ES2601802T3 - Transesterificación enzimática con lipasas inmovilizadas sobre resinas hidrófobas en soluciones acuosas - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la transesterificación/esterificación de una fuente de ácido graso con un alcohol, para formar ésteres de alquilo de ácidos grasos, que comprende (A) hacer reaccionar una fuente de ácido graso y un alcohol o un donante de alcohol en presencia de una preparación de lipasa inmovilizada, en el que la preparación de lipasa inmovilizada comprende al menos una lipasa inmovilizada sobre un soporte poroso hidrófobo y el medio de reacción contiene una solución acuosa de tampón alcalino en más de un 5 % en peso de la fuente de ácido graso; o (B) hacer reaccionar una fuente de ácido graso y un alcohol o un donante de alcohol en presencia de una preparación de lipasa inmovilizada, en el que la preparación de lipasa inmovilizada comprende al menos una lipasa inmovilizada sobre un soporte poroso hidrófobo y el medio de reacción contiene agua en más de un 5 % en peso de la fuente de ácido graso.
Description
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DESCRIPCION
Transesterificacion enzimatica con lipasas inmovilizadas sobre resinas hidrofobas en soluciones acuosas Campo de la invencion
Se divulga un procedimiento enzimatico para la produccion de esteres de alquilo de acidos grasos para su uso en industrias de biocombustibles, alimentarias y de detergentes. En este procedimiento, una fuente de acidos grasos y un alcohol o donante de alcohol se hacen reaccionar en presencia de enzimas inmovilizadas sobre una resina hidrofoba, en presencia de un tampon acuoso alcalino o agua. El procedimiento divulgado se puede hacer funcionar tanto por lotes como continuamente utilizando un tanque de agitacion continua o reactores en columna de lecho empaquetado.
Antecedentes de la invencion
Se ha descrito la inmovilizacion de enzimas mediante un gran numero de tecnicas que intentan basicamente reducir la contribucion a los costes de las enzimas en los procedimientos enzimaticos globales; facilitando la recuperacion de las enzimas a partir de los productos; y permitir el funcionamiento continuo del procedimiento.
Las tecnicas de inmovilizacion estan en general divididas de acuerdo con lo siguiente:
1. Adsorcion ffsica de enzimas a soportes solidos, tales como sflice y polfmeros insolubles.
2. Adsorcion en resinas de intercambio ionico.
3. Enlace covalente de las enzimas a un material de soporte solido, tales como soportes inorganicos o polimericos epoxidados.
4. Atrapamiento de enzimas en un polfmero en crecimiento.
5. Confinamiento de enzimas en un reactor de membranas o en geles semipermeables.
6. Reticulacion de cristales (CLECS) o agregados (CLEAS) de enzimas.
Todos los procedimientos de inmovilizacion de enzimas anteriormente mencionados estan comprendidos por las siguientes etapas:
1. Disolver la enzima en un sistema tampon adecuado con respecto al pH, temperatura, tipo de sales de tampon y fuerza ionica.
2. Anadir el soporte solido a la solucion enzimatica y mezclar durante algun tiempo hasta que las moleculas enzimaticas esten inmovilizadas sobre el soporte solido.
3. Eliminar mediante filtracion el soporte solido que contiene la enzima inmovilizada.
4. Lavar el soporte con un tampon adecuado para eliminar las moleculas enzimaticas debilmente unidas y a continuacion secar el soporte solido.
Se han inmovilizado enzimas interfaciales, principalmente lipasas, siguiendo las tecnicas anteriormente mencionadas. Estas preparaciones de enzimas inmovilizadas ofrecidas poseen una baja actividad sintetica y un tiempo de vida media en funcionamiento corto. Se han aplicado diferentes procedimientos de activacion en un intento de aumentar la actividad y la estabilidad sintetica de las lipasas inmovilizadas y otras enzimas interfaciales. Estos procedimientos incluyen:
1. Unir los grupos superficiales de enzimas con restos hidrofobos tales como acidos grasos o polietilenglicol.
2. Revestir la superficie de las enzimas con tensioactivos, tales como esteres de acidos grasos de polioles.
3. Poner en contacto enzimas con soportes hidrofobos, normalmente polipropileno, que se han pretratado con disolventes hidrofilos, tales como etanol o isopropanol.
Ninguno de los procedimientos anteriormente mencionados ha proporcionado resultados satisfactorios con respecto a la estabilizacion y a la rentabilidad de las enzimas interfaciales inmovilizadas, a fin de llevar a cabo las conversiones enzimaticas inversas en cantidades industriales. Asimismo, se ha notificado que la mayona de las enzimas, cuando se inmovilizan de acuerdo con los procedimientos anteriormente mencionados, pierden bien una parte significativa de su actividad sintetica o bien no presentan su comportamiento de actividad completo debido a determinadas restricciones impuestas por el procedimiento de inmovilizacion, o debido a la presencia de determinados inhibidores enzimaticos en el medio de reaccion.
Otro inconveniente importante de las lipasas y fosfolipasas es su baja tolerancia hacia los sustratos hidrofilos, en particular alcoholes de cadena corta y acidos grasos de cadena corta (por debajo de C4). Se ha observado en muchos estudios de investigacion que los alcoholes de cadena corta y acidos grasos de cadena corta, tales como metanol y acido acetico, respectivamente, son responsables de separar las moleculas de agua esenciales de la estructura cuaternaria de dichas enzimas, llevando a su desnaturalizacion y consiguientemente a la perdida de su actividad catalftica. Este inconveniente ha impedido la aplicacion de lipasas para la produccion de cantidades comerciales de "biodiesel" de esteres metflicos de acidos grasos utilizando trigliceridos de aceite y metanol como sustratos.
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Un inconveniente adicional de utilizar lipasas inmovilizadas para la transesterificacion/esterificacion de una fuente de acido graso con un alcohol libre es la acumulacion de glicerol y los subproductos acuosos formados sobre el biocatalizador y por tanto impidiendo el libre acceso de los sustratos al sitio activo de la enzima inmovilizada. Dichos biocatalizadores generalmente pierden su comportamiento catalftico tras unos pocos ciclos cuando se usa el mismo lote de biocatalizador.
El documento WO/2011/107977 describe un procedimiento enzimatico para la produccion de esteres de alquilo de acidos grasos para el uso en industrias de biocombustibles, alimentarias y de detergentes, en cuyo procedimiento, una fuente de acidos grasos u un alcohol o donante de alcohol se hacen reaccionar en presencia de lipasa(s) inmovilizada(s) sobre una resina hidrofoba, en presencia de un tampon acuoso alcalino o agua.
El documento US 2009/0133322 describe un procedimiento para la preparacion de esteres de alquilo de acidos grasos de cadena corta en un sistema exento de disolvente, haciendo reaccionar una fuente de acido graso con un alcohol libre de cadena corta, en presencia de una preparacion de lipasa que comprende al menos dos lipasas inmovilizadas sobre un soporte adecuado, teniendo al menos una de las lipasas una afinidad aumentada por gliceridos parciales y estando al menos una de las lipasas espedficas de la posicion sn-1,3
El documento US 2010/0209982 se refiere a preparaciones de lipasas modificadas y fosforolipasas inmovilizadas sobre un soporte solido, en el cual la enzima se rodea de un microambiente hidrofobo y se protege de la desactivacion y/o de la agregacion en presencia de agentes hidrofilos, sustratos y/o productos de reaccion. La enzima se protege uniendose covalentemente a los grupos lfpidos que la revisten, o inmovilizandose o incluyendose en un soporte solido hidrofobo. Las enzimas se pueden usar eficazmente en la preparacion de biodiesel.
El documento EP2050823 divulga una reaccion de transesterificacion donde la lipasa puede inmovilizarse sobre sepiolita. Se puede anadir una base para conseguir un pH entre 8 y 13.
Salis y col, J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 57 (2009) 262-269, divulgan estudios llevados a cabo para investigar la influencia de la superficie del soporte sobre la carga y la actividad enzimatica de la lipasa de Pseudomonas fluorescens inmovilizada No existe una clara divulgacion de los sistemas que comprenden 5 % en peso o mas de agua.
Foresti y col, Enzyme and Microbial Technology, 41 (2007) 62-70, divulgan sistemas espedficos inmovilizados en polipropileno que se basan en un sistema de reaccion en dos fases lfquidas.
Los presentes inventores han desarrollado preparaciones de enzimas inmovilizadas especiales, que presentan buena estabilidad durante muchos ciclos de produccion, y actividad persistente. Se divulgan ejemplos de dichas preparaciones enzimaticas, entre otros, en los documentos WO 2008/084470, WO 2008/139455 y WO 2009/069116.
Las condiciones bajo las cuales se lleva a cabo la reaccion catalftica pueden afectar adversamente la estabilidad y la eficacia de las preparaciones de enzimas inmovilizadas. Es importante tener preparaciones de enzimas que retengan la estabilidad y la actividad en las condiciones de reaccion.
Estos y otros objetos de la invencion seran evidentes a medida que prosigue la descripcion.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un procedimiento para la transesterificacion/ esterificacion de una fuente de acido graso con un alcohol, para formar esteres de alquilo de acidos grasos, que comprende bien
(A) hacer reaccionar una fuente de acido graso y un alcohol o donante de alcohol en presencia de una preparacion de lipasa inmovilizada, en el que la preparacion de lipasa inmovilizada comprende al menos una lipasa inmovilizada sobre un soporte poroso hidrofobo y el medio de reaccion contiene una solucion acuosa de tampon alcalino en mas de un 5 % en peso de la fuente de acido graso; o
(B) hacer reaccionar una fuente de acido graso y un alcohol o un donante de alcohol en presencia de una preparacion de lipasa inmovilizada, en el que la preparacion de lipasa inmovilizada comprende al menos una lipasa inmovilizada sobre un soporte poroso hidrofobo y el medio de reaccion contiene agua en mas de un 5 % en peso de la fuente de acido graso.
En una realizacion, el procedimiento comprende (A) y la solucion acuosa de tampon tiene un pH de 7 a 11.
En otra realizacion, el procedimiento comprende (A) y la cantidad de dicha solucion de tampon alcalino en el medio de reaccion es de mas del 5 % en peso y de hasta el 99 % en peso de la fuente de acido graso.
