen la energfa requerida para la hibridacion, son particularmente utiles para hibridaciones con sondas de ANB.

En una realizacion, las sondas pueden comprender un marcador detectable (una molecula que proporciona una senal identificable analtticamente que permite la deteccion del fubrido sonda-diana), tal como se describe en la publicacion de patente estadounidense n.° 2005/0266459. Las sondas pueden marcarse para hacer posible la identificacion del fubrido sonda-diana mediante el uso, por ejemplo, de un microscopio/escaner de fluorescencia o campo brillante. En algunas realizaciones, la sonda puede marcarse usando marcadores radiactivos tales como 31P, 33P o 32S, marcadores no radiactivos tales como digoxigenina y biotina o marcadores fluorescentes. El marcador detectable puede unirse directamente a una sonda o puede unirse indirectamente a una sonda, por ejemplo, mediante el uso de un ligador. Puede usarse cualquier metodo de marcaje conocido por los expertos en la tecnica, incluyendo procedimientos enzimaticos y qrnmicos, para marcar las sondas usadas en los metodos y las composiciones de la invencion. En otras realizaciones, las sondas no se marcan.

En general, las tecnicas de hibridacion in situ tales como CGH, FISH, CISH y SISH, emplean grandes sondas de acido nucleico, principalmente sin especificar, que se hibridan con diversas condiciones de rigurosidad con genes o fragmentos de genes en los cromosomas de las celulas. El uso de sondas grandes hace que la tecnica de hibridacion in situ sea mas sensible. Sin embargo, el uso satisfactorio de las sondas genomicas grandes en los ensayos de hibridacion tradicionales depende del bloqueo de la tincion de fondo no deseada derivada de, por ejemplo, secuencias repetitivas que estan presentes por todo el genoma. Los metodos tradicionales para disminuir la union de sonda no espedfica incluyen saturar los sitios de union en protemas y tejido mediante la incubacion del tejido con disoluciones de prehibridacion que contienen ficoll, albumina serica bovina (BSA), polivinilpirrolidona y acidos nucleicos. Tales etapas de bloqueo llevan mucho tiempo y son caras. Ventajosamente, los metodos y las composiciones de la invencion reducen y/o eliminan la necesidad de tales etapas de bloqueo, y muestran niveles de fondo reducidos significativamente sin necesidad de agentes de bloqueo y sin necesidad de hibridacion durante la noche en tampones que contienen formamida. Sin embargo, en una realizacion, pueden suprimirse las secuencias repetitivas segun los metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, tal como se da a conocer en el documento PCT/US02/30573.

Pueden detectarse sondas unidas en muestras citologicas e histologicas o bien directamente o bien indirectamente con fluorocromos (por ejemplo, FISH), cromogenos organicos (por ejemplo, CISH), partfculas de plata (por ejemplo, SISH) u otras partfculas metalicas (por ejemplo, hibridacion in situ de fluorescencia facilitada por oro, GOLDFISH). Por tanto, dependiendo del metodo de deteccion, las poblaciones de celulas obtenidas de una muestra que va a someterse a prueba pueden visualizarse a traves de microscopfa de fluorescencia o microscopfa optica de campo brillante convencional.

Los ensayos de hibridacion en muestras citologicas e histologicas son herramientas importantes para determinar el numero, el tamano y/o la ubicacion de secuencias de ADN espedficas. Por ejemplo, en la CGH, se tinen genomas completos y se comparan con genomas de referencia normales para la deteccion de regiones con un numero de copias aberrante. Normalmente, se marca el ADN de tejido objeto y de tejido de control normal con diferentes sondas de color. Se mezclan los conjuntos de ADN y se anaden a una extension en metafase de cromosomas normales (o a un chip de microalineamiento, para la CGH de matriz o alineamiento). Entonces se comparan las razones de colores para identificar regiones con numero de copias aberrante.

Normalmente se usa FISH cuando se requiere la obtencion de imagenes de multiples colores y/o cuando el protocolo exige la cuantificacion de senales. La tecnica generalmente implica preparar una muestra citologica, marcar sondas, desnaturalizar cromosomas diana y la sonda, hibridar la sonda con la secuencia diana y detectar la senal. Normalmente, la reaccion de hibridacion tine de manera fluorescente las secuencias seleccionadas como diana de modo que puede determinarse su ubicacion, tamano o numero usando microscopfa de fluorescencia, citometna de flujo u otra instrumentacion adecuada. Pueden estudiarse secuencias de ADN que oscilan desde genomas completos hasta varias kilobases usando FISH. Con tecnicas de microscopfa de fluorescencia mejoradas, tales como, por ejemplo, desconvolucion, puede detectarse incluso una sola molecula de ARNm. Tambien puede usarse FISH en eXtensiones en metafase y nucleos en interfase.

Se ha usado FISH satisfactoriamente para mapear secuencias de ADN repetitivas y de una sola copia en cromosomas en metafase, nucleos en interfase, fibras de cromatina y moleculas de ADN desnudo, y para la identificacion de cromosomas y el analisis de cariotipo a traves de la localizacion de grandes familias repetidas,

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normalmente los ADN ribosomicos y familias de alineamiento en tandem. Una de las aplicaciones mas importantes para FISH ha sido en la deteccion de secuencias de ADN de una sola copia, en particular de genes relacionados con enfermedades en seres humanos y otras especies eucariotas modelo, y en la deteccion de agentes infecciosos. FISH puede usarse para detectar, por ejemplo, aneuploidfa cromosomica en diagnosticos prenatales, canceres hematologicos y tumores solidos; anomaKas genicas tales como amplificaciones de oncogenes, deleciones de genes o fusiones de genes; anomalfas estructurales cromosomicas tales como translocaciones, duplicaciones, inserciones, o inversiones; smdromes de genes contiguos tales como smdrome de microdelecion; los efectos geneticos de diversas terapias; acidos nucleicos virales en celulas somaticas y sitios de integracion virales en cromosomas; etc. En la FISH multicolor, se tine cada cromosoma con un color independiente, lo que permite determinar los cromosomas normales de los que se derivan cromosomas anomalos. Tales tecnicas incluyen FISH multiple (m- FISH), cariotipado espectral (SKY), marcaje de ratio binario combinado (COBRA), cariotipado por cambio de color, bandeo de colores entre especies, bandeo multicolor de alta resolucion, FISH multiple de telomeros (TM-FISH), FISH de senal dividida (ssFISH) y FISH de senal de fusion.

Pueden usarse CISH y SISH para muchas de las mismas aplicaciones que FISH, y tienen la ventaja adicional de permitir el analisis de la morfologfa tisular subyacente, por ejemplo en aplicaciones de histopatologfa. Si se realiza FISH, la mezcla de hibridacion puede contener conjuntos de pares de sondas distintos y equilibrados, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 6.730.474. Para CISh, la mezcla de hibridacion puede contener al menos un conjunto de sondas configurado para la deteccion con uno o mas cromogenos organicos convencionales, y para SISH, la mezcla de hibridacion puede contener al menos un conjunto de sondas configurado para su deteccion con partfculas de plata, tal como se describe en Powell RD et al., “Metallographic in situ hibridation”, Hum. Pathol., 38:1145-59 (2007).

Las composiciones dadas a conocer en la solicitud tambien pueden usarse completa o parcialmente en todos los tipos de tecnicas de biologfa molecular que implican hibridacion, incluyendo transferencia y sondaje (por ejemplo, de tipo Southern, de tipo Northern, etc.), alineamientos, y tecnicas de amplificacion incluyendo PCR tradicional, RT- PCR, PCR para mutacion, PCR asimetrica, PCR de inicio en caliente, PCR inversa, PCR multiple, PCR anidada, PCR cuantitativa y PCR in situ. La PCR in situ es una reaccion en cadena de la polimerasa que tiene lugar dentro de una celula en un portaobjetos, por ejemplo, las muestras de citologfa e histologfa descritas antes. Normalmente, tras adherir la muestra a un portaobjetos de microscopio, se rehidratan y permeabilizan las celulas y luego se combinan con una mezcla apropiada de reactivos de PCR incluyendo polimerasa, dNTP y cebadores. La PCR puede llevarse a cabo en un instrumento especializado, tal como el sistema GeneAmp In situ PCR System 1000 (Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA) usando ciclos de temperatura y tiempo de desnaturalizacion/renaturalizacion/amplificacion convencionales, y el producto amplificado puede detectarse usando sondas marcadas o incorporando dNTP marcados durante la amplificacion. En algunas realizaciones, los metodos de la invencion son utiles para aplicaciones de hibridacion de acidos nucleicos, con la condicion de que tales aplicaciones no incluyan la amplificacion del acido nucleico tal como, por ejemplo, mediante PCR, PCR in situ, etc.

(3) Condiciones de hibridacion

El metodo de la presente invencion implica el uso de disolventes aproticos polares en la hibridacion de cadenas de acido nucleico. Las composiciones dadas a conocer en la presente solicitud son particularmente utiles para eliminar la etapa de desnaturalizacion en dichos metodos inventivos.

Los metodos de hibridacion que usan las composiciones dadas a conocer pueden implicar aplicar las composiciones a una muestra que comprende una secuencia diana de acido nucleico, lo mas probablemente en forma bicatenaria. El disolvente aprotico polar interacciona con los acidos nucleicos bicatenarios y facilita su desnaturalizacion. Por tanto, los disolventes aproticos polares eliminan la necesidad de una etapa de desnaturalizacion independiente en los metodos de hibridacion. Como resultado, los disolventes aproticos polares especificados en la presente invencion reducen la evaporacion de disolventes, conservan la morfologfa de la muestra, reducen el fondo, simplifican los procedimientos de hibridacion y hacen el procedimiento de hibridacion considerablemente mas facil de automatizar.

Las hibridaciones que usan las composiciones dadas a conocer pueden realizarse usando la misma metodologfa de ensayo que para las hibridaciones realizadas con composiciones tradicionales. Por ejemplo, las etapas de pretratamiento termico, digestion, hibridacion, lavado y montaje pueden usar las mismas condiciones en lo que se refiere a volumenes, temperaturas, reactivos y tiempos de incubacion que para las composiciones tradicionales. Sin embargo, las composiciones dadas a conocer permiten la eliminacion de la etapa de desnaturalizacion. Adicionalmente, las composiciones dadas a conocer permiten la reduccion del tiempo de hibridacion en metodos que comprenden sondas de hibridacion mas largas o fragmentos de sondas de hibridacion, por ejemplo, sondas de hibridacion o fragmentos de sondas de hibridacion que comprenden de 40 a 500 nucleotidos, sondas de hibridacion o fragmentos de sondas de hibridacion que comprenden de 50 a 500 nucleotidos, o sondas de hibridacion o fragmentos de sondas de hibridacion que comprenden de 50 a 200 nucleotidos. Existe una gran variacion en los protocolos de hibridacion tradicionales conocidos en la tecnica. Por ejemplo, algunos protocolos especifican una etapa de desnaturalizacion independiente de nucleotidos bicatenarios potenciales sin sonda presente, antes de la siguiente etapa de hibridacion, mientras que otros protocolos desnaturalizaran la sonda y la muestra juntas. Las composiciones dadas a conocer pueden usarse en cualquiera de los protocolos de hibridacion tradicionales

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conocidos en la tecnica.

