ES2601329T3 - Uso de células modificadas para el tratamiento de la esclerosis múltiple - Google Patents

Abstract

Una celula sanguinea que se selecciona de una celula mononuclear de sangre periferica humana o de un globulo rojo humano que estan quimicamente acoplados a un coctel de peptidos en donde el coctel se selecciona de a) MBP 13-32, MBP 83-99, MBP 111-129, MBP 146-170, PLP 139-154, MOG 1-20 y MOG 35-55 b) MBP 13-32, MBP 82-98, MBP 111-129, MBP 146-170, PLP 139-154, MOG 1-20 y MOG 35-55 c) MBP 13-32, MBP 83-99, MBP 111-129, MBP 146-170, PLP 139-154, MOG 1-20, MOG 35-55 y MBP 82-98 d) MBP 13-32, MBP 111-129, MBP 146-170, PLP 139-154, MOG 1-20 y MOG 35-55.

Description

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celular. 3) En comparación con el programa manual, el recuento de eritrocitos es más bajo.

Tabla 1

Aféresis I

Duración Volumen de Volumen del PBMC x % de linfocitos % de monocitos

(min)

sangre (ml) del producto 109 (dentro de MNC) (dentro de MNC)

paciente

(ml)

290SA

128 4500 61 5,5 77,6 17,8

IJ1804

86 4552 61 5,1 80,2 13,4

445CO

88 3908 61 5,5 67,7 15,2

978TH

99 5502 61 5,5 62,4 21,5

RM1401

102 5153 60 4,2 71,0 22,8

IJ2801

115 5747 60 2,7 82,6 10,8

1066ST

112 3479 61 5,5 72,9 16,7

Validación de lisis de eritrocitos

Aunque el producto de aféresis contiene una cantidad muy baja de eritrocitos, en números absolutos los eritrocitos sobrepasan las células mononucleares de 10 a 40 veces. Por tanto, es necesario lisar los eritrocitos para obtener una pureza mayor del producto celular. Para la lisis de eritrocitos, se usa un tampón de lisis establecido (tampón ACK). Se ensayó la eficacia del tampón de lisis en capas leucocitarias, que contienen una cantidad mucho mayor de eritrocitos en comparación con el producto de aféresis. En capas leucocitarias se consigue lisis eficaz de los eritrocitos (hemoglobina media (Hb) antes de la lisis 10,03 g/dl, después de la lisis 0,63 g/dl; Tabla 2). En las aféresis, el contenido de eritrocitos es mucho más bajo desde el inicio y está por debajo de los valores medibles de la lisis.

Tabla 2

Producto

Hb antes de lisis (g/dl) Hb después de lisis (g/dl)

BC9198169

8,4 0,4

BC9204876

12,6 1,0

BC9247719

9,8 0,5

BC9261124

9,32 0,6

Carga de bolsas de sangre en cámara estéril

Todos los reactivos se cargarán a través de un tubo estéril que tiene un dispositivo Luer-lock. El tubo se soldará a la bolsa usando un dispositivo estéril de soldadura. Después de haber cargado los reactivos en la bolsa, el tubo se separará usando un sellador portátil de tubos.

Cantidad de células

La cantidad absoluta de células en el producto en un punto crítico en el proceso de fabricación. Durante el proceso de fabricación, se pierden células (Tabla 3). Por tanto, es esencial definir las cantidades mínimas de células que son necesarias para la producción del producto ETIMS. Estas cantidades de células tienen que comprobarse a través de controles en el proceso. Los criterios de aceptación para las cantidades de células necesarias para el proceso de fabricación se han definido en varias ejecuciones de validación usando capas leucocitarias. En contenido de células de la capa leucocitaria es de aproximadamente 1 x 109 células, por tanto, para las ejecuciones de validación, se abordará una cantidad final de células de 5 x 108 células. Los recuentos de células se evaluaron antes de empezar el proceso de fabricación, antes de la reacción de acoplamiento y después de la última etapa de lavado. En todas las ejecuciones de validación, puedo alcanzarse el recuento diana de células, cuando la cantidad inicial de células era mayor de 1,2 x 109 .