En una realizacion adicional, el procedimiento comprende (B) y el agua esta en la forma de una solucion acuosa de sales disueltas y el pH del sistema de reaccion o de la solucion acuosa es de 3 a 11.
En una realizacion adicional, el procedimiento comprende (B) o el procedimiento de la reivindicacion 4, en el que el medio de reaccion contiene el agua o la solucion acuosa de sales disueltas en mas de un 5 % en peso y hasta un 99% en peso de la fuente de acidos grasos. Preferentemente, dicho alcohol es un alcohol de alquilo C1-C6 de
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cadena corta, y dicho donante de alcohol es un monoalquil ester, o un carbonato de dialquilo, que sirve tambien como una fuente de reactivo moderadamente alcalino en el medio de reaccion.
En el procedimiento de la invencion la mencionada solucion acuosa de tampon alcalino puede ser una solucion acuosa de tampon alcalino. La mencionada solucion acuosa de tampon alcalino puede estar contenida en la mezcla de reaccion en una cantidad de hasta un 99 % en peso de la fuente de acido graso, por ejemplo, hasta el 90 %, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 12%, 10% y 8%. Como alternativa, la mencionada solucion acuosa de tampon alcalino puede estar contenida en la mezcla de reaccion en una cantidad de mas de un 5 % en peso de la fuente de acido graso, mas de un 6 %, 8 %, 10 %, 12 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, y hasta el 99 %. La solucion acuosa tamponante puede tener un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 11, por ejemplo, uno cualquiera de 7-8,5, 7-9, 7-9,5, 7-10 y 7-11. En el procedimiento de la invencion, el pKa del reactivo moderadamente alcalino suplementado que comprende la solucion tamponante puede ser mayor o igual al pKa de los acidos libres presentes en la fuente de acido graso.
El medio de reaccion del procedimiento de la presente invencion puede comprender agua. El agua esta en la forma de agua destilada o de agua que contiene diversas sales disueltas, con un pH de entre 3 a 11. El medio de reaccion puede contener el agua o solucion acuosa en una cantidad de hasta un 99 % en peso de la fuente de acido graso, por ejemplo, hasta el 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 12%, 10% y 8%. Como alternativa, el agua o la solucion acuosa pueden estar contenidas en la mezcla de reaccion en una cantidad de mas de un 5 % en peso de la fuente de acido graso, mas de un 6 %, 8 %, 10 %, 12 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, y hasta el 99 %.
En todas las realizaciones y aspectos de la invencion, el alcohol puede ser un alcohol de cadena corta, por ejemplo, alcohol de alquilo C1-C6, mas espedficamente alcohol de alquilo C1-C4, particularmente metanol o etanol. Cuando dicho alcohol es metanol y dichos esteres de acidos grasos resultantes son esteres medicos de acidos grasos (FAME - Biocombustible). El alcohol puede ser tambien un alcohol graso de cadena intermedia (C6-C10) o alcoholes grasos de cadena larga (C12-C22). El donante de alcohol puede ser un monoalquil ester o un carbonato de dialquilo, tal como carbonato de dimetilo o carbonato de dietilo.
En todas las realizaciones y aspectos de la invencion, dicha lipasa inmovilizada es capaz de catalizar la esterificacion de los acidos grasos libres para dar como resultado esteres de alquilo de acidos grasos y agua como subproductos, y la transesterificacion de trigliceridos, gliceridos parciales, esteres de ceras, y fosfolfpidos para dar como resultado esteres de alquilo de acidos grasos y glicerol, y alcoholes grasos de cadena larga y glicerofosfolfpidos como subproductos, respectivamente.
En todas las realizaciones y aspectos de la invencion relacionados con el uso de un tampon alcalino o una solucion alcalina, la cantidad de dicho tampon o solucion alcalina en el medio de reaccion es mas de 0,001 % en peso de la fuente de acido graso.
En todas las realizaciones y aspectos de la invencion, dicha al menos una lipasa puede ser una lipasa derivada de una cualquiera de Rhizomucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus niveus, Mucor javanicus, Rhizopus oryzae, Aspergillus niger, Penicillium camembertii, Alcaligenes sp., Acromobacter sp., Burkholderia sp., Thermomyces lanuginosus, Chromobacterium viscosum, Candida antarctica B, Candida rugosa, Candida antarctica A, semillas de papaya y pancreatina. La preparacion de lipasa puede comprender al menos dos lipasas que pueden inmovilizarse por separado sobre un soporte hidrofobo o coinmovilizarse sobre el mismo soporte hidrofobo. Las mencionadas lipasas son capaces de catalizar de forma simultanea o consecutiva la esterificacion de los acidos grasos libres para dar como resultado esteres de alquilo de acidos grasos y agua como subproducto, y la transesterificacion de trigliceridos y gliceridos parciales para dar como resultado esteres de alquilo de acidos grasos y glicerol como subproductos, y/o las transesterificacion de fosfolfpidos para dar como resultado esteres de alquilo de acidos grasos y lisofosfolfpidos y glicerofosfolfpidos como subproductos.
En todas las realizaciones y aspectos de la invencion, dicho soporte puede ser uno cualquiera de un soporte basado en un polfmero alifatico hidrofobo y un soporte basado en un polfmero aromatico hidrofobo. El mencionado soporte de polfmero hidrofobo puede comprender cadenas organicas lineales o ramificadas. El mencionado soporte puede comprender cadenas de polfmeros o copolfmeros organicos macrorreticulares. El mencionado soporte puede ser un soporte inorganico poroso o no poroso, que puede ser hidrofobo o estar revestido con un material organico hidrofobo. El mencionado material organico puede ser una cadena organica hidrofoba lineal, ramificada, o funcionalizada.
En todas las realizaciones y aspectos de la invencion donde se usa una solucion tamponada alcalina, la mencionada solucion acuosa tamponada alcalina puede ser una solucion de una sal alcalina inorganica o una base inorganica. La mencionada solucion tamponada alcalina puede ser una solucion de uno cualquiera de un hidroxido metalico alcalino, carbonato, bicarbonato, fosfato, sulfato, acetato y citrato, sales de acidos grasos, aminas primarias, secundarias y terciarias, y cualquiera de sus mezclas. En realizaciones espedficas, la mencionada solucion tamponada alcalina puede ser una solucion de una base debil seleccionada entre bicarbonatos y carbonatos de sodio o potasio. En algunas realizaciones espedficas del procedimiento de la invencion, la mencionada solucion tamponada alcalina puede anadirse a dicha fuente acida en un estado de premezcla o directamente al medio de
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reaccion.
En todas las realizaciones y aspectos de la invenciOn donde se usa una soluciOn tamponada alcalina, el contenido de dicha soluciOn tamponada alcalina en el medio de reacciOn de transesterificaciOn/esterificaciOn puede estar en una cantidad de mas de 0,001 % en peso de la materia prima oleosa, por ejemplo, 1-30 % en peso, 1-20 % en peso, 1-10 % en peso, 1-5 % en peso o 1-2 % en peso de la materia prima oleosa, o cantidades de mas de un 5 % en peso de la materia prima oleosa, por ejemplo, mas de un 6 %, 7 %, 8 %, 10 %, 12 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 % y 50 % en peso de la materia prima oleosa.
En algunas realizaciones de la invenciOn, la fuente de acido graso puede mezclarse en primer lugar con la soluciOn tamponada alcalina o con el agua o la soluciOn acuosa, y la mezcla puede tratarse a continuaciOn con dicha preparaciOn de lipasa inmovilizada, seguido por la adiciOn de dicho alcohol y permitiendo que la reacciOn continue en condiciones adecuadas hasta que dicha fuente de acido graso se convierta en esteres de acidos grasos.
En todas las realizaciones y aspectos de la invenciOn, dicha fuente de acidos grasos puede ser una cualquiera de un aceite vegetal, grasas animales, aceite de algas, aceite de pescado, aceites residuales y cualquier mezcla de los anteriores. La mencionada fuente de acido graso puede comprender acidos grasos libres, monogliceridos, digliceridos o trigliceridos, sus mezclas en cualquier relaciOn, en ausencia o presencia de otros derivados de acidos grasos minoritarios tales como fosfolfpidos, esteres de ceras y esteres de esteroles. La fuente de acido graso puede ser no refinada, refinada, decolorada, desodorizada o cualquiera de sus combinaciones.
En todas las realizaciones y aspectos de la invenciOn, la reacciOn puede llevarse a cabo a una temperatura entre 10°C y 100°C, espedficamente entre 25-30 °C
En todas las realizaciones y aspectos de la invenciOn, la mencionada fuente de acido graso puede premezclarse con dicho alcohol o donante de alcohol y con dicho agua o soluciOn tamponada en un recipiente de preparaciOn prerreacciOn para formar una emulsiOn que se puede alimentar junto con dicha preparaciOn de lipasa inmovilizada en un recipiente de reacciOn transesterificaciOn/esterificaciOn.
En todas las realizaciones y aspectos de la invenciOn, dicha lipasa inmovilizada se puede usar en reactores en columna de lecho empaquetado que funcionan en modo discontinuo o continuo.
Se describe tambien en el presente documento un sistema para la transesterificaciOn/ esterificaciOn de un acido graso con un alcohol, para formar esteres de alquilo de acidos grasos, que comprende:
un recipiente de reacciOn configurado para hacer reaccionar un medio de reacciOn incluyendo un acido graso y al menos uno de un alcohol y un donante de alcohol en presencia de una preparaciOn de lipasa inmovilizada, en el que la preparaciOn de lipasa inmovilizada comprende al menos una lipasa inmovilizada sobre un soporte poroso hidrOfobo y el medio de reacciOn contiene al menos uno de una soluciOn tamponada alcalina acuosa y agua.
El sistema puede comprender una o mas de las siguientes caractensticas, en cualquier combinaciOn o permutaciOn deseada:
A. El recipiente de reacciOn puede comprender la preparaciOn de lipasa inmovilizada, al menos durante el funcionamiento de dicho sistema para la producciOn de esteres de alquilo de acidos grasos.
B. Adicional o alternativamente a la caractenstica A, el recipiente de reacciOn puede comprender el acido graso y el al menos uno de un alcohol y un donante de alcohol, al menos durante el funcionamiento de dicho sistema para la producciOn de esteres de alquilo de acidos grasos.