Alternativamente, los ensayos que usan las composiciones dadas a conocer pueden cambiarse y optimizarse a partir de metodolog^as tradicionales, por ejemplo, disminuyendo el tiempo de hibridacion, disminuyendo las temperatures de hibridacion y/o disminuyendo los volumenes de hibridacion.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones dadas a conocer produciran senales fuertes cuando la temperatura de desnaturalizacion es de desde 60°C hasta 100°C y la temperatura de hibridacion es de desde 20°C hasta 60°C. En otras realizaciones, las composiciones dadas a conocer produciran senales fuertes cuando la temperatura de desnaturalizacion es de desde 60°C hasta 65°C, desde 65°C hasta 70°C, desde 70°C hasta 75°C, desde 75°C hasta 80°C o desde 80°C hasta 85°C, y la temperatura de hibridacion es de desde 20°C hasta 30°C, desde 30°C hasta 40°C, desde 40°C hasta 50°C o desde 50°C hasta 60°C. En otras realizaciones, las composiciones dadas a conocer produciran senales fuertes cuando la temperatura de desnaturalizacion es de 62°C, 67°C, 72°C u 82°C, y la temperatura de hibridacion es de 37°C, 40°C, 45°C, 50°C o 55°C.

En determinadas divulgaciones, las composiciones dadas a conocer en la solicitud produciran senales fuertes cuando el tiempo de desnaturalizacion es de desde 0 hasta 15 minutos y el tiempo de hibridacion es de desde 0 minutos hasta 24 horas. En otras divulgaciones, las composiciones produciran senales fuertes cuando el tiempo de desnaturalizacion es de desde 0 hasta 10 minutos y el tiempo de hibridacion es de desde 0 minutos hasta 8 horas. En otras divulgaciones, las composiciones produciran senales fuertes cuando el tiempo de desnaturalizacion es de 0, 1, 2, 3, 4 o 5 minutos, y el tiempo de hibridacion es de 0 minutos, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 180 minutos o 240 minutos. Los expertos en la tecnica entenderan que en algunos casos, por ejemplo, deteccion de ARN, no se requiere una etapa de desnaturalizacion con tampones tradicionales. Se ha encontrado sorprendentemente que las composiciones dadas a conocer tambien eliminan la necesidad de una etapa de desnaturalizacion y/o reducen la temperatura requerida para la desnaturalizacion de otros tipos de acidos nucleicos tales como, por ejemplo, ADN. Por tanto, en una realizacion, el tiempo de desnaturalizacion es de 0 minutos, es decir, se elimina completamente la etapa de desnaturalizacion requerida con tampones de la tecnica anterior.

Por consiguiente, pueden realizarse hibridaciones usando las composiciones dadas a conocer en menos de 8 horas. En otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en menos de 6 horas. Todavfa en otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en el plazo de 4 horas. En otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en el plazo de 3 horas. Aun en otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en el plazo de 2 horas. En otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en el plazo de 1 hora. Todavfa en otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en el plazo de 30 minutos. En otras realizaciones, la etapa de hibridacion puede tener lugar en el plazo de 15 minutos. La etapa de hibridacion puede tener lugar incluso en el plazo de 10 minutos o en menos de 5 minutos. Las figuras 1 y 2 ilustran un transcurso de tiempo tfpico para aplicaciones de hibridacion realizadas en muestras histologicas y citologicas, respectivamente, que usan las composiciones de la invencion en comparacion con aplicaciones de hibridacion que usan composiciones tradicionales.

Ademas, las composiciones dadas a conocer permiten hibridaciones rapidas usando sondas o fragmentos de sondas mas largos, por ejemplo, sondas o fragmentos de sondas que comprenden 40-500 nucleotidos, sondas o fragmentos de sondas que comprenden 50-500 nucleotidos, o sondas o fragmentos de sondas que comprenden 50200 nucleotidos. En algunas realizaciones, pueden realizarse hibridaciones en menos de 8 horas. En otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en menos de 6 horas. Todavfa en otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en el plazo de 4 horas. En otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en el plazo de 3 horas. Aun en otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en el plazo de 2 horas. En otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en el plazo de 1 hora. Todavfa en otras realizaciones, la etapa de hibridacion se realiza en el plazo de 30 minutos. En otras realizaciones, la etapa de hibridacion puede tener lugar en el plazo de 15 minutos. La etapa de hibridacion puede tener lugar incluso en el plazo de 10 minutos o en menos de 5 minutos.

A medida que cambia el tiempo de hibridacion, tambien puede variarse la concentracion de sonda con el fin de producir senales fuertes y/o reducir el fondo. Por ejemplo, a medida que disminuye el tiempo de hibridacion, puede aumentarse la cantidad de sonda con el fin de mejorar la intensidad de senal. Por otra parte, a medida que disminuye el tiempo de hibridacion, puede disminuirse la cantidad de sonda con el fin de mejorar la tincion de fondo.

Las composiciones dadas a conocer tambien eliminan la necesidad de una etapa de bloqueo durante aplicaciones de hibridacion mejorando la senal y la intensidad de fondo mediante el bloqueo de, por ejemplo, secuencias repetitivas para el ADN diana. Por tanto, no hay necesidad de usar ADN humano total, ANP de bloqueo, ADN de COT-1 o ADN de cualquier otra fuente como agente de bloqueo. Ademas, los metodos de la invencion y las composiciones dadas a conocer muestran sorprendentemente niveles de fondo reducidos significativamente sin necesidad de hibridacion durante la noche en tampones que contienen formamida. Sin embargo, los niveles de fondo pueden reducirse adicionalmente anadiendo agentes que reducen la union no espedfica, tal como a la membrana celular, tal como pequenas cantidades de ADN humano total o ADN de origen no humano (por ejemplo, ADN de esperma de salmon) a una reaccion de hibridacion usando las composiciones de la invencion.

Las composiciones acuosas dadas a conocer en la solicitud proporcionan ademas la posibilidad para reducir considerablemente la concentracion de secuencias de acido nucleico incluidas en la composicion. Generalmente, la

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concentracion de sondas puede reducirse desde 2 hasta 8 veces en comparacion con concentraciones tradicionales. Por ejemplo, si se usan sondas de ADN de HER2 y sondas de ANP de CEN 17 en las composiciones de la invencion, sus concentraciones pueden reducirse en % y respectivamente, en comparacion con sus concentraciones en las composiciones de hibridacion tradicionales. Esta caractenstica, junto con la ausencia de cualquier necesidad de ADN de bloqueo, tal como COT1 o ANP de bloqueo, permite un volumen de sonda aumentado en sistemas de instrumento automatizado en comparacion con el volumen de 10 |il tradicional usado en los sistemas de composiciones tradicionales, lo que reduce la perdida debida a evaporacion, tal como se comenta en mas detalle a continuacion.

La reduccion de la concentracion de sonda tambien reduce el fondo. Sin embargo, la reduccion de la concentracion de sonda esta inversamente relacionada con el tiempo de hibridacion, es decir, cuanto menor es la concentracion, mayor es el tiempo de hibridacion requerido. No obstante, aunque se usan concentraciones extremadamente bajas de sonda con las composiciones acuosas de la invencion, el tiempo de hibridacion es todavfa mas corto que con las composiciones tradicionales.

Las composiciones dadas a conocer a menudo permiten mejores relaciones senal-ruido que las composiciones de hibridacion tradicionales. Por ejemplo, con determinadas sondas, una hibridacion de una hora con las composiciones de la invencion producira un fondo similar y senales mas fuertes que una hibridacion durante la noche en las composiciones tradicionales. No se observan fondos cuando no se anade sonda.

Tambien pueden cambiarse y optimizarse los metodos de ensayo tradicionales cuando se usan las composiciones dadas a conocer dependiendo de si el sistema es manual, semiautomatizado o automatizado. Por ejemplo, un sistema semiautomatizado o uno completamente automatizado se beneficiara de la eliminacion de una etapa de desnaturalizacion que es posible con las composiciones de la invencion. Estos cambios con respecto a los metodos de hibridacion tradicionales pueden reducir las dificultades encontradas cuando se usan las composiciones tradicionales en tales sistemas. Por ejemplo, un problema con los sistemas semiautomatizados y completamente automatizados es que puede producirse evaporacion significativa de la muestra durante la hibridacion, puesto que tales sistemas requieren pequenos volumenes de muestra (por ejemplo, 10-150 |il), temperaturas de desnaturalizacion elevadas, y tiempos de hibridacion prolongados (por ejemplo, 14 horas). Por tanto, son bastante invariables las proporciones de los componentes en las composiciones de hibridacion tradicionales. Sin embargo, puesto que las composiciones dadas a conocer permiten la eliminacion de una etapa de desnaturalizacion, se reduce la evaporacion, permitiendo la flexibilidad aumentada en las proporciones de los componentes en las composiciones de hibridacion usadas en sistemas semiautomatizados y completamente automatizados.

Por ejemplo, se han usado dos instrumentos automatizados para realizar hibridaciones usando las composiciones dadas a conocer en aplicaciones de hibridacion que tienen una etapa de desnaturalizacion tradicional. Se han usado composiciones que comprenden carbonato de etileno al 40% (v/v) en el aparato dado a conocer en la solicitud PCT DK2008/000430, y se han usado composiciones que comprenden carbonato de etileno al 15% (v/v) en el instrumento HYBRIMASTER HS-300 (Aloka CO. LTD, Japon). Cuando las composiciones de la invencion se usan en el instrumento HYBRIMASTER HS-300, el instrumento puede realizar una hibridacion FISH rapida con agua en lugar de la mezcla de formamida toxica tradicional, mejorando asf la seguridad y reduciendo la evaporacion. Si se adhieren tiras humedecidas con agua a la tapa en la parte interior de la unidad de reaccion del instrumento de Aloka (camara de hibridacion), por ejemplo, tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense n.° 11/031.514, la evaporacion se reduce incluso mas.