Tabla 3

Capa leucocitaria

Duración (min) Recuento inicial de células Recuento de células después de la lisis Recuento de células después del acoplamiento

9261124

320 16,5 x 108 9,95 x 108 7,2 x 108

9247719

330 17 x 108 11 x 108 6,5 x 108

9204876

380 15 x 108 11,4 x 108 10 x 108

9198169

350 12 x 108 8,6 x 108 11 x 108

Duración del proceso de fabricación

El objetivo era reducir la duración del proceso de fabricación para potenciar la viabilidad y disminuir el riesgo de contaminación microbiológica. Como en varias ejecuciones de validación, no pudieron detectarse cantidades residuales de EDC en la primera solución de lavado después de la reacción de acoplamiento, se redujo una etapa

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pasado las células. Para asegurarse adicionalmente contra los agregados, se contó la concentración celular antes y después de haber pasado a través del filtro y no se pudo observar ninguna diferencia (n=2).

b) Se evaluó la presencia de agregados por microscopía en un frotis de sangre o después de transferir células a 5 una placa de cultivo celular. No se observó ninguna diferencia en comparación con células no tratadas.

c) Para detectar y cuantificar micro-agregados, se analizaron varios productos (n=5) por FACS. Evaluando el área de dispersión directa (FSC-A) y la anchura de dispersión directa (FSC-W) no pudo detectarse mayor frecuencia de micro-agregados en el producto celular en comparación con las células antes del tratamiento con

10 EDC. La frecuencia de agregados no aumentó durante el periodo de almacenamiento de 4 horas.

d) La inyección de producto humano (ETIMS) en ratones (n=20) no condujo a embolia, a causa de agregados en ninguno de los ratones.

15 Identidad

Se analizó la composición celular del producto de aféresis y el producto de fármaco final, con el objetivo de evaluar diferencias en la composición celular final del producto de fármaco resultante del procesamiento de las células. Una caracterización fenotípica clara del producto final está impedida por el tratamiento de las células, muy 20 probablemente a causa de que los tratamientos químicos alteran la estructura diana para los anticuerpos específicos. Por tanto, se fenotipará el producto celular antes del procesamiento de las células para evaluar si la relación entre diferentes poblaciones (células T, células B, monocitos) tiene influencia sobre el resultado del tratamiento. El objetivo es establecer los criterios de aceptación para el desarrollo adicional del producto de fármaco.

25 Seguridad preclínica

Estudios en animales: Se usaron dos configuraciones experimentales diferentes para la evaluación de toxicidad. 1) El ensayo toxicológico del producto humano puede evaluarse solamente a corto plazo a causa de la inmunotoxicidad cuando se ensaya en diferentes especies. Por tanto, se evaluó la toxicidad a corto plazo del producto humano en

30 ratones inmunocomprometidos (inmunodeficiencia combinada severa; SCID). 2) Se evaluó la toxicidad a plazo medio de esplenocitos singénicos acoplados con los siete péptidos de mielina usados en el ensayo, en el modelo SJL.

Ambos estudios toxicológicos se realizaron por el LPT Laboratory of Pharmacology and Toxicology GmbH & Co. KG, 35 Redderweg, Hamburgo, un laboratorio certificado por GLP.

Estudio de toxicidad aguda de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) acopladas a péptido humano y plasma humano por única administración intravenosa a ratones SCID (LPT 22043).

Artículo de ensayo

1 x 109 PBMC humanas acopladas químicamente a siete péptidos de mielina (MBP13-32 (MBP1), MBP83-99 (MBP2), MBP111-129 (MBP3), MBP146-170 (MBP4), MOG1-20 (MOG1), MOG35-55 (MOG2), PLP139-154 PLP1) resuspendidas en 100 ml de plasma humano. El plasma humano sirvió como control

Cantidad de experimentos

Dos diferentes, a dos puntos temporales independientes, PBMC acopladas a péptido humano fabricado (Producto A y Producto B)

Cantidad de animales por experimento

5 machos y 5 hembras recibieron células acopladas a péptido, 1 macho y 1 hembra recibieron plasma humano como control

Inyección intravenosa

Dosis/aprox. 15 segundos

Volumen de administración

200 ml i.v.

Dosis

2 x 106 PBMC humanas acopladas a péptido

Peso corporal (al inicio del tratamiento)

Machos:

17-22 g

Hembras:

15 - 17 g

Edad (al inicio del tratamiento)

Machos:

41 - 48 días

Hembras:

41 - 48 días

Identificación del animal

Por marcas coloreadas y etiqueta de la jaula

Duración del experimento

Al menos 5 días de adaptación 1 día de ensayo 24 horas de periodo de recuperación

Evaluación

Se realizaron observaciones para todos los animales y se registraron sistemáticamente (con registros individuales mantenidos para cada animal) antes e inmediatamente, 5, 15, 30 y 60 min., así como 3, 6 y 24 horas después de la administración.