C. Adicional o alternativamente a las caractensticas A o B, dicho medio de reacciOn comprende una mezcla, dicho sistema comprende ademas un recipiente prerreacciOn en comunicaciOn de fluidos selectiva con dicho recipiente de reacciOn, estando configurado dicho vaso de prerreacciOn para premezclar al menos el acido graso y al menos uno de un alcohol y un donante de alcohol para formar dicha mezcla, y para administrar selectivamente dicha mezcla a dicho recipiente de reacciOn al menos durante el funcionamiento de dicho sistema para la producciOn de dichos esteres de alquilo de acidos grasos. El sistema puede comprender ademas opcionalmente una fuente de acido graso en comunicaciOn de fluidos selectiva con dicho recipiente de reacciOn y configurada para administrar selectivamente el acido graso a dicho recipiente de prerreacciOn al menos durante dicho funcionamiento de dicho sistema, y una fuente de alcohol en comunicaciOn de fluidos selectiva con dicho recipiente de prerreacciOn y configurada para administrar selectivamente el al menos uno de un alcohol y un donante de alcohol a dicho recipiente de prerreacciOn al menos durante dicho funcionamiento de dicho sistema. El sistema puede comprender ademas opcionalmente una fuente tamponada en comunicaciOn de fluidos selectiva con dicho recipiente de prerreacciOn y configurada para administrar selectivamente al menos uno de una soluciOn tamponada alcalina acuosa y agua a dicho recipiente de prerreacciOn que se va a incluir en dicha mezcla al menos dicho funcionamiento de dicho sistema.
D. Adicional o alternativamente a las caractensticas A a C, el sistema puede configurarse para administrar selectivamente uno o mas del acido graso y/o el al menos uno de un alcohol y un donante de alcohol y/o el al menos una de una soluciOn tamponada alcalina acuosa y agua a dicho recipiente de prerreacciOn cada uno tanto de manera continua como en lotes discretos, al menos durante dicho funcionamiento de dicho sistema.
E. Adicional o alternativamente a las caractensticas A a D, el recipiente de prerreacciOn puede configurarse para
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administrar selectivamente dicha mezcla a dicho recipiente de reaccion de una manera continua y/o en lotes discretos, al menos durante el funcionamiento de dicho sistema.
F. Adicional o alternativamente a las caractensticas A a E, el sistema se puede configurar para administrar de forma selectiva y directa a dicho recipiente de reaccion al menos uno del acido graso; el al menos uno de un alcohol y un donante de alcohol; y la al menos una de una solucion tamponada alcalina acuosa y agua.
G. Adicional o alternativamente a las caractensticas A a F, el recipiente de reaccion puede comprender un sistema de regulacion termica configurado para mantener el medio de reaccion en dicho recipiente de reaccion en un intervalo de temperatura seleccionado.
H. Adicional o alternativamente a las caractensticas A a G, el sistema puede comprender opcionalmente ademas una disposicion de retencion configurada para retener la preparacion de lipasa inmovilizada en dicho recipiente de reaccion al menos durante el funcionamiento de dicho sistema.
I. Adicional o alternativamente a las caractensticas A a H, el sistema comprende ademas un recipiente de separacion de producto en comunicacion de fluidos selectiva don dicho recipiente de reaccion, estando configurado dicho sistema para administrar selectivamente una mezcla de reaccion que incluye productos de reaccion de dicho recipiente de reaccion a dicho recipiente de separacion de producto, y en el que dicho recipiente de separacion de producto se configura para separar selectivamente el rendimiento de los esteres de alquilo de acidos grasos de la mezcla de reaccion administrada a los anteriores. Por ejemplo, el recipiente de separacion del producto puede ser uno de un sistema de separacion por centnfuga y gravedad.
J. Adicional o alternativamente a las caractensticas A a 1, el recipiente de reaccion se configura para administrar selectivamente dicha mezcla de reaccion a dicho recipiente de separacion de producto de una manera continua y/o en lotes discretos al menos durante dicho funcionamiento de dicho sistema.
K. Adicional o alternativamente a las caractensticas I a J, el sistema se configura para administrar selectivamente dicho rendimiento de esteres de alquilo de acidos grasos desde dicho recipiente de separacion de producto. Por ejemplo, el sistema se configura para administrar selectivamente dicho rendimiento de esteres de alquilo de acidos grasos desde dicho recipiente de separacion de producto de una manera continua y/o en lotes discretos.
L. Adicional o alternativamente a las caractensticas A a K, el sistema se configura para aumentar dicho rendimiento de los esteres de alquilo de acidos grasos de la mezcla de reaccion administrada a dicho recipiente de separacion de producto. En una configuracion del sistema que tiene esta caractenstica, el sistema se configura para redirigir dicho rendimiento de los esteres de alquilo de acidos grasos a dicho recipiente de reaccion para aumentar ademas dicho rendimiento de dichos esteres de alquilo de acidos grasos de la mezcla de reaccion posteriormente administrada a dicho recipiente de separacion de producto. En otra configuracion del sistema que tiene esta caractenstica, el sistema se configura para redirigir selectivamente dicho rendimiento de los esteres de alquilo de acidos grasos a un modulo reactor auxiliar, en el que dicho modulo reactor auxiliar comprende un recipiente reactor auxiliar y un recipiente de separacion de producto auxiliar, en el que dicho rendimiento aumentado adicional de los esteres de alquilo de acidos grasos se administra posteriormente de forma selectiva mediante dicho recipiente de separacion de producto auxiliar.
Breve descripcion de las figuras
A fin de comprender la invencion y de ver como puede llevarse a cabo en la practica, se describiran ahora las realizaciones, por medio de un unico ejemplo no limitante, con referencia a los dibujos acompanantes, en los que:
Figura 1: La conversion del aceite de soja en esteres metflicos de acidos grasos y glicerol despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador (Thermomyces lanuginosus (TL) inmovilizado sobre un soporte de DVB-PS) en multiples lotes experimentales, a diferentes concentraciones de solucion de bicarbonato de sodio de 0.1 M. Se anadio metanol a la mezcla de reaccion en una etapa en una relacion en base molar de 1:3 entre aceite y metanol.
Abreviaturas: Conv. - conversion; Cic. - ciclo; Sol. - solucion
Figura 2: La conversion de aceite de soja en biodiesel y glicerol despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador (Pseudomonas sp. (SP) inmovilizado sobre un soporte de DVB-PS) en multiples lotes experimentales a diferentes concentraciones de una solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M. Se anadio metanol a la mezcla de reaccion en una etapa sobre una relacion en base molar de 1:3 entre aceite y metanol. Abreviaturas: Conv. - conversion; Cic. - ciclo; Sol. - solucion
Figura 3: La conversion de aceite de soja en biodiesel y glicerol despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador (Thermomyces lanuginosus (TL) inmovilizado sobre un soporte de DVB-PS) en multiples lotes experimentales a diferentes concentraciones de agua destilada en la mezcla de reaccion. Se anadio metanol a la mezcla de reaccion en una etapa sobre una relacion en base molar de 1:3 entre aceite y metanol.
Abreviaturas: Conv. - conversion; Cic. - ciclo; Agu. - agua
Figura 4: La conversion de acido oleico en biodiesel y agua tras 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador (Thermomyces lanuginosus (TL) inmovilizado sobre un soporte de DVB-PS) en multiples lotes experimentales en diferentes concentraciones de solucion de bicarbonato de sodio. Se anadio metanol 0,1 M a la mezcla de reaccion en una etapa sobre la relacion en base molar de 1:3 entre aceite y metanol.
Abreviaturas: Conv. - conversion; Cic. - ciclo; Sol. - solucion
Figura 5: La conversion de diferentes mezclas de trigliceridos de acido oleico y aceite de soja en biodiesel, glicerol y agua despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador Thermomyces
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lanuginosus (TL) inmovilizado sobre un soporte de DVB-PS) en multiples lotes experimental en presencia de una solucion de bicarbonato de sodio al 8 % en peso 0,1 M. Se anadio metanol a la mezcla de reaccion en una etapa sobre una relacion en base molar de 1:3 entre aceite y metanol.
Abreviaturas: Conv. - conversion; Cic. - ciclo; Ac. ol. Acido oleico
Figura 6: La conversion de los aceites brutos que contienen fosfolfpidos en biodiesel y glicerol despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador (Thermomyces lanuginosus (TL) inmovilizado sobre un soporte de DVBPS) en multiples lotes experimentales en presencia de una solucion de bicarbonato de sodio al 8 % en peso. Se anadio metanol 0,1 M a la mezcla de reaccion en una etapa sobre una relacion en base molar de 1:3 entre aceite y metanol.
Abreviaturas: Conv. - conversion; Cic. - ciclo; RS- BO - aceite de soja refinado; CSBO - aceite de soja bruto; RSBO - aceite de soja refinado; PL - fosfolfpidos; O - aceite;
Figura 7: La conversion de aceite de soja en biodiesel y glicerol despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador Thermomyces lanuginosus (TL) inmovilizado sobre un soporte de DVB-PS) en
multiples lotes experimentales a diferentes valores de pH de una solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M. La
concentracion de tampon en el medio de reaccion era del 8 % en peso del aceite. Se anadio metanol a la mezcla de reaccion en una etapa sobre una relacion en base molar de 1:3 entre aceite y metanol.
Abreviaturas: Conv. - conversion; Cic. - ciclo
Figura 8: La conversion de aceite de soja en biodiesel y glicerol despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador (Thermomyces lanuginosus (TL) inmovilizado sobre un soporte de DVB-PS) en
multiples lotes experimentales a diferentes concentraciones de una solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M. La
concentracion de tampon en el medio de reaccion era de 8 % en peso de aceite. Se anadio metanol a la mezcla de reaccion en una etapa sobre una relacion en base molar de 1:3 entre aceite y metanol.
Abreviaturas: Conv. - conversion; Cic. - ciclo; Acet. - acetato
La Fig. 9: ilustra esquematicamente un sistema para la produccion de esteres de alquilo de acidos grasos.
La Fig. 10 ilustra esquematicamente un sistema para la produccion de esteres de alquilo de acidos grasos.