Otros problemas con el analisis de obtencion de imagenes automatizado son el numero de imagenes necesarias, la enorme cantidad de sitio de almacenamiento requerido y el tiempo requerido para tomar las imagenes. Las composiciones de la invencion abordan este problema produciendo senales muy fuertes en comparacion con las composiciones tradicionales. Debido a las senales muy fuertes producidas por las composiciones dadas a conocer, la obtencion de imagenes puede realizarse a menor ampliacion que la requerida para las composiciones tradicionales y todavfa puede detectarse y analizarse, por ejemplo, mediante algoritmos. Puesto que el plano focal se vuelve mas amplio con menor ampliacion, las composiciones de la invencion reducen o eliminan la necesidad de realizar cortes en serie de una muestra. Como resultado, la obtencion de imagenes global es mucho mas rapida, puesto que las composiciones dadas a conocer requieren menos cortes o no requiere cortes en serie y cada imagen cubre un area mucho mayor. Ademas, el tiempo global para el analisis es mas rapido, puesto que los archivos de imagenes totales son mucho mas pequenos.

Por tanto, los metodos de la invencion resuelven muchos de los problemas asociados con las composiciones y los metodos de hibridacion tradicionales.

La divulgacion puede entenderse mas claramente con la ayuda de los ejemplos no limitativos que siguen, que constituyen realizaciones preferidas de las composiciones segun la divulgacion. Aparte de en los ejemplos, o donde se indique de otra manera, ha de entenderse que todos los numeros que expresan cantidades de componentes, condiciones de reaccion, etc., usados en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones estan modificados en todos los casos por el termino “aproximadamente.” Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parametros numericos expuestos en la siguiente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que busca obtenerse en el presente documento. Como

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mmimo, y sin intentar limitar la aplicacion de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parametro numerico debe interpretarse a la luz del numero de d^gitos significativos y enfoques de redondeo ordinarios.

Pese a que los intervalos numericos y parametros que exponen el amplio alcance son aproximaciones, los valores numericos expuestos en el ejemplo espedfico se notifican de la manera mas precisa posible. Sin embargo, cualquier valor numerico contiene de manera inherente determinados errores necesarios que resultan de la desviacion estandar encontrada en sus mediciones de prueba respectivas. Los ejemplos que siguen ilustran la presente invencion.

Ejemplos

Ahora se hara referencia en detalle a realizaciones espedficas de la invencion. Aunque la invencion se describira conjuntamente con estas realizaciones, se entendera que no se pretende limitar la invencion a esas realizaciones. Al contrario, se pretende que la invencion cubra alternativas, modificaciones y equivalentes que pueden incluirse dentro de la invencion tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Los reactivos usados en los siguientes ejemplos son del kit Histology FISH Accessory (K5599) y el kit Cytology FISH Accessory (K5499) de Dako (Dako Denmark A/S, Glostrup, Dinamarca). Los kits contienen todos los reactivos clave, excepto la sonda, requeridos para completar un procedimiento de FISH para muestras de corte tisular incluidas en parafina, fijadas con formalina. Todas las muestras se prepararon segun la descripcion del fabricante. Se uso el dispositivo de hibridacion de Dako (S2451, Dako) para las etapas de digestion, desnaturalizacion e hibridacion.

Se realizo la evaluacion de portaobjetos de FISH en el plazo de una semana tras la hibridacion usando un microscopio de fluorescencia Leica DM6000B, equipado con filtros individuales de DAPI, FITC, rojo Texas y filtros dobles de FITC/rojo Texas con un objetivo con aceite 10x, 20x, 40x y 100x.

Se realizo la evaluacion de portaobjetos de CISH usando un microscopio optico Olympus BX51 con un objetivo 4x, 10x, 20x, 40x y 60x.

En los ejemplos que siguen, “sulfato de dextrano” se refiere a la sal de sodio de sulfato de dextrano (D8906, Sigma) que tiene un peso molecular Mw > 500.000. Todas las concentraciones de disolventes aproticos polares se facilitan como porcentajes en v/v. Tampon fosfato se refiere a una disolucion tamponada con fosfato que contiene NaH2PO4, 2H2O (fosfato de sodio dibasico dihidratado) y Na2HPO4, H2O (fosfato de sodio monobasico monohidratado). Tampon citrato se refiere a una disolucion tamponada con citrato que contiene citrato de sodio (Na3C6HsO7, 2H2O; 1.06448, Merck) y acido dtrico monohidratado (C6H8O7, H2O; 1.00244, Merck).

Procedimiento de FISH/CISH de histologia general para los ejemplos 1-20

Se calentaron en estufa los portaobjetos con cortes de alineamiento tisular multiple incluidos en parafina fijados con formalina (FFPE) cortados de seres humanos (amfgdalas, carcinoma de mama, rinon y colon) a 60°C durante 30-60 min, se desparafinaron en banos de xileno, se rehidrataron en banos de etanol y luego se transfirieron a tampon de lavado. Entonces se pretrataron las muestras en disolucion de pretratamiento a un mmimo de 95°C durante l0 min y se lavaron 2 x 3 min. Entonces se digirieron las muestras con pepsina RTU a 37°C durante 3 min, se lavaron 2 x 3 min, se deshidrataron en una serie de evaporaciones de etanol y se secaron al aire. Entonces se incubaron las muestras con 10 |il de sonda de FISH tal como se describe en los experimentos individuales. Entonces se lavaron las muestras mediante lavado en condiciones de rigurosidad a 65°C 10 min, luego se lavaron 2 x 3 min, luego se deshidrataron en una serie de evaporaciones de etanol y se secaron al aire. Finalmente, se montaron los portaobjetos con 15 |il de medio de montaje Antifade. Cuando se completo la tincion, observadores capacitados para evaluar la intensidad de senal, la morfologfa y el fondo de los portaobjetos tenidos realizaron la puntuacion.

Procedimiento de FISH de citologia general para los ejemplos 21-22

Se fijaron portaobjetos con preparaciones en metafase en formaldetndo al 3,7% durante 2 min, se lavaron 2 x 5 min, se deshidrataron en una serie de evaporaciones de etanol y se secaron al aire. Entonces se incubaron las muestras con 10 |il de sonda de FISH tal como se describe en los experimentos individuales. Entonces se lavaron las muestras mediante lavado en condiciones rigurosas a 65°C 10 min, luego se lavaron 2 x 3 min, luego se deshidrataron en una serie de evaporaciones de etanol y se secaron al aire. Finalmente, se montaron los portaobjetos con 15 |il de medio de montaje Antifade. Cuando se completo la tincion, observadores capacitados para evaluar la intensidad de senal y el fondo de los portaobjetos tenidos realizaron la puntuacion tal como se describe en las directrices de puntuacion para cortes tisulares.

Procedimiento de FISH/CISH de histologia general para los ejemplos 23-29 y 31-32

Se calentaron en estufa portaobjetos con cortes de alineamiento tisular multiple incluidos en parafina fijados con formalina (FFPE) cortados de seres humanos (amfgdalas, carcinoma de mama, rinon y colon) a 60°C durante 30-60 min, se desparafinaron en banos de xileno, se rehidrataron en banos de etanol y luego se transfirieron a tampon de lavado. Entonces se pretrataron las muestras en disolucion de pretratamiento a un mmimo de 95°C durante 10 min y

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se lavaron 2 x 3 min. Entonces se digirieron las muestras con pepsina RTU a 37°C durante 3 min, se lavaron 2 x 3 min, se deshidrataron en una serie de evaporaciones de etanol y se secaron al aire. Entonces se incubaron las muestras con 10 |il de sonda de FISH tal como se describe en los experimentos individuales. Entonces se lavaron las muestras con tampon de lavado en condiciones de rigurosidad a 65°C 10 min, luego se lavaron en tampon de lavado durante 2 x 3 min, luego se deshidrataron en una serie de evaporaciones de etanol y se secaron al aire. Finalmente, se montaron los portaobjetos con 15 |il de medio de montaje Antifade. Cuando se completo la tincion, observadores capacitados para evaluar la intensidad de senal, la morfologfa y el fondo de los portaobjetos tenidos realizaron la puntuacion.

Procedimiento de FISH de citologia general para el ejemplo 30

Se fijaron portaobjetos con preparaciones en metafase en formaldetudo al 3,7% durante 2 min, se lavaron 2 x 5 min. Para el ejemplo 32, se digirieron algunas de las muestras con pepsina (vial 2, K5599, Dako) a 37°C durante 2 min y se lavaron 2 x 5 min. Se deshidrataron todas las muestras en una serie de evaporaciones de etanol y se secaron al aire. Entonces se incubaron las muestras con 10 |il de sonda de FISH tal como se describe en los experimentos individuales. Entonces se lavaron las muestras en tampon de lavado en condiciones de rigurosidad a 65°C 10 min, luego se lavaron en tampon de lavado 2 x 3 min, luego se deshidrataron en una serie de evaporaciones de etanol y se secaron al aire. Finalmente, se montaron los portaobjetos con 15 |il de medio de montaje Antifade. Cuando se completo la tincion, observadores capacitados para evaluar la intensidad de senal y el fondo de los portaobjetos tenidos realizaron la puntuacion tal como se describe en las directrices de puntuacion para cortes tisulares.

Directrices de puntuacion para cortes tisulares

Se evaluaron las intensidades de senal en una escala de 0-3 significando 0 ausencia de senal y equivaliendo 3 a una senal fuerte. Se evaluaron las estructuras celulares/tisulares en una escala de 0-3 significando 0 sin estructura y sin lfmites de nucleos y equivaliendo 3 a estructura intacta y lfmites de nucleos claros. Entre 0 y 3 hay grados adicionales de 0,5 a partir de los cuales el observador puede evaluar la intensidad de senal, la estructura tisular y el fondo.

La intensidad de senal se puntua a partir de un sistema graduado en una escala de 0-3.

0 No se observa senal.

1 La intensidad de senal es debil.

2 La intensidad de senal es moderada.

3 La intensidad de senal es fuerte.

El sistema de puntuacion permite el uso de A grados.

La estructura tisular y nuclear se puntua a partir de un sistema graduado en una escala de 0-3.

0 Las estructuras tisulares y los lfmites nucleares estan completamente destruidos.

1 Las estructuras tisulares y/o los lfmites nucleares son escasos. Este grado incluye situaciones en las que algunas zonas tienen nucleos vacfos.

2 Se observan estructuras tisulares y/o lfmites nucleares, pero los lfmites nucleares no estan claros. Este grado incluye situaciones donde algunos nucleos estan vacfos.

3 Las estructuras tisulares y los lfmites nucleares estan intactos y son claros.

El sistema de puntuacion permite el uso de A grados.

El fondo se puntua a partir de un sistema graduado en una escala de 0-3.

0 Se observa poco o ningun fondo.

1 Algo de fondo.

2 Fondo moderado.

3 Alto fondo.

El sistema de puntuacion permite el uso de A grados.