Observación

Se observaron cambios de piel y pelos, ojos y membranas mucosas, función respiratoria y circulatoria, sistema nervioso autónomo y central y actividad somatomotora, así como el patrón de comportamiento. Se puso atención a posibles temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargia, sueño y coma. Se hicieron observaciones sobre la mortalidad emprendiendo acciones apropiadas para minimizar la pérdida de animales durante el estudio.

Mediciones

Se registraron los pesos corporales individuales antes de la administración del artículo de ensayo y después de 24 horas. Se calcularon y registraron los cambios en el peso.

Al final de los experimentos todos los animales se sacrificaron en anestesia con éter cortando la aorta abdominalis, se exanguinaron, se pesaron, se diseccionaron e inspeccionaron macroscópicamente bajo la dirección de un patólogo.

Resultados resumidos

En las presentes condiciones de ensayo, inyecciones intravenosas únicas de 200 µl de PBMC periférica acoplada a péptido humano (Producto A), PBMC acopladas a péptido humano (Producto B) o plasma humano a ratones no condujeron a ningún signo de toxicidad. No apareció mortalidad.

Síntomas/Criterio

Producto A Producto B Plasma humano

machos

hembras machos hembras machos hembras

Signos clínicos

ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno

Mortalidad en 6 h

0 0 0 0 0 0

en 24 h

0 0 0 0 0 0

Peso corporal medio al inicio

18,6 15,6 20,4 16,2 20,5 17,0

después de 24 h

19,0 15,8 20,6 16,4 20,5 17,5

Inhibición de ganancia de peso corporal

ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno ninguno

Hallazgos en la necropsia *

ninguno 2 de 5 4 de 5 4 de 5 2 de 2 2 de 2

* Se observó un tamaño de bazo reducido en 0 de 5 animales machos y en 2 de 5 animales hembra tratados con Producto A, en 4 de 5 animales macho y en 4 de 5 animales hembra tratados con Producto B y en 2 de 2 animales macho y en 2 de 2 animales hembra tratados con plasma humano.

Estudio de toxicidad aguda de esplenocitos acoplados a péptidos por administración intravenosa única a ratones SJL (LPT 21988)

Artículo de ensayo

Esplenocitos singénicos acoplados químicamente a siete péptidos de mielina (MBP13-32 (MBP1), MBP83-99 (MBP2), MBP111-129 (MBP3), MBP146-170 (MBP4), MOG1-20 (MOG1), MOG35-55 (MOG2), PLP139-154 (PLP1)) resuspendidos en PBS.

Cantidad de experimentos

1

Cantidad de animales por experimento

5 machos y 5 hembras recibieron esplenocitos acoplados a péptidos

Inyección intravenosa

Dosis/aprox. 15 segundos

Volumen de administración

200 µl i.v.

Dosis

5 x 107 esplenocitos acoplados a péptidos

Peso corporal (al inicio del tratamiento) Machos: Hembras:

17-19 g 17-18 g

Edad (al inicio del tratamiento) Machos: Hembras:

43 días 43 días

Identificación del animal

Por marcas coloreadas y etiqueta de la jaula

Duración del experimento

Al menos 5 días de adaptación 1 día de ensayo

2 semanas de periodo de recuperación

Evaluación

Se realizaron observaciones para todos los animales y se registraron sistemáticamente (con registros individuales mantenidos para cada animal) antes e inmediatamente, 5, 15, 30 y 60 min., así como 3, 6 y 24 horas después de la administración.

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respectivos, se les añadieron 5 x 104 PBMC tratadas con EDC en presencia de los 7 péptidos usados en el ensayo (=PBMC acopladas a péptidos, tAPCpep), 5 x 104 PBMC tratadas con EDC pero sin péptido (tAPC), 2,5 µg/ml de fitohemaglutinina (PHA) o sin estímulo adicional (APC).

5 La presencia de células acopladas a péptidos no indujo proliferación en PBMC en comparación con PBMC no estimuladas o PBMC estimuladas con PHA (Figura 3).