Descripcion detallada de la invencion
En la busqueda de la mejora de procedimientos industriales catalizados enzimaticamente, particularmente, procedimientos para transesterificacion/esterificacion de una fuente de acidos grasos con un alcohol en presencia de lipasa(s), inmovilizada(s), los presentes inventores han desarrollado condiciones espedficas bajo las cuales, la estabilidad de la(s) lipasa(s) inmovilizadas se preserva sobre las puntuaciones de los ciclos de produccion.
En una realizacion de la invencion, la invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de esteres de alquilo de acidos grasos, particularmente esteres de alquilo de acidos grasos de cadena corta, tales como esteres metilicos y etflicos de acidos grasos (biodiesel) en un sistema microacuoso alcalino exento de disolvente. En realizaciones espedficas, el sistema microacuoso alcalino es un sistema microacuoso alcalino suave. El procedimiento comprende proporcionar una fuente de acido graso y hacer reaccionar esta con un alcohol libre o un donante de alcohol, en presencia de una preparacion de lipasa inmovilizada, en las mencionadas condiciones alcalinas o alcalinas suaves. Sin pretender quedar vinculado por teona alguna, el pretratamiento de la fuente de acido graso con una solucion tamponada alcalina da como resultado la neutralizacion de acidos que pueden tener un efecto inhibidor sobre la enzima. La cantidad de alcohol necesaria para finalizar la reaccion hasta una conversion del 100 % se puede anadir por etapas o en un lote. Ademas, el alcohol puede ser un alcohol de cadena corta, por ejemplo, metanol o etanol. Se pueden usar otros donantes de alcohol en la reaccion con la fuente de acido graso en presencia de una hidrolasa y permitiendo que proceda la reaccion en las condiciones adecuadas, hasta que dicha fuente de acido graso se convierta en esteres de alquilo de acidos grasos, espedficamente, esteres de metilo de acidos grasos (FAME) o esteres de etilo de acidos grasos, en el que dicha preparacion de hidrolasa comprende una o mas lipasas, inmovilizadas por separado o juntas sobre un soporte basado en polfmero hidrofobo poroso macrorreticular adecuado.
En una realizacion adicional, la reaccion de transesterificacion/esterificacion entre la fuente de acido graso y el alcohol o donante de alcohol se lleva a cabo en un microambiente acuoso, con adicion de agua a la mezcla de reaccion. En las realizaciones espedficas se puede anadir agua en una cantidad superior a 0,0001 % en peso (sobre la base de la fuente de acido graso). Por agua, como se usa aqrn, se entiende agua pura o agua destilada, y tambien "soluciones acuosas" (denominadas tambien soluciones acuosas), que pueden ser, pero no de forma limitativa, agua corriente, agua de mar o agua procedente de cualquier otro recurso o deposito de agua natural, agua desalinizada, agua purificada qrnmica o enzimaticamente o agua tratada, y cualesquiera otras soluciones acuosas, por ejemplo, soluciones salinas disueltas. El pH del sistema de reaccion o de la solucion puede variar, y puede ser, por ejemplo, aproximadamente 3-11, por ejemplo 4-10, 5-10, 5-9, 6-10, 6-9, o 7-9.
El procedimiento de la invencion puede llevarse a cabo eliminando continuamente a la vez el glicerol formado y cualquier agua en exceso procedente de la mezcla de reaccion. La conversion de los grupos acilo de los acidos grasos o de los acidos grasos libres comprendido en dicha fuente de acidos grasos en alquilos de acidos grasos, espedficamente esteres metflicos, se puede vigilar en diversos puntos temporales durante la reaccion. El medio de reaccion puede retirarse por medios adecuados en cualquier punto temporal deseado durante la reaccion, deteniendo por tanto la reaccion, y los esteres metflicos de acidos grasos formados y opcionalmente el glicerol formado se afslan del medio de reaccion. La reaccion puede detenerse espedficamente cuando la conversion de los
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grupos acilo de los acidos grasos o los acidos grasos libres comprendidos en dicha fuente de acidos grasos en esteres metflicos de acidos grasos ha alcanzado al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 85 %, o al menos un 90 %.
El sistema de reacciones puede ser similar al descrito en la patente WO 2009/069116 en tramitacion junto con la presente. Por ejemplo, el sistema de produccion puede usar un reactor tanque agitado con filtro de vidrio o acero inoxidable sinterizado en la parte inferior que retiene el biocatalizador en el reactor, sin embargo, permite al medio de reaccion la permeacion a traves del reactor. Dicha configuracion del reactor permite que los subproductos, espedficamente glicerol y agua, que se autodesorben a partir de la enzima inmovilizada, para hundirse en la parte inferior del reactor, y permear a traves del filtro. El resultado es la eliminacion continua del glicerol formado desorbido y tambien del agua en exceso, fuera del medio de reaccion, conduciendo al cambio de la reaccion hacia la smtesis, alcanzando de esta forma conversiones por encima del 98 %. El biocatalizador utilizado es este reactor puede estar comprendido por lipasas de un solo tipo o de varios tipos, en consideracion a su especificidad de posicion, asf como a su origen, tal como se describe en el presente documento. De forma alternativa, se pueden usar dos reactores tanque agitado consecutivos con un filtro en la parte inferior. Se puede usar un tanque de sedimentacion o centnfuga entre los dos reactores. El primer reactor puede contener un biocatalizador inmovilizado comprendido por un solo tipo o varios tipos de lipasas. El papel del tanque de sedimentacion o la centnfuga entre ambos reactores es eliminar el glicerol formado y el agua en exceso del medio de reaccion, conduciendo a un aumento en la conversion de las materias primas en sus esteres de alquilo de acidos grasos correspondientes por encima del 98 % en el segundo reactor en un tiempo de reaccion razonable. Se describen a continuacion algunos sistemas y procedimientos de reaccion espedficos.
Los terminos "mezcla de reaccion", "sistema de reaccion" y "medio de reaccion" se pueden usar en el presente documento como sinonimos.
El uso de lipasas inmovilizadas sobre resinas hidrofobas en presencia de una solucion tamponada alcalina o agua, como en las realizaciones del procedimiento de invencion, asegura una elevada estabilidad de la enzima y tambien evita la acumulacion de sustancias hidrofilas, tal como agua y el subproducto de glicerol formado, sobre el biocatalizador. En todos los aspectos y realizaciones del procedimiento de la invencion en el que se usa tampon alcalino o alcalino suave, se usa en mas de una solucion tamponante alcalina o alcalina suave al 5 %, por ejemplo, pero no de forma limitativa a 5-50 %, 5-45 %, 5-40 %, 5-35 %, 5-30 %, 5-25 %, 5-20 %, 5-15 %, 5-10 %, 5-8 %, tales como pero no de forma limitativa al 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 10 %, 12 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, o 70 %. Los niveles de la solucion tamponada alcalina o alcalina suave pueden ser de hasta un 99 % en peso. en todos los aspectos y realizaciones de la invencion donde se utilizan agua o una solucion acuosa, el agua o la solucion acuosa se usan a niveles de mas del 5 %, por ejemplo, 5-50 %, 5-50 %, 5-50 %, 5-30 %, 5-30 %, 5-30 %, 5-20 %, 5-20 %, 5-20 %, tal como mas del 6 %, 7 %, 8 %, 10 %, 12 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, o 70 %. Los niveles de agua o de solucion acuosa en la mezcla de reaccion pueden ser de hasta un 99 % en peso. Como se ha mencionado, cuando se usa una solucion alcalina, esta puede neutralizar los acidos normalmente presentes en la fuente de acidos grasos o los producidos debido a reacciones secundarias. La eliminacion activa continua de estos subproductos puede aumentar ademas la eficacia del procedimiento. El glicerol aislado puede utilizarse industrialmente.
La fuente de acido graso utilizada en el procedimiento de la invencion puede comprender al menos uno de aceite de soja, aceite de canola, aceite de algas, aceite de semillas de colza, aceite de oliva, aceite de ricino, aceite de palma, aceite de girasol, aceite de cacahuete, aceite de semillas de algodon, aceite de Jatropha, aceite de mafz bruto, aceite de pescado, grasas derivadas de animales, aceite de cocina usado, grasa amarilla, trigliceridos de aceite derivados de fuentes vegetales no comestibles, gliceridos parciales y acidos grasos libres derivados de aquellos aceites o de cualquier mezcla de al menos dos de los anteriores, en cualquier relacion deseada.
Se presenta un ejemplo para el uso del aceite bruto como fuente de acidos grasos en la Fig. 6, donde se usa aceite de soja bruto. Esta figura muestra tambien el uso de fosfolfpidos que contienen aceite, a diversas concentraciones, como la fuente de acido graso. Se ilustra el uso de una mezcla de acidos grasos libres con aceite, a modo de ejemplo, en la Fig. 5, donde una mezcla de acido oleico con aceite, a diversas concentraciones, y tambien de acido oleico per se (100 %) sirvio como la fuente de acido graso.
En todos los procedimientos de la invencion, los esteres de alquilo de acidos grasos de cadena corta formados por la reaccion son espedficamente esteres de metilo, etilo, /so-propilo o butilo (biodiesel). Otros alcoholes grasos de cadena media (C6-C10) y alcoholes grasos de cadena larga (C12-C22) pueden utilizarse tambien en el procedimiento de produccion de la presente invencion. Estos alcoholes mas largos pueden ser espedficamente adecuados en la produccion de ceras, por ejemplo, para productos cosmeticos.
Las lipasas pueden ser lipasas derivadas de Thermomyces lanug/nosus, Rh/zomucor m/ehe/, Mucor m/ehe/, Pseudomonas sp., Rh/zopus sp., Mucor javan/cus, Pen/c/ll/um roquefort/, Asperg/llus n/ger, Chromobacter/um v/scosum, Acromobacter sp., Burkholder/a sp., Cand/da antarct/ca A, Cand/da antarct/ca B, Cand/da rugosa, Alcal/genes sp., Pen/c/ll/um camembert//, semillas de papaya y pancreatina, pero no estan limitados a lo anterior.