Ejemplo 1

Este ejemplo compara la intensidad de senal y la morfologfa celular de muestras tratadas con las composiciones

dadas a conocer o disoluciones de hibridacion tradicionales en funcion de la temperatura de desnaturalizacion.

Composicion I de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, formamida al 40% (15515-026, Invitrogen), ANP de bloqueo 5 pM (vease Kirsten Vang Nielsen et al., PNA Suppression Method Combined with Fluorescence In situ Hybridisation (FISH) Technique inPRINS and PNA Technologies in 5 Chromosomal Investigation, capftulo 10 (ed. Franck Pellestor) (Nova Science Publishers, Inc. 2006)), sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (RP11-1143E20, tamano 192 kb).

Composicion II de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de etileno al 40% (03519, Fluka), ANP de bloqueo 5 pM, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (RP11-1143E20, tamano 192 kb).

10 Se mezclaron, si estaban presentes, fases de diferente viscosidad antes de su uso. Se desnaturalizaron las sondas de FISH tal como se indica durante 5 min y se hibridaron a 45°C durante 60 minutos.

Resultados:

Temperatura de desnaturalizacion

Senal Morfologfa celular

(I) Formamida

(II) EC Formamida EC

72°C

0 2 Buena Buena

82°C

/ 3 Buena Buena

92°C

/ 3 No buena No buena

Las senales que puntuaron como “3" fueron claramente visibles en un objetivo x20.

Ejemplo 2

15 Este ejemplo compara la intensidad de senal y la tincion de fondo de muestras tratadas con las composiciones dadas a conocer o disoluciones de hibridacion tradicionales en funcion del tiempo de hibridacion.

Composicion I de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, formamida al 40%, ANP de bloqueo 5 pM, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 10 ng/pl.

Composicion II de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de 20 etileno al 40%, ANP de bloqueo 5 pM, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 10 ng/pl.

Se mezclaron, si estaban presentes, fases de diferente viscosidad antes de su uso. Las sondas de FISH se incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 14 horas, 4 horas, 2 horas, 60 minutos, 30 minutos, 15 minutos, 0 minutos.

Resultados:

Tiempo de hibridacion

Senal Tincion de fondo

(I) Formamida

(II) EC Formamida EC

14 horas

3 3 +/ +2

4 horas

1 3 +/ + 1

2 horas

/ 3 +0 + 1

60 min.

/ 3 +0 + 1

30 min.

0 2 / +0 + 1

15 min.

0 2 +0 + 1

0 min.

0 1 +0 +/

25 Las senales que puntuaron como “3" fueron claramente visibles en un objetivo x20.

Ejemplo 3

Este ejemplo compara la intensidad de senal de muestras tratadas con las composiciones dadas a conocer que tienen diferentes disolventes aproticos polares o disoluciones de hibridacion tradicionales.

Composicion I de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, formamida al 30 40%, ANP de bloqueo 5 pM, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 10 ng/pl.

Composicion II de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de etileno al 40% (EC), ANP de bloqueo 5 pM, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 10 ng/pl.

Composicion III de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de propileno al 40% (PC) (540013, Aldrich), ANP de bloqueo 5 pM, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo 35 Texas 10 ng/pl.

Composicion IV de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCI 300 mM, tampon fosfato 5 mM, sulfolano al 40% (SL) (T22209, Aldrich), ANP de bloqueo 5 pM, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 10 ng/pl.

Composicion V de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, acetato de nitrilo al 40% (AN) (C02CIIX, Lab-Scan), ANP de bloqueo 5 pM, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo 5 Texas 10 ng/pl.

Composicion VI de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, y-butirolactona al 40% (GBL) (B103608. Aldrich), ANP de bloqueo 5 pM, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 7,5 ng/pl.

Se mezclaron, si estaban presentes, fases de diferente viscosidad antes de su uso. Las sondas de FISH se 10 incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 60 minutos.

Resultados:

Senal

(I) Formamida

(II) EC (III) PC (IV) SL (V) AN (VI) GBL

A

3 3 3 2 3

Las senales que puntuaron como “3" fueron claramente visibles en un objetivo x20.

Ejemplo 4

Este ejemplo compara la intensidad de senal de muestras tratadas con las composiciones dadas a conocer que 15 tienen diferentes concentraciones de disolvente aprotico polar.

Composiciones de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de etileno al 10-60% (tal como se indica), ANP de bloqueo 5 pM, sonda de gen de aDn constante para IGK marcada con rojo Texas 7,5 ng/pl ((CTD- 3050E15, RP11-1083E8; tamano 227 kb) y sonda de ADN de gen variable para IGK marcada con FITC 7,5 ng/pl (CTD-2575M21, RP11-122B6, RP11-316G9; tamano 350 y 429 kb).

20 Se mezclaron, si estaban presentes, fases de diferente viscosidad antes de su uso. Las sondas de FISH se incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 60 minutos.

Resultados:

Carbonato de etileno (EC)

10%

20% 30% 40% 60%

Intensidad de senal

rojo Texas 1 A 2 3 3 2

FITC

1 1 A 2 2 A 2

Las senales que puntuaron como “3" fueron claramente visibles en un objetivo x20

Ejemplo 5

25 Este ejemplo compara la intensidad de senal y la intensidad de fondo de muestras tratadas con las composiciones con y sin bloqueo de ANP.

Composiciones de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de etileno al 40%, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 7,5 ng/pl.

Se mezclaron, si estaban presentes, fases de diferente viscosidad antes de su uso. Las sondas de FISH se 30 incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 60 minutos.

Resultados:

Carbonato de etileno (EC)

Bloqueo de ANP

Sin bloqueo de ANP

Intensidad de senal

3 3

Intensidad de fondo

A + A +

Las senales que puntuaron como “3" fueron claramente visibles en un objetivo x20 Ejemplo 6

Este ejemplo compara la intensidad de senal de muestras tratadas con las composiciones dadas a conocer en 35 funcion de la concentracion de la sonda y el tiempo de hibridacion.

Composiciones de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de

5

10

15

20

25

etileno al 40%, y sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 10, 7,5, 5 o 2,5 ng/pl (tal como se indica).

Se mezclaron, si estaban presentes, fases de diferente viscosidad antes de su uso. Las sondas de FISH se incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 3 horas, 2 horas y 1 hora.

Resultados:

Tiempo de hibridacion

Intensidad de senal

(I) (II) (III) (IV)

10 ng/pl 7,5ng/pl 5 ng/pl 2,5 ng/pl

3 horas

3 3 3 3

2 horas

3 3 3 1

1 hora

3 3 3 A

Las senales que puntuaron como “3" fueron claramente visibles en un objetivo x20 Ejemplo 7

Este ejemplo compara la intensidad de senal de muestras tratadas con las composiciones dadas a conocer en funcion de las concentraciones de tampon, fosfato y sal.

Composiciones de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, ([NaCl], [tampon fosfato], [tampon TRIS] tal como se indica en los resultados), carbonato de etileno al 40%, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 7,5 ng/pl.

Se mezclaron, si estaban presentes, fases de diferente viscosidad antes de su uso. Las sondas de FISH se incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 60 minutos.

Resultados:

[NaCl]

300 mM

100 mM 0 mM

Intensidad de senal fosfato [0 mM]

2 1 A

Intensidad de senal fosfato [5 mM]

3 2A A

Intensidad de senal fosfato [35 mM]

- - 3

Intensidad de senal TRIS [40 mM]

- - 2

Las senales que puntuaron como “3" fueron claramente visibles en un objetivo x20.

Ejemplo 8

Este ejemplo compara la intensidad de senal de muestras tratadas con las composiciones dadas a conocer en funcion de la concentracion de sulfato de dextrano.

Composiciones de sonda de FISH: 0, 1, 2, 5, o sulfato de dextrano al 10% (tal como se indica), NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de etileno al 40%, sonda de ADN de gen SIL-TAL1 marcada con rojo Texas 5 ng/pl (RP1-278O13; tamano 67 kb) y FITC SIL-TAL1 6 ng/pl (ICRFc112-112C1794, RP11-184J23, RP11-8J9, CTD- 2007B18, 133B9; tamano 560 kb).

Se mezclaron, si estaban presentes, fases de diferente viscosidad antes de su uso. Las sondas de FISH se incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 60 minutos. Sin bloqueo.

Resultados:

% de sulfato de dextrano

Sonda de Intensidad de senal roio Texas Sonda de FITC

0%

1 1

1%

1 1

2%

1A 1A

5%

2 2A

10%

2 2A

NOTA: este experimento no produjo resultados que puntuaron como “3” porque la sonda marcada con rojo Texas de SIL-TAL1 es de solamente 67 kb y fue a partir de una preparacion no optimizada.

5

10

15

20

25

30

35

40

Este ejemplo compara la intensidad de senal de muestras tratadas con las composiciones dadas a conocer en funcion de las concentraciones disolvente aprotico polar, fosfato, sal y sulfato de dextrano.

Composicion Ia de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 34%, NaCl 0 mM, tampon fosfato 0 mM, carbonato de etileno al 0%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Composicion Ib de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 34%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de etileno al 0%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Composicion Ic de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 34%, NaCl 600 mM, tampon fosfato 10 mM, carbonato de etileno al 0%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Composicion IIa de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 32%, NaCl 0 mM, tampon fosfato 0 mM, carbonato de etileno al 5%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Composicion IIb de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 32%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de etileno al 5%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Composicion IIc de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 32%, NaCl 600 mM, tampon fosfato 10 mM, carbonato de etileno al 5%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Composicion IIIa de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 30%, NaCl 0 mM, tampon fosfato 0 mM, carbonato de etileno al 10%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Composicion IIIb de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 30%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de etileno al 10%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Composicion I IIc de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 30%, NaCl 600 mM, tampon fosfato 10 mM, carbonato de etileno al 10%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Composicion IVa de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 28%, NaCl 0 mM, tampon fosfato 0 mM, carbonato de etileno al 15%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Composicion IVb de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 28%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de etileno al 15%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Composicion IVc de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 28%, NaCl 600 mM, tampon fosfato 10 mM, carbonato de etileno al 15%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl (tamano 218 kb) y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM.

Referencia V de sonda de FISH: vial de venta convencional de mezcla de sondas PharmDx de HER2 (K5331, Dako) que contiene ANP de bloqueo. Hibridacion durante la noche durante 20 horas.

Todas las composiciones estuvieron presentes como fase unica. Las sondas de FISH se incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 60 minutos sin bloqueo, excepto para la referencia V de sonda de FISH, que tema bloqueo de ANP y se hibrido durante 20 horas.