También se analizó la presencia de citoquinas inflamatorias después de 3 horas y 24 horas. En resumen, se cultivaron PBMC durante una noche en IMDM completo que contenía 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 50

10 µg/ml gentamicina, L-glutamina 2 mM, suero humano descomplementado por calor al 5 %, en presencia de 2,5 µg/ml de PHA o sin estímulo. Después de 24 horas, las células se lavaron en IMDM completo y se sembraron en una placa de 24 pocillos (4 x 106/ml) en presencia de PBMC tratadas con EDC y los 7 péptidos usados en el ensayo (=PBMC acopladas a péptidos, tAPCpep), 1 x 106 PBMC tratadas con EDC, pero sin péptido (tAPC), 2,5 µg/ml de PHA (PHA)

o sin estímulo adicional (APC).

15 Como se representa en la Figura 4 y en la Figura 5, no existe inducción significativa de citoquinas inflamatorias en presencia de PBMC acopladas a péptidos en comparación con el control negativo (APC).

En la Figura 5 se representan las concentraciones de citoquinas sin control de PHA.

20 Para analizar si la respuesta a células acopladas a péptidos difiere dependiendo del estado de activación de las células, se pre-activaron las PBMC con PHA durante 24 horas y se añadieron a las PBMC acopladas a péptidos. No se observó ninguna inducción de proliferación (Figura 6) o de citoquinas (Figura 7) en respuesta a células acopladas a péptidos.

25 En resumen, no se observó ninguna activación de células inmunitarias inducidas por la presencia de células acopladas a péptidos in vitro. Este resultado se correlaciona bien con la experiencia que nosotros y otros (34) hemos hechos con tolerización de clones de células T humanas in vitro y la inducción de tolerancia con células acopladas a péptidos in vivo en diferentes modelos animales.

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Potencia de células acopladas a péptidos humanos in vitro

El objetico del estudio fue evaluar el efecto de células acopladas a péptidos sobre la respuesta específica de antígeno de células T humanas. Se usó un clon de células T (TCC) obtenido de fluido cefalorraquídeo (CSF) de un

35 paciente con MS durante recidiva. En resumen, se cultivaron TCC (2 x 104 células/pocillo) en IMDM completo (que contenía 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 50 µg/ml gentamicina, L-glutamina 2 mM, suero humano descomplementado por calor al 5 %) y pulsado con el péptido (MSI118) en presencia de PBMC irradiadas (1 x 105 células/pocillo). Se añadieron PBMC acopladas a péptidos (MSI118, 10 µg/ml) a los pocillos a diferentes concentraciones celulares. La respuesta proliferativa de las TCC se midió por incorporación de 3H-Timidina después

40 de 72 horas (Figura 8).

La incubación de TCC con el péptido específico en presencia de células acopladas a antígeno reduce la respuesta específica de antígeno medida por incorporación de timidina de un modo dependiente de la dosis.

45 Para excluir una inhibición tóxica de las células acopladas a péptidos sobre los TCC se añadió IL-2 o anticuerpo monoclonal anti-CD28 a los pocillos respectivos. Como se representa en la Figura 9, la proliferación de los TCC puede recuperarse por la adición de IL-2 o el anticuerpo anti-CD28 en presencia de células acopladas a péptidos.

Se ha sugerido que fijando células presentadoras de antígeno pulsadas con péptido, no puede formarse una

50 sinapsis inmunológica y se induce anergia en células T auto-reactivas a través de la presentación del péptido a través del MHC sin co-estimulación. La sinapsis inmunológica se refiere al motivo espacialmente organizado de proteínas de membrana y moléculas citosólicas que se forma en la unión entre la célula T y una célula presentadora de antígeno.

55 Para explorar adicionalmente la invención, se analiza la formación de la sinapsis inmunológica por microscopia de fluorescencia y analizando los parámetros biofísicos (por ejemplo, flujo entrante de calcio) que caracteriza la interacción TCR MHC.

Hasta ahora no está claro a partir de la bibliografía, ni de ningún modelo animal, ni de estudios humanos, el

60 subconjunto de células presentadoras de antígeno que es más importante en el proceso de tolerización. Se examina esta cuestión analizando la potencia del régimen descrito anteriormente, después de aislar células específicas de la población de PBMC. El aislamiento de las células se realiza usando columnas con perlas marcadas o con un clasificador celular.

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