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Las lipasas pueden inmovilizarse juntas sobre un soporte adecuado, de forma espedfica un soporte basado en un poKmero alifatico hidrofobo o un soporte polimerico aromatico hidrofobo. Cada una de dichas lipasas puede inmovilizarse sobre un soporte adecuado, en el que los soportes sobre los cuales se inmovilizan son identicos o diferentes. Las lipasas empleadas pueden ser reg/'oespedficas de su sustrato, o aleatorias. Cuando se usa mas de una lipasa, las lipasas pueden inmovilizarse sobre el mismo o en diferentes soportes hidrofobos. Las lipasas coinmovilizadas sobre el mismo soporte pueden presentar selectividades de sustrato identicas o diferentes o reg/oespecificidades en sus sustratos.
Las lipasas pueden ser regioespedficas (o espedficas de sitio), utilizarse cada una sola o en combinacion con lipasas de la misma o diferente especificidad de sitio. Cuando se hace referencia a las posiciones sn-1, sn-2 o sn-3, estas son posiciones en la estructura del glicerol de los diversos gliceridos. Por lo tanto, las lipasas usadas en el procedimiento de la invencion pueden poseer una selectividad hacia la posicion sn-2 mayor que la de las lipasas aleatorias, es decir, su aceptacion cataliza la reaccion entre el alcohol o el alcohol donante con el grupo acilo graso de la posicion sn-2, mientras que las lipasas aleatorias presentan la misma actividad de transesterificacion para los grupos acilo grasos en las tres posiciones de la estructura del glicerol. Algunas lipasas presentan unicamente actividad posicional sobre la posicion sn-2, especialmente en las condiciones espedficas determinadas por los sustratos, productos, etc. Otras lipasas utilizadas en el procedimiento de la invencion son las espedficas de la posicion sn-1,3. Se pueden usar solas o junto con una lipasa aleatoria, espedficamente la lipasa que tiene afinidad con los gliceridos parciales, y opcionalmente una tercera lipasa con una elevada afinidad por la posicion sn-2.
El soporte es espedficamente un soporte hidrofobo poroso y macrorreticular, que pueden ser tanto organicos como inorganicos. Los ejemplos de soportes son soportes inorganicos porosos, tales como, pero no se limitan a soportes basados en sflice y/o alumina, y soportes organicos hidrofobos tales como, pero no de forma limitativa, soportes polimericos o basados en polfmeros. Los soportes pueden contener opcionalmente grupos funcionales activos seleccionados entre grupos epoxi y/o grupos aldehfdo, o grupos ionicos.
El soporte insoluble utilizado en los procedimientos de la invencion es espedficamente un soporte poroso y un soporte basado en un polfmero alifatico o aromatico hidrofobo reticular, tal como AmberliteR XAD 1600 y SepabeadsR SP70 comprendidos ambos por una resina microrreticular porosa preparada a partir de divinilbenceno o a partir de una mezcla de divinilbenceno y poliestireno, AmberliteR XAD 7HP comprendida por un polfmero acnlico alifatico microrreticular, y un polfmero alifatico poroso tal como polipropileno poroso (AccurelR).
El soporte puede ser un polfmero hidrofobo reticular comprendido por divinilbenceno, o una mezcla de divinilbenceno y estireno, y un polfmero alifatico hidrofobo reticular comprendido por polfmeros acnlicos alifaticos o polialqueno, tal como polipropileno. Los soportes espedficos son matrices porosas, de un tamano de poro en el intervalo de 25-1000 A, y mas espedficamente en el intervalo de 80-200 A. El soporte puede ser tambien sflice hidrofoba porosa en polvo o granular u otros oxidos inorganicos. El soporte puede ser tambien sflice hidrofobizada porosa en polvo o granular u otros oxidos inorganicos. En realizaciones espedficas, el area superficial de las resinas de soporte es mayor de 100 m2/g.
La cantidad de solucion acuosa alcalina o alcalina suave que se va a suplementar en la reaccion de transesterificacion/esterificacion catalizada por lipasa entre la fuente de acidos grasos y el alcohol se ajusta generalmente de acuerdo con las otras condiciones de reaccion, los materiales de partida, el biocatalizador, etc. Se puede variar esta cantidad, como se enumera e ilustra en el presente documento. Se prepara esta solucion alcalina, por ejemplo, a partir de una base o sal alcalina inorganica o a partir de una base organica. Las bases y sales inorganicas son, por ejemplo, hidroxidos de metales alcalinos, carbonatos, bicarbonatos, fosfatos, sulfatos, acetatos y citratos. Las bases organicas pueden ser, por ejemplo, aminas primarias, secundarias o terciarias. Se contemplan tambien las mezclas de estos agentes alcalinos. En el procedimiento de acuerdo con la invencion, el pH del microambiente de la enzima inmovilizada se mantiene a valores alcalinos o alcalinos suaves. La adicion del agua destilada al sistema de reaccion mejora el rendimiento de las lipasas inmovilizadas sobre un soporte hidrofobo (resinas). Como se ilustra en la Fig. 3, se puede anadir agua incluso en cantidades elevadas, a la vez que se preserva la estabilidad del biocatalizador (enzima inmovilizada), por ejemplo, en un contenido de agua del 30 % en peso, el mismo lote de biocatalizador presento un 60 % de actividad de conversion tras como mucho 50 ciclos. La adicion de diversos tampones alcalinos, con diferentes valores de pH dependiendo del tipo de base utilizado, dio como resultado tambien la estabilizacion de las lipasas inmovilizadas sobre soportes hidrofobos (resinas), tal como se muestra, por ejemplo, en las Figs. 1, 2 y 4, que muestran que elevados niveles de soluciones alcalinas acuosas no perjudican la actividad del biocatalizador, con, por ejemplo, aproximadamente de tasas de conversion del 60 %, en el mismo lote de biocatalizador, al 30 % en peso de una solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M en el sistema de reaccion, despues de mas de como mucho 50 ciclos de la reaccion. Sin pretender quedar vinculado por teona alguna, se necesitan elevadas concentraciones de agua a medida que la enzima puede hidrolizar preferentemente ademas los enlaces ester en las formas de gliceridos y esterificar consecutivamente los acidos grasos libres formados con el alcohol suplementado. El agua anadida puede suprimir tambien la extraccion de moleculas de agua esenciales para mantener la configuracion catalttica enzimatica favorecida. Los tampones de carbonato y bicarbonato son ejemplos de bases suaves que son eficaces para aumentar la estabilidad de las lipasas inmovilizadas sobre soportes hidrofobos. Se describen en el presente documento otras bases adecuadas. La solucion alcalina suave como se usa en el presente documento es generalmente una solucion con un pH de entre 7 a aproximadamente 11, por ejemplo, 7-8,5, 7-9, 7-9,5, 7-10 o 7-11. En general, la cantidad de solucion acuosa
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alcalina o alcalina suave utilizada se expresa en porcentajes en peso (% en peso) sobre la base de la cantidad de aceite utilizado en la reaccion.
El uso de lipasas inmovilizadas sobre soportes basados en poUmeros hidrofobos porosos (resinas) en presencia de una solucion alcalina o alcalina suave, asf como en presencia de agua o soluciones acuosas como se define en el presente documento, en las cantidades enumeradas anteriormente e ilustradas tambien espedficamente, da como resultado la estabilizacion de la actividad de los biocatalizadores en las reacciones de transesterificacion/esterificacion entre la fuente de acidos grasos y el alcohol. Esto se muestra en los siguientes ejemplos.
La fuente de acido graso es al menos una de trigliceridos, gliceridos parciales, acidos grasos libres, fosfolfpidos, esteres y amidas de acidos grasos o una mezcla comprendida por al menos dos fuentes de aminoacidos.
La produccion de esteres de alquilo de acidos grasos se lleva a cabo mediante transesterificacion o esterificacion, ya sea simultanea o secuencialmente. Bajo dicho sistema de reaccion, la actividad del biocatalizador se mantiene sin perdidas de actividad significativas en multiples usos y evita tambien la acumulacion de subproductos de glicerol y agua u otros compuestos hidrofilos sobre el biocatalizador.
La presente invencion proporciona procedimientos que emplean enzimas interfaciales inmovilizadas que retienen una elevada actividad y estabilidad sobre muchos ciclos de produccion. Espedficamente, se usa la preparacion de lipasas y fosfolipasas, en las reacciones de transesterificacion/esterificacion. Estas reacciones pueden emplearse en la produccion de artfculos alimentarios, cosmeticos y biocombustibles ("biodiesel"). De especial interes, estas enzimas se pueden usar para la smtesis de esteres de alquilo de acidos grasos de cadena corta para su uso como "biodiesel".
La presente invencion emplea enzimas interfaciales inmovilizadas estables, de elevada tolerancia hacia los alcoholes de cadena corta, tales como metanol, etanol y glicerol, asf como acidos grasos de cadena corta, tales como acido acetico. El uso de estas preparaciones de enzimas evita tambien la acumulacion en el biocatalizador inmovilizado de sustancias hidrofilas, espedficamente glicerol y agua.
En una realizacion de la invencion se proporciona un procedimiento para reacciones de
transesterificacion/esterificacion simultaneas o secuenciales de una fuente de acido graso con un alcohol utilizando uno o mas tipos de lipasas, inmovilizadas sobre un soporte hidrofobo (resina), en presencia de una solucion acuosa alcalina o alcalina suave, para obtener el producto deseado, concretamente, esteres de alquilo de acidos grasos, aproximandose a completar las conversiones durante un tiempo de reaccion razonable, habitualmente por debajo de 5 horas. Una solucion alcalina suave, por ejemplo, una solucion 0,001 M, 0,1 M, 0,5 M o 1 M de bicarbonato de sodio, puede estar presente en el sistema de reaccion en una cantidad de mas de un 5 % en peso de la cantidad de aceite utilizada en la reaccion, por ejemplo, 6 %, 8 %, 10 %, 12 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 % o 50 % en peso.
Como se muestra en los siguientes Ejemplos, el tiempo de vida en funcionamiento de las lipasas puede extenderse tambien utilizando un soporte de resina hidrofoba para la inmovilizacion de la lipasa en combinacion con el uso de una solucion tamponada alcalina o alcalina suave, en los diversos niveles e intervalos y subintervalos de concentraciones enumeradas e ilustradas en el presente documento, en el medio de reaccion de transesterificacion/esterificacion. Como se muestra ademas en los siguientes Ejemplos, el contenido de agua de la mezcla de reaccion puede aumentarse con respecto al valor del pH. Por lo tanto, en otra realizacion, la estabilidad del biocatalizador aumenta con el aumento en el contenido del agua del sistema de reaccion anadiendo agua, en los diversos niveles e intervalos y subintervalos de concentraciones enumerados e ilustrados en el presente documento. Los resultados muestran que la adicion de una solucion alcalina (Figs. 1,2, 4) o agua (Fig. 3) da como resultado el mantenimiento de la actividad y estabilidad enzimatica durante muchos ciclos de la reaccion.