Resultados:

Intensidad de senal

Sondas de ADN Sondas de ANP

Composicion Ia

0 /

Composicion Ib

0 /

Composicion Ic

/ 2 /

Composicion IIa

/ 3

Composicion IIb

1 2

Composicion IIc

/ 3

Composicion IIIa

1 2 /

Composicion IIIb

1 / 2 /

Composicion IIIc

2 3

Composicion IVa

2 / - 3 3

Composicion IVb

3 3

Composicion IVc

3 3

Referencia V

2 2 /

NOTA: La composicion IVa produjo fuertes senales de ADN sin sal. Esto no es posible con composiciones de FISH convencionales, donde la union al ADN es dependiente de la sal.

Ejemplo 10

Este ejemplo compara la intensidad de senal de muestras tratadas con las composiciones dadas a conocer en 5 funcion de la concentracion de sulfato de dextrano y disolvente aprotico polar en condiciones altas de sal (normal x4).

Composicion I de sonda de FISH: carbonato de etileno al 0%, sulfato de dextrano al 29%, NaCl 1200 mM, tampon fosfato 20 mM, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM. La composicion fue una unica fase.

10 Composicion II de sonda de FISH: carbonato de etileno al 5%, sulfato de dextrano al 27%, NaCl 1200 mM, tampon fosfato 20 mM, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM. La composicion fue una unica fase.

Composicion III de sonda de FISH: carbonato de etileno al 10%, sulfato de dextrano al 25%, NaCl 1200 mM, tampon fosfato 20 mM, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl y sonda de ANP de CEN-7 marcada 15 con FITC 50 nM. La composicion fue una unica fase.

Composicion IV de sonda de FISH (no sometida a prueba): carbonato de etileno al 20%, sulfato de dextrano al 21%, NaCl 1200 mM, tampon fosfato 20 mM, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 10 ng/pl y sonda de ANP de CEN-7 marcada con FITC 50 nM. La composicion tuvo dos fases.

Resultados:

Intensidad de senal

Sondas de ADN Sondas de ANP

Composicion I

/ 3

Composicion II

2 2 /

Composicion III

3 3

Composicion IV

- -

20 Nota: La composicion II produjo buenas senales de ADN con solamente EC al 5% y fuertes senales de ADN con EC al 10%.

Ejemplo 11

Este ejemplo compara la intensidad de senal y de fondo de muestras tratadas con diferentes fases de las composiciones dadas a conocer.

25 Composicion de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, carbonato de etileno al 40%, sonda de ADN de gen HER2 marcada con rojo Texas 8 ng/pl y sonda de ANP de CEN-17 marcada con FITC 600 nM. Las sondas de FISH se incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 60 minutos. Sin bloqueo.

Resultados:

Intensidad de senal

Sonda de ADN Sonda de ANP Fondo

Fase superior

3 1 / +2

Fase inferior

3 2 / + 1

Mezcla de las fases superior e inferior

2 / 3 +/

30 NOTA: la fase superior tuvo mas fondo que la fase inferior en estos experimentos.

Ejemplo 12

Este ejemplo es similar al ejemplo previo, pero usa una sonda diferente de ADN y GBL en lugar de EC.

Composicion de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, GBL al 40%,

5

10

15

20

25

30

sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 10 ng/|il y sonda de ANP de CEN-17 marcada con FITC 600 nM.

Las sondas de FISH se incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 60 minutes. Sin bloqueo.

Resultados:

Intensidad de senal Fondo

Sonda de ADN

Sonda de ANP

Fase de arriba

3 0 - A + 1 A

Fase de abajo

2 A +3

Fases mezcladas

2 A A +2 A

Ejemplo 13

Este ejemplo examina el numero de fases en las composiciones dadas a conocer en funcion de la concentracion de sulfato de dextrano y disolvente aprotico polar.

Composiciones de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10 o al 20%; NaCl 300 mM; tampon fosfato 5 mM; EC al 0, al 5, al 10, al 15, al 20, al 25, al 30%; sonda 10 ng/pl.

Resultados:

% de EC

Numero de fases dextrano al 10% Numero de fases dextrano al 20%

0

1 1

5

1 1

10

1 1

15

1 1

20

2 2

25

2 2

30

2 2

NOTA: EC al 15%, sulfato de dextrano al 20% producen las mejores intensidades de senal altas de la disolucion de una fase anterior. EC al 20% de dos fases tiene incluso densidades de senal mas altas que al 15%. (Datos no mostrados).

Ejemplo 14

Este ejemplo compara la intensidad de senal y de fondo de muestras tratadas con diferentes composiciones dadas a conocer en funcion de la concentracion de la sonda y el tiempo de hibridacion.

Composicion I de sonda de FISH: sonda de ADN marcada con RojoTx de HER2 10 ng/|il (concentracion convencional) y concentracion convencional de sonda de ANP marcada con FITC de CEN7 (50 nM); EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon fosfato 10 mM.

Composicion II de sonda de FISH: sonda de ADN marcada con RojoTx de HER2 5 ng/|il (A de la concentracion convencional) y concentracion convencional (50 nM) de sondas de ANP de CEN7 marcadas con FITC; EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon fosfato 10 mM.

Composicion III de sonda de FISH: sonda de ADN marcada con RojoTx de HER2 2,5 ng/|il (1/4 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (25 nM) de sondas de ANP de CEN7; EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon fosfato 10 mM.

Las composiciones I-III existieron como unica fase. Las sondas de FISH se incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 3 horas, 2 horas y 1 hora.

Resultados:

Tiempo de hibridacion

Intensidad de senal

I ADN ANP B.G.

II ADN ANP B.G. III ADN ANP B.G.

3 horas

3 3 +3 3 3 +2,5 3 3 + 1,5

2 horas

2,5 2,5 +3 3 3 +3 3 3 + 1,5

1 hora

2,5 2,5 +3 3 3 + 1,5 2,5 3 + 1

Las senales que puntuaron como “3" fueron claramente visibles en un objetivo x20.

5

10

15

20

25

30

35

Este ejemplo compara la intensidad de senal y de bloqueo de muestras tratadas con las composiciones dadas a conocer en funcion del agente de bloqueo.

Composiciones de sonda de FISH: EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon fosfato 10 mM; sonda de ADN marcada con RojoTx de HER2 2,5 ng/U (1/4 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) sonda de ANP de CEN 17 marcada con FITC. Se bloquearon las muestras con: (a) nada; (b) COT1 0,1 mg/ul (15279-011, Invitrogen); (c) COT1 0,3 mg/ul; o (d) ADN humano total 0,1 mg/ul antes de la hibridacion usando las composiciones de la invencion.

Todas las muestras estuvieron presentes como unica fase. Las sondas de FISH se incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 60 minutos.

Resultados:

Agente de bloqueo

Fondo Intensidad de senal ADN ANP

Nada

+ 1-1,5 3 2,5

COT 1 0,1 mg/ul

+ 1 3 2,5

COT 1 0,3 mg/ul

+ 1,5 3 2,5

ADN humano total 0,1 mg/ul

+A 3 2,5

NOTA: Los niveles de fondo sin bloqueo son significativamente inferiores que los que se observan normalmente mediante FISH convencional sin bloqueo. En cambio, si una composicion de FISH convencional no contiene un agente de bloqueo, las senales no pueden leerse normalmente.

Ejemplo 16

Este experimento compara diferentes formas de retirar la tincion de fondo usando las composiciones dadas a conocer.

Todas las composiciones conteman EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM, tampon fosfato 10 mM, sondas de ADN de HER2 2,5 ng/U (1/4 de la concentracion convencional), sonda de ANP de CEN 17 300 nM (1/2 de la concentracion convencional), y uno de los siguientes agentes reductores de fondo:

A) ANP de bloqueo 5 pM (vease Kirsten Vang Nielsen et al., PNA Suppression Method Combined with Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) Technique inPRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation, capttulo 10 (ed. Franck Pellestor) (Nova Science Publishers, Inc. 2006))

B) ADN de COT-1 0,1 pg/pl

C) ADN humano total 0,1 pg/pl (THD) (THD sin marcar sonicado)

D) ADN de esperma de salmon sometido a cizalladura 0,1 pg/pl (AM9680, Ambion)

E) ADN de timo de ternero 0,1 pg/pl (D8661, Sigma)

F) ADN de esperma de arenque 0,1 pg/pl (D7290, Sigma)

G) formamida al 0,5%

H) formamida al 2%

I) etilenglicol al 1% (1,09621, Merck)

J) glicerol al 1% (1,04095, Merck) B.G.: Back ground.

K) 1,3-Propanodiol al 1%(533734, Aldrich)

L) H2O al 1%(control)

Todas las muestras estuvieron presentes como unica fase. Las sondas se incubaron a 82°C durante 5 minutos y luego a 45°C en cortes tisulares FFPE durante 60 y 120 minutos.

Resultados:

Bloqueo de fondo

Hibridacion/min Fondo Intensidad de senal ADN ANP

ANP de bloqueo

60 + 1 3 2,5

ANP de bloqueo

120 + 1-1 A 3 2,5

COT-1

60 +A 3 2,5

COT-1

120 +0-/ 3 2,5

THD

60 +0 3 3

THD

120 +/ 3 2,5

Esperma de ADN de salmon

60 +0 3 3

Esperma de ADN de salmon

120 +0 3 3

ADN de timo de ternero

60 +0 2,5 3

ADN de timo de ternero

120 +/ 3 2,5

ADN de esperma de arenque

60 +0 3 3

ADN de esperma de arenque

120 +/ 2,5 3

Formamida al 0,5%

60 +0 2,5 3

Formamida al 0,5%

120 +0 3 3

Formamida al 2%

60 +/ 2,5 3

Formamida al 2%

120 +/ 3 3

Etilenglicol al 1%

60 +/ 2,5 3

Etilenglicol al 1%

120 + 1 / 3 2,5

Glicerol al 1%

60 +/ 0,5 3

Glicerol al 1%

120 + 1 3 2,5

1,3-Propanodiol al 1%

60 +0 3 2,5

1,3-Propanodiol al 1%

120 + 1 3 2,5

Nada

60 + 1 2,5 2,5

Nada

120 + 1 / 3 2,5

NOTA: todos los reactivos reductores de fondo, excepto ANP de bloqueo, mostraron un efecto en la reduccion de fondo. Por tanto, no se requiere bloqueo espedfico frente a secuencias de ADN repetitivas.

Ejemplo 17

Este experimento compara la intensidad de senal de las fases superior e inferior usando dos disolventes aproticos 5 polares diferentes.

Composicion I de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, tritiocarbonato de etileno al 40% (ET) (E27750, Aldrich), ANP de bloqueo 5 pM, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 10 ng/pl.

Composicion II de sonda de FISH: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, sulfito de glicol 10 al 40% (GS) (G7208, Aldrich), ANP de bloqueo 5 pM, sonda de ADN de gen CCND1 marcada con rojo Texas 10 ng/pl.

Las sondas de FISH se incubaron a 82°C durante 5 min y luego a 45°C durante 60 minutos.

Resultados:

Intensidad de senal

I (ET)

II (GS)

Fase superior 1

/ 0

Fase inferior

0 3

Mezcla de las fases superior e inferior

2 / 3

Ejemplo 18.

15 Este experimento examina la capacidad de diversos disolventes aproticos polares para formar un sistema de una fase.

Todas las composiciones conteman: sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM, tampon fosfato 10 mM, y o bien el 10, el 15, el 20 o bien el 25% de uno de los siguientes disolventes aproticos polares:

Sulfolano

20 y-Butirolactona

Tritiocarbonato de etileno Sulfito de glicol

5

10

15

20

25

30

35

Carbonato de propileno

Resultados: todos los disolventes aproticos polares a todas las concentraciones examinadas produjeron al menos un sistema de dos fases en las composiciones usadas. Sin embargo, esto no excluye que estos compuestos puedan producir un sistema de una fase en otras condiciones de composicion.

Ejemplo 19

Este experimento examina el uso de las composiciones dadas a conocer en analisis de hibridacion in situ cromogenica (CISH) en cortes tisulares FFPE multiples.

Composicion de sonda de FISH I: sonda de ADN de gen marcada con FITC de TCRAD 4,5 ng/|il (1/4 de la concentracion convencional) (RP11-654A2, RP11-246A2, CTP-2355L21, RP11-158G6, RP11-780M2, RP11- 481C14; tamano 1018 kb); eC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Composicion de sonda de FISH II: sonda de ADN de gen marcada con FITC de TCRAD 4,5 ng/|il (1/4 de la concentracion convencional) (tamano 1018 kb); EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0; ADN de esperma de salmon sometido a cizallamiento 0,1 ug/ul.

Composicion de sonda de FISH III: 300 nM de cada sonda individual de CEN 17 de ANP marcada con FITC (1/2 de la concentracion convencional); EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Todas las muestras se analizaron usando el protocolo DuoCISH de Dako (SK108) y composiciones para sondas divididas con la excepcion de que el lavado en condiciones de rigurosidad se llevo a cabo durante 20 minutos en lugar de 10 minutos, y sin usar la etapa de cromogeno rojo DuoCISH.

Resultados:

Intensidad de senal

Composicion

ADN con FITC ANP con FITC

I

3 -

II

3 -

III

- 3

Nota: Las intensidades de senal fueron muy fuertes. Debido a los altos niveles de fondo, no fue posible distinguir si la adicion de ADN de esperma de salmon en la composicion II redujo el fondo. Las senales fueron claramente visibles usando un objetivo x10 en, por ejemplo, amfgdalas, que en general teman menos fondo. Si los tejidos posefan fondo altos, las senales fueron claramente visibles usando un objetivo x20.

Ejemplo 20

Este ejemplo compara la intensidad de senal y el fondo de cortes tisulares FFPE tratados con las composiciones dadas a conocer con dos sondas de ADN.

Composicion de sonda de FISH I: sonda de ADN de gen marcada con FITC de IGH 9 ng/|il (RP11-151B17, RP11- 112H5, RP11-101G24, RP11-12F16, RP11-47P23, CTP-3087C18; tamano 612 kb); sonda de ADN marcada con rojo Tx MYC 6,4 ng/|il (CTD-2106F24, CTD-2151C21, CTD-2267H22; tamano 418 kb); EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Composicion de sonda de FISH II: sonda de ADN de gen marcada con FITC IGH 9 ng/|il; sonda de ADN marcada con rojo Tx MYC 6,4 ng; EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0; ADN de esperma de salmon sometido a cizallamiento 0,1 ug/ul.

Intensidad de senal

ADN de salmon

Sonda de FITC Sonda de rojo Texas Fondo

-

2 A 2 A +2,5

+

3 3 + 1,5

NOTA: el fondo alto se debio probablemente al hecho de que se usaron concentraciones de sonda convencionales. Ejemplo 21

Este experimento examina el uso de las composiciones dadas a conocer en muestras citologicas.

Composicion de sonda de FISH: EC al 15%; sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon fosfato 10 mM; sonda de ADN marcada con rojo Tx de HER2 5 ng/|il (1/2 de la concentracion convencional) y A de la concentracion

5

10

15

20

25

30

35

convencional de CEN7 (25 nM).

Las sondas de FISH se incubaron sobre extensiones cromosomicas en metafase a 82°C durante 5 minutos, luego a 45°C durante 30 minutos, todo sin bloqueo.

Resultados:

Intensidad de senal

Fondo

Sonda de ADN

Sonda de ANP

3

3

+ 1

No se observo bandeo cromosomico (patron de bandeo R) con las composiciones de la invencion, a diferencia de con las disoluciones de ISH tradicionales, que normalmente muestran bandeo R. Se observo una baja tincion de fondo roja homogenea de los cromosomas en metafase y nucleos en interfase.

Ejemplo 22

Este ejemplo compara la intensidad de senal y el fondo de sondas de ADN en muestras citologicas, extensiones en metafase, con y sin bloqueo.

Composicion de sonda de FISH I: sonda de ADN de gen marcada con rojo Texas de TCRAD 6 ng/ul (concentracion convencional) (CTP- 31666K20, CTP-2373N7; tamano 301 kb) y sonda de ADN de gen marcada con FITC 4,5 ng/ul (1/4 de la concentracion convencional); EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Composicion de sonda de FISH II: sonda de ADN de gen marcada con rojo Texas TCRAD 6 ng/ul (concentracion convencional) (tamano 301 kb) y sonda de ADN de gen marcada con FITC 4,5 ng/ul (1/4 de la concentracion convencional); EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0; ADN de esperma de salmon sometido a cizallamiento 0,1 ug/ul.

Las sondas de FISH se incubaron sobre extensiones en metafase a 82°C durante 5 min, luego a 45°C durante 60 min.

Resultados:

Agente de bloqueo

Fondo Intensidad de senal Rojo Tx FITC

Nada

+0 3 3

ADN de salmon 0,1 ug/ul

+0 3 3

De nuevo, no se observo bandeo cromosomico (patron de bandeo R) con las composiciones de la invencion. Ademas, no se observo tincion de fondo de los cromosomas en metafase o nucleos en interfase.

Ejemplo comparativo 23

Este ejemplo compara la intensidad de senal y el fondo en funcion de la desnaturalizacion a temperaturas y tiempos diferentes.

Composicion de sonda de FISH: sonda de ADN marcada con rojo Tx de HER2 2,5 ng/ul (1/4 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC; EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Los portaobjetos se desnaturalizaron tal como se indica en la tabla y se hibridaron a 45°C durante 60 min. Resultados:

Temperatura de desnaturalizacion

Tiempo de desnaturalizacion Fondo Intensidad de senal ADN ANP

82°C

5 min +3 3 3

82°C

10 min +2 A 3 3

72°C

10 min + 1A 3 3

62°C

10 min +A CO CM 3

Estos resultados muestran que el fondo fue significativamente menor cuando se desnaturalizaron las muestras a 72°C y 62°C durante 10 min, en comparacion con 82°C durante 5 y 10 min Por tanto, las composiciones de la invencion producen senales fuertes con fondo mejorado a temperaturas de desnaturalizacion mas bajas.

Ejemplo comparativo 24

5

10

15

20

25

30

35

Este ejemplo compara la intensidad de senal y el fondo en funcion de la desnaturalizacion a temperaturas y tiempos diferentes.

Composicion de sonda de FISH: sonda de ADN marcada con rojo Tx de HER2 2,5 ng/|il (1/4 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC; EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Los portaobjetos se desnaturalizaron tal como se indica en la tabla y se hibridaron a 45°C durante 60 min. Resultados:

Temperatura de desnaturalizacion

Tiempo de desnaturalizacion Fondo ADN Intensidad de senal ANP

82°C

5 min +2A 3 3

72°C

10 min + 1 3 3

67°C

10 min +A 3 3

62°C

10 min + 1 3 3

Estos resultados muestran que el fondo fue significativamente menor cuando las muestras se desnaturalizaron a 72, 67 y 62°C durante 10 min, en comparacion con 82°C durante 5 min Por tanto, las composiciones de la invencion producen senales fuertes con fondo mejorado a temperaturas de desnaturalizacion mas bajas.

Ejemplo comparativo 25

Este ejemplo compara la intensidad de senal y el fondo en funcion de la desnaturalizacion a temperaturas y tiempos diferentes.

Composicion de sonda de FISH: sonda de ADN marcada con rojo Tx de HER2 2,5 ng/|il (1/4 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC; EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Los portaobjetos se desnaturalizaron tal como se indica en la tabla y se hibridaron a 45°C durante 60 min. Resultados:

Temperatura de desnaturalizacion

Tiempo de desnaturalizacion Fondo ADN Intensidad de senal ANP

82°C

5 min +2 3 3

72°C

15 min + 1 3 2 A

67°C

15 min +3 3 2 A

62°C

15 min +3 3 3

Estos resultados muestran que el fondo fue mas alto cuando las muestras se desnaturalizaron a 67 y 62°C durante 15 min. Sin embargo, el tipo de fondo observado (lmeas verdes a lo largo del tejido en contraposicion al fondo rojizo mas normal), sugirio que la morfologfa de la muestra empezo a sufrir la desnaturalizacion de 15 minutos. Este tipo de fondo puede reducirse usando pretratamiento termico mas suave y/o condiciones de digestion con pepsina.

En general, temperaturas de desnaturalizacion mas bajas reducen los niveles de fondo significativamente. Ademas, bajando la temperatura de desnaturalizacion, pero manteniendo el tiempo de 5 min, se reduce la intensidad de senal de la sonda de ADN (datos no mostrados).

Ejemplo comparativo 26

Este ejemplo compara la intensidad de senal y el fondo en funcion de la hibridacion a diferentes temperaturas cuando las muestras se desnaturalizan a 82°C durante 5 min.

Composicion de sonda de FISH I: sonda de ADN marcada con rojo Tx de HER2 2,5 ng/|il (1/4 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC; EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Composicion de sonda de FISH II: EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0

Los portaobjetos se desnaturalizaron con composiciones de sonda de FISH a 82°C durante 5 min y se hibridaron tal como se indica en la tabla durante 60 min.