El alcohol o donante de alcohol empleado en los procedimientos de la invencion puede ser un alcohol de alquilo de cadena corta, espedficamente alcohol de alquilo C1-C6, mas espedficamente alcohol de alquilo C1-C4, y particularmente metanol o etanol o el alcohol donante puede ser monoalquil ester o carbonato de dialquilo, tal como carbonato de dimetilo. Un donante de alcohol tal como por ejemplo carbonato de dialquilo puede servir como una fuente para la alcalinidad o alcalinidad suave del sistema de reaccion.
Se describe tambien en el presente documento un sistema para la produccion de esteres de alquilo de acidos grasos. Con referencia a la Fig. 9, un primer ejemplo de dicho sistema, designado generalmente con la referencia numerica 100, comprende un recipiente reactor 120, un recipiente de preparacion prerreaccion 140, y un recipiente de separacion del producto 160. El recipiente de preparacion prerreaccion 140 se configura para recibir materiales de alimentacion y tampon (y/u agua), para formar una emulsion adecuada a partir del anterior, y para alimentar la emulsion preparada PE (denominada tambien en el presente documento alimento emulsionado) al recipiente del reactor 120. En particular, dichos materiales de alimentacion puede incluir acidos grasos FA (por ejemplo, aceite de cocina usado) a partir de una fuente de acido graso 182 y alcohol AL (por ejemplo, metanol) a partir de una fuente de alcohol 184, y tampon (y/o agua) BU a partir de una fuente de solucion acuosa de tampon 186, proporcionada a traves de lmeas de suministro adecuadas 152, 154, 156, respectivamente, en comunicacion de fluidos con dicho recipiente de preparacion prerreaccion 140 mediante las entradas de recipientes 172, 174, 176, respectivamente y
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las valvulas adecuadas (no se muestran).
El recipiente de preparacion de prerreaccion 140 define un volumen interno V1 en el que la mezcla de reaccion, incluyendo los materiales de alimentacion y la solucion acuosa de tampon, proporcionada en el anterior mediante entradas del recipiente 172, 174, 176, se mezclan juntos por medio de un sistema de agitacion adecuado 142, impulsado por una fuente de energfa (no se muestra), para formar la emulsion de PE. El recipiente de preparacion de la prerreaccion 140 comprende una camisa externa 149 a traves de la cual puede hacerse circular un fluido de trabajo adecuado para mantener el volumen V1 en una temperatura en estado estacionario deseada. Por ejemplo, el fluido de trabajo puede ser aceite o agua, calentado o enfriado en un recipiente diferente (no se muestra) y bombeado a traves de la camisa 149 mediante puertos de entrada y salida adecuados (no se muestran). En variaciones alternativas de este ejemplo, el recipiente de preparacion prerreaccion 140 puede comprender un sistema de elementos de calentamiento y/o enfriamiento, por ejemplo, elementos de calentamiento y/o enfriamiento alimentados electricamente, en vez de o ademas de la camisa 149.
El recipiente reactor 120 se configura para recibir la emulsion preparada PE a partir de un recipiente de preparacion prerreaccion 140, para hacer reaccionar los materiales de alimentacion en presencia de un biocatalizador BC adecuado para producir productos de reaccion RP, y para alimentar los productos de reaccion RP a partir de la mezcla de reaccion al recipiente de preparacion del producto 160. Una lmea de salida 148 proporciona una comunicacion de fluidos selectiva entre el recipiente de preparacion prerreaccion 140 y el recipiente reactor 120 mediante valvulas adecuadas (no se muestran) y permite que la emulsion preparada PE se prepare mediante el recipiente de preparacion prerreaccion 140 que se va a alimentar al recipiente reactor 120 segun se desee.
El recipiente de reaccion 120 define un volumen interno V2 en el que la emulsion preparada PE en la mezcla de reaccion, proporcionada en el anterior mediante entradas del recipiente 122, se hace reaccionar, y la mezcla de reaccion puede agitarse por medio de un sistema de agitacion adecuado 124, impulsado por una fuente de energfa (no se muestra) para formar los productos de reaccion RP. El biocatalizador BC puede comprender una enzima adecuada y se proporciona en la forma de perlas de enzimas inmovilizadas que permanecen en el recipiente reactor 120 hasta que llegan a ser ineficaces o no son suficientemente eficaces, despues de lo cual se pueden eliminar y sustituir con un nuevo biocatalizador BC. Por ejemplo, el biocatalizador BC puede comprender una lipasa derivada de Thermomyces lanuginosus inmovilizada sobre una resina basada en poliestireno-divinilbenceno porosa e hidrofoba.
El recipiente reactor 120 comprende un sistema de regulacion termica en la forma de una camisa externa 129 mediante la cual se puede hacer circular un fluido de trabajo adecuado para mantener el volumen V2 a una temperatura en estado estacionario deseada. Por ejemplo, el fluido de trabajo puede ser aceite o agua, calentado o enfriado en un recipiente diferente (no se muestra) y bombeado a traves de la camisa 129 mediante puertos de entrada y salida adecuados 123. En variaciones alternativas de este ejemplo, el sistema de regulacion termica comprende un sistema de elementos de calentamiento y/o enfriamiento, por ejemplo, elementos de calentamiento y/o enfriamiento alimentados electricamente, en vez de o ademas de la camisa 129.
La parte inferior del recipiente reactor 120 comprende una salida 127, y se proporciona un dispositivo de retencion adecuado en la forma de filtro 125 anteriormente de la salida 127 configurada para, filtrar la mezcla de reaccion. en particular los productos de reaccion RP antes de eliminarse del recipiente reactor 120, y para prevenir que se elimine el biocatalizador BC con los productos de reaccion RP.
El recipiente de separacion del producto 160 se configura para separarlo, a partir de los productos de reaccion RP, el producto P deseado (ester de alquilo de acido graso) a partir de subproductos que incluyen agua en exceso y glicerol G. La lmea de salida 147 proporciona comunicacion de fluidos selectiva entre el recipiente de separacion del producto 160 y el recipiente reactor 120 mediante valvulas adecuadas (no se muestra) y permite a los productos de reaccion RP alimentarse al recipiente de separacion de producto 160 a partir del recipiente reactor 120 segun se desea. En este ejemplo, el recipiente de separacion del producto 160 comprende un sistema de separacion por centnfuga o gravedad para llevar a cabo la separacion anteriormente mencionada, e incluye una primera salida 162 para hacer salir el producto P, y una segunda salida 164 para recoger el agua en exceso y el glicerol G. El producto P puede recogerse mediante el tapon 163.
El sistema puede hacerse funcionar de esta manera en un modo de produccion continuo, en el que la emulsion preparada Pe se alimenta en el recipiente reactor 120 y el producto deseado P se recoge de una manera continua mediante el tapon 163. La emulsion PE puede prepararse y administrarse de una manera continua en el recipiente reactor 120 para hacer que aumente el volumen de reactivo en el anterior a la misma velocidad que los productos de reaccion RP que se eliminan de la salida 127. Como alternativa, puede prepararse la emulsion PE y administrarse en lotes al recipiente reactor 120 para hacer que aumente el volumen de reactivo en la mezcla de reaccion a intervalos discretos por lo cual, el nivel de reactivos en el recipiente 120 disminuye a un nivel mmimo concreto tras la eliminacion continua de los productos de reaccion RP mediante la salida 127. Por supuesto, es tambien posible hacer funcionar el sistema 100 para proporcionar el producto deseado P en lotes mas bien que continuamente.
Como alternativa, el sistema 100 se puede hacer funcionar en un modo de rendimiento potenciado, en el que el producto P es, en vez de recogerse de forma inmediata mediante el tapon 163, redirigirse al recipiente reactor 120
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mediante un sistema de redireccionamiento opcional, incluyendo la lmea 165, entrada del recipiente 121 y valvula 166, en el que la valvula 166 puede hacerse funcionar selectivamente para desviar el producto P del tapon 163. Cuando se redirigen al recipiente reactor 120, el producto P puede hacerse reaccionar ademas con el anterior con el alcohol AL, proporcionado mediante una lmea separada (no se muestra) a partir de la fuente 184, a partir de una fuente de alcohol diferente (no se muestra), o a partir de una fuente 184 en el recipiente de preparacion prerreaccion 140, para producir un rendimiento mayor del producto P, que se puede separar de nuevo a partir de los subproductos utilizando el recipiente de separacion de producto 160. Cuando se proporciona el alcohol mediante el recipiente de preparacion 140, el ultimo se vada en primer lugar de la emulsion preparada PE, y las valvulas adecuadas evitan los acidos grasos FA y opcionalmente se proporciona un tampon acuoso por las fuentes respectivas 182 y 186. Se pueden proporcionar bombas adecuadas o alimentaciones por gravedad para transportar selectivamente los materiales respectivos a traves de las lmeas respectivas 152. 154, 156, 148, 147, 165, y monitores controladores adecuados (no se muestra) y controles de funcionamiento del sistema.
En al menos algunas variaciones alternativas del primer ejemplo, el recipiente de preparacion prerreaccion 140 puede ser integral con el recipiente reactor 120. Por ejemplo, los respectivos volumenes internos V1 y V2 pueden separarse por una pared que tiene una disposicion abierta que corresponde a la lmea 148. Como alternativa, los respectivos volumenes internos V1 y V2 pueden ser contiguos, pero el volumen interno V1 esta suficientemente separado del biocatalizador BC para proporcionar un tiempo suficiente para que se forme la emulsion PE antes de alcanzar el biocatalizador BC.
En variaciones alternativas del primer ejemplo, se pueden proporcionar uno, dos o todos los acidos grasos FA, el alcohol AL, y el tampon acuoso BU directamente al recipiente reactor 120, derivando el recipiente de preparacion prerreaccion 140. Por ejemplo, uno o mas de la fuente de acido graso 182, la fuente de alcohol 184, y la fuente de tampon acuoso 186, pueden estar en comunicacion de fluidos directamente con el recipiente reactor 120 mediante lmeas de suministro adecuadas (no se muestran) derivando el recipiente de preparacion prerreaccion 140.