Resultados:

Temperatura de desnaturalizacion

Composicion de sonda de FISH Fondo Intensidad de senal ADN ANP

45°C

I + 1 - 2 CO CM 2A

50°C

I + 1 - 1A 3 2A

55°C

I + 1 A - 2 CM CM 2A

45°C

II +0 0 0

Estos resultados muestran que las senales mas altas se observaron a hibridacion de 50°C. El control sin sonda no mostro tincion de fondo. La morfologfa empezo a sufrir cuando se hibrido a 55°C. Sin embargo, este efecto en la morfologfa puede reducirse usando pretratamiento termico mas suave y/o condiciones de digestion con pepsina.

Ejemplo comparativo 27

5 Este ejemplo compara la intensidad de senal y el fondo en funcion de la hibridacion a diferentes temperaturas cuando las muestras se desnaturalizan a 67°C durante 10 min.

Composicion de sonda de FISH: sonda de ADN marcada con rojo Tx de HER2 2,5 ng/|il (1/4 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC; EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

10 Los portaobjetos se desnaturalizaron con la composicion de sonda de FISH a 67°C durante 10 min y se hibridaron durante 60 min.

Resultados:

Temperatura de desnaturalizacion

Fondo ADN Intensidad de senal ANP

45°C

+ 1 - 1A 3 2A

50°C

+ 1 - 2 3 3

55°C

+ 1 - 2 3 2A

Estos resultados muestran que las senales mas altas se observaron a hibridacion de 50°C. La morfologfa empezo a sufrir cuando se hibrido a 55°C. Sin embargo, este efecto en la morfologfa puede reducirse usando pretratamiento 15 termico mas suave y/o condiciones de digestion con pepsina.

Ejemplo 28

Este ejemplo compara la intensidad de senal y el fondo de la hibridacion a 45°C y a temperatura ambiente (TA, 21°C) sin desnaturalizar la sonda y el tejido.

Composicion de sonda de FISH: sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 2,5 ng/|il (1/4 de la concentracion 20 convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC; EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Se hibridaron las sondas de FISH y el tejido (no desnaturalizados) a TA en una camara de humedad o en un dispositivo de hibridacion Dako (S2450, Dako) a 45°C durante la noche.

Resultados:

Desnaturalizacion

Temperatura de hibridacion Tejido Fondo Intensidad de senal ADN ANP

no

TA Mama +0 CM O

no

TA Airngdalas +0 CM O

no

45°C Mama +0-1A 3 3

no

45°C Amfgdalas +0 3 3

25 Estos resultados muestran que el tampon puede usarse sin desnaturalizar o bien la muestra o la composicion de sonda. Observese que la sonda no se calento por encima de la TA en ningun momento antes de o durante este experimento, aparte de la etapa de hibridacion.

Ejemplo 29

Este ejemplo compara la intensidad de senal y de fondo de la hibridacion a 45 y 50°C (durante 1 h y durante la 30 noche) sin desnaturalizacion del corte tisular, y con o sin desnaturalizacion de la sonda de FISH (ejemplo comparativo en la medida en que tuvo lugar la desnaturalizacion).

Composicion de sonda de FISH I: sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 3,3 ng/|il (1/3 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC; EC

al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCI 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Composicion de sonda de FISH II (mezcla de sonda de HER2 PharmDx, K5331, Dako): sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 10 ng/|il y (600 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC, formamida al 45%, sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, ANP de bloqueo sin marcar 5 |iM.

5 Se pretrataron los portaobjetos tal como se describe anteriormente en el protocolo FISH de Dako convencional hasta despues de la etapa de deshidratacion (K5599, Dako). La sonda de FISH o bien no se desnaturalizo con calor, o bien se desnaturalizo con calor en un bloque termico en tubos de centnfuga de 1,5 ml a 67°C durante 1 min o a 82°C durante 5 min y se puso en hilo. Se pretrataron las muestras, se deshidrataron y se secaron al aire. Se anadieron a la muestra diez pl de sonda de FISH no desnaturalizada con calor o desnaturalizada con calor, se cubrio con un 10 cubreobjetos y se sello, y se hibrido a 45°C durante 60 min. Entonces se siguio el procedimiento FISH de Dako convencional. La sonda no se calento por encima de la TA en ningun momento antes del experimento.

Resultados:

Sonda

Temp./tiempo de desnaturalizacion de la sonda Temp. de hibridacion Tiempo de hibridacion Fondo Intensidad de senal ADN ANP

I

- 45°C 1 h +0-/ 2 3

II

- 45°C 1 h 0 0 3

I

- 45°C durante la noche* + 1-2 3 2-2/

II

- 45°C durante la noche +0 / 2/

I

- 50°C 1 h +/ 2/ 3

II

- 50°C 1 h +0 0 3

I

- 50°C durante la noche* +2-3 3 1/

II

- 50°C durante la noche +0 / 2

I

67°C/1 min 45°C 1 h +/ 2/-3 3

II

67°C/1 min 45°C 1 h 0 0 3

I

67°C/1 min 45°C durante la noche* +2 3 2

II

67°C/1 min 45°C durante la noche +0 1/-2 2-2/

I

67°C/1 min 50°C 1 h + 1 2/-3 3

II

67°C/1 min 50°C 1 h +0 0 2/

I

67°C/1 min 50°C durante la noche* +2 3 2

II

67°C/1 min 50°C durante la noche + 1 1 2/

I

82°C/5 min 45°C 1 h +/-1 2-2/ 3

II

82°C/5 min 45°C 1 h 0 0 2

I

82°C/5 min 45°C durante la noche* +2-3 3 1/

II

82°C/5 min 45°C durante la noche +0 1 2

I

82°C/5 min 50°C 1 h + 1-1/ 3 2-2/

n

82°C/5 min 50°C 1 h 0 0 2

I

82°C/5 min 50°C durante la noche* +3 2 1

ii

82°C/5 min 50°C durante la noche 0 1 3

*Se secaron los portaobjetos con composicion de sonda de FISH I tras la hibridacion durante la noche.

Estos resultados muestran que las sondas a base de ADN y ANP no requieren la desnaturalizacion de la muestra de 15 tejido o la sonda con composicion de sonda de FISH I. Sin embargo, si la composicion de sonda de FISH I se desnaturalizo a 67°C durante 1 min o a 82°C durante 5 min antes de la hibridacion, se obtuvieron senales mas fuertes. Las composiciones de la invencion mostraron senales de ADN mejoradas sin desnaturalizacion de la muestra con o sin desnaturalizacion de la sonda, en comparacion con tampones que contienen formamida. Observese que para la composicion de sonda de FISH II (formamida), las puntuaciones para la sonda a base de 20 ADN eran todas cero a una incubacion con hibridacion durante 60 min. Por tanto, las composiciones de la invencion

5

10

15

20

25

30

35

mostraron senales en hibridaciones de una hora sin desnaturalizacion.

Ejemplo 30

El ejemplo compara la intensidad de senal en muestras citologicas (extensiones en metafase) de la hibridacion a 45°C sin desnaturalizar la sonda y el tejido.

Composicion de sonda de FISH I: sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 2,5 ng/|il (1/4 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC; EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Composicion de sonda de FISH II (mezcla de sonda de HER2 PharmDx, K5331, Dako): sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 10 ng/|il y (600 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC, formamida al 45%, sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, ANP de bloqueo sin marcar 5 pM.

Tras la fijacion en formaldetndo, algunas de las muestras se digirieron con pepsina (vial 2, K5599) para permitir un mejor acceso para la sonda no calentada a la diana no calentada. Se aplico pepsina a 37°C durante 2 min, entonces se lavo 2 x 5 min con tampon de lavado, antes de realizar la etapa de deshidratacion. Se hibridaron las sondas de FISH y las extensiones en metafase (no desnaturalizadas) a 45°C durante 180 min. Se desnaturalizo la muestra de control a 82°C durante 5 min, seguido por hibridacion a 45°C durante 180 min. La sonda no se calento por encima de la TA en ningun momento antes del experimento.

Resultados:

Sonda

Pepsina Desnaturalizacion Intensidad de senal

ADN ANP

I

- - A 1

I

+ - 1A 2

I

- + 2A 2A

II

- - 0 0

II

+ - 0 A

II

- + 1 3

Estos resultados muestran que las composiciones de la invencion (composicion I) producen senales mas fuertes que las composiciones que contienen formamida tradicionales (composicion II) cuando la muestra y la sonda no estan desnaturalizadas, y cuando las muestras se digieren con pepsina. Ademas, las composiciones de la invencion producen senales mas fuertes para sondas de ADN que las composiciones que contienen formamida tradicionales incluso cuando se realiza una etapa de desnaturalizacion.

Observese que el experimento anterior implicaba una hibridacion de 3 horas. En otros experimentos, la hibridacion durante la noche de muestras en metafase creo una alta tincion de fondo, y la hibridacion de 60 min mostro senales debiles (datos no mostrados). Observese tambien que la estructura de los cromosomas en las extensiones en metafase que no se habfan desnaturalizado estaba mejor conservada que en aquellas que se habfan desnaturalizado. Esto era cierto para la composicion tanto I como II.

Ejemplo 31

Este ejemplo compara la intensidad de senal y el fondo de la hibridacion de sondas de FISH en cortes tisulares FFPE hibridados a 50°C durante 120 min o desnaturalizados a 82°C durante 5 min e hibridados a 45°C durante 60 min (ejemplo comparativo en la medida en que tuvo lugar la desnaturalizacion).

Composicion de sonda de FISH I: sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 3,3 ng/|il (1/3 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC; EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

Composicion de sonda de FISH II: sonda de ADN marcada con rojo TX de TOP2A 3 ng/|il (1/3 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC; EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0.

La sonda no se calento por encima de la TA en ningun momento antes del experimento.