Se aprecia que todos los componentes del sistema 100 de acuerdo con el primer ejemplo, o sus variaciones alternativas, son de una forma adecuada y se preparan a partir de materiales adecuados como se conoce en la materia, tales como para permitir que cada componente lleve a cabo las funciones respectivas en las condiciones respectivas, que incluyen la temperatura, presion, pH y asf sucesivamente.
Con referencia a la Fig. 10, un segundo ejemplo del sistema, designado con la referencia numero 200, comprende todos los elementos y caractensticas del primer ejemplo, incluyendo sus variaciones alternativas, incluyendo todos los componentes numerados de forma similar como en la Fig. 9, mutatis mutandis, con algunas diferencias. Por ejemplo, el sistema 200 comprende tambien: un recipiente reactor 120, un recipiente de preparacion prerreaccion 140, un recipiente de separacion del producto 160, una fuente de acidos grasos 182, la fuente de alcohol 184, una fuente de una solucion acuosa de tampon 186, lmeas de suministro 152, 154, 156, entradas del recipiente 172, 174, 176, sistema de agitacion 142, camisa externa 149, lmea de salida 148 entrada del recipiente 122, sistema de agitacion 124, biocatalizador BC camisa externa 129, puertos de entrada y salida 123, salida 127, filtro 125, lmea de salida 147 primera salida 162 segunda salida 164; como se divulga en el primer ejemplo, mutatis mutandis.
Sin embargo, en el segundo ejemplo, se omiten la lmea 165, el tapon 163 y la valvula 166 del primer ejemplo y en vez de que se conecte un modulo de reactor auxiliar 300 a la primera salida 162 del recipiente de separacion del producto 160.
El modulo del reactor auxiliar 300 comprende un recipiente de reactor auxiliar 220 y un recipiente de separacion del producto auxiliar 260, que en este ejemplo son sustancialmente similares al recipiente reactor 120 y al recipiente de separacion de producto 160, mutatis mutandis. En funcionamiento, el producto deseado P procedente del recipiente de separacion de producto 160 se dirige al recipiente reactor auxiliar 220 mediante la lmea 266, la valvula 267 y la entrada del recipiente 221. Cuando se dirige al recipiente reactor 220, el producto P puede hacerse reaccionar ademas con el anterior con el alcohol AL, proporcionado mediante una lmea separada (no se muestra) a partir de una fuente 184 o a partir de una fuente de alcohol diferente (no se muestra), para producir adicionalmente productos reaccionados FRP. La lmea 249 permite a los productos reaccionados FRP adicionales transportarse el recipiente de separacion de producto auxiliar 260, que funciona a continuacion para separar un rendimiento mayor del producto P' en subproductos.
El sistema 200 puede hacerse funcionar de una manera similar a la del sistema 100, mutatis mutandis.
Debe destacarse que, como se usa en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y “el” incluyen las referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa.
A lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a no ser que el contexto requiera otra cosa, se entendera que la palabra "comprende ", o sus variaciones tales como "comprenden" y "que comprende", implica la inclusion de un numero entero o etapa o grupo de numeros enteros indicados, pero no la exclusion de cualquier otro entero o etapa o grupo de enteros o etapas.
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Ejemplos
General
Todos los experimented se llevaron a cabo tanto en tubos de vidrio de 30 ml de volumen con fondo con un filtro de vidrio centrado o en reactores agitados mecanicamente de 500 ml de volumen con fondo con un filtro de vidrio sinterizado de porosidad de 150-250 mm. El medio de reaccion tipico contema una fuente de acido graso, alcohol, normalmente, metanol o etanol en una base molar 1:1 en relacion con el acido graso independientemente libre o unido a una estructura de glicerol (para los acidos grasos y monogliceridos libres 1:1, para los digliceridos 1:2 y para los trigliceridos 1:3 en favor del alcohol). La fuente de acido graso se premezclo con diferentes cantidades de tampon alcalino, bicarbonato de sodio en realizaciones espedficas. Las reacciones se iniciaron mediante la adicion de lipasa inmovilizada sobre una resina hidrofoba (10-15% en peso) y el medio de reaccion se sacudio tanto mecanicamente como se agito a 30 °C. La cantidad de alcohol se anadio igualmente en tres etapas con una hora de separacion entre las mismas, salvo que se indique otra cosa. Se siguieron las conversiones de la reaccion tomando muestras procedentes del medio de reaccion en intervalos de tiempo diferentes y analizando los componentes de los acidos grasos. La conversion en biodiesel se calculo como: 100* del area maxima de la suma de esteres de alquilo de acidos grasos de todas las areas maximas.
Inmovilizacion de las lipasas Se inmovilizaron las lipasas siguiendo procedimientos normalizados donde la lipasa derivada de un determinado microorganismo se solubiliza en solucion tampon 0,1 M a un determinado valor de pH, por ejemplo 7,5. Una resina de polfmero organico o inorganico se introdujo en la solucion de lipasa. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 8 horas. Se anadio opcionalmente acetona fria a la mezcla a fin de aumentar la precipitacion enzimatica de protemas sobre la resina. La mezcla se filtro y las perlas de enzimas se secaron para reducir el contenido de agua a menos del 5 %.
Se utilizaron diferentes resinas incluyendo resinas de polfmeros hidrofobos basadas en poliestireno/divinilbenceno, parafina o cualquiera de sus combinaciones, para obtener resinas de caractensticas hidrofobas. Las resinas hidrofobas tfpicas utilizadas incluyeron AmberliteR XAD 1600 (Rohm & Haas, EE.UU.) y SepabeadsR SP70 (Resindion, Italia). Las resinas hidrofilas tfpicas utilizadas incluyeron DuoliteR D568 (Rohm & Haas) y gel de sflice poroso. Se pueden inmovilizar lipasas por separado sobre una resina o diferentes lipasas se coinmovilizan sobre la misma resina.
Ejemplo 1
A. La conversion del aceite de soja en biodiesel y glicerol despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador en multiples lotes experimentales.
Condiciones de reaccion: Aceite de soja refinado y decolorado (20 g) que contema diferentes concentraciones de solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M. Se anadio metanol (2,5 ml) en una etapa. Se uso lipasa derivada de Thermomyces lanuginosus inmovilizada sobre una resina basada en poliestireno-divinilbenceno hidrofoba y porosa, (10 % en peso). El medio de reaccion se agito a 300 rpm y 30 °C. En la Fig. 1 se muestran los resultados.
B. La conversion del aceite de soja en biodiesel y glicerol despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador en multiples lotes experimentales. Condiciones de reaccion: Aceite de soja refinado y decolorado (20 g) que contema diferentes concentraciones de solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M. Se anadio metanol (2,5 ml) en una etapa. Se uso lipasa derivada de Pseudomonas sp. inmovilizada sobre una resina porosa basada en poliestireno-divinilbenceno, (10 % en peso). El medio de reaccion se agito a 300 rpm y 30 °C. En la Fig. 2 se muestran los resultados.
Las Figs. 1 y 2 muestran que la cantidad de bicarbonato de sodio en el medio de reaccion tiene un papel principal sobre la vida operativa de las lipasas Thermomyces lanuginosus y Pseudomonas sp. inmovilizadas sobre resinas hidrofobas. Esto se puede observar en las Figs. 1 y 2, que en ausencia de una solucion alcalina suave, ambas lipasas inmovilizadas perdieron drasticamente su actividad tras unos pocos ciclos, mientras que las mismas lipasas inmovilizadas mantuvieron su actividad de transesterificacion sobre multiples usos en presencia de una solucion de bicarbonato de sodio como una base en el sistema de reaccion. Los resultados de ambas enzimas inmovilizadas muestran que aumentando la cantidad de solucion de bicarbonato de sodio en el medio de reaccion en el intervalo de 0 - 30 % en peso da como resultado una actividad de transesterificacion de la enzima aumentada en multiples usos del mismo lote de enzima inmovilizada. Aumentar la cantidad de solucion de bicarbonato de sodio en mas de un 30 % en peso conduce a disminuir la actividad de la enzima. Sin pretender quedar vinculado por teona alguna, esta disminucion puede probablemente atribuirse al lavado de la enzima procedente de la resina.
Ejemplo 2
La conversion del aceite de soja en biodiesel y glicerol despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador en multiples lotes experimentales.
Condiciones de reaccion: Aceite de soja refinado y decolorado (20 g) que contema diferentes concentraciones de agua destilada. Se anadio metanol (2,5 ml) en una etapa. Se utilizo lipasa derivada de Thermomyces lanuginosus
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inmovilizada sobre una resina basada en poliestireno-divinilbenceno porosa e hidrofoba. (10% en peso). El medio de reaccion se agito a 300 rpm y 30 °C. En la Fig. 3 se muestran los resultados.
La Fig. 3 muestra que la cantidad de agua en el medio de reaccion tiene un papel principal sobre la vida operativa de la lipasa de Thermomyces lanuginosus inmovilizada sobre resinas hidrofobas. Se puede observar en la Fig. 3 que en ausencia de agua, la lipasa inmovilizada pierde drasticamente su actividad despues de unos pocos ciclos, mientras que la misma lipasa inmovilizada mantiene su actividad de transesterificacion sobre multiples usos en presencia de agua en el sistema de reaccion. Los resultados para la enzima inmovilizada muestran que aumentar la cantidad de agua en el medio de reaccion en el intervalo de 0 - 30 % da como resultado una actividad aumentada de transesterificacion de la enzima en multiples usos del mismo lote de la enzima inmovilizada, aumentando a la vez la cantidad de agua por encima del 30 % en peso, condujo a disminuir la actividad enzimatica.
Ejemplo 3
La conversion del aceite de soja en biodiesel y agua despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador en multiples lotes experimentales.
Condiciones de reaccion: Aceite de soja refinado y decolorado (20 g) que contiene diferentes concentraciones de solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M. Se anadio metanol (2,5 ml) en una etapa. Se uso lipasa derivada de Thermomyces lanuginosus inmovilizada sobre una resina basada en poliestireno-divinilbenceno hidrofoba y porosa, (10 % en peso). El medio de reaccion se agito a 300 rpm y 30 °C. En la Fig. 4 se muestran los resultados.