Resultados:

Sonda

Temp./tiempo de Temp./tiempo Muestra* Fondo** Intensidad de senal

desnaturalizacion de hibridacion ADN ANP

5

10

15

20

25

HER2 (I)

- 50°C/120 min Carcinoma de mama +0 2/-3 2/-3

HER2 (I)

- 50°C/120 min Airngdalas +0 2-3 3

HER2 (I)

- 50°C/120 min Rinon +/ 2 2/

HER2 (I)

- 50°C/120 min Colon +0 1/-2 2-2/

TOP2A (II)

- 50°C/120 min Carcinoma de mama +0 2/ 3

TOP2A (II)

- 50°C/120 min Airngdalas +0 2-2/ 3

TOP2A (II)

- 50°C/120 min Rinon +2/ 1/-2 2-2/

TOP2A (II)

- 50°C/120 min Colon +0 1/ 2-2/

HER2 (I)

82°C/5 min 45°C/60 min Carcinoma de mama +2/ 2/ 2/

HER2 (I)

82°C/5 min 45°C/60 min Airngdalas +2/ 2/ 2

HER2 (I)

82°C/5 min 45°C/60 min Rinon +2/ 1/-2 1/-2

HER2 (I)

82°C/5 min 45°C/60 min Colon +2/ 1/-2 1/-2

TOP2A (II)

82°C/5 min 45°C/60 min Carcinoma de mama + 1 2/ 3

TOP2A (II)

82°C/5 min 45°C/60 min Airngdalas + 1 2/-3 2

TOP2A (II)

82°C/5 min 45°C/60 min Rinon + 1/ 1/-2 1/-2

TOP2A (II)

82°C/5 min 45°C/60 min Colon + 1 1/-2 2-2/

El colon y el rinon proporcionaron senales mas debiles que el carcinoma de mama y las airngdalas. Se observa en (F)ISH que tejidos como, por ejemplo, colon y rinon, pueden requerir un pretratamiento mas largo que, por ejemplo, carcinoma de mama y airngdalas para obtener senales fuertes, por ejemplo, mediante incubacion con digestion con pepsina mas larga, debido a ambas caractensticas espedficas del tejido y lo mas importante un tiempo de fijacion del tejido a menudo mas largo (es decir, un pretratamiento mas riguroso). Observese que la intensidad de senal del colon y el rinon sin desnaturalizacion es equivalente al tejido y la sonda desnaturalizados. Por tanto, estos resultados ilustran sorprendentemente que las composiciones de la invencion eliminan la necesidad de una etapa de desnaturalizacion con calor para las muestras tisulares.

Ejemplo 32

Este ejemplo la intensidad de senal y de fondo de hibridaciones realizadas con sulfolano, carbonato de propileno, y- butirolactona con y sin desnaturalizacion (ejemplo comparativo en la medida en que tuvo lugar la desnaturalizacion).

Composicion de sonda de FISH I: SL al 40% (T22209, Aldrich), sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 5 ng/|il (1/2 de la concentracion convencional) y la concentracion convencional (600 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC.

Composicion de sonda de FISH II: SL al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH

6.0, sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 5 ng/|il (1/2 de la concentracion convencional) y la concentracion convencional (600 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC.

Composicion de sonda de FISH III: PC al 40% (540013, Aldrich), sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 5 ng/|il (1/2 de la concentracion convencional) y la concentracion convencional (600 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC.

Composicion de sonda de FISH IV: PC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH

6.0, sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 5 ng/|il (1/2 de la concentracion convencional) y la concentracion convencional (600 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC.

Composicion de sonda de FISH V: GBL al 40% (B103608, Aldrich), sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampon fosfato 5 mM, sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 5 ng/|il (1/2 de la concentracion convencional) y la concentracion convencional (600 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC.

Composicion de sonda de FISH VI: GBL al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0, sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 5 ng/|il (1/2 de la concentracion convencional) y la

concentracion convencional (600 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC.

Composicion de sonda de FISH VII: EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0, sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 3,3 ng/|il (1/3 de la concentracion convencional) y A de la concentracion convencional (300 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC.

5 Composicion de sonda de FISH VIII: formamida (FM) al 15% (15515-026, Invitrogen), sulfato de dextrano al 20%; NaCl 600 mM; tampon citrato 10 mM, pH 6,0, sonda de ADN marcada con rojo TX de HER2 5 ng/|il (1/2 de la concentracion convencional) y la concentracion convencional (600 nM) de sondas de ANP de CEN17 marcadas con FITC.

Las composiciones de FISH I-VI teman dos fases a temperatura ambiente. Para las composiciones al 40% (I, III y V), 10 solo se uso la fase de arriba de las dos fases. Las composiciones al 15% que presentaron fases de diferente viscosidad (II, IV, VI) se mezclaron antes de su uso. Las composiciones VII y VIII teman una fase.

Resultados:

Sonda

Temp./tiempo de Temp./tiempo Muestra* Fondo** Intensidad de senal

desnaturalizacion de hibridacion ADN ANP

SL 40% (I)*

50°C/120 min Carcinoma de mama +2A 2-2A A

Airngdalas +2A 1A-2A A

Carcinoma +2 2-2A A

SL 40% (I)*

82°C/5 min 45°C/60 min de mama

Airngdalas +2 1-1A A

Carcinoma +2 2-2A 2-2A

SL 15% (II)

- 50°C/120 min de mama

Airngdalas + 1 3 2A-3

Carcinoma + 1 2-2A 2-2A

SL 15% (II)

82°C/5 min 45°C/60 min de mama

Airngdalas +0 3 2-2A

Carcinoma + 1-1A 2A 2-2A

PC 40% (III)*

- 50°C/120 min de mama

Airngdalas +0-3 3 3

Carcinoma +0-3 A-1 2

PC 40% (III)*

82°C/5 min 45°C/60 min de mama

Airngdalas +0 A 1A

Carcinoma + 1 1-2 3

PC 15% (IV)

- 50°C/120 min de mama

Airngdalas +0 A 3

PC 15% (IV)

82°C/5 min 45°C/60 min Carcinoma de mama +2-3 2-2A 2-2A

Airngdalas + 1-2 2A 2

GBL 40% (V)*

50°C/120 min Carcinoma de mama +3 A-1 A

Airngdalas +2 1A-2 A

GBL 40% (V)*

82°C/5 min 45°C/60 min Carcinoma de mama +3 2-2A A

Airngdalas +2 2-2A A

GBL 15% (VI)

50°C/120 min Carcinoma de mama +2 1A-2A 1A-2A

Airngdalas + 1 1-1A 2

GBL 15% (VI)

82°C/5 min 45°C/60 min Carcinoma de mama +0-1A 2-2A 2

Airngdalas +0 2A-3 A

Carcinoma +0 2A-3 2

EC 15% (VII)

- 50°C/120 min de mama

Airngdalas +0 3 2A

EC 15% (VII)

82°C/5 min 45°C/60 min Carcinoma de mama +2A 2A 2A

Airngdalas + 1 3 2A

FM 15% (VIII)

50°C/120 min Carcinoma de mama +0 0-A 2

Airngdalas +0 0-A 2

FM 15%

82°C/5 min 45°C/60 min Carcinoma +0 A 2A-3

(VIII)

de mama Amfgdalas +0 / 1/

*Se uso la fase de arriba.

Estos resultados muestran que EC, PC, SL y GBL eliminan la necesidad de una desnaturalizacion convencional de la sonda y el ADN de muestra. Ademas, estos disolventes aproticos polares posibilitan hibridaciones mas rapidas que el tampon de hibridacion de referencia de gran tradicion que contiene formamida (composicion de sonda de 5 FISH VIII).

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Metodo de hibridacion de secuencias de acido nucleico in situ en una muestra en un portaobjetos sin una etapa de desnaturalizacion y en un sistema automatizado que comprende:

   - proporcionar una primera secuencia de acido nucleico,

   5 - proporcionar una segunda secuencia de acido nucleico,

   - proporcionar una composicion de hibridacion que comprende una cantidad eficaz de al menos un disolvente aprotico polar, y

   - combinar las secuencias de acido nucleico primera y segunda y la composicion de hibridacion en el sistema automatizado durante al menos un periodo de tiempo suficiente para hibridar las secuencias de

   10 acido nucleico primera y segunda,

   en el que el disolvente aprotico polar no es dimetilsulfoxido (DMSO).
2. 2. Metodo de hibridacion de secuencias de acido nucleico in situ en una muestra en un portaobjetos sin una etapa de desnaturalizacion y en un sistema automatizado que comprende:

   - proporcionar una primera secuencia de acido nucleico, y

   15 - aplicar una composicion de hibridacion que comprende una segunda secuencia de acido nucleico y una

   cantidad eficaz de al menos un disolvente aprotico polar durante al menos un periodo de tiempo suficiente para hibridar las secuencias de acido nucleico primera y segunda,

   en el que el disolvente aprotico polar no es dimetilsulfoxido (DMSO).
3. 3. Metodo segun las reivindicaciones 1 o 2, en el que la primera secuencia de acido nucleico esta en una

   20 muestra biologica.
4. 4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la primera secuencia de acido nucleico es una secuencia monocatenaria y la segunda secuencia de acido nucleico es una secuencia bicatenaria o en el que la primera secuencia de acido nucleico es una secuencia bicatenaria en una muestra biologica y la segunda secuencia de acido nucleico es una secuencia monocatenaria.

   25 5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que se proporciona una cantidad de energfa

   suficiente para hibridar los acidos nucleicos primero y segundo.
5. 6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la etapa de hibridacion dura menos de 8 horas, por ejemplo menos de 1 hora, o por ejemplo menos de 30 minutos, o por ejemplo menos de 15 minutos, o por ejemplo menos de 5 minutos.

   30 7. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la concentracion de disolvente aprotico

   polar es del 5% al 10% (v/v) o del 10% al 20% (v/v).
6. 8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el disolvente aprotico polar en la composicion de hibridacion tiene un parametro de solubilidad en dispersion de entre 17,7 y 22,0 MPa1/2, un parametro de solubilidad polar de entre 13 y 23 MPa1/2, y un parametro de solubilidad por puente de

   35 hidrogeno de entre 3 y 13 MPa1/2
7. 9. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el disolvente aprotico polar en la composicion de hibridacion se selecciona del grupo que consiste en:

   imagen1

   5
8. 10.

   10 11.
9. 12.

   15
10. 13.
11. 14.

    20
12. 15.

    imagen2

    donde X es opcional y si esta presente, se elige de O o S, donde Z es opcional y si esta presente, se elige de O o S,

    donde A y B son independientemente O o N o S o parte del alquildnlo o una amina primaria, donde R es alquildnlo, y donde Y es O o S o C.

    Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el disolvente aprotico polar en la composicion de hibridacion se selecciona del grupo que consiste en:

    imagen3

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el disolvente aprotico polar en la composicion de hibridacion es:

    O

    imagen4

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el disolvente aprotico polar en la composicion de hibridacion se selecciona del grupo que consiste en carbonato de etileno, sulfolano, gamma-butirolactona, carbonato de propileno, tritiocarbonato de etileno, sulfito de glicol/sulfito de etileno, delta-valerolactama (2-piperidona) y 1-oxido de tetrahidrotiofeno.

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la composicion de hibridacion comprende sulfato de dextrano y NaCl y/o tampon fosfato.

    Metodo segun la reivindicacion 13, en el que el sulfato de dextrano esta presente a una concentracion del 5% al 40%, el NaCl esta presente a una concentracion de 0 mM a 1200 mM, y/o el tampon fosfato esta presente a una concentracion de 0 mM a 50 mM.

    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la composicion de hibridacion comprende el 15% de al menos un disolvente aprotico polar, sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM, y tampon fosfato 10 mM o la composicion de hibridacion comprende el 15% de al menos un disolvente aprotico polar, sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM y tampon acido citrico 10 mM, pH 6,2.