La Fig. 4 muestra que la concentracion de la solucion de bicarbonato de sodio en el medio de reaccion tiene un papel principal en la determinacion de la actividad de esterificacion de Thermomyces lanuginosus inmovilizada sobre una resina basada en poliestireno-divinilbenceno porosa e hidrofoba. Se puede observar en la Fig. 4 que en ausencia de agua en el sistema de reaccion la lipasa inmovilizada sobre resina hidrofoba pierde su actividad bruscamente cuando se usa en multiples lotes experimentales. Aumentar la concentracion de la solucion de bicarbonato de sodio en el intervalo de 0-205 en peso dio como resultado un aumento en la actividad de esterificacion del biocatalizador en multiples usos. Aumentar la cantidad de fase acuosa por encima del 30 % en peso dio como resultado la perdida de actividad de la enzima en multiples usos, debido con mayor probabilidad al lavado de la enzima a partir de la resina
Ejemplo 4
La conversion de mezclas de trigliceridos de acido oleico y aceite de soja en biodiesel, glicerol y agua despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador en multiples lotes experimentales.
Condiciones de reaccion: Aceite de soja refinado y decolorado conteniendo diferentes concentraciones de acido oleico (20 g) se suplemento con 8 % en peso de solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M. Se anadio metanol (2,5 ml) en una etapa. Se uso lipasa derivada de Thermomyces lanuginosus inmovilizada sobre una resina basada en poliestireno-divinilbenceno hidrofoba y porosa, (10 % en peso). El medio de reaccion se agito a 300 rpm y 30 °C. En la Fig. 5 se muestran los resultados.
La Fig. 5 muestra que la lipasa de Thermomyces lanuginosus inmovilizada sobre una resina de lipasa hidrofoba y porosa y en presencia de una solucion tampon es capaz de esterificar y transesterificar los acidos grasos libres, y los gliceridos para formar biodiesel y subproductos de glicerol y agua. Los resultados muestran tambien que las lipasas inmovilizadas mantienen su actividad catalftica sin perdidas significativas de actividad en multiples usos del mismo lote de biocatalizador durante 50 ciclos.
Ejemplo 5
La conversion de los aceites brutos que contienen fosfoftpidos en biodiesel y glicerol despues de 6 horas de reaccion utilizando el mismo lote de biocatalizador en multiples lotes experimentales.
Condiciones de reaccion: El aceite de soja bruto que contiene diferentes concentraciones de fosfoftpidos (20 g) se suplemento con 8 % en peso de solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M. Se anadio metanol (2,5 ml) en una etapa. Se utilizo lipasa derivada de Thermomyces lanuginosus inmovilizada sobre una resina basada en poliestireno- divinilbenceno porosa e hidrofoba. (10 % en peso). El medio de reaccion se agito a 300 rpm y 30 °C. En la Fig. 6 se muestran los resultados.
La Fig. 6 muestra la actividad de transesterificacion de la lipasa de Thermomyces lanuginosus inmovilizada sobre una resina de divinilbenceno-poliestireno porosa e hidrofoba. Los analisis de los resultados en contraste con los informes de bibliografta previos de las lipasas inmovilizadas sobre resinas hidrofobas en presencia de una solucion de bicarbonato de sodio son capaces de transesterificar gliceridos incluyendo fosfoftpidos para dar como resultado biodiesel, y los subproductos de glicerol y glicerofosfoftpidos. Asimismo, los resultados muestran que las lipasas mantienen su actividad catalftica de transesterificacion cuando el mismo lote de enzima inmovilizada se usa en multiples etapas.
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Ejemplo 6
A. La conversion de aceite de soja en biodiesel y glicerol utilizando el mismo lote de biocatalizador (Thermomyces lanuginosus (TL) inmovilizado sobre un soporte de DVB-PS) en multiples lotes experimentales a diferentes valores de pH para una solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M.
Condiciones de reaccion: Aceite de soja refinado y decolorado (20 g) que contema 8 % en peso de solucion de bicarbonato de sodio 0,1 M a diferentes valores de pH. Se anadio metanol (2,5 ml) en una etapa. Se uso lipasa derivada de Thermomyces lanuginosus inmovilizada sobre una resina basada en poliestireno-divinilbenceno hidrofoba y porosa, (10 % en peso). El medio de reaccion se agito a 300 rpm y 30 °C. En la Fig. 7 se muestran los resultados.
B. La conversion de aceite de soja en biodiesel y glicerol utilizando el mismo lote de biocatalizador (Thermomyces lanuginosus (TL) inmovilizado sobre un soporte de DVB-PS) en multiples lotes experimentales a diferentes valores de pH para una solucion de acetato de sodio 0,1 M.
Condiciones de reaccion: Aceite de soja refinado y decolorado (20 g) que contema 8 % en peso de solucion de acetato de sodio 0,1 M a diferentes valores de pH. Se anadio metanol (2,5 ml) en una etapa. Se uso lipasa derivada de Thermomyces lanuginosus inmovilizada sobre una resina basada en poliestireno-divinilbenceno hidrofoba y porosa, (10 % en peso). El medio de reaccion se agito a 300 rpm y 30 °C. En la Fig. 8 se muestran los resultados.
Los resultados presentados en la Fig. 7 muestran que, a valores de pH por encima de 5,5, el biocatalizador ha retenido mas del 60 % de su actividad de transesterificacion inicial despues de 50 ciclos utilizando el mismo lote de enzima. Los resultados muestran claramente que existfa una disminucion lineal en la actividad enzimatica a un valor de pH de 5,5 y la actividad enzimatica alcanzada fue de un 20 % por debajo de la actividad enzimatica inicial.
Se han observado rasgos similares cuando se utilizo el tampon acetato a valores de pH por encima de 6,5 cuando la enzima ha retenido mas de un 50 % de su actividad inicial despues de 50 usos repetidos (Fig. 8). Los resultados presentados en la Fig. 8 muestran tambien que cuando se uso la solucion de acetato de sodio de pH 5,5, la actividad enzimatica era baja y se mantuvo sin embargo constante despues de 50 ciclos de uso repetido.
Claims (14)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Un procedimiento para la transesterificacion/esterificacion de una fuente de acido graso con un alcohol, para formar esteres de alquilo de acidos grasos, que comprende(A) hacer reaccionar una fuente de acido graso y un alcohol o un donante de alcohol en presencia de una preparacion de lipasa inmovilizada, en el que la preparacion de lipasa inmovilizada comprende al menos una lipasa inmovilizada sobre un soporte poroso hidrofobo y el medio de reaccion contiene una solucion acuosa de tampon alcalino en mas de un 5 % en peso de la fuente de acido graso; o(B) hacer reaccionar una fuente de acido graso y un alcohol o un donante de alcohol en presencia de una preparacion de lipasa inmovilizada, en el que la preparacion de lipasa inmovilizada comprende al menos una lipasa inmovilizada sobre un soporte poroso hidrofobo y el medio de reaccion contiene agua en mas de un 5 % en peso de la fuente de acido graso.
- 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el procedimiento comprende (A) y la solucion acuosa de tampon tiene un pH de 7 a 11.
- 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el procedimiento comprende (A) y la cantidad de dicha solucion de tampon alcalino en el medio de reaccion es de mas del 5 % en peso y de hasta el 99 % en peso de la fuente de acido graso.
- 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el procedimiento comprende (B) y el agua esta en la forma de una solucion acuosa de sales disueltas y el pH del sistema de reaccion o de la solucion acuosa es de 3 a 11.
- 5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el procedimiento comprende (B) o el procedimiento de la reivindicacion 4, en el que el medio de reaccion contiene el agua o la solucion acuosa de sales disueltas en mas de un 5 % en peso y hasta un 99 % en peso de la fuente de acidos grasos.
- 6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho alcohol es un alcohol de alquilo C1-C6 de cadena corta, y dicho donante de alcohol es un monoalquil ester, o un carbonato de dialquilo, que sirve tambien como una fuente de reactivo moderadamente alcalino en el medio de reaccion.
- 7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha al menos una lipasa es una lipasa derivada de una cualquiera de Rhizomucor miehei, Pseudomonas sp., Rhizopus niveus, Mucor javanicus, Rhizopus oryzae, Aspergillus niger, Penicillium camembertii, Alcaligenes sp., Acromobacter sp., Burkholderia sp., Thermomyces lanuginosus, Chromobacterium viscosum, Candida antarctica B, Candida rugosa, Candida antarctica A, semillas de papaya y pancreatina.
- 8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha al menos una lipasa inmovilizada es capaz de catalizar la esterificacion de los acidos grasos libres para dar como resultado esteres de alquilo de acidos grasos y agua como subproductos, y la transesterificacion de trigliceridos y gliceridos parciales para dar como resultado esteres de alquilo de acidos grasos y glicerol como subproductos.
- 9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha preparacion de lipasa comprende al menos dos lipasas.
- 10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho soporte puede ser uno cualquiera de entre un soporte basado en un polfmero alifatico hidrofobo y un soporte basado en un polfmero aromatico hidrofobo.
- 11. El procedimiento de la reivindicacion 1 a 6, en el que dicha solucion acuosa de tampon alcalino es una solucion de una base debil seleccionada entre bicarbonatos y carbonatos de sodio o potasio.
- 12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicha fuente de acido graso es uno cualquiera de un aceite vegetal, grasas animales, aceite de algas, aceite de pescado, aceites residuales y cualquier mezcla de los anteriores.
- 13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que dicha fuente de acido graso comprende acidos grasos libres, monogliceridos, digliceridos o trigliceridos, sus mezclas en cualquier relacion, en ausencia o presencia de otros derivados de acidos grasos menores, tales como fosfolfpidos y esteres de esteroles, en el que dicha fuente de acido graso es sin refinar, refinada, decolorada, desodorizada o cualquiera de sus combinaciones.
- 14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho alcohol es metanol y dichos esteres de acidos grasos resultantes son esteres metilicos de acidos grasos (FAME - biodiesel) o dicho alcohol es un alcohol graso de cadena intermedia (C6-C10) o un alcohol graso de cadena larga (C12-C22).